A lymphangiogenezis mechanizmusainak és a nyirokerek szerepének vizsgálata tüdő rákban
Doktori értekezés
Dr. Rényi-Vámos Ferenc
Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető : Dr. Döme Balázs, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Vizi Éva, Ph.D. Dr. Muraközy Gabriella, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Szabó Zoltán professzor emeritus Dr. Kóbori László egyetemi docens, Med.Habil. Dr. Heiler Zoltán fő orvos, Ph.D.
Budapest 2009
I. Tartalomjegyzék
I. Tartalomjegyzék 1.old. II. A dolgozatban használt rövidítések jegyzéke 3.old. III. Általános bevezető5.old. IV. Irodalmi háttér 7.old. IV/1. Angiogenezis 7.old. IV/1/1. Vaszkulogenezis 7.old. IV/1/2. Angiogenezis, Tumor-indukált angiogenezis (TIA) 7.old. IV/1/3. A tumorok vaszkularizációjának mechanizmusai 8.old. IV/1/3/1. Bimbózás 8.old. IV/1/3/2. A gazdaszövet ereinek inkorporációja vagy kooptációja 8.old. IV/1/3/3. Intusszuszceptív angiogenezis 10.old. IV/1/3/4. Glomeruloid angiogenezis 10.old IV/1/3/5. Vaszkuláris mimikri, tumor-sinusok,mozaik erek 11.old. IV/1/3/6. Posztnatális vaszkulogenezis,keringőendotheliális prekurzorok 12.old. IV/2. A nem kissejtes tüdőrák vascularizációja 13.old. IV/3. Lymphangiogenezis 15.old IV/3/1. Nyirokrendszer anatómiája 15.old. IV/3/1/1. Lymphoid endothel sejtek 15.old. IV/3/1/2. A nyirok keletkezése, a nyirokkeringés elve, a nyirokerek anatómiája 15.old. IV/3/2. A nyirokrendszer embriológiája 17.old. IV/3/3. Nyirokér markerek 19.old. IV/3/4. A nyirokrendszer szerepe az áttétképződésben 19.old. IV/3/4/1. A nyirokerek aktiválása a nyirokcsomókban 21.old. IV/3/4/2. A tumorsejtek nyirokerekbe történőbelépésének mechanizmusa 22.old. IV/3/4/3. Lymphangiogenezis és nyirokcsomómetasztázis 23.old. IV/3/5. Tumor lymphangiogenezis és lymphangiogén növekedési faktorok 25.old. IV/3/5/1. VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3 jelátviteli tengely 25.old. IV/3/5/2. Egyéb lymphangiogén növekedési faktorok 27.old. IV/3/5/2/1. Cyclooxigenáz-2 (COX-2) 27.old. IV/3/5/2/2. Fibroblaszt növekedési faktor-2 28.old.
1
IV/3/5/2/3. Angiopoietinek és Tie 1/Tie 2. 28.old. IV/3/5/2/4. Thrombocyta növekedési faktorok (PDGF-ek) 29.old. IV/3/5/2/5. Insuline Like Growth Factor (IGF) 29.old. IV/3/5/2/6. Hepatocita növekedési faktorok (HGF) 30.old. IV/3/5/2/7. Vaszkuláris Endotheliális Növekedési Faktor-A (VEGF-A) 31.old. IV/3/5/2/8. Nitrogén oxid (NO) 32.old. IV/3/6. A gyulladás szerepe a lymphangiogenezisben 33.old. IV/4. Lymphovaszkulogenezis –LVEPC (Lymphatic Vascular Endothelial Progenitor Cell) sejtek 34.old. V. Célkitűzések 35.old. VI. Anyag és módszer 36.old VI/1. Klinikai adatok 37.old. VI/2. A nyirokrendszer karakterizálása immunhisztokémiával 38.old. VI/3. A nyirokrendszer komputer asszisztált morfometriai analízise 40.old. VI/4. SCLC betegek perifériás véréből flow cytometriával végzett LVEPC szám meghatározás 40.old. VI/5. Egészséges kontrollok és SCLC betegek perifériás véréből VEGF-C szint mérése 41.old. VI/6. Statisztikai analízis 41.old. VII. Eredmények 42.old. VII/1. A nyirokerek azonosítása normál tüdőszövetben LYVE-1 és D2-40 antitesttel 42.old. VII/2. A nyirokerek karakterizálása nem kissejtes tüdőrákban 42.old. VII/3. Nyirokér denzitás és kerület nem kissejtes tüdőrákokban 43.old. VII/4. Túlélés 44.old. VII/5. Lymphatikus proliferáció 45.old. VII/6. VEGF expresszió humán tüdődagantban 46.old. VII/7. LVEPC szint meghatározás kissejtes tüdőrákos betegek perifériás vérében 46.old. VII/8. LVEPC szint és a klinikopatológiai paraméterek összefüggései 47.old. VII/9. VEGF-C szint SCLC betegek perifériás vérmintájában 47.old. VIII. Megbeszélés 47.old.
2
VIII/1. A lymphangiogenezis vizsgálata és jelentősége nem kissejtes tüdőrákban 47.old. VIII/2. . A lymphovaszkulogenezis (LVEPC-k) vizsgálata és jelentősége kissejtes tüdőrákban 51.old. IX. Következtetések 54.old. X. Összefoglalás 54. old. XI. Táblázatok és ábrák 56.old. XII. Irodalomjegyzék 70.old. XIII. Saját közlemények jegyzéke 93.old XIII/1. A disszertációhoz kapcsolódó közlemények jegyzéke 93.old. XIII/2. A disszertációhoz nem kapcsolódó közleményel jegyzéke 94.old. XIV. Köszönetnyílvánítás 94.old. II. A dolgozatban használt rövidítések jegyzéke
SCLC: Small Cell Lung Cancer, kissejtes tüdőrák NSCLC: Non Small Cell Lung Cancer, nem kissejtes tüdőrák ATS: American Thoracic Society TIA: Tumor indukált angiogenezis VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor Ang 1: Angiopoietin 1 Ang 2: Angiopoietin 2 VEGFR: Vascular Endothelial Growth Factor Receptor HIF:Hypoxia indukálta faktor VHL: von Hippel-Lindau protein EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor PDGF: thrombocyta növekedési faktor bFGF: bázikus fibroblaszt növekedési faktor MMPs: mátrix metalloproteázok EGF: epidermális növekedési faktor PIGF: placenta növekedési faktor IL-8: interleukin-8
3
HGF: hepatocyta növekedési faktor EC: endothel sejt EPC: endothelialis progenitor sejt NO: nitrogén-monoxid TNF-α: tumor nekrózis faktor alfa CRP: C-reaktív protein E14: embrionális időszak 14. napja E15: embrionális időszak 15. napja VEGF-C: Vascular Endothelial Growth Factor –C VEGF-D: Vascular Endothelial Growth Factor -D VEGFR-3: Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3 VEGFR-2: Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Eph: ephrin HA: hialuronsav LEC: nyirok endothel sejt LVI: nyirokér invázió LVD: Lymphatic Vessel Density, nyirokérsűrűség VEGF-A: Vascular Endothelial Growth Factor-A CXCR4: chemokine receptor CCR7: chemokine receptor CXCL12: stromal-cell derived factor-1 CCL21: secondary lymphoid chemocine ITL: intratumorális nyirokér PTL: peritumorális nyirokér PC5: plazmin és a proprotein konvertáz család enzime PC7: plazmin és a proprotein konvertáz család enzime COX-2: Cyclooxigenáz-2 PG: prosztaglandin FGF-2: Fibroblaszt növekedési faktor-2 mTOR: mammalian target of rapamycin IGF: Insuline Like Growth Factor IGFBP: IGF-kötőproteinből
4
IGF-1R: IGF -1 Receptor c-Met, HGF-R: hepatocyta növekedési faktor receptor NOS: nitrogén-oxid szintáz eNOS: endotheliális NOS iNOS: az indukálható NOS nNOS: neurális NOS sGC: szolúbilis guanilát cikláz cGMP: Guanosine-monophosphate LVEPC: Lymphatic Vascular Endothelial Progenitor Cell TIA: Tumor Indukálta Angiogenezis TILA: Tumor Indukálta Lymphangiogenezis OKTPI: Országos Korányi Tbc és Pulmonológiai Intézet AJCC: American Joint Cancer Comitee UICC: International Union Against Cancer EDTA: ethylenediamineteracetic acid IASLC: International Assotiation for the Study of Lung Cancer LD: limited disease GOLD: Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease s COPD: Chronic Obstructive Pulmonary Disease CT: komputer tomográfia MRI: mágnese rezonancia EP: ciszplatin plusz etopozid kemotherápiás kombináció H2O2: hidrogénperoxid III. Általános bevezető
A világon évente tizenegy millió új daganatos megbetegedést jelentenek, hat és fél millió ember hal meg daganatos kórok miatt (1), mely az összes halálozás 12 %-át jelenti. A leggyakrabban előforduló rosszindulatú daganat a tüdőrák, 1.35 millió új tüdőrákos beteget regisztrálnak évente. A tüdőrákot az emlőrák, illetve a vastagbélrák követi egy millió illetve 940 ezer új beteggel. A halálozási adatokat figyelembe véve a tüdőrák a halálozás 17.8 %-ért felelős, míg az új megbetegedések csak 12%-áért.
5
Minden ötödik daganatos beteg tüdőrákban hal meg. Sajnos növekvőtendenciát figyelhetünk meg az új megbetegedések számában, amíg 1980-ban 600 ezret jelentettek, 2000-ben már 1.2 milliót. Magyarországon évente mintegy 8000 új esetet regisztrálnak (2). A férfi –nőmegoszlás a világban 2.7:1 a férfiak javára, a hazai adatok ezzel lényegében megegyeznek. A férfiak tekintetében Magyarország a tüdőrák mortalitásában világelső. A jelentős számú haláleset több okkal magyarázható. Világszerte nem megoldott a szűrés, ezáltal a korai stádiumban észlelt daganatok aránya alacsony. A bronchuskarcinoma alattomos betegség, sokáig „néma”, a panaszok jelentkezése idején legtöbbször előrehaladott stádiumú betegségről van szó. A fejlett országokban a dohányzás visszaszorításával komoly eredményeket értek el, hazánkban e témában jelentős lemaradás figyelhetőmeg. A tüdőrák epidemiológiai adatai a nyugati világban ellenkezőirányba mozdultak el, mint Magyarországon. A világon férfiak esetén a tüdőrák incidenciája tekintetében elértük a platót, míg nők esetén az incidencia folyamatosan növekszik. Általánosan megfigyelhetőaz adenokarcinoma arányának növekedése a laphámrákkal szemben. Magyarországon egyenlőarányban fordul előa mirigysejtes és a laphámkarcinoma. Az adenokarcinomák szaporodásának elképzelhető oka lehet a "light" dohánytermékek térnyerése. Terápiás szempontból két főcsoportot különíthetünk el: a kissejtes (SCLC, Small Cell Lung Cancer) és nem kissejtes tüdőrák (NSCLC, Non Small Cell Lung Cancer). Ez utóbbi magába foglalja a planocelluláris-, az adeno-, a nagysejtes- és a bronchioloalveoláris karcinomát. A tüdőrákos betegek körülbelül 85 %-a az NSCLC típusba tartozik, mely típusra jellemző, hogy korai stádiumban is nyirokcsomó áttétet adhat. A nyirokcsomókban kialkult metasztázis a staging meghatározása és a kezelés módjának eldöntése szempotjából alapvetőfontosságú. Tüdőrákos betegeknél a nyirokcsomó metasztázisok klasszifikációja az ATS (American Thoracic Society) által meghatározása került nyirokcsomótérkép alapján történik. A primer tumor stadium mellett nagy prognosztikai súlya van a nyirokcsomóáttéteknek. N2 és N3 betegségben a túlélés esélyei jelentősen csökkennek, ezért az N besorolást önálló prognosztikai csoportként is kezelik. Maga a nyirokúti invázió folyamata és a metasztázis kialakulása a regionális nyirokcsomókban, valamint az a kérdés, hogy a daganatok az angiogenezishez hasonlóan elősegítik-e a lymphangiogenezist (azaz új nyirokerek kialakulását), még nem egészen tisztázott.
6
A kutatók érdelkődése a malignus tumorok keringésének tanulmányozása területén jóval előbb fordult a daganatos ér- , mint a nyirokérhálózatok kutatása felé. Mára törzskönyvezett antiangiogén gyógyszerek vannak forgalomban, a tumoros nyirokhálózat kialakulásának leírása, a tumor indukálta lymphangiogenezis folymatának részletes bemutatása, illeteve ezen folyamatok gátlására épülőterápia bevezetése még várat magára. A lymphangiogenezis tanulmányozása az angiogenezis és lymphangiogenezis hasonlóságaira épül. Fontosnak tartom röviden ismertetni a tumor indukálta angiogenezis folymatát, amelynek segítségével megismerjük a lymphangiogenezis kutatás alapjait is. IV. Irodalmi háttér IV/1. Angiogenezis
A szervezetben új véredények keletkezése két mechanizmus révén lehetséges. A korai embrionális fejlődés során az erek de novo alakulnak ki angioblaszt sejtek felhasználásával. Ezt nevezzük vaszkulogenezisnek (3, 4) Ezzel szemben angiogenezis alatt a már egzisztáló véredényekből kiinduló érképződést értjük, függetlenül attól, hogy fiziológiás (embriogenezis, sebgyógyulás, szöveti regeneráció) vagy patológiás (gyulladás, tumor-indukált angiogenezis) körülmények között zajlik (5-8). IV/1/1. Vaszkulogenezis
A korai embrionális fejlődés (praesomita stádium) során a szikhólyag falának mesodermájában megjelenő, haemangioblasztok (9) alkotta „vér-szigetek” összeolvadásából primitív kapillárishálózat fejlődik ki, amely a keringés megjelenésével párhuzamosan a vasa omphaloenterica révén az embrió szívcsövével összeköttetésben álló arteriovenosus érrendszerré alakul át (10). A „vérszigetek” centrálisan elhelyezkedő sejtjeiből haematopoetikus- az őket körülvevősejtekből endotheliális őssejtek (angioblasztok) fejlődnek ki. IV/1/2. Angiogenezis, Tumor-indukált angiogenezis (TIA)
7
Az. „angiogén switch” jelenségének leírása, amely az 1970-es évek kezdetére esett és Judah Folkman nevéhez fűződik, indította el azt a rendkívül intenzív kutatómunkát mely azóta is töretlenül tart. A Folkman-féle teóriára (a daganatok az 1-2 mm-es átmérő eléréséig avaszkulárisak maradnak) alapozott kezdeti terápiás elképzelés ugyanis az volt, hogy a megállapítás nyilván meg is fordítható: egyfelől ha sikerülne megakadályozni a tumor- és stromasejtek által termelt citokinek indukálta „új” kapillárisok kialakulását, akkor a daganat tartósan ebben az avaszkuláris stádiumban lenne tartható, másfelől az antiangiogén ágensek mint neoadjuváns szerek hatására a már előrehaladt stádiumban felismert daganat átmérője is 1-2 mm-re lenne redukálható (11). Miután a daganatos betegek életét a primer tumor általában sokkal kevésbé veszélyezteti, mint annak metasztázisai, további fontos kérdés a daganatok áttétképző képessége és a neoangiogenezis illetve a vaszkularizáltság közti összefüggés. IV/1/3. A tumorok vaszkularizációjának mechanizmusai
A következőkben ismertetésre kerülőmechanizmusok akár egymás mellett, párhuzamosan is működhetnek, és nem csak patologiás, hanem fiziológiás folyamtokban is megfigyelhetőek. IV/1/3/1. Bimbózás
A bimbózás elsőlépéseként a postkapilláris venulán tágulat képződik, a bazalmembrán degradálódik a venulának az angiogén stimulus felöli oldalán, az endothel sejtek között fellazul a kapcsolat, megkezdődik a migráció, a bipoláris elrendeződésű, migráló endothelsejtek szolid sejtköteget képeznek, lumen kialakítására kerül sor az intracelluláris vakuolák fúziója, vagy az egyes endothelsejtek sejttesteinek csővé záródása révén, hurokképzés történik, pericyták jelennek meg és új bazalmembrán szintetizálódik. IV/1/3/2. A gazdaszövet ereinek inkorporációja vagy kooptációja
8
Egy angol munkacsoport kísérleti állatokba oltott emlőtumorokat vizsgálva megfigyelte, hogy a növekvődaganatot közvetlenül körülölelőstroma felől a tumor centrális területei felé haladva egyre alacsonyabb az érdenzitás, függetlenül az aktuális növekedési stádiumtól (12). Ez számukra azt sugallta, hogy a növekvőtumormassza folyamatosan inkorporálja a környezőkötőszövetben elhelyezkedő, - részben a daganatsejtek által termelt citokinek hatására újonnan kialakult, részben a már perzisztáló gazdaszervezeti ereket tartalmazó - rendkívül sűrűperitumorális kapillárisfonatot. Az erek inkorporációjának illetve kooptációjának következőleírása kb. egy évtizeddel az elsőpublikációt követően jelent meg (13). Humán glioblastoma multiforme, C6 patkány glioma és Lewis tüdőtumorok vaszkularizációjának vizsgálata során kimutatták, hogy ezek a daganatok növekedésük elsőfázisában nem indukálnak angiogenezist; ellenkezőleg, a bekebelezett alapszöveti erek endothelsejtjeinek apoptosisa figyelhetőmeg, melyet a daganat centrumában masszív tumorsejt elhalás kísér. A következőstádiumban a tumor perifériája felől erőteljes érproliferáció indul meg a még életben lévőtumorsejtek felé. A folyamatban résztvevőcitokinek közül kulcsszerepe van a VEGF-nek(Vascular Endothelial Growth Factor), és az angiopoetineknek (Ang1, Ang2). Az Ang1 – amely endotheltenyészetekben antiapoptotikus hatásúnak bizonyult – expressziója a progresszió során lényegesen nem változik, a daganatsejtek folyamatosan termelik. Az Ang2 hatása VEGF függő. A daganatos progresszió korai fázisában – VEGF hiányában - az endothelsejtek által termelt, autokrin módon ható Ang2 felelős a kooptált kapillárisok regressziójáért. Később a centrálisan kialakult nekrózist túlélő, de hypoxiás tumorsejtek termelte VEGF, és az Ang2 együttes hatására a periféria felől indul meg a tumorszferoid revaszkularizációja. A tumorok vaszkularizációja nem mindig jár együtt endothelproliferációval illetve neoangiogenezissel. Ennek legmarkánsabb példája humán primer és metasztatikus tüdőtumorok kapcsán került leírásra (14, 15). Pezzella és munkatársai megfigyelték, hogy minden egyes a tumorban található kapilláris mentén korompigment azonosítható. Ennek alapján megállapítható volt, hogy az invazív növekedés és szöveti destrukció ellenére az alveoláris szeptumokban futó tüdőkapillárisok megkíméltek maradtak, elegendőtápanyaggal és oxigénnel szolgálva a tumorsejtek számára. A folyamatosan
9
újabb és újabb alveoláris tereket elfoglaló daganatszövet így a perzisztáló alapszöveti erek segítségével képes neoangiogenezis híján is túlélni, sőt növekedni. A fenti példa arra utal, hogy a daganatok érhálózatának szerkezete sokkal inkább függ a gazdaszövet érstruktúrájától, mint azt korábban az in vitro körülmények között-, vagy a virtuális subcutan térben növekvődaganatokat vizsgálva feltételezték. Az angiogenezis a gazdaszövet stromális reakciója a tumorsejtekkel szemben, illetve bonyolult parakrín kölcsönhatás a tumorsejtek és az alapszövet között, tulajdonképpen „egy seb, amelyik nem gyógyul” (16). A képet tovább árnyalja, hogy a metasztázisok érstruktúráját nem csak a gazdaszövet-, de a kiindulás helyéül szolgáló alapszövet szerkezete is determinálja IV/1/3/3. Intusszuszceptív angiogenezis
Intusszuszceptiv angiogenezis során a lumen endothelproliferáció és bimbózás nélkül, pusztán a rendkívül flexibilis endothelsejtek reorganizációja révén, az érfal egymással szemközt elhelyezkedőfalai között kialakuló transzverzális vagy longitudinális szöveti pillérek segítségével képes ketté- vagy többfelé osztódni és ezáltal komplex érhálózatokat létrehozni. Az elsőleíró Short (17) volt 1950-ben, aki nyúlembriók tüdejének kapillárishálózatát vizsgálta fénymikroszkóposan. Munkája azonban hosszú időre feledésbe merült és Caduff és munkatársai csak 1986-ban igazolták újra a jelenség létezését (18). IV/1/3/4. Glomeruloid angiogenezis
A glomeruloid testek kapillárisokból felépülő, szövettani metszetben akár egyszerű fénymikroszkópos vizsgálattal is felismerhető, rendkívül jellegzetes érstruktúrák, amelyek nevüket a vese glomerulusaihoz való felületes hasonlóságuk miatt kapták. Immunhisztokémiai és elektronmikroszkópos vizsgálatok szerint, szorosan egymás mellett elhelyezkedőkapillárishurkokból felépülő, 100-200 μm átmérőjű, rendkívül kompakt szerkezetű„érgombolyagok”, amelyek felépítésében az endothelsejteken kívül az endothelcsőbazális membránjába ágyazott pericyták is részt vesznek (19, 20). Leggyakoribb megjelenési helyük a központi idegrendszer, ahol diagnosztikus
10
kritériumai a glioblastoma multiformenak (21), de tüdőtumorok agyi áttétei (22) kapcsán is leírták előfordulásukat. Az első, és mostanáig az egyetlen a glomeruloid testek patogenezisével foglalkozó kísérletes tanulmányban (23) VEGF-et expresszáló fibroblasztokat immunszupprimált egerek fülkagylójának bőrébe oltva a glomeruloid testek alábbi életciklusát állapították meg: 1. nap: A VEGF-et expresszáló sejtek közelében elhelyezkedőkapillárisok lumene kitágul, a pericyták leválnak az endothelcsőről, a bazalmembrán lebomlik. 2. nap: megkezdődik az endothelproliferáció. 3. nap: a proliferáló endothelsejtek sejtcsoportokba rendeződnek az eredeti lumen körül, miközben a pericyták a frissen képződött, több rétegben elhelyezkedőbazalmembrán anyagba ágyazottan helyezkednek el. 7-10. nap: a továbbra is kifejezett endothelproliferáció eredményeképpen létrejött sejtcsoportok az eredeti lumenbe nyomulva azt két résszerűlumenné szakítják szét; eközben egyre több pericyta és macrophag jelenik meg az endothelsejtek között. 14-21. nap: szabályos felépítésű, egymással szorosan összefekvő, de jól elkülönülőkapillárislumenek láthatóak a centrálisan elhelyezkedőVEGF-et expresszáló sejt körül. 28. nap: a frissen képződött kapillárisok egymástól kissé eltávolodnak egymástól, de egy-egy kontraktilis pericyta révén még össze vannak egymással kapcsolva. 35-90. nap: a glomeruloid test helyén kötőszövetbe ágyazott, normális kapillárisok alakulnak ki. IV/1/3/5. Vaszkuláris mimikri, tumor-sinusok, mozaik erek
A közelmúltban csaknem sokkolták a tudományos közvéleményt egy iowai munkacsoport, az un. vaszkuláris mimikri jelenségét leíró publikációi, amelyekben uveális melanómákat vizsgálva arra a következtetésre jutottak, hogy maguk a tumorsejtek alkalmasak a vér szállítására alkalmas csatornák képzésére (24, 25). Megfigyelésük szerint az erre a daganattípusra különösen jellemző, a tumoros sejtfészkeket egymástól elválasztó kötőszövetes sövények réseiben endothelbélés nélküli, a daganatsejtektől csupasz bazalmembránnal határolt csatornák helyezkednek el, amelyek vörösvértesteket tartalmaznak, tehát valahol összeköttetésben kell lenniük a „konvencionális” érhálózattal. A daganatokban jelenlévő, endothelmentes vaszkuláris csatornák leírása ugyanakkor régi megfigyelés. Definíció szerint ezek tumorsejtek által határolt, vörösvértesteket és a
11
vér más alakos elemeit tartalmazó rések, un. tumor-sinusok (26), melyek valamilyen tisztázatlan módon kapcsolatban állnak a daganatot ellátó erekkel. A hazai patológusok idősebb generációja számára ez a fogalom nem ismeretlen. A 40-es évektől hallhattak ezekről Kellner Bélától, aki előbb a debreceni egyetem majd az Országos Onkológiai Intézet patológus professzora volt. Őírta le 1941-ben a tumor-sinusokat lágyrésztumorokban (27). Néhány évvel később mások is leírták ezeket a struktúrákat (28). majd csaknem minden évtizedben újra és újra felfedezték (29-31) később már elektronmikroszkópos bizonyítékokat is szolgáltatva (32-34). Tumorsejtek vesznek részt a mozaik erek falának felépítésében is (35). Ebben az esetben azonban az endothelsejtek és a tumorsejtek közösen, mozaikszerűen elhelyezkedve határolják a lument. Jelentős különbség a vaszkuláris mimikrivel szemben, hogy itt a daganatsejtek nem expresszálnak sem endotheliális-, sem az embrionális fenotípusra jellemzőmarkereket, valamint nem vesznek fel az endothelsejtekhez hasonló alakot. IV/1/3/6. Posztnatális vaszkulogenezis, keringőendotheliális prekurzorok
Egészen a közelmúltig úgy tartották, hogy a felnőtt szervezetben neovaszkularizáció kizárólag angiogenezis útján képzelhetőel. 1997-ben azonban Asahara és munkatársai (36) az egészséges felnőtt szervezet vérkeringésében is jelenlévőVEGFR2+, AC133+ (37), CD34+ endotheliális prekurzorokat, angioblasztokat mutattak ki. E sejtpopuláció tagjai – amelyek a magasabb proliferációs index által különböztethetőek meg a desquamálódott endotheltsejtektől (38) - beépülhetnek az ischiaemiás károsodást szenvedett harántcsíkolt (39)- és szívizomszövet (40) revaszkularizációja során felépülő kapillárishálózatba, a sebszövetet tápláló véredények falába (41), és valószínűleg szerepük van az érimplantátumok endothelizációjának folyamatában, valamint a levált endothelsejtek pótlásáért felelős „karbantartó angiogenezis”-ben is (42). A posztnatális vaszkulogenezis jelenségét leírták daganatos kísérleti modellekben is: csontvelőeredetűendothelsejt prekurzorok gócszerűbeépülése volt megfigyelhető egerek bőre alá oltott kolonkarcinoma érrendszerének elsősorban a tumor perifériás területeit tápláló kapillárisaiba..
12
IV/2.A nem kissejtes tüdőrák vascularizációja
A daganatok növekedéséhez és áttétképzéséhez megfelelővérellátás szükséges. A többi szolid tumorhoz hasonlóan a NSCLC is számtalan angiogén faktort termel, ezek hatására egy komplex folyamatsor játszódik le, melynek eredményeként új erek képződnek. Ezen angiogén molekulák közt kulcsfontosságú a vaszkuláris endotheliális növekedési faktor (VEGF), mely az endotheliális bimbózásért felelős (ez definíció szerint az endothel sejtek in situ proliferációját jelenti) (43-45). Bár a hypoxia indukálta faktor (HIF) – von Hippel-Lindau (VHL) fehérje rendszernek van a legfontosabb szerepe a VEGF expresszió szabályozásában, egy sor különbözőonkogén szintén fokozhatja a VEGF termelődését, ideértve az aktivált epidermális növekedési faktor receptort (EGFR), a RAS-t és az erbB-2/Her2-t. A VEGF mellett az alábbi molekulák szintén befolyásolják az endothel bimbózást NSCLC-ben: thrombocyta-függő növekedési faktor (PDGF) (46), bázikus fibroblaszt növekedési faktor (bFGF) (47), mátrix metalloproteázok (MMPs) (48), epidermális növekedési faktor (EGF) (49), placenta eredetűnövekedési faktor (PIGF) (50), interleukin-8 (IL-8) (51), hepatocyta eredetűnövekedési faktor (HGF) (52), angiopoetinek (53). Ezen molekulák közti interakciók kaszkádszerűen újabb angiogén folyamatokat indítanak el: további növekedési faktorok termelődnek, a különbözőendothel sejt (EC) eredetűadhéziós molekulák révén pedig új sejt-sejt és sejt-mátrix közti interakciók lépnek fel. Ez utóbbi sejtfelszíni adhéziós molekulák közé tartoznak az integrinek, a cadherinek, a sejtmembrán proteoglikánok és a szelektinek. Az endothel bimbózásban szerepet játszó kulcsfontosságú adhéziós molekulák az integrinek családjából kerülnek ki. Bár a tüdőrákokban megfigyelhetőendothel bimbózás ideális célpontja az érellenes terápiáknak, ma már tudjuk, hogy a tumorok kapillárisainak fejlődése nem csak e folyamat révén valósulhat meg. A legfontosabb „nem bimbózásos” mechanizmus NSCLC-ben az ér-inkorporáció. A „nem angiogén” vagy „alveolaris típusú” növekedésnél tumorsejtek töltik ki az alveolusokat, ugyanakkor a daganatsejtek bekebelezik, de nem pusztítják el az alveolusok falát az inkorporált kapillárisokkal együtt. A tumorsejt fészkek alveolaris fallal vannak körülvéve, nincs jelen neoangiogenezis (azaz endothel proliferáció vagy bimbózás) (14). A „nem angiogén” típusú NSCLC-k érhálózatának elemzése bebizonyította, hogy a vaszkulatúra a normális
13
alveolaris kapillárisokéval megegyező(54), továbbá, hogy a „nem angiogén” és „angiogén” tumorok génexpressziója különböző(55). A NSCLC-ben ismert másik vaszkularizációs mechanizmus a posztnatális vaszkulogenezis, melynek során csontvelőeredetűendothelialis progenitor sejtek (EPCk) épülnek be a növekvőúj véredények falába és ott endothel sejtekké differenciálódnak (56). Az EPC-k az embrionális angioblasztokhoz hasonlítanak, azaz olyan kitapadásfüggetlen, keringősejtek, melyek képesek proliferációra, migrációra és érett endothel sejtté történődifferenciációra. Bár az EPC-k csontvelői felszabadulását és daganatos érhálózatba történőbeépülését szabályozó mechanizmusok pontosan még nem ismertek, ebben a VEGF és a fehér- és vörösvérsejtek mobilizációjáért felelős molekulák (a granulocyta/makrofág kolóniastimuláló faktor és az erythropoietin) tűnnek kulcsfontosságúnak (57). Újabb kutatási eredmények a PDGF-CC (58), a PIGF (59), a nitrogén-monoxid (NO) (60), az angiopoetin-1 (61), a 3-hidroxi-3-metilglutaril koenzim-A reduktáz inhibitorok (sztatinok) (62) és az ösztrogének (63) endothel progenitor sejteket mobilizáló hatásait igazolták. Ezzel ellentétben a tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-α) és a C-reaktív protein (CRP) EPC apoptózist indukálnak és gátolják e sejtek funkcióját (64, 65). Asahara és mtsai. elsőként megjelenőközleménye után (36), mások is emelkedett EPC szinteket mutattak ki hepatocellularis-(66), emlő-(67) és kolorectalis rákokban(68), myeloma multiplexben (69), myelofibrosisban (70), nonHodgkin lymphomában (71), akut myeloid leukémiában (72) és malignus gliomákban (73). Döme és munkatársai igazolták elsőként, hogy NSCLC-s betegek perifériás vérében az EPC-k szintje szignifikánsan magasabb ill., hogy ez a szint összefüggést mutat a tumor nagyságával és a klinikai kórlefolyással (74). Hilbe és mtsai. pedig szignifikánsan emelkedett inkorporált CD133 pozitív EPC-ket mutattak ki NSCLC-s betegek tumormintáiban (75). Összefoglalva az eddigieket, a NSCLC vaszkularicációja más malignus daganattípusokhoz hasonlóan egy igen komplex folyamat, mely számos különböző angiogén molekula interakciójának tökéletes összhangját igényli. IV/3.Lymphangiogenezis IV/3/1. Nyirokrendszer anatómiája
14
IV/3/1/1. Lymphoid endothel sejtek
A vaszkuláris és lymphoid endothel sejtek sok hasonlóságot mutatnak (76) (Alitalo és mtársai, 2005). Bár kezdetben úgy gondolták, hogy csupán a vérér endothel sejteire jellemzőaz FVIII expresszió, később ezt lymphoid endothel sejtekben is kimutatták (77-79). Ugyanakkor, in vitro, a vér- és nyirokér endothel sejtek génállománya 98 százalékban mutatott átfedést (80-82), és különbség csak a lymphangiogenezis és a lymphoid funkció szabályozásában játszó gének között volt látható (83). Mindenesetre, az összehasonlító tanulmányok arra engednek következtetni, hogy a különböző lymphoid endothel sejteknek a vaszkuláris endothel sejtekhez hasonlóan, különféle fenotípusai vannak, amelyeknek valószínűleg különféle a biológiai viselkedése (84). IV/3/1/2. A nyirok keletkezése, a nyirokkeringés elve, a nyirokerek anatómiája
Az ér- és a nyirokrendszer egymás szerepét kiegészítőfunkcióval bírnak a szövetek perfúziójában, illetve az extracelluláris folyadék reabszorpciójában. A kapillárisok fala a vérpályában visszatartja a vérsejteket és a vérnedv nagy molekulájú alkotórészeit, tehát elsősorban a fehérjét. Szabadon átjárható viszont a kapillárisfal a víz és a benne oldott kismolekulájú (krisztalloid) anyagok számára. A kapillárisok falán átlépő folyadék mozgását befolyásolja az intrakapilláris nyomás, a folydék ozmotikus nyomása és a sejtközötti folyadék egyéb, nem vérpályán át történőelvezetésének lehetősége. Általában a kapillárishálózat artériás oldalán a nyomás hatására kifelé, míg a vénás oldalon inkább befelé irányuló áramlás figyelhetőmeg. A kilépőés a felvett folydék nem egyenlőmennyiségű, általában meghaladja a kilépőtérfogat mennyiségeamelyhez hozzáadódik a sejtek anyagcseréje során (égés) keletkezett víz és a benne oldott kisebb molekulájú anyagok- a vénás kapillarisokba visszaáramló sejt közötti folyadék mennyiségét. A fel nem vett felesleges sejt közötti folyadékot a nyirokkapillárisok vezetik el. Ezek endothelcsőhálozatok, amelyek vak zsákokként kezdődnek és fokozatosan nagyobbodó nyirokerekbe szedődnek össze. A nyirokerek egy bonyolult nyitott végűkapilláris rendszert alkotnak, amely a nyirkot különféle szervekből és szövetekből gyűjti össze. A nyirokereket egyrétegű, fenesztrált endothel
15
béleli, amely a legtöbb helyen rendkívül vékony. A nyirokerek bazalmemránja jóval kevésbé strukturált, mint a vérereké. Ezzel magyarázható, hogy a nyirokerek nem csupán vízben oldott krisztalloid, hanem kolloid diszperzitású nagy molekulájú anyagok, sőt a kolloidális részecskéknél nagyobb szemcsék számára is átjárhatók. Normális körülmények között is, nagyon kis mennyiségben, de főleg gyulladásos állapotokban kerülnek be kolloidális anyagok (nagyobbára fehérjék) a sejt közti térbe. Ezek folyamatos elszállításában a vérkapillárisok igen alárendelt szereppel bírnak, ez döntően a nyirokrendszer feladata. A nyirokereket vékony kötőszöveti filamentumok kapcsolják a környezőextracelluláris matrixhoz, melyek „kipányvázzák” azokat és egyben biztosítják, hogy magas onkotikus nyomás esetén lumenük ne essen össze, illetve közvetítik az extracelluláris mátrixokból „kívülről befelé” irányuló szignálokat. A komplex rögzítőrostrendszer fokális tapadásai valószínűleg a nyirokér endothel áteresztőképességét is kontrollálják, és a nyirokérképződés finom szabályozását végzik az extracelluláris mátrix fiziológiai adottságainak megfelelően. A nyirok (lympha) tehát a nyirokerekbe bejutott szövet közti folyadék: azaz víz, benne oldott krisztalloid anyagok, és gázok (CO2, N2), valamint kisebb mennyiségben kolloidok, és elvétve (500 / µl) a nyirokhajszálerek falán átvándorolt különbözősejtek. –Mennyisége nagymértékben függ a szövetek működési állapotától: az egész test nyiroktermelése durva becsléssel napi 3 literre tehető. A nyirokrendszer hálózatos jellegét a kapillárisoktól a főnyirokgyüjtők felé haladva tovább megőrzi, mint az érrendszer, a főbb nyirokerek falszerkezete a vénák falszerkezetére hasonlít: endothel, intima, körkörös és spirális izomréteg illetve adventitia alkotja. A nyirokrendszer különbözőrészei között vannak szerkezetbeli különbségek. A szövetekben lévőnyirokerek elnyelőkapillárisok, amelyek falai csakis endothel sejtekből állnak, és a gyűjtőerekbe szállítanak. A gyűjtőnyirokereknek vékony extracelluláris bevonatuk van, és a periciták csökkentik a nyirok folyadék extravazációját (85). Az abszorbeáló és a gyűjtőerek közötti átmenet fokozatos, a szakirodalom ún. előgyűjtőket ír, amelyek a csomópont előtti gyűjtőerekbe ürülnek egy szabálytalan vagy tekervényes pályával. Az előgyűjtők és a gyűjtőlymphoid erek billentyűkkel is rendelkeznek, amelyek lehetővé teszik az egyirányú nyirokáramlást (86).
16
A nyirokerek nyirokszűrőszervekbe, nyirokcsomókba nyílnak. A központi idegrendszer kivételével minden szerv rendelkezik nyirokrendszerrel és a megfelelő regionális nyirokcsomókkal. A nyirokkapillárisok mind nagyobb erekbe torkollnak, és végül a ductus thoracicus és truncus lymphaticus dexter útján bekerül a nyirok a vénás rendszer alacsony nyomású pontjába, a véna jugularis interna és a véna subclavia összeömlésénél keletkező, ún. angulus venosusba (az előbbi bal oldaliba, az utóbbi a jobb oldaliba). A nyirokkeringés tehát a szövet közti folyadék ama részének elvezetését végzi, amely nem képes felszívódni a vérpályába. A nyirokáramlást különbőző tényezők, mint például a nagyobb nyirokerek falában elhelyezkedősimaizomsejtek kontrakciója, a szövet közti nyomás – turgor -, a vázizom mozgása, illetve a belégzés alatti negatív intrathorakális nyomás szívóereje biztosítja. Az egyirányú áramlás a sűrűn elhelyezkedőés a nagy nyiroktörzsek irányába nyíló billentytűknek köszönhető. Végül a szövetnedv csatlakozik a véráramhoz, ennek azon helyén, ahol a vérnyomás gyakorlatilag a legalacsonyabb értékkel bír. IV/3/2. A nyirokrendszer embriológiája
A lymphoid fejlődés legkorábbi eseménye a Prox-1 transzkripciós faktor expressziója az endothel sejtek egy alpopulációjában, amely burjánzásával és elágazásaival létrehozza a nyirokrendszert (87). A vaszkuláris fenotípus a kezdetleges vénás endothel sejtekben nem jelenik meg; a Prox-1 expresszió során a sejtek egy lymphoid vaszkuláris fenotípust adoptálnak (88). Prox-1 overexpresszió az emberi vaszkuláris endothel sejtekben elnyomja a vérér specifikus géneket (80,89). A Prox gén kiesése egér embriókban az embrionális időszak E14 és E15 napján letális, aminek okaként az embriókban kóros chylust tartalmazó aszciteszt lehetett megfigyelni, a lymphoid vaszkulatúra pedig nem fejlődött ki (87). A Prox-l homeobox gén egyetlen alleléljének funkcionális inaktiválása felnőtteket érintőelhízottsághoz vezet, mivel abnormális módon nyirok szivárog a rossz mintázatú és repedt nyirokedényekből; a Prox-l heterozigótás egerek a felnőtteket érintő elhízottság kiváló modelljei (90). A VEGF-C lényeges kemotaktikai és túlélési tényezőa lymphangiogenezis folyamatában, valamint felelős az elsőlymphoid edény kialakulásáért az embrionális
17
vénákban (91). Egér embriókban a VEGF-C homozigóta deléciója a lymphoidvaszkulatúra teljes hiányához vezet; míg a heterozigóta VEGF-C egerek súlyos lymphoid hiperpláziát mutatnak (91). A VEGF-D deléció nem befolyásolja a lymphoidvaszkulatúra fejlődését, bár exogén VEGF-D hatásra helyreáll a sérült nyirokérfejlődés a VEGF-C- embriókban (91, 92). A VEGFR-3 szignáljai hatására az endothel sejtek valószínűleg lymphoid endothel fenotipus irányába kezdenek differenciálódni (93). A VEGFR-3 deléciója hibás véredény remodellinget és embrionális halált okoz korai véredény diszfunkció révén a vemhesség félidejében (94). A VEGF-C által indukált egér embrionális őssejtek endothel differenciálódásához a VEGFR-2 szignálra van szükség (93). Valószínűleg a FOXC2 transzkripciós tényezőirányíthatja a nyirokér fejlődés érési szakaszát, és fontos szerepe van a nyirokúti billentyűk kialakulásában is (95). Az efrin B2 és az Eph receptoroknak nagy valószínűséggel összetett szerepe van; a valin kivonása az efrin B2 PDZ kötési területről nem befolyásolja az egerek normális vérér szerkezetének kialakulását, de a nyirokerek, és a billentyűk fejlődése zavart szenved (96). A podoplanin hiánya az újszülött egerek bőrében abnormálisan tág és nem működőfelszíni nyirokereket eredményez (97). A Neuropilin 2, amelyet eredetileg a szemaforin receptorának tekintettek, VEGFR-3-on kívül a VEGF-C-hez is kötődik (98). A Neuropilin 2 hiányos egerek a lymphoid hajszálerek súlyos hipopláziáját mutatták a 13. gesztációs héttől a születésig, de normális gyűjtővénákkal rendelkeztek (99); ezen defektusok átmenetiek voltak és a túlélőegerek regenerálták a hajszálereket, hasonlóan a hetrozigota VEGF-C egerekhez. Az angiopoietin-2 hiányos (Ang 2) egerek is hiányosságokat mutattak a lymphatikus vaszkulatúrában, ezeket azonban Ang 1-el meg lehetett menteni (100). Az integrin α1Xβ1 közvetlenül a VEGF-C/D-hez kötődik, amely összefüggést feltételez a VEGFR-3 szignál és az integrin mediált lyphmfatikus endothel sejtek tapadása és migrációja között (101). Valószínű, hogy a syk/slp-76 szignálút is érintett, mivel azok az egerek, melyeknek tirozin kináz Syk protein receptora, vagy ennek ligandja (az elosztó SLP-76 protein) mutációt mutatott, ödémásak lettek, aszciteszük alakult ki, valamint az érintett egerekben arterio-venozus malformaciók voltak megfigyelhetőek (102). A Prox-1-pozitív endothel sejtek migrációja által kialakított primitív nyirok hólyagokból alakulhatnak ki a másodlagos nyirokszervek (nyirokcsomók és a vékonybél Peyer plakkok) (103). Bár a nyirokrendszer fejlődését
18
még nem értjük teljesen, az bizonyos, hogy a Prox-1 és a VEGF-C elengedhetetlen a fejlődéshez, amihez további proteinek is különbözőformában hozzájárulnak. IV/3/3. Nyirokér markerek
Bár a daganatok nyirokúti terjedése gyakori, a kórlefolyást negatívan befolyásoló tényező, a nyirokcsomómetasztázisok kialakulásának mechanizmusait csak a közelmúltban kezdték el tanulmányozni. A nyirokcsomó metasztázisokkal kapcsolatos ismeretek megszerzésének egyik főakadálya egy olyan marker hiánya volt, amellyel a nyirok-endothel specifikusan jelölhetőés tanulmányozható lett volna (104). Az új nyirokér markerek nemrégiben történt azonosítása, amelyek segítségével a szövettani metszetekben pontosan el tudják különíteni a nyirokereket a vérerektől (LYVE-1, podopaplin, -kemokin receptor D6, makrofág mannose receptor, desmopaklin, és D240) (105-107, 83), új távlatokat nyitott az áttétképződés mechanizmusának megértésében. Ezek közül leginkább LYVE-1-et, D2-40-et és podopaplint használják a nyirokér denzitás /nyirokterület mérésére, amelyek túlélés és a nyirokcsomó státusz megbecsülésére szolgáló prognosztikai faktorok. A LYVE-1 a hialuronsav (HA) nyirok-specifikus receptora (106). A LYVE-1 azonban normál máj vér szinuszoidokban is expresszálódik, mind egekben, mind emberekben, illetve azonosították makrofágokon is (108). A mucin-típusú transzmembrán glikoprotein podopaplin egy fokozottan expresszált nyirok-specifikus gén a LECkben(nyirok endothel sejtek) (109, 105), a D2-40 pedig egy új, monoklonális antitest, amely reakcióba lép a magzati csírasejtben jelenlévőonkofoetális antigénnel. Ezek az antitestek ugyancsak hatékonyak a formalinban fixált metszetekben található nyirokerek azonosításában. IV/3/4. A nyirokrendszer szerepe az áttétképződésben
A daganatsejtek először a nyirokrendszeren keresztül kerülnek be a regionális nyirokcsomókba. A regionális nyirokcsomók daganatos statusa fontos paraméter a staging meghatározásakor, és előre jelzi a beteg túlélési esélyeit, valamint segít meghatározni a kezelési módot. Bár a nyirokcsomóáttétek nem felelősek közvetlenül a
19
daganatos halálozásért, a daganatsejtek a nyirokcsomókból eljuthatnak távoli szervekbe, amelyekben kialakuló metasztatikus tumor megzavarhatja az érintett szerv funkcióit, így közvetve mégis felelősek lehetnek a beteg haláláért. A fenti okfejtés még nem igazolódott minden kétséget kizáróan, azonban azok a klinikai adatok, amelyek szerint javult a beteg túlélési esélye a regionalis nyirokcsomók eltávolítása után, közvetve alátámasztják ezt a modellt. Az őrszem nyirokcsomó biopsziáról és a regionalis blockdisszekcióról bebizonyosodott, hogy csökkenti a nyirokcsomó metasztázis kiújulását, és meghosszabbítja a tünetmentes túlélési időszakot, így bizonyos daganatoknál ma már az elfogadott kezelési metódust jelenti. A primer tumor elhelyezkedésének megfelelőregionális nyirokcsomólánc elsőtagját őrszem nyirokcsomónak nevezzük. Az őrszem nyirokcsomót lymphoszcintigráfiás vizsgálattal ill. metilénkék festék segítségével identifikálhatjuk. Jelen ismereteink szerint ezen nyirokcsomó tumormentessége a régió tumormentességét jelenti, elhanyagolható százalékban figyeltek meg „skip”metasztázist, tehát az őrszem nyirokcsomót „átugró”, a regionális lánc távolabbi nyirokcsomójában megjelenő metasztázist. Az őrszem nyirokcsomó biopszia egyrészt információt szolgáltat az esetleges nyirokúti terjedésről, másrészt negativitása esetén elkerülhetővé teszi a régió összes, nem daganatos nyirokcsomójának felesleges eltávolítását. Az őrszem nyirokcsomó biopszia elfogadott rutineljárás emlőrák, melanoma malignum, peniszrák, anuskarcinoma kezelésénél. A nyirokér invázió (LVI) egy fontos paraméter a metasztázis kialakulás kockázatának meghatározásában. Számos kutatás bebizonyította, hogy az LVI jelentősen növelte a nyirokcsomómetasztázis kialakulás, a relapszus, a távoli áttét kialakulás veszélyét. Melanoma malignumnál az LVI a nyirokcsomó metasztázist adó esetek 57%-ban volt kimutatható, míg csak 12%-ban ott, ahol a daganat a bőrre lokalizálódott. A távoli áttéteket az LVI pozitív betegek 74%-ában voltak kimutathatóak, míg a LVI negatív betegeknél ez az arány 22% volt (110). Melanoma malignumnál a nyirokér invázió 25%-os 5 éves túlélési aránnyal jár együtt, míg a nyirokrendszer érintettsége nélkül ez az arány 50% (111). Az LVI kedvezőtlen prognózist jelez emlőrák (112, 113), gyomorrák (114, 115), hólyagrák (116), prosztatarák (117), vastagbél (118) - és végbélrák (119), és endometrium karcinóma (120) esetén. A nyirokcsomó negatív tumoroknál a nyirokér invázió egy független, negativ prognosztikai tényezőa regionális
20
és távoli áttétek kialakulásának valószínűségére vonatkozóan. Végül, ami a legfontosabb, hogy az LVI fordítottan arányos a túléléssel emlőrák, gyomorrák, hólyagrák, és prosztatarák esetén. Nemrégiben a nyirokér sűrűséről (LVD, Lymphatic Vessel Density) kiderült, hogy egy másik ígéretes mutatója lehet a beteg kórjóslatának (121, 122). Egyre több tanulmány mutatja ki az összefüggést a beteg túlélése és a nyirokér sűrűség között különböző daganat típusoknál. A magas LVD a helyi és távoli áttétek előfordulásának gyakoriságával és rossz túlélési eséllyel függ össze melanoma malignum, emlőrák, tüdőrák, vastagbél-, gyomor- és méhnyálkahártya rák esetén (121, 122). A tumoros lymphangiogenezis mennyiségi meghatározása korai kórjóslatot tehet lehetővé, és különösen előnyös lehet olyan tumoros betegeknél, akiknél nincs nyirokcsomó érintettség. Bár a lymphangiogenezis rossz kórjóslattal jár, és kimutatták, hogy elősegíti az áttétek kialakulását sok állat modellben (122, 86, 123), nem világos az a mechanizmus, hogy az újonnan képződött nyirokerek hozzájárulnak-e a tumoros progresszióhoz. A nyirokerek inváziója a tumorba növelheti az áttétek kialakulásának valószínűségét azáltal, hogy növeli annak lehetőségét, hogy a daganatsejtek elhagyják a primer tumort. A daganatos nyirokerek emellett elősegíthetik a gyorsan burjánzó daganatsejtek által termelt toxikus metabolitok szállításának fokozódását a tumorból. Egyes tanulmányok rámutatnak, hogy a daganatos nyirokerek hátrányosan befolyásolták az oldott anyagokra és makromolekulákra vonatkozó szállítási funkciót (124). Ebben az esetben a nyirokér funkció megváltozása azt eredményezheti, hogy megváltozik a daganat mikrokörnyezete a nyirokerek közelében, így növelve az áttétképződés kialakulásának esélyét. Ezen kívül a nyirok endothel sejtek (LEC-k) elősegíthetik, hogy a daganat még gyorsabban terjedjen, azáltal, hogy hozzájárulnak a daganatos sejtek vándorlásához és behatolásához a nyirokerekbe. IV/3/4/1. A nyirokerek aktiválása a nyirokcsomókban
Nemrégiben megjelent tanulmányok kimutatták, hogy a lymphangiogenezis nem csak az elsődleges daganat helyén fordul elő, hanem az őrszem nyirokcsomókban is. Az egér laphámsejtekben VEGF-A-t, vagy VEGF-C-t overexpresszáló és kémiailag indukált karcinogenezis protokollnak alávetett transzgenikus egerekben növekedett a nyirokér
21
hálózat a regionális nyirokcsomókban (82, 125). Figyelemre méltó, hogy a nyirokcsomóban lymphangiogenezist figyeltek meg még a metasztázis kialakulása előtt. Ehhez hasonlóan, daganat által előidézett őrszemnyirokcsomó lymphangiogenezist mutattak ki, az orr-garat rák és melnoma malignum áttéteinek kialakulása előtt (126, 127). A P19/Arf és p53 hiány összefügg a fokozott nyirokcsomó lymphangiogenezissel (128). A papilloma-hordozó p19/Arf és p53-hiányos egereknél a nyirokcsomó lymphangiogenezis jelentősen felgyorsult, ami együtt járt azzal, hogy ezen tumorok malignizálódási és áttétképzőhajlama fokozódott. Emlőrákos betegeknél, akiknek pozitív volt az őrszem nyirokcsomójuk, a fokozott nyirokcsomó lymphangiogenezis együtt járt a regionális nyirokáttétek gyakoriságának növekedésével (129, 130). Bár néhány daganatos modellben a nyirokcsomó lymphangiogenezis összefüggött az áttétképződéssel, a lymphangiogenezis nem csak a rosszindulatú dagantok sajátossága. Lymphangiogenezist figyeltek meg jóindulatú dagantok regionális nyirokcsomóiban, és gyulladásban is (82, 125, 128). A nyirokér hálózat bővülését figyelték meg immunizált nyirokcsomókon belül, amelyekben a B sejtekre kimutathatóan szükség volt a folyamathoz (131). Mindezek alapján úgy tűnik, hogy a nyirokcsomó lymphangiogenezis lényeges eleme a normál szöveti immunválasznak, ami viszont, paradox módon, hozzájárul a tumor metasztázis kialakuláshoz. IV/3/4/2. A tumorsejtek nyirokerekbe történőbelépésének mechanizmusa
He és mtársai megvizsgálták (132), hogy a tumor sejtek hogyan jutnak be a nyirokerekbe. A tumor sejtek által termelt VEGF-C hatására a nyirokerek burjánzásba kezdtek a tumor sejtek irányába, a drenáló nyirokerek dilatáltak, a nyirokér növekedés mértéke megnőtt a tumor xenotranszplantációját követő2. és 3. hét között, ami egyidejű nyirokáttét kialakulást is okozott. Ezeket a folyamatokat dózisfüggően meg lehetett akadályozni a VEGFR-3 szignál blokkolásával. Azonban a nyirokcsomó áttét kialakulását nem lehetett megakadályozni, ha az anti-VEGFR3 szolúbilis antitestet azután alkalmazták miután a tumor sejtek már szétterjedtek. Ez arra engedve következtetni, hogy a tumor sejtek belépése a nyirokerekbe egy kulcs lépés a tumor nyirokúti terjedésében. Annak ellenére, hogy a lymphangiogenesis-t és a nyirokcsomó metasztázis kialakulást jelentősen gátolta a VEGFR-3 ellenes antitest, egy-egy
22
tumorsejtet még így is kimutattak a nyirokcsomókban. Ez azt jelzi, hogy a nyirokúti metasztázis kialakulásának teljes blokkolásához valószínűleg mind a tumor lymphangiogenesist, mind a tumor sejt inváziót meg kell akadályozni. Wong és mtársai kimutatták, hogy VEGF-C iRNS módszerrel az általuk használt xenograft tumor modellekben a lympangiogenesis 99 százalékkal csökkent, de a VEGFC gátlás nem befolyásolta a nyirokcsomó metasztázisok kialakulását, jelezve, hogy bár a tumorok által szekretált VEGF-C szükséges a lymphangiogenesishez, de a lymphangiogenesis nem szükséges a nyirokcsomó metasztázisok kialakulásához (133). A tumor sejtek fiziológiás chemokin receptor ligand kölcsönhatásokat is használhatnak a metasztázisok kialakulásakor. A humán emlőrák CXCR4 és CCR7 chemokine receptorokat expresszál, és az ezekhez tatozó ligandok, a CXCL12 (stromal-cell derived factor-1) és CCL21 (secondary lymphoid chemocine) nagymértékben expresszálódnak azon szervekben, ahol az emlőrák áttétei kialakulnak (134). Az izolált LEC-k CXCL12t és CCL21-t is expresszálnak, ami arra enged következtetni, hogy a tumor sejteket a chemokinek szekréciója által képesek vonzani (135). Ehhez hasonlóan, a nyirokér endothel szekretálja a CCL21 chemokint (secondary lymphoid chemocine), amely kötődik a CC kemokine 7-es receptorhoz, ami a kifejlett dendritikus sejtek kemotaxisát és a bőrből a nyirokcsomóhoz történőmigrációjukat segíti; a CC chemokine 7-es receptor néhány melanóma malignum sejt vonalban is expresszálódik (136). Összegzésként, a VEGF-C/VEGF-D a VEGFR-3 receptorokon keresztül elősegíti a nyirokúti áttétképződést. Ez jelenthet intratumorális vagy peritumorális lymphangiogenezist, vagy a tumor-nyirokendothelsejt közötti kapcsolatok finomabb szabályozását. IV/3/4/3. Lymphangiogenezis és nyirokcsomómetasztázis
Sokáig feltételezték, hogy a nyirokcsomómetasztázisok kialakulása passzív folyamat, melynek során tumorsejtek jutnak el a nyirokcsomókba a nyirokáramlás természetes útjain keresztül (137). Azonban az elmúlt néhány évben nyilvánvalóvá vált, hogy az egyik mechanizmus, amely a regionális nyirokcsomó metasztázis kialakulását szabályozhatja, az a tumor-indukált lymphangiogenezis, az új nyirokerek kialakulása, amely egy komplex növekedési faktor, citokin és kemokin hálózat által szabályozva
23
aktívan hozzájárulhat a tumor metasztázis megjelenéséhez (139-140). Azt az általánosan elfogadott nézetet, hogy a tumorszövetben nincsen lymphangiogenezis, az újabb tanulmányok megkérdőjelezik (141, 142). Számos genetikai és xenograft tumor modellen végzett kísérlet utal arra, hogy a lymphangiogén növekedési faktorok expressziója vezetett az új, daganatos nyirokérrendszer kialakulásához akár intratumorálisan, akár a tumor periférián. Ehhez társult a nyirokcsomómetasztázisok növekvőszáma és, egyes esetekben, a távoli metasztázisok kialakulása (140, 143, 144). A múltban a nyirokerek tanulmányozását megnehezítette a specifikus nyirokendothel markerek hiánya, nehéz volt megkülönböztetni a vérereket a nyirokerektől. Azonban az elmúlt években az LYVE-1, a Prox-1, és podoplanin nyirok-markerek felfedezésével ezen probléma megoldódott (145, 146). Ezek a markerek lehetővé tették a lymphangiogenezis klinikopatológiai vizsgálatát. Az új bizonyítékok arra utalnak, hogy a tumorsejtek metasztázisuk kialakulása előtt is előidézhetnek nyirokcsomó lymphangiogenezist, valamint, hogy a metasztatikus daganatsejtek folytatják a nyirokér növekedés indukálását a sentinel nyirokcsomókon belül, elősegítve a további metasztatikus disszeminációt (147, 82, 1269). Számos klinikopatológiai vizsgálat közvetlen összefüggést mutatott ki a VEGF-C/-D expresszió és a humán tumormetasztázis kialakulása között (148, 149). Az utóbbi időben megpróbálták megmagyarázni a tumorszövetek és az intratumorális nyirokerek (ITL) vagy a peritumorális nyirokerek (PTL) közti kölcsönhatást, amelyek nyilvánvalóan szükségesek a rosszindulatú sejtek szervezeten belüli elterjedéséhez. Néhány lényeges pont azonban továbbra is ellentmondásos maradt. Sok szerzővéli úgy, hogy a nyirokcsomó metasztázis kialakulás kizárólag peritumorális nyirokereken keresztül lehetséges, mivel az intratumorális nyirokerek – az intratumorális magas kötőszöveti nyomás miatt - esetleg nem funkcionálnak (104, 141). Néhány tanulmány azonban igazolta az intratumorális nyirokedények jelenléte, nyirokúti inváziója, valamint a fejnyaki laphámkarcinómával (150), melanomával (142), és papilláris pajzsmirigykarcinómával (151) operált betegek rossz prognózisa közti összefüggést. Noha a tanulmányok többsége arról számol be, hogy az intratumorális nyirokerek nem működnek, bizonyos tanulmányok viszont keringőnyirokendothel sejtek és tumor embolus jelenlétét igazolták az intratumorális nyirokerekben (152). Ezek az ellentétek valószínűleg a tanulmányozott tumormodellek közti különbségekből adódnak.
24
Mindamellett, egyes modellekben a nyirokcsomóban kialakult metasztázis tumor lymphangiogenezis hiányában jött létre, talán a tumor kialkulása előtt már egzisztáló PTL-eken keresztül, jelezvén, hogy a PTL-ek elégségesek lehetnek a tumorsejtek helyi és távolabbi nyirokcsomókba történőeljuttatásához (133). A jövőben fontos lesz meghatározni mely tumorok metasztatikus terjedése függ a lymphangiogenezistől és mely lymphangiogén növekedési faktorok szükségesek ezen folyamatokhoz. IV/3/5. Tumor lymphangiogenezis és lymphangiogén növekedési faktorok
Két lymphangiogén molekula, a VEGF-C és VEGF-D érendotheliális növekedési faktor, valamint receptoruk, a VEGFR3 felfedezéde új areát nyitottak a nyirokrendszer tanulmányozásában (153). Az elmúlt néhány évben számos tanulmány igazolta, hogy a VEGF-C és VEGF-D lymphangiogén növekedési faktorokat expresszáló tumorok által okozott lymphangiogenezis képes metasztázis képződést generálni a regionális nyirokcsomókban. A nyirokerek megnövekedett sűrűsége növeli az esélyét, hogy az invazív tumorsejtek bejussanak a nyirokrendszerbe és eljussanak a regionális nyirokcsomókhoz. A tumornövekedés közbeni lymphangiogenezis molekuláris mechanizmusainak tanulmányozásában tett fejlődés reményre ad okot új célzott kezelések kifejlesztésére a nyirokcsomó és/vagy zsigeri metasztázis kialakulásának megelőzésére (138). A következőkben vázoljuk azon lymphangiogén növekedési faktorok bővülőlistáját, amelyek lényegesek lehetnek a tumor lymphangiogenezis szempontjából. Ezek a molekulák fontos potenciális célpontjai lehetnek a nyirokcsomómetasztázis kialakulást tumor lymphangiogenezis blokkolással gátló kezeléseknek. IV/3/5/1. VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3 jelátviteli tengely
A legrészletesebben tanulmányozott lymphangiogén szignál rendszer a VEGFC/VEGF-D/VEGFR-3 jelátviteli tengely. A VEGFR-3 egy sejtfelszíni receptor tirozin kináz, amely a felnőtt szervezet nyirokendothel sejtfelületén expresszálódik (154). Ligandjai a VEGF-C és VEGF-D, a VEGF család tagjai (155, 156). A VEGF-C és VEGF-D szekréciója biológiailag alacsony aktivitású proteinek formájában történik. Az
25
N- és C-terminál egymást követőproteolízise növeli a ligandumok affinitását a VEGFR-3 iránt. Ezt a proteolízist (a VEGF-D és VEGF-C esetében) a plazmin és a proprotein konvertáz család enzimei, a PC5, PC7 és (a VEGF-C esetében) a furin (157) katalizálja. VEGFR-3 ligandjai által történt aktiválása a receptor heterodimerizációját, valamint intracelluláris tirozin kináz doménjének aktiválódását és intracelluláris szignáltranszdukciót idéz elő, amely a nyirokendothel sejtek proliferációjához vezet. A VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3 tengely lymphangiogén aktivitását számos transzgén illetve génablációs in vivo és in vitro modellben kimutatták (157). A tumorsejtek VEGF-C és/vagy VEGF-D overexpressziója a xenograft vagy transzgenikus tumormodellekben fokozta a peritumorális és/vagy intratumorális lymphangiogenezist, a regionális nyirokcsomó metasztázis kialakulást, és egyes tanulmányok szerint távoli szerv metasztázist okozott (138, 140, 141). A VEGF-C/VEGFR-3 tengely fokozza a ráksejt mobilitását és invazív készségét, valamint hozzájárul a daganatsejt metasztázis kialakulásához különböződaganatos betegedéseknél, mint például a tüdőrák, emlőrák, méhnyakrák, prosztatarák és kolorektális rák (158). Ezen szignál utak blokkolása csökkentette a nyirokerek számát a tumorokban és a nyirokcsomó metasztázis előfordulási gyakoriságát egyes tumormodellekben (143, 144, 159, 132). Az előbb idézett tanulmányok azt sugallják, hogy humán tumorok esetében eredményes lehet a szignálút blokkolása a metasztázis kialakulás gátlás érdekében. A VEGF-C/VEGFD/VEGFR-3 tengely szerepét humán tumorok esetében szintén vizsgálták az elmúlt években. A kutatások többsége összefüggést talált a tumorsejtek VEGF-C/-D expressziója és a nyirokrendszeri terjedés, nyirokcsomó metasztázis, illetve távoli metasztázis kialakulás között, habár számos ellentmondásos eredmény is ismert (138, 152). A VEGF-C/-D elősegítheti a metasztázis kialakulását a nyirokendothelsejtekkel kapcsolatban álló tumorsejtek felületének növelése révén az ér permeabilitás fokozása és/vagy a nyirokendothelsejt adhéziós tulajdonságok vagy a citokin/kemokin expresszió megváltoztatása által (160). Más tanulmányok kimutatták, hogy a tumorsejtek expresszálhatnak VEGFR-3-at és hogy a VEGFR-3 szintén egy kedvezőtlen prognosztikai faktor (160, 161). Két tanulmány igazolta a tumorsejtek VEGF-C expressziójának negatív hatását a túlélésre, azonban a nyirokcsomó metasztázisok kialakulása és a VEGF C expresszió között nem talált korrelációt (161, 163). Az
26
ellentmondásos eredmények némelyike azzal magyarázható, hogy szinte minden humán tumoron végzett tanulmány kizárólag a tumorsejtekben vizsgálta a VEGF-C vagy VEGF-D expresszióját, holott bizonyított, hogy ezeket a faktorokat makrofágok, perivaszkuláris stróma sejtek és vérlemezkék is szekretálják (164). Ezért további tanulmányok szükségesek, hogy pontosabban meghatározhassuk a VEGF-C/VEGFD/VEGFR-3 tengely szerepét a humán tumorokban. IV/3/5/2. Egyéb lymphangiogén növekedési faktorok
A VEGF család tagjain kívül, egyéb növekedési faktorokról - mint az FGF-2, Ang-1, Ang-2, és PDGF-ek - szintén kimutatták, hogy in vivo lymphangiogenezist indukálnak. IV/3/5/2/1. Cyclooxigenáz-2 (COX-2)
A cyclooxigenáz (COX) egy kulcsfontosságú enzim, amelynek az arachidonát prosztaglandinokká (PGs) és thromboxánná történőátalakításában van szerepe. Az enzim két jelentős izoformját azonosították: COX-1 és COX-2. A COX-1 „háztartási” génként ismert, konstitutívan expresszálódik a legtöbb szövetben, fiziológiás funkciók és a gyulladás szabályozásában van szerepe (165). A COX-2 expresszióját különböző stimulusok, mint például gyulladás, citokinek, tumor promóterek, és növekedési faktorok fokozzák (166, 167). A konstitucionális COX-2 expressziót sok tumorban megfigyelték és a tumor agresszivitásával, valamint a rossz prognózissal függött össze (167). Némely adat arról tanúskodik, hogy a COX-2-nek a tumor angiogenezisben, az apoptózis kivédésében, tumor terjedésben, metasztatikus folyamatokban és az antitumor immunitásnak történőellenállásban van szerepe (168). A COX-2-ről nemrégiben kiderült, hogy a VEGF-C szabályozója tüdőadenokarcinómában (169) és emlőrákban (170), amely arra enged következtetni, hogy a lymphangiogenezisben promóter szerepet tölt be. Számos humán tumoron végzett vizsgálat összefüggést mutatott a tumor sejtek VEGF-C és a COX-2 expressziója között, valamint a VEGF C és COX 2 expresszió illetve a nyirokérdenzitás és a nyirokúti terjedés között (169-171). A cyclooxigenáz-2 inhibitorok nagyon ígéretesnek tűnnek az in vitro anti-lymphangiogenezis kezelés terén (172). A cyclooxigenáz-2 inhibíció csökkenti a tumor növekedést emlőrák xenograft
27
modellben, és potenciálisan csökkentheti a daganat kiújulás veszélyét az Akt inaktiválása és nyirokér képzés gátlása által (173) IV/3/5/2/2. Fibroblaszt növekedési faktor-2
Az FGF-2 egy heparin-kötőprotein, amely különféle sejttípusok proliferációját és differenciálódását indukálja (174). Az FGF-2 képes mind angiogenezist, mind lymphangiogenezist indukálni és szabályozza a VEGF-C és VEGF-D expressziót egér szaruhártya kísérletben (175, 176). VEGFR-3 antitest blokkolja az FGF-2-indukált lymphangiogenezist, bizonyítva, hogy az FGF-2 nyirokér növekedést idéz előa VEGFC/VEGF-D/VEGFR-3 jelátviteli tengelyen keresztül (175, 177). Egyes tanulmányok szerint az FGF-2 tumor lymphangiogén aktivitása a nyirokendothel sejtekben elsősorban az Akt/mTOR (mammalian target of rapamycin)/p70S6 kináz útvonalon, valamint a tumorsejtek és a nyirokendothel FGF-2 receptorainak aktív kölcsönhatásán keresztül valósul meg (178). IV/3/5/2/3. Angiopoietinek és Tie 1/Tie 2
Az angiopoetinek az endothel sejt felület receptor tirozin kináz Tie2 ligandjai. Míg az Ang-1 aktiválja a Tie2-t és a véredények stabilizációjának és remodellingjének pozitív szabályozójaként szolgál, addig az Ang-2 gátolja a Tie2-t és az angiogenezis negatív szabályzójaként funkcionál. Az Ang-1 az embrionális vaszkuláris fejlődés szempontjából fontos, az Ang-2 nélkülözhetőugyan ebben a folyamatban, de a posztnatális vaszkuláris remodellinghez szükséges (179). Nemrégiben az Ang1-ről és Ang2-ről kiderült, hogy a nyirokerek képződését szabályozzák Tie2 receptorukon keresztül (180, 100). Az embrionális fejlődés során az Ang-2 elvesztése a nyirokér hálózat jelentős mintázat- és működésbeli hiányosságaihoz vezet, amelyet az Ang-1 korrigálhat, jelezvén, hogy az Ang-2 kulcsfontosságú a nyirokér fejlődés szempontjából (180). Egyes jelentések szerint az Ang-1 egér szaruhártya modellen lymphangiogenesist (100) és nyirokér hiperpláziát idéz elő, amikor transzgénikus egerek bőrében expresszálódik vagy amikor vírusos expresszió vektorokon keresztül kerül az egér bőrébe (181). A nyirokerek Ang-1-indukált növekedését a VEGFR-3 egyik szolubilis
28
formája blokkolja, jelezvén, hogy a VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3 tengelynek szerepe van az Ang-1-által közvetített lymphangiogén jelátvitelben (181). Az Ang-1 lymphangiogén hatása közvetett: a nyirokendothel sejtek fokozott VEGFR3 expressziója révén érvényesül. IV/3/5/2/4. Thrombocyta növekedési faktorok (PDGF-ek)
A PDGF-ek szekretált dimer glycoprotein ligandok, melyeknek biológiai aktivitását három tirozin kináz receptor szabályozza. Ezek két géntermék által kódoltak, a PDGFRA és a PDGFR- B által (182). Öt különböződiszulfid-kötésűdimer létezik, ideértve a három régebbről ismert dimer változatot, a PDGF-AA-t, a PDGF-AB-t és a PDGF-BBt, valamint a homodimerek két új tagját: a PDGF-CC-t és a PDGF-DD-t (183). A PDGF család tagjai gyakran expresszálódnak a daganatos sejtekben (182). A PDGF receptorok jelátvitele a tumorbiológia több területén fontos szerepet játszik, ideértve a daganatos sejtek burjánzásának autokrin stimulálását, a tumor angiogenezis serkentését, valamint a strómális fibroblastok regrutálását (182). Egy egér fibrosarcomát vizsgáló tanulmány kimutatta ezen PDGF-BB indukálta lymphangiogenezis megjelenését, mely intratumoralis nyirokerek kialakulását okozta, illetve amely a nyirokcsomókban fokozott metasztázis kialakuláshoz vezetett (184). Ezen tanulmány szerint a PDGF-BB in vivo ugyanolyan hatásosan működhet a daganatos sejteken belüli lymphangiogenezis kiváltásában, mint a VEGF-C, anélkül, hogy a VEGF-C/-D/VEGFR- 3 szignálútvonalon keresztüli mediáció szükséges lenne (184). Így a különbözőPDGF gátlók kifejlesztése fontos terápiás lehetősséggé válhatnak a daganatos betegségek kezelésében. IV/3/5/2/5. IGF (Insuline Like Growth Factor)
Az IGF jelátviteli rendszer két szekretált ligandból (IGF-1 és IGF-2), két sejtfelszíni receptorból (IGF-1R és IGF-2R), és számos IGF-kötőproteinből (IGFBP-k) áll (185, 186). Mind az IGF-1 és az IGF- 2 angiogenezist indukált számos in vitro és in vivo kisérletben (187, 188). Az IGFBP-k szabályozhatják az IGF-ek biológiai aktivitását (189). A sejtnövekedést elősegítőtevékenységükön kívül az IGF-ek egyszersmind
29
hatékony túlélési faktorokként is működnek, melyek meggátolhatják a daganatos sejtekben, a vérerek endothel sejtjeiben és a nyirokrendszer endothel sejtjeiben a sejtszintűapoptózist (190, 191). Egy nemrégiben megjelent tanulmány igazolta az IGF1 és IGF-2 által kiváltott proliferációt és chemotaxist a nyirok endothel sejtjeiben, mely IGF-1R és IGF-2R expresszióját eredményezi a felszínen (185). Mind az IGF-1-ről és IGF-2-ről egér szaruhártya kísérlet során kimutatták, hogy hozzájárulnak a nyirokerek növekedéséhez, és hogy az IGF-1 által indukált lymphangiogenezist nem lehetett szolúbilis VEGFR-3-al gátolni, mely arra utal, hogy az IGF-1 hatására fellépő lymphangiogenezis független a VEGF-C/VEGF-D/VEGFR- 3 jelátviteli tengelytől (185). Az az eredmény, hogy az IGF-1 és az IGF-2 serkenti a lymphangiogenezist, az IGF-eknek a daganatos sejtek növekedése terén betöltött összetett szerepére enged következtetni. Ugyanakkor, Lewis tüdőkarcinoma modell vizsgálata során azt találták, hogy az IGF-1R aktivitás VEGF- C expresszió fokozódáshoz és nyirokcsomó metasztázis kialkuláshoz vezetett, melyből arra következtethetünk, hogy ez a receptor pozitív VEGF-C szabályozóként is működhet, és ezáltal elősegítheti a nyirokrendszeri metasztázisok kialkulását (192). Bár ezek az adatok azt jelzik, hogy az IGF-ek fontos szerepet játszhatnak a lymphangiogenezisben, további kísérletek szükségesek annak meghatározására, milyen szerepet játszik pontosan az IGF a daganatok nyirokérrendszerének működésében és a nyirokcsomó metasztázisok kialakulásában IV/3/5/2/6. Hepatocita növekedési faktorok (HGF)
A HGF különbözőmesenchymalis eredetűsejt által szintetizált glycoprotein (193, 194). A HGF (mely „scatter factor” néven is ismert), a máj regenerálódásának elősegítője, hozzájárul több sejttípus migrációjához és proliferációjához (különösen az endothel sejtekéhez) valamint részt vesz a szövetek regenerálódásában és a tumorok terjedésében. Aktivitását úgy fejti ki, hogy egy sejtfelszíni receptorhoz, egy tirozin kinázhoz kötődik, melyet HGF-R vagy c-Met-ként ismerünk. Több tanulmány utalt a cMet expresszió vagy a c-Met aktivizáló mutációk előfordulása és a rák metasztatikus terjedése között fennálló összefüggésre (195). Egy nemrégiben készült tanulmány arról számol be, hogy c-Met expresszálódott nyirokendothel sejteken a nyirokendothel regenerációja során. In vitro a HGF elősegíti a nyirokendothel sejtek proliferációját,
30
migrációját és tubulusképzését, a VEGF-C/VEGF-D/VEGFR- 3 tengely szignáljaitól függetlenül. In vivo a HGF transzgenetikus egér kísérletekben serkenti a lymphangiogenezist, mely arra utal, hogy működhet lymphangiogén növekedési faktorként, valamint nagy valószínűséggel a tumor lymphangiogenezist előidézőegyik molekula lehet (193). Egy másik tanulmányból kiderül, hogy a tumorsejtek által kiválasztott HGF képesnek látszott a PTL-ek növekedését stimulálni a VEGFR-3mediált szignálúton keresztül (196). Ennek megerősítésére további, ezt alátámasztó kísérletre van szükség IV/3/5/2/7.Vaszkuláris Endotheliális Növekedési Faktor-A (VEGF-A)
A VEGF-A egy specifikus vér angiogén faktor, mely a véredények endotheliumán expresszálódó VEGFR-1 és a VEGFR-2 tirozin kináz aktivitású sejtfelszini receptorok aktiválásán keresztül fejti ki hatását (197). VEGFR- 2 expressziója egyes nyirokerek endothel sejtjein is megfigyelhető(198) . Számos állatkisérletes tanulmány szerint bizonyítást nyert a VEGF-A szerepe a lymphangiogenezis indukálásában (82, 199, 200). Egy kémiai úton indukált bőr carcinogenezis modellben a VEGF-A nemcsak hogy elősegítette a többlépcsős bőr carcinogenezist, hanem már a metasztázis megjelenése előtt a tumorral asszociált nyirokerek proliferációját és a sentinel nyirokcsomó lymphangiogenezisét idézte elő(82). Hasonlóképpen, egy egereken végzett tumor xenograft kísérletben, a fibrosarcomás sejtek VEGF-A expressziója hozzájárult a peritumorális nyirokerek növekedéséhez és a nyirokcsomó metasztázis kialakulásához (201). Számos klinikai tanulmány számol be összefüggésről a tumor sejtek VEGF-A expressziója és a nyirokcsomó metasztázis kialakulása között a végbél – és vastagbél rák, a nyelőcsőrák, valamint fej-nyaki laphámkarcinomák esetén (202,-204). Mindazonáltal ellentmondó eredményekre jutottak számos lymphangiogenezist vizsgáló állatkísérlet után. A VEGF-A nem serkentette a lymphangiogenezist, vagy nyirokcsomó metasztázis kialakulását a 293EBNA sejt xenograft kísérletben, míg a VEGF-D megjelenése mindkét hatást eredményezte (143). A VEGF-A nem serkentette a nyirokcsomó metasztázis kialakulását transzgenikus pancreas tumor kísérletben sem (205). Ezek a látszólag ellentmondó eredmények valószínűleg a peritumorális nyirokendothel sejtek eltérőVEGFR-2 expressziójával, az expresszált VEGF-A
31
izoformok más és más típusával, illetve a VEGF-A által odavonzott stroma sejtek különbözőségével magyarázhatóak (157). A molekuláris mechanizmus, melynek segítségével a VEGF-A serkenti a tumor lymphangiogenezist valamint a metasztázisok kialakulását még nem egyértelműen tisztázott, így lehet direkt vagy indirekt is (76): direkt a nyirok endothel sejtek felszínén történőVEGFR- 2 aktiválásán keresztül, vagy indirekt az intratumorális makrofágok megnövekedett VEGF-C és VEGF- D szekréciója révén. IV/3/5/2/8. Nitrogén oxid (NO)
A NO három nitrogén-oxid szintáz (NOS) izoform segítségével keletkezik. Ezek a kalcium dependens endotheliális NOS (eNOS), az indukálható NOS (iNOS), és neurális NOS (nNOS) (206). A NO egy sor jelátviteli folyamatot szabályoz. Az érrendszerben megfigyelhetőNO hatások közé tartozik a vazodilatáció és az érfal megnövekedett permeabilitása (207). A szolúbilis guanilát cikláz (sGC) a NO egyetlen ismert fiziológiai receptora. A szolúbilis guanilát ciklázok fontos szerepet töltenek be a normál és a patológiás érrendszeri angiogenezis szabályozásában (208), illetve a szolúbilis guanilát cikláz blokkolása képes gátolni a neovaszkularizációt a csirke chorioallantois membrán modellben (209). Közelmúltban készült tanulmányok kimutatták, a nyirok endothel sejtekben NO képződik és szabadul fel, mely valószínűleg a nyirokpermeabilitást és áramlást szabályozza, valamint, hogy az iNOS aktivitás a daganatos sejtekben összefüggésbe hozható a VEGF-C és VEGF-D lymphangiogén növekedési faktorok expressziójával (210-212). Kajiya és munkatársai azt találták, hogy az LEC-k specifikusan expresszálják a szolúbilis guanilát ciklázok a1b1 izoformáját, hogy a VEGF-A hatékonyan indukálja a sGCa1b1-t termelődését, illetve, hogy a NO által indukált LEC proliferáció, migráció és a cGMP termelés az LEC-kben specifikusan az sGCa1b1 aktivitásának függvénye. Ezen túlmenően a sGC inhibitor, az NS-2028 teljes mértékben meggátolja az UV B-sugárzás által kiváltott nyirokér növekedést, ödéma kialakulást és bőrgyulladást in vivo körülmények között. Ezek az eredmények a NO/sGCa1b1/cGMP útvonal központi szerepét támasztják alá a nyirokér funkciók szabályozásában. A sGCa1b1 szignálút blokkolása új terápiás stratégia lehet a lymphangiogenezis gátlás területén (213).
32
IV/3/6. A gyulladás szerepe a lymphangiogenezisben
A nyirokerek számos fiziológiás és patológiás folyamatban játszanak szerepet, úgy mint a sebgyógyulásban, a krónikus gyulladásokban és tumorok szóródásában (76). A tumorokban tapasztalt gyulladásos válaszreakciókból általában a rosszindulatú folyamatokra és a metasztázisra lehet következtetni (214). A gyulladt területeken az aktivált leukociták nagy számban termelnek növekedési faktorokat, ideértve a FGF, VEGF, és PDGF család tagjait, amelyek stimulálhatják a proliferációját, migrációját és a túlélését az egyes LEC-knek. A makrofágokról kimutatták, hogy kettős szerepet játszanak a gyulladás által indukált lymphangiogenezis szabályozásában: VEGF-C és D szekréciójuk révén lymphangiogenezist indukálnak, ugyanakkor képesek transzdiffernciálódás révén nyirokérendothel sejtekké alakulni, hogy aztán beépüljenek a nyirokerek endothel rétegébe (215-217). Egy egér kornea modellben Cursiefen és munkatársai azt fedezték fel, hogy a VEGF-A VEGFR-1 receptor aktiválásával odavonzza a makrofágokat a sebesülés helyére, majd az aktivált gyulladásos sejtek VEGF-C-t és VEGF-D-t termelnek, mely által lymphangiogenezist indukálnak (199). Egyre több bizonyíték mutatja, hogy a nyirokerek is aktívan részt vesznek az akut és krónikus gyulladással járó megbetegedésekben. A krónikus pikkelysömör, a psoriázis, jellegzetes tünete a bőrön határozottan jelentkezőlymphoid hyperplasia, valamint az egerekben fellépőkrónikus bőrgyulladás tüneteként is ismert a LEC proliferáció és a lymphoid hyperplasia (218). Ezen túlmenően a veseátültetés során fellépőkilökődést is gyakran kíséri lymphangiogenezis (219), és az újonnan képződött nyirokerek termelik a szekunder chemokineket (SLC/CCL21), amelyek vonzzák a CCR7 lymphocitákat és dendritikus sejteket (216). Krónikus légúti gyulladás modellekben is megfigyeltek lymphangiogenezist (220). Nemrégiben Kajiya és munkatársai azt találták, hogy az UV B sugárzás által indukált pikkelysömör és az ödéma kialakulása is összefüggésbe hozható a sérülékeny, szivárgó nyirokerekkel, amelyek funkcionálisan károsodtak (221). A bőrt érőUV B sugárzás szintén növeli a VEGF-A expressziót, illetve a VEGFA szisztematikus blokkolása az UV B-indukált nyirokér anomáliák és bőrbetegségek csökkenését eredményezi egerekben (221). Halin és munkatársai azt találták, hogy a krónikus gyulladás aktívan hozzájárul a nyirokcsomókban a lymphangiogenezishez.,
33
melyet a gyulladás helyétől távol termelődőlymphangiogenetikus faktorok kontrollálnak (222). A csontvelőbesurgárzás a gyulladásos sejtek számának csökkentése által meggátolja a lymphangiogenezist a szaruhártyában (199). COX-2 gátlók és non-szteroid gyulladásgátló gyógyszerek hatékony lymphangiogenezis gátlónak bizonyultak (172). A gyulladásos utak gátlása ily módon csökkentheti a nyirokrendszeri metasztázisok kialakulását. Összefoglalva, számos humán daganat esetén a nyirokrendszer jelenti a legfontosabb útvonalat a tumor sejtek szóródásához. A közelmúlt felfedezései bebizonyították, hogy a tumor-asszociált lymphangiogenezis igen fontos szerepet játszik a nyirokcsomó metasztázisok kialakulásában, a mechanizmus mára bizonyítottan elfogadható a rákos sejtek metasztatizálódásánsak új útjaként. A közelmúltban végzett kísérletek arra engednek következtetni, hogy a VEGF-C/VEGF- D/VEGFR- 3 szignál tengelyen kívüli, további növekedési faktorok is szerepet játszanak a lymphangiogenezis szabályozásában, és hogy hasznos lehet, ha ezen növekedési faktorokat célozzuk meg a nyirokrendszeri metasztázis kialakulásának teljes blokkolása érdekében. A legtöbb, ilyen újonnan beazonosított nyirokrendszeri növekedési faktor potenciális hatásának feltérképezése a tumor-indukált lymphangiogenezisre és a nyirokcsomó metasztázisok megjelenésére még további vizsgálatokat igényel IV/4. Lymphovaszkulogenezis –LVEPC (Lymphatic Vascular Endothelial Progenitor Cell) sejtek
A neovaszkularizáció egyetlen útjának az angiogenezist tartotta a tudomány egészen 1997-ig amikor azonban Asahara és munkatársai (36) az egészséges felnőtt szervezet vérkeringésében is jelenlévőVEGFR2+, AC133+ (37), CD34+ endotheliális prekurzorokat, angioblasztokat mutattak ki. Ezen progenitorok beépülhetnek az ischiaemiás károsodást szenvedett harántcsíkolt (39) - és szívizomszövet (40) revaszkularizációja során felépülőkapillárishálózatba, a sebszövetet tápláló véredények falába (41), és valószínűleg szerepük van az érimplantátumok endothelizációjának folyamatában, valamint a levált endothelsejtek pótlásáért felelős „karbantartó angiogenezis”-ben is (42).
34
A posztnatális vaszkulogenezis jelenségét leírták daganatos kísérleti modellekben is: csontvelőeredetűendothelsejt prekurzorok gócszerűbeépülése volt megfigyelhetőa tumor perifériás területeit tápláló kapillárisaiba. A daganatos nyirokerek ismert keletkezési módja az ’in situ’ nyirokérképződés, amelynek során a már meglevőnyirokerek mintegy belenőnek a tumormasszába. 2003ban azonban Salven és munkatársai leírták, hogy nem csak az angiogenezisben szerepet játszó vérér progenitor sejtek léteznek, hanem egy másik progenitor sejtpopulációLymphatic Vascular Endothelial Progenitor Cell (LVEPC)- is kimutatható a csontvelőben, amely a nyirokérképződés folyamatában tölthet be kulcsszerepet, hasonlóan az érkapillárisok képződésénél leirt folyamathoz, ahol is a daganatsejt által termelt angiogén faktor (VEGF) a csontvelőbe jutva progenitor sejt felszabadulást vált ki, ezen progenitor sejtek a véráram útján a daganatba jutnak és endothel sejtekké differeniálódnak. 2005-ben Religa és munkacsoportja egérdaganatok megfigyelése során bizonyította, hogy a lymphatikus progenitor sejtek beépülnek a nyirokérhálózatba, Kerjaschki pedig a modell működésének humán bizonyítékául szolgálva vesetranszplantáción átesett betegek vizsgálata során leírta az LVEPC-k nyirokkapillárisba történőbeépülését. V. Célkitűzések
Az NSCLC jól ismert arról a tulajdonságáról, hogy korai stádiumban is nyirokcsomó áttétet adhat, ezért az N status fontos klinikumot meghatározó tényező(223). Ennek ellenére mégis keveset tudunk a humán NSCLC nyirokrendszeréről, illetve a nyirokrendszer és a nyirokcsomó metasztázisok valamint a prognózis összefüggéséről. Miután a kutatók jóval nagyobb hangsúlyt fektettek a Tumor Indukálta Angiogenezisre (TIA), mint a Tumor Indukálta Lymphangiogenezisre (TILA), lényegesen kevesebbet tudunk az utóbbiról. A közelmúltban elvégzett kísérletes tanulmányok azt sugallják, hogy a daganatok képesek új nyirokér kapillárisok képződését indukálni, elsősorban olyan citokinek termelésével, mint a VEGF család tagjai, továbbá azt, hogy a TILA aktivitása korrelál a nyirokcsomó metasztázisok számával (155, 224, 143). Ennek ellenére még mindig bizonytalan, hogy a nyirokúton történődaganatos progresszió az újonnan képződött nyirokér-kapillárisok tumoros invázióján keresztül, vagy a nyirokér-
35
kapillárisok inkorporációján át működik (hasonlóan, mint ahogy leírták a daganatos vérérkapillárisokkal kapcsolatban) (225, 12). NSCLC esetén egy úgynevezett nem angiogén és egy angiogén növekedési mintát írtak le (14). Angiogén típus esetén a daganatnak az eredeti szöveti szerkezet elpusztítása után saját stroma kialakítására van szüksége, amelyben benne foglaltatnak a kapillárisok is. Ebben az esetben valódi érképződésről van szó. Nem angiogén típusban a daganatok újabb és újabb alveoláris tereket kitöltve képesek növekedni anélkül, hogy új vérérkapillárisok képződését indukálnák, pusztán a már perzisztáló, az alveoláris septumokban futó gazdaszöveti kapillárisok nyújtotta oxigén- és tápanyagellátást használva, azokat mintegy kooptálva. A mi hypothezisünk az volt, hogy létezhet hasonlóság nem kissejtes tüdőrákban az angiogenezis és a lymphangiogenezis között. Ennek bizonyítására tisztázni akartuk a nyirokrendszer szerepét a tumor növekedése során. Elemeztük, hogyan épül fel a nem kissejtes tüdőrák nyirokérrendszere, és megvizsgáltuk, hogy a lymphangiogenezis mértéke összefüggésben van–e az angiogén fenotipussal (angiogén versus nem angiogén) és/ vagy a nyirokcsomó metasztázissal és a betegek átlagos túlélésével. Ahogyan azt a fentiekben már említettük, a malignus daganatok hasonlóan a vérerek rendszeréhez, nyirokerekre is több mechanizmus útján tehetnek szert. A nyirokér bimbózás (sprouting) mechanizmusán kívül az általunk is leírt nyirokér-inkorporáció és az LVEPC-k is nagy valószínűséggel részt vesznek a nyirokhálózatok kialakításában. Munkánk következőfázisában így arra voltunk kíváncsiak, hogy vajon az LVEPC-knek van-e klinikai jelentősége a tüdőrákok másik gyakori típusában, a kissejtes tüdőrákban (SCLC). Az LVEPC-k szerepe még tisztázatlan volt SCLC-ben, de feltételeztük a progresszióban való részvételüket, miután egy analóg sejtpopuláció (hemangio endotheliális progenitor sejtek) vizsgálata során szignifikáns klinikai összefüggést észleltek az érképződéssel különbözőhumán malignus betegségekben (66, 70, 67, 69, 56), ezek között a nem kissejtes tüdődaganatokban is (74, 226). Tanulmányunkban kissejtes tüdődaganatos betegek perifériás vérében flow cytometriával mértük a keringő LVEPC sejtek szintjét és vizsgáltuk a sejt szám összefüggését a lymphangiogenezis kulcsfontosságú citokinjének, a VEGF-C-nek a szérum szintjével és ezek hatását a nyirok metasztázisok kialakulására és a túlélésre. VI. Anyag és módszer
36
VI/1. Klinikai adatok
Tanulmányunk elsőrészébe, amelyben az angiogén és nem angiogén fenotipusok biológiai viselkedését hasonlítottuk össze összesen 103, az OKTPI (Országos Korányi Tbc és Pulmonológiai Intézet) mellkassebészeti osztályán 1994 január elseje és 1997 december elseje között NSCLC-vel kezelt beteget vontunk be. 62 férfit és 41 nőt vizsgáltunk, átlagéletkoruk 63 év volt (38 és 76 év) (1. táblázat). Formalinban fixált, parafinba ágyazott NSCLC metszeteket tanulmányoztunk az OKTPI patológiai osztályának anyagából, az intézet etikai bizottságának jóváhagyásával. A szövettani minták a daganatos tüdőparenchima és a daganatos tüdőparenchima-ép tüdőparenchima határ reprezentatív részleteit tartalmazták. Minden mintát elektiv műtét során nyertünk. A műtét előtt a betegek nem kaptak adjuváns kezelést. A szövettani diagnózist és az N státuszt hematoxilin-eozinnal festett metszeteken állapítottuk meg. 53 laphámkarcinómát, 42 adenokarcinómát és 8 nagysejtes karcinómát találtunk. Daganatmentes tüdőszövetmintákat is nyertünk a daganattól távol lévő tüdőparenchymából (két minta), vagy tüdőtágulás miatt műtött betegekből (két minta). A staging a sebészeti és a patológiai leleteknek alapján, az AJCC/UICC TNM rendszernek megfelelően történt. Pezzella és mtársai megfigyelései alapján a tumorokat angiogén (szöveti destrukciót és érképződést mutató) és nem angiogén (az eredeti szöveti stuktúrát respektáló) tumorcsoportokba osztottuk. LVEPC-k mérése céljából perifériás vért gyűjtöttünk 88 kissejtes lokálisan kiterjedt stádiumú tüdődaganatos betegtől a kezelés megkezdése előtt. A vért 21G tűvel nyertük és EDTA–val (ethylenediamineteraacetic acid) kezelt csövekbe gyűjtöttük. Az International Assotiation for the Study of Lung Cancer (IASLC) ajánlása szerint a lokálisan kiterjedt (LD/ limited diseases) betegség definíciója : egy mellkasfélre lokalizálódó, regionális nyirokcsomó metasztázisok, beleértve a hílusi, ipsilaterális és/ vagy kontralatreális mediastinális és/vagy ipsilaterális és/vagy kontralaterális szuprakavikuláris nyirokcsomókat (227). Bár a LD magába foglalja a malignus pericardiális, illetve pleurális folyadék gyülemet, vizsgálatunkba nem vontunk be ilyen betegeket. A kissejtes tüdődaganatban szenvedőbetegeinknél nem volt gyulladásos betegség, pulomnalis fibrozis, nyílt seb vagy egyéb fekély és kardiovaszkuláris rizikó
37
faktor mint diabétesz mellitusz, krónikus vesebetegség, kezeletlen hipertónia vagy reumatoid arthritisz sem, melyeknél leírták analóg csontvelő-eredetűsejt populációt (VEGFR-2+ hemangiogén EPC-k (228), melyek fokozhatják az LVEPC számot. Emellett Fadini és munkatársai nemrégiben a VEGFR2+ hemangiogén progentitor sejtek csökkenését írták le krónikus légzőszervi betegségben és tartós hypoxiában (229). Ennek megfelelően azokat a kissejtes tüdődaganatos betegeket, akik GOLD (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease) (230) stádium III-IV-ben (súlyos/nagyon súlyos) illetve akut exacerbációjú COPD I-II-ben (krónikus obstruktív tüdőbetegség) szenvedtek, szintén kizártuk a vizsgálatból. 54 férfi és 34 nőbeteget vizsgáltunk, az átlag életkoruk 63 év volt (44-77 év) (4. táblázat). A betegeknél a stádium megállapításhoz komplex vizsgálatot végeztünk el: fizikális vizsgálat, labor vizsgálat, légzésfunkciós teszt, mellkas röntgen, mellkasi, hasi CT (komputer tomográfia) vizsgálat, csontszcintigráfia, agyi MRI (mágnese rezonancia) illetve CT vizsgálat. Valamennyi SCLC beteg kemoterápiában (ciszplatin plusz etopozid, EP) és kiegészítőirradiációban részesült. A betegség progressziójakor kemoszenzitív tumor esetén (progresszió> 3 hónappal az elsővonalbeli kezelés utolsó ciklusát követően) ismételten EP kezelést alkalmaztunk. Azoknak a betegeknek, akiknél a progresszió három hónapon belül jelentkezett, másodvonalbeli kezelést adtunk cyclophosphamide+epirubicin+vincristin kombinációban. A túlélést a diagnózis dátumától a halál dátumáig definiáltuk és számoltuk. A tényleges átlag követési idő15 hónap volt (4-től 27 hónapig). A potenciális medián követést „Kaplan-Meier” analízissel számoltuk, amely 26 hónap volt (25-27 hónap). A vizsgálat végéig 77 beteg halt meg (87%) a betegség következtében. A kontroll csoportba 32 egészséges egyént vontunk be. A 4.táblázat-ban foglaltuk össze a kor, nem, dohányzási szokás és légzésfunkciós paramétereket. Valamennyi SCLC-s beteg és önkéntes beleegyező nyilatkozatot írt alá, a vizsgálatot a helyi etikai bizottság engedélyével végeztük. VI/2. A nyirokrendszer karakterizálása immunhisztokémiával
Immunhisztokémiai festést végeztünk a 10%-os neutrális formalinban fixált és paraffinba ágyazott mintákon. Az 5 μm paraffin metszeteket deparaffináltuk és rehidráltuk. A fénymikroszkópos vizsgálathoz az endogén peroxidáz enzim aktivitását
38
metanollal és 3%-os H2O2-vel 15 percen keresztül semlegesítettük. Antigén feltárást végeztünk 0,1M citrát pufferben (pH 6) egy 800 W teljesítményűmikrohullámú készülékkel 15 percig. A PBS –ben történt lemosás után az alábbi elsődleges antitesteket használtuk: nyúl poliklonalis anti humán LYVE-1 (1:100; Reliatech, Braunschweig, Németország), egér monóklónalis anti-humán D2-40 (1:100; DakoCytomation, Caprinteria, CA), egér monóklónalis anti-humán CD31 (1:40; DakoCytomation), poliklónalis nyúl anti-humán VEGF-C (1:100, Zymed, San Francisco, CA), nyúl monoklónális anti-humán Ki67 (1:200, Lab Vision, Suffolk, UK). Normál egér és nyúl IgG-k helyettesítették a primer antitesteket negatív kontrollként.(a vizsgálatban szereplőantitest koncentrációval megegyezőkoncentrációban) Immunfluoreszcens festés céljából, a PBS –ben történt lemosás után a metszeteket szimultán inkubáltuk a megfelelő, másodlagos antitestekkel (FITC-konjugált kecske anti-egér IgG, FITC konjugált kecske anti-nyúl IgG, és rodamin-konjugált kecske antiegér IgG; rodamin konjugált kecske anti-nyúl IgG, mindezek a Jackson Immunoresearch Inc.-től, 1:50, West Grove, PA), TOTO-3 magfestéssel (1:1000, MolecularProbes, Eugene, OR). A fénymikroszkópos vizsgálathoz a metszeteket először LYVE-1-gyel vagy D2-40 antitestekkel inkubáltuk és ezután HRP Envision rendszer (DakoCytomation) használatával hívtuk előa primer antitesteket. Ezután a metszeteket lemostuk PBS-ben és inkubáltuk az antitestekkel: anti-human CD31 anti-humán Ki67 és anti-humán VEGF-C ellen, majd ezt követően a metszeteket AP-vel (DakoCytomation, EnVision rendszer) előhívtuk. Végül háttérfestést végeztünk metilénzölddel. A VEGF-C státusz meghatározásához a mintákat pozitív és negatív csoportokra osztottuk, ahol a küszöbérték korábbi tanulmányok (161, 231) megfigyelésein alapult. Azon esetben, amikor a ráksejtek 30%-a pozitívan festetődött VEGF-C-re, a mintát VEGF-C pozitívként értékeltük, illetve a sejtek <30%-ának festődése esetén a mintát VEGF-C negatívként értékeltük. A metszeteket Nikon Eclipse 80i mikroszkóppal vizsgáltuk, a digitális felvételeket SPOT digitális fényképezőgéppel készítettük (Diagnosztikai készülékek, Sterling Heights, MI), vagy Bio-Rad MRC-1024 konfokális lézer mikroszkópos rendszer (BioRad, Richmond, CA) használatával.
39
VI/3. A nyirokrendszer komputer asszisztált morfometriai analízise
A morfometriai paramétereket a nyirokkapillárisok anti-humán LYVE-1 és anti-humán D2-40 /podoplanin festésével határoztuk meg. Minden metszetben három különböző intratumorális és peritumorális területet vizsgáltunk. Ezek az alábbiak voltak: (I) tumorcentrum; (II) tumorperiféria (az invazív szél közvetlen szomszédságában lévő1 mm széles daganatsáv); és (III) peritumorális tüdőszövet.( a daganat peremének a közvetlen szomszédságában lévő1 mm széles ép tüdőszövet) Daganatonként három metszetet elemeztünk CUE-2 számítógépes képelemzőrendszer használatával (amely egy speciális szoftverből, képfeldolgozóból, digitális fényképezőgépből és videó monitorból áll: Olympus, Tokió, Japán) az előzőekben leírtak szerint (232) A kontraszt növelése érdekében a nyirokerek sötétbarna árnyalata (amelyet diamino-benzidin festéssel nyertünk), és a sejtmag zöld színe (metilén zöld) között, egy 436 nm-es szűrőt használtunk a mikroszkópban. Számítógépes képelemzést (233) végeztünk, a képeket úgy készítettük, hogy a mikroszkópot összekapcsoltuk a videó kamerával képeket IBM számítógép (IBM Computer, Inc.)használatával digitalizáltuk. Ez az eljárás abból állt, hogy az elkészített képeket pontokba vagy pixelekbe konvertáltuk a szürketónusnak megfelelően. Azon esetekben, ahol interferenciát találtunk más sötét anyaggal, úgy mint antrakotikus festék vagy szaruanyag, interaktív módon javítottunk. Amint a számítógép kiválasztotta a hasonló színűterületeket (egy bizonyos tűrési határon belül és a háttér kizárása után), ezeket a területeket kitöltöttük feketével és a képet konvertáltuk a szürke skálába. A komputerizált rendszer az alábbiakat mérte meg a húszszoros objektív/metszet/ terület 5-10-es mezőinek mindegyikében: LVD (nyirokér sűrűség, a nyirokerek száma mm2-enként, a képelemzés alapján) és nyirokér kerület. Végül a különbözőintra-és peritumorális területeket integráltuk egyetlen eredménybe, minden minta és paraméter esetében. VI/4. SCLC betegek perifériás véréből flow cytometriával végzett LVEPC szám meghatározás
A keringőLVEPC sejtszám meghatározása flow cytometriás analízissel történt: vörösvérsejt lízist követően, a maradék perifériás vér mononukleáris sejt frakcióját 90μl
40
foszfát puffert és 0.1%-os bovin albumint tartalmazó sejt szeparációs pufferben reszuszpendáltuk és 30 percig inkubáltuk 4°C-on PE-Cy5-konjugált anti-humán CD34gyel (BD Biosciences, San Jose, CA) és PE konjugált anti-humán VEGFR3-mal (R&D Systems, Minneapolis, MN). Fluorochrom –konjugált izotípus kontrollt használtunk minden egyes festési eljáráshoz. A megfelelőfestődést követően a CD34+/VEGFR3+ kettős pozitív sejteket megszámoltuk és az adatokat sejtszám/vér ml-ben adtuk meg, CyFlow SL flow cytometer és FlowMax software-t alkalmazva (mindkettőPartec, Münster, Germany). VI/5. Egészséges kontrollok és SCLC betegek perifériás véréből VEGF-C szint mérése
VEGF-C szint meghatározásához szérum mintát készítettünk valamennyi egészséges kontroll egyén és a betegek perifériás véréből és -80°C-on tároltuk az analízisig. VEGFC szint mérést gyári ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN) felhasználásával végeztük, követve a pontos felhasználási útmutatót. Az eredményt standard görbével hasonlítottuk össze, az alsó detekciós limit 4pg/mL volt. Minden mérést kétszer megismételtünk. VI/6. Statisztikai analízis A kategória adatokat összevetettük a χ 2 vagy a Fischer-féle pontos valószínűségi vizsgálattal. A folyamatos változókat Student’s teszttel hasonlítottuk össze, amennyiben a minta eloszlása normál volt, vagy Mann-Whitney U tesztet használtunk, ha a minta eloszlása aszimmetrikus volt. A nyirokér paraméterek és a nyirokcsomó státusz közötti kapcsolatot egyirányú ANOVA-val elemeztük, amelyet Neuman-Keuls vizsgálat követett. A határozott adatokat Fishers’ exact találati valószínűségi és chi négyzet teszttel hasonlítottuk össze. Az LVEPC sejtszám és VEGF-C szint összefüggésének megállapítására Spearman rank’s korrelációs tesztet alkalmaztunk. Az átlagos túlélést Kaplan-Meier módszerrel elemeztük. Az átlagos túlélés a betegség első diagnosztizálásától a halál időpontjáig tartó időszak volt. A különbözőcsoportok túlélése közötti szignifikáns különbséget long rank statisztikával állapítottuk meg. A
41
prognosztikai faktorok multivariáns analízise Cox-féle regressziós modell használatával történt. A különbségeket akkor tekintették szignifikánsnak, amikor a P kevesebb volt, mint 0,05. Az összes statisztikai elemzést a Statistica 6.0 és 7.0 szoftver program (StatSoft Inc., Tulsa, OK) segítségével végeztük el. VII. Eredmények VII/1. A nyirokerek azonosítása normál tüdőszövetben LYVE-1 és D2-40 antitesttel
A normál tüdőszövet immunfestése LYVE-1-gyel (egy nyirok specifikus hialuronsav receptor) (106) hasonló mintázatot adott, mint D2-40-nel (szintén egy nyirokér specifikus marker-podoplanin) (234). Pozitív festés volt megfigyelhetőa vékonyfalú, vörösvértesteket nem tartalmazó nyirokkapillárisokban(1.ábra A). Ezek a nyirokerek elsősorban arteriolákhoz és venulákhoz asszociálodtak. A nyirok-és vérerek közötti különbséget tovább erősítette a kettős immunfestés LYVE-1 -gyel vagy D2-40 podoplaninnal és a vérér kapilláris endothélt jelölőCD 31-gyel. A LYVE-1 és D2-40 pozitív erek gyengén CD31 pozitívak is voltak, és ellenkezőleg, a vörösvértesteket tartalmazó CD31 pozitív erek LYVE-1 és D2-40 negatívak voltak.(1. ábra A) VII/2. A nyirokerek karakterizálása nem kissejtes tüdőrákban
Feni célból immunfestést végeztünk LYVE-1 és D2-40 antitestekkel. Mindkét esetben pozitív nyirokkapillárisok helyezkedtek el a peritumorális tüdőszövetben és a tumorok perifériáján.(1.ábra B) A LYVE-1 festés hiányzott a tumorok centrumából, kivéve a nem angiogén ,szöveti destrukció nélkül növekvőtumorokat, ahol a LYVE-1 -et expresszáló erek elsősorban a kooptált vérerek mentén helyezkedtek el.(2.ábra A-B) A D2-40 antitest vizsgálata során a tumor centrális területein azonban nyirokkapillárisokat fedeztünk fel homogénen elszórva a tumorokban, közvetlen kontaktusban a tumorsejtekkel. Ezekben az angiogén tumorokban a D2-40 pozitív nyirokerek véletlenszerűen oszlottak el a tumormasszában.
42
VII/3. Nyirokér denzitás és kerület nem kissejtes tüdőrákokban
Mivel az N1 és N2 csoportok nem különböztek az LVD tekintetében (P>0.1 minden mérésnél), ezért nyirokcsomó pozitív és nyirokcsomó negatív csoportokat állítottunk fel. Mind LYVE-1, mind D2-40 festéssel az összes alkalmazott kategóriában a tumor periférián, illetve a peritomorális kötőszövetben szignifikánsan több nyirokér helyezkedett el, mint a tumorok centrumában.(3.ábra A). Az LVD-k értékelése során (LYVE-1, vagy D2-40) a peritumorális kötőszövet és a tumor centrum LVD és a nyirokcsomó status között nem igazolódott szignifikáns összefüggés. Ugyanakkor a tumor periféria LVD-k szignifikánsan magasabbak voltak a nyirokcsomó pozitív csoportban a nyirokcsomó negatív csoporthoz képest.(4.8-tól 9.9/mm2 LYVE-1 –nél és 5.8 tól 11.3/mm2 D2-40nél, P<0.005; 3. ábra A). Korábbi megfigyelések alapján (14, 54), illetve a CD31 immunreaktivitást felhasználva a daganatok angiogén(84 eset; 2. ábra A) és nem angiogén(19 eset; 2.ábra B) tumorokra lettek felosztva. Annak ellenére, hogy azon betegeknek, akinek nem angiogén tumora volt, 13-nak nyirokcsomó metasztázisa volt (68% vs33.3% az angiogén csoportban, P=0.0048), ebben a tumorcsoportban az LVD értékek nem adtak prognosztikus információt egyik tumorterületből sem (P>0.05 minden mérésben; 3. ábra B). Az angiogén tumorokban a tumor periféria LVD mind LYVE-1, mind D2-40 immunreaktivitás alapján szignifikánsan nagyobb volt a nyirocsomó pozitív csoportban a nyirokcsomó negatívhoz képest.(4.5- től 10.8/mm2 LYVE-1 –nél; 5.6-tól 11.9/mm2 D2-40-nél; 3.ábra C) Bár az LVD kvantifikálása D2-40-nel pozitív korrelációt adott a tumorcentrum LVD és a nyirokcsomó metasztázisok között az angiogén tumorokban, ez a tendencia nem volt statisztikailag szignifikáns.(3. ábra C) Nem volt korreláció a tumorcentrum LVD és a nyirokcsomó status között az angiogén tumorcsoportban LYVE-1 immunfestéssel. Sem LYVE-1, sem D2-40 festés során nem igazolódott összefüggés a lymphatikus progresszió és a peritumorális LVD között. A nyirokkapillárisok kerületei a legnagyobbak a peritumorális szövetben, illetve a tumorperiférián voltak és ebből a szempontból nem volt különbség a különböző kategóriák között.(3.ábra D) Ugyanakkor nem volt szignifikáns különbség a kerületek és a klinikopatológiai faktorok között egyik tumor területen sem. Végül nem volt
43
szignifikáns összefüggés az LVD és a kerületek, a sex, a tumor méret, a tumor grádus és a nekrózis között.( P>0.1 minden mérésnél, az adatokat nem ismertetjük) VII/4. Túlélés
Mivel a nyirokcsomó metasztázist adó NCSLC-re signifikáns tumor periféria LVD emelkedés volt jellemző, Kaplan-Meier analízissel meghatároztuk az alacsony és magas tumor periféria LVD értékkel bíró betegek átlagos túlélését.(4. ábra). Ezen besorolás az LVD-k középértékein alapult. Úgy találtuk, hogy a tumorperiférián tapasztalható fokozott lymphangiogenezis a rövidebb túlélés szignifikáns prognosztikai faktora volt. A betegek ötéves túlélési aránya magas LYVE-1-LVD-vel és alacsony LYVE-1-LVDvel 23,3 %, illetve 68,7 % volt( P< 0,001, long-rank teszt, 4.A ábra). A magas illetve az alacsony D2-40 LVD szintekkel rendelkezőbetegek ötéves túlélési arányának az összehasonlítása 30%-ot, illetve 67,2 %-ot adott( P<0,001long-rank test, 4.A ábra). Ugyanakkor, amikor a daganatokat az angiogén fenotípusuk szerint osztályoztuk, ez a tendencia csak az angiogén daganatcsoport esetében volt szignifikáns(P<0,001, mind a Lyve-1, mind a D2-40 esetében, long-rank teszt, 4.B ábra) és nem tudtunk statisztikailag szignifikáns következtetést levonni a nem angiogén daganatok LVD-iből (a P értékek a Lyve-1 és a D2-40 esetében 0,59 illetve 0,98 voltak, long-rank teszt, 4.C ábra). Mivel úgy találtuk, hogy a nem angiogén fenotípus és a nyirokcsomó áttétek kialakulásának kockázata kapcsolatban áll, a betegpopulációnk átlagos túlélését a daganatok angiogén fenotípusa szerint is kielemeztük és azt figyeltük meg, hogy a nem angiogén daganattal rendelkezőbetegeknek jelentősen rosszabb túlélési esélyeik voltak, mint az angiogén fenotipusú daganattal rendelkezőbetegeknek. A nem angiogén daganattal rendelkezőbetegek ötéves túlélési aránya az angiogén daganattal rendelkező betegek túlélési arányával összevetve 26,3%, illetve 54,8 % volt (P=0,032; long-rank teszt, 4.D ábra). Bár nem angiogén tumoroknál nem tudtunk prognosztikai információt adni a lymphangiogenezis (LVD értékek) szintjéből, a nem angiogén daganatok esetében, a fenti adatok elemzése Cox-féle regressziós modellel megerősítette, hogy a nem angiogén fenotípus hátrányos prognosztikai tényezőaz átlagos túlélést tekintve (P=0,
44
044, 2. táblázat). A multivariáns analízis (beleértve a standard prognosztikai paramétereket, úgy, mint daganat kiterjedés, nyirokcsomó státusz, és a beteg kora) is azt mutatta, hogy a daganat perifériás LVD-i által megjósolt kórlefolyás-független a többi változótól (P-értékek a Lyve-1 és a D2-40 esetében 0,007 illetve 0,008; lásd 2. táblázat). A rövidebb túléléssel összefüggőtovábbi prognosztikai faktorok a tumor stádium és a nyirokcsomó metasztázis voltak. Angiogén daganattal rendelkezőbetegek esetében, a tumor periférián észlelt fokozott lymphangiogenezis szintén független, kedvezőtlen prognosztikai faktornak bizonyult (P-Lyve-1 <0,001; P-D2-40=0,002; lásd 2. táblázat). Megpróbáltunk összefüggést találni a SCLC-s betegek túlélése és perifériás vérükben mért LVEPC szint között. Tekintettel arra, hogy a SCLC betegeknél nyirokcsomó érintettségnél emelkedett LVEPC számot észleltünk, Kaplan-Meier analízissel tovább vizsgáltuk a teljes túlélést, két csoportra osztva a betegeket, az észlelt alacsony illetve magas LVEPC szintek alapján. (6. ábra) Azt találtuk, hogy azoknál a betegeknél, akiknél alacsony kiindulási CD34+/VEGFR3+ szintet detektáltunk, (középérték <1625/mL) szignifikánsan hosszabb volt a túlélés, mint a kezelés előtt mért magasabb keringőLVEPC sejtszámú betegeknél.(közép túlélési idő20 versus 11.5 hónap; P<0.01, 6.ábra) Az összes beteg medián túlélése 14 hónap volt. A multivariáns analízis (bele foglalva a standard prognosztikai paramétereket mint az életkor, nem, tumor és nyirokcsomó stádium) szintén jelezte, hogy a kezelés előtti keringőLVEPC szint független prediktora ezen változóknak. (P<0.01, 6.táblázat) A legújabb IASLC (International Assotiation for the Study of Lung Cancer) SCLC klinikai stádium analízise alapján egy további független prognosztikai faktor, amely a rövidebb túléléssel korrelált, az N2-3 betegség volt. (versus N0-1 stádium, P=0,014, 6. táblázat) VII/5. Lymphatikus proliferáció
A nyirokerek proliferációs statusának vizsgálatára kettős immunfestést alkalmaztunk a D2-40, ill KI 67 nuklearis fehérje ellenes antitestekkel.(1.ábra C) A nyirok endothelsejtek jelölési indexe a különbözőintra és peritumorális nyirokér populációkban 100 endothelmag számolását követően a jelölt sejtek meghatározásával történt. Az eredmények megerősítették, hogy a KI 67 magfestés, ahogy az várható volt ,az endothelsejtekben és daganatsejtekben is látható volt.(1.ábra C) Az endothelsejt
45
jelölési index mindig a peritumorális kötőszövetben volt a legmagasabb és minden esetben alacsonyabb volt a tumor centrumban mint a tumor periférián.(2. táblázat) A legszélsőségesebb helyezet a nem angiogén tumorcsoportban volt, ahol egy viszonylag alacsony számú osztódó endothelsejt volt észlelhetőperitomorálisan, viszont nem volt KI 67 festés intratumorálisan.(2.táblázat) Ez azt jelenti, hogy a nem angiogén tumorokban elhelyezkedőintratumorális nyirokerek valójában a növekvőtumormassza által bekebelezett kapillárisok. Ezzel szemben az angiogén tumoroknál a nyirok endothelsejtek proliferációjának megfigyelése során minden vizsgált területen osztódó magokat láttunk.(2. táblázat) VII/6. VEGF expresszió humán tüdődaganatban
A 103 daganatból 56 volt VEGF-C pozitív. Nem volt festődés normál tüdőszövetben. A VEGF-C-t gyakrabban expresszálták az angiogén tumorok, mint a nem angiogének. (1. táblázat) A festődési minta diffúz (döntően az angiogén tumoroknál,2. ábra C) vagy fokális(döntően a nem angiogén tumoroknál, 2.ábra D) volt. Nem találtunk összefüggést a kor, a nem, a szövettani típus, vagy a dohányzási szokás és a VEGF-C expresszió között.(1. táblázat) Nem volt összefüggés a VEGF expresszió intenzitása és a nodalis status, vagy az LVD között sem podoplanin, sem LYVE-1 festéssel. Továbbá nem tudtunk összefüggést kimutatni a VEGF-C expresszió és az endothlesejt jelölési index között. Ezek alapján nem tudtuk a VEGF-C expresszió prognosztikai szerepét kimutatni multivariáns analízisben sem.(3. táblázat) VII/7. LVEPC szint meghatározás kissejtes tüdőrákos betegek perifériás vérében
Mind a vér, mind a nyirokér progenitorok CD34+ hemopoetikus progenitor sejtek leszármazottai (235, 236), míg a hemangiogén progenitorok CD34, CD133 és VEGFR2 pozitívak (237), addig a LVEPC-k CD34, CD133 és VEGFR3 expressziót mutatnak (238). Ismert, hogy mindkét típusú endothel progenitor sejt gyorsan elveszíti CD133 expresszióját a csontvelőből a keringésbe történőmigráció során, valamint, hogy a CD133+ LVEPC sejtek megfelelnek a teljes CD34+ LVEPC szubpopulációjának. Munkánkban meghatároztuk a CD34+/VEGFR3+ kettős pozitív LVEPC sejteket 32
46
egészséges önkéntes kontroll egyénnél és 88 SCLC betegnél flow cytometriával.(5.ábra A) A kontroll csoportban a CD34+/VEGFR3 keringőLVEPC sejtek átlag értéke 455/mL volt (interquartil range, 370-530/mL) a perifériás vérmintákban (n=32; 5.ábra B). A kissejtes tüdődaganatos betegeknél ez az érték szignifikánsan magasabb volt, a középérték 1625/mL –nek felet meg. (interquartil range, 600-2750/mL; n=88; P <0.01, 5.ábra B) VII/8. LVEPC szint és a klinikopatológiai paraméterek összefüggései
Az LVEPC számot betegeink klinikopatológiai faktoraival összegfüggésében is kiértékeltük. Statisztikailag szignifikáns összefüggést észleltünk az LVEPC szint és a nyirokcsomó metasztázisok között.(P <0.01, 5.táblázat) További klinikai paraméterekkel, mint a kor, dohányzási szokás, életkor és a tumor stádium nem találtunk szignifikáns összefüggést.(5.táblázat) VII/9. VEGF-C szint SCLC betegek perifériás vérmintájában
Annak ellenére, hogy a VEGF-C szérum szint a betegeknél szignifikánsan emelkedett volt a kontroll(egészséges) egyénekéhez képest (4931±881 vs. 3992±462pg/mL, illetve, P <0.01; 4.táblázat), szignifikáns kapcsolatot nem tudtunk kimutatni e kulcsfontosságú lymphgangiogén molekula, a VEGF-C és a keringőCD34+/VEGFR3+ LVEPC szám között (P=0.74, az adatokat nem ismertettük). Ezen felül, azon estekben, amikor a VEGF-C szint emelkedett volt, a betegek egyéb klinikapatológiai faktoraival, mint életkor, dohányzási szokás, nem, és még érdekesebb, hogy tumor stádium és nyirokcsomó státusz, nem volt szignifikáns összefüggés (adatokat nem részleteztük). VIII. Megbeszélés VIII/1. A lymphangiogenezis vizsgálata és jelentősége nem kissejtes tüdőrákban
A nem kissejtes tüdőrákok gyakran adnak nyirokcsomó áttéteket, a lokoregionalis nyirokcsomó status pedig az egyik legfontosabb prognosztikai faktor ebben a
47
tumortípusban. Azonban a nyirokrendszer tüdődaganatokban betöltött szerepének ismerete messze elmaradt az érhálózat szerepének ismeretétől, elsősorban a specifikus nyirokendothel markerek ismeretének hiánya miatt. A közelmúltban felfedezett LYVE1 (106) és D2-40/podoplanin (234) antitestek, amelyek specifikusnak bizonyultak a nyirokendothelre, új eszközöket adtak a kutatók kezébe a lymphangiogenezis human malignomákban történőtanulmányozására. A nem kissejtes tüdőtumorainkban vizsgálva a nyirok kapillárisok eloszlását, a fent leirt antitestek segítségével, az LVD csökkenését tapasztaltuk a peritumorális szövetek felől a tumor centruma irányába haladva, függetlenül a tumor méretétől vagy szövettani tipusától. Ez részben egyezik egy korábbi munkának az eredményével, amelyben a szerzők nem tudtak LYVE-1 pozitív nyirokereket kimutatni a tüdőtumorok centrális területein (239). Fontos ugyanakkor megjegyezni, hogy ellentétben a fenti szerzőkkel, akik nyirokereket csak a peritumorális tüdőszövetben illetve a tumorperiférián figyeltek meg, a mi vizsgálataink nem adtak ilyen szélsőséges eredményt. A normál tüdőszövetben a LYVE-1 és a podoplanin hasonló mintázatot adott. Jóllehet, néha megfigyeltük őket a respiratorikus bronchiolusok mentén is, a peribronchiális nyirokerek elsősorban a terminális bronchiolusok mentén eredtek, ugyanakkor az alveolusok falában soha nem voltak megfigyelhetőek. A tüdődaganatszövet vizsgálata, egyezve egy korábbi humán pancreas szövet vizsgálattal (148), feltárta, hogy a LYVE-1 csak egy részét jelöli a nyirokereknek a podoplaninnal összehasonlitva. Meglepőmódon a nem kissejtes tüdőrák kategorizálása az angiogen fenotipus alapján kiderítette, hogy ez a jellegzetesség elsősorban a destruktív módon növekvőangiogén tumorok jellemzője, amelyekben a LYVE-1 pozitív erek kizárólag a tumor perifériáján és a peritumorális kötőszövetben voltak detektálhatóak, míg a podoplanin pozitív nyirokerek a tumor centrumában is kimutathatóak voltak. Ezzel szemben, egy szignifikáns része a nem angiogén tüdőtumoroknak tartalmazott LYVE-1 pozitív és podoplanin pozitív nyirokereket a daganat centrumában és a tumor periférián is. Fenti jelenség oka nem teljesen világos. A nyirokerek szimpla kollapszusa nehezen magyarázná a LYVE-1 szelektív elvesztését, mivel az összeesett nyirokér kapillárisoktól is elvárható lenne, hogy megtartják LYVE-1 expressziójukat. Mivel a centrális területei az angiogén tumoroknak szignifikánsan alacsonyabb LVD értékeket mutattak (mind LYVE-1, mind podoplanin festéssel)összehasonlítva a tumorperifériával és a peritumorális kötőszövettel-lehetséges, hogy a
48
relatíve magasabb expressziója a podoplaninnak ezekben a daganatokban a teljesen destruktív növekedés eredménye, amelynek során a hialuron receptorok elvesztése hamarabb jelenik meg a degeneratív falú bekebelezett gazdaszöveti nyirokerekben, mint a mucin típusú glycoprotein podoplniné. Más szóval, mivel az intratumoralis nyirokendothel proliferációja kizárólag a LYVE-1 negatív, podoplanin pozitív angiogen tumorok nyirokereiben volt látható, elképzelhető, hogy az újonnan képződőnyirokerek korábban expresszálják a podoplanint mint a LYVE-1-et. Továbbá azon megfigyelés, hogy a nem angiogén tumorok csak peritumorálisan mutattak lymphangiogenezist, együtt azzal a ténnyel, hogy az intratumorális nyirokerek eloszlása ezekben a daganatokban hasonló a normál tüdőszövethez, arra enged következtetni, hogy ezek a daganatok a normál tüdőszövetben elhelyezkedőnyirokereket kebelezik be. Egy sor nyirokér marker, amelyet primer tumorokban teszteltek, összefüggést mutatott a nyirokáttétek megjelenésével gyomor (240), emlő(241), fej-nyaki (242) tumorokban valamint melanomákban (142). Ugyanakkor mindössze két tanulmányban vizsgálták a lymhangiogenezis lehetőségét humán tüdőrákban (142, 239). Jelen tanulmányunkban bemutatjuk azon új felfedezésünket, hogy jóllehet mind a nyirokcsomó negatív, mind a nyirokcsomó pozitív kategóriákban a peritumorális tüdőszövet jóval több nyirokeret tartalmazott, mint a vizsgált intratumorális területek, morphometriai vizsgálat segítségével demonstráltuk, hogy a tumor periféria (nem a tumor centrum!) LVD jóval magasabb a nyirok metasztázist adó tumorokban a nem metasztatizálókhoz képest. Továbbá kiderült, hogy a nyirokerek jelen vannak centrális tumor területeken is, de a nyirokér denzitásnak a tumor periférián jóval nagyobb klinikai szignifikanciája van. A diagnózis felállításakor észlelt magas perifériás nyirokér számok nem csak a magasabb nyirokcsomó metasztázis számmal függtek össze, hanem a rövidebb túléléssel is. Ugyanakkor ez a tendencia csak az angiogén tumorcsoportban igazolódott, azt sugallva, hogy a tumormasszában az angiogén tumorok esetében a növekvőtumorsejtek által indukált mechanikai erők és a folyamatosan invazív ráksejtek összenyomják és rombolják a tumorcentrumban elhelyezkedőnyirokereket, ezzel funkcióvesztést okozva, továbbá az angiogén tumorokban a nyirokér-invázió területe úgy tűnik, hogy nem felel meg a legnagyobb nyirokér denzitással bíró területeknek, különösen abban az esetben, amikor a ’hotspotok’ a tumormasszán kívül helyezkednek el. Összefoglalva, a nyirokerek a tumorok perifériáján fontosabbak a metasztatikus folyamatban, mint a
49
peritumorális lymphatikus hálózat (amely területen a lymphatikus hotspotok találhatóak), vagy a tönkretett és ezáltal nem funkcionáló tumor centrum nyirokerek az angiogén nem kissejtes tüdőrákokban. Jóllehet a nem angiogen növekedési típus a nyirokcsomó áttétek megjelenésének szignifikáns veszélyével és rövidebb túléléssel jár, nem tudtunk prognosztikus információt nyerni az LVD értékekből egy vizsgált területén sem ezen tumoroknak. Az úgynevezett nem angiogén tumorok rendkívül agresszívek (14, 243) és a bekebelezett tüdőnyirokerek kulcsszerepet játszhatnak a már perzisztáló vérér kapillárisok mellett. A bekebelezett nyirokerek jóval effektívebbek lehetnek, mint az újonnan képződöttek, mivel a nem angiogén tüdődaganatokban a nyirok így közvetlenül a bekebelezett gazdaszöveti tüdőnyirokér hálózatba kerül, míg az angiogén tumorokban kizárólag a daganatok perifériájáról vezetnek nyirokerek a környezőnormál szövetbe. Nem angiogén tumorokban ily módon a nyirokrendszeren át történőtumor disszeminació a korábban már meglévőnyirokutak segítségével történhet a teljes tumormasszából. Jóllehet a különbözőrosszindulatú daganatokban, így a tüdőrákban is a VEGF-C expressziót többször is összefüggésbe hozták a nyirokcsomó metasztázisok megjelenésével (244-249) és mi is megemelkedett VEGF-C immun-reaktivitást észleltünk a tüdődaganatokban a normál tüdőszövethez képest, nem volt kézzelfogható összefüggés a VEGF-C expresszió és az LVD értékek, a nyirokcsomó metasztázisok, vagy a betegek túlélése között (amely összecseng Arinaga és munkacsoportja (161), valamint Ogawa és munkacsoportja (163) megfigyelésével). Továbbá nem tudtunk összefüggést kimutatni a VEGF-C expresszió és a lypmhatikus endotehliális sejt jelölési index között. Ezért nehéz arra következtetni, hogy a lymphangiogenezis a humán tüdőrákban a VEGF-C hatásának az eredménye, ahogy azt korábbi kísérletes modellekben leírták (250). A mi eredményeink inkább azt sugallják, hogy a VEGF-C leginkább túlélési faktorként működik a tüdődaganatokban. Ezt a gondolatot tovább erősítette a megfigyelés, hogy a nem angiogén tumorokban, amelyek nem mutattak intratumorális nyirokér bimbózást, a VEGF-C expresszió a bekebelezett nyirokerek közvetlen szomszédságára korlátozodott. Ugyanakkor valószínű, hogy hasonlóan, mint a tumor indukálta angiogenezis esetében, ahol több cytokin interakciója kontrollálja a tumor vaszkularzációt, a lymphangiogén faktorok egy dinamikus egyensúlya határozza meg a lymphangiogenezis aktivitását.
50
VIII/2. A lymphovaszkulogenezis (LVEPC-k) vizsgálata és jelentősége kissejtes tüdőrákban
Munkánkban elsőként mutatjuk be, hogy a kissejtes tüdődaganatos betegek perifériás vérében keringőCD34+/VEGFR3+ LVEPC sejtszám szignifikánsan emelkedett a tumormentes kontroll egyénekével összehasonlítva, és ezen sejtszint a nyirok metasztázis kialakulásával és így a klinikai viselkedéssel is összefüggésben áll. Bár emelkedett csontvelőeredetűkeringőVEGFR2+ hemangiogén EPC sejteket különböző malignus betegségekben leírtak már korábban (66, 226), mégis munkánk elsőként bizonyítja, hogy a malignus betegek perifériás vérében a keringőlymphovaszkuláris EPC sejtek szintje emelkedett. Egyre növekvőszámú bizonyíték, irodalmi adat utal arra, hogy a tumor vérér kialakulása nemcsak endothel sejtek bimbózása útján jöhet létre, hanem nagymértékben vaszkulogenezis segítségével, azzal a mechanizmussal, melynek során csontvelőeredetűsejtek egy része, EPC sejtek erősítik a folyamatban lévő vaszkularizációt, oly módon, hogy keringősejt populációk felkeresik a kapilláris falakat és beépülnek az endothel csőbe (237, 56). Napjainkra szintén elfogadott, hogy a lymphangiogenezist (in situ nyirokérbimbózás), a VEGFR3 szignál segíti elő, hozzájárulva a tumor progresszióhoz (251, 252). A legújabb bizonyítékok azt vetették fel, hogy a tumor nyirokérképződés szintén nem feltétlenül az endothel bimbózásból ered; helyette, hasonló mechanizmussal a vaszkulogenezishez, a tumor nyirokér szintén kifejlődhet lymphangiogenezis útján is, amely folyamat során a csontvelőeredetű LVEPC sejtek toborzása és in situ érett endothel sejtté differenciálódása biztosítja az új nyirokér kapillárisok kialakulását (253). Ezek a VEGFR3+ LVEPC sejtek funkcionálisan egységes sejt populációt alkotnak, CD34-et expresszálnak de nem expresszálnak CD105, CD11b, CD14 vagy VEGFR1-t. Tekintettel arra, hogy in vitro kimutatták nyirok és/vagy vaszkuláris endothel sejtté való differenciálódási képességüket (238), LVEPC sejtek humán SCLC-ben hozzájárulhatnak mind nyirok-, mind vérér kapilláris kialakulásához. Jelen tanulmány nem tette lehetővé sem az LVEPC sejtek vaszkulogén aktivitásának mérését, sem a vaszkulogenezishez, illetve lymphangiogenezishez való hozzájárulás arányának megállapítását. Azonban megfigyelhettük, hogy az LVEPC sejtek száma kapcsolatban állt a nyirokcsomó
51
metasztázisok kiterjedésével, amely alapján feltételezhetőezen sejteknek potenciális szerepük van a lymphangiogenezis folyamatában, vagy legalább feltételezhető, hogy hasonló mozgató rugója van a kissejtes tüdőrák nyirokcsomó áttétek progressziójának és az LVEPC sejtek csontvelőből történőmobilizációjának. A fenti elmélet alapján feltételezhető, hogy megfigyelésünk (az emelkedett LVEPC szám) az emelkedett VEGF-C szint, az emelkedett VEGFR3 ligand eredménye. Experimentális állat modellekben mutatták be a közvetlen bizonyítékot, hogy ez a kulcs lymphangiogén citokin játszik kritikus szerepet a daganat progresszióban lymphangiogenezist indukálva és erősítve a metasztatikus terjedést a nyirokereken keresztül, valamint, hogy ezt a hatását a VEGFR3 szignálút blokkolásával gátolni lehet (254). Humán nem kissejtes tüdőrák xenograft modellekben, VEGF-C-t overexpresszáló tumorokban magasabb nyirokér denzitást észleltek, mint a kontroll tumorokban és a VEGFR3 szignál gátlásával csökkent a tumor lymphangiogenezis és a regionális nyirokcsomó metszatázisok száma (255). Munkánkban perifériás vérben vizsgáltuk a VEGF-C szintet és azt találtuk, hogy bár a koncentrációja szignifikánsan magasabb volt a kissejtes tüdődaganatos betegeknél a kontroll (egészséges) csoporthoz képest, statisztikailag nem volt szignifikáns kapcsolat a VEGF-C szint és a keringőLVEPC sejtszám között. Mégis, annak ellenére, hogy a jelen eredményeink nem támasztották alá, hogy a SCLC betegek perifériás vérében keringőVEGF-C serkentette az LVEPC sejtek csontvelőből történőmozgósítását, lehetséges, hogy, ahogyan egyéb (például kardiovaszkuláris, malignus, vagy gyulladásos) betegségekben, amelyekben számos inflammatorikus és noninflammatorikus citokin kontrollálja a vaszkulogén EPC-sejteket (228, 256), a különbözőnövekedési faktorok dinamikus egyensúlya daganatos betegségekben is meghatározza a működőLVEPC sejtek számát és funkcióját. Azon megfigyelésünkön túlmenően, miszerint a kissejtes tüdődaganatos betegeknél, összehasonlítva a kontroll csoportéval, emelkedett kezelés előtti keringőLVEPC sejtszámot észleltünk, ez a prospektív tanulmány bemutatja, hogy a CD34/VEGFR3+ LVEPC sejtek egyszerűflow cytometriás mérése hasznos prediktív marker a SCLC betegek túlélésére vonatkozóan. A 25 hónapos utókövetés alatt szignifikánsan magasabb halálozást észleltünk azoknál a betegeknél, akiknél magas LVEPC számot detektáltunk, összehasonlítva az alacsonyabb kiindulási LVEPC számú csoporttal, ami arra enged következtetni, hogy flow
52
cytomeriával a perifériás vérből mért LVEPC sejtszám korrelál a humán SCLC klinikai viselkedésével. A korábban ismertetett experimentális tanulmány mellet számos vizsgálat különböző humán daganat esetében felvetette, hogy VEGF-C expresszió tumor szövetből immunhisztokémiával és/vagy ELISA módszerrel perifériás vérből történő meghatározása korrelál a nyirokcsomó metasztázissal és/vagy a beteg túléléssel (244249). Ennél fogva munkánk során szintén értékeltük VEGF-C perifériás vér szintjének mérését, mint potenciális módszert a nyirokcsomó metasztázis és/vagy SCLC prognózisának megítélésére. Bár emelkedett VEGF-C koncentrációt észleltünk a kissejtes tüdődaganatos betegeknél összehasonlítva a kontroll csoporttal, a VEGF-C szint és a betegek túlélése között nem találtunk összefüggést, továbbá nem volt különbség a betegcsoport különbözőklinikopatológiai alcsoportjaiban a VEGFC szint tekintetében. Nem láttunk különbséget a VEGF-C szintben az N1 illetve N2-3 betegség stádiumban. Ez a megfigyelés megegyezik egy korábbi tanulmányban leírtakkal, amelyben kissejtes tüdődaganatos betegek perifériás vér VEGF-C szintjét vizsgálták (257). Ezzel ellentétben a perifériás vér VEGF-C szintje előjelezte a nyirokcsomó státuszt különbözőegyéb tumor típusokban, mint például nyelőcső(258), vagy gyomor tumor esetén (259), papilláris pajzsmirirákban (260), malignus melanómában (261), és nem kissejtes tüdődaganat esetén (262). Kissejtes tüdődaganatokban, mint a malignus tumorok többségében a nyirokcsomó áttétek a rövidebb túléléssel függenek össze, és ez az egyik faktor, mely rosszabb prognózissal társul. Annak eldöntése, hogy a nyirokúti terjedés a rosszabb prognózisra mechanizmusa, vagy markere az agresszív biológiai viselkedésnek, még megállapításra vár. Jelen tanulmány elsőként demonstrálja, hogy SCLC –ban a csontvelőeredetű LVEPC sejtek száma szignifikánsan emelkedett, és korrelál a regionális nyirokúti terjedéssel és a betegek túlélésével. Bár adataink felvetik az LVEPC sejtek részvételét SCLC betegek nyirokúti tumor progressziójában, nem világos még, vajon az LVEPC sejtek csak a tumor sejtek nyirok útján történőterjedésében játszanak szerepet, vagy elősegítik a primer tumor növekedését és a hematogén metasztázisok kialakulását az új vérér kapillárisok képződési ütemének fokozásával. Továbbá még megállapításra vár, hogy az LVEPC sejteket használhatjuk-e kiegészítőmarkrekként a standard, illetve a jövőben kifejlesztésre kerülőanti(nyirok)angiogén kezelés hatékonyságának
53
monitorozására SCLC-ben. További kutatást igényel még, hogy eldöntsük, vajon az LVEPC sejtek, mint terápiás célpontok, használhatók-e a SLCL–s betegeknél. XI. Következtetések
Összefoglalva a tüdőrák metasztázisának megjelenése egy kulcsesemény, amelyet gyakran prognosztikai faktorként használunk. A mi munkánk elsőként demonstrálja, hogy a lymphangiogenezis kizárólag az angiogén növekedési típusú tüdődaganatokban jelenik meg és, hogy az LVD összefügg a klinikai viselkedéssel és a nyirokcsomó státusszal ebben a növekedési típusú tüdődaganatban. Továbbá szintén az első bizonyítéka annak, hogy a nyirokcsomó metasztázisok megjelenésének veszélye és rövidebb túlélés valószínűbb a nem angiogén paciens populációban, és hogy a nem angiogén tumorok elsősorban bekebelezik a gazdaszöveti nyirokereket növekedésük során ellenben az angiogén tumorokkal, amelyek folyamatos lymphangiogenezis kíséretében növekednek. Ez utóbbi azt sugallja, hogy a bekebelezett nyirokerek tüdőrákban fontosabbak a metasztatikus folyamatban, mint az újonnan képződöttek. Ez a feltevés ugyanakkor további vizsgálatokat és klinikai igazolást kíván. Munkánkban ugyancsak elsőként bizonyítottuk, hogy kissejtes tüdődaganatos betegek perifériás vérében szignifikánsan emelkedett a csontvelőeredetűLVEPC sejtek szintje, amely korrelált a nyirokcsomó metasztázissal és a rosszabb prognózissal. További kutatások szükségesek annak eldöntésére, hogy ezen LVEPC sejtek targetálásával válik –e lehetővé a kissejtes tüdőrákban szenvedőbetegek gyógyítása, vagy mivel ezen sejtek képesek a daganatos nyirokérhálózatba beépülni, érdemesebb esetleg az LVEPC-k manipulálása, például toxinokkal történőösszekapcsolása, a daganatsejtek elpusztítása céljából. Végül, mivel fenti eredményeink nem specifikusak a kissejtes tüdőrákra, számos új eljárás kidolgozásában segíthetnek a malignus tumorok elleni küzdelemben. X. Összefoglalás
A
daganatok
nyirokérhálózatának
kialakulásáról,
a
Tumor
Indukálta
Lymphangiogenezisről (TILA) mind a mai napig lényegesen kevesebbet tudunk, mint a Tumor Indukálta Angiogenezisről (TIA). A tumoros nyirokérhálózat tanulmányozása a
54
specifikus markerek hiányában a közelmúltig nem tudott megvalósulni. A LYVE-1, a D2-40, illetve a podoplanin nyirokérmarkerek azonban lehetővé tették a daganatok nyirokrendszerének megfigyelését, az angiogén, illetve nem angiogén fenotípusok biológiai viselkedésének összehasonlítását, a keringő progenitor (vaszkuláris és lymphogén) sejtek szerepének leírását. Kísérletes tanulmányok azt sugallják, hogy a daganatok képesek új nyirokér kapillárisok képződését indukálni, elsősorban olyan citokinek termelésével, mint a VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) család tagjai, továbbá azt, hogy a TILA aktivitása korrelál a nyirokcsomó metasztázisok számával, valamint azt, hogy a lymphvaszkulogenezisnek (LVEPC-k) is szerepe lehet a tüdődaganatok nyirokrendszerének kialakításában. Tanulmányunkban célul tűztük ki az angiogén
illetve
nem
angiogén
fenotípusú
nem
kissejtes
tüdőtumorok
lymphangiogenezisének összehasonlítását, valamint a perifériás vér LVEPC (Lymphatic Vascular Endothelial Progenitor Cell) sejtszámok összefüggésének vizsgálatát a VEGFC a szérum szintjével és ezek hatását a nyirok metasztázisok kialakulására és a túlélésre, kissejtes tüdőrákban. Elemeztük, hogy hogyan épül fel a nem kissejtes tüdőrák nyirokérrendszere,
és
megvizsgáltuk,
hogy
a
lymphangiogenezis
mértéke
összefüggésben van–e az angiogén fenotipussal (angiogén versus nem angiogén) és/ vagy a nyirokcsomó metasztázissal, illetve a betegek átlagos túlélésével. Dolgozatunk elsőként demonstrálja, hogy a lymphangiogenezis kizárólag az angiogén növekedési típusú nem kissejtes tüdődaganatokban jelenik meg és, hogy az LVD (Lymphatic Vessel Density, nyirokér denzitás) összefügg a klinikai viselkedéssel és a nyirokcsomó státusszal ebben a növekedési típusú tüdődaganatban. Eredményeink szintén az első bizonyítékai annak, hogy a nyirokcsomó metasztázisok megjelenésének veszélye és a rövidebb túlélés valószínűbb a nem angiogén paciens populációban, és hogy a nem angiogén tumorok elsősorban bekebelezik a gazdaszöveti nyirokereket növekedésük során, ellenben az angiogén tumorokkal, amelyek folyamatos lymphangiogenezis kíséretében növekednek. Munkánkban ugyancsak elsőként bizonyítottuk, hogy kissejtes tüdődaganatos betegek perifériás vérében szignifikánsan emelkedett a csontvelőeredetű LVEPC sejtek szintje, amely korrelált a nyirokcsomó metasztázissal és a rosszabb prognózissal XI. Táblázatok és ábrák
55
1.ábra : nyirokér kapillárisok normál tüdőszövetben és nem kissejtes tüdőrákban
A: normál tüdőszövet erythrocyta tartalmú vérér kapilláris (CD 31-rózsaszinűnyíl) és nyirokér (lyve-1-barna nyilhegy) immunhisztokémiai jelölése. A LYVE-1 pozitív nyirokér kapilláris gyengén CD 31 pozitív, a vérér kapilláris azonban nem festődött LYVE-1-gyel.
B: Nem kissejtes tüdőrák tumor perifériás terület kettős immunfestése LYVE-1-gyel és D2-40-nel. A LYVE-1 (barna) festődést csak D2-40 (lila) festődéssel együtt tapasztaltuk, a három ábrázolódó nyirokér kapillárisból csak egy (csillag) festődött LYVE-1-gyel.
C: Ki67 festődés látható a tumorsejtek magjaiban, ahogy a nyirokér (barna) sejtmagokban (nyíl) is. Nagyítás: x 200 (A), x 400 (B és C)
56
Figure 1.
A.
C.
B.
*
Renyi-Vamos et al.
2.ábra: Nyirokér kapillárisok elhelyezkedése és példák a VEGFC immunfestődésre humán nem kissejtes tüdőrákban az angiogén fenotípus alapján
A: destruktívan növekvő, angiogén fenotípusú nem kissejtes tüdőrák erőteljes angiogenezist mutató képe, nagy számú intratumorális vérérkapillárissal (CD 31, piros fluoreszcens), nyirokerek (LYVE-1, zöld fluoreszcens) elszórva ábrázolódnak a tumorperiférián
B: a nem angiogén kissejtes tüdőrákban a tumor respektálja az alveoláris septumokat, illetve a septumokban futó inkorporált gazdaszöveti vérér (CD31, piros floureszcens) és nyirokér (LYVE-1, zöld fluoreszcens) kapillárisokat.
57
C: diffúz VEGFC (piros floureszcens) expresszió a destruktívan növekvőangiogén tumorokban
D: fokális VEGFC (piros floureszcens) expresszió a nem angiogén tumorokban A nyilak a tumorban megfigyelhetőVEGFC-t expresszáló nyirokérkapilláris (D2-40, zöld fluoreszcens) endothel sejteket jelölik a C és D ábrán Magfestés TOTO-3 (A-D ábrák) Nagyítás: x 200 .
Figure 2.
A.
B.
C.
D.
Renyi-Vamos et al.
3.ábra: A nyirokérhálózat morfometriai adatai intra és peritumorálisan a nyirokcsomó status (nyirokcsomó metasztázis pozitív ill metasztázis negatív) függvényében LYVE-1
58
és D2-40 jelöléssel. Az LVD (nyirkérdenzitás) az átlagos nyirokérszámot jelenti négyzetmiliméternként. A nyirokér kerületet micronban adtuk meg.
A: A teljes populáció átlagos LVD értékei P
Nyirokér denz itás
ny iro kér/mm 2
16
*
14 12 10
A.
*
Total Lyve N0
8
Total Lyve N+ Total D2-40 N0
t
6
Total D2-40 N+
4 2 0 Tumor centrum Tumor periféria
Peritumorális tüdő szövet
nyirokér/mm 2
Nyirokér denz itás
B.
18 16 14 12
Non-Angio Lyve N0 Non-Angio Lyve N+
10 8 6 4
Non-Angio D2-40 N0 Non-Angio D2-40 N+
2 0 Tumor centrum
Tumor periféria
Peritumorális tüd ő szövet
C.
Nyirokér denz itás
nyirokér/mm 2
16 14
*
12 10 8
* Angio Angio Angio Angio
6 4
Lyve N0 Lyve N+ D2-40 N0 D2-40 N+
2 0 Tumor centrum Tumor periféria
Peritumorális tüd ő szövet
D.
Nyirokér kerület 100
m icron
90 80 70
Total Lyve N0
60 50
Total Lyve N+ Total D2-40 N0
40 30
Total D2-40 N+
20 10 0 Tumor centrum
Tumor periféria
Peritumorális tüdő szövet
4.ábra: Az átlagos túlélés és a nyirokérdenzitás összefüggése
59
A: A teljes beteganyagra vonatkozó átlagos túlélés és tumor periféria nyirokér denzitás összefüggésének Kaplan Meier görbéje alacsony, illetve magas LYVE-1és D2-40 festődésnél.
B: Az angiogén fenotípusú betegcsoport átlagos túlélés és tumor periféria nyirokérdenzitás összefüggésének Kaplan-Meier görbéje alacsony, illetve magas LYVE-1 és D2-40 festődésnél.
C: A nem angiogén fenotípusú betegcsoport átlagos túlélés és tumor periféria nyirokérdenzitás összefüggésének Kaplan-Meier görbéje alacsony, illetve magas LYVE-1 és D2-40 festődésnél.
D: Az átlagos túlélés és az angiogén, illetve nem angiogén fenotípus összefüggésének Kaplan-Meier görbéje.
60
5.ábra: KeringőLVEPC-k kvantitativ meghatározása flow cytometriás analízissel
A: Reprezentatív flow cytometriás analízis CD 34+/VEGFR3+ LVEPC sejtek számának meghatározására (Q1=CD34-/VEGFR3+, Q2=CD34+/VEGFR3+, Q3=CD34/VEGFR3-, Q4=CD34+/VEGFR3- sejtek).
B: :”Box and Whiskers” ábrázolásnál a pont a mediánt mutatja; a Box pedig a 25%75% kvartilis tartományait, illetve az egészséges (n=32)és SCLC betegek (n=88) keringőCD34+/VEGFR3+ LVEPC szintjének maximalis/ minimalis értékeit (bajusz).
61
6. ábra: Kissejtes tüdőrákos betegek átlagos túlélése és flow cytometriával perifériás vérben mért CD34+/VEGFR3+ LVEPC szintje összefüggésének Kaplan Meier görbéje. Az alacsony és a magas kezelés előtti CD34+VEGFR3+ LVEPC szintek közötti határt 1625 LVEPC/ml-nél húztuk meg.
62
1.táblázat: Klinikopatológiai jellemzők és VEGFC expresszió összefüggése nem kissejtes tüdőrákos betegekben
VEGF-C
VEGF-C
Betegszám (%)
negatív (%)
pozitív (%)
103
47
56
<63
59 (57%)
29 (62%)
30 (53.5%)
>63
44 (43%)
18 (38%)
26 (46.5%)
Nem dohányozó
40 (39%)
17 (36%)
20 (%)
dohányzó
63 (61%)
30 (64%)
36 (%)
Angiogén
84 (81.5%)
33 (70%)
51 (91%)
Nem angiogén
19 (18.5%)
14 (30%)
5 (9%)
Férfi
62 (60%)
23 (49%)
39 (69.6%)
Nő
41 (40%)
24 (51%)
17 (30.4%)
n.s.
Laphámrák
53 (51.4%)
25 (53.2%)
28 (50%)
n.s.b
Adenocarcinoma
42 (41%)
18 (38.3%)
24 (42.9%)
Nagy sejtes rák
8 (7.6%)
4 (8.5%)
4 (7.1%)
rosszul
34 (33%)
18 (38.3%)
16 (28.6%)
közepesen
42 (41%)
20 (42.5%)
22 (39.3%)
jól
27 (26%)
9 (19.2%)
18 (32.1%)
36 (35%)
19 (40.4%)
17 (30.4%)
Összes beteg
P érték
Kor(év)
n.s.
Dohányzás
n.s.
Angiogén fenotípus
0.0065c
Nem
Szövettani típus
Tumor differenciáció
Patológiai T-stádium T1
63
n.s.
T2
54 (52.4%)
25 (53.2%)
29 (51.8%)
T3
13 (12.6%)
3 (6.4%)
10 (17.8%)
N0
55 (53.4%)
25 (53.2%)
30 (53.6%)
N1
29 (28.2%)
17 (36.2%)
12 (21.4%)
N2
19 (18.4%)
5 (10.6%)
14 (25%)
Stádium I
28 (27.2%)
12 (25.5%)
16 (28.6%)
Stádium II
58 (56.3%)
32 (68.1%)
26 (46.4%)
Stádium IIIA
17 (16.5%)
3 (6.4%)
14 (25%)
n.s.
Patológiai N-stádium
n.s.
Patológiai stádium
n.s.
2. Táblázat:A nyirokér jelölési indexek összevetése humán nem kissejtes tüdőrákban az angiogén fenotípus függvényében, Ki 67 és D2-40 kettős nyirokérjelölés alapján
Tumor Összes
Peritumorális
Centrum
Tumor Periféria
tüdőszövet
1.27+0.18a
2.48+0.21b
4.32+0.24
1.34+0.28a
2.36+0.4b
4+0.036
Nyirokcsomó negatív Nyirokcsomó pozitív
Tumor Angiogén
Peritumorális
Centrum
Tumor Periféria
tüdőszövet
1.41+0.2a
2.75+0.2b
4.41+0.25
1.96+0.29a
3.46+0.35
4.14+0.43
Nyirokcsomó negatív Nyirokcsomó pozitív
Tumor Nem angiogén
Peritumorális
Centrum
Tumor Periféria
64
tüdőszövet
Nyirokcsomó negatív
0
0
3.5+0.76
0
0
3.69+0.39
Nyirokcsomó pozitív
Az adatokat átlagban fejeztük ki+S.E.M. A statisztikai analízist Student’s teszttel végeztük. a= p0.01 (vs. tumor periféria és peritumorális tüdőszövet), b= p0.01 (vs. peritumorális tüdőszövet)
3. táblázat: Humán nem kissejtes tüdőrák különbözőprognosztikai faktorainak multivariáns analízise
Prognosztikai faktor
RR
95% CI
P
Életkor(év)(<63 vs. >63)
1.521 0.971-2.112
0.098
Nem(ffi vs nő)
1.131 0.531-2.154
0.701
Patológiai T stádium (T1 vs. T2-3)
2.102 0.966-3.528
0.029
Patológiai N stádium (N0 vs. N1-2)
2.455 1.658-3.875
0.008
VEGF-C (negatív vs. pozitív)
1.756 0.627-2.724
0.082
Angiogén fenotípus (angiogén vs. nem angiogén)
1.989 0.988-2.714
0.044
magas)
2.647 1.648-4.756
0.007
TP-LVD teljes populáció(D2-40-alacsony vs. D2-40-magas)
2.354 1.478-3.989
0.008
3.146 1.121-4.956
<0.001
2.942 1.311-4.516
0.002
TP-LVD teljes populació(LYVE-1-alacsony vs. LYVE-1-
TP-LVD angiogén NSCLC-ben(LYVE-1-alacsony vs. LYVE-1magas) TP-LVD angiogén NSCLC-ben (D2-40-alacsony vs. D2-40magas)
RR: relative risk, CI: confidence interval, TP-LVD: tumor periféria LVD
65
4. táblázat: SCLC betegek és egészséges kontroll csoport VEGFC szintje, valamint meghatározó adatai
Betegek (n=88)
Kontroll
P
csoport(egészségesek) (n=32) Nem(Ffi/Nő)
54/34 (61.4% vs.
19/13 (59.4% vs.
0.5 a
38.6%)
40.6%)
Életkor(év)
63 (range, 44-77)
61 (range, 48-70)
0.62 b
Dohányzási szokás
75/13 (85.2% vs.
26/6 (81.2% vs. 18.8%)
0.39 a
(dohányos/nem dohányos)
14.8%)
Légzésfunkció(spirometria)
74/14 (84% vs. 16%)
27/5 (84.4% vs. 15.6%)
0.61 a
4931+881d
3992+462d
<0.01e,f
(normal vagy enyhe COPD) c
VEGF-C (pg/mL)
a Fischer’s exact teszt; b Mann-Whitney teszt; c GOLD (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Diseases) klasszifikáció szerinti beosztás); d átlag+SD; e Student tteszt; fSzignifikáns különbség a beteg és az egészséges csoport között ;
66
5. táblázat: 88 kissejtes tüdőrákos beteg klinikopatológiai jellemzői és LVEPC szintje közötti összefüggés
CD34+/VEGFR3+
P
LVEPC
érték
Betegsz alacsony a (%) magas a (%) ám (%) Kor(év) a 63<
43
22
21
(48.9% (50%)
(47.7%)
) 63>
45
22
23
(51.1% (50%)
(52.3%)
)
0.83
Dohányz á-si szokás Nem
13
6
7
dohányzó (14.8% (13.7%)
(15.9%)
) dohányzó 75
38
37
(85.2% (86.3%)
(84.1%)
)
0.77
Nem FFi
54
25
29
(61.4% (56.8%)
(65.9%)
) Nő
34
19
15
(38.6% (43.2%)
(34.1%)
)
0.38
N stádium
67
N0-1
24
21
3
(27.3% (47.3%)
(6.8%)
) N2-3
64
23
41
(72.7% (52.7%)
(93.2%)
)
<0.01
T stádium T1
T2-T4
8
6
2
(9.1%)
(13.6%)
(4.5%)
80
38
42
(90.9% (86.4%)
(95.5%)
)
0.14
VEGF-C szint b Magas
44(50% 22
22
)
(50%)
(50%)
Alacsony 44(50% 22
22
)
(50%)
(50%)
68
37
31
1
Kemoter ápiás kombiná ció EP
(77.3% (84.1%)
(70.5%)
) EP+CEV 20
7
13
(22.7% (15.9%)
(29.5%)
)
68
0.13
a küszöb értéknek a medián értéket vettük; b küszöb értéknek az átlag értéket vettük, a zárójelben jelölt adatok az oszlopadatok százalékos arányát mutatják; CT, kemoterápia; EP: cisplatin és etoposide; CEV: cyclophosphamide, epirubicin és vincristine
69
6. táblázat: Kissejtes tüdőrákos betegek különbözőprognosztikai faktorainak multivariáns analízise
Prognosztikai faktor
RR
95% CI
P
Kor évben kifejezve (<63 versus ≥63)
1.213 (0.747-1.969)
0.434
Nem(Ffi versus nő)
1.081 (0.655-1.782)
0.761
T stádium(T1 versus T2-4)
2.024 (0.725-5.65)
0.178
N stádium(N0-1 versus N2-3)
2.634 (1.215-5.711)
0.014
CD34+/VEGFR3+ LVEPC szint(alacsony versus magas)a
5.379 (2.659-10.882) <0.01
VEGF-C szérum szint(alacsony versus magas)b
1.221 (0.76-1,961)
0.408
a küszöb értéknek a medián értéket vettük; b küszöb értéknek az átlag értéket vettük; RR: relative risk, CI: confidence interval XII. Irodalomjegyzék
1 Jemal A, Murray T, Ward E, et al. Cancer statistics, 2005. CA Cancer J Clin 2005; 55:10-30. 2 Kovács G,Ostoros Gy,Szondy K, et al.Tüdőrák a gyakorlatban 2004.Medicina ,14-15 3 Risau W, Flamme I. Vasculogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 1995; 11:73-91. 4 Auerbach R, Gilligan B, Lu LS, Wang SJ. Cell interactions in the mouse yolk sac: vasculogenesis and haematopoesis. J Cell Physiol 1997; 173: 202-205. 5 Jain RK, Schlenger K, Hockel M, Yuan F. Quantitative angiogenesis assays: progress and problems. Nat Med 1997; 3:1203-8. 6 Pepper MS. Positive and negative regulation of angiogenesis: from cell biology to the clinic. Vasc Med 1996; 1:259-66. 7 Ausprunk DH, Folkman J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvasc Res 1977; 14:53-65. 8 Wilting J, Brand-Saberi B, Kurz H, Christ B. Development of the embryonic vascular system. Cell Mol Biol Res 1995; 41:219-32.
70
9 Flamme I, Risau W. Induction of vasculogenesis and hematopoiesis in vitro. Development 1992; 116:435– 439. 10 Risau W, sariola H, Zerwes HG, Sasse J, Ekblom P, Kemler R, Doetschman T. Vasculogenesis and angiogenesis in embryonic stem cell-derived embryoid bodies. Development 1988; 102:471-478. 11 Folkman J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. Ann Surg. 1972; 175:409-16. 12 Thompson WD, Shiach KJ, Fraser RA, McIntosh LC, Simpson JG. Tumours acquire their vasculature by vessel incorporation, not vessel ingrowth. J Pathol 1987; 151: 323– 332. 13 Holash J, Maisonpierre PC, Compton D, et al. Vessel cooption, regression, and growth in tumours mediated by angiopoietins and VEGF. Science 1999; 284: 1994– 1998. 14 Pezzella F, Pastorino U, Tagliabue E, et al. Non-small-cell lungcarcinoma tumour growth without morphological evidence of neo-angiogenesis. Am J Pathol 1997; 151: 1417–1423. 15 Pezzella F, Di Bacco A, Andreola S, Nicholson AG, Pastorino U, Harris AL. Angiogenesis in primary lung cancer and lung secondaries. Eur J Cancer 1996; 32A: 2494-2500. 16 Dvorak HF. Tumours: wounds that do not heal. Similarities between tumour stroma generation and wound healing. N Engl J Med 1986; 315: 1650–1659. 17 Short RHD. Alveolar epithelium in relation to growth of the lung. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1950; 235:35-87. 18 Caduff JH, Fischer LC, Burri PH. Scanning electron microscope study of the developing microvasculature in the postnatal rat lung. Anat Rec 1986; 216:154-64. 19 Rojiani AM, Dorovini-Zis K.Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study. J Neurosurg 1996; :1078–1084. 20 Wesseling P, Schlingemann RO, Rietveld FJR, et al. Early and extensive contribution of pericytes/vascular smooth muscle cells to microvascular proliferation in glioblastoma multiforme: An immuno-light and immuno-electron microscopic study. J Neuropathol Exp Neurol 1995; 54:304-310.
71
21 Cotran ES, Kumar V, Collins T. Robbins pathologic basis of disease. 1999; 6th ed. pp. 1344-45. 22 Ito T, Kitamura H, Nakamura N, et al. A comparative study of vascular proliferation in brain metastasis of lung carcinomas. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol 1993; 23:13-7. 23 Sundberg C, Nagy JA, Brown LF, Feng D, Eckelhoefer IA, Manseau EJ, Dvorak AM, Dvorak HF. Glomeruloid microvascular proliferation follows adenoviral vascular permeability factor /vascular endothelial growth factor-164 gene delivery. Am J Pathol 2001; 158:1145–1160. 24 Maniotis AJ, Folberg R, Hess A, Seftor EA, Gardner LM, Pe'er J, Trent JM, Meltzer PS, Hendrix MJ. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry. Am J Pathol 1999; 155:739-52. 25 Folberg R, Hendrix MJ, Maniotis AJ. Vasculogenic mimicry and tumor angiogenesis. Am J Pathol 2000; 156:361-81. 26 Tímár J, Tóth J, Döme B, Paku S. Tumoral sinuses or vascular channels in tumors: legacy of B. Kellner (1904-1975). Hungarian Oncology 2000; 44:105–107. 27 Kellner B. Die Fettmorphologie der Sarkome. Z Krebsforsch 1941; 52:240-246. 28 Willis RA. Pathology of tumours. Butterworth & Co., Ltd., London 1948; p136. 29 Francois J. Malignant melanoma of the choroid. Br J Ophthalmol 1963; 47:736-743. 30 Francois J. Neetens A. Physico-anatomical studies of spontaneous and experimental intraocular new growth: vascular supply. Bibl Anat 1967; 9:403-411. 31 Jensen OA. The Knapp-Ronne type of malignant melanoma of the choroid: a haemangioma-like melanoma with a typical clinical picture. So-called „pre-retinal malignant choroidal melanoma”. Acta Ophtalmol 1976; 54:41-54. 32 Warren BA. The vascular morphology of tumors. Peterson H-I eds. In Tumor Blood Circulation: Angiogenesis, Vascular Morphology and Blood Flow of Experimental and Human Tumors. 1979; pp 1-48. CRC Press, Inc., Boca Raton. 33 Prause JU, Jensen OA: Scanning electron microscopy of frozen-cracked, dry-cracked and enzyme-digested tissue of human malignant choroidal melanomas. Albrecht Von Graefes Arch Klin Exp Ophthalmol 1980; 212:217-225.
72
34 Hammersen F, Endrich B, Messmer K: The fine structure of tumor blood vessels. I. Participation of non-endothelial cells in tumor angiogenesis. Int J Microcirc Clin Exp 1985; 4:31-43. 35 Chang YS, di Tomaso E, McDonald DM, Jones R, Jain RK, Munn LL. Mosaic blood vessels in tumors: frequency of cancer cells in contact with flowing blood. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97:14608-13. 36 Asahara T, Murohara T, Sullivan A, Silver M, van der Zee R, Li T, Witzenbichler B, Schatteman G, Isner JM. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 1997; 275:965–967. 37 Yin AH, Miraglia S, Zanjani ED, et al. AC133, a novel marker for Human hematopoetic stem and progenitor cells. Blood 1997; 90:5000-12. 38 Lin Y, Weisdorf DJ, Solovey A, Hebbel RP. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest 2000; 105:71–77. 39 Asahara T, Masuda H, Takahashi T et al. Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ Res 1999; 85: 221–228. 40 Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ, et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function. Nat Med 2001; 7:430– 436. 41 Takahashi T, Kalka C, Masuda H, et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med 1999; 5:434–438. 42 Peichev M, Naiyer AJ, Pereira D, et al. Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34(1) cells identifies a population of functional endothelial precursors. Blood 2000; 95:952–958. 43 Delmotte P, Martin B, Paesmans M, Berghmans T, Mascaux C, Meert AP, Steels E, Verdebout JM, Lafitte JJ, Sculier JP. VEGF and survival of patients with lung cancer: a systematic literature review and meta-analysis. Rev Ma Respir 19:577-84, 2002 44 Fontanini G, Vignati S, Boldrini L, Chinè S, Silvestri V, Lucchi M, Mussi A, Angeletti CA, Bevilacqua G. Vascular endothelial growth factor is associated with
73
neovascularization and influences progression of non-small cell lung carcinoma. Clin Cancer Res 3:861-5, 1997 45 Han H, Silverman JF, Santucci TS, Macherey RS, d'Amato TA, Tung MY, Weyant RJ, Landreneau RJ. Vascular endothelial growth factor expression in stage I non-small cell lung cancer correlates with neoangiogenesis and a poor prognosis. Ann Surg Oncol 8:72-9, 2001 46 Vignaud JM, Marie B, Klein N, Plénat F, Pech M, Borrelly J, Martinet N, Duprez A, Martinet Y. The role of platelet-derived growth factor production by tumor-associated macrophages in tumor stroma formation in lung cancer. Cancer Res 54:5455-63, 1994 47 Iwasaki A, Kuwahara M, Yoshinaga Y, Shirakusa T. Basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) levels, as prognostic indicators in NSCLC. Eur J Cardiothorac Surg 25:443-8, 2004 48 Shiraga M, Yano S, Yamamoto A, Ogawa H, Goto H, Miki T, Miki K, Zhang H, Sone S. Organ heterogeneity of host-derived matrix metalloproteinase expression and its involvement in multiple-organ metastasis by lung cancer cell lines. Cancer Res 62:5967–73, 2002 49 Ellis LM. Epidermal growth factor receptor in tumor angiogenesis. Hematol Oncol Clin North Am 18:1007-21, 2004 viii. 50 Zhang L, Chen J, Ke Y, Mansel RE, Jiang WG. Expression of Placenta growth factor (PlGF) in non-small cell lung cancer (NSCLC) and the clinical and prognostic significance. World J Surg Oncol 13, 3, 68, 2005 51 Chen JJ, Yao PL, Yuan A, Hong TM, Shun CT, Kuo ML, Lee YC, Yang PC. Upregulation of tumor interleukin-8 expression by infiltrating macrophages: its correlation with tumor angiogenesis and patient survival in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 9:729-37, 2003 52 Olivero M, Rizzo M, Madeddu R, Casadio C, Pennacchietti S, Nicotra MR, Prat M, Maggi G, Arena N, Natali PG, Comoglio PM, Di Renzo MF. Overexpression and activation of hepatocyte growth factor/scatter factor in human non-small-cell lung carcinomas. Br J Cancer 74:1862-8, 1996 53 Tanaka F, Ishikawa S, Yanagihara K, Miyahara R, Kawano Y, Li M, Otake Y, Wada H. Expression of angiopoietins and its clinical significance in non-small cell lung cancer. Cancer Res 62:7124-9, 2002
74
54 Passalidou E, Trivella M, Singh N, Ferguson M, Hu J, Cesario A, Granone P, Nicholson AG, Goldstraw P, Ratcliffe C, Tetlow M, Leigh I, Harris AL, Gatter KC, Pezzella F. Vascular phenotype in angiogenic and non-angiogenic lung non-small cell carcinomas. Br J Cancer 86:244-9, 2002 55 Hu J, Bianchi F, Ferguson M, Cesario A, Margaritora S, Granone P, Goldstraw P, Tetlow M, Ratcliffe C, Nicholson AG, Harris A, Gatter K, Pezzella F. Gene expression signature for angiogenic and nonangiogenic non-small-cell lung cancer. Oncogene 24:1212-9, 2005 56 Dome B, Dobos J, Tovari J, Paku S, Kovacs G, Ostoros G, Timar J. Circulating bone marrow-derived endothelial progenitor cells: Characterization, mobilization, and therapeutic considerations in malignant disease. Cytometry A 73:186-93, 2008 57 Fujimoto K, Abe T, Müller NL, Terasaki H, Kato S, Sadohara J, Kono R, Edamitsu O, Ishitake T, Hayashi A, Rikimaru T, Hayabuchi N. Small peripheral pulmonary carcinomas evaluated with dynamic MR imaging: correlation with tumor vascularity and prognosis. Radiology 227:786-93, 2003 58 Li X, Tjwa M, Moons L, Fons P, Noel A, Ny A, Zhou JM, Lennartsson J, Li H, Luttun A, Ponten A, Devy L, Bouche A, Oh H, Manderveld A, Blacher S, Communi D, Savi P, Bono F, Dewerchin M, Foidart JM, Autiero M, Herbert JM, Collen D, Heldin CH, Eriksson U, Carmeliet P. Revascularization of ischemic tissues by PDGF-CC via effects on endothelial cells and their progenitors. J Clin Invest 115:118-27, 2005 59 Li B, Sharpe EE, Maupin AB, Teleron AA, Pyle AL, Carmeliet P, Young PP. VEGF and PlGF promote adult vasculogenesis by enhancing EPC recruitment and vessel formation at the site of tumor neovascularization. FASEB J 20:1495-7, 2006 60 Aicher A, Heeschen C, Mildner-Rihm C, Urbich C, Ihling C, Technau-Ihling K, Zeiher AM, Dimmeler S. Essential role of endothelial nitric oxide synthase for mobilization of stem and progenitor cells. Nat Med 9:1370–1376, 2003 61 Moore MA, Hattori K, Heissig B, Shieh JH, Dias S, Crystal RG, Rafii S. Mobilization of endothelial and hematopoietic stem and progenitor cells by adenovector-mediated elevation of serum levels of SDF-1, VEGF, and angiopoietin-1. Ann. N.Y. Acad Sci 938:36–47, 2001
75
62 Llevadot J, Murasawa S, Kureish Y, Uchida S, Masuda H, Kawamoto A, Walsh K, Isner JM, Asahara T. HMG-CoA reductase inhibitor mobilizes bone marrow–derived endothelial progenitor cells. J Clin Invest 108:399–405, 2001 63 Strehlow K, Werner N, Berweiler J, Link A, Dirnagl U, Priller J, Laufs K, Ghaeni L, Milosevic M, Bohm M, Nickenig G. Estrogen increases bone marrow-derived endothelial progenitor cell production and diminishes neointima formation. Circulation 107:3059–3065, 2003 64 Seeger FH, Haendeler J, Walter DH, Rochwalsky U, Reinhold J, Urbich C, Rossig L, Corbaz A, Chvatchko Y, Zeiher AM, Dimmeler S. p38 mitogen-activated protein kinase downregulates endothelial progenitor cells. Circulation 111:1184-91, 2005 65 Verma S, Kuliszewski MA, Li SH, Szmitko PE, Zucco L, Wang CH, Badiwala MV, Mickle DA, Weisel RD, Fedak PW, Stewart DJ, Kutryk MJ. C-reactive protein attenuates endothelial progenitor cell survival, differentiation, and function: further evidence of a mechanistic link between C-reactive protein and cardiovascular disease. Circulation 109:2058-67, 2004 66 Ho JW, Pang RW, Lau C, Sun CK, Yu WC, Fan ST, Poon RT. Significance of circulating endothelial progenitor cells in hepatocellular carcinoma. Hepatology 44:83643, 2006 67 Furstenberger G, von Moos R, Lucas R, Thurlimann B, Senn HJ, Hamacher J, Boneberg EM. Circulating endothelial cells and angiogenic serum factors during neoadjuvant chemotherapy of primary breast cancer. Br J Cancer 94:524-31, 2006 68 Willett CG, Boucher Y, di Tomaso E, Duda DG, Munn LL, Tong RT, Chung DC, Sahani DV, Kalva SP, Kozin SV, Mino M, Cohen KS, Scadden DT, Hartford AC, Fischman AJ, Clark JW, Ryan DP, Zhu AX, Blaszkowsky LS, Chen HX, Shellito PC, Lauwers GY, Jain RK. Direct evidence that the VEGF-specific antibody bevacizumab has antivascular effects in human rectal cancer. Nat Med 10:145-7, 2004 69 Zhang H, Vakil V, Braunstein M, Smith EL, Maroney J, Chen L, Dai K, Berenson JR, Hussain MM, Klueppelberg U, Norin AJ, Akman HO, Ozcelik T, Batuman OA. Circulating endothelial progenitor cells in multiple myeloma: implications and significance. Blood 105:3286-94, 2005 70 Massa M, Rosti V, Ramajoli I, Campanelli R, Pecci A, Viarengo G, Meli V, Marchetti M, Hoffman R, Barosi G. Circulating CD34+, CD133+, and vascular
76
endothelial growth factor receptor 2-positive endothelial progenitor cells in myelofibrosis with myeloid metaplasia. J Clin Oncol 23:5688-95, 2005 71 Igreja C, Courinha M, Cachaco AS, Pereira T, Cabecadas J, da Silva MG, Dias S. Characterization and clinical relevance of circulating and biopsy-derived endothelial progenitor cells in lymphoma patients. Haematologica 92:469-77, 2007 72 Wierzbowska A, Robak T, Krawczynska A, Wrzesien-Kus A, Pluta A, Cebula B, Smolewski P. Circulating endothelial cells in patients with acute myeloid leukemia. Eur J Haematol 75:492-7, 2005 73 Zheng PP, Hop WC, Luider TM, Sillevis Smitt PA, Kros JM. Increased levels of circulating endothelial progenitor cells and circulating endothelial nitric oxide synthase in patients with gliomas. Ann Neurol 62:40-8, 2007 74 Dome B, Timar J, Dobos J, Meszaros L, Raso E, Paku S, Kenessey I, Ostoros G, Magyar M, Ladanyi A, Bogos K, Tovari J. Identification and clinical significance of circulating endothelial progenitor cells in human non-small cell lung cancer. Cancer Res 66:7341-7, 2006 75 Hilbe W, Dirnhofer S, Oberwasserlechner F, Schmid T, Gunsilius E, Hilbe G, Wöll E, Kähler CM. CD133 positive endothelial progenitor cells contribute to the tumour vasculature in non-small cell lung cancer. J Clin Pathol 57:965-9, 2004 76 Alitalo K, Tammela T, Petrova TV (2005) Lymphangiogenesis in development and human disease. Nature 438: 946– 953 77 Di Nucci A, Marchetti C, Serafini S, Piovella F (1996) P-selectin and von Willebrand factor in bovine mesenteric lymphatics: an immunofluorescent study. Lymphology 29: 25– 28 78 Marchetti C (1996) Weibel-Palade bodies and lymphatic endothelium:observations in the lymphatic vessels of normal and inflamed human dental pulps. Vasa 25: 337– 340 79 Sacchi G, Weber E, Agliano M, Cavina N, Comparini L (1999) Lymphatic vessels of the human heart: precollectors and collecting vessels. A morpho-structural study. J Submicrosc Cytol Pathol 31: 515–525 80 Petrova TV, Makinen T, Makela TP, Saarela J, Virtanen I, Ferrell RE, Finegold DN, Kerjaschki D, Yla-Herttuala S, Alitalo K (2002) Lymphatic endothelial reprogramming of vascular endothelial cells by the Prox-1 homeobox transcription factor. EMBO J 21: 4593–4599
77
81 Podgrabinska S, Braun P, Velasco P, Kloos B, Pepper MS, Jackson DG, Skobe M (2002) Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. PNAS 99: 16069– 16074 82 Hirakawa S, Kodama S, Kunstfeld R, Kajiya K, Brown LF, Detmar M (2005) VEGF-A induces tumor and sentinel lymph node lymphangiogenesis and promotes lymphatic metastasis. J Exp Med 201: 1089–1099 83 Sleeman JP, Krishnan J, Kirkin V, Baumann P (2001) Markers for the lymphatic endothelium: in search of the Holy Grail? Microsc Res Tech 55: 61–69 84 Garrafa E, Alessandri G, Benetti A, Turetta D, Corradi A, Cantoni AM, Cervi E, Bonardelli S, Parati E, Giulini SM, Ensoli B, Caruso A (2006) Isolation and characterization of lymphatic microvascular endothelial cells from human tonsils. J Cell Physiol 207: 107–113 85 Pepper MS, Skobe M (2003b) Lymphatic endothelium: morphological, molecular and functional properties. J Cell Biol 163: 209–213 86 Swartz MA, Skobe M (2001) Lymphatic function, lymphangiogenesis, and cancer metastasis. Microsc Res Tech 55: 92–99 87 Wigle JT, Oliver G: Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell 98:769-778, 1999 88 Wigle JT, Harvey N, Detmar M, et al: An essential role for Prox1 in the induction of the lymphatic endothelial cell phenotype. Embo J 21: 1505-1513, 2002 89 Hong YK, Harvey N, Noh YH, et al: Prox1 is a master control gene in the program specifying lymphatic endothelial cell fate. Dev Dyn 225:351-357, 2002 90 Harvey NL, Srinivasan RS, Dillard ME, et al: Lymphatic vascular defects promoted by Prox1 haploinsufficiency cause adult-onset obesity. Nat Genet 37:1072-1081, 2005 91 Karkkainen MJ, Haiko P, Sainio K, et al: Vascular endothelial growth factor C is required for sprouting of the first lymphatic vessels from embryonic veins. Nat Immunol 5:74-80, 2004 92 Baldwin ME, Halford MM, Roufail S, et al: Vascular endothelial growth factor D is dispensable for development of the lymphatic system. Mol Cell Biol 25:2441-2449, 2005
78
93 Suzuki H, Watabe T, Kato M, et al: Roles of vascular endothelial growth factor receptor 3 signaling in differentiation of mouse embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells into endothelial cells. Blood 105:2372-2379, 2005 94 Dumont DJ, Jussila L, Taipale J, et al: Cardiovascular failure in mouse embryos deficient in VEGF receptor-3. Science 282:946-949, 1998 95 Petrova TV, Karpanen T, Norrmen C, et al: Defective valves and abnormal mural cell recruitment underlie lymphatic vascular failure in lymphedema distichiasis. Nat Med 10:974-981, 2004 96 Ma¨kinen T, Adams RH, Bailey J, et al: PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes Dev 19: 397-410, 2005 97 Schacht V, Ramirez MI, Hong YK, et al: T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema. Embo J 22:35463556, 2003 98 Karkkainen MJ, Saaristo A, Jussila L, et al: A model for gene therapy of human hereditary lymphedema. Proc Natl Acad Sci U S A 98:12677-12682, 2001 99 Yuan L, Moyon D, Pardanaud L, et al: Abnormal lymphatic vessel development in neuropilin 2 mutant mice. Development 129:4797-4806, 2002 100 Morisada T, Oike Y, Yamada Y, et al: Angiopoietin-1 promotes LYVE-1-positive lymphatic vessel formation. Blood 105:4649-4656, 2005 101 Vlahakis NE, Young BA, Atakilit A, et al: The lymphangiogenic vascular endothelial growth factors VEGF-C and -D are ligands for the integrin {alpha}9{beta}1. J Biol Chem 280:4544-4552, 2005 102 Abtahian F, Guerriero A, Sebzda E, et al: Regulation of blood and lymphatic vascular separation by signaling proteins SLP-76 and Syk. Science 299:247-251, 2003 103 Mebius RE: Organogenesis of lymphoid tissues. Nat Rev Immunol 3:292-303, 2003 104 Pepper MS. Lymphangiogenesis and tumor metastasis: myth or reality? Clin Cancer Res 2001;7:462e468. 105 Breiteneder-Geleff S, Soleiman A, Kowalski H, et al: Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: Podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol 154:385-394, 1999
79
106 Banerji S, Ni J, Wang SX, et al: LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol 144:789-801, 1999 107 Kahn HJ, Marks A: A new monoclonal antibody, D2-40, for detection of lymphatic invasion in primary tumors. Lab Invest 82:1255-1257, 2002 108 Schledzewski K, Falkowski M, Moldenhauer G, et al: Lymphatic endotheliumspecific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1, F4/80, CD11b macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: Implications for the assessment of lymphangiogenesis. J Pathol 209:67-77, 2006 109 Hirakawa S, Hong YK, Harvey N, et al: Identification of vascular lineage-specific genes by transcriptional profiling of isolated blood vascular and lymphatic endothelial cells. Am J Pathol 162:575- 586, 2003 110 STRAUME,O.&L.A.AKSLEN. 1996. Independent prognostic importance of vascular invasion in nodular melanomas. Cancer 78: 1211–1219. 111 KASHANI-SABET, M. et al. 2001. Vascular involvement in the prognosis of primary cutaneousmelanoma. Arch. Dermatol.137: 1169–1173. 112 HODA, S.A. et al. 2006. Issues relating to lymphovascular invasion in breast carcinoma. Adv. Anat. Pathol. 13: 308– 315. 113 KIRUPARAN, P. & L. FORREST. 2007. Prediction in breast cancer of the extent of axillary node involvement from the size and lymphovascular invasion status of the primary tumour: medico-legal considerations. Eur. J. Surg. Oncol. 33: 435–437. 114 LEE, C.C. et al. 2007. Survival predictors in patients with node-negative gastric carcinoma. J. Gastroenterol. Hepatol. 22: 1014–1018. 115 DICKEN, B.J. et al. 2006. Lymphovascular invasion is associated with poor survival in gastric cancer: an application of gene-expression and tissue array techniques. Ann. Surg. 243: 64–73. 116 QUEK, M.L. et al. 2005. Prognostic significance of lymphovascular invasion of bladder cancer treated with radical cystectomy. J. Urol. 174: 103–106 117 CHENG, L. et al. 2005. Lymphovascular invasion is an independent prognostic factor in prostatic adenocarcinoma. J. Urol. 174: 2181–2185.
80
118 KIM, J.C. et al. 2005. Genetic and pathologic changes associated with lymphovascular invasion of colorectal adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis 22: 421– 428. 119 BENSON, R. et al. 2001. Local excision and postoperative radiotherapy for distal rectal cancer. Int. J. Radiat. Oncol Biol. Phys. 50: 1309–1316. 120 HACHISUGA, T. et al. 1999. The grading of lymphovascular space invasion in endometrial carcinoma. Cancer 86: 2090–2097. 121 VAN DER AUWERA, I. et al. 2006. First international consensus on the methodology of lymphangiogenesis quantification in solid human tumours. Br. J.Cancer 95: 1611–1625. 122 PEPPER, M.S. et al. 2003. Lymphangiogenesis and tumor metastasis. Cell Tissue Res. 314: 167–177. 123 CASSELLA, M. & M. SKOBE. 2002. Lymphatic vessel activation in cancer. Ann. N.Y. Acad. Sci. 979: 120–130. 124 ISAKA,N. et al. 2004. Peritumor lymphatics induced by vascular endothelial growth factor-C exhibit abnormal function. Cancer Res. 64: 4400–4404. 125 HIRAKAWA, S. et al. 2007. VEGF-C-induced lymphangiogenesis in sentinel lymph nodes promotes tumor metastasis to distant sites. Blood 109: 1010–1017. 126 HARRELL,M.I., B.M. IRITANI&A. RUDDELL. 2007. Tumorinduced sentinel lymph node lymphangiogenesis and increased lymph flow precede melanoma metastasis. Am. J. Pathol. 170: 774–786. 127 QIAN, C.N. et al. 2006. Preparing the “soil”: the primary tumor induces vasculature reorganization in the sentinel lymph node before the arrival of metastatic cancer cells. Cancer Res. 66: 10365–10376. 128 RUDDELL, A. et al. 2007. p19/Arf and p53 suppress sentinel lymph node lymphangiogenesis and carcinomametastasis. Oncogene [Epub ahead of print]. 129 VAN DEN EYNDEN, G.G. et al. 2006. Induction of lymphangiogenesis in and around axillary lymph node metastases of patients with breast cancer. Br. J. Cancer 95: 1362–1366. 130 VANDEN EYNDEN, G.G. et al. 2007. Increased sentinel lymph node lymphangiogenesis is associated with nonsentinel axillary lymph node involvement in breast cancer patients with a positive sentinel node. Clin. Cancer Res. 13: 5391–
81
5397. 131 ANGELI, V. et al. 2006. B cell-driven lymphangiogenesis in inflamed lymph nodes enhances dendritic cell mobilization. Immunity 24: 203–215 132 He Y, Rajantie I, Pajusola K, et al: Vascular endothelial cell growth factor receptor 3-mediated activation of lymphatic endothelium is crucial for tumor cell entry and spread via lymphatic vessels. Cancer Res 65:4739-4746, 2005 133 Wong SY, Haack H, Crowley D, et al: Tumorsecreted vascular endothelial growth factor-C is necessary for prostate cancer lymphangiogenesis, but lymphangiogenesis is unnecessary for lymph node metastasis. Cancer Res 65:9789-9798, 2005 134 Mu¨ller A, Homey B, Soto H, et al: Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis. Nature 410:50-56, 2001 135 Kriehuber E, Breiteneder-Geleff S, Groeger M, et al: Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. J Exp Med 194:797-808, 2001 136 Streit M, Detmar M: Angiogenesis, lymphangiogenesis, and melanoma metastasis. Oncogene 22:3172-3179, 2003 ev Cancer 5:735-743, 2005 137 Carmeliet P, Jain RK. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 2000;407:249e257 138 Stacker SA, Achen MG, Jussila L, Baldwin ME, Alitalo K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer 2002;2:573e583 139 Ji RC. Lymphatic endothelial cells, lymphangiogenesis, and extracellular matrix. Lymph Res Biol 2006;4:83e100. 140 Saharinen P, Tammela T, Karkkainen MJ, Alitalo K. Lymphatic vasculature: development, molecular regulation and role in tumor metastasis and inflammation. Trends Immunol 2004;25:387e395. 141 Padera TP, Kadambi A, Tomaso E, Carreira CM, Brown EB, Boucher Y, et al. Lymphatic metastasis in the absence of functional intratumor lymphatics. Science 2002;296:1883e1886. 142 Dadras SS, Paul T, Bertoncini J, Brown LF, Muzikansky A, Jackson DG, et al. Tumor lymphangiogenesis: a novel prognostic indicator for cutaneous melanoma metastasis and survival. Am J Pathol 2003;162:1951e1960.
82
143 Stacker SA, Caesar C, Baldwin ME, Thornton GE, Williams RA, Prevo R, et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med 2001;7:186e191 144 Karpanen T, Egeblad M, Karkkainen MJ, Kubo H, Yla-Herttuala S, Jaattela M, et al. Vascular endothelial growth factor C promotes tumor lymphangiogenesis and intralymphatic tumor growth. Cancer Res2001;61:1786e1790. 145 Jackson DG, Prevo R, Clasper S, Banerji S. LYVE-1, the lymphatics and tumor lymphangiogenesis. Trends Immunol 2001;22:317e321 146 Stacker SA, Baldwin ME, Achen MG. The role of tumor lymphangiogenesis in metastatic spread. FASEB J 2002;16:922e934 147 Dadras SS, Lange-Asschenfeldt B, Velasco P, Nguyen L, Vora A, Muzikansky A, et al. Tumor lymphangiogenesis predicts melanoma metastasis to sentinel lymph nodes. Mod Pathol 2005;18:1232e1242 148 Rubbia-Brandt L, Terris B, Giostra E, Dousset B, Morel P, Pepper MS. Lymphatic vessel density and vascular endothelial growth factor-C expression correlate with malignant behavior in human pancreatic endocrine tumors. Clin Cancer Res 2004;10:6919e6928 149 Gombos Z, Xu X, Chu CS, Zhang PJ, Acs G. Peritumoral lymphatic vessel density and vascular endothelial growth factor C expression in early-stage squamous cell carcinoma of the uterine cervix. Clin Cancer Res 2005;11:8364e8371 150 Maula SM, Luukkaa M, Grenman R, Jackson D, Jalkanen S, Ristamaki R. Intratumoral lymphatics are essential for the metastatic spread and prognosis in squamous cell carcinomas of the head and neck region. Cancer Res 2003;63:1920e1926. 151 Hall FT, Freeman JL, Asa SL, Jackson DG, Beasley NJ. Intratumoral lymphatics and lymph node metastases in papillary thyroid carcinoma. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2003;129:716e719. 152 Kyzas PA, Geleff S, Batistatou A, Agnantis NJ, Stefanou D. Evidence for lymphangiogenesis and its prognostic implications in head and neck squamous cell carcinoma. J Pathol 2005;206:170e177 153 Karpanen T, Alitalo K. Lymphatic vessels as targets for tumor therapy? J Exp Med 2001;194:37e42
83
154 Taipale J, Makinen T, Arighi E, Kukk E, Karkkainen M, Alitalo K. Vascular endothelial growth factor-3. Curr Top Microbiol Immunol 1999;237:85e96. 155 Joukov V, Pajusola K, Kaipainen A, Chilov D, Lahtinen I, Kukk E, et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J 1996;15:290e298 156 Achen MG, Jeltsch M, Kukk E, Makinen T, Vitali A, Wilks AF, et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:548e553. 157 Achen MG, Stacker SA. Tumor lymphangiogenesis and metastatic spread—new players begin to emerge. Int J Cancer 2006;119: 1755e1760. 158 Su JL, Yang PC, Shih JY, Yang CY, Wei LH, Hsieh CY, et al. The VEGFC/VEGFR-3 axis promotes invasion and metastasis of cancer cells. Cancer Cell 2006;9:209e223. 159 Lin J, Lalani AS, Harding TC, Gonzalez M, Wu WW, Luan B, et al. Inhibition of lymphogenous metastasis using adeno-associated virusmediated gene transfer of a soluble VEGFR-3 decoy receptor. Cancer Res 2005;65:6901e6909. 160 Alitalo K, Carmeliet P. Molecular mechanisms of lymphangiogenesis in health and disease. Cancer Cells 2002;1:219e227 161 Arinaga M, Noguchi T, Takeno S, Chujo M, Miura T, Uchida Y. Clinical significance of vascular endothelial growth factor C and vascular endothelial growth factor receptor 3 in patients with non-small cell lung carcinoma. Cancer 2003;97:457e464. 162 Kojima H, Shijubo N, Yamada G, Ichimiya S, Abe S, Satoh M, et al. Clinical significance of vascular endothelial growth factor-C and vascular endothelial growth factor receptor 3 in patients with T1 lung adenocarcinoma. Cancer 2005;104:1668e1677. 163 Ogawa E, Takenaka K, Yanagihara K, Kurozumi M, Manabe T, Wada H, et al. Clinical significance of VEGF-C status in tumor cells and stromal macrophages in nonsmall cell lung cancer patients. Br J Cancer 2004;91:498e503.
84
164 Achen MG, Williams RA, Baldwin ME, Lai P, Roufail S, Alitalo K, et al. The angiogenic and lymphangiogenic factor vascular endothelial growth factor-D exhibits a paracrine mode of action in cancer. Growth Factors 2002;20:99e107. 165 Han SL, Tang HJ, Hua YW, Ji SQ, Lin DX. Expression of COX-2 in stomach cancers and its relation to their biological features. Dig Surg 2003;20:107e114. 166 Ohno R, Yoshinaga K, Fujita T, Hasegawa K, Iseki H, Tsunozaki H, et al. Depth of invasion parallels increased cyclooxygenase-2 levels in patients with gastric carcinoma. Cancer 2001;91:1876e1881. 167 Chen CN, Sung CT, Lin MT, Lee PH, Chang KJ. Clinicopathologic association of cyclooxygenase 1 and cyclooxygenase 2 expression in gastric adenocarcinoma. Ann Surg 2001;233:183e188. 168 Zha S, Yegnasubramanian V, Nelson WG, Isaacs WB, Marzo AM. Cyclooxygenases in cancer: progress and perspective. Cancer Lett 2004; 215:1e20. 169 Su JL, Shih JY, YenML, Jeng YM, Chang CC, Hsieh CY, et al. Cyclooxygenase-2 induces EP1-and HER-2/Neu-dependent vascular endothelial growth factor-C upregulation: a novel mechanismof lymphangiogenesis in lung adenocarcinoma. Cancer Res 2004;64:554e564. 170 Timoshenko AV, Chakraborty C, Wagner GF, Lala PK. COX- 2-mediated stimulation of the lymphangiogenic factor VEGF-C in human breast cancer. Br J Cancer 2006;94:1154e1163 171 Da MX, Wu XT, Wang J, Guo TK, Zhao ZG, Luo T, et al. Expression of cyclooxygenase-2 and vascular endothelial growth factor-c correlates with lymphangiogenesis and lymphatic invasion in human gastric cancer. Arch Med Res 2008;39:92e99. 172 Alitalo K, Mohla S, Ruoslahti E. Lymphangiogenesis and cancer: meeting report. Cancer Res 2004;64:9225e9229 173 Barnes NLP, Waenberg F, Farnie G, White D, Jiang W, Anderson E, et al. Cyclooxygenase-2 inhibition:effects on tumour growth, cell cycling and lymphangiogenesis in a xenograft model of breast cancer. Br J Cancer 2007;96:575e582 174 Dailey L, Ambrosetti D, Mansukhani A, Basilico C. Mechanisms underlying differential responses to FGF signaling. Cytokine Growth Factor Rev 2005;16:233e247.
85
175 Chang LK, Garcia-Cardena G, Farnebo F, Fannon M, Chen EJ, Butterfield C, et al. Dose dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:11658e11663. 176 Cao R, Eriksson A, Kubo H, Alitalo K, Cao Y, Thyberg J. Comparative evaluation of FGF-2-, VEGF-A-, and VEGF-C-induced angiogenesis, lymphangiogenesis, vascular fenestrations, and permeability. Circ Res 2004;94:664e670. 177 Kubo H, Cao R, Brakenhielm E, Makinen T, Cao Y, Alitalo K. Blockade of vascular endothelial growth factor receptor-3 signaling inhibits fibroblast growth factor2-induced lymphangiogenesis in mouse cornea. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:8868e8873. 178 Matsuo M, Yamada S, Koizumi K, Sakurai H, Saiki I. Tumour-derived fibroblast growth factor-2 exerts lymphangiogenic effects through Akt/mTOR/p70S6kinase pathway in rat lymphatic endothelial cells. Eur J Cancer 2007;43:1748e1754. 179 Thurston G. Role of angiopoietins and Tie receptor tyrosine kinases in angiogenesis and lymphangiogenesis. Cell Tissue Res 2003;314: 61e68. 180 Gale NW, Thurston G, Hackett SF, Renard R, Wang Q, McClain J, et al. Angiopoietin-2 is required for postnatal angiogenesis and lymphatic patterning, and only the latter role is rescued by angiopoietin-1. Dev Cell 2002;3:411e423. 181 Tammela T, Saaristo A, Lohela M, Morisada T, Tornberg J, Norrmen C, et al. Angiopoietin-1 promotes lymphatic sprouting and hyperplasia. Blood 2005;105:4642e468. 182 Pietras K, Sjoblom T, Rubin K, Heldin C-H, Ostman A. PDGF receptors as cancer drug targets. Cancer Cell 2003;3:439e443. 183 Heldin CH, Eriksson U, Ostman A. New members of the plateletderived growth factor family of mitogens. Arch Biochem Biophys 2002;398:284e290. 184 Cao R, Bjorndahl MA, Religa P, Clasper S, Garvin S, Galter D, et al. PDGF-BB induces intratumoral lymphangiogenesis and promotes lymphatic metastasis. Cancer Cell 2004;6:333e345 185 Bjorndahl M, Cao R, Nissen LJ, Clasper S, Johnson LA, Xue Y, et al. Insulin-like growth factors 1 and 2 induce lymphangiogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102:15593e1558
86
186 Foulstone E, Prince S, Zaccheo O, Burns JL, Harper J, Jacobs C, et al. Insulin-like growth factor ligands, receptors, and binding proteins in cancer. J Pathol 2005;205:145e153 187 Kern PA, Svoboda ME, Eckel RH, Van Wyk JJ. Insulin-like growth factor action and production in adipocytes and endothelial cells from human adipose tissue. Diabetes 1989;38:710e717. 188 Lee OH, Bae SK, Bae MH, Lee YM, Moon EJ, Cha HJ, et al. Identification of angiogenic properties of insulin-like growth factor II in in vitro angiogenesis models. Br J Cancer 2000;82:385e391. 189 Clemmons DR. Insulin-like growth factor binding proteins and their role in controlling IGF actions. Cytokine Growth Factor Rev 1997; 8:45e62. 190 Baserga R, Hongo A, Rubini M, Prisco M, Valentinis B. The IGF-I receptor in cell growth, transformation and apoptosis. Biochim Biophys Acta 1997;1332:105e126. 191 Jenkins PJ, Bustin SA. Evidence for a link between IGF-I and cancer. Eur J Endocrinol 2004;151:S17eS22. 192 Tang Y, Zhang D, Fallavollita L, Brodt P. Vascular endothelial growth factor C expression and lymph node metastasis are regulated by the type I insulin-like growth factor receptor. Cancer Res 2003;63: 1166e1171. 193 Kajiya K, Hirakawa S, Ma B, Drinnenberg I, Detmar M. Hepatocyte growth factor promotes lymphatic vessel formation and function. EMBO J 2005;24:2885e2895 194 Birchmeier C, Birchmeier W, Gherardi E, Vande Woude GF. Met, metastasis, motility and more. Nat Rev Mol Cell Biol 2003;4: 915e925. 195 Danilkovitch-Miagkova A, Zbar B. Dysregulation of Met receptor tyrosine kinase activity in invasive tumors. J Clin Invest 2002;109: 863e867. 196 Cao R, Bjorndahl MA, Gallego MI, Chen S, Religa P, Hansen AJ, et al. Hepatocyte growth factor is a lymphangiogenic factor with an indirect mechanism of action. Blood 2006;107:3531e3536. 197 Ferrara N, Gerber H-P, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med 2003;9:669e676 198 Saaristo A, Veikkola T, Enholm B, Hyto¨nen M, Arola J, Pajusola K, et al. Adenoviral VEGF-C overexpression induces blood vessel enlargement, tortuosity, and
87
leakiness but no sprouting angiogenesis in the skin or mucous membranes. FASEB J 2002;16:1041e1049 199 Cursiefen C, Chen L, Borges LP, Jackson D, Cao J, Radziejewski C, et al. VEGF-A stimulates lymphangiogenesis and hemangiogenesis in inflammatory neovascularization via macrophage recruitment. J Clin Invest 2004;113:1040e1050. 200 Hong YK, Lange-Asschenfeldt B, Velasco P, Hirakawa S, Kunstfeld R, Brown LF, et al. VEGF-A promotes tissue repair-associated lymphatic vessel formation via VEGFR-2 and the a1b1 and a2-b1 integrins. FASEB J 2004;18:1111e1113. 201 Bjorndahl MA, Cao R, Burton JB, Brakenhielm E, Religa P, Galter D, et al. Vascular endothelial growth factor promotes peritumoral lymphangiogenesis and lymphatic metastasis. Cancer Res 2005;65: 9261e9268. 202 Ishigami SI, Arii S, Furutani M, Niwano M, Harada T, Mizumoto M, et al. Predictive value of vascular endothelial growth factor (VEGF) in metastasis and prognosis of human colorectal cancer. Br J Cancer 1998;78:1379e1384. 203 Shih CH, Ozawa S, Ando N, Ueda M, Kitajima M. Vascular endothelial growth factor expression predicts outcome and lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the esophagus. Clin Cancer Res 2000;6:1161e1168. 204 O-charoenrat P, Rhys-Evans P, Eccles SA. Expression of vascular endothelial growth factor family members in head and neck squamous cell carcinoma correlates with lymph node metastasis. Cancer 2001; 92:556e568. 205 Gannon G, Mandriota SJ, Cui L, Baetens D, Pepper MS, Christofori G. Overexpression of vascular endothelial growth factor- A165 enhances tumor angiogenesis but not metastasis during b-cell carcinogenesis. Cancer Res 2002;62:603e608. 206 Stuehr DJ. Mammalian nitric oxide synthases. Biochim Biophys Acta 1999;1411:217e230 207 Kim-Shapiro DB, Schechter AN, Gladwin MT. Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics. Arterioscler. Thromb Vasc Biol 2006;26:697e705. 208 Morbidelli L, Donnini S, Ziche M. Role of nitric oxide in the modulation of angiogenesis. Curr Pharm Des 2003;9:521e530.
88
209 Pyriochou A, Beis D, Koika V, Potytarchou C, Papadimitriou E, Zhou Z, et al. Soluble guanylyl cyclase activation promotes angiogenesis. J Pharmacol Exp Ther 2006;319:663e671. 210 Ohhashi T, Mizuno R, Ikomi F, Kawai Y. Current topics of physiology and pharmacology in the lymphatic system. Pharmacol Ther 2005; 105:165e188. 211 Franchi A, Massi D, Santucci M, Masini E, Degl Innocenti DR, Magnelli L, et al. Inducible nitric oxide synthase activity correlates with lymphangiogenesis and vascular endothelial growth factor-C expression in head and neck squamous cell carcinoma. J Pathol 2006;208:439e445. 212 Nakamura Y, Yasuoka H, Zuo H, Takamura Y, Miyauchi A, Nakamura M, et al. Nitric oxide in papillary thyroid carcinoma: induction of vascular endothelial growth factor D and correlation with lymph node metastasis. J Clin Endocrinol Metab 2006;91: 1582e1585. 213 Kajiya K, Huggenberger R, Drinnenberg I, Ma B, Detmar M. Nitric oxide mediates lymphatic vessel activation via soluble guanylate cyclase a1b1-impact on inflammation. FASEB J 2008;22:000e000. Published online September 13, 2007 (doi: 10.1096/fj.078873). 214 Mouta C, Heroult M. Inflammatory triggers of lymphangiogenesis. Lymphat Res Biol 2003;1:201e218. 215 Schoppmann SF, Birner P, Stockl J, Kalt R, Ullrich R, Caucig C, et al. Tumorassociated macrophages express lymphatic endothelial growth factors and are related to peritumoral lymphangiogenesis. Am J Pathol 2002;161:947e956. 216 Kerjaschki D. The crucial role of macrophages in lymphangiogenesis. J Clin Invest 2005;115:2316e2319. 217 Maruyama K, Ii M, Cursiefen C, Jackson DG, Keino H, Tomita M, et al. Inflammation-induced lymphangiogenesis in the cornea arises from CD11b-positive macrophages. J Clin Invest 2005;115: 2363e2372. 218 Kunstfeld R, Hirakawa S, Hong YK, Schacht V, Lange- Asschenfeldt B, Velasco P, et al. Induction of cutaneous delayed-type hypersensitivity reactions in VEGF-A transgenic mice res lts in chronic skin inflammation associated with persistent lymphatic hyperplasia. Blood 2004;104:1048e1057.
89
219 Kerjaschki D, Huttary N, Raab I, Regele H, Bojarski-Nagy K, Bartel G, et al. Lymphatic endothelial progenitor cells contribute to de novo lymphangiogenesis in human renal transplants. Nat Med 2006;12:230e234. 220 Baluk P, Tammela T, Ator E, Lyubynska N, Achen MG, Hicklin DJ, et al. Pathogenesis of persistent lymphatic vessel hyperplasia in chronic airway inflammation. J Clin Invest 2005;115:247e257. 221 Kajiya K, Hirakawa S, Detmar M. Vascular endothelial growth factor-A mediates ultraviolet B-induced impairment of lymphatic vessel function. Am J Pathol 2006;169:1496e1503. 222 Halin C, Tobler NE, Vigl B, Brown LF, Detmar M. VEGF-A produced by chronically inflamed tissue induces lymphangiogenesis in draining lymph nodes. Blood 2007;110:3158e3167. 223 Sihoe AD, Yim AP. Lung cancer staging. J Surg Res 2004; 117:92-106. 224 Skobe M, Hawighorst T, Jackson DG, et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med 2001; 7:192-198 225 Dome B, Paku S, Somlai B, Timar J. Vascularization of cutaneous melanoma involves vessel co-option and has clinical significance. J Pathol 2002; 197:355-62 226 Pircher A, Kähler CM, Skvortsov S, et al. Increased numbers of endothelial progenitor cells in peripheral blood and tumor specimens in non-small cell lung cancer: A methodological challenge and an ongoing debate on the clinical relevance. Oncol Rep 2008; 19:345-52. 227 Stahel R, Ginsberg R, Havemann K, et al. Staging and prognostic factors in small cell lung cancer: a consensus report. Lung Cancer 1989; 5:119–126. 228 Khakoo AY, Finkel T. Endothelial progenitor cells. Annu Rev Med 2005; 56:79101 229 Fadini GP, Schiavon M, Cantini M, et al. Circulating progenitor cells are reduced in patients with severe lung disease. Stem Cells 2006; 24:1806-13. 230 Global Strategy for the Diagnosis, Management and Prevention of COPD, Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) 2007. Available from: http://www.goldcopd.org
90
231 Nakashima T, Huang CL, Liu D, et al. Expression of vascular endothelial growth factor-A and vascular endothelial growth factor-C as prognostic factors for non-small cell lung cancer. Med Sci Monit 2004; 10:BR157-65 232 Paku S, Kopper L, Nagy P. Development of the vasculature in "pushing-type" liver metastases of an experimental colorectal cancer. Int J Cancer 2005; 115:893-902. 233 Hamilton PW, Allen DC. Morphometry in histopathology. J Pathol 1995; 175:36979. 234 Schacht V, Dadras SS, Johnson LA, Jackson DG, Hong YK, Detmar M. Upregulation of the lymphatic marker podoplanin, a mucin-type transmembrane glycoprotein, in human squamous cell carcinomas and germ cell tumors. Am J Pathol 2005; 166:913-21 235 Hristov M, Weber C. Endothelial progenitor cells: characterization, pathophysiology, and possible clinical relevance. J Cell Mol Med 2004; 8:498-508. 236 Eguchi M, Masuda H, Asahara T. Endothelial progenitor cells for postnatal vasculogenesis. Clin Exp Nephrol 2007; 11:18-25. 237 Döme B, Hendrix MJ, Paku S, Tóvári J, Tímár J. Alternative vascularization mechanisms in cancer: Pathology and therapeutic implications. Am J Pathol 2007; 170:1-15 238 Salven P, Mustjoki S, Alitalo R, Alitalo K, Rafii S. VEGFR-3 and CD133 identify a population of CD34+ lymphatic/vascular endothelial precursor cells. Blood 2003; 101:168-72 239 Koukourakis MI, Giatromanolaki A, Sivridis E, et al. LYVE-1 immunohistochemical assessment of lymphangiogenesis in endometrial and lung cancer. J Clin Pathol 2005; 58:202-6. 240 Kitadai Y, Kodama M, Cho S, et al. Quantitative analysis of lymphangiogenic markers for predicting metastasis of human gastric carcinoma to lymph nodes. Int J Cancer 2005; 115:388-92 241 Bono P, Wasenius VM, Heikkila P, Lundin J, Jackson DG, Joensuu H. High LYVE-1-positive lymphatic vessel numbers are associated with poor outcome in breast cancer. Clin Cancer Res 2004; 10:7144-9. 242 Beasley NJ, Prevo R, Banerji S, et al. Intratumoral lymphangiogenesis and lymph node metastasis in head and neck cancer. Cancer Res 2002; 62: 1315-20..
91
243 Pastorino U, Andreola S, Tagliabue E, et al. Immunocytochemical markers in stage I lung cancer: relevance to prognosis. J Clin Oncol 1997; 15:2858-65 244 Tsurusaki T, Kanda S, Sakai H, et al. Vascular endothelial growth factor-C expression in human prostatic carcinoma and its relationship to lymph node metastasis. Br J Cancer 1999; 80:309-13. 245 Kitadai Y, Amioka T, Haruma K, et al. Clinicopathological significance of vascular endothelial growth factor (VEGF)-C in human esophageal squamous cell carcinomas. Int J Cancer 2001; 93:662-6 246 Schietroma C, Cianfarani F, Lacal PM, et al. Vascular endothelial growth factor-C expression correlates with lymph node localization of human melanoma metastases. Cancer 2003; 98:789-97 247 Yonemura Y, Endo Y, Fujita H, et al. Role of vascular endothelial growth factor C expression in the development of lymph node metastasis in gastric cancer. Clin Cancer Res 1999; 5:1823-9. 248 Li Q, Dong X, Gu W, Qiu X, Wang E. Clinical significance of co-expression of VEGF-C and VEGFR-3 in non-small cell lung cancer. Chin Med J (Engl) 2003; 116:727-30 249 Sedivy R, Beck-Mannagetta J, Haverkampf C, Battistutti W, Honigschnabl S. Expression of vascular endothelial growth factor-C correlates with the lymphatic microvessel density and the nodal status in oral squamous cell cancer. Oral Pathol Med 2003; 32:455-60. 250 Skobe M, Hamberg LM, Hawighorst T, et al. Concurrent induction of lymphangiogenesis, angiogenesis, and macrophage recruitment by vascular endothelial growth factor-C in melanoma. Am J Pathol 2001; 159:893-903. 251 Jackson DG. Lymphatic markers, tumour lymphangiogenesis and lymph node metastasis. Cancer Treat Res 2007; 135:39-53. 252 Sundar SS, Ganesan TS. Role of lymphangiogenesis in cancer. J Clin Oncol 2007; 25:4298-307. 253 Religa P, Cao R, Bjorndahl M, Zhou Z, Zhu Z, Cao Y. Presence of bone marrowderived circulating progenitor endothelial cells in the newly formed lymphatic vessels. Blood 2005; 106:4184-90
92
254 Su JL, Yen CJ, Chen PS, et al. The role of the VEGF-C/VEGFR-3 axis in cancer progression. Br J Cancer 2007; 96:541-5 255 He Y, Kozaki K, Karpanen T, et al. Suppression of tumor lymphangiogenesis and lymph node metastasis by blocking vascular endothelial growth factor receptor 3 signaling. J Natl Cancer Inst 2002; 94:819-25. 256 Liew A, Barry F, O'Brien T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays 2006; 28: 261-70. 257 Naumnik W, Izycki T, Swidzińska E, Ossolińiska M, Chyczewska E. Serum levels of VEGF-C, VEGF-D, and sVEGF-R2 in patients with lung cancer during chemotherapy. Oncol Res 2007; 16:445-51. 258 Kimura H, Kato H, Tanaka N, et al. Preoperative serum vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) levels predict recurrence in patients with esophageal cancer. Anticancer Res 2008; 28:165-9 259 Wang TB, Deng MH, Qiu WS, Dong WG. Association of serum vascular endothelial growth factor-C and lymphatic vessel density with lymph node metastasis and prognosis of patients with gastric cancer. World J Gastroenterol 2007; 13:1794-7; 260 Yu XM, Lo CY, Lam AK, Leung P, Luk JM. Serum vascular endothelial growth factor C correlates with lymph node metastases and high-risk tumor profiles in papillary thyroid carcinoma. Ann Surg 2008; 247:483-9. 261 Vihinen PP, Hilli J, Vuoristo MS, Syrjänen KJ, Kähäri VM, Pyrhönen SO. Serum VEGF-C is associated with metastatic site in patients with malignant melanoma. Acta Oncol 2007; 46:678-84. 262 Tamura M, Ohta Y. Serum vascular endothelial growth factor-C level in patients with primary nonsmall cell lung carcinoma: a possible diagnostic tool for lymph node metastasis. Cancer 2003; 98:1217-22. XIII. Saját közlemények jegyzéke XIII/1. A disszertációhoz kapcsolódó közlemények jegyzéke
1. Lymphangiogenesis correlates with lymph node metastasis, prognosis, and angiogenic phenotype in human non-small cell lung cancer.
93
Renyi-Vamos F, Tovari J, Fillinger J, Timar J, Paku S, Kenessey I, Ostoros G, Agocs L, Soltesz I, Dome B. Clin Cancer Res. 2005 Oct 15;11(20):7344-53 IF:5.715
2. High VEGFR-3-positive circulating lymphatic/vascular endothelial progenitor cell level is associated with poor prognosis in human small cell lung cancer. Bogos K, Renyi-Vamos F, Dobos J, Kenessey I, Tovari J, Timar J, Strausz J, Ostoros G, Klepetko W, Ankersmit HJ, Lang G, Hoda MA, Nierlich P, Dome B. Clin Cancer Res. 2009 Mar 1;15(5):1741-6. Epub 2009 Feb 24. IF:6.25
3. Circulating endothelial cells, bone marrow-derived endothelial progenitor cells and proangiogenic hematopoietic cells in cancer: From biology to therapy. Dome B, Timar J, Ladanyi A, Paku S, Renyi-Vamos F, Klepetko W, Lang G, Dome P, Bogos K, Tovari J. Crit Rev Oncol Hematol. 2009 Feb;69(2):108-24. Epub 2008 Sep 3. IF:4.632 XIII/2. A disszertációhoz nem kapcsolódó közlemények jegyzéke
4. Role of retinoic receptors in lung carcinogenesis. Bogos K, Renyi-Vamos F, Kovacs G, Tovari J, Dome B. J Exp Clin Cancer Res. 2008 Jul 14;27:18. IF:1.5
5. Giant cystic pheochromocytoma located in the renal hilus. Melegh Z, Rényi-Vámos F, Tanyay Z, Köves I, Orosz Z. Pathol Res Pract. 2002;198(2):103-6; discussion 107-8. IF:0.85 XIV. Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom Döme Balázs barátomnak, aki megismertetett a tudományos kutatás szépségeivel. Hálás vagyok Köves Istvánnak, hogy igyekezett beavatni a sebészet rejtelmeibe, ezen igen fáradtságos tevékenységben segítségére volt Jankovich Mihály és Vadász Pál is.
94
Mindig bátran fordulhattam Besznyák Istvánhoz kérdéseimmel, problémáimmal, atyai gondoskodással állt mellettem. Walter Klepetko a szervátültetés csodáját mutatta meg nekem és személyében közelröl láthattam a világ mellkassebészetének élvonalát. Barátaim, Farkas Emil, Sávolt Ákos, Mátrai Zoltán, Lang György nem egyszer helyettesítettek a műtői munkában, amikor kutatásaimmal voltam elfoglalva. Köszönöm Tóth Lászlónak, hogy támogatta ambicióimat. Köszönettel tartozom Kásler Miklósnak, aki minden szakmai és tudományos törekvésemet támogatta, pályámat tanácsaival, észrevételeivel egyengette. Végül, de nem utolsósorban köszönöm feleségemnek, Beának és családomnak a sok szeretetet és bíztatást, valamint türelmet, amit munkám során tőlük kaptam.
95
