Új módszerek emlős sejtek hidrogén-peroxid termelő mechanizmusainak vizsgálatára

Új módszerek emlős sejtek hidrogén-peroxid termelő mechanizmusainak vizsgálatára Doktori értekezés

Dr. Enyedi Balázs Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Geiszt Miklós egyetemi docens, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Tretter László egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Virág László egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Falus András egyetemi tanár, az MTA rendes tagja Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Arányi Tamás, Ph.D. Dr. Bánhegyi Gábor egyetemi tanár, az MTA doktora

Budapest 2011

1. TARTALOMJEGYZÉK 2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE..................................................................................... 4 3. BEVEZETÉS.............................................................................................................. 7 3.1 A reaktív oxigén származékokról általában ......................................................... 8 3.2 A reaktív oxigén származékok sejten belüli forrásai............................................ 9 3.2.1 A mitokondrium mint a ROS forrása ........................................................... 10 3.2.2 A NADPH-oxidáz enzimcsalád.................................................................... 11 3.2.2.1

NOX2, a fagocita oxidáz ..................................................................... 12

3.2.2.2

A NOX1, NOX3, NOX4 és NOX5 enzimek főbb sajátosságai .......... 14

3.2.2.3

A DUOX fehérjék................................................................................ 16

3.2.3 Az endoplazmás retikulum szerepe a sejten belüli H2O2-képződésben ....... 19 3.2.3.1

A PDI és az Ero1 fehérjék ................................................................... 19

3.2.3.2

Az ER megfelelő közeget biztosít a diszulfidhidak kialakulásához.... 21

3.3 A reaktív oxigén származékok elbontása a sejten belül ..................................... 21 3.4 A reaktív oxigén származékok jelátviteli szerepe .............................................. 22 3.4.1 A H2O2 mint legfontosabb jelátvivő a reaktív oxigén származékok közül .. 22 3.4.1.1

Cisztein oldalláncok oxidatív módosításai .......................................... 23

3.4.2 H2O2 által szabályozott fehérjék és jelpályák ............................................... 24 3.4.2.1

Transzkripciós faktorok....................................................................... 24

3.4.2.2

Protein tirozin foszfatázok................................................................... 26

3.4.2.3

Kalciumháztartás, ioncsatornák és pumpák......................................... 28

3.5 A H2O2 sejten belüli szintjének mérésére alkalmas módszerek ......................... 29 3.5.1 H2O2 mérésre alkalmas festékek................................................................... 29 3.5.2 ROS és H2O2-érzékelő genetikailag kódolt fehérjeszondák......................... 31 3.5.3 roGFP – a redox érzékeny zöld fluoreszcens fehérje ................................... 31 3.5.4 HyPer – a H2O2-érzékeny fluoreszcens szonda............................................ 32 4. CÉLKITŰZÉSEK..................................................................................................... 34 5. MÓDSZEREK.......................................................................................................... 35 5.1 Munkánk során használt anyagok ...................................................................... 35 5.2 Plazmid konstrukciók, géncsendesítési technikák.............................................. 36 5.2.1 A HyPer és más fluoreszcens fehérjék irányítása különböző sejtalkotókba 36 5.2.2 Ero1-Lα klónozása és génjének csendesítése ............................................... 37 5.2.3 Módosított J-lánc .......................................................................................... 38

2

5.2.4 OxyFRET és PerFRET klónozása, transzpozon vektorok készítése ............ 39 5.2.5 DUOX1 és DUOXA1 klónozása.................................................................. 41 5.3 Sejtvonalak, sejttenyészetek fenntartása............................................................. 41 5.4 Primer urotél sejtek preparálása ......................................................................... 42 5.5 Tranziens és stabil transzfekciók........................................................................ 42 5.6 Immunofluoreszcens jelölés, konfokális lézer mikroszkópia............................. 43 5.7 Fluoreszcens mikroszkópia : HyPer, citoplazmatikus [Ca2+] és FRET mérések 44 5.7.1 Intracelluláris [H2O2] mérése a HyPer szondával......................................... 44 5.7.2 Citoplazmatikus [Ca2+] mérése fluoreszcens mikroszkópiával .................... 45 5.7.3 FRET (fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer) működési elve és mikroszkópos mérése ................................................................................... 46 5.8 Citoplazmatikus [Ca2+] mérése szuszpenzióban................................................ 47 5.9 H2O2-mérés Amplex Red módszerrel................................................................. 48 5.10 Western-blot kísérletek és a J-lánc oxidatív érésének vizsgálata ....................... 48 5.11 Statisztikai analízis és dózis-hatás görbeelemzés............................................... 49 6. EREDMÉNYEK....................................................................................................... 50 6.1 A H2O2 szintjének feltérképezése különböző sejtalkotókban............................. 50 6.2 Az ER-ben mérhető szignál eredetének vizsgálata............................................. 52 6.3 A H2O2 forrásának vizsgálata az ER-ben ........................................................... 54 6.4 Az ER [Ca2+] hatása a sejtalkotó H2O2 szintjére ................................................ 55 6.5 A JcM oxidatív fehérjeérését nem befolyásolja az [Ca2+]ER .............................. 57 6.6 A H2O2 szintjének hatása emlős sejtek Ca2+-háztartására .................................. 58 6.7 Hidrogén-peroxid mérésére alkalmas új szondák kifejlesztése.......................... 59 6.8 Az OxyFRET és PerFRET szondák működésének vizsgálata és jellemzése ..... 60 6.9 Sejten belüli [H2O2] mérések PLB sejteken ....................................................... 63 6.10 A DUOX1 enzim H2O2-termelésének vizsgálata ............................................... 64 7. MEGBESZÉLÉS ...................................................................................................... 70 8. KÖVETKEZTETÉSEK ........................................................................................... 79 9. ÖSSZEFOGLALÁS ................................................................................................. 81 10. SUMMARY ............................................................................................................. 82 11. IRODALOMJEGYZÉK ........................................................................................... 83 12. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE ................................................................... 109 13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ................................................................................ 110

3

2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ATCC

American Type Culture Collection

bFGF

bázikus fibroblaszt növekedési faktor

BSA

szarvasmarha szérum albumin

[Ca2+]ER

endoplazmás retikulum [Ca2+]

CCCP

karbonil-cianid-3-fenil-hidrazon

cCRD

C-terminális cisztein-gazdag régió

CGD

krónikus granulomatózis betegség

CR3

komplement receptor 3

CRT

kalretikulin

DCFH

2’,7’-dichlorodihidrofluorescein

dDUOX

D. melanogaster kettős oxidáz (dual oxidase)

dNOX

D. melanogaster NOX5-homológ

DMFA

dimetilformamid

DPI

difenil-jodónium

DTT

dithiothreitol

DUOX

kettős oxidáz (dual oxidase)

DUOXA

DUOX aktivátor

EDTA

etiléndiamin-tetraacetát

EGF

epidermális növekedési faktor

EGFP

zöld fluoreszcens fehérje (enhanced green fluorescent protein)

ER

endoplazmás retikulum

ERcyto

endoplazmás retikulum citoplazmatikus felszíne

Ero1

endoplazmás retikulum oxidoreduktáz

FAD

flavin-adenin-dinukleotid

FCCP

p-trifluorometoxi-karbonil-cianid-fenil-hidrazon

FBS

fötális borjúszérum

fMLP

N-formil-metionil-leucil-fenilalanin

FOXO

’forkhead box’ fehérje

FRET

fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer

GFP

zöld fluoreszcens fehérje

4

GM-CSF

granulocita-makrofág kolónia-stimuláló faktor

GPx7

glutation peroxidáz 7

Grx1

glutaredoxin 1

GSH

redukált glutation

GSSG

oxidált glutation

HEPES

2-[4-(2-Hidroxietil)-1-piperazinil]-etánszulfonsav

HRP

tormaperoxidáz

IP3R1

inozitol-1,4,5-triszfoszfát receptor

LO-5

lipoxigenáz-5

MCS

poliklónozó hely (multi-cloning site)

MOPS

3-(N-morfolino)-propánszulfonsav

mRFP

monomer piros fluoreszcens fehérje

NADPH

redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát

nCRD

N-terminális cisztein-gazdag régió

NF-κB

nukláris faktor kappa B

NOX

NADPH-oxidáz

NOXA1

Nox aktivátor 1

NOXO1

Nox szabályozó 1

PB1 domén

Phox és Bem1 domén

PBS

foszfát pufferelt fiziológiás sóoldat

PDGF

trombocita eredetű növekedési faktor

PDI

protein diszulfid izomeráz

PI3K

foszfatidil-inozitol-3 kináz

PKC

protein kináz C

PMA

forbol-mirisztil-acetát

PPARγ

peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor-gamma

PTEN

foszfatáz és tenzin homológ (Phosphatase and tensin homolog)

PTP

protein tirozin foszfatáz

PX

phox homológia domén

RENOX

vese-oxidáz (renal oxidase)

RHD2

Root Hair Defective 2

Rho-GDI

Rho GDP-disszociáció inhibítor

5

RNAi

RNS interferencia

roGFP

redox-érzékeny zöld fluoreszcens fehérje

RLU

relatív fényegység (relative light unit)

ROI

mérési terület (region of interest)

ROS

reaktív oxigén származékok

RTK

tirozin-kináz receptor

SDS

nátrium dodecil-szulfát

SERCA

szarko-endoplazmás retikulum Ca2+ ATPáz

SH3

Src homológia 3 domén

siRNS

kis interferáló RNS

SOD

szuperoxid-dizmutáz

Tg

thapsigargin

TGF-β1

transzformáló növekedési faktor-β1

THOX

tiroid oxidáz

TM

transzmembrán domén

TNF-α

tumor nekrózis faktor-α

TRPV4

tranziens receptor potenciál vanilloid 4 csatorna

Trx

tioredoxin

UCP

szétkapcsoló fehérje (uncoupling protein)

UDX1

tengerisün DUOX1 (urchin dual oxidase 1)

VEGF

vaszkuláris endoteliális növekedési faktor

Yap1

yeast activator protein 1

6

3. BEVEZETÉS

Az oxigén jelenléte a Föld légkörében megteremtette annak a lehetőségét, hogy az aerob körülmények között élő szervezetek nagy hatásfokkal nyerjék ki az energiát tápanyagaikból.

A

sejtek

által

felhasznált

oxigén

jelentős

hányadából

a

mitokondriumokban zajló terminális oxidáció során víz képződik, egy része azonban reaktív oxigén származékokká (ROS) alakul át. A reaktív oxigén származékokat kétélű kardnak tekinthetjük: szervezetünk egyrészt kihasználja toxikus hatásaikat, így fagocita sejtjeink a bekebelezett részecskéket, baktériumokat pusztítják velük, másrészről azonban nem kívánt károsító hatásaik is vannak, gyulladásos reakciókat segítenek elő, daganatos és neurodegeneratív betegségek kialakulásáért felelősek, és gyorsítják az öregedést. A toxikus hatások általában akkor következnek be, ha nagy mennyiségben képződnek, és nem specifikus módon reagálnak DNS, fehérje, szénhidrát és lipid molekulákkal. Szabályozott körülmények között keletkezve azonban célzott szerkezeti változást hozhatnak létre, ami fiziológiás szabályozásban játszhat szerepet. Ennek megfelelően az utóbbi időben nyilvánvalóvá vált, hogy olyan alapvető biológiai folyamatokban is részt vesznek, mint a hormonszintézis, az értónus szabályozása, a programozott sejthalál vagy akár a megtermékenyítés. Doktori ösztöndíjasként a reaktív oxigén származékok, elsősorban a hidrogénperoxid emlős sejteken belüli képződésének vizsgálatával foglalkoztam. Az alábbiakban röviden bemutatom a legfontosabbnak tekintett reaktív oxigén származékokat, ismertetem intracelluláris képződésük és elbontásuk lehetőségeit, és röviden kifejtem hatásaikat.

Munkám

fontos

részét

képezte

a

hidrogén-peroxid

megbízható,

intracelluláris térben való mérésre alkalmas módszerek fejlesztése. Ezért a bevezető végén összefoglalom azokat a lehetőségeket, melyek a vizsgálataim kezdetén rendelkezésre álltak a reaktív oxigén származékok kimutatására.

7

3.1

A reaktív oxigén származékokról általában A

sejtek

anyagcseréjében

a

katabolikus

folyamatok

jelentős

része

elektrontranszferrel járó folyamat – oxidoredukció. A biológiai oxidáció során az oxigén mint végső elektronfelvevő vízzé redukálódik. Egy oxigénmolekula ebben a folyamatban négy elektront vesz fel, adódnak azonban olyan körülmények, amikor csak részlegesen redukálódik. Az így létre jött molekulákat, a szuperoxidot (O2•−), hidrogénperoxidot (H2O2) és a hidroxil-gyököt (•OH) nevezzük szűkebb értelemben ROS-nak 1. Reaktív oxigén származék ezeken kívül a szinglet oxigén (1O2), mely a molekuláris oxigén (O2) gerjesztett állapotú változata, és pl. növényekben fotoszintézis során keletkezik, illetve az ózon is (O3), mely UV-fény hatására jöhet létre, és szintén nagyon reaktív. Az oxigén más molekulákkal is kialakíthat reaktív származékokat, így a nitrogénnel képzett reaktív nitrogén származékok közé tartozik például a nitrogénmonoxid (•NO) vagy a peroxinitrit (ONOO−). Szabadgyöknek nevezzük azokat az atomokat vagy molekulákat, melyek külső elektronhéján egy vagy több párosítatlan elektron található, vagy antiparallel spinekkel rendelkező elektronokat tartalmaznak. Ennek megfelelően a felsorolt reaktív oxigén származékok közül szabadgyök a O2•−, •OH, •NO, és nem gyök természetű a H2O2, 1O2, vagy az O3. Szuperoxid kialakulásához az oxigén egy elektront vesz fel, mely a külső elektronhéjra kerülve párosítatlanul marad, így rendkívül reakcióképessé teszi a molekulát. A O2•− egy elektron további felvételével spontán vagy biológiai rendszerekben a szuperoxid-dizmutáz (SOD) katalizálta reakcióban hidrogén-peroxiddá alakulhat 2: 2 O2•− + 2 H+ ⎯SOD ⎯ ⎯→ H2O2 + O2 A H2O2 nem gyök természetű, de szintén erősen oxidáló hatású. Féléletideje limfocitákon mért eredmények alapján három nagyságrenddel hosszabb, mint a szuperoxidé (1 ms az 1 μs-hoz képest) 3, ami alkalmassá teszi arra, hogy a képződés helyétől jelentős távolságra is eljusson. A H2O2 erősen poláros, így szabad átjutása a biológiai membránokon korlátozott 3. Fizikokémiai tulajdonságaiban hasonlít a vízre, és

8

transzportjában feltételezik az aquaporin csatornák szerepét, amire kísérleti adatok is utalnak 4,5. A H2O2 szuperoxid jelenlétében a Haber-Weiss reakció során hidroxil-gyökké alakulhat: O2•− + H2O2 Æ •OH + HO- + O2 A lassú reakciót kétértékű fémionok katalizálják, így Cu2+- vagy Fe2+-ionok jelenlétében jelentősen felgyorsul. A katalitikus ciklus első lépésében, melyet Fenton-reakciónak is nevezünk, a H2O2 kétértékű ionokkal reagálva hidroxil-gyökké alakul: Fe2+ + H2O2 Æ Fe3+ + HO− + •OH A ciklus második lépésében az oxidált ionok redukált formájukat a szuperoxiddal reagálva visszanyerik: Fe3+ + O2•− Æ Fe2+ + O2 A hidroxil-gyök a legreaktívabb az említett reaktív oxigén származékok közül, nanoszekundumos időtartományban reagál a környezetében lévő molekulákkal, ennek megfelelően nagyon rövid féléletidővel rendelkezik (1 ns) 6. 3.2

A reaktív oxigén származékok sejten belüli forrásai A reaktív oxigén származékok sejten belüli képződésének mennyiségi viszonyai

egyelőre tisztázatlanok. Egyik legjelentősebbnek tartott intracelluláris forrásuk a mitokondrium,

melyben

évtizedekre

visszanyúló

elképzelések

szerint

melléktermékként, a légzési lánc működéséhez kapcsoltan képződnek. A ROS élő szervezetekben zajló szabályozott, célzott termelése elsősorban a NADPH-oxidáz (NOX) enzimek működéséhez köthető 7. Ezen túlmenően irodalmi adatok bizonyítják, hogy az eukarióta sejtek endoplazmás retikulumában, az itt zajló fehérjeérési folyamatok során is keletkeznek reaktív oxigén származékok 8. A ROS további, az alábbiakban nem részletezett forrásai is jelen vannak sejtjeinkben, mint pl. a citokróm p450 enzimcsalád 9, egyes lipoxigenáz enzimek

10,11

, vagy a peroxiszóma, melyben a

zsírsavak β-oxidációja és a flavin-oxidázok működése kapcsán keletkeznek reaktív oxigén származékok 12.

9

3.2.1

A mitokondrium mint a ROS forrása A mitokondrium néhány kivételtől eltekintve minden eukarióta sejtben

megtalálható sejtszervecske, mely az aerob anyagcsere központjaként a légzéssel felvett oxigén mintegy 98%-át használja fel

13

. A kettős membránrendszerű sejtalkotó belső

hártyarendszere tartalmazza a légzési lánc működéséhez szükséges fehérjéket. Az itt zajló terminális oxidáció során a redukáló ekvivalensekről származó elektronok a légzési lánc tagjain keresztül az oxigénre jutnak, ami a jelenlévő protonokkal együtt vízképződést eredményez 14. Már 1966-ban kimutatták, hogy az oxigén redukciója nem mindig zajlik le tökéletesen

15

, és részlegesen redukált, reaktív oxigén származékok

képződhetnek. Chance és kollégái izolált mitokondriumokon végzett úttörő kísérleteik során megállapították, hogy e sejtorganellumok hidrogén-peroxidot termelnek

16-18

.

További kísérletek során vált világossá, hogy az elsődlegesen képződő reaktív oxigén 19

származék a szuperoxid, mely H2O2-dá dizmutálódik

. Párhuzamosan zajló

kutatásokban derült fény arra, hogy a mitokondriumok tartalmaznak egy saját szuperoxid-dizmutáz enzimet

20

, melyet ma SOD2-nek nevezünk, így a sejtalkotó

önmagában is képes a ROS teljes arzenáljának létrehozására. Ezek az eredmények indították útra a mitokondriális ROS képződésének kutatását. Noha jól dokumentált és általánosan elfogadott, hogy a legtöbb sejttípusban a mitokondrium kiemelkedően fontos forrása a reaktív oxigén származékoknak

21

,

képződési mechanizmusukkal kapcsolatban ellentmondásos irodalmi adatok állnak rendelkezésre. Több olyan mitokondriumokat érintő kóros vagy fiziológiás állapot ismert, melyben fokozódik a ROS képződése. Ilyenek például a iszkémia23, az azt követő reperfúzió

24,25

hipoxia

22

, az

vagy a légzési lánc gátlása26,27. Ez utóbbi

esetben az I. és a III. komplex gátlószerei (rotenon, antimycin) bizonyultak a leghatékonyabb szuperoxid-termelést fokozó ágensnek

19

, melyek a mitokondriális

mátrixban (I. és III. komplex) és az intermembrán térben (III. komplex) is fokozzák a O2•− szintjét

27

. Az irodalmi adatokban azonban nincs teljes összhang a ROS

mitokondriális képződésével kapcsolatban, hiányzik még az átfogó kép e téren13,21. Általánosan elfogadott, hogy a mitokondriális membrán hiperpolarizációja növeli, míg depolarizációja csökkenti a O2•−-termelést

19

. Ez utóbbi hatást

farmakológiásan létre lehet hozni a légézi lánc szétkapcsolószereivel (pl. FCCP,

10

CCCP). Fiziológiásan is felmerült ilyen szabályozás lehetősége, a UCP2 és UCP3 mitokondriális szétkapcsoló fehérjékkel kapcsolatban, melyekről kimutatták, hogy oxidatív stressz során a mitokondriumokat depolarizálva mérsékelhetik a ROS termelődését 13. Fontos megemlíteni, hogy nemcsak a légzési lánc enzimei termelhetnek ROS-t. További mitokondriális enzimreakciók kapcsán, így az α-ketoglutarát-dehidrogenáz

28

,

citokróm b5 reduktáz 29, monoaminooxidázok 30, α-glycerofoszfát dehidrogenáz 31 vagy a szukcinát dehidrogenáz

32

működése közben is keletkezhetnek reaktív oxigén

származékok, melyek szintén hozzájárulhatnak ezen sejtalkotó fontos szerepéhez a ROS sejten belüli keletkezésében. 3.2.2 A NADPH-oxidáz enzimcsalád A fagocita sejtek NADPH-oxidáz enzimének azonosításával találtak először olyan fehérjét, melynek működése során a szuperoxid nem káros melléktermékként, hanem a biológiai hatásért felelős molekulaként jelenik meg

33,34

. A fagocita oxidáznak

emlősökben 6 homológja ismert, melyekre mind jellemző, hogy a NADPH oxidációjának terhére szuperoxidot vagy H2O2-ot termelnek. Szerkezeti felépítésükben pero

xidá z dom szerű én

2 O2•−

2 O2•−

Fe2+

Fe2+

Fe2+

Fe2+

Fe2+

Fe2+

2 O2•− Æ H2O2

extracelluláris tér/ fagoszóma

citoplazma

2 e-

FAD

EF

EF

EF

EF

2 e-

NADPH NADP+

FAD

EF EF

NADPH +

NADP+

H+

NOX1 NOX2 (gp91phox) NOX3 NOX4

NOX5

2 e-

FAD

NADPH +

H+

NADP+ + H+

DUOX1 DUOX2

1. ábra – A NADPH-oxidáz enzimek családja A NOX/DUOX enzimek szerkezeti felépítésük alapján három csoportba sorolhatók. Az összesre jellemző a C-terminálison elhelyezkedő NADPH- és FAD-kötő régió, és hat transzmembrán domén, melyek két hem-csoportot kötnek. A NOX5 ezeken túlmenően tartalmaz négy N-terminális EF-hand típusú Ca2+-kötő domént, a DUOX enzimek pedig egy N-termináis extracelluláris peroxidázszerű domént, egy extra transzmembrán domént, és két EF-hand motívumot.

11

közös

a

C-terminálison

elhelyezkedő

NADPH-kötő

és

ettől

N-terminálisan

elhelyezkedő FAD-kötő régió, melyet hat konzervált transzmembrán (TM) domén követ. Működésükhöz elengedhetetlen a 3. és 5. TM szegmens között elhelyezkedő két hem prosztetikus csoport, melyek koordinálásában négy konzervált hisztidin oldallánc vesz részt 35. A hét emlős NADPH-oxidáz enzimet filogenetikailag és szerkezetileg három csoportba oszthatjuk. A fagocita oxidázzal, melyet ma NOX2 enzimként tartunk számon, jelentősen homológ a NOX1, NOX3 és NOX4 fehérje. Különálló csoportba sorolható a humán NOX5 enzim, mely evolúciós szempontból távol áll az előbbiektől. A harmadik csoportba a DUOX1 és DUOX2 enzimek tartoznak, melyek felépítése a NOX enzimekhez képest kiegészül egy N-terminális extracelluláris peroxidázszerű doménnel, valamint egy járulékos TM doménnel (1. ábra). Fontos megemlíteni, hogy a NOX5 és DUOX enzimek citoplazmatikus EF-hand típusú kalciumkötő motívumokat is tartalmaznak (1. ábra), melyek meghatározó szerepet töltenek be az enzimek aktivációjában. 3.2.2.1 NOX2, a fagocita oxidáz Évtizedekkel megelőzve a NADPH-oxidáz enzimek felfedezését, a XX. század első felében felismerték, hogy a fagocitózis során jelentősen fokozódik a fehérvérsejtek oxigénfogyasztása

36

. A felvett többlet oxigént a fagociták az ún. oxidatív robbanás

(respiratory burst) során H2O2 termelésre fordítják 7. Elsődlegesen szuperoxid képződik, melyből spontán vagy enzimatikus átalakulás során H2O2 keletkezik. Az oxidatív robbanás felfedezése mellett egy másik kutatási irány is elősegítette az oxidáz enzim azonosítását. 1957-ben Berendes és mtsai. leírtak egy ritka szindrómát, a

súlyos,

visszatérő

megbetegedést

bakteriális

(chronic

fertőzésekkel

granulomatous

disease

járó –

krónikus CGD)

granulomatózis 37

.

A

betegek

polimorfonukleáris sejtjeinek számos funkciója, mint a fagocitózis, a degranuláció és a kemotaxis megtartott volt, a baktériumölő kapacitásuk azonban lecsökkent. Ennek okát is leírták: a sejtekben nem tudtak oxidatív robbanást kiváltani

38-40

. 1978-ban Segal,

valamint Jones és mtsai azonosítottak egy fehérjekomplexet, mely számos CGD-s beteg neutrofil granulocitáiból hiányzott

33,34

. Ez a komplex a b-típusú citokrómok közé

tartozik, melyet ezt megelőzően oxidázként már azonosítottak granulocitákban, azonban

12

nem hozták egyértelműen összefüggésbe az oxidatív robbanással 41. Flavocitokróm b558nak nevezték el, mivel egy membránkötött fehérjekomplex, mely két hem és egy FAD prosztetikus csoportot tartalmaz, és 558 nm-en van az abszorbciós maximuma

35

. A

heterodimer komplex két fehérjéből épül fel. Az 1980-as évek végére két munkacsoport párhuzamosan klónozta meg egyik alegységét, a gp91phox fehérjét, mely a komplex enzimatikus aktivitásáért felelős. Ezt a fehérjét nevezzük fagocita oxidáznak vagy a mai nevezéktan szerint NOX2-nek (a ’phox’ jelölés a fagocita oxidáz angol nevéből származik: phagocyte oxidase). Partnere a flavocitokróm b558 komplexben a p22phox fehérje, melynek hiányában szintén CGD alakul ki 35. A NOX2 legnagyobb mennyiségben fagocita sejtekben fejeződik ki, így megtalálható neutrofil, eozinofil granulocitákban, monocitákban, makrofágokban és jelen van B limfocitákban is. Expressziós vizsgálatok során számos további szövetben is kimutatták mRNS-ét. Tekintettel arra, hogy szöveti makrofágok szinte mindenhol megtalálhatók,

sokáig

úgy

tekintették,

mindössze

az

e

sejtekből

származó

“szennyeződés” mérhető 7. Mára azonban több bizonyíték támasztja alá jelenlétüket nem fagocita sejttípusokban is (pl. endotél, szívizomsejtek, fibroblasztok) 42. A NOX2 hat transzmembrán domént tartalmazó, erősen glikozilált ~ 70-90 kDa molekulatömegű fehérje 35, mely heterodimert alkot a 22 kDa molekulatömegű, szintén glikozilált, két transzmembrán doménnel rendelkező p22phox fehérjével. Ez utóbbi fehérje szélesebb szöveti kifejeződést mutat, mint a NOX2, szinte minden magzati és felnőtt sejttípusban megtalálható

43,44

. Neutrofil granulocitákban a NOX2 és p22phox

fehérjék a primer és szekunder granulumokban találhatók, melyek a sejt aktivációja során fuzionálnak a fagoszómával. A fagociták aktiválhatók bakteriális peptidekkel (pl. fMLP), Fcγ- vagy komplement-receptorokon (CR3, CR4) keresztül (kísérletes körülmények között például opszonizált zimozán hatására), vagy indukálhatók PMA-val (forbol-mirisztil-acetát) is42. Nyugalmi körülmények között az NOX2 nem termel szuperoxidot, stimulációját követően azonban elektrontranszfer indul be, melynek során a NADPH-ról származó két elektron a FAD-kötő, majd a hem prosztetikus csoporton keresztül a membrán túloldalára jut, ahol molekuláris oxigénnel reagálva szuperoxidot képeznek (1. ábra) 7. NADPH + 2 O2 Æ NADP+ + H+ + 2 O2•−

13

A NOX2 működéséhez szükségesek még a phox fehérjék (p47phox, p67phox és p40phox), melyek nyugalomban inaktív trimer komplexet alkotnak a citoplazmában, és a Rac1 vagy Rac2 fehérje, mely a stimulációt megelőzően GDP-kötött inaktív formában található, a Rho-GDI fehérjével komplexben (2. ábra) 35. zó m fagos

2 e-

NOX2 p40phox

á tiv ak NO X2 DI G oh R Rac GDP

c ió

p67

ox

p47phox p67phox

P P

p47phox P

NADPH NADP+ + H+

p2 2 ph

p40phox

Rac GTP

p67phox

p22phox

a

zm a citopla

2 O2˙-

H2O2

2. ábra – A NOX2 enzim aktiválódásának mechanizmusa Nyugalomban a NOX2 és a p22phox fehérjék a fagociták primer és szekunder granulumaiban találhatók. A sejtek aktivációja során a fagoszóma membránjába épülnek, majd a p47phox fehérje foszforilációját követő konformációváltozása segíti elő a citoszolikus alegységek transzlokációját az enzimhez. A p40phox és a p47phox fehérjék PX-doménjükön keresztül a fagoszóma membránjához kapcsolódnak, és lehetővé teszik, hogy a komplex aktivátoraként működő p67phox és a GTP kötött Rac fehérjék beindítsák a szuperoxid képződését.

A fagociták aktiválódását követően a phox fehérjék és a Rac transzlokálódnak a flavocitokróm b558 komplexet tartalmazó fagoszómamembránhoz

45

. Ebben központi

szerepet játszik a p47phox citoszolikus szabályozófehérje, melynek foszforilációja szabaddá teszi a p22phox kötésében szerepet játszó SH3 (src homológ 3) régiókat, és a fagoszómamembrán foszfolipidjeit kötő PX (phox) domént

46

. A p67phox az oxidáz

aktivátoraként működik, interakciós doménjein keresztül kapcsolódik az összes citoszolikus szabályozó fehérjével, aktivációs doménje pedig a GTP-kötött Rac jelenlétében elősegíti a NOX2-n az elektronok vándorlását a NADPH-ról a FAD-ra (2. ábra)35. A p40phox fehérje PX-doménjével és a p67phox-szal interakciót képző PB1 doménjével hídként kapcsolja a p67phox fehérjét a fagoszóma membránjához 45,46. 3.2.2.2 A NOX1, NOX3, NOX4 és NOX5 enzimek főbb sajátosságai A NOX2 enzimmel homológ oxidázok azonosítására a szekvencia-adatbázisok elemzése adott lehetőséget. Az első homológot, a NOX1-et eredetileg mitogén oxidáz 1nek ill. NADPH-oxidáz homológ 1-nek keresztelték 47,48. A NOX1 legnagyobb mennyiségben a vastagbél epitél sejtjeiben fejeződik ki, de megtalálható endotél sejtekben, az érfal simaizomzatában, a méhben és méhlepényben, valamint a prosztatában is 7. Működése a NOX2-éhez hasonló citoszolikus szabályozó

14

fehérjéket igényel, melyeket Geiszt és mtsai azonosítottak 49. Ezek a fagocita p47phox és p67phox homológjai, melyeket a mai nevezéktan szerint NOXO1-nek és NOXA1-nek hívunk 50. Ezen kívül a NOX1 működéséhez szükség van még a p22phox és a GTP-kötött Rac1 fehérjékre is 49,51. A NOX1 bélnyálkahártyában betöltött szerepe egyelőre ismeretlen. Felmerült, hogy a fagocita oxidázhoz hasonlóan antibakteriális funkciója lenne, és a nyálkahártya homeosztázisának fenntartásában venne részt

52-54

. Ezen túlmenően bizonyított, hogy

NOX1 génhiányos egereken csökkent a nyugalmi vérnyomás, valamint enyhébb az angiotenzin II-indukálta magas vérnyomás során kialakuló aortafal-hipertrófia is 55,56. A NOX1-et túlexpresszáló transzgenikus egereken ezzel összhangban, az előbbiekkel ellentétes irányú változásokat figyeltek meg 57. A NOX3 szekvenciájában és szerkezetében is nagyfokú hasonlóságot mutat a NOX2-vel

58

. Az enzim legfontosabb kifejeződési helye a belső fül, és hiányában

egyensúlyérzékelési zavar alakul ki. Ennek hátterében az áll, hogy az utriculus és a sacculus üregeiben nem jelennek meg az otolit kristályok, a NOX3 pontos szerepét a folyamatban azonban még nem ismerjük

59,60

. A NADPH-oxidáz enzimaktivitásának

fontosságát más genetikai vizsgálatok is alátámasztották: a p22phox vagy a NOXO1 génjeinek mutációit hordozó egér füléből is hiányoznak az otolit kristályok

61,62

. A

NOX3 működéséhez tehát szükség van az előbb említett két fehérjére, és további eredmények szerint a NOXA1 és a Rac1 is szabályozhatja 60,63. A NOX4 enzimet eredetileg mint vese-oxidázt azonosították (renal oxidase, azaz RENOX)

64,65

. In situ hibridizációval a vesekéregben, a proximális tubulusok epitél

sejtjeiben mutatták ki hírvivő RNS-ét 64. Gyengébb mértékű expresszió mutatható még ki

fibroblaszt

sejtekben,

oszteoklasztokban,

endotélben,

simaizomsejtekben,

hemopoetikus őssejtekben, adipocitákban és a fötális májban is

7

. A NOX4

konstitutívan aktív, működéséhez nincs szükség citoszolikus szabályozókra, csak a p22phox fehérjére

66

. Mai ismereteink szerint szabályozása expressziós szintjének

változtatásával történik: kifejeződése fokozódik fibroblaszt, illetve simaizom sejtekben TGF-β és TNF-α hatására

67,68

, ezen kívül az aorta simaizomsejtjeiben endoplazmás

retikulum stressz során, valamint angiotenzin II hatására ischémiás körülmények között a vesében

71,72

69,70

és hipoxiás, illetve

. A NOX4 funkciójával kapcsolatos átfogó

kép egyelőre még hiányzik a vese vonatkozásában is, ahol pedig a legnagyobb

15

mértékben expresszálódik. Egyes feltételezések szerint az oxigénérzékelésben és az eritropoetin-szintézis szabályozásában vehet itt részt, erre vonatkozó egyértelmű kísérletes bizonyítékok azonban még nem állnak rendelkezésre

73

. Kardiovaszkuláris

szabályozásban és érelmeszesedési folyamatokban is felmerült a szerepe tekintettel arra, hogy endotél sejtekben a NOX4 a domináns NADPH-oxidáz

73

. A tüdőben betöltött

szerepe vonatkozásában viszont bizonyított, hogy a NOX4 által termelt szuperoxid szükséges

a

TGF-β1-indukálta

fibroblaszt-miofibroblaszt

átalakuláshoz

és

az

74

extracelluláris mátrix szintéziséhez . A NOX5 szerkezete jelentősen különbözik a NOX1-4 izoformáktól: a fehérje Nterminális részén négy egymást követő kalciumkötő EF-hand motívum található 43,75 (1. ábra). Humán szövetek közül a herében a spermiumokban, a lépben és a nyirokcsomókban (feltételezhetően a T- és B-limfocitákban), ezenkívül a petefészekben, placentában, méhben, hasnyálmirigyben, csontvelőben és az érfal simaizomzatában is expresszálódik 8. Különlegessége, hogy az egér genomjában nem található meg. Pontos élettani szerepe nem ismert, szabályozásáról azonban elmondható, hogy az EF-hand motívumok Ca2+-kötésének hatására aktiválódik

76

. Egyelőre nem ismert, hogy

működéséhez más fehérjére is szükség lenne.

3.2.2.3 A DUOX fehérjék A pajzsmirigy oxidáz funkciót ellátó enzimét régóta keresték, mivel ismert volt, hogy a follikulusok epitélsejtjei H2O2-ot termelnek 77. Két munkacsoport párhuzamosan azonosította és klónozta meg a mirigy két oxidázát, melyek a THOX1 és THOX2 (thyroid oxidase) elnevezést kapták

78,79

. A későbbiekben szerkezeti sajátosságaik

alapján, kettős oxidáznak (dual oxidase) keresztelték el őket (DUOX1 és DUOX2), mivel a fehérjék N-terminálisa, eltérően a NOX enzimektől, tartalmaz egy peroxidáz aktivitás nélküli extracelluláris peroxidázszerű domént

80

. További különbség a NOX

enzimekhez képest, hogy két EF-hand típusú kalciumkötő motívum található a jellegzetes 6 transzmembrán doméntől N-terminálisan (3. ábra), valamint hogy a működésük során nem mutatható ki szuperoxid, csak H2O2 képződése 7. Ennek pontos magyarázata egyelőre nem ismert, de valószínűsíthető, hogy a képződő O2•− közvetlenül

16

az enzim környezetében, talán annak saját dizmutáz aktivitása folytán H2O2-dá alakul át. pero x

H2O2

idáz dom szerű én

3. ábra – A DUOX enzimek szerkezete A DUOX1 és DUOX2 enzimek a plazmamembránban komplexben találhatók a DUOXA1, illetve DUOXA2 fehérjékkel. Az enzimek a NADPH-oxidáz homológ régióban tartalmaznak egy C-terminális NADPH-kötő, egy FAD-kötő és hat transzmembrán domént. A DUOX enzimek sajátossága az extracellulárisan elhelyezkedő N-terminális peroxidázszerű domén, egy extra traszmembrán domén a többi NOX enzimhez képest és az 1. és 2. transzmembrán domén között elhelyezkedő két citoplazmatikus EF-hand motívum, melyek az enzim aktivációjában játszanak szerepet.

2 O2•−

extracelluláris tér

Fe2+ Fe2+

citoplazma

EF EF

2 e-

FAD

NADPH NADP+ + H+

DUOX1 DUOX2

DUOXA1 DUOXA2

A DUOX fehérjék a pajzsmirigyen kívül kifejeződnek még a nyálmirigyek kivezető csöveinek hámsejtjeiben (DUOX2), a gasztrointesztinális rendszer (DUOX2), valamint a légcső és a bronchusok felszínét borító nyálkahártyában (DUOX1 és DUOX2)

81,82

. A DUOX1 fehérjét munkacsoportunk kimutatta a húgyhólyag urotél

83

sejtjeiben , valamint jelen van még a bőr keratinocitáiban is 84. A DUOX enzimek működésének legfontosabb szabályozója a citoplazmatikus [Ca2+] változása: az EF-hand motívumhoz kötő Ca2+-ok aktiválják őket. A legtöbb NOX enzimhez hasonlóan (a NOX5-től eltekintve) a DUOX enzimek is heterodimer komplexet alkotnak. A DUOX1 partnere a DUOXA1 fehérje, a DUOX2 pedig a DUOXA2-vel kerül komplexbe

46

. A DUOX érési faktornak is nevezett DUOX

aktivátor fehérjék (DUOXA1 és DUOXA2) stabilizálják az enzimet, és lehetővé teszik, hogy a komplex a plazmamembránban helyezkedjen el. Hiányukban a DUOX enzimek az endoplazmás retikulumban rekednek

85,86

. A DUOX fehérjék működését szabályozó

további fehérjékről egyelőre nincsenek ismereteink. A DUOX enzimek szerepe néhány szövetben pontosan ismert. A pajzsmirigy hormonszintézisének egyik lépése a tireoglobulin tirozin oldalláncainak jódozása, melyhez nélkülözhetetlen a DUOX2 által termelt H2O2. A DUOX2 vagy a DUOXA2 funkciójának kiesése hipotireózist eredményez

87

. A DUOX1 is jelen van a

pajzsmirigyben, de nem tudja helyettesíteni a DUOX2-t annak hiánya esetén

88

. A

DUOX enzimek által termelt H2O2-ot jellemző módon egy peroxidáz használja fel, így a

17

pajzsmirigyben a tireoperoxidáz, a nyálban és a légúti hámsejtek felszínén pedig a laktoperoxidáz enzim. A tireoperoxidáz alakítja monojódtirozinná és dijódtirozinná a tireoglobulin tirozin oldalláncait, ami fontos lépése a tireoglobulinhoz kötött T4 hormon keletkezésének 89. A DUOX által termelt H2O2 extracelluláris mátrixot stabilizáló hatása több élőlény esetében ismert. Tengerisün petesejtek megtermékenyítése során aktiválódik a DUOX-homológ UDX1 (urchin dual oxidase 1) 90, mely egy kemény fertilizációs burok kialakítását teszi lehetővé, aminek funkciója a polispermia megakadályozása és a fejlődő embrió védelme. Az UDX1 működése is kapcsolódik egy peroxidáz enzimhez, az ovoperoxidázhoz, mely a H2O2-ot felhasználva ditirozin-keresztkötéseket alakít ki az extracelluláris fehérjék között, ezáltal megszilárdítja a fertilizációs burkot

90,91

. DUOX

fehérjéket kódoló gének a C. elegans genomjában is megtalálhatók. A ceDUOX1 génjének csendesítése esetén a fonalférgeken hólyagok és egyéb morfológiai defektusok jelennek meg, melyek a zavart kutikula-bioszintézis következményei

80

. A tengerisün

petesejtjéhez hasonlóan itt is di- és tritirozin kötések képződését teszi lehetővé a DUOX, ami elengedhetetlen a kutikula stabilizálásához. Alacsonyabb

rendű

élőlények

esetén

bizonyított

a

DUOX

enzimek

immunvédekezésben betöltött szerepe. Így a D. melanogaster dDUOX génjének csendesítése a tápcsatorna antibakteriális védekezésének károsodásához és fertőzések esetén az egyedek gyorsabb pusztulásához vezet

92,93

. Zebradánió lárvákon végzett

kísérletekben kimutatták, hogy a farokúszó sebzését követően H2O2 termelődik, mely elősegíti a fehérvérsejtek kemotaxisát. A zebradánió DUOX génjének csendesítése meggátolta a H2O2 képződését, és csökkentette a sebhez vándorló fehérvérsejtek számát94. Emlősök esetében egyelőre hiányoznak a minden kétséget kizáró bizonyítékok, melyek a DUOX fehérjék immunvédekezésben betöltött szerepét alátámasztanák. Ismert azonban, hogy a nyálmirigyek kivezető csöveiben és a nyálkahártyákat borító felszíneken kifejeződő DUOX enzimek laktoperoxidáz jelenlétében antimikrobiális hatású hipotiocionát-iont termelnek 81,82,95.

18

3.2.3

Az endoplazmás retikulum szerepe a sejten belüli H2O2-képződésben A legegyszerűbb baktériumoktól az élesztőgombákon át egészen az emlősökig,

minden sejtben működnek azok a mechanizmusok, melyek lehetővé teszik a fehérjék másodlagos és harmadlagos szerkezetének stabilizálását

96

. Megfelelő tekeredésükhöz

többnyire szükség van meghatározott cisztein oldalláncok közötti diszulfidhidak kialakulására. Prokariótákban ez a folyamat a periplazmában zajlik, míg eukarióta sejtekben az endoplazmás retikulumban képződnek diszulfidhidak a később szekrécióra kerülő, illetve a membránokba épülő fehérjékben 97. A tiol-csoportok oxidációja során egy diszulfidhíd kialakulása közben két elektron helyeződik át a fehérjékről egy elektronakceptorra. A végső elektronakceptor jelenlegi elképzelések szerint a molekuláris oxigén, mely két elektron felvételével H2O2-dá alakul 8 (4. ábra). Így feltételezhető, hogy az endoplazmás retikulumban zajló diszulfidhíd-képződés során jelentős a ROS termelése, egyes számítások szerint ez a ROS teljes képződésének akár 25%-át is kiteheti az élénk fehérjeszintézist folytató sejtekben 98. 3.2.3.1 A PDI és az Ero1 fehérjék Anfinsen és mtsai. már 50 évvel ezelőtt bebizonyították, hogy in vitro nagyon lassan, de spontán is kialakulnak diszulfidhidak a fehérjék szabad tiol-csoportjai között99. Ezt a folyamatot in vivo a protein diszulfid izomeráz enzimek (PDI) katalizálják, melyek tiol-diszulfid-kicserélődési reakciók révén jelentősen felgyorsítják a natív konformáció kialakulását 100,101. A PDI erősen konzervált, az egyik legnagyobb mennyiségben jelenlévő ER luminális fehérje eukarióta sejtekben

102

. Négy tioredoxinszerű domént tartalmaz,

melyek oxidáltsági állapotuktól függően képesek az újonnan képződő fehérjék diszulfidhídjainak kialakítására és a helytelenül kialakult kötések izomerizálására vagy redukciójára

102

. A folyamat során az enzim aktív centrumában található tiolok

redukálódnak, melyek reoxidálása szükségszerű a folyamat fenntartása céljából. Az PDI visszaoxidálásában (regenerálásában) a legfontosabb szerepet betöltő enzim az endoplazmás retikulum oxidoreduktáz (Ero1) 103-105. Élesztőgombákon végzett kísérletek során állapították meg, hogy a működésképtelen Ero1-et kifejező mutáns

19

törzsekben tiol redukáló ágens, ditiotreitol (DTT) hatására a PDI redukált állapotba kerül és felhalmozódnak a hibásan tekeredett, redukált fehérjék is 103,106,107. Emlősökben két homológját azonosították a fehérjének: az általános szöveti kifejeződést mutató Ero1-Lα-t

108

, és az Ero1-Lβ-t, mely több fehérjeszekrécióra specializálódott szövetben

is megtalálható (pankreász béta-sejtek, a gyomor fősejtjei)

104,109

. Érdekes megfigyelés,

hogy ez utóbbi fehérje expressziója más szövetekben is indukálható, így a fokozott fehérjetermeléssel járó ER stressz idején támogathatja az Ero1-Lα funkcióját 104. Az Ero1 mélyén található aktív centrumában egy FAD prosztetikus csoport helyezkedik el, mely a PDI oxidálása során FADH2–vé alakul

110

. In vitro kísérletek

során megállapították, hogy végső elektronakceptorként ebben a folyamatban a molekuláris oxigén szerepel, mely H2O2-dá redukálódik (4. ábra) 8. Érdekes azonban, hogy élesztőgombák esetében anaerob körülmények között is zajlik a fehérjék oxidálódása, működik a PDI/Ero1 rendszer, így léteznie kell valamilyen alternatív elektronfelvevőnek is a folyamatban, melyet egyelőre nem ismerünk 111. SH

SH

SH

SH

2e-

PDI 2e-

Oxidáció S S

SH SH

Ero1 2e-

SH

S S

Izomerizáció

O2

H2O2

4. ábra – A PDI és az Ero1 enzimek katalizálják az oxidatív fehérjeérés folyamatát Az endoplazmás retikulumban szintetizálódó fehérjék szerkezetét stabilizáló diszulfidhidak kialakítását a protein diszulfid izomeráz (PDI) enzimek katalizálják. A cisztein oldalláncok szabad tiol-csoportjainak oxidációja során a PDI redukálódik. Visszaoxidálásában a legfontosabb szerepet betöltő enzim az endoplazmás retikulum oxidoreduktáz (Ero1) Végső elektronakceptorként a molekuláris oxigén veszi át az elektronokat, és H2O2 képződik belőle.

SH

Az Ero1 szerkezeti sajátossága, hogy a molekulán belül számos diszulfidhíd képződésére van lehetőség. Mind élesztőben (Ero1p), mind emlősökben (Ero1-L) azonosítottak olyan cisztein oldalláncokat, melyek negatív visszacsatolás révén szabályozzák a fehérjét

112-114

. Oxidálódás esetén ezek az intramolekuláris

diszulfidhidak gátolják az enzim működését, így megelőzik az ER túlzott H2O2termelését. A szabályozás a PDI-n keresztül történik, mely nyugalmi körülmények között a szabályozó ciszteinek redukálásval aktív állapotban tartja az Ero1-et 112-114.

20

Élesztőgombákban az Ero1p pótolhatatlannak tűnik a normális fehérjeérés folyamatában, az emlős sejtek azonban hasonló célra több alternatív útvonalat is kifejlesztettek

115

. Ezt támasztja alá, hogy az Ero1-Lα/Ero1-Lβ kettős génhiányos

egerek életképesek, és sejtjeikben az oxidatív fehérjeérés nem károsodott 116. Alternatív oxidáló lehetőséget biztosít maga a H2O2, aminek közvetlen diszulfidhíd-képző szerepe is felmerült 117. Ismert továbbá egy ER-rezidens peroxiredoxin fehérje, a PrxIV 118 mely H2O2

felhasználásával

képződését

119,120

oxidálja

a

PDI-t,

így

katalizálja

új

diszulfidhidak

. Ezenkívül emlős sejtekben a quiescin szulfhidril oxidázok

vitamin epoxid-oxidoreduktáz

122

, a GPx7 és GPx8

123

121

és a dehidroaszkorbát

, a K124

is

kialakíthat diszulfidhidakat. 3.2.3.2 Az ER megfelelő közeget biztosít a diszulfidhidak kialakulásához Az endoplazmás retikulum a fehérjék oxidálásához szükséges enzimek biztosításán

túl

megfelelő

közeget

is

kialakít

a

normális

fehérjetekeredési

folyamatokhoz. Számos redox-pár mennyiségi megoszlásában is megmutatkozik, hogy jóval oxidáltabb az ER lumene a citoplazmához képest

125

. Így a redukált/oxidált

glutation aránya a citoplazmában (GSH:GSSG) 1:1-1:3 körül van, míg a hányados az ER-ben 1:30-1:100

126

. A glutation csak kivételes esetekben képes diszulfidhidak

kialakítására, megfelelő koncentrációja azonban szükséges a normális fehérjetekeredési folyamatokhoz 127,128.

3.3

A reaktív oxigén származékok elbontása a sejten belül A sejtjeinkben termelődő és a rájuk ható ROS szintjét az oxidatív károsodás

elkerülése érdekében megfelelő kontroll alatt kell tartani. Számos antioxidáns mechanizmus

ismert,

melyeket

enzimatikus

és

nem-enzimatikus

csoportokba

sorolhatunk 129. A mitokondriumok légzési láncának és a NOX enzimek működésének elsődleges termékét, a szuperoxidot a citoszólban (SOD2) és a mitokondriális mátrixban (SOD1) megtalálható szuperoxid-dizmutázok H2O2-dá és oxigénné alakítják szuperoxidot semlegesíthetik még a mitokondriális peroxiredoxin fehérjék citokróm-oxidáz enzimek is

132

131

130

. A

, illetve a

. A további enzimatikus lebontás lehetőségét a

21

peroxiszómában, a mitokondriális mátrixban és a citoszólban is megtalálható kataláz enzim biztosítja, mely a H2O2-ot nagy hatékonysággal vízzé és oxigénné alakítja

12

.A

glutation peroxidázok és peroxiredoxinok (tioredoxin peroxidázok) redukált glutation és tioredoxin terhére bontják el a H2O2-ot 129. A túlzott oxidatív hatásokkal szemben több nem-enzimatikus védekezési faktor is rendelkezésre áll a sejtekben. Ezek közé tartoznak vízoldékony molekulák, mint az aszkorbát vagy a glutation, melyek 1-10 mM-os koncentrációban vannak jelen a legtöbb sejtalkotóban, és antioxidánsként viselkedve hatékonyan eliminálhatnak oxidáló ágenseket

133

. A lipidoldékony antioxidánsok, mint a tokoferol, a karotin vagy az

ubikinon legfontosabb feladata a lipidperoxidációs folyamatok gátlása révén a biológiai membránok védelme 134.

3.4

A reaktív oxigén származékok jelátviteli szerepe A NADPH-oxidáz enzimek tárgyalása kapcsán több hatást is említettem,

melyeket az enzimek működése során termelt O2•− és H2O2 hoz létre. Az alábbi fejezetben a reaktív oxigén származékok sejten belüli szerepét foglalom össze, külön kitérve azokra a molekuláris mechanizmusokra, melyek az általános károsító hatásokkal szemben a szabályozás lehetőségét teremtik meg.

3.4.1

A H2O2 mint legfontosabb jelátvivő a reaktív oxigén származékok közül Az elmúlt időszakban tankönyvi adattá vált a ROS jelátviteli szerepének

fontossága. A redox jelátvitel tárgykörébe sorolható minden olyan sejten belüli folyamat, melyet reaktív oxigén származékok szabályozottan irányítanak. Sajátságos kémiai szerkezetüknek köszönhetően az egyes reaktív oxigén származékoknak meghatározott biológiai hatásspektrumuk van. A bevezetőben említett reaktív oxigén származékok közül a hidroxil-gyök a legreaktívabb, nem specifikus módon reagál lipid-, DNS- és fehérje-molekulákkal, így jelátviteli folyamatokban szabályozott módon valószínűleg nem vesz részt 1. Noha a szuperoxid stabilabb molekula, a sejtekben alacsony koncentrációban van jelen, és rövid féléletideje illetve kis hatótávolsága miatt jelátviteli szerepét szintén elhanyagolhatónak tekintik

22

135

.

Elektrosztatikus tulajdonsága miatt néhány kivételes esetben reakcióba léphet egyes fehérjék vas-kén központjával

135

, például a bakteriális SoxR fehérjével, egy a

szuperoxid elleni védelemben szerepet játszó traszkripciós faktorral

136

. A H2O2 az

előzőeknél kevésbé reaktív, gyenge oxidáns, így alacsony koncentrációban kevéssé lép nem-specifikus reakciókba, és alig reagál vas-kén központokkal. Hatását legtöbb esetben fehérjék cisztein oldalláncainak szabad tiol-csoportján fejti ki, melyeket szelektív módon oxidálhat 137-139.

3.4.1.1 Cisztein oldalláncok oxidatív módosításai A fehérjék cisztein oldalláncainak tiol-csoportjait a H2O2 szulfén-, szulfin-, illetve szulfonsavvá oxidálhatja (5. ábra). A szulfénsav (-SOH) nagyon reaktív, amint egy szabad tiol- vagy amid-csoport közelébe kerül, diszulfid-, illetve szulfenamid-kötést alakít ki 140,141.

tiol :

SH H2O2

szulfénsav :

SOH

H2 O

diszulfid :

H2O2

H2O

S S

H2 O

szulfinsav :

SOOH H2O2

H2 O

szulfonsav :

SO3H

5. ábra – Cisztein oldalláncok oxidatív módosulásai A fehérjék cisztein oldalláncainak alacsony pKa értékkel rendelkező tiolcsoportjait a H2O2 szulfén-, szulfin-, illetve szulfonsavvá oxidálhatja. A szulfénsav egy további szabad tiolcsoporttal reagálva diszulfidhidat alakít ki.

A fehérjék cisztein oldalláncai nem azonos mértékben reakcióképesek. Azok az alacsony pKa értékkel (pKa : 5,0-6,7) rendelkező tiol-csoportok oxidálódnak nagyobb valószínűséggel, melyek a sejten belüli átlagos 6,8-7,2-es pH mellett dominánsan szabad tiolát anionként (-S-) vannak jelen

137-139

. Fontos még, hogy a fehérje felszínén,

vagy a H2O2 számára hozzáférhető részén helyezkedjenek el. A H2O2-függő redox jelátvitel specificitását az biztosítja, hogy a cisztein oldalláncoknak csak kis hányada teljesíti maradéktalanul ezeket a feltételeket

142

. Az oxidálódás eredményeképpen a

fehérjén belül vagy intermolekulárisan diszulfidhidak alakulhatnak ki, illetve kisebb méretű tiol-tartalmú molekulákkal, mint pl. glutationnal konjugálódhatnak

23

143

. A

megváltozott szerkezet módosíthatja a fehérje működését vagy a sejten belüli elhelyezkedését 142. A szabályozás során fontos szempont a folyamat reverzibilitása. Ez a feltétel is adott; az oxidált oldalláncok visszaalakítására olyan enzimek állnak rendelkezésre, mint pl. a glutaredoxin (Grx) vagy tioredoxin fehérjék (Trx), melyek működéséhez megfelelő redukáló molekulák jelenléte szükséges (glutation, NADPH) 144.

3.4.2

H2O2 által szabályozott fehérjék és jelpályák Folyamatosan növekszik azon fehérjék száma, melyekről kimutatják, hogy

redox-függő szabályozás alatt állnak

129

. A tucatnyi, akár több száz fehérje bemutatása

meghaladná ezen dolgozat kereteit, így az alábbiakban csak azoknak a példáknak a bemutatására szorítkozom, melyeket legjobban ismerünk. 3.4.2.1 Transzkripciós faktorok A reaktív oxigén származékok károsító hatásaival szemben a baktériumoktól a gombákon át egészen az emlős szervezetekig, minden élőlény kifejlesztett védekező mechanizmusokat. A hosszútávú védekezés részét képezik olyan transzkripciós faktorok, melyek érzékelik a H2O2 szintjének emelkedését, és ennek hatására az antioxidáns gének expresszióját fokozzák 145,146. 6. ábra – Az OxyR aktivációja A H2O2 oxidálja az OxyR transzkripciós faktor zöld színnel jelölt szabályozóközpontjában található Cys199-cet, mely intramolekuláris diszulfidhidat alakít ki a Cys208-cal. A létre jövő konformációváltozás akiválja a transzkripciós faktort. Inaktiválását a glutaredoxin (Grx1) végzi GSH jelenlétében. (Kristályszerkezet : Cell. 2001 Apr 6;105 (1):103-13. )

H2O2 Cys199

Grx1 (GSH) Cys208

redukált OxyR

oxidált OxyR

A fiziológiás szintet már minimálisan meghaladó H2O2 koncentráció is aktiválja az E. coli baktériumok H2O2-függő transzkripciós faktorát, az OxyR fehérjét

147

. A

H2O2 oxidálja a 199-es pozícióban található ciszein oldallánc tiol-csoportját, mely ezt követően intramolekuláris diszulfid hidat alakít ki a Cys208-cal (6. ábra)

24

145,148

. Ez

konformációváltozáshoz vezet, aminek következtében az OxyR aktív transzkripciós faktorrá válik

149

. A fehérje redukálását és inaktiválását a glutaredoxin (Grx1) végzi

GSH jelenlétében 145. S. cerevisiae élesztőgombában egy fehérjepár tölti be az OxyR-hez hasonló H2O2-szenzitív transzkripciós faktor szerepét 150. Az oxidáns receptor protein 1 (Orp1) a glutation peroxidázok családjába tartozó fehérje, mely a Yap1 (yeast activator protein 1) transzkripciós faktorral együttműködve érzékeli a H2O2 szintjének változását

145,151,152

.

A Yap1 bázikus leucin zippzár motívumot tartalmazó transzkripciós faktor, melyben nukleáris lokalizációs szignál (NLS), valamint egy N- és egy C-terminális ciszteingazdag régió is található (nCRD, cCRD) (7. ábra)

151

. A cCRD-ben lévő nukleáris

export szignált a Crm1p nukleáris export fehérje köti, mely RanGTP jelenlétében eltávolítja a Yap1-et a magból, és így meggátolja, hogy ott kifejtse hatását SH 36

Orp1red

H2O2

Trx

36

SOH

153

.

SH 36

Orp1ox

Orp1red cCRD

NES SSS

SH

NLS

bZIP

nCRD

Yap1 (inaktív)

SSS

598

cCRD

NES

NLS Trx

Crm1p

bZIP

nCRD

Yap1 (aktív) nukleáris akkumuláció

nukleáris export

7. ábra – A Yap1 transzkripciós faktor H2O2-függő aktivációja A S. cerevisiae eredetű Yap1 transzkripciós faktor sejtmagi felhalmozódását nyugalmi körülmények között a Crm1p, nukleáris export fehérje gátolja. H2O2 hatására oxidálódik az Orp1 fehérje Cys36 oldallánca, mely ezt követően intermolekuláris diszulfidhidat alakít ki a Yap1 Cys598 oldalláncával. További tiol-diszulfid átrendeződési reakciók révén három intramolekuláris diszulfidhíd jön létre a Yap1 nCRD és cCRD doménje között. Ez a konformációváltozás elfedi a fehérje nukleáris export szignálját (NES), és lehetővé teszi, hogy nukleáris lokalizációs szignálja (NLS) révén feldúsuljon a sejtmagban. Az Orp1 és Yap1 fehérjék redukálásában a tioredoxin reduktáz rendszer (Trx) vesz részt.

Az Orp1-Yap1 rendszer elektrontranszferláncként működik, melyben első lépésként az Orp1 katalitikus cisztein oldallánca (Cys36) oxidálódik H2O2 hatására

152

.

Ezt követően az Orp1 intermolekuláris diszulfidhidat alakít ki a Yap1 cCRD régiójában elhelyezkedő Cys598-cal, mely végül további oxidálódás és több lépésből álló tiol-

25

diszulfid

átrendeződési

reakciók

révén

három

intramolekuláris

diszulfidhidat 154

eredményez a Yap1 két cisztein-gazdag régiója között (7. ábra)

.

A

konformációváltozás eredményeképpen a molekula mélyére kerül a NES, így a Crm1p export fehérje nem képes hozzákötődni, ami végül a NLS-nak köszönhetően a Yap1 nukleáris felhalmozódásához vezet

153,155

. A Yap1 és az Orp1 fehérjék redukálásában a

tioredoxin reduktáz rendszer (Trx) vesz részt

156-158

, így a H2O2 szintjének csökkenését

követően ez felelős a Yap1-függő génexpresszió leállításáért. Magasabb rendű, többsejtű élőlényekben nem található meg az OxyR és Orp1Yap1 fehérjékhez hasonló akut transzkripciós rendszer, mely azonnal reagálni képes a H2O2 szintjének változására 1. Helyettük olyan transzkripciós faktorok működnek, melyek hosszútávú alkalmazkodást tesznek lehetővé a sejteket érő oxidatív hatásokkal szemben. Több fehérje és jelátviteli útvonal ismert, így pl. a p53 fehérje koaktivátora, a PGC1α az NF-κB útvonal

163

160

, a c-Myc onkogén

161

159

, a PPARγ

, a FOXO transzkripciós faktor

162

, és

, melyek H2O2 hatására aktiválódnak, és lehetővé teszik az oxidatív

hatás mértékétől függően a SOD, a kataláz és a glutation peroxidáz antioxidáns rendszerek fokozott expresszióját vagy jelentősebb sejtkárosodás esetén az apoptózis folyamatának beindítását. 3.4.2.2 Protein tirozin foszfatázok Régóta ismert, hogy alacsony koncentrációjú H2O2 a növekedési faktorok hatását utánozva fokozhatja a sejtek osztódását

164,165

. E jelenség molekuláris szintű

magyarázatára az utóbbi időben derült fény. Különböző, tirozin-kináz jelpályán keresztül is ható receptorok aktiválása a protein foszforiláció mellett H2O2-termelést is eredményez. Így több citokinről (TGF-β1, TNF-α, interleukinok), növekedési faktorokról (PDGF, EGF, VEGF, bFGF és inzulin), valamint heterotrimer G-fehérjéket aktiváló receptor agonistáról (AII, trombin, lizofoszfatidsav, bradikinin) mutatták ki, hogy hatásukra H2O2 termelődik kaszkádjában

másodlagos

hírvívő

166

. A képződő H2O2 a receptorok jelátviteli

szerepet

tölt

be

167-169

.

Egyik

legjobban

tanulmányozott hatása a protein tirozin foszfatáz enzimek (PTP) gátlása, amivel potencírozza a tirozin-kináz aktivitású receptorok működését 170. A protein tirozin foszfatáz enzimek a cisztein alapú foszfatázok családjába tartoznak. Jellemző tulajdonságuk, hogy aktív centrumukat egy katalitikus cisztein

26

képzi. Az aktív centrum konzervált Cys-Xaa5-Arg motívuma alacsony (5,0-6,7) pKa értéket kölcsönöz a tiol-csoportnak

171

. Ez biztosítja a H2O2-függő oxidáció és így a

szabályozás lehetőségét (8. ábra). 8. ábra – Protein tirozin foszfatázok (PTP) H2O2-függő szabályozása Tirozin oldalláncukon foszforilálódó receptorok, mint a tirozin-kináz receptorok (RTK), ligandkötés hatására fokozhatják a ROS termelését. A képződő H2O2 a receptor környezetében oxidálja a protein tirozin foszfatáz enzimek aktív centrumát képző cisztein oldallánc tiol-csoportját, ami az enzim inaktiválódásához vezet. A foszfatázok redukálásában a glutaredoxin (Grx1) és tioredoxin (Trx) rendszerek vesznek részt.

ligand extracelluláris tér

RTK

RTK citoplazma

inaktív

aktív

PP

H2O2

PTP SH aktív

P

PTP SOH

Grx/GSH Trx

inaktív

További foszfatázok is vannak, melyek érzékenyek a H2O2-függő inaktivációra. Ezek a kettős specificitású foszfatázok az alacsony molekulatömegű PTP-ok és a PTEN lipid foszfatáz, melyek aktív csoportjukban szintén ciszteint tartalmaznak 170. Az említett jelpályák aktiválódása során fontos kérdés, hogy milyen forrásból származik a H2O2. Különböző elképzelések láttak ezzel kapcsolatban napvilágot, részletes ismertetésük azonban túlmutatna a dolgozatom keretein, így csak a legfontosabbakat említem meg. Felmerült

a

lipoxigenáz

enzimek

szerepe

(LO-5,

LO-12),

melyek

aktiválódhatnak a tirozin-kináz jelpályák során, és arachidonsav metabolizálása közben H2O2-ot termelnek

10,11

. A fagocita oxidáz homológjainak azonosítása óta azonban a

legáltalánosabban elfogadott elképzelés szerint a NOX enzimek felelősek a H2O2termelésért ezen folyamatokban. Az EGF hatására képződő H2O2 termelődésében pl. a NOX1 szerepét vetették fel a következő jelpálya aktiválódásán keresztül: EGFR-PI3KβPix-Rac1-Nox1

172

. Az inzulin hatására keletkező H2O2 forrásaként a NOX4 enzimet

jelölték meg 3T3-L1 adipocitákban

173

. A legmeglepőbb eredmények szerint egyes

tirozin-kináz aktivitású receptorok, mint az EGFR vagy a GM-CSF receptor extracelluláris doménje ligand kötődés hatására önmagában is H2O2-ot termelhet 174.

27

3.4.2.3 Kalciumháztartás, ioncsatornák és pumpák A H2O2 szerepet játszhat a sejtek kalciumháztartásának szabályozásában is. Több ioncsatornáról és pumpáról is kimutatták, hogy működésüket a reaktív oxigén származékok szabályozzák. Az alábbiakban azokat a példákat emelem ki, melyek a dolgozat további részeiben is említésre kerülnek. A. thaliana gyökérszövetének vizsgálata során megfigyelték, hogy az RHD2 nevű (Root Hair Defective 2) Ca2+-függő NADPH-oxidáz enzim hiánya esetén károsodik a gyökérszőrök kialakulása. A gyökérszőr végén növekedés közben Ca2+szignál alakul ki, mely az RHD2 aktiválásán keresztül lokálisan fokozza a ROS képződését, ami pozitív visszacsatolással tovább növeli a beáramló Ca2+ mennyiségét175. Hasonló szabályozási folyamat játszódik le az ecetmuslicák ováriumában található simaizomsejtekben is. A D. melanogaster dNOX génjének csendesítése, mely a humán NOX5 homológja, csökkentette a nőstények peterakó-képességét. A károsodás hátterében az ovárium simaizomsejtjeinek csökkent összehúzódási képessége áll, aminek oka, hogy stimulus hatására kisebb Ca2+-jel alakul ki a sejtekben. Az eltérés molekuláris magyarázata, hogy hiányzik a pozitív visszacsatolási kör a dNOX által termelt H2O2 és a Ca2+-beáramlás között 176. Eukarióta sejtek kalciumháztartásának szabályozásában kulcsfontosságú az endoplazmás retikulum, mely a sejt fő kalcium raktárának tekinthető. A citoplazmához képest nagyságrendekkel magasabb [Ca2+]ER fenntartásában játszanak szerepet a szarkoendoplazmás retikulum Ca2+ ATPázai (SERCA) működését a kalretikulin

177

. Egyik izoformájuk, a SERCA2b

(CRT) és az ERp57 fehérjék redox-függő módon

szabályozzák178. A pumpa negyedik intraluminális hurokrégiójában található cisztein oldalláncok oxidációja lehetővé teszi a CRT-ERp57 komplex kötődését, ami gátolja a pumpa működését. Ezen túlmenően az ER membránjában található Ca2+-csatorna, az 1es típusú IP3 receptor (IP3R1) is redox-függő szabályozás alatt áll. A sejtalkotó lumene felé néző L3V doménjén keresztül a csatornához kötődik, és működését gátolja a tioredoxin családba tartozó ERp44 fehérje. Az L3V doménben található cisztein oldalláncok oxidált állapotban gátolják az ERp44 kötődését

179

. A SERCA2b és az

IP3R1 említett cisztein oldalláncai az ER lumene felé néznek, így a sejtalkotóban működő oxidoreduktáz enzimek vagy akár közvetlenül a H2O2 is szabályozhatja őket.

28

Az 1-es típusú IP3 receptorhoz hasonlóan redox-szabályozás alatt áll a szarkoplazmás retikulum 1-es és 2-es típusú rianodinreceptora is (RyR1, RyR2)

180

. A

rianodinreceptorok cisztein oldalláncainak tiol-csoportjai oxidált állapotban jellemző módon fokozzák a csatorna működését, és akadályozzák a gátló hatású kalretikulin kötődését a fehérjéhez

181

. Oxidáló körülmények között a felsorolt szabályozási

mechanizmusok a sejtalkotó Ca2+ leadását, redukáló körülmények között a Ca2+ felvételét segíthetik elő 179. 3.5

A H2O2 sejten belüli szintjének mérésére alkalmas módszerek Bátran kimondható, hogy a reaktív oxigén származékok kutatásának jelenleg

legnagyobb kerékkötője a megfelelő mérési módszerek hiánya. Számos érzékeny és specifikus módszer létezik, mely alkalmas az extracelluláris térben lévő különböző reaktív oxigén származékok mérésére, a sejten belüli detektálás azonban távolról sincs megoldva. Fluoreszcens módszerek nyújtják a legjobb lehetőséget különböző biológiailag fontos molekulák képződésének valós idejű követésére az élő sejten belül. Amióta Roger Tsien úttörő munkájának köszönhetően mérhetővé vált a sejtek [Ca2+]-ja

182,183

,

számos fluoreszcens szondát készítettek, melyek egyre több sejten belüli folyamat mérését teszik lehetővé. Két fő megközelítés létezik: a vizsgálni kívánt sejtek fluoreszcens festékekkel tölthetők meg, vagy genetikailag kódolt fehérjeszondákat fejeztethetünk ki bennük. 3.5.1

H2O2 mérésre alkalmas festékek A 2′,7′-dichlorodihidrofluorescein (DCFH) a széles körben használt fluoreszcein

molekula dihidro-származéka, mely reaktív oxigén származékok mérésre alkalmas. Oxidálódás hatására erősen fluoreszkáló vegyületté, 2′,7′-dichlorofluoresceinné (DCF) alakul

184

. E molekula diacetát észterszármazéka (DCFH-DA) sejt-permeábilis, mely

intracelluláris nemspecifikus észterázokkal reagálva elveszti membránpermeabilitását, így feldúsul az élő sejtekben, és alkalmassá válik a ROS termelésének követésére Hasonló dihidro-vegyületek még a dihydrorhodamine 123 (DHR123) dihydrocalcein

187

, a dihydroethidium

188

29

186

185

.

, a

, a 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine

189

(AmplexRed) H2TMRos)

190

és

a

2,3,4,5,6-pentafluoro-dihydrotetramethyl-rosamine

(PF-

.

Hátránya a felsorolt vegyületeknek, hogy különböző mértékben, de mindegyikük fotoszenzitív, vagyis a gerjesztő fény hatására is oxidálódik

191

. Ezen túlmenően nem

szelektívek, tehát nem egy meghatározott reaktív oxigén származék szintjét mérik, csak általánosságban követhetjük velük a sejten belüli oxidáló ágensek szintjének változását. A leggyakrabban használt DCFH-t oxidálják például a lipid peroxidok, a hidroxil-gyök, a nitrogén monoxid, a peroxinitrit és a hipoklorit is 185. Kellő óvatossággal és kritikával kell tehát kezelni minden olyan eredményt, melyet ezekkel a festékekkel nyertek, hiszen nem állapítható meg, hogy pontosan milyen oxidáló ágens hatását mérték. Az elmúlt évek során jelentős előrelépés történt a reaktív oxigén származékokra érzékeny festékek fejlesztésében. Több munkacsoport is létrehozott olyan molekulákat, melyek jóval specifikusabbak az előbb felsorolt dihidro-vegyületeknél. Ezek a molekulák, mint a pentafluorobenzenesulfonyl boronátvegyületek,

mint

a

192

vagy a Chang-labor által kifejlesztett

Peroxyresorufin-1

(PR1),

Peroxyfluor-1

(PF1),

Peroxyxanthone-1 (PX1), Peroxy Green1 (PG1) és a Peroxy Crimson1 (PC1) 193-195 nem oxidálódnak H2O2 hatására. Működésük ún. védőcsoport-eltávolítási reakción alapul, melynek lényege, hogy H2O2 hatására lehasad egy boronátcsoport a molekuláról, és ennek következtében válik fluoreszcenssé a festék

185

. Az utóbbi molekulák a ciántól a

zöldön át egészen a vörös színig lefedik az egész színpalettát, így különböző hullámhosszakon akár más festékekkel kombinálva is használhatók. Problémát jelent azonban, hogy ezen specifikus H2O2-érzékeny festékek a sejten belül nagyon lassan reagálnak H2O2-dal (a PG1 esetében például 30 perces H2O2-kezelésre van szükség mérhető szignál kialakulásához 195), ami nem teszi lehetővé gyors változások követését. A jelenleg létező és itt bemutatott festékekre egyaránt jellemző, hogy reaktív oxigén származékokkal irreverzíbilisen reagálnak. Ez kismértékű képződés esetében akár előnyös is lehet, mivel a szignált integrálva érzékenyebbé teszik a detektálást, gyors reverzíbilis változások kimutatására vagy a reakciók kinetikájának követésére azonban alkalmatlanok. A kémiai természetű fluoreszcens festékek a fenti problémák figyelembevétele mellett lehetőséget adnak a ROS sejten belüli képződésének követésére. Újabb fejlesztések haladnak abba az irányba, hogy lokalizált módon is mérhessünk velük, és

30

feldúsíthassuk őket sejtalkotókban, szubcelluláris kompartmentumokban. Ezek a megközelítések azonban még gyerekcipőben járnak 196. 3.5.2

ROS és H2O2-érzékelő genetikailag kódolt fehérjeszondák A genetikailag kódolt, fehérje természetű szondák előnye, hogy meghatározott

szignálszekvenciák segítségével különböző sejtalkotókba vagy membránfelszínekre juttathatók

197,198

. Ezen túlmenően más (pl. a szignalizációban szerepet játszó)

fehérjékhez fuzionáltatva akár azok közvetlen környezetében is lehetőség nyílik biológiai változások kimutatására 199. 3.5.3

roGFP – a redox érzékeny zöld fluoreszcens fehérje Roger Tsien labatóriumában készült az első olyan fluoreszcens fehérje, mely

alkalmas a sejtek redox-státuszának követésére 200. A roGFP a zöld fluoreszcens fehérje (GFP) 201 módosított változata, melyben a hordó alakú molekula (9. ábra) felszínén két aminosavat

cisztein

oldalláncokra

cseréltek

(S147C/Q204C).

Ezek

olyan

konformációban és környezetben helyezkednek el, hogy oxidáló ágensek hatására diszulfidhíd képződhet köztük, mely a fehérje fluoreszcens gerjesztési spektrumát megváltoztatja. Oxidálódás következtében gerjeszthetőségük 400 nm-en nő, és 490 nmen csökken

200

. A két hullámhosszon gerjesztve és 515 nm-en mérve a kibocsátott fény

intenzitását meghatározható az ún. gerjesztési hányados (EM400nm/EM490nm), mely arányos a fehérje oxidáltságának mértékével. 9. ábra – A roGFP2 molekula térszerkezete A roGFP2 fehérje felszínén elhelyezkedő két cisztein oldallánc (Cys147 és Cys204) között oxidáció hatására diszulfidhíd képződik. A létre jövő konformációváltozás a molekula fluoreszcens gerjesztési spektrumát megváltoztatja. (kristályszerkezet : J Biol Chem. 2004 Mar 26;279 (13):13044-53. )

Cys204

Cys147

roGFP2

Az első közlemény hét roGFP variánst mutatott be, közülük a roGFP1 és a roGFP2 bizonyult a legjobban használhatónak

200

. A fejlesztés során a roGFP1 további

14 módosított változatát is létrehozták, melyek különböző sebességgel oxidálódnak, és

31

más-más redox-potenciáljuk révén alkalmasak lehetnek oxidáltabb (ER) vagy redukáltabb (citoplazma) közegben zajló változások mérésére

202

. Legáltalánosabb in

vivo használatra a roGFP1-R12 ajánlatos. Elkészítették a roGFP fehérjék mitokondriális mátrixba

200

, endoplazmás retikulumba vagy a sejtfelszínre

197

irányított változatait is,

melyek lehetővé teszik élő sejtek különböző sejtalkotóiban a redox státusz feltérképezését. A roGFP szondákkal kapcsolatban fontos kiemelni, hogy teljesen mesterséges redox-érzékeny fehérjékről van szó, melyek nemcsak a H2O2, hanem akármilyen cisztein oldalláncot oxidáló ágens hatását kimutatják

185

. Ezen túlmenően a H2O2 iránti

érzékenységük kisebb, mint az előző fejezetben említett festékeké, ami magyarázhatja, hogy miért nem alkalmasak jelátviteli kaszkádok során képződő ROS mérésére 203. 3.5.4

HyPer – a H2O2-érzékeny fluoreszcens szonda Az első specifikusan H2O2-érzékeny fehérjét Belousov és mtsai. fejlesztették

ki204. A szonda működése az OxyR bakteriális transzkripciós faktor H2O2-függő konformációváltozásán alapszik

145

. A HyPer egy fúziós fehérje, melyben az OxyR két

szabályozó cisztein oldallánca közé építették be a sárga fluoreszcens fehérje (YFP) egy módosított változatát (10. ábra). A YFP-ben az eredeti N- és C-terminálisokat összekötötték, és a hordó alakú molekulát a másik végén felnyitották, azaz cirkulárisan

OxyR

B relatív fényintenzitás

A

HyPer

+ H2O2

hullámhossz (nm)

10. ábra – A HyPer szonda szerkezete és működése (A) A HyPer egy fúziós fehérje, melyben az OxyR két szabályozó cisztein oldallánca (Cys199 és Cys208) közé építették be a sárga fluoreszcens fehérje cirkulárisan permutált változatát (cpYFP). (B) A szonda gerjesztési spektruma H2O2 hatására megváltozik, a 420 nm-en mérhető gerjesztési csúcs csökken, miközben az 500 nm-en mérhető nő. (gerjesztési spektrum : Nat Methods. 2006 Apr;3(4):281-6., kristályszerkezetek : OxyR: Cell. 2001 Apr 6;105 (1):103-13.; YFP : Structure. 1998 Oct 15;6(10):1267-77.)

32

permutálták a fehérjeláncot (cpYFP). Ezzel a módosítással a fehérje gerjesztési spektruma

jelentősebben 205

következtében

tolódik

el

a

molekula

konformációváltozásának

.

A létrehozott fehérjének két gerjesztési maximuma van (420 és 500 nm-en), és a kibocsátott fényintenzitás 516 nm-en a legnagyobb. H2O2 hatására a 420 nm-en mérhető gerjesztési csúcs csökken, az 500 nm-en mérhető nő (10. ábra, B panel). Az 500 és 420 nm-en mért intenzitások hányadosa adja a HyPer gerjesztési hányadosát, mely arányos a fehérje oxidáltságával

204

. A továbbfejlesztett változat, a HyPer-2 egy pontmutáció

eredményeképpen (A406V) a gerjesztési hányados nagyobb változásával reagál a H2O2 szintjének növekedésére 206. A HyPer specificitása annak köszönhető, hogy működése egy természetes H2O2érzékelő fehérje konformációváltozásán alapul, melyben az érzékelő ciszteinek a molekula mélyén, egy hidrofób zsebben találhatók

148

. A speciális felépítés

következtében csak a H2O2 tudja megközelíteni a szonda szabályozó központját, így más redukáló ágens, mint a szuperoxid, a NO, a peroxinitrit vagy a GSSG nem hat rá204. A HyPer használatát azonban egy komoly probléma korlátozza: a pH változása jelentős mértékben befolyásolja a fehérje fluoreszcenciáját. A pH-nak már kisfokú emelkedése is ugyanolyan változást hoz létre a fehérje gerjesztési spektrumában, mint a H2O2. A pH-érzékenységet jól szemlélteti, hogy ezt a tulajdonságát kihasználva pHszondát is készítettek belőle oly módon, hogy a H2O2 érzékeléséért felelő szabályozó ciszteint szerinre cserélték (C199S) 207. A SypHer-nevű szonda így a H2O2-ot nem, csak a pH változását méri

207

. A reaktív oxigén származékokat mérő festékekhez hasonlóan

tehát óvatosan kell értelmezni a HyPer használatával nyert eredményeket is, hiszen a mért fluoreszcencia változások hátterében a szonda környezetének lúgosodása vagy savanyodása is állhat.

33

4. CÉLKITŰZÉSEK

PhD-munkám során számos kérdéskört kutattam, melyek a sejtekben képződő H2O2 eredetének, hatásainak és mérésének témája köré csoportosultak. Kísérletes munkám fő célkitűzései az alábbiak voltak: •

A sejten belüli [H2O2] feltérképezése különböző sejtalkotókban egy genetikailag kódolt mérőszondával, a HyPer-rel.

•

Az ER-ben mért magas [H2O2] forrásának vizsgálata, és szintjének követése a sejtalkotó Ca2+-tartalmának mobilizálása során.

•

A fiziológiás körülmények között képződő H2O2 hatásainak vizsgálata a sejtekben kialakuló Ca2+-szignálra, vad típusú és DUOX1 génhiányos egerekből származó primer urotél sejtek felhasználásával.

•

Az eddig rendelkezésre álló H2O2 mérőmódszereknél előnyösebb, új eljárás kifejlesztése.

•

Az új szondákkal a NOX2 és a DUOX1 enzimek működése során képződő H2O2 koncentráció térbeli és időbeli változásainak követése az oxidázt kifejező és az őket körülvevő sejtekben.

34

5. MÓDSZEREK

Kísérletes munkám jelentős részét módszertani fejlesztés képezte, így az alábbi fejezet néhány pontja a szokásost meghaladó részletességgel mutatja be az alkalmazott módszereket. 5.1

Munkánk során használt anyagok A kísérletekben használt monoklonális anti-PDI és anti-HA antitesteket az Abcam

(Cambridge, MA, USA) cégtől, a poliklonális anti-Ero1-Lα antitestet a Cell Signaling (Danvers, MA, USA) cégtől vásároltuk. A monoklonális anti-V5 antitest az AbD Serotec (Martinsried, Németország) cégtől származott, az antirabbit- és antimousehorseradish peroxidase ellenanyagot pedig az Amersham Biosciences-től (Piscataway, NJ, USA) rendeltük. A következő anyagok az Invitrogen™ Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) cégtől származtak: Alexa-488 és Alexa-568 konjugált másodlagos antitestek, Lipofectamine 2000, Lipofectamine LTX, Opti-MEM®, Amplex Ultra Red reagens. A Fura-2 és Fura-PE3 festéket a Teflabs-től vásároltuk (Austin, TX, USA). A FugeneHD transzfekciós reagens a Roche (Basel, Svájc) cégtől származott. A szövettenyésztéshez használt flaskákat és fluoreszcens méréshez használt 96-lyukú lemezeket a Greiner Bio-One GmbH-tól (Kremsmuenster, Ausztria) vásároltuk. A sejttenyésztéshez használt DMEM és fötális borjú szérum (FBS) a Lonza cég (Basel, Svájc) terméke volt. A Pfu DNS polimeráz, restrikciós és reverz transzkriptáz enzimeket a Fermentas cégtől (Burlington, Kanada) vásároltuk. Az összes többi anyag a Sigma-Aldrich-tól (St. Louis, Missouri, USA) származik amennyiben másképp nem jelöltem. S. cerevisiae cDNS-t Harcska Lajos (SZBK, Genetikai intézet, Szeged) bocsátott rendelkezésünkre. A pSB/amaxaGFP transzpozon plazmidot és az SB100x Sleeping Beauty transzpozázt kódoló vektort Orbán Tamástól és Izsvák Zsuzsannától (MTA-SE Membránbiológiai Kutatócsoport, Budapest; Mobile DNA Group, MaxDelbrück Center for Molecular Medicine, Berlin, Németország) kaptuk. A kísérleteinkben használt extracelluláris médium (EC-1) összetétele: 133 mM NaCl, 3,1 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 0,5 mM KH2PO4, 0,5 mM MgSO4, 2 mM NaHCO3, 5 mM glükóz és 5 mM Na-Hepes, pH 7,4.

35

5.2 5.2.1

Plazmid konstrukciók, géncsendesítési technikák A HyPer és más fluoreszcens fehérjék irányítása különböző sejtalkotókba A citoszólban és a mitokondriális mátrixban elhelyezkedő HyPer és HyPer-M

fehérjéket kódoló plazmidokat 204 az Evrogen cégtől (Moszkva, Oroszország) vásároltuk meg. A fehérjét ezt követően különböző sejtalkotókba vagy azok citoszolikus felszínére irányító lokalizációs szekvenciákkal láttuk el (11. ábra). Az endoplazmás retikulum (HyPer-ERcyto) és a plazma membrán (HyPer-PM) citoszolikus felszínére irányító szekvenciákat, illetve a sejtmagi lokalizációs szignált a fehérje C-terminális végéhez illesztettük egy rövid összekötő peptidláncon keresztül (ANSRV). A következő irányító szekvenciákat használtuk: HyPer-ERcyto: S. cerevisiae ubikvitin konjugáz 6 lokalizációs szignálja (MVYIGIAIFLFVGLFMK); HyPer-3NLS: SV40 T-antigén nukleáris lokalizációs szignálja háromszoros ismétlődésben (DPKKKRKV)3; HyPer-PM: a humán K-Ras C-terminális CAAX-doménje (KMSKDVKKKKKKSKTKCVIM). A HyPer fehérjét az endoplazmás retikulum lumenébe is bejuttattuk (HyPer-ERlum) olyan módon, hogy a fehérjét kódoló génszakaszt PCR segítségével sokszorosítottuk, majd a pCMV/myc/ER/GFP (Invitrogen) eukarióta expressziós vektorba illesztettük a GFP fluoreszcens fehérje helyére, a PstI és NotI restrikciós helyek közé. Ebben a konstrukcióban a HyPer kódoló szakasza elé az egér Vh-lánc ER-irányító szekvenciája kerül (MGWSCIILFLVATATGAHS), a fehérje C-terminálisára pedig egy KDEL retenciós szignál kapcsolódik, melyek együttesen hatékonyan az ER-be juttatják, és ott is tartják a fehérjét. HyPer-C : HyPer-M :

HyPer 2MTS

HyPer

HyPer-3NLS :

HyPer

HyPer-PM :

HyPer

HyPer-ERcyto :

HyPer

HyPer-ERlum : ERlum

HyPer

11. ábra - Különböző sejtalkotókba irányított HyPer konstrukciók A HyPer különböző sejtalkotókba juttatásához rövid irányító szekvenciákat 3NLS illesztettünk a fehéjre kódoló régiójának Nvagy C-terminálisához. A HyPer CCAAX terminálisára helyezett nukleáris lokalizációs szignál (3NLS) vagy a plazmamembrán UBC6 (CAAX), illetve az ER citoplazmatikus felszínére (UBC6) irányító szekvencia, és az KDEL N-terminálisra helyezett mitokondriális mátrixba (2MTS), illetve az ER lumenébe targetáló szekvencia (az utóbbi egy Cterminális KDEL retenciós szignállal kiegészítve) a fehérjét a kívánt sejtalkotóba juttatja.

36

Az ER lumenében elhelyezkedő, piros színben fluoreszkáló mCherry-ER konstrukció elkészítéséhez a pCMV/myc/ER/GFP plazmidban található GFP-t NheI és NotI restrikciós vágóhelyek felhasználásával mCherry-re cseréltük. A mitokondriális mátrixba irányított mito-mRFP-t kifejező plazmidot pEF/myc/mito/GFP (Invitrogen) plazmidból készítettük el úgy, hogy PstI és NotI restrikciós vágással mRFP-t kódoló génszakaszt illesztettünk a GFP helyére. Az utóbbi konstrukció a humán citokróm c oxidáz

VIII.

alegységének

N-terminális

lokalizációs

szignálját

használja.

A

plazmamembránhoz irányított PM2-mRFP konstrukcióban a Lyn fehérje N-terminális palmitoilációs/mirisztoilációs

szignál

szekvenciája

(MGCIKSKGKDSAGA)

van

jelen208, a sejtmagba targetált mRFP-3NLS pedig az SV40 T-antigén nukleáris lokalizációs szignálját tartalmazza a HyPer-3NLS-hez hasonlóan. 5.2.2

Ero1-Lα klónozása és génjének csendesítése A teljes humán Ero1-Lα kódoló régiót humán pulmonáris fibroblaszt sejtekből

(Promocell, Heidelberg, Németország) származó cDNS-ből PFU DNS polimerázzal sokszorosítottuk a következő oligonukleotidokkal : 5’-AAG CTG CCG GAG CTG CAA TGG-3’ és 5’-TTA ATG AAT ATT CTG TAA CAA GTT CCT GAA GT-3’. A restrikciós vágási helyek nélküli primerekkel készült PCR-terméket pcDNA3.1 V5-HisTOPO vektorba illesztettük a gyártó utasításainak megfelelően (Invitrogen), majd a TOPO klónozás után restrikciós vágásokkal ellenőriztük az inzert megfelelő orientációját.

A

piros

színben

fluoreszkáló

Ero1-Lα-mCherry

konstrukció

elkészítéséhez pmCherry-N1 vektorba helyeztük át az Ero1-Lα génjét kódoló szakaszt XhoI és KpnI restrikciós helyek közé. Az Ero1-Lα génjének csendesítésére az RNAi módszert alkalmaztuk. Három különböző Ero1-Lα-ra specifikus Stealth® duplex inhibitoros RNS-t rendeltünk (Invitrogen) a következő szekvenciákkal : Ero1-Lα-Si1: 5’-GGG ACA CAA CAU UAC AGA AUU UCA A-3’; Ero1-Lα-Si2: 5’- GGG CUU UAU CCA AAG UGU UAC CAU U-3’. Kontrollként a gyártó által ajánlott közepes GC-tartalommal rendelkező siRNS-t használtuk (Si-C). Az Ero1-Lα-Si1 és Si2 szekvenciáknak megfelelő rövid, hajtű RNS-t kódoló vektorokat is készítettünk a Promega cég (Madison, WI) psiSTRIKE-hMGFP

37

plazmidját felhasználva. Ebben a megközelítésben előnyös volt, hogy hajtű RNS-t kifejező sejtekben egy fluoreszcens fehérje is átíródik, így mikroszkópos mérések során kiválaszthatók a géncsendesített sejtek. Kontrollként az Si1 és Si2 szekvenciák módosított változatait készítettük el, melyben 3 nukleotidot felcseréltünk egymással: Kontroll Ero1-Lα-Si1: GGG ACg CAA CAa UAC AuA AUU UCA A; Kontroll Ero1Lα-Si2: GGG CUg UAU uCA AAG UcU UAC CAU U. A psiSTRIKE vektorokat igényeinknek megfelelően tovább alakítottuk: a zöld színű hMGFP fluoreszcens fehérjét kódoló szekvencia helyére a piros mCherry-t illesztettük az NheI-BstBI restrikciós enzimeket használva, így a zöld színben fluoreszkáló HyPer konstrukciókat is kifejező sejtekben is láthatóvá tudtuk tenni a géncsendesített sejteket. A HyPer és az Ero1-Lα cDNS-ében változásokat hoztunk létre irányított mutagenezissel, a Stratagene® cég (La Jolla, CA) QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit-jének segítségével (C199S mutáns a HyPer-ben, mely az OxyR-ben C121S mutációnak felel meg, és C394S mutáns az Ero1-Lα-ban). A mutáns klónok egyszerűbb kimutatása érdekében néma mutációkat is illesztettünk a QuikChange primerekbe, melyeket a Czirják Gábor (SE, Élettani Intézet) által kifejlesztett “SeqHandler” program segítségével terveztünk 209. 5.2.3

Módosított J-lánc A dimer és pentamer immunglobulinok összekötő lánca, az ú.n. J-lánc egy ER-

ben érő, számos diszulfidhidat tartalmazó fehérje, mely alkalmassá tehető a sejtalkotóban zajló oxidatív fehérjeérési folyamatok követésére 210. Mezghrani és mtsai. leírása alapján elkészítettünk egy módosított egér J-láncot (JcM). A J-lánc génjét egér lépből

származó

cDNS-ből

erősítettük

ki

PFU

polimerázzal,

a

következő

oligonukleotidok felhasználásával: 5’- ATG AAG ACC CAC CTG CTT CTC TGG – 3’ és 5’- CGA TTC TTG CTA CCT TGA CTG CTC GAG C – 3’. A PCR-terméket pcDNA3.1 V5-His-TOPO TA-klónozó vektorba illesztettük az Ero1-Lα-hoz hasonlóan. A klónozáshoz használt oligonukleotidokat úgy készítettük el, hogy a J-lánc kódoló régióját követően még egy cisztein aminosav íródik át a fehérjével együtt, és ezt követően a klónozó vektorban megtalálható V5-címke is átíródik. A fehérje kódoló szekvenciáját, jobb kifejeződése érdekében egy GCCACC Kozak-szekvenciát

38

tartalmazó pcDNA 3.1(+) vektorba helyeztük át (Invitrogen) a KpnI/EcoRI restrikciós helyeket fölhasználva. Végül a fehérjére az endoplazmás retikulum lumenében visszatartó KDEL szekvenciát illesztettünk, a C-terminális részére a V5-címke után. 5.2.4

OxyFRET és PerFRET klónozása, transzpozon vektorok készítése Az OxyFRET elnevezésű, általunk tervezett, rekombináns H2O2 mérőszondát a

következő fehérjék és domének összeillesztésével állítottuk elő: CeruleanΔ11, a Yap1 fehérje összekapcsolt nCRD és cCRD doménjei (melyet Yap1RD néven már korábban is elkészítettek

151

) valamint a cp173Venus fehérje (12. ábra). A S. cerevisiae H2O2-

érézkelő transzkripciós faktorának, a Yap1 fehérjének élesztőgombából származó cDNS-ből PFU polimerázzal kierősítettük az nCRD doménjének (N279-K327) és a cCRD doménjének

(N565-N650) megfelelő kódoló régióját. A PCR-reakcióhoz

felhasznált oligonukleotidokon az nCRD esetében az 5’-végen HindIII, a 3’ végen BamHI restrikciós helyeket, a cCRD esetében 5’ BamHI és 3’ SacII vágási helyeket terveztünk. A Yap1RD elkészítéséhez a két PCR-terméket összeligáltuk, melynek eredményeképpen egy rövid glicin és szerin aminosavakból álló híd kötötte össze a doméneket (GGSGG). A Yap1RD 5’ végéhez ezt követően egy kék színben fluoreszkáló

fehérjét

illesztettünk,

a

Cerulean-t,

melynek

C-terminálisáról

eltávolítottunk 11 aminosavat. Az elkészült CeruleanΔ11-Yap1RD fúziós fehérjét kódoló szekvenciához végül a 3’ végen egy módosított sárga színben fluoreszkáló fehérjét illesztettünk, a Venus-nak egy ú.n. cirkulárisan permutált változatát, a cp173Venus-t

211

. Ez azt jelenti, hogy a fehérje eredeti C-terminálisán lévő utolsó 173

aminosavat áthelyezzük az N-terminálisra úgy, hogy egy 5 aminosavból álló (GGSGG) összekötő hidat illesztünk a két vég közé. Számos irodalmi adat mutat arra, hogy ez a módosított fluoreszcens fehérjepár (CeruleanΔ11 és cp173Venus) kiemelkedő hatékonyságú FRET párt alkot

212,213

. Az elkészített OxyFRET szondát pEGFP-N1

(Clontech, Palo Alto, CA) eukarióta expressziós vektorba illesztettük SacI/NotI restrikciós vágási helyek felhasználásával, illetve pSB/CMV/MCS/Puro transzpozon plazmidba helyeztük az NheI/NotI restrikciós helyek közé. Az utóbbi vektort a pSB/amaxaGFP transzpozon vektorból készítettük. A plazmid két expressziós kazettát tartalmaz egyszerre, egy CMV-promóter által meghajtott poliklónozó helyet, melybe igény szerint illeszthető bármilyen kifejezendő

39

gén, illetve egy SV40-promóter által meghajtott puromycin rezisztencia gént. Mindkét kazetta az eredeti transzpozon működését lehetővé tevő IR-DR(L) és IR-DR(R) ismétlődő szekvenciák közé esik. A transzpozon vektort koexpresszálva egy hiperaktív transzpozázt kódoló plazmiddal (SB100x Sleeping Beauty) az ismétlődő szekvenciák közé eső kazetták véletlenszerűen átvágódnak “TA” dinukleotid szekvenciákat tartalmazó genomiális DNS régiókba, így stabilan beépülnek a genomba. A kívánt génnel együtt beépülő puromycin rezisztencia lehetővé teszi a fehérjéket stabilan expresszáló klónok kiválasztását. Az OxyFRET szekvenciájának módosításával készült a PerFRET H2O2 mérőszonda. Az nCRD helyére került a S. Cerevisiae-ből származó teljes hosszúságú Orp1 (Gpx3) fehérje. Ennek klónozásához élesztő cDNS-ből indultunk ki, és a kódoló régió sokszorosításához olyan oligonukleotidokat használtunk föl, melyek a gén 5’ végére egy HindIII restrikciós helyet, a 3’ végére egy BamHI helyet illesztenek. Végeredményként a PerFRET-ben egy négy aminosavból (GGGS) álló híd köti össze az Orp1 és nCRD doméneket.

OxyFRET :

CeruleanΔ11

nCRD 279

PerFRET :

CeruleanΔ11

GGSGG

GGGS

Orp1 1

cCRD

565

327

164

cp173Venus

650

cCRD 565

cp173Venus

650

12. ábra - Az OxyFRET és PerFRET szondák domén-szerkezete Az OxyFRET szondában a CeruleanΔ11 és a cp173Venus fluoreszcens fehérjék közé illesztettük a Yap1, H2O2–függő transzkripciós faktor szabályozó doménjét (Yap1RD), mely az nCRD és cCRD domének néhány aminosavval (GGSGG) összekötött láncából álló fúziós fehérje. A PerFRET az OxyFRET szondától annyiban különbözik, hogy az nCRD helyén az Orp1 található, melyet egy rövid aminosavhíd köt a cCRD doménhez (GGGS).

Az OxyFRET és PerFRET szondáknak elkészítettük a plazma membrán citoplazmatikus felszínéhez és a mitokondriális mátrixba irányított változatát is. Az előbbi esetben a humán Lyn fehérje N-terminális palmitoilációs/mirisztilációs szignálját kialakító (MGCIKSKGKDSAGA) szekvencia felelős a megfelelő helyű sejten belüli elhelyezkedésért, míg az utóbbi konstrukció a humán citokróm c oxidáz VIII. alegységének N-terminális lokalizációs szignálját használja kétszeres ismétlődésben (MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLGD)2.

40

Az előbbiekben már említett irányított mutagenezis stratégiájával az OxyFRET és PerFRET cDNS-ében több mutációt készítettünk. Az OxyFRET-M-ben a Yap1RDben található összes cisztein oldalláncot szerinre mutáltuk (Cys303, 310, 315, 598, 610, 629 a Yap1 fehérje eredeti számozása alapján), a PerFRET-M-ben pedig az Orp1 Cys36, 64, 82 oldalláncait cseréltük szerinekre és a cCRD Cys598, 610, 629 aminosavait szintén szerinekre. 5.2.5

DUOX1 és DUOXA1 klónozása A humán DUOX1 HA-epitóp címkével ellátott fehérjét kifejező pcDNA5/FRT

HA-DUOX1 plazmidot Thomas L. Leto (NIAID, Bethesda, MD, USA) bocsátotta rendelkezésünkre 86. Eukarióta expresszió és stabil transzfekció céljából a HA-DUOX1et kódoló génszakaszt a korábbiakban leírt pSB/CMV/MCS/Puro transzpozon vektorba helyeztük át NheI/NotI restrikciós helyek felhasználásával. A DUOXA1 génjét kódoló szekvenciát humán tracheából származó cDNS-ből (Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX, USA) sokszorosítottuk PFU polimeráz segítségével olyan oligonukleotidokat felhasználva, melyek a gén 5’ végére NheI restrikciós helyet, GCCACC Kozak-szekvenciát és egy V5-epitóp címkét, 3’ végére pedig egy NotI restrikciós helyet illesztettek. Eukarióta expresszió céljára a kierősített és restrikciósan megemésztett V5-DUOXA1 PCR-terméket a pSB/CMV/MCS/Puro transzpozon vektorba illesztettük. A fentiekben felsorolt összes konstrukciót és mutáns fehérjét kódoló plazmid szekvenciáját automata szekvenálással ellenőriztük (MWG Biotech, Ag., Ebersberg, Németország). A szekvenciák tervezéséhez és nyilvántartásához a Vector NTI Advance™ 10.0 (Invitrogen) programot használtuk. 5.3

Sejtvonalak, sejttenyészetek fenntartása A munkánk során használt sejtvonalak a PLB-985 kivételével az ATCC-LGC

(Manassas, VA) cégtől származtak. A COS-7 majomvese fibroblaszt sejtvonalat és az epiteliális jellegű HeLa sejteket 10%-os fötális borjú szérumot, valamint penicillint (50 U/ml) és streptomycint (50 μg/ml) tartalmazó Dulbecco’s modified Eagle’s médiumban (DMEM) tenyésztettük (Lonza, Basel, Svájc). A PLB-985 humán myeloid leukémia

41

sejtvonalat Mary C. Dinauer (Indiana University School of Medicine, USA) bocsátotta az Élettani Intézet rendelkezésére. A sejteket szuszpenzióban növesztettük 10%-os fötális borjú szérumot, valamint penicillint (50 U/ml) és streptomycint (50 μg/ml) tartalmazó RPMI 1640 mediumban (Lonza). Neutrofil granulocita jellegű sejtekké differenciáltatásukhoz 7 napig 0,5% v/v dimetilformamid (DMFA) és 0,5% v/v-ra csökkentett szérumtartalom mellett növesztettük őket 214. HeLa és COS-7 sejteket a Western-blot és J-lánc oxidációs kísérletekhez a transzfekciót megelőző napon 2x105/10cm2 sűrűségben ültettünk 6-lyukú lemezekre. Mikroszkópos kísérletekhez a transzfekciót megelőző napon a HeLa és COS-7 sejteket 25-mm átmérőjű fedőlemezekre ültettük 1.5x105/fedőlemez sűrűséggel, míg a szondákat stabilan kifejező, differenciált PLB-985 sejteket közvetlenül a mérés előtt ültettük kezeletlen fedőlemezekre 1x106/fedőlemez sejtszámban. 5.4

Primer urotél sejtek preparálása Vad típusú és DUOX1 génhiányos egereket dietil-éterrel kábítottunk el, majd

cervikális diszlokáció után a húgyhólyagokat eltávolítottuk és szilikon gélt tartalmazó kristályosító csészében, EC-1 médiumban, a húgycső felől injekciós tűvel rögzítettük. A hólyagot középen kettévágtuk, majd az urotéliumot, valamint a húgyhólyag többi részét egy-egy csipesszel megfogtuk és óvatosan kettéválasztottuk. A hólyagról leválasztott urotélium réteget PBS oldatban egyszer öblítettük, majd 1 ml 200 mg/l-es tripszinEDTA oldatban 30 percig 37 ºC-on emésztettük. Tripszin-neutralizáló oldat hozzáadása után a sejteket 10 percig 500 g-vel centrifugáltuk, majd a felülúszót eltávolítva a sejteket EC-1 médiumban szuszpendáltuk, és a mérésig szobahőmérsékleten tartottuk. Az állatkísérleteket a 22.1/1100/003/2008-számú etikai engedélyben leírtak szerint végeztük. 5.5

Tranziens és stabil transzfekciók A DNS plazmidok transzfekciójához FuGene HD-t (Roche) vagy Lipofectamin

2000-et (Invitrogen) használtunk a gyári protokoll szerint (1-1,5 μg DNS és 2-3 μl transzfekciós reagens arányban). A kísérleteket a transzfekciót követő 24-48 órában végeztük, amikor a tranziensen expresszált fehérjék mennyisége a legnagyobb volt. A Stealth® siRNS duplex-eket 100 nM-os koncentrációban 48 órával a Western blot

42

kísérletek előtt transzfektáltuk Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) felhasználásával. A differenciálatlan PLB-985 sejteket elektroporációval transzfektáltuk a Neon™ transzfekciós rendszer segítségével (Invitrogen) a gyártó leírását követve a következő paraméterek beállításával : pulse voltage-1600 V, pulse width-10 ms, pulse number-3. A szonda fehérjéinket stabilan kifejező PLB-985 sejtek létrehozásához 1:10 arányban kotranszfektáltuk a sejteket az SB100x Sleeping Beauty transzpozázt és a szondáinkat tartalmazó pSB/CMV/MCS/Puro vektorokkal, majd a transzfekciót követő 24. órában puromycint helyeztünk a médiumba 1 µg/ml koncentrációban. Két hét elteltével a tranziens transzfekció nagy valószínűséggel lecseng, és csak azok a sejtek élnek túl, melyek már a genomiális DNS-ükbe integrálták a plazmiddal bejuttatott géneket. Ezt követően a fluoreszcens fehérjéket stabilan kifejező, legjobban expresszáló sejteket áramlási citometriás módszer segítségével egy FACS Aria készüléken válogattuk ki Várady György segítségével (MTA-SE Membránbiológiai Kutatócsoport, Budapest) olyan módon, hogy az expresszáló sejtek legintenzívebben fluoreszkáló 25%át tartottuk meg. 5.6

Immunofluoreszcens jelölés, konfokális lézer mikroszkópia Fedőlemezen növesztett sejteket PBS-sel történő mosás után 4% paraformaldehid,

PBS-ben fixáltuk 15 percig szobahőn. Ezt követően ötször mostuk PBS-ben, majd 200 mM glicint tartalmazó PBS-sel inkubáltuk 10 percig. Két ismételt glicines, majd PBS-es mosást követően, ha szükség volt rá 1% BSA és 0,1% Triton tartalmú PBS-ben permeabilizáltunk 20 percig. A blokkolás 3% BSA, PBS-ben történt egy óráig, majd 1% BSA, PBS-ben jelöltünk az első antitesttel 1 óráig. Ezután 6 mosás következett PBS-ben, majd a második, fluoreszcensen jelölt antitesttel 30-60 percig inkubáltunk ugyanilyen pufferben, és végül újabb 6 mosást végeztünk PBS-ben. A sejtmagokat DAPI festékkel festettük meg a másodlagos antitest hozzáadásával egyidőben. A fedőlemezekre Mowiol®4-88-ból készített reagenst (Mowiol4-88, glicerin, H2O és Tris pH 8,5) cseppentettünk, és így fordítottuk őket a tárgylemezre. A konfokális képeket egy LSM510 lézer scanning konfokális mikroszkópon készítettük (Carl Zeiss) 63x-os, 1,4 numerikus apertúrájú Plan-Apochromat és 40xes, 1,3 numerikus apertúrájú plan Neofluar immerziós objektívekkel (Carl Zeiss). Az

43

excitációhoz 405 nm-en emittáló dióda lézert, egy 25-milliwattos, 488 nm-en emittáló argon lézert és 1,0 milliwattos, 543 nm-en emittáló helium/neon lézert alkalmaztunk. Az emissziót 420-480-nm-es szűk sávú filterrel detektáltuk DAPI és Cerulean esetén, 500– 530 nm-es szűk sávú filterrel Alexa488, GFP, cp173Venus és HyPer esetén, valamint egy 560 nm felett átengedő széles sávú filterrel Alexa568, mRFP és mCherry esetén. Általában 1–2 μm optikai szeletvastagságú képeket készítettünk multitrack módban. A fluoroforok közötti átbeszélés elhanyagolható volt. Az elkészült képek utólagos feldolgozásához a Photoshop (Adobe) programot használtuk. 5.7 5.7.1

Fluoreszcens mikroszkópia : HyPer, citoplazmatikus [Ca2+] és FRET mérések Intracelluláris [H2O2] mérése a HyPer szondával Mikrofluorimetriás

méréseinket

egy

fordított

állású

Axio

Observer

mikroszkópon (Carl Zeiss; Oberkochen, Németország) végeztük, ami egy 40xes 1,4 numerikus apertúrájú (Fluar, Zeiss) immerziós objektívvel és egy Cascade II camrával (Photometrics; Tucson, AZ, USA) van felszerelve. A gerjesztő fényt egy xenon ívlámpa biztosította, és a kívánt hullámhosszakat DeltaRAM, Photon Technology International készülék monokromátorán állítottuk be. A HeLa sejtek különböző sejtalkotóinak H2O2 szintjét genetikailag kódolt szondával, a HyPer-rel térképeztük fel. A fehérje transzfekcióját követően 24-48 órával mértük excitációs ratiometriával a molekula fluoreszcens spektrumának megváltozását. Ez azt jelenti, hogy 490 és 420 nm-en egymást követően gerjesztve a HyPer-t, a kibocsátott fluoreszcens fényt egy 505 nm-es dikroikus tükrön, majd egy 525/36 nm-es emissziós szűrőn átengedve, mértük az intenzitást a fehérje 520 nm körüli emissziós maximumán. A fehérje fluoreszcens abszorpciós maximuma a bevezetőben említett módon attól függ, hogy oxidált állapotban található-e a szabályozó központjában lévő két cisztein oldallánc. Oxidáció során a 420 nm körüli abszorpciós maximum csökken, és a 490-500 nm körüli nő (lásd 10. ábra). A megfelelő háttérlevonási korrekciók után 520 nm-en mérve, a két kibocsátott fluoreszcens jel intenzitásának hányadosaként egy számot kapunk (HyPer F490/F420), mely a molekula oxidáltsági állapotával, így a H2O2szinttel arányos. A mérést megelőzően a fedőlemezeken növesztett sejteket egy fém kamrába illesztettük, melyet a mikroszkóp 37 fokra melegíthető tartójába helyeztünk. A

44

kamrába 1 ml HEPES-alapú EC1 médiumot tettünk, és a sejtek stimulálását 100 μl 10x töménységű oldatokkal végeztük, miután 100 μl médiumot eltávolítottunk a kamrából. A méréseket a MetaFluor (Molecular Devices; Sunnyvale, CA, USA) program segítségével végeztük, majd a képek további feldolgozásához a MetaMorph (Molecular Devices) programot használtuk. A 3-30 percig folyó mérések során 10 másodpercenként készültek felvételek. A

HeLa

sejtekben

kifejeződő

HyPer

fehérje

dózis-hatás

görbéjének

elkészítéséhez folyamatosan növekvő koncentrációban adtunk a sejtekhez H2O2-ot úgy, hogy 3 percenként emeltük a dózist. Adott H2O2-koncentrációra létre jövő választ a sejtek felett mérhető átlagos fluoreszcencia értékek hányadosából számítottuk a megfelelő háttérintenzitások levonása után. 5.7.2

Citoplazmatikus [Ca2+] mérése fluoreszcens mikroszkópiával Párhuzamos intracelluláris [Ca2+] és HyPer mérésekhez 3 μM Fura-PE3 AM

fluoreszcens indikátor festékkel töltöttük meg a sejteket EC-1 médiumban 30 percen keresztül szobahőmérsékleten. A festék kimosását követően a HyPer-nél használt szűrőrendszerrel vizsgáltuk a sejteket úgy, hogy két további hullámhosszon, 340 és 380 nm-en is gerjesztettük a sejteket. A Fura-PE3 fluoreszcens abszorpciós maximuma attól függ, hogy kalciumiont kötő vagy szabad formában van. A szabad molekula abszorpciós maximumának értéke 380 nm-nél, ezzel szemben a kalciumionnal szaturált molekuláé 340 nm-nél található. A Fura-PE3 emissziós maximuma mindkét esetben 510 nm-nél van. Ez a tulajdonság lehetővé teszi, hogy a molekulát a citoszól szabad kalciumion koncentrációjának nyomon követésére használjuk. A két fluoreszcens intenzitás

hányadosának

(340nm/380nm)

koncentrációjának szintje és változása

183

értékével

arányos

a

kalcium

. Az endoplazmás retikulumba irányított HyPer

és a Fura-PE3 közötti fluoreszcens átbeszélést minimalizáltuk olyan módon, hogy a Fura-PE3 szignálját a sejtmag fölött mértük. A további átbeszélés korrekciója és a háttérértékek intenzitásának levonása után számoltuk a HyPer és Fura gerjesztési hányadosokat.

45

5.7.3

FRET (fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer) működési elve és mikroszkópos mérése A

rezonancia

vizsgálhatóvá

energiatranszfer

válnak

konformációváltozásai

különböző 215

mérések

segítségével

molekulák,

fehérjék

élő

sejtekben

interakciói

is és

. A FRET alapja két fluoreszcens molekula közötti,

fotonkibocsátás nélkül lezajló energiatranszfer (Förster-effektus), melynek feltétele, hogy a donor fluorofór emissziós spektruma és az akceptor abszorpciós spektruma között átfedés legyen. Amennyiben a két fluorofór molekuláris közelségbe kerül, a donor fluoreszcens gerjesztése során emittált energia egy része nem kerül fény formájában kibocsátásra (donor emisszió csökken), hanem a másik fluorofórt gerjeszti, így annak az emissziós spektrumában fokozódik a fénykibocsátás intenzitása (akceptor emisszió nő) (13. ábra). Az energiatranszfer a két fluorofór távolságának a hatodik hatványával fordítottan arányos, így 2-10 nm közötti molekuláris távolságok változását lehet ezzel a technikával érzékenyen vizsgálni 216. B

C

donor (pl.Cerulean)

0 57

0 54

0

45

0

480nm

51

480nm

a FRET hányados értéke nagy

0

435nm 435nm

535nm

535nm

a FRET hányados értéke kicsi

48

akceptor (pl. Venus)

kibocsátott fényintenzitás

A

kibocsátott fény hullámhossza (nm)

FRET hányados =

akceptor emisszió (535nm) donor emisszió (480nm)

13. ábra – A fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (FRET) működési elve (A) Egy donor és egy akceptor fluorofór között, amennyiben megfelelő távolságra vannak egymástól (2-10nm), fénykibocsátás nélküli energiatranszfer jön létre, ha a donort fluoreszcensen gerjesztjük. (B) Egy Cerulean és Venus fluoreszcens fehérjét tartalmazó intramolekuláris FRET szenzor fluoreszcens emissziós spektruma energiatranszfer hiányában (fekete) és kialakulása után (piros). (C) A FRET hányados számolásához az akceptor gerjesztési csúcsán mért kibocsátott fényintenzitást osztjuk a donor gerjesztési csúcsán mért értékkel.

Intramolekuláris FRET vizsgálatok esetén egy molekulán, fehérjén belül található két fluorofór, melyek megfelelő FRET donor-akceptor párt alkotnak, és az őket összekötő régió konformációjának változásáról adnak hírt (13. ábra).

46

Munkánk során két intramolekuláris FRET szondát hoztunk létre (OxyFRET és PerFRET), melyekkel az előbbiekben ismertetett mikroszkópon folytattunk méréseket. A HyPer és Fura-PE3 excitációs ratiometriás mérésével szemben ebben az esetben emissziós ratiometriás mérés adott lehetőséget a FRET-szignál számszerűsítésére. A mérés lényege, hogy 435 nm-en gerjesztjük a fluoreszcens szondát, majd az emittált fényt egy Dual-View (Photometrics) tükörrendszer segítségével szétválasztjuk, így egyidőben tesszük láthatóvá a donor (CeruleanΔ11) 480 nm körüli és az akceptor (cp173Venus) 535 nm körüli emissziós maximummal kibocsátott fényét. A Dual-View rendszerben egy 505 nm-es dikroikus tükör választja szét a két fehérjéből származó emittált fényt, majd ezt követően egy 480/30 és egy 535/30 nm-es szűrőn engedi át a kamera CCD-jének két felére a szignált. A FRET hányados kiszámításához a háttérintezitás levonása után kapott képeken az akceptor által kibocsátott ú.n. FRET emissziós szignált elosztjuk a donor által kibocsátott donor emisszióval (13. ábra). A mérések során alkalmazott körülmények és módszerek többségében megegyeztek a HyPer szonda ismertetése során bemutatott eljárásokkal. Különbségként kiemelendő, hogy a FRET szondák dózis-hatás görbéjének elkészítésére szolgáló mérések során az alapvonal felvételét követően 3 percig tartó stimulálás után 1 mM H2O2 hozzáadásával maximálisan oxidáltuk a mérőszondákat. A FRET hányados relatív változásainak kiszámításához az alapvonalra normalizált értékeket viszonyítottuk a maximálisan oxidált, 100%-nak tekintett értékhez. A FRET szondák pH-függésének kimutatására különböző pH-értékekre beállított, nigericin (5μg/ml) és monensin (5 μM) protonofórokat

tartalmazó extracelluláris

puffert áramoltattunk a sejtek fölött, és egy gravitációs elven működő, szolenoid kapcsolóval felszerelt szuperfúziós rendszerrel cseréltük az oldatokat. A megfelelő pH értékek beállításához a következő puffereket használtuk : MOPS (pH 6.7-7.0), HEPES (pH 7.2-7.8) vagy TRIS (pH 8.0). 5.8

Citoplazmatikus [Ca2+] mérése szuszpenzióban A kísérletekhez frissen preparált urotél sejteket használtunk. 106 sejtet 2 ml EC-1

médiumban 45 percig töltöttünk 2 μM Fura-PE3-mal 37 °C-on, majd két mosási lépéssel eltávolítottuk a festéket az oldatból. A mérést 106 / 2,75 ml-es sűrűségben végeztük egy DeltaScan fluoreszcens spektrofotométerrel (PTI; Lawrenceville, NJ,

47

USA), 340 és 380 nm-en történő excitációval és 510 nm-en detektált emisszióval. A frissen izolált urotél sejtek stimuláláshoz thapsigargint (200 nM), NaATP-t (10 μM) vagy GSK 1016790A (10 nM) TRPV4 agonistát használtunk. Az adatokat a Felix for Windows 1.42 programmal elemeztük ki. 5.9

H2O2-mérés Amplex Red módszerrel Differenciáltatott PLB-985 és DUOX1-DUOXA1-et együttesen kifejező COS-7

sejteken mértünk H2O2-termelést. Standard extracelluláris EC-1 oldatban szuszpendált vagy letapasztott sejtekhez 1 U/ml HRP-t és 20 μM Amplex Ultra Red reagenst adtunk, majd stimuláltuk a sejteket PMA-val (1 μM), ionomycinnel (10 μM) vagy NaATP-vel (10 μM). Fél órás 37 ºC-os inkubálást követően 100 μl sejtmentes felülúszót nyertünk, és 96-lyukú fekete lemezen, 580 nm-en gerjesztve, 610 nm-en mértük a keletkezett rezofurin mennyiségét POLARstar OPTIMA fluoriméterrel (BMG LABTECH Gmbh, Offenburg, Németország). 5.10 Western-blot kísérletek és a J-lánc oxidatív érésének vizsgálata A HeLa sejtekben kifejeződő Ero1-Lα mennyiségét a transzfekciót vagy géncsendesítést követő 48. órában vizsgáltuk. A 6-lyukú lemezen növesztett sejteket jégre helyeztük, majd 4x Laemmli mintapufferben denaturálva kapartuk fel. A mintákat rövid szonikálást követően 10 percig forraltuk, majd 10 %-os SDS-poliakrilamid gélen futtattuk. A fehérjéket nitrocellulóz membránra blottoltuk (12 óra, 50 V), majd 5 %-os tejport és 0,1 % Tween 20-at tartalmazó PBS-ben blokkoltuk. A membránt elsődleges antitestekkel 1 óráig inkubáltuk a blokkoló oldatban, majd 3x15 perces mosás után további fél óráig inkubáltuk HRP-konjugált anti-nyúl vagy anti-egér másodlagos antitestet jelenlétében 1:5000 hígításban. Végül egy kemilumineszcencia elven működő eljárással (ECL, GE Healthcare) előhívtunk, és a jelet FUJI Super RX

filmen

detektáltuk. Az anti-Ero1-Lα, anti-V5 és anti-béta-aktin poli-, illetve monoklonális elsődleges antitesteket 1:1000-es hígításban használtuk. Az endoplazmás retikulumban zajló diszulfidhíd-képződés mértékének követésére a Mezghrani és mtsai. által kifejlesztett módszert alkalmaztuk 4. Ennek lényege egy 8 cisztein oldalláncot tartalmazó rekombináns fehérje, a ”Plazmid konstrukciók,

48

géncsendesítési technikák” fejezetben ismertetett módosított J-lánc (JcM) kifejezése a vizsgálni

kívánt

diszulfidhidak

sejtek

száma

endoplazmás befolyásolja

retikulumában. a

A

nem-denaturáló

fehérjében körülmények

kialakuló közötti

elektroforetikus futtatását, és a hozzá kapcsolt V5-epitóp címke lehetővé teszi a detektálását Westen-blot technikával. A diszulfidhíd-képző kapacitás vizsgálatára a sejteket egy membránpermeábilis tiol-alkiláló vegyülettel, N-ethyl maleimiddel (NEM) kezeltük elő, mely a J-lánc cisztein oldalláncainak szabad tiol-csoportjaihoz kötve befolyásolja annak futási sebességét. A sejtek adott körülmények közötti diszulfidhíd-képző kapacitásának vizsgálatát a következőképpen végeztük: a J-láncot kifejező sejteken 10 mM dithiothreitol (DTT) előkezelést alkalmaztunk, mely 20 perc alatt 37 °C-on hatékonyan redukálja a fehérjék diszulfidhidait, majd gyors mosást követően nyugalmi körülmények közé (37 °C-os DMEM-be) helyeztük őket vissza. Ezután 0, 1, 2, 4, és 8 perc visszaoxidálódási időt hagytunk a fehérjéknek, majd 10 mM N-ethyl maleimidet tartalmazó jeges PBS-sel állítottuk le a folyamatot. Végül egy Triton X-100 alapú pufferben lizáltuk a sejteket (1% Triton X-100, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM NEM, proteáz inhibítorok), és standard nem-redukáló SDS-PAGE és Western-blot eljárást követően tettük láthatóvá a J-lánc visszaoxidálódásának sebességét. Az elkészült filmeket később szkenneltük, és denzitometriával kvantifikáltuk az ImageJ 1.41 program segítségével. 5.11 Statisztikai analízis és dózis-hatás görbeelemzés Az adatok átlag ± standard hiba formában kerültek feltüntetésre. A csoportok közötti különbségeket t-próba, illetve Mann-Whitney-Wilcoxon próba használatával vizsgáltuk a kísérleti felállásnak és az adatok jellemzőinek megfelelően. Az adatok elemzésére a Sigmaplot for Windows 11.0 programot használtuk (2008 systat Software, Inc.) és a 0,05-nél kisebb p értéket tekintettük szignifikánsnak. A dózis-hatás adatok analíziséhez nem-lineáris regressziót (görbeillesztést) végeztünk, a szigmoid dózis-hatás görbe modell felhasználásával, Origin 8.0 program segítségével (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA).

49

6. EREDMÉNYEK 6.1

A H2O2 szintjének feltérképezése különböző sejtalkotókban Az elmúlt néhány évtized során fény derült a H2O2 sejten belüli szabályozó

szerepére

a

legkülönbözőbb

folyamatokban.

Intracelluláris

koncentrációjának

változásait azonban a sejtalkotók szintjén a korábban rendelkezésre álló technikák segítségével nem lehetett pontosan nyomon követni. Az első genetikailag kódolt specifikus H2O2-szonda, a HyPer forgalomba kerülésével

204

megnyílt az ilyen jellegű

vizsgálatok lehetősége is. Kísérleteinkben a HyPer N- és C-terminálisához rövid irányító szekvenciákat kapcsoltunk, melyek a fehérjét meghatározott sejtalkotókba juttatják. A fehérjéket kódoló plazmidokat HeLa sejtekbe transzfektáltuk és konfokális mikroszkópiával ellenőriztük a szondák sejten belüli elhelyezkedését. Az irányító szekvencia nélküli citoszolikus és a mitokondriális mátrixban elhelyezkedő HyPer-t kódoló plazmidokat Belousov és mtsai.

204

már elkészítették, így számunkra is rendelkezésre álltak. A

sejtmagban kifejeződő szonda létrehozásához az SV40 T-antigénjének sejtmagi

14. ábra - HyPer lokalizációja különböző sejtalkotókban A konfokális mikroszkópiával készült felvételeken HeLa sejtek láthatók, melyek kifejezik a citoszólban (HyPer-C), a mitokondriális mátrixban (HyPer-M), a sejtmagban (HyPer3NLS), a plazmamembrán citoszolikus felszínén (HyPer-PM), az endoplazmás retikulum lumében (HyPer-ERlum) és az ER citoszolikus felszínén (HyPer-ERcyto) elhelyezkedő HyPer konstrukciókat. (skála = 10 µm)

50

lokalizációs szignálját használtuk fel, a plazmamembrán citoszolikus felszínére juttatáshoz pedig a humán K-Ras CAAX-doménjét kapcsoltuk a fehérje Cterminálisához (14. ábra). A HyPer-t ezen kívül kifejeztük az endoplazmás retikulumban és annak citoszolikus felszínén is. Az egér Vh-lánc N-terminális szignálszekvenciája és egy C-terminális KDEL retenciós szignál a fehérjét az ER lumenébe juttatja, míg a S. cerevisiae ubikvitin konjugáz-6 enzimének (UBC6) C-terminális irányító-szekvenciája e sejtalkotó citoszolikus felszínén dúsítja fel (14. ábra). A következő lépésben ellenőriztük, hogy a szondák milyen mértékben találhatók a kívánt sejtalkotókban. Ehhez megvizsgáltuk a kolokalizációjukat a sejtalkotókat jelölő markerekkel vagy adott organellumhoz más irányító szekvenciával juttatott fluoreszcens fehérjékkel. A 15. ábrán látható, hogy mindegyik szonda jelentős átfedésben található a kontroll markerével, tehát ténylegesen a kívánt sejtalkotóba jut.

15. ábra - Különböző sejtalkotókba irányított HyPer kolokalizációja a sejtalkotókat jelölő markerekkel HeLa sejtekben konfokális mikroszkópiával vizsgáltuk a HyPer-M kolokalizációját mitomRFP-vel (A-C), a HyPer-3NLS átfedését a sejtmagot festő DAPI markerrel (D-F), a HyPerPM kolokalizációját PM2-mRFP-vel (G-I) és a HyPer-ERlum, illetve HyPer-ERcyto kolokalizációját az endoplazmás retikulum markerével, a PDI-vel (J-O). A HyPer megfelelő elhelyezkedését az egyesített képek sárga vagy világoskék (F) árnyalata jelzi. (skála = 10 µm)

51

Következő kísérleteinkben megmértük HeLa sejtekben a különböző HyPer szondák fluoreszcens gerjesztési hányadosát. Az 16. ábrán látható, hogy a citoplazmában, a sejtmagban és az ER, illetve a plazmamembrán citoszolikus felszínén 1 körüli a hányados. A mitokondriális mátrixban mérhető érték magasabb (1,49±0.03), aminek hátterében a sejtalkotóban zajló mitokondriális légzéshez kapcsolódó H2O2-termelés állhat. A legmagasabb gerjesztési hányados értéket az ER lumenében mértük (3,10±0,11), a HyPer szonda tehát a vizsgált sejtalkotók közül az ER-ben kerül a legoxidáltabb állapotba. Fontos kiemelni, hogy eredményeink alapján az itt képződő H2O2 nem lép túl az ER membránján, hisz a sejtalkotó citoszolikus felszínéhez irányított szondával alacsony, 1 körüli gerjesztési hányadost mértünk, ami megegyezik a citoplazmatikus szondával mérhető értékkel. 16. ábra - A H2O2 szintjének mérése különböző sejtalkotókban Sejtalkotókba irányított HyPer szondákat expresszáltunk HeLa sejtekben, és 490nm/420nm-en mértük a fluoreszcens gerjesztési hányados értékét. Az oszlopdiagramm négy független kísérletből származó adatok átlagát ± SEM mutatja (n=43-103 sejt).

6.2

Az ER-ben mérhető szignál eredetének vizsgálata További

kísérletekben

megvizsgáltuk,

hogy

hozzávetőlegesen

milyen

koncentrációban lehet jelen a H2O2 az ER-ben. A 17. ábráról leolvasható, hogy HeLa sejtekhez kb. 90 μM koncentrációban adott H2O2 emelte meg a citoszólban elhelyezkedő szonda gerjesztési hányadosát olyan értékre, amit nyugalmi körülmények között az ER-ben mértünk.

52

17. ábraábra. - A HyPer dózis-hatás görbéje, és DTT …….. A HyPer dózis-hatás görbéje, és iránti DTT érzékenysége iránti érzékenysége (A) A HyPer dózis-hatás görbéjét HeLa sejteken, emelkedő koncentrációjú 2O2 szekvenciális (A) A HyPer H2O2-al mérhető dózis-hatás görbéjét HeLa sejteken H vettük fel három hozzáadásával mértük. A három független kísérletből származó n=42 sejten kapott értékek független kísérletből származó, n=42 sejten. átlagát az átlag hibáját tüntettem fel. (B) A ±citoszólban és az ER lumenében elhelyezkedő HyPer szondát kifejező HeLa (B) A citoszólban az ER lumenében elhelyezkedő HyPer szondát kifejezőa HeLa sejteket sejteket 0,5 mMésDTT-vel kezeltünk. Öt perc elteltével kimostuk DTT-t, majd0,5a mM DTT-vel kezeltük miközben mértük a fluoreszcens gerjesztési hányadost. Öt perc kísérlet végén 100 μM H O2-ota adtuk a sejtekhez. (n=26 és n=16, 3 független elteltével kimostuk a DTT-t, 2majd kísérlet végén 100 μM H2O2-ot adtuk a sejtekhez. A kísérletben).A regisztrátumokon ± átlag hibája feltüntetésre. regisztrátumokon átlag ± SEM kerültátlag feltüntetésre. (n=26került ill. n=16 sejt 3 független kísérletből)

Ezen túlmenően megvizsgáltuk egy nem specifikus tiol-redukáló ágens, a DTT hatását is az ER-ben és a citoszólban elhelyezkedő szondákra. 0,5 mM DTT öt percen belül lecsökkentette az ER-ben mérhető magas szignált, majd kimosását követően gyorsan visszaállt az eredetihez közeli érték (17. ábra, B panel). Ezt követően 100 μM H2O2 hozzáadásával a nyugalmi értéknél magasabb szintre tudtuk oxidálni a szondát. A citoszólban DTT hatására nem csökkent jelentősen a HyPer gerjesztési hányadosa, a szonda ebben a kompartmentben tehát nyugalmi körülmények között redukált állapotban van (17. ábra, B panel). Következő kísérleteinkben azt vizsgáltuk, hogy az ER-ben mérhető szignál kialakításáért ténylegesen a szonda aktív centrumában elhelyezkedő cisztein oldalláncok oxidációja felelős-e. Ehhez elkészítettük a HyPer H2O2-ra érzéketlen mutáns változatát, a HyPerC121S szondát, melynek gerjesztési hányadosa az 18. ábrán látható, hogy nem változik H2O2 hatására. Amennyiben a mutáns szondát az ER lumenében fejeztük ki, az eredetihez képest jelentősen alacsonyabb gerjesztési hányadost mértünk már kontroll körülmények között is, ahhoz hasonlót, mint amilyent DTT-kezelés után láttunk a vadtípusú HyPer-ERlum szondával.

53

18. ábra - A HyPer aktív centrumában lévő cisztein oldalláncok oxidált állapotban vannak az ER-ben (A) HyPer-C-t és C121S mutánsát kifejező HeLa sejteken 3 percig mértük a gerjesztési hányados értékét nyugalmi körülmények között, majd 100 µM H2O2 hozzáadását követően (n=46, ill. 91 sejt). (B) Az ER lumenébe irányított HyPer-ERlum és H2O2-ra érzéketlen C121S mutánsának nyugalmi gerjesztési hányadosát mértük HeLa sejteken (n=85, ill. 60 sejt). A bemutatott eredmények 4-4 kísérletből származtak, és az átlag ± SEM került feltüntetésre.

6.3

A H2O2 forrásának vizsgálata az ER-ben Következő kísérleteinkben arra kerestük a választ, mi lehet a forrása az ER-ben

mérhető magas H2O2-koncentrációnak, illetve milyen hatásokra változhat a szintje. Tisztított fehérjék felhasználásával in vitro rekonstruált rendszerben korábban több munkacsoport is kimutatta, hogy oxidatív fehérjeérés során H2O2 termelődik 8,217. Ismert volt továbbá, hogy a S. cerevisiae baktériumban expresszáltatott Ero1p fehérje működése közben H2O2-ot képez. Vizsgálatainkat megelőzően azonban nem álltak rendelkezésre olyan adatok, melyek az emlős Ero1 fehérjékkel kapcsolatban vagy élő sejtekben szolgáltattak volna ugyanerre bizonyítékot. A kérdés megválaszolására a humán Ero1-Lα fehérjét túlexpresszáltattuk, illetve az endogén fehérje kifejeződését géncsendesítéssel gátoltuk. Az endogén Ero1-Lα működését más módon, egy domináns negatív mutáns, az Ero1-LαC394S fehérje kifejezésével is gátoltuk

210

. A beavatkozások hatékonyságát Western-blot technikával

vizsgáltuk, valamint mértük az ER H2O2 szintjét (19. ábra, A panel). Két különböző siRNS is hatékonyan csökkentette az Ero1-Lα szintjét. A könnyebb mikroszkópos nyomon követés érdekében mCherry-vel, egy vörös fluoreszcens fehérjével jelöltük

54

meg az Ero1-Lα-t, és ezen fúziós fehérje hatását vizsgáltuk az ER H2O2 szintjére. Túlexpresszió során az ER-ben mérhető szignál szignifikánsan nőtt (3,67±0,10), míg a domináns negatív mutáns Ero1-LαC394S-mCherry csökkentette a gerjesztési hányadost (2,49±0,04). Géncsendesítést követően szintén szignifikánsan csökkent az ER H2O2 szintje ( Si1: 2,41±0,05; Si2: 2,58±0,05).

19. ábra - Az Ero1-Lα hatása az ER H2O2 szintjére (A) HeLa sejtekben tranziensen expresszáltuk, illetve a csendesítettük az Ero1-Lα génjét két specifikus (si1, si2) és egy kontroll siRNS-sel. A transzfekciót követő második napon Western-blot technikával vizsgáltuk a fehérje kifejeződését. (reprezentatív 3 független kísérletre) (B) Az ER-be irányított HyPer fluoreszcens gerjesztési hányadosát mértük HeLa sejtekben, melyek kontrollként az mCherry-ER fehérjét expresszálták (n=266). Mértük az Ero1-LαmCherry (n=143) vagy Ero1-LαC394S-mCherry (n=187) fehérjét kifejező, illetve az Ero1-Lα génjét csendesítő plazmidok (kontroll Ero1-Lα-si1 (n=143), Ero1-Lα-si1 (n=190), kontroll Ero1-Lα-si2 (n=153), Ero1-Lα-si1 (n=171)) hatását. A bemutatott eredmények 3 független kísérletből származnak, és az átlag ± SEM került feltüntetésre (** p<0,001; * p=0,01). Az átlagos mCherry fluoreszcencia megegyezett az összes kísérletben.

6.4

Az ER [Ca2+] hatása a sejtalkotó H2O2 szintjére Az ER eukarióta sejtek kalciumháztartásának szabályozása szempontjából

kulcsfontosságú organellum, így érdekes kérdésnek tűnt annak vizsgálata, hogy a sejtalkotó [Ca2+]-jának változtatása hatással van-e a H2O2 szintjére. A SERCA-pumpát

55

gátoló thapsigargin hatására jelentősen csökkent az ER [Ca2+]-ja

218

, ennek megfelelő

kinetikával rövid időn belül lecsökkent az ER H2O2 koncentrációja is (20.ábra,A panel).

20. ábra – A kalcium mobilizációja az ER-ből csökkenti az ER H2O2 szintjét (A-B) Az ER-ba irányított HyPer-ERlum, illetve HyPer-ER(C121S)lum fluoreszcens gerjesztési hányadosát mértük HeLa sejtekben 200 nM thapsigargin illetve 100 μM hisztamin kezelés közben, majd 100 μM H2O2 hozzáadásával fejeztük be a mérést. A görbék három független kísérletben mért n=24-34 sejtből származó értékek átlagát ± SEM mutatják. A C-D paneleken reprezentatív mérési eredményei láthatók egyazon sejtben párhuzamosan mért citoszolikus [Ca2+]-nak (FuraPE3 - piros) és ER [H2O2]-nak (fekete) 200 nM thapsigargin, illetve 100 μM hisztamin kezelés során. A kezelést követően H2O2 hozzáadásával a HyPer-ER ismét oxidálódott. Thapsigargin kezelés a raktárak [Ca2+]-jának csökkentésével kapacitatív Ca2+ belépést is kivált

219

,

melynek során a külső térből jelentős mennyiségű Ca2+ áramlik a sejtbe. Az ER [H2O2]jának csökkenése azonban Ca2+-mentes oldatban is megfigyelhető volt, így a kapacitatív Ca2+ belépés szerepét kizárhatjuk a folyamatban (az eredményeket külön nem mutatom). Azt is megfigyeltük, hogy az ER Ca2+-tartalmának hisztaminnal történő mobilizálása is a kalcium szintjének változásával azonos irányú és kinetikájú [H2O2] változást eredményezett (20.ábra, B panel). Kísérleteink egy részében egyazon sejtben

56

is nyomon követtük a citoplazmatikus [Ca2+] és az ER H2O2 szintjének szimultán változását, melyről reprezentatív mérési eredményeket mutatok be

(20.ábra,C-D

panel). Összefoglalva tehát elmondható, hogy az ER Ca2+ szintjének csökkenése receptor agonista, vagy a SERCA gátlása révén a sejtalkotóban mérhető [H2O2] csökkenését eredményezi. 6.5

A JcM oxidatív fehérjeérését nem befolyásolja az [Ca2+]ER A H2O2 szintjét a fent bemutatott eredmények alapján mind az Ero1-Lα, mind az

ER [Ca2+]-ja befolyásolja. Elképzelhetőnek tartottuk, hogy a két tényező egymással összefügg, az ER [Ca2+]-jának változása az Ero1-Lα aktivitás módosításán keresztül hat a H2O2 szintjére. Ennek tisztázása érdekében kihasználtuk az Ero1-Lα diszulfidhídképződésben játszott szerepét, és aktivitásának vizsgálatára a módosított J-lánc (JcM) MW(kDa) 2001007050302520-

DTT

-

+

+

+

+

+

-

diamid

-

-

-

-

-

-

+

kimosás

-

0’ 1’ 2’ 4’ 8’ 0’

21.ábra - Módosított J-lánc futtatása nem-redukáló gélen multimer HeLa sejtekbe V5-epitóppal jelölt módosított J-láncot transzfektáltunk. 48 óra eltelte után tiol-redukáló illetve -oxidáló ágensekkel, DTT-vel dimer vagy diamiddal (10-10 mM) kezeltük redukált a sejteket 20 percig, majd oxidált kimosásukat követően 0, 1, 2, 4 illetve 8 percig hagytuk regenerálódni a sejteket. A JcM-et anti-V5 antitesttel, standard, nemredukáló SDS-PAGE-t követő Western-blot eljárás révén tettük láthatóvá.

diszulfidhídjainak kialakulását követtük nyomon a “Módszerek” fejezetben részletezett módon. A HeLa sejtekben expresszált JcM a sejtekhez adott DTT hatására redukálódott, majd a szer kimosását követően visszaoxidálódott. A 21.ábrán a J-láncról készült teljes Western-blot gélképet mutatom, melyen jól láthatók a redukált és oxidált monomer-, a dimer- és multimer formák is. A további kísérletek során csak a redukált J-lánc sávját emeltem ki és mutatom be. Az irodalmi adatoknak megfelelően Ero1-Lα túlexpresszió hatására a J-lánc visszaoxidálódása jelentősen gyorsult, génjének csendesítése pedig lassította az eredeti oxidációs szint visszaállását

210

. Thapsigargin hatására nem változott a diszulfidhíd-

57

kialakulás sebessége, az oxidáció kinetikája a kontrollhoz hasonló volt (22.ábra). Ezek az eredmények tehát arra utalnak, hogy az ER kalciumtartalmának csökkentése nem az Ero1-Lα szabályozásán keresztül hat a sejtalkotó H2O2 szintjére.

22.ábra - A JcM oxidatív fehérjeérését nem befolyásolja az luminális [Ca2+]ER (A) Módosított J-láncot kifejező plazmiddal önmagában transzfektáltunk HeLa sejteket, és mellé Ero1-Lα-t kifejező plazmidot, vagy génjét csendesítő siRNS-t koexpresszáltunk. A kezeletlen vagy thapsigarginnal stimulált (200nM, 20min) sejteket 10 mM DTT kezelést követően mostuk, majd a jelölt ideig inkubáltuk nyugalmi körülmények között. Végül meghatározott időpontokban leállítottuk a reakciót, és standard nem-redukáló SDS-PAGE-t követő Western-blot eljárással tettük láthatóvá a JcM redukált formáját. (B) Denzitometriával számszerűsítettük a JcM relatív redukáltságát, a 0’-es értéket 100%-nak, és az átlagos háttérintenzitást 0%-nak véve. A bemutatott eredmények három (Ero1-Lα), illetve négy kísérlet (az összes többi kondíció) átlagát ± SEM mutatják.

6.6

A H2O2 szintjének hatása emlős sejtek Ca2+-háztartására A bevezetőben részleteztem, hogy a NOX enzimek által termelt H2O2

szabályozhatja a sejtek Ca2+-felvételét. Növényi és rovar sejtekben (A. thaliana és D. melanogaster) is kimutatták, hogy a Ca2+-szignál hatására termelődő H2O2 pozitív visszacsatolással tovább fokozhatja a beáramló Ca2+ mennyiségét

175,176

. Primer emlős

sejteken ilyen szabályozási folyamatot vizsgálatainkat megelőzően, kétséget kizáróan, nem írtak le. Laboratóriumunkban Dr. Donkó Ágnes kimutatta, hogy a DUOX1 enzim kifejeződik urotél sejtekben, ahol Ca2+-szignál hatására H2O2-ot termel

83

. A sejteket

ATP-vel, thapsigarginnal, vagy a TRPV4 csatornák szelektív agonistájával

220

,

GSK1016790A-val stimulálta. DUOX1 génhiányos egerekből származó urotélben a vad típusú sejtekkel szemben nem fokozódott a H2O2 termelése az előbbi kezelések hatására83.

58

Az endogén módon H2O2-ot termelő urotél sejtek lehetőséget adtak arra, hogy megvizsgáljuk primer emlős sejteken a H2O2 esetleges Ca2+-szignált moduláló szerepét. Frissen izolált urotél sejtekben mértük a citoplazmatikus [Ca2+]-t Fura-2/AM-el. A 23.ábrán látható, hogy az ATP, thapsigargin (Tg) vagy a GSK1016790A (GSK) hatására kialakuló Ca2+-szignál nem különbözött jelentősen a vad típusú és a génhiányos egerekből származó sejtekben. Eredményeink alapján tehát megállapíthatjuk, hogy primer uroteliális sejtekben, melyek endogén módon fejezik ki a DUOX1 enzimet, nincsen hatása a képződő H2O2 nak a citoplazmatikus Ca2+-szignál mértékére és kinetikájára.

23.ábra - Ca2+-szignál kinetikája vad típusú és DUOX1 génhiányos urotél sejtekben Vad típusú és DUOX1 génhiányos (k.o.) egerekből preparált urotél sejteket Fura-2-vel töltöttünk. Ezt követően a sejteket 10μM ATP-vel majd thapsigarginnal (Tg), illetve a TRPV4agonista GSK1016790A-val stimuláltuk, és mértük a kialakuló Ca2+-szignál kinetikáját. A reprezentatív görbék minimum négy, hasonló eredményt mutató mérés egyikét mutatják.

6.7

Hidrogén-peroxid mérésére alkalmas új szondák kifejlesztése A sejten belüli [H2O2] mérésére létrehozott HyPer szonda nagy érzékenységű, és

megfelelő

specificitással

különbözteti

meg

a

H2O2-ot

más

reaktív

oxigén

származékoktól. Nagyfokú pH-érzékenysége azonban komoly problémát jelent, ezért új, saját fejlesztésű H2O2-szondák létrehozását tűztük ki célul. Megközelítésünk alapja az volt, hogy a H2O2 bizonyos fehérjék cisztein oldalláncainak specifikus oxidációjával megváltoztatja azok konformációját, amit intramolekuláris fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (FRET) segítségével terveztünk mérhetővé tenni. Két szondát hoztunk létre, melyek szerkezetét és működési elvét a “Módszerek” fejezetben részleteztem. Röviden összefoglalva, a Cerulean és Venus fluoreszcens fehérjék módosított változatai közé illesztettük a Yap1 H2O2-függő transzkripciós faktor

59

szabályozó doménjét (Yap1RD), illetve a szintén H2O2-függő Orp1 fehérjét, a Yap1-ből származó cCRD doménnel együtt. Így alakítottuk ki az OxyFRET és a PerFRET szondákat. 6.8

Az OxyFRET és PerFRET szondák működésének vizsgálata és jellemzése Szondáink, amennyiben HeLa sejtekben expresszáljuk őket, a sejtmagon kívül, a

citoszólban helyezkednek el (24. ábra, E-F). Lokalizációjukat az magyarázza, hogy mindkét fehérjében jelen van a Yap1 cCRD-ben található nukleáris export szignálja, más irányító szekvenciákat pedig nem tartalmaznak. A sejtekhez H2O2-ot adva FRETszignál növekedést mértünk az OxyFRET szondával (24. ábra, A). A PerFRET esetében meglepő módon FRET-szignál csökkenés jött létre, aminek hátterében az állhat, hogy oxidáció hatására a molekulát alkotó donor és akceptor fluorofórok eltávolodnak egymástól (24. ábra, B). Mindkét szonda dózisfüggő módon reagált a H2O2-dal, és a kontrolljaikat képező mutáns változatok (OxyFRET-M és PerFRET-M) nem válaszoltak H2O2 hozzáadására. A szondák működésével kapcsolatban fontos tisztázni, hogy oxidációjuk reverzíbilisen zajlik-e. A 24. ábra, C-D panelén látható, hogy a H2O2 kimosását követően perceken belül visszaállt az alapvonalhoz közeli FRET-hányados értéke, a szondák tehát intracellulárisan visszaredukálódtak. 1.9

OxyFRET OxyFRET-M H2O2 100μM

FRET hányados

1.8 H2O2 10μM

1.7 1.6 1.5 1.4

C

0

3

2.1

idő (min)

6

H2O2 100μM

1.7

E

1.6 1.5 1.4

D

1.8 1.7 1.6

3

6 idő (min)

H2O2 100μM

2.1

9

12

PerFRET mosás

F

2.0 FRET hányados

H2O2 100μM

1.9

0

9

PerFRET PerFRET-M

H2O2 10μM

2.0 FRET hányados

OxyFRET mosás

1.3

1.3

B

1.9 1.8

FRET hányados

A

1.9 1.8 1.7 1.6 1.5

1.5 0

3

idő (min)

6

9

0

3

6 idő (min)

9

12

24. ábra - Az OxyFRET és PerFRET szondák lokalizációja és H2O2 -ra adott válasza OxyFRET és OxyFRET-M (A), illetve PerFRET és PerFRET-M (B) szondákat kifejező HeLa sejtekben mértük a FRET hányados értékét nyugalmi körülmények között, és 10 μM majd 100 μM hozzáadását követően, illetve a H2O2 kimosása után (C-D). Az OxyFRET (E) és a PerFRET (F) sejten belüli elhelyezkedését konfokális mikroszkópiával vizsgáltuk.

60

A szondák érzékenységét jellemző dózis-hatás görbékről leolvasható (25. ábra), hogy az OxyFRET és a PerFRET esetében a H2O2 félmaximális oxidáló koncentrációja a sejtben 18,8 μM, illetve 22,8 μM értéknél van, és a szondák az 1-100 μM koncentrációtartományban alkalmasak a sejtekhez hozzáadott H2O2 mérésére. PerFRET relatív FRET hányados változás

relatív FRET hányados változás

OxyFRET 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1

10

100

H2O2 (μM)

1000

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1

10

100

H2O2 (μM)

1000

25. ábra - Az OxyFRET és PerFRET szondák dózis-hatás görbéje Az OxyFRET és PerFRET szondákat expresszáló HeLa sejtekhez különböző koncentrációban H2O2-ot adtunk, és mértük a kialakuló FRET hányados értékét. A relatív FRET hányados megállapításához az értéket a nyugalmi, illetve 1 mM H2O2 hatására kialakuló hányadoshoz viszonyítottuk. Az átlag ± SEM értékeket az OxyFRET esetében n=5-13 sejt, a PerFRET esetében n=5-17 sejt mérésével nyertük.

Következő vizsgálataink a szondák pH-érzékenységére irányultak. A HeLa sejteket, melyekben kifejeztük a szenzorokat, nigericin és monensin protonofórok jelenlétében különböző pH-értékekre állított extracelluláris pufferekben mértük. A 26. ábrán látható, hogy a fiziológiás tartományt átölelő pH = 6,7-8,0 tartományban csak kis mértékben függ a nyugalmi FRET-hányados értéke a pH-tól. OxyFRET + H2O2

2.4 2.2

2.2 FRET hányados

FRET hányados

PerFRET + H2O2

2.4

2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0

2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0

6.8

7.2

pH

7.6

8.0

6.8

7.2

pH

7.6

8.0

26. ábra - Az OxyFRET és PerFRET szondák pH-függése Az OxyFRET és PerFRET szondákat expresszáló HeLa sejteket nigericint (5 μg/ml) és monensint (5 μM) tartalmazó, különböző pH értékekre állított extracelluláris pufferekben vizsgáltuk. Mértük a nyugalmi, és 500 μM H2O2 hatására kialakuló FRET hányadost. Az átlag ± SEM értékeket OxyFRET esetében n=26, PerFRET esetében n=20 sejt mérésével nyertük.

61

HyPer (100µM)

3 2 1 0

3

6

9

idő (min)

2.2

(100µM)

(10mM)

12

15

FRET hányados

NH4Cl

4

1.7

1.6

NH4Cl

1.5

(10mM)

0

H2O2 (100µM)

2.3

H2O2

1.8

FRET hányados

HyPer (F490/F420)

5

PerFRET

OxyFRET H2O2

3

2.1 2.0 1.9

NH4Cl

1.8

(10mM)

1.7 1.6

6

9

idő (min)

12

15

0

3

6

9

12

15

idő (min)

27. ábra - A HyPer, OxyFRET és PerFRET szondák pH-függésének összehasonlítása A HyPer, OxyFRET és PerFRET szondákat kifejező HeLa sejtekben mértük a 10 mM NH4Cl, majd 100 μM H2O2 hatására kialakuló szignált. (reprezentatív mérési eredmények 2-2 sejtről)

Szondáink pH-érzékenységét HeLa sejteken összehasonlítottuk a HyPer-ével, az intracelluláris pH-t lúgosító NH4Cl, majd H2O2 hozzáadásával. 10 mM NH4Cl aspecifikus szignált eredményezett a HyPer esetében, az OxyFRET és PerFRET FRET hányadosa azonban csak H2O2-ra változott (27. ábra). A szondák jellemzéséhez hozzátartozik a specificitás kérdésének tisztázása is. Szintén HeLa sejtekben vizsgáltuk, hogy egyformán 100 μM-os koncentrációban alkalmazva milyen hatása van különböző oxidáló és redukáló ágenseknek. A H2O2 100%-nak tekintett oxidáló hatásához képest az oxidált glutation (GSSG) és menadion hatása nem bizonyult szignifikánsnak (28. ábra). Ez utóbbi vegyület több mechanizmuson keresztül is indukálja a reaktív oxigén származékok, illetve a O2•− termelését

221,222

. A tiol-redukáló ágens DTT nem befolyásolta a szondák nyugalmi

FRET-hányados értékét, míg a tiol-oxidáló diamid a H2O2-hoz hasonlóan jelentős

relatív FRET hányados változás (%)

oxidációt eredményezett (28. ábra). OxyFRET PerFRET

100

28. ábra - Az OxyFRET és PerFRET szondák specificitása Az OxyFRET és PerFRET szondákat expresszáló HeLa sejtek FRET hányados értékét 3 percig tartó, 100 μM H2O2, GSSG, menadion, DTT vagy diamid kezelés után mértük, és az értéket a nyugalmi, illetve 500 μM H2O2 hatására kialakuló értékekhez viszonyítottuk. A diagrammokon átlag ± SEM értékek láthatók (n=7-10 sejt).

80 60 40 20 0 baseline H2O2 alapvonal H2O2

GSSG menadione GSSG menadion DTT

diamide diamid

Az OxyFRET és PerFRET szondákkal kapcsolatban összefoglalóan elmondható, hogy szenzitív és specifikus módon alkalmasak a sejten belüli [H2O2] változásait

62

követni. Ezen túlmenően alacsony pH-érzékenységüknek köszönhetően mérsékelt pHváltozással járó folyamatok mellett is használhatók. 6.9

Sejten belüli [H2O2] mérések PLB sejteken A NADPH-oxidáz enzimek működése során keletkező ROS vagy H2O2

intracelluláris szintjének változását mindeddig senki sem mutatta ki genetikailag kódolt specifikus szondával. Ezért célként tűztük ki, hogy az aktivációt követő intracelluláris [H2O2] változását megmérjük neutrofil granulocita jellegű sejtekké differenciáltatott PLB-985 sejtekben, melyek kifejezik a NOX2 fagocita oxidáz enzimet az összes szabályozó komponensével együtt

214

. A myeloid-eredetű PLB-985 sejtek nehezen

transzfektálhatók, így stabil sejtvonalakat készítettünk, melyek az OxyFRET szonda plazmamembránhoz

(PM2-OxyFRET),

illetve

mitokondriális

mátrixba

(Mito-

OxyFRET) irányított változatát fejezték ki. A szondák sejten belüli elhelyezkedését konfokális mikroszkópiával ellenőriztük (29. ábra, A-B) Megvizsgáltuk ezt követően, hogy a stabil sejtvonalak működőképesek maradtak-e. Kimutattuk, hogy a differenciáltatott sejtek PMA hatására jelentős mennyiségű H2O2-ot termelnek az extracelluláris tér irányába, mely Amplex Ultra Red reagenssel mérhető (29. ábra,C-D). A

B

PM2-OxyFRET stabil PLB-985 sejtek

Mito-OxyFRET stabil PLB-985 sejtek

D PMA kontroll

PMA 10000

PMA kontroll

PMA H2O2 (Amplex Red RLU)

C H2O2 (Amplex Red RLU)

29. ábra - A PM2-OxyFRET és MitoOxyFRET szondákat stabilan kifejező PLB-985 sejtek H2O2 termelése A PM2-OxyFRET (A) és MitoOxyFRET (B) szondák sejten belüli elhelyezkedését PLB-985 sejtekben konfokális mikroszkópiával ellenőriztük (skála = 5μM). A sejteket 0,5% DMFA és csökkentett szérumtartalom mellett (0,5% v/v) differenciáltattuk 7 napig, majd 1μM PMA-val stimuláltuk, és mértük az extracelluláris tér irányába termelt H2O2 szintjét Amplex Ultra Red reagenssel. A PM2OxyFRET-et stabilan kifejező sejtek H2O2 termelése a C panelen, a MitoOxyFRET stabil expressziót mutató sejteké a D panelen látható. A görbék négy független kísérletből származó eredmények átlag ± SEM értékét mutatják.

10000

1000

1000

100

0

10

63

20

idő (min)

30

100

0

10

20

idő (min)

30

Ezt követően egyedi sejtek mikroszkópos mérésével követtük a [H2O2] sejten belüli változását. Az eredmények összefoglalása 30. ábrán látható: kimutattuk, hogy mind a plazmamembrán citoszolikus felszínén, mind a mitokondriális mátrixban emelkedik PMA hatására a [H2O2]. A hatás kivédhető volt, amennyiben a NADPHoxidáz enzimek gátlószerével, DPI-vel kezeltük elő a sejteket. stimulus

100

B

PMA Kontroll H2O2

relatív FRET hányados (%)

relatív FRET hányados (%)

A

DPI + PMA

80 60 40 20 0 0

5

10

15

idő (min)

20

25

stimulus

100

DPI + PMA

80 60 40 20 0 0

30

PMA Kontroll H2O2

5

10

15

idő (min)

20

25

30

30. ábra - H2O2-termelés mérése PLB-985 sejteken a PM2-OxyFRET és a Mito-OxyFRET szondákkal PM2-OxyFRET (A) és Mito-OxyFRET (B) szondákat stabilan kifejező PLB-985 sejtekben mértük a FRET hányadost 1 μM PMA vagy 1 mM H2O2 kezelést követően, nyugalmi körülmények között, illetve 20 perc 10 μM DPI előkezelés mellett. A görbék n=5-13 sejt méréséből származó átlag ± SEM értékét mutatják.

6.10 A DUOX1 enzim H2O2-termelésének vizsgálata A fagocita oxidáz által termelt jelentős mennyiségű szuperoxid illetve H2O2 szerepe igen lényeges a bekebelezett részecskék és kórokozók elpusztításában. E működés károsodása a kóroki tényező krónikus granulomatózis megbetegedésben. Valószínűsíthető, hogy a DUOX enzimek H2O2-termelése lényegesen kisebb, mint a fagocita oxidázé

83

. Vannak olyan elképzelések, melyek szerint a DUOX enzimek

működése során képződő H2O2 is szerepet játszhat toxikus, immunvédekezési funkciókban, teljes bizonyossággal azonban eddig csak a pajzsmirigy hormonszintézise során, és alacsonyabb rendű állatok extracelluláris mátrixának stabilizálásában betöltött szerepe bizonyított. Így célként tűztük ki a DUOX1 enzim H2O2-termelésének nyomon követését is.

64

A várhatóan alacsonyabb szintű H2O2-képződés kimutatása érdekében szondáinkat a DUOX1 enzim közvetlen környezetében szerettük volna kifejezni. Ennek megvalósítása céljából fúziós fehérjéket készítettünk. A DUOX1 enzim kifejeződését elősegítő, és vele funkcionális komplexet alkotó DUOXA1 fehérje citoszolikusan elhelyezkedő C-terminálisához illesztettük a szondáinkat, és létrehoztuk a DUOXA1OxyFRET és DUOXA1-PerFRET szenzorokat. Ezt követően ellenőriztük, hogy a DUOXA1 fúziós szenzorok működőképesek maradtak-e: a szondák sejten belüli elhelyezkedését konfokális mikroszkópiával követtük, majd megvizsgáltuk, hogy Ca2+szignál fokozza-e a sejtek H2O2-termelését, ha a DUOX1 fehérjét is koexpresszáljuk velük együtt. A 31. ábra A panelén látható, hogy mindkét fúziós szonda dúsul a plazmamembrán környékén, és kolokalizációt mutat a DUOX1 fehérjével, ami feltétele annak, hogy együttműködhessenek

85,86

. A fúziós szenzorok ezen túlmenően

funkcióképesek is maradtak: a DUOX1-et is koexpresszáló COS-7 sejtek extracelluláris terében H2O2-képződést mértünk, amennyiben receptor-agonista ATP-vel vagy Ca2+ionofór ionomycinnel Ca2+-jelet hoztunk létre bennük (31. ábra, B). A

B

DUOX1

14000

DUOX1 + DUOXA1

DUOX1+ DUOX1 DUOXA1-OxyFRET DUOXA1-PerFRET

DUOXA1-OxyFRET

HA-DUOX1

egyesített

H2O2 (Amplex Red RLU)

12000

10000

8000

6000

4000

2000

ionomycin

ATP

kontroll

ionomycin

ATP

kontroll

ionomycin

ATP

egyesített

kontroll

HA-DUOX1

ionomycin

DUOXA1-PerFRET

kontroll

0

31. ábra - DUOXA1-OxyFRET és DUOXA1-PerFRET szondák lokalizációjának és működésének vizsgálata (A) A DUOXA1-OxyFRET, illetve a DUOXA1-PerFRET fúziós szondákat COS-7 sejtekben koexpersszáltuk a HA-DUOX1 enzimmel, majd nem permeabilizált sejtekben immuncitokémiai eljárás segítségével láthatóvá tettük a sejtfelszíni HA-epitóp címkét, és konfokális mikroszkópiával vizsgáltuk a fehérjék elhelyezkedését. Az egyesített képek sárga árnyalata mutatja a kolokalizációt, mely a nyilakkal jelölt sejtszéli fodrokban a legnyilvánvalóbb. (B) COS-7 sejtekben expresszáltuk a DUOX1 enzimet önmagában, vagy a DUOXA1, DUOXA1-OxyFRET, illetve a DUOXA1-PerFRET fehérjékkel együtt. A sejteket 5 μM ionomycinnel vagy 10 μM ATP-vel stimuláltuk, és Amplex Ultra Red reagenssel mértük az extracelluláris tér irányába termelt H2O2 mennyiségét. (átlag ± SEM n=3)

65

Ezt követően egyedi sejtek mikroszkópos mérése során vizsgáltuk a DUOXA1 fúziós szondákkal, hogy intracellulárisan, a DUOX1 közvetlen környezetében detektálható-e H2O2 termelődése. A 32. ábrán látható, hogy szondáink FRET hányadosának megváltozása H2O2-képződést jelzett, mind az ionomycin, mind az ATP sejtekhez való hozzáadását követően (32. ábra, A,B,D,E panel, piros görbék). DUOX1 hiányában nincs H2O2-termelődés (32. ábra, A,B,D,E panel, fekete görbék), és a kontroll, mutáns szenzorokkal sincs FRET-szignál változás stimuláció hatására (32. ábra, A,B panel, kék görbék).

1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3

1.5 1.4 1.3

0

3

6

9

12

idő (min)

15

0

3

6

9

12

idő (min)

DUOXA1-OxyFRET

DUOXA1-PerFRET

DUOXA1-OxyFRET + DUOX1 DUOXA1-OxyFRET-M + DUOX1

DUOXA1-PerFRET + DUOX1 DUOXA1-PerFRET-M + DUOX1

D

E

2.0

15

F

ATP

H2O2

2.0

H2O2

1.9

1.9

ATP

FRET hányados

FRET hányados

1.6

1.8 1.7 1.6 1.5 1.4

1.8 1.7 1.6 1.5 1.4

0

3

6

9

idő (min)

12

15

0

3

6

9

idő (min)

12

DUOXA1-OxyFRET + DUOX1

DUOXA1-PerFRET + DUOX1

DUOXA1-OxyFRET-M + DUOX1

DUOXA1-PerFRET-M + DUOX1

15

*

80

60

40

20

0

PerFRET

1.7

ionomycin

ATP

100

80

60

*

*

PerFRET

ionomycin

H2O2

ionomycin

1.8

FRET hányados

FRET hányados

2.0

*

OxyFRET

2.1

100

OxyFRET

H2O2

C

relatív FRET hányados változás

B

relatív FRET hányados változás

A

40

20

0

32. ábra - A DUOX1 enzim H2O2-termelésének mérése az enzimhez fuzionáltatott szondákkal COS-7 sejtekben expresszáltuk a DUOXA1-OxyFRET vagy DUOXA1-OxyFRET-M, illetve DUOXA1-PerFRET vagy DUOXA1-PerFRET-M szondákat önmagukban vagy DUOX1-el együtt, és mértük az 5 μM ionomycin (A-C) vagy a 10 μM ATP (C-F) hatására keletkező H2O2 szintjének változását. A C és F paneleken a FRET hányados alapvonalhoz viszonyított relatív megváltozásának maximális értéke látható az 500 μM H2O2 által kiváltott szignálhoz képest. (átlag ± SEM; n=7-12 sejt, * p < 0,001)

66

A sikeres enzimközeli mérések után megvizsgáltuk, vajon a citoszólban detektálható-e a DUOX1 aktiválódásakor keletkező H2O2. A 33. ábrán látható, hogy citoszolikus szondáink is jelezték mind az ionomycin, mind az ATP hatására bekövetkező változást. A

B

OxyFRET

Roi1 Roi2

OxyFRET

2.2 2.1

FRET hányados

1.90

1.20

2.0 1.9

ionomycin

H2O2

1.8 1.7 1.6

0 min

3 min

12 min

15 min

ionomycin

0

H2O2

PerFRET

2.5

9

12

FRET hányados

15

Roi1 Roi2 Roi3 Roi4

H2O2

2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6

1.30

ionomycin

1.5

0 min

3 min

12 min

0

15 min

OxyFRET

6

9

12

idő (min)

3 min

5 min

12 min

15 min

Roi1 Roi2 Roi3 Roi4

ATP

1.7 1.6 1.5 1.4 0

ATP

15

H2O2

1.8

FRET hányados 0 min

3

OxyFRET

1.9

D

1.60

1.20

6

idő (min)

2.4

2.30

C

3

PerFRET

2.6

H2O2

3

6

9

12

idő (min)

PerFRET

2.4

H2O2

2.3

FRET hányados

PerFRET 2.30

15

Roi1 Roi2 Roi3 Roi4

2.2 2.1 2.0 1.9

ATP

1.8 1.7

E

3 min 100

5 min

OxyFRET

12 min

PerFRET

80 60 40 20 0

ionomycin DUOX1 + DUOXA1

+ -

+ +

0

F

*

*

1.6

15 min 100

relatív max. FRET hányados változás (%)

0 min

relatív max. FRET hányados változás (%)

1.30

+ -

+ +

3

OxyFRET

6

9

12

idő (min)

15

PerFRET

80 60

*

*

40 20 0

ATP DUOX1 + DUOXA1

+ -

+ +

+ -

+ +

33. ábra - A DUOX1 H2O2 termelésének mérése a citoszólban DUOX1-et és DUOXA1-et koexpresszáló COS-7 sejtekben mértük a H2O2 szintjének változását az OxyFRET és PerFRET szondákkal, 5 μM ionomycin (A-B, E) valamint 10 μM ATP (C-D, F), illetve 500 μM H2O2 hatására. Az A és C paneleken a FRET hányadost színkódolt formában mutató felvételek láthatók a sejtekről. A jelölt ROI-okban mérhető FRET hányados változását a B és D panelek mutatják. Az E és F paneleken a FRET hányados alapvonalhoz viszonyított relatív megváltozásának maximális értéke látható az 500 μM H2O2 által kiváltott szignálhoz képest. (átlag ± SEM; n=11-28 sejt, * p < 0,001)

67

A DUOX1 H2O2-termelésének térbeli viszonyait úgy vizsgáltuk, hogy az enzimet kifejező sejtek mitokondriumaiban mértük a H2O2 szintjének változását, illetve az enzimet nem expresszáló közeli sejtek citoplazmájában követtük a [H2O2]-t. A PerFRET szonda 10 μM ATP hatására a mitokondriumokban nem oxidálódik szignifikánsan, a plazmamembrán területén képződő H2O2 ilyen körülmények között nem jut el ebbe a sejtalkotóba (34. ábra, B panel). Ezzel szemben a DUOX1 által termelt H2O2 mind ATP mind ionomycin hatására megjelenik a szomszédos sejtek

B

iono.

80 60 40

*

20

*

ionomycin

H2O2

m ito .m at sz rix om sz éd cit sz o. om sz éd ci to .

0

Mito-PerFRET

C

ATP

100

relatív max. FRET hányados változás (%)

A

D

Roi1 Roi2 Roi3 Roi4 Roi5

PerFRET

2.4 2.3

2.1

* *

* *

*

* *

* *

*

* *

* *

*

* *

1.20

*

FRET hányados

* *

2.2 2.1 2.0 1.9 1.8 1.7

ionomycin

1.6

H2O2

1.5

0 min

3 min

12 min

15 min

0

3

6

9

12

15

idő (min)

34. ábra - A DUOX1 H2O2 termelésének mérése a mitokondriumokban és a szomszédos sejtekben (A) Konfokális mikroszkópiával ellenőriztük a Mito-PerFRET szonda elhelyezkedését COS-7 sejtekben (skála = 10 μM). (B) A PerFRET szonda FRET hányadosának maximális változását mértük ATP (10 μM) kezelés hatására, a DUOX1-et kifejező COS-7 sejtek mitokondriumaiban, illetve ATP és ionomycin (5 μM) hatására, a DUOX1-et kifejező sejtekkel szomszédos sejtek citoplazmájában (átlag±SEM; n=11-42 sejt, * p < 0,001). (C-D) COS-7 sejteket kotranszfektáltunk a PerFRET szondával és a sejtmagban kifejeződő mRFP-NLS markerral, vagy a DUOX1 és DUOXA1-et kódoló plazmidokkal együttesen. A transzfekciót követő napon a kétféleképpen transzfektált sejteket feltripszineztük és összekevertük, majd újabb 1 nap elteltével mértük őket. Az ábra (C) panelén látható kicsinyített képbetéteken a PerFRET szonda és az mRFP-NLS egyesített képe látható. Piros a sejtmagja azon sejteknek, melyek nem expresszálják a DUOX1 és DUOXA1 fehérjéket, az enzimet kifejező sejteket *-gal jelöltem. A sejteket 5 μM ionomycinnel stimuláltuk, és mértük a H2O2 szintjének változását. Az ábra (C) panelén a FRET hányadost színkódolt formában mutató felvételek láthatók a sejtekről. A jelölt ROIokban mérhető FRET hányados változását a (D) panel mutatja.

68

citoszóljában (34. ábra, B panel). A 34. ábrán ezen túlmenően látható, hogy a H2O2 távolságfüggő módon jut át a környező sejtekbe. A PerFRET szonda közel maximálisan oxidálódik 5 μM ionomycin hatására a DUOX1-et és DUOXA1-et koexpresszáló COS7 sejtekben (34. ábra, ’D’ panel, piros görbék), a közvetlen szomszédos sejtekben részlegesen (’D’ panel, zöld görbék), míg a távolabbi sejtekben minimálisan oxidálódik (34. ábra, ’D’ panel, kék görbe).

69

7. MEGBESZÉLÉS A hidrogén-peroxid változatos szerepet tölt be prokarióta és eukarióta élőlényekben

egyaránt.

Szabályozott

körülmények

között

képződhet

pl.

immunvédekezés, hormon-szintézis és az extracelluláris mátrix kialakulása során vagy jelátviteli kaszkádok működése kapcsán 52. Több sejten belüli forrása ismert: a NADPHoxidáz enzimcsalád tagjainak elsődleges funkciója szuperoxid, illetve H2O2 termelése 7, ezen túlmenően képződhet a mitokondriumok működése közben melléktermékként 19 és az oxidatív fehérjeérés kapcsán is 98. Doktori munkám során egy genetikailag kódolt mérőszondával, a HyPer-rel térképeztem fel a nagyobb sejtalkotók H2O2 szintjét HeLa sejtekben. Kísérleteinkkel megállapítottuk, hogy a vizsgált sejtalkotók közül az ER-ben a legmagasabb a [H2O2]. Munkámat megelőzően végzett vizsgálatok bizonyították, hogy sejtmentes körülmények között az oxidatív fehérjeérés H2O2 keletkezésével jár. Az élesztőből származó és emlős Ero1 fehérjéket a diszulfidhíd-képződéshez szükséges PDI-vel együtt in vitro rekonstruálták, és mindkét fajból származó Ero1 fehérje jelenlétében H2O2 termelődését mutatták ki

8,217

. Eredményeinkkel elsőként bizonyítottuk, hogy élő, emlős sejtekben,

működőképes antioxidáns rendszerek mellett is számottevő az ER H2O2-képzése. A HyPer szonda működésének alapja az érzékelő központját képviselő két cisztein oldallánc oxidációja. Joggal lehetne feltételezni, hogy az Ero1/PDI rendszer vagy más oxidatív fehérjeérésben szerepet játszó enzim H2O2-tól függetlenül is oxidálni tudja ezen tiol-csoportokat. Eredményeink nem zárják ki ennek lehetőségét, azonban több megfigyelés is alátámasztja a HyPer (illetve funkcionálisan aktív részének, az OxyR fehérjének) H2O2 iránti specificitását. E. coli baktériumokon és a belőlük tisztított fehérjén végzett kísérletek során összehasonlították az OxyR érzékenységét különböző oxidáló ágensek iránt 145. Baktériumokban azt tapasztalták, hogy a H2O2-dal, diamiddal, S-nitrozociszteinnel, nitrittel, hidrazinnal és hipoklóros-savval való kezelések közül csak a H2O2 és a diamid tudta hatékonyan oxidálni az OxyR fehérjét. In vitro a diamid-, S-nitrozocisztein-, és a GSSG-kezelés csak részlegesen aktiválta az OxyR-t, míg a H2O2 szigifikánsan alacsonyabb koncentrációban is hatékony volt. A HyPer-t előállító munkacsoport vizsgálatai szerint a szenzor gerjesztési hányadosát nem növelte a szuperoxid, a GSSG, a NO és a peroxinitrit sem

70

204

. Az OxyR és a szonda nagyfokú

specificitásának hátterében a bevezető fejezetben említett szerkezeti felépítés állhat, melynek lényege az érzékelő központot képző ciszteinek rejtett elhelyezkedése a molekula hidrofób zsebében, amihez így csak a H2O2 fér hozzá 148. Annak vizsgálatára, hogy az ER-ben a HyPer működéséért felelős cisztein oldalláncok ténylegesen oxidált állapotban vannak, elkészítettük a szonda mutáns változatát (HyPerC121S), mely érzéketlen H2O2-ra, és a citoszólban mért gerjesztési hányadosa a vad-típusú szondáéval megegyező. A HyPerC121S gerjesztési hányadosa az ER-ben a citoszolikuséhoz hasonló alacsony értéket mutatott, ami bizonyítja, hogy a HyPer-rel mért magas hányados ténylegesen a fehérje oxidáltsági állapotát tükrözi, és nem a fluoreszcens spektrum aspecifikus eltolódásának következménye. A mitokondriális mátrixban magasabb gerjesztési hányados értéket mértünk a citoszolikushoz képest, ami tükrözheti a légzési lánc működése kapcsán képződő H2O2ot. Ezen a ponton fontos kiemelni a HyPer nagyfokú pH-érzékenységét, mely jelentősen korlátozza használatát: lúgosabb közegben a gerjesztési hányados értéke [H2O2]-tól független módon nő. A mitokondriális mátrixról ismert, hogy benne a pH magasabb mint a citoszólban, így az általunk is vizsgált HeLa sejtekben mérve átlagosan 7,64 ± 0,14 , míg a citoszólban 7,19 ± 0,14

207

. A kísérleteink során mért HyPer gerjesztési

hányados értéket tehát egyaránt magyarázhatja a magasabb pH és a mitokondriálisan képződő H2O2 is. Az ER-ben mért eredményeinket is befolyásolhatná a sejtalkotó [H+]ja, irodalmi adatokból azonban ismert, hogy szemben a mitokondriumokkal az ER pHja megegyezik a citoszolikussal, és nem változik Ca2+-mobilizáció során sem

223

. Ezen

túlmenően a H2O2-ra érzéketlen mutáns szondával sem láttunk Ca2+-mobilizáció során szignálváltozást az ER-ben, ami bizonyítja eredményeink specificitását. A sejtalkotó-szintű [H2O2]-mérések során kapott eredmények közül fontos még kiemelni, hogy az ER citoszolikus felszínéhez irányított szondával nem mértünk magasabb értéket mint a citoszólban. Ez arra utal, hogy az ER-ben képződő H2O2 nem jut ki az organellumból. A bevezetőben megemlítettem, hogy a H2O2 szabad diffúziója biológiai membránokon át csekély, feltehetően aquaporin csatornák szükségesek a transzportjához. Elképzelhető tehát, hogy a citoszolikus oxidatív stressz megelőzése érdekében az ER membránjának H2O2-permeabilitása korlátozott. Az ER-ben mérhető magas [H2O2] forrásának azonosítása céljából a humán Ero1-Lα fehérje mennyiségét változtattuk HeLa sejtekben. Kifejeződésének fokozása

71

emelte, génjének csendesítése vagy a fehérje domináns negatív mutánsa csökkentette a sejtalkotó [H2O2]-ját. A kisfokú, de szignifikáns változások (mintegy 25%-os növekedés, illetve csökkenés), arra engednek következtetni, hogy az Ero1-Lα részt vesz a H2O2-termelésben, de működése nem kizárólagos oka annak, hogy a HyPer “oxidációs szintje” magasabb az ER-ben, mint a citoszólban. Ennek megfelelően felmerült alternatív H2O2-források jelenléte is az ER-ben

121,224

. A NOX4 enzimet például

kimutatták már ebben a sejtalkotóban is, viszont H2O2-termelő képességét az ER-ben még nem bizonyították

69,225,226

. Annak vizsgálata céljából, hogy az általunk vizsgált

HeLa sejtekben a NOX enzimek működése hatással van-e az ER H2O2 szintjére, siRNS kezeléssel csendesítettük a p22phox fehérje kifejeződését. Az ER-ben mérhető [H2O2] nem változott (az eredményeket külön nem mutattam), ami arra utal, hogy a NOX1, NOX2, NOX3 és NOX4 enzimek nem járulnak hozzá a H2O2 termeléséhez, hiszen működésük elengedhetetlen feltétele a p22phox megfelelő szintű expressziója. Annak oka, hogy az Ero1-Lα géncsendesítése csak mérsékelt [H2O2]-változást eredményezett, az lehet, hogy a beavatkozással nem sikerült teljes mértékben megszüntetnünk a fehérje kifejeződését. Elképzelhető az is, hogy az Ero1-Lα siRNS kezeléssel előidézett hiányát részlegesen kompenzálja más oxidázok megnövekedett expressziója, melyek szintén termelnek H2O2-ot. Felmerült az Ero1-Lß szerepe, mely az Ero1-Lα homológja, és ismert, hogy expressziója ER stressz során indukálódik

104

. Génjének kifejeződése

azonban Ero1-Lα siRNS hatására nem növekedett (az eredményeket külön nem mutattam), így ezt a lehetőséget kizártuk. H2O2-forrásként szolgálhatnak még a mitokondriumok is, melyek által (a légzési lánc működése kapcsán) termelt H2O2 szerepet kaphat az ER-ből a sejtfelszínre kerülő fehérjék diszulfidhídjainak kialakulásában227. Ennek pontos mechanizmusa nem ismert, azonban tekintettel az ER és mitokondriumok szoros kapcsolatára elképzelhető akár a H2O2 közvetlen transzportja is a két organellum között 228. Vizsgálataink közben azt az érdekes megfigyelést tettük, hogy az endoplazmás retikulum kalciumtartalmának hisztaminnal történő mobilizálása vagy thapsigarginnal való depléciója a [Ca2+]ER változásával azonos irányú és kinetikájú [H2O2]-változást eredményezett. A jelenségre magyarázatot egyelőre nem tudunk adni. Megvizsgáltuk, vajon lehet-e a hatásért felelős az Ero1-Lα aktivitásának változása. Ezt a lehetőséget azonban kizártuk azokkal a kísérletekkel, melyek során az ER-ben zajló fehérjeérést

72

követtük nyomon a J-lánc oxidáltsági szintjének mérésével. Amint az irodalmi adatok alapján várható volt, az Ero1-Lα fokozta a diszulfidhidak kialakulásának sebességét 210. Az ER kalciumtartalmának csökkentése azonban nem befolyásolta ezt a folyamatot. Az eredmények láttán elképzelhető az is, hogy az ER luminális [Ca2+]-jának csökkenése a H2O2 képződése helyett annak elbontását befolyásolja. Akármi is áll a jelenség hátterében, eredményeink új megvilágításba helyezhetnek korábbi megfigyeléseket az ER “oxidatív státuszával” és kalciumháztartásával kapcsolatban, melyek szerint a rianodinreceptorok és az IP3R1 gátlódik, a SERCA2b pedig aktiválódik alacsonyabb oxidáltsági szint esetén178,179. Ezen hatások és saját megfigyeléseink alapján egy olyan modell állítható fel, mely szerint a Ca2+ ürülése következtében kialakuló alacsonyabb H2O2 szint elősegíti az endoplazmás retikulum kalcium raktárának visszatöltődését, és gátolja a további, rianodin- és IP3 receptorokon keresztüli kalciumfelszabadulást. A HyPer szondával mért eredményeinket összefoglalva tehát elmondható, hogy megerősítettük azt a korábbi feltételezést, mely szerint az emlős sejtek endoplazmás retikulumában zajló diszulfidhíd-képződés H2O2-termeléssel jár. Ezen túlmenően megfigyeltük, hogy a sejtalkotó kalcium szintje a fehérjeérésre kifejtett hatás nélkül is befolyásolja a [H2O2]-t. Eredményeink valószínűsítik további ismeretlen hidrogénperoxid források jelenlétét is az ER-ben, melyek felderítése a jövő feladata lesz. A reaktív oxigén származékok szerepét számos jelátviteli folyamatban felvetették. A 3.4.2.3. fejezetben részleteztem, hogy NADPH-oxidázok által termelt reaktív oxigén származékok növelhetik a növényi és rovarsejtekben kialakuló Ca2+szignál amplitúdóját, ami tovább fokozhatja a Ca2+-függő NOX enzimek aktivitását. Ez a pozitív visszacsatolás növényi sejtekben hatással van a gyökérszőr növekedésre, rovarsejtekben pedig az ovariális simaizomsejtek megfelelő összehúzódási készségét biztosítja

175,176

. Vannak olyan adatok, melyek szerint a DUOX1 enzim emlős sejtek

esetében is szerepelhet hasonló pozitív visszacsatolási körökben. Kísérleti eredmények szerint B-sejt és T-sejt receptor aktivációt követően DUOX1-függő módon fokozódik az limfociták H2O2-termelése, és a DUOX1 kifejeződésének csendesítése csökkentette a sejtekben kialakuló Ca2+-szignál nagyságát 229,230. Urotél sejteken végzett kísérletek során munkacsoportunk kétséget kizáróan bizonyította a DUOX1 fehérje jelenlétét és a sejtek Ca2+-szignál hatására kialakuló

73

H2O2-termelését

83

. Lehetőségünk nyílt tehát a DUOX1 enzimet kifejező primer urotél

sejtekben vizsgálni a H2O2 hatását a sejtek Ca2+-szignáljára. A szupszpenzióban tartott sejtekhez ATP-t, thapsigargint, vagy TRPV4 agonista GSK1016790A-t adva ugyanolyan kinetikájú és nagyságú Ca2+-szignál alakult ki a vad típusú és DUOX1 génhiányos egerekből izolált sejtekben. Negatív eredményeinket – szemben a limfocitákra vonatkozó adatokkal – magyarázhatja a sejttípusonként eltérő szabályozás. Fontos azonban kiemelni, hogy vizsgálataink során valódi genetikai kontrollt, génhiányos egereket is felhasználtunk, míg a korábbi mérések siRNS technikán alapultak, mely gyakrabban vezet aspecifikus eredményekhez. Egyelőre azonban az sem zárható ki, hogy a húgyhólyagban, megtartott szöveti struktúra esetében, a képződő H2O2 szabályozza a Ca2+-jel mértékét, és az általunk használt kísérleti rendszerben veszik csak el a hatás. Terveink között szerepel, hogy az izolált sejtek szuszpenzióban történő mérése helyett vad típusú és génhiányos urotél sejteket sejtkultúrában konfluenssé növesszünk, és a fiziológiáshoz hasonló sejt-sejt kapcsolatokat megtartva mérjük a Ca2+-szignál kialakulását. Évtizedekre visszanyúló próbálkozások ellenére sem teljesen megoldott a ROS sejten belüli szintjének pontos mérése. A témával kapcsolatos legújabb közlemények is kiemelik az igényt új technikák kifejlesztésére, és hangsúlyozzák a jelenlegi módszerekkel

kapott

megközelítésekkel

231

eredmények

alátámasztásának

szükségességét

alternatív

. Ennek ismeretében célként tűztük ki új mérési eljárások

kifejlesztését. Fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer elvét kihasználó, genetikailag kódolt szondákat készítettünk, melyekben a H2O2 érzékelése a S. cerevisiae dedikált H2O2-szenzor fehérjéinek működésén alapul. Az OxyFRET nevű szondában a Yap1 transzkripciós faktor érzékelő doménje található (Yap1RD), mely H2O2 hatására konformációváltozáson esik át, és térben közelebb hozza egymáshoz az OxyFRET-ben található fluoreszcens fehérjéket, a Cerulean-t és Venus-t. Ennek köszönhetően dózisfüggő módon FRET-szignál növekedést mérhetünk a szenzorral. A PerFRET elnevezésű szondában a Yap1 egyik doménje, a cCRD mellett a vele H2O2-függő módon diszulfidhidat kialakító Orp1 fehérje található. Ez a szonda dózisfüggően a FRET-szignál csökkenésével reagál a H2O2-ra, melynek valószínűsíthető oka, hogy a

74

konformációváltozás hatására “kinyílik” a fehérje, ami eltávolítja egymástól a donor és az akceptor fluorofórokat. Az OxyFRET és PerFRET érzékenysége az általunk végezett összehasonlító kísérletek alapján meghaladja az eddig legjobbnak tartott H2O2-érzékelő szonda, a HyPer szenzitivitását. Szondáink már 5-10 μM körüli koncentrációtartományban is érzékelik a H2O2 szintjének változását, a HyPer esetében 20-30 μM-nál magasabb koncentrációjú H2O2-dal kell kezelni HeLa sejteket ahhoz, hogy mérhető szignált kapjunk. Az OxyFRET és PerFRET gradáltabb módon is méri a [H2O2] változását, félmaximális oxidációja 20 μM körüli H2O2-dal érhető el, míg a HyPer esetében ez az érték 76 μM-nál van, és mindegyik szenzor telítődik 100-200 μM H2O2 hatására. Új szondáink válaszsebessége is kitűnő, az OxyFRET a HyPer-hez hasonló, a PerFRET azt meghaladó sebességgel éri el adott koncentrációjú H2O2 hatására az új egyensúlyi FRET-hányados értékét. Gyors kinetikájú [H2O2]-változások követésére a jelenleg elérhető szenzorok közül a PerFRET lehet a legalkalmasabb. A PerFRET gyors válaszkészsége abból adódhat, hogy tartalmazza az Orp1 peroxidázt. Az Orp1-ről ugyanis szondáink elkészítését követően kimutatták, hogy más redox-szenzorokkal fuzionáltatva fokozódik a H2O2-ra adott válasz sebessége (pl roGFP2-Orp1 szonda) 232. Szenzoraink specificitásával kapcsolatban kiemelendő, hogy azokat az általunk vizsgált fiziológiásan is képződő reaktív oxigén származékok közül csak a H2O2 oxidálta szignifikáns mértékben. A szuperoxidforrásnak tekinthető menadion magas koncentrációban (1-10mM) már oxidálta ugyan a szondákat, ez azonban valószínűleg csak annak a következménye, hogy metabolizációja során ilyen koncentráció esetében már jelentős mennyiségű H2O2 is keletkezik, melynek eltávolításához nem elégséges a sejtek antioxidáns kapacitása. Nem-specifikus ROS-szondák, mint a roGFP1-2 már lényegesen alacsonyabb koncentrációjú menadion (10-100 μM) hatásra is jelentősen oxidálódnak203, ami az OxyFRET és a PerFRET esetében még hatástalan. A szondák elkészítésekor fontos szempontnak tekintettük, hogy mérési eredményeinket minél kevésbé befolyásolják a pH esetleges változásai. Bár a fluoreszcens fehérjék, melyek az intramolekuláris FRET technika során felhasználhatók, általában pH-érzékenyek, a Cerulean és Venus alkalmazásával sikerült egy olyan párosítást találnunk, melynek esetében ez a probléma kiküszöbölhető volt

211,212

. Az

elkészült szondáink pH-érzékenysége a fiziológiás tartományban csekély, így jól

75

alkalmazhatók akár olyan folyamatok követésére is, melyek során a pH kismértékben megváltozik. A NOX enzimek aktivációja során, a NADPH oxidációja közben például H+-ok szabadulnak fel. Ez olyan mértékű, hogy a DUOX1 enzim H2O2-termelését a HyPer szondával nem tudtuk biztonsággal kimutatni, mivel az intracelluláris pH savanyodása olyan mértékű volt, hogy elfedte a keletkező H2O2 által kiváltott szignált (az eredményeket nem mutattam). A FRET-alapú szondák azonban alkalmasak voltak a H2O2-termelés valós idejű követésére. Szondáink csekély pH-függésén túlmenő előnye, hogy a FRET-technika önmagában hordozza egy olyan belső kontroll lehetőségét, melynek segítségével elkülöníthetők a specifikus szignálok a műtermékektől. A FRET-szenzorok tényleges konformációváltozása esetén a donor és akceptor emissziója ellentétes irányban változik. Jelentős pH-változás vagy más aspecifikus hatás esetén szintén látható bizonyos estekben FRET-hányados változás, ilyenkor azonban a donor és akceptor emissziója jellemző módon azonos irányba, csak eltérő mértékben változik. Ilyen “belső” kontrollra az egy fluoreszcens fehérjét tartalmazó szondák esetében (pl. HyPer) nincs lehetőség. Munkánkat nem csak a technikai fejlesztés iránti vágy inspirálta, eredeti célunk fiziológiás [H2O2] változással járó folyamatok azonosítása és jellemzése volt. A NADPH-oxidáz enzimek aktiválódása során genetikailag kódolt szondákkal még nem követték nyomon a ROS sejten belüli képződését. Célként tűztük ki tehát a NOX2 és a DUOX1 enzimek működése közben képződő H2O2 mérését. A NOX2 által termelt igen jelentős mennyiségű szuperoxid, illetve H2O2 fontos szerepet tölt be a bekebelezett részecskék és kórokozók elpusztításában 233. A sejtekből az extracelluláris tér irányába termelt és a fagoszómába kerülő szuperoxid jelentős hányada H2O2-dá alakul, melyről vizsgálatainkat megelőzően kérdéses volt, hogy milyen mértékben jut vissza a sejtek citoplazmájába vagy más sejtalkotóiba. Szondáink lehetőséget adnak a H2O2 specifikus mérésére, így neutrofil granulocita jellegű sejtekké differenciáltatott PLB-985 sejtekben mértük a plazmamembrán citoszolikus felszínén és a mitokondriális mátrixban a sejtek aktivációját követően a [H2O2] változását. Eredményeink alapján elmondható, hogy a PLB-985 sejtekben PMA hatására keletkező H2O2 visszajut a plazmamembránon át a citoplazmába, és azon átdiffundálva a mitokondriális mátrixban is megjelenik. Fagocita sejtek jelentős antioxidáns

76

kapacitással rendelkeznek, ami az oxidatív robbanás során védelmet nyújt saját struktúráik károsodásával szemben

234

. PMA stimulussal a PKC aktiválásán keresztül

robosztus NOX2 aktivációt, és H2O2-termelést idézhetünk elő, amit az antioxidáns mechanizmusok már nem tudnak kompenzálni. Elképzelhető azonban, hogy fiziológiás stimulusok, mint az LPS, citokinek vagy intakt baktériumok, nem idéznek elő olyan mértékű H2O2-termelést, ami intracellulárisan is mérhető lenne. Ismert, hogy ezek a stimulusok enyhébb fagocita aktivációt idéznek elő, mint a PMA

235

, így további

vizsgálatok tárgyát képezhetné az általuk generált H2O2 szintjének mérése. A DUOX enzimek a fagocita oxidázhoz képest alacsonyabb mennyiségben termelnek ROS-t

83,233,236

. Feltételezik, hogy a légutakban az általuk képzett H2O2 részt

vesz az immunvédekezésben, más szövetekben azonban toxikus hatás kifejtése helyett a hormonszintézist teszik lehetővé, vagy az extracelluláris mátrix stabilizálásához járulnak hozzá

79,80

. A DUOX1 enzim pontos szerepe még ismeretlen az urotél

sejtekben és a bőr keratinocitáiban. Nem tisztázott, hogy a képződő H2O2 autokrin vagy parakrin hatásokat fejt-e ki, így célként tűztük ki, hogy szondáinkkal jellemezzük a DUOX1 H2O2 -termelését. Kísérleteink során elsőként sikerült mérnünk a DUOX1 közvetlen közélében a [H2O2] változását az enzimet rekombináns módon kifejező COS-7 sejtekben. Szondáinkat a DUOXA1 fehérje C-terminálisához fuzionáltattuk, és megállapítottuk, hogy a képződő H2O2 a plazmamembránon átjutva az enzim citoplazmatikus oldalán is mérhető. A [H2O2] hasonló kinetikával változik, mint a citoplazmatikus [Ca2+]. Ezen túlmenően sikerült kimutatnunk, hogy a képződő H2O2 nem bomlik el az enzim közvetlen környezetében, keletkezése a citoplazmatikus szondával is nyomon követhető. Végezetül sikerült azt is megállapítanunk, hogy a szondáink által lefedett mérési tartományban a DUOX1 által termelt H2O2 nem jelenik meg a sejtek mitokondriumaiban, miközben a szomszédos sejtek citoplazmájába eljut. Megfigyeléseinkkel elsőként tudtuk jellemezni a DUOX1 H2O2-termelésének sejtalkotó

szintű,

térbeli

és

időbeli

viszonyait.

Eredményeink

a

korábbi

megfigyelésekkel összecsengően arra engednek következtetni, hogy a DUOX1 H2O2termelése kisebb mértékű, mint a NOX2 enzimé. PMA-val stimulált PLB-985 sejtek mitokondriumaiban közel maximálisan oxidálódnak a mérőszondáink, míg a DUOX1-et kifejező sejtekben az enzim aktivációját követő jelentős H2O2-szignál csak a DUOX1

77

közvetlen környezetében vagy a citoplazmában mérhető. Ezen túlmenően eredményeink szerint a DUOX1 által termelt H2O2 parakrin hatást is kifejthet, hisz az enzimet nem tartalmazó sejtek citoplazmájába is átjut a szomszédos termelő sejtekből. Mindez egybecseng azzal a korábbi megfigyeléssel, mely szerint zebradánióban a DUOX által termelt H2O2 kemoattraktáns molekulaként viselkedhet 94.

78

8. KÖVETKEZTETÉSEK Kísérleteink során egy közelmúltban leírt fluoreszcens fehérje, a HyPer felhasználásával sikeresen feltérképeztük HeLa sejtek különböző sejtalkotóinak [H2O2]ját, és megállapítottuk, hogy a H2O2 szintje a vizsgált organellumok közül az ER-ben a legmagasabb. Eredményeink arra engednek következtetni, hogy az itt képződő H2O2 nem jut ki jelentős mennyiségben a sejtalkotóból, ugyanis az ER membránjának citoszolikus felszínén nem mértünk magasabb értéket, mint a citoplazmában. Kimutattuk továbbá, hogy az oxidatív fehérjeérés folyamatában fontos szerepet betöltő Ero1-Lα mennyisége befolyásolja az ER H2O2 szintjét, de az enzim nem kizárólagos forrása

e

reaktív

oxigén

származéknak

a

sejtalkotóban.

Ezzel

kísérletesen

alátámasztottuk azt a korábbi feltételezést, mely szerint az emlős sejtek endoplazmás retikulumában

zajló

diszulfidhíd-képződés

H2O2-termeléssel

jár. A

sejtalkotó

kalciumtartalmát hisztaminnal vagy thapsigarginnal mobilizálva azt a megfigyelést tettük, hogy az ER [Ca2+]-jának változásával azonos irányban változik a sejtorganellum H2O2 szintje. Eredményeink szerint azonban az ER-ben zajló oxidatív fehérjeérésre a sejtalkotó [Ca2+]-jának csökkentése nem volt hatással. Ez a megfigyelés, mely szerint a sejtalkotó kalcium szintje a fehérjeérésre gyakorolt hatás nélkül is befolyásolja a [H2O2]-ját, szintén más hidrogén-peroxid forrás jelenlétét valószínűsíti az ER-ben. A H2O2 esetleges szerepét a sejtek Ca2+-háztartásának szabályozásában primer urotél sejtek felhasználásával vizsgáltuk. Kimutattuk, hogy az endogén DUOX1 enzim H2O2termelése nincs hatással a sejtekben kialakuló Ca2+-szignál amplitúdójára és kinetikájára. Doktori munkám során metodikai fejlesztőmunkát is végeztem. A korábban rendelkezésre álló H2O2 mérési módszerekhez képest teljesen új elven működő, FRET technikán alapuló mérőszondákat készítettem. Az OxyFRET és PerFRET szondák kiválóan alkalmazhatók a [H2O2] változásának követésére 1-100 μM-os koncentrációtartományban. Megállapítottam, hogy a szondák nemcsak érzékenységükben, hanem specificitás tekintetében is felülmúlják azokat a szondákat, melyek munkánkat megelőzően rendelkezése álltak. Kiemelendő, hogy csekély pH-érzékenységük lehetővé teszi alkalmazásukat olyan fiziológiás folyamatok vizsgálatára is, melyek a [H+] megváltozásával járnak. Az OxyFRET és PerFRET szondák segítségével követni tudtuk

79

a NOX2 és DUOX1 enzimek aktiválódásakor keletkező és intracellulárisan megjelenő H2O2-ot. A két enzim által termelt H2O2 mennyisége jelentősen különbözik. A NOX2 enzim aktivációjának hatására képződő H2O2 detektálható volt a neutrofil granulocitaszerű sejtekké differenciáltatott PLB-985 sejtek plazmamembránja alatt, és a mitokondriális mátrixban is. A DUOX1 által termelt H2O2 azonban csak az enzim közvetlen környezetében és a citoszólban jelent meg, a mitokondriális mátrixba nem jutott el. Végezetül megállapítottuk, hogy a DUOX1 enzimek aktiválódása a szomszédos sejtek citoszóljában is megemeli a [H2O2]-t, ami felveti annak a lehetőségét, hogy a molekula fiziológiás körülmények között parakrin hatást fejt ki.

80

9. ÖSSZEFOGLALÁS A hidrogén-peroxid (H2O2) sejtjeinkben változatos szerepet betöltő reaktív oxigén származék. Olyan alapvető biológiai folyamatokban vesz részt, mint az immunvédekezés, a hormonszintézis, az értónus szabályozása, a programozott sejthalál vagy a megtermékenyítés. Képződhet a mitokondriális légzési lánc működése kapcsán, a NADPH-oxidáz enzimek termékeként, vagy az endoplazmás retikulumban zajló fehérjeérési folyamatok során. Sejten belüli szerepének azonban számos részlete tisztázatlan, nem ismertek sem keletkezésének pontos tér- és időbeli viszonyai, sem intracelluláris megoszlása a különböző sejtalkotók között. Célként tűztük ki a H2O2 szintjének feltérképezését a nagyobb sejtalkotókban egy korábban létrehozott mérőszondával, a HyPer-rel. Eredményeink szerint a vizsgált sejtorganellumok közül az ER lumenében a legmagasabb a [H2O2], és termelésében fontos szerepet tölt be az Ero1-Lα enzim. Mennyiségét befolyásolja a sejtalkotó kalcium koncentrációja is, melynek változásával azonos irányban módosult a H2O2 szint. A H2O2 esetleges szerepét a sejtek Ca2+-háztartásának szabályozásában primer urotél sejtek felhasználásával vizsgáltuk. A DUOX1-függő módon H2O2-ot termelő sejtekben nem volt hatása a képződő H2O2-nak a sejtekben kialakuló Ca2+-szignálra. Új mérési módszerek létrehozásával jelentős előrelépést tettünk a reaktív oxigén származékok mérésének területén. A fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (FRET) elvén működő OxyFRET és PerFRET szondákkal érzékeny és specifikus módon követhetjük nyomon a H2O2 keletkezésének szubcelluláris lefolyását. A szondák alkalmasnak bizonyultak a NOX2 és DUOX1 enzimek H2O2-termelésének mérésére, így kísérleteinkkel elsőként sikerült genetikailag kódolt mérőszondával jellemeznünk a H2O2-termelést NADPH-oxidáz enzimek aktiválódását követően. Eredményeink alátámasztják azokat korábbi megfigyeléseket, melyek szerint a NOX2 jelentősebb mennyiségű H2O2-ot termel mint a DUOX1 enzim. Jellemeztük ezen túlmenően a H2O2 sejten belüli és sejtek közötti diffúziós képességét, és megállapítottuk, hogy a DUOX1 által termelt H2O2 eljut a környező sejtek citoplazmájába, viszont nem jelenik meg jelentős mennyiségben a mitokondiális mátrixban még azokban a sejtekben sem, melyekben keletkezik. Eredményeink alátámasztják a H2O2 korábban már felvetett esetleges parakrin mediátor szerepét.

81

10. SUMMARY Hydrogen peroxide (H2O2) is a reactive oxygen species of various functions in our cells. It plays important roles in fundamental biological processes such as host defense, hormone biosynthesis, regulation of vascular tone, apoptosis or fertilization. It is produced for example during mitochondrial respiration, the activation of NADPH oxidase enzymes or oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. Numerous aspects of its intracellular role are still of debate, such as details of its spatial and temporal production or its concentration within different cellular compartments. Our goal was to map the intracellular level of H2O2 at different subcellular sites with a recently described protein-based sensor, HyPer. We measured the highest [H2O2] within the ER, and the enzyme Ero1L-α was demonstrated to play an important role in its production. Its amount also depends on the concentration of calcium within the ER, alterations of the [Ca2+]ER leads to parallel changes in the level of [H2O2]ER. The potential role of H2O2 in regulating cellular calcium homeostasis was investigated by characterizing the calcium signal in urothelial cells prepared from wild-type and DUOX1 knockout mice. The DUOX1-formed H2O2, however, did not influence the level of calcium in these cells. We developed novel measuring techniques for H2O2, and thereby broadened the array of methods for the detection of ROS. With our fluorescence resonance energy transfer (FRET) based OxyFRET and PerFRET probes we can follow the subcellular production of H2O2 with high sensitivity and specificity. The probes have proven to be capable of reporting the H2O2 production of NOX2 and DUOX1 enzymes. Our experiments characterize for the first time the H2O2 production of NADPH oxidase enzymes with genetically encoded probes. Our results are confirm previous observations claming that NOX2 produces higher amounts of H2O2 than the DUOX1 enzyme. Furthermore, we have characterized the extent of H2O2 diffusion within and between the cells, and we observed that DUOX1-derived H2O2 reaches the cytoplasm of both the producing and the surrounding cells, on the other hand, it doesn’t significantly increase the [H2O2] measured in the mitochondrial matrix of the producing cells. Our results confirm with direct experiments for the first time the previously proposed role of H2O2 as being a potential paracrine mediator molecule.

82

11. IRODALOMJEGYZÉK (1) D'Autreaux B, Toledano MB. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8:813824. (2) Mandl József. Az "oxigéntoxicitás". In: Ádám V., Dux L., Faragó A., Fésüs L., Machovich R., Mandl J. et al., eds. Orvosi Biokémia. Budapest: Medicina Könyvkiadó; 2001:309-314. (3) Bienert GP, Schjoerring JK, Jahn TP. Membrane transport of hydrogen peroxide. Biochim Biophys Acta. 2006;1758:994-1003. (4) Bienert GP, Moller AL, Kristiansen KA, Schulz A, Moller IM, Schjoerring JK, Jahn TP. Specific aquaporins facilitate the diffusion of hydrogen peroxide across membranes. J Biol Chem. 2007;282:1183-1192. (5) Miller EW, Dickinson BC, Chang CJ. Aquaporin-3 mediates hydrogen peroxide uptake to regulate downstream intracellular signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107:15681-15686. (6) Pryor WA. Oxy-radicals and related species: their formation, lifetimes, and reactions. Annu Rev Physiol. 1986;48:657-667. (7) Bedard K, Krause KH. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 2007;87:245-313. (8) Gross E, Sevier CS, Heldman N, Vitu E, Bentzur M, Kaiser CA, Thorpe C, Fass D. Generating disulfides enzymatically: reaction products and electron acceptors of the endoplasmic reticulum thiol oxidase Ero1p. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:299-304. (9) Zangar RC, Davydov DR, Verma S. Mechanisms that regulate production of reactive oxygen species by cytochrome P450. Toxicol Appl Pharmacol. 2004;199:316-331.

83

(10) Mills EM, Takeda K, Yu ZX, Ferrans V, Katagiri Y, Jiang H, Lavigne MC, Leto TL, Guroff G. Nerve growth factor treatment prevents the increase in superoxide produced by epidermal growth factor in PC12 cells. J Biol Chem. 1998;273:22165-22168. (11) Woo CH, Lee ZW, Kim BC, Ha KS, Kim JH. Involvement of cytosolic phospholipase A2, and the subsequent release of arachidonic acid, in signalling by rac for the generation of intracellular reactive oxygen species in rat-2 fibroblasts. Biochem J. 2000;348 Pt 3:525-530. (12) Schrader M, Fahimi HD. Peroxisomes and oxidative stress. Biochim Biophys Acta. 2006;1763:1755-1766. (13) Duchen MR. Mitochondria in health and disease: perspectives on a new mitochondrial biology. Mol Aspects Med. 2004;25:365-451. (14) Mandl József. Bioenergetika. Energiatermelés és -raktározás az anyagcsere során. In: Ádám V., Dux L., Faragó A., Fésüs L., Machovich R., Mandl J. et al., eds. Orvosi Biokémia. Budapest: Medicina Könyvkiadó; 2001:55-92. (15) Jensen PK. Antimycin-insensitive oxidation of succinate and reduced nicotinamide-adenine dinucleotide in electron-transport particles. I. pH dependency and hydrogen peroxide formation. Biochim Biophys Acta. 1966;122:157-166. (16) Boveris A, Chance B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochem J. 1973;134:707716. (17) Chance B, Sies H, Boveris A. Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. Physiol Rev. 1979;59:527-605. (18) Loschen G, Flohe L, Chance B. Respiratory chain linked H(2)O(2) production in pigeon heart mitochondria. FEBS Lett. 1971;18:261-264.

84

(19) Murphy MP. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 2009;417:1-13. (20) Weisiger RA, Fridovich I. Superoxide dismutase. Organelle specificity. J Biol Chem. 1973;248:3582-3592. (21) Stowe DF, Camara AK. Mitochondrial reactive oxygen species production in excitable cells: modulators of mitochondrial and cell function. Antioxid Redox Signal. 2009;11:1373-1414. (22) Becker LB, Vanden Hoek TL, Shao ZH, Li CQ, Schumacker PT. Generation of superoxide in cardiomyocytes during ischemia before reperfusion. Am J Physiol. 1999;277:H2240-H2246. (23) Kevin LG, Camara AK, Riess ML, Novalija E, Stowe DF. Ischemic preconditioning alters real-time measure of O2 radicals in intact hearts with ischemia and reperfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003;284:H566H574. (24) Ambrosio G, Zweier JL, Duilio C, Kuppusamy P, Santoro G, Elia PP, Tritto I, Cirillo P, Condorelli M, Chiariello M, . Evidence that mitochondrial respiration is a source of potentially toxic oxygen free radicals in intact rabbit hearts subjected to ischemia and reflow. J Biol Chem. 1993;268:18532-18541. (25) Venditti P, Masullo P, Di Meo S. Effects of myocardial ischemia and reperfusion on mitochondrial function and susceptibility to oxidative stress. Cell Mol Life Sci. 2001;58:1528-1537. (26) Turrens JF, Boveris A. Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochem J. 1980;191:421-427. (27) Chen Q, Vazquez EJ, Moghaddas S, Hoppel CL, Lesnefsky EJ. Production of reactive oxygen species by mitochondria: central role of complex III. J Biol Chem. 2003;278:36027-36031.

85

(28) Tretter L, Adam-Vizi V. Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress. J Neurosci. 2000;20:8972-8979. (29) Nishino H, Ito A. Subcellular distribution of OM cytochrome b-mediated NADH-semidehydroascorbate reductase activity in rat liver. J Biochem. 1986;100:1523-1531. (30) Hauptmann N, Grimsby J, Shih JC, Cadenas E. The metabolism of tyramine by monoamine oxidase A/B causes oxidative damage to mitochondrial DNA. Arch Biochem Biophys. 1996;335:295-304. (31) Drahota Z, Chowdhury SK, Floryk D, Mracek T, Wilhelm J, Rauchova H, Lenaz G, Houstek J. Glycerophosphate-dependent hydrogen peroxide production by brown adipose tissue mitochondria and its activation by ferricyanide. J Bioenerg Biomembr. 2002;34:105-113. (32) Zhang L, Yu L, Yu CA. Generation of superoxide anion by succinatecytochrome c reductase from bovine heart mitochondria. J Biol Chem. 1998;273:33972-33976. (33) Segal AW, Jones OT. Novel cytochrome b system in phagocytic vacuoles of human granulocytes. Nature. 1978;276:515-517. (34) Segal AW, Jones OT, Webster D, Allison AC. Absence of a newly described cytochrome b from neutrophils of patients with chronic granulomatous disease. Lancet. 1978;2:446-449. (35) Cross AR, Segal AW. The NADPH oxidase of professional phagocytes-prototype of the NOX electron transport chain systems. Biochim Biophys Acta. 2004;1657:1-22. (36) Baldridge CW, Gerard RW. The extra respiration of phagocytosis. American Journal of Physiology -- Legacy Content. 1932;103:235-236.

86

(37) Berendes H, Bridges RA, Good RA. A fatal granulomatosus of childhood: the clinical study of a new syndrome. Minn Med. 1957;40:309-312. (38) Baehner RL, Nathan DG. Leukocyte oxidase: defective activity in chronic granulomatous disease. Science. 1967;155:835-836. (39) Holmes B, Page AR, Good RA. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. J Clin Invest. 1967;46:1422-1432. (40) Quie PG, White JG, Holmes B, Good RA. In vitro bactericidal capacity of human

polymorphonuclear

leukocytes:

diminished

activity

in

chronic

granulomatous disease of childhood. J Clin Invest. 1967;46:668-679. (41) Hattori H. Studies on the labile, stable Nadi oxidase and peroxidase staining reactions in the isolated particles of horse granulocyte. Nagoya J Med Sci. 1961;23:362-378. (42) Rada B, Leto TL. Oxidative innate immune defenses by Nox/Duox family NADPH oxidases. Contrib Microbiol. 2008;15:164-187. (43) Cheng G, Cao Z, Xu X, van Meir EG, Lambeth JD. Homologs of gp91phox: cloning and tissue expression of Nox3, Nox4, and Nox5. Gene. 2001;269:131140. (44) Parkos CA, Dinauer MC, Walker LE, Allen RA, Jesaitis AJ, Orkin SH. Primary structure and unique expression of the 22-kilodalton light chain of human neutrophil cytochrome b. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85:3319-3323. (45) Lapouge K, Smith SJ, Groemping Y, Rittinger K. Architecture of the p40-p47p67phox complex in the resting state of the NADPH oxidase. A central role for p67phox. J Biol Chem. 2002;277:10121-10128. (46) Leto TL, Morand S, Hurt D, Ueyama T. Targeting and regulation of reactive oxygen species generation by Nox family NADPH oxidases. Antioxid Redox Signal. 2009;11:2607-2619.

87

(47) Banfi B, Maturana A, Jaconi S, Arnaudeau S, Laforge T, Sinha B, Ligeti E, Demaurex N, Krause KH. A mammalian H+ channel generated through alternative splicing of the NADPH oxidase homolog NOH-1. Science. 2000;287:138-142. (48) Suh YA, Arnold RS, Lassegue B, Shi J, Xu X, Sorescu D, Chung AB, Griendling KK, Lambeth JD. Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Mox1. Nature. 1999;401:79-82. (49) Geiszt M, Lekstrom K, Witta J, Leto TL. Proteins homologous to p47phox and p67phox support superoxide production by NAD(P)H oxidase 1 in colon epithelial cells. J Biol Chem. 2003;278:20006-20012. (50) Banfi B, Clark RA, Steger K, Krause KH. Two novel proteins activate superoxide generation by the NADPH oxidase NOX1. J Biol Chem. 2003;278:3510-3513. (51) Takeya R, Ueno N, Kami K, Taura M, Kohjima M, Izaki T, Nunoi H, Sumimoto H. Novel human homologues of p47phox and p67phox participate in activation of superoxide-producing NADPH oxidases. J Biol Chem. 2003;278:2523425246. (52) Geiszt M, Leto TL. The Nox family of NAD(P)H oxidases: host defense and beyond. J Biol Chem. 2004;279:51715-51718. (53) Geiszt M, Lekstrom K, Leto TL. Analysis of mRNA transcripts from the NAD(P)H oxidase 1 (Nox1) gene. Evidence against production of the NADPH oxidase homolog-1 short (NOH-1S) transcript variant. J Biol Chem. 2004;279:51661-51668. (54) Kawahara T, Kuwano Y, Teshima-Kondo S, Takeya R, Sumimoto H, Kishi K, Tsunawaki S, Hirayama T, Rokutan K. Role of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1 in oxidative burst response to Toll-like receptor 5 signaling in large intestinal epithelial cells. J Immunol. 2004;172:3051-3058.

88

(55) Matsuno K, Yamada H, Iwata K, Jin D, Katsuyama M, Matsuki M, Takai S, Yamanishi K, Miyazaki M, Matsubara H, Yabe-Nishimura C. Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice. Circulation. 2005;112:2677-2685. (56) Gavazzi G, Banfi B, Deffert C, Fiette L, Schappi M, Herrmann F, Krause KH. Decreased blood pressure in NOX1-deficient mice. FEBS Lett. 2006;580:497504. (57) Dikalova A, Clempus R, Lassegue B, Cheng G, McCoy J, Dikalov S, San Martin A, Lyle A, Weber DS, Weiss D, Taylor WR, Schmidt HH, Owens GK, Lambeth JD, Griendling KK. Nox1 overexpression potentiates angiotensin IIinduced hypertension and vascular smooth muscle hypertrophy in transgenic mice. Circulation. 2005;112:2668-2676. (58) Kikuchi H, Hikage M, Miyashita H, Fukumoto M. NADPH oxidase subunit, gp91(phox) homologue, preferentially expressed in human colon epithelial cells. Gene. 2000;254:237-243. (59) Paffenholz R, Bergstrom RA, Pasutto F, Wabnitz P, Munroe RJ, Jagla W, Heinzmann U, Marquardt A, Bareiss A, Laufs J, Russ A, Stumm G, Schimenti JC, Bergstrom DE. Vestibular defects in head-tilt mice result from mutations in Nox3, encoding an NADPH oxidase. Genes Dev. 2004;18:486-491. (60) Banfi B, Malgrange B, Knisz J, Steger K, Dubois-Dauphin M, Krause KH. NOX3, a superoxide-generating NADPH oxidase of the inner ear. J Biol Chem. 2004;279:46065-46072. (61) Nakano Y, Longo-Guess CM, Bergstrom DE, Nauseef WM, Jones SM, Banfi B. Mutation of the Cyba gene encoding p22phox causes vestibular and immune defects in mice. J Clin Invest. 2008;118:1176-1185. (62) Kiss PJ, Knisz J, Zhang Y, Baltrusaitis J, Sigmund CD, Thalmann R, Smith RJ, Verpy E, Banfi B. Inactivation of NADPH oxidase organizer 1 results in severe imbalance. Curr Biol. 2006;16:208-213.

89

(63) Ueyama T, Geiszt M, Leto TL. Involvement of Rac1 in activation of multicomponent Nox1- and Nox3-based NADPH oxidases. Mol Cell Biol. 2006;26:2160-2174. (64) Geiszt M, Kopp JB, Varnai P, Leto TL. Identification of renox, an NAD(P)H oxidase in kidney. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:8010-8014. (65) Shiose A, Kuroda J, Tsuruya K, Hirai M, Hirakata H, Naito S, Hattori M, Sakaki Y, Sumimoto H. A novel superoxide-producing NAD(P)H oxidase in kidney. J Biol Chem. 2001;276:1417-1423. (66) Ambasta RK, Kumar P, Griendling KK, Schmidt HH, Busse R, Brandes RP. Direct interaction of the novel Nox proteins with p22phox is required for the formation of a functionally active NADPH oxidase. J Biol Chem. 2004;279:45935-45941. (67) Moe KT, Aulia S, Jiang F, Chua YL, Koh TH, Wong MC, Dusting GJ. Differential upregulation of Nox homologues of NADPH oxidase by tumor necrosis factor-alpha in human aortic smooth muscle and embryonic kidney cells. J Cell Mol Med. 2006;10:231-239. (68) Sturrock A, Cahill B, Norman K, Huecksteadt TP, Hill K, Sanders K, Karwande SV, Stringham JC, Bull DA, Gleich M, Kennedy TP, Hoidal JR. Transforming growth factor-beta1 induces Nox4 NAD(P)H oxidase and reactive oxygen species-dependent proliferation in human pulmonary artery smooth muscle cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2006;290:L661-L673. (69) Pedruzzi E, Guichard C, Ollivier V, Driss F, Fay M, Prunet C, Marie JC, Pouzet C, Samadi M, Elbim C, O'dowd Y, Bens M, Vandewalle A, Gougerot-Pocidalo MA, Lizard G, Ogier-Denis E. NAD(P)H oxidase Nox-4 mediates 7ketocholesterol-induced endoplasmic reticulum stress and apoptosis in human aortic smooth muscle cells. Mol Cell Biol. 2004;24:10703-10717. (70) Higashi M, Shimokawa H, Hattori T, Hiroki J, Mukai Y, Morikawa K, Ichiki T, Takahashi S, Takeshita A. Long-term inhibition of Rho-kinase suppresses

90

angiotensin II-induced cardiovascular hypertrophy in rats in vivo: effect on endothelial NAD(P)H oxidase system. Circ Res. 2003;93:767-775. (71) Suliman HB, Ali M, Piantadosi CA. Superoxide dismutase-3 promotes full expression of the EPO response to hypoxia. Blood. 2004;104:43-50. (72) Vallet P, Charnay Y, Steger K, Ogier-Denis E, Kovari E, Herrmann F, Michel JP, Szanto I. Neuronal expression of the NADPH oxidase NOX4, and its regulation in mouse experimental brain ischemia. Neuroscience. 2005;132:233238. (73) Geiszt M. NADPH oxidases: new kids on the block. Cardiovasc Res. 2006;71:289-299. (74) Hecker L, Vittal R, Jones T, Jagirdar R, Luckhardt TR, Horowitz JC, Pennathur S, Martinez FJ, Thannickal VJ. NADPH oxidase-4 mediates myofibroblast activation and fibrogenic responses to lung injury. Nat Med. 2009;15:10771081. (75) Banfi B, Molnar G, Maturana A, Steger K, Hegedus B, Demaurex N, Krause KH. A Ca(2+)-activated NADPH oxidase in testis, spleen, and lymph nodes. J Biol Chem. 2001;276:37594-37601. (76) Banfi B, Tirone F, Durussel I, Knisz J, Moskwa P, Molnar GZ, Krause KH, Cox JA. Mechanism of Ca2+ activation of the NADPH oxidase 5 (NOX5). J Biol Chem. 2004;279:18583-18591. (77) Bjorkman U, Ekholm R. Generation of H2O2 in isolated porcine thyroid follicles. Endocrinology. 1984;115:392-398. (78) Dupuy C, Ohayon R, Valent A, Noel-Hudson MS, Deme D, Virion A. Purification of a novel flavoprotein involved in the thyroid NADPH oxidase. Cloning of the porcine and human cdnas. J Biol Chem. 1999;274:37265-37269.

91

(79) De D, X, Wang D, Many MC, Costagliola S, Libert F, Vassart G, Dumont JE, Miot F. Cloning of two human thyroid cDNAs encoding new members of the NADPH oxidase family. J Biol Chem. 2000;275:23227-23233. (80) Edens WA, Sharling L, Cheng G, Shapira R, Kinkade JM, Lee T, Edens HA, Tang X, Sullards C, Flaherty DB, Benian GM, Lambeth JD. Tyrosine crosslinking of extracellular matrix is catalyzed by Duox, a multidomain oxidase/peroxidase with homology to the phagocyte oxidase subunit gp91phox. J Cell Biol. 2001;154:879-891. (81) Geiszt M, Witta J, Baffi J, Lekstrom K, Leto TL. Dual oxidases represent novel hydrogen peroxide sources supporting mucosal surface host defense. FASEB J. 2003;17:1502-1504. (82) El Hassani RA, Benfares N, Caillou B, Talbot M, Sabourin JC, Belotte V, Morand S, Gnidehou S, Agnandji D, Ohayon R, Kaniewski J, Noel-Hudson MS, Bidart JM, Schlumberger M, Virion A, Dupuy C. Dual oxidase2 is expressed all along the digestive tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2005;288:G933-G942. (83) Donko A, Ruisanchez E, Orient A, Enyedi B, Kapui R, Peterfi Z, De D, X, Benyo Z, Geiszt M. Urothelial cells produce hydrogen peroxide through the activation of Duox1. Free Radic Biol Med. 2010;49:2040-2048. (84) Hirakawa S, Saito R, Ohara H, Okuyama R, Aiba S. Dual Oxidase 1 Induced by Th2 Cytokines Promotes STAT6 Phosphorylation via Oxidative Inactivation of Protein Tyrosine Phosphatase 1B in Human Epidermal Keratinocytes. J Immunol. 2011;186:4762-4770. (85) Grasberger H, Refetoff S. Identification of the maturation factor for dual oxidase. Evolution of an eukaryotic operon equivalent. J Biol Chem. 2006;281:18269-18272.

92

(86) Morand S, Ueyama T, Tsujibe S, Saito N, Korzeniowska A, Leto TL. Duox maturation factors form cell surface complexes with Duox affecting the specificity of reactive oxygen species generation. FASEB J. 2009;23:1205-1218. (87) Ohye H, Sugawara M. Dual oxidase, hydrogen peroxide and thyroid diseases. Exp Biol Med (Maywood ). 2010;235:424-433. (88) Moreno JC, Bikker H, Kempers MJ, van Trotsenburg AS, Baas F, de Vijlder JJ, Vulsma T, Ris-Stalpers C. Inactivating mutations in the gene for thyroid oxidase 2 (THOX2) and congenital hypothyroidism. N Engl J Med. 2002;347:95-102. (89) Ris-Stalpers C, Bikker H. Genetics and phenomics of hypothyroidism and goiter due to TPO mutations. Mol Cell Endocrinol. 2010;322:38-43. (90) Wong JL, Creton R, Wessel GM. The oxidative burst at fertilization is dependent upon activation of the dual oxidase Udx1. Dev Cell. 2004;7:801-814. (91) Deits TL, Shapiro BM. Conformational control of ovoperoxidase catalysis in the sea urchin fertilization membrane. J Biol Chem. 1986;261:12159-12165. (92) Ha EM, Lee KA, Park SH, Kim SH, Nam HJ, Lee HY, Kang D, Lee WJ. Regulation of DUOX by the Galphaq-phospholipase Cbeta-Ca2+ pathway in Drosophila gut immunity. Dev Cell. 2009;16:386-397. (93) Ha EM, Oh CT, Bae YS, Lee WJ. A direct role for dual oxidase in Drosophila gut immunity. Science. 2005;310:847-850. (94) Niethammer P, Grabher C, Look AT, Mitchison TJ. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 2009;459:996-999. (95) Forteza R, Salathe M, Miot F, Forteza R, Conner GE. Regulated hydrogen peroxide production by Duox in human airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2005;32:462-469.

93

(96) Inaba K. Structural basis of protein disulfide bond generation in the cell. Genes Cells. 2010;15:935-943. (97) Sevier CS, Kaiser CA. Formation and transfer of disulphide bonds in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002;3:836-847. (98) Tu BP, Weissman JS. Oxidative protein folding in eukaryotes: mechanisms and consequences. J Cell Biol. 2004;164:341-346. (99) Anfinsen CB, Harrington WF, Hvidt A, Linderstrom-Lang K, Ottesen M, Schellman J. Studies on the structural basis of ribonuclease activity. 1955. Biochim Biophys Acta. 1989;1000:200-201. (100) Venetianer P, Straub FB. The enzymic reactivation of reduced ribonuclease. Biochim Biophys Acta. 1963;67:166-168. (101) Venetianer P, Straub FB. The mechanism of action of the ribonucleasereactivating enzyme. Biochim Biophys Acta. 1964;89:189-190. (102) Freedman RB, Hirst TR, Tuite MF. Protein disulphide isomerase: building bridges in protein folding. Trends Biochem Sci. 1994;19:331-336. (103) Frand AR, Kaiser CA. The ERO1 gene of yeast is required for oxidation of protein dithiols in the endoplasmic reticulum. Mol Cell. 1998;1:161-170. (104) Pagani M, Fabbri M, Benedetti C, Fassio A, Pilati S, Bulleid NJ, Cabibbo A, Sitia R. Endoplasmic reticulum oxidoreductin 1-lbeta (ERO1-Lbeta), a human gene induced in the course of the unfolded protein response. J Biol Chem. 2000;275:23685-23692. (105) Tu BP, Ho-Schleyer SC, Travers KJ, Weissman JS. Biochemical basis of oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 2000;290:15711574.

94

(106) Pollard MG, Travers KJ, Weissman JS. Ero1p: a novel and ubiquitous protein with an essential role in oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. Mol Cell. 1998;1:171-182. (107) Frand AR, Kaiser CA. Ero1p oxidizes protein disulfide isomerase in a pathway for disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum. Mol Cell. 1999;4:469-477. (108) Cabibbo A, Pagani M, Fabbri M, Rocchi M, Farmery MR, Bulleid NJ, Sitia R. ERO1-L, a human protein that favors disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 2000;275:4827-4833. (109) Dias-Gunasekara S, Gubbens J, van Lith M, Dunne C, Williams JA, Kataky R, Scoones D, Lapthorn A, Bulleid NJ, Benham AM. Tissue-specific expression and dimerization of the endoplasmic reticulum oxidoreductase Ero1beta. J Biol Chem. 2005;280:33066-33075. (110) Tu BP, Weissman JS. The FAD- and O(2)-dependent reaction cycle of Ero1mediated oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. Mol Cell. 2002;10:983-994. (111) Sevier CS, Cuozzo JW, Vala A, Aslund F, Kaiser CA. A flavoprotein oxidase defines a new endoplasmic reticulum pathway for biosynthetic disulphide bond formation. Nat Cell Biol. 2001;3:874-882. (112) Sevier CS, Qu H, Heldman N, Gross E, Fass D, Kaiser CA. Modulation of cellular disulfide-bond formation and the ER redox environment by feedback regulation of Ero1. Cell. 2007;129:333-344. (113) Appenzeller-Herzog C, Riemer J, Christensen B, Sorensen ES, Ellgaard L. A novel disulphide switch mechanism in Ero1alpha balances ER oxidation in human cells. EMBO J. 2008;27:2977-2987. (114) Baker KM, Chakravarthi S, Langton KP, Sheppard AM, Lu H, Bulleid NJ. Low reduction potential of Ero1alpha regulatory disulphides ensures tight control of substrate oxidation. EMBO J. 2008;27:2988-2997.

95

(115) Margittai E, Banhegyi G. Oxidative folding in the endoplasmic reticulum: towards a multiple oxidant hypothesis? FEBS Lett. 2010;584:2995-2998. (116) Zito E, Chin KT, Blais J, Harding HP, Ron D. ERO1-beta, a pancreas-specific disulfide oxidase, promotes insulin biogenesis and glucose homeostasis. J Cell Biol. 2010;188:821-832. (117) Karala AR, Lappi AK, Saaranen MJ, Ruddock LW. Efficient peroxide-mediated oxidative refolding of a protein at physiological pH and implications for oxidative folding in the endoplasmic reticulum. Antioxid Redox Signal. 2009;11:963-970. (118) Tavender TJ, Sheppard AM, Bulleid NJ. Peroxiredoxin IV is an endoplasmic reticulum-localized enzyme forming oligomeric complexes in human cells. Biochem J. 2008;411:191-199. (119) Zito E, Melo EP, Yang Y, Wahlander A, Neubert TA, Ron D. Oxidative protein folding by an endoplasmic reticulum-localized peroxiredoxin. Mol Cell. 2010;40:787-797. (120) Tavender TJ, Springate JJ, Bulleid NJ. Recycling of peroxiredoxin IV provides a novel pathway for disulphide formation in the endoplasmic reticulum. EMBO J. 2010;29:4185-4197. (121) Kodali VK, Thorpe C. Quiescin sulfhydryl oxidase from Trypanosoma brucei: catalytic activity and mechanism of a QSOX family member with a single thioredoxin domain. Biochemistry. 2010;49:2075-2085. (122) Li W, Schulman S, Dutton RJ, Boyd D, Beckwith J, Rapoport TA. Structure of a bacterial homologue of vitamin K epoxide reductase. Nature. 2010;463:507-512. (123) Nguyen VD, Saaranen MJ, Karala AR, Lappi AK, Wang L, Raykhel IB, Alanen HI, Salo KE, Wang CC, Ruddock LW. Two endoplasmic reticulum PDI peroxidases increase the efficiency of the use of peroxide during disulfide bond formation. J Mol Biol. 2011;406:503-515.

96

(124) Saaranen MJ, Karala AR, Lappi AK, Ruddock LW. The role of dehydroascorbate in disulfide bond formation. Antioxid Redox Signal. 2010;12:15-25. (125) Banhegyi G, Benedetti A, Csala M, Mandl J. Stress on redox. FEBS Lett. 2007;581:3634-3640. (126) Hwang C, Sinskey AJ, Lodish HF. Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum. Science. 1992;257:1496-1502. (127) Cuozzo JW, Kaiser CA. Competition between glutathione and protein thiols for disulphide-bond formation. Nat Cell Biol. 1999;1:130-135. (128) Chakravarthi S, Jessop CE, Bulleid NJ. The role of glutathione in disulphide bond formation and endoplasmic-reticulum-generated oxidative stress. EMBO Rep. 2006;7:271-275. (129) Veal EA, Day AM, Morgan BA. Hydrogen peroxide sensing and signaling. Mol Cell. 2007;26:1-14. (130) Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutases. Annu Rev Biochem. 1995;64:97-112. (131) Chang TS, Cho CS, Park S, Yu S, Kang SW, Rhee SG. Peroxiredoxin III, a mitochondrion-specific

peroxidase,

regulates

apoptotic

signaling

by

mitochondria. J Biol Chem. 2004;279:41975-41984. (132) Balaban RS, Nemoto S, Finkel T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 2005;120:483-495. (133) Chaudiere J, Ferrari-Iliou R. Intracellular antioxidants: from chemical to biochemical mechanisms. Food Chem Toxicol. 1999;37:949-962. (134) Sies H. Oxidative stress: oxidants and antioxidants. Exp Physiol. 1997;82:291295.

97

(135) Imlay JA. Pathways of oxidative damage. Annu Rev Microbiol. 2003;57:395418. (136) Hidalgo E, Demple B. An iron-sulfur center essential for transcriptional activation by the redox-sensing SoxR protein. EMBO J. 1994;13:138-146. (137) Poole LB, Karplus PA, Claiborne A. Protein sulfenic acids in redox signaling. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2004;44:325-347. (138) Winterbourn CC, Metodiewa D. Reactivity of biologically important thiol compounds with superoxide and hydrogen peroxide. Free Radic Biol Med. 1999;27:322-328. (139) Gilbert HF. Molecular and cellular aspects of thiol-disulfide exchange. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 1990;63:69-172. (140) Salmeen A. Redox regulation of protein tyrosine phosphatase 1B involves a sulphenyl-amide intermediate. Nature. 2003;423:769-773. (141) van Montfort RL, Congreve M, Tisi D, Carr R, Jhoti H. Oxidation state of the active-site cysteine in protein tyrosine phosphatase 1B. Nature. 2003;423:773777. (142) Stone JR, Yang S. Hydrogen peroxide: a signaling messenger. Antioxid Redox Signal. 2006;8:243-270. (143) Paget MS, Buttner MJ. Thiol-based regulatory switches. Annu Rev Genet. 2003;37:91-121. (144) Nordberg J, Arner ES. Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system. Free Radic Biol Med. 2001;31:1287-1312. (145) Zheng M, Aslund F, Storz G. Activation of the OxyR transcription factor by reversible disulfide bond formation. Science. 1998;279:1718-1721.

98

(146) Kuge S, Jones N. YAP1 dependent activation of TRX2 is essential for the response of Saccharomyces cerevisiae to oxidative stress by hydroperoxides. EMBO J. 1994;13:655-664. (147) Aslund F, Zheng M, Beckwith J, Storz G. Regulation of the OxyR transcription factor by hydrogen peroxide and the cellular thiol-disulfide status. Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96:6161-6165. (148) Choi H, Kim S, Mukhopadhyay P, Cho S, Woo J, Storz G, Ryu S. Structural basis of the redox switch in the OxyR transcription factor. Cell. 2001;105:103113. (149) Toledano MB. Redox-dependent shift of OxyR-DNA contacts along an extended DNA-binding site: a mechanism for differential promoter selection. Cell. 1994;78:897-909. (150) Toledano MB, Delaunay A, Monceau L, Tacnet F. Microbial H2O2 sensors as archetypical redox signaling modules. Trends Biochem Sci. 2004;29:351-357. (151) Wood MJ, Storz G, Tjandra N. Structural basis for redox regulation of Yap1 transcription factor localization. Nature. 2004;430:917-921. (152) Ma LH, Takanishi CL, Wood MJ. Molecular mechanism of oxidative stress perception by the Orp1 protein. J Biol Chem. 2007;282:31429-31436. (153) Yan C, Lee LH, Davis LI. Crm1p mediates regulated nuclear export of a yeast AP-1-like transcription factor. EMBO J. 1998;17:7416-7429. (154) Okazaki S, Tachibana T, Naganuma A, Mano N, Kuge S. Multistep disulfide bond formation in Yap1 is required for sensing and transduction of H2O2 stress signal. Mol Cell. 2007;27:675-688. (155) Kuge S, Toda T, Iizuka N, Nomoto A. Crm1 (XpoI) dependent nuclear export of the budding yeast transcription factor yAP-1 is sensitive to oxidative stress. Genes Cells. 1998;3:521-532.

99

(156) Izawa S. Thioredoxin deficiency causes the constitutive activation of Yap1, an AP-1-like transcription factor in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 1999;274:28459-28465. (157) Delaunay A, Isnard AD, Toledano MB. H2O2 sensing through oxidation of the Yap1 transcription factor. EMBO J. 2000;19:5157-5166. (158) Carmel-Harel O. Role of thioredoxin reductase in the Yap1p-dependent response to oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae. Mol Microbiol. 2001;39:595605. (159) Sablina AA. The antioxidant function of the p53 tumor suppressor. Nature Med. 2005;11:1306-1313. (160) St Pierre J. Suppression of reactive oxygen species and neurodegeneration by the PGC-1 transcriptional coactivators. Cell. 2006;127:397-408. (161) Benassi B. c-Myc phosphorylation is required for cellular response to oxidative stress. Mol Cell. 2006;21:509-519. (162) Tothova Z. FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress. Cell. 2007;128:325-339. (163) Morgan MJ, Liu ZG. Crosstalk of reactive oxygen species and NF-kappaB signaling. Cell Res. 2011;21:103-115. (164) Roth S, Droge W. Regulation of T-cell activation and T-cell growth factor (TCGF) production by hydrogen peroxide. Cell Immunol. 1987;108:417-424. (165) Staal FJ, Anderson MT, Staal GE, Herzenberg LA, Gitler C, Herzenberg LA. Redox regulation of signal transduction: tyrosine phosphorylation and calcium influx. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91:3619-3622. (166) Rhee SG, Chang TS, Bae YS, Lee SR, Kang SW. Cellular regulation by hydrogen peroxide. J Am Soc Nephrol. 2003;14:S211-S215.

100

(167) Bae YS, Kang SW, Seo MS, Baines IC, Tekle E, Chock PB, Rhee SG. Epidermal growth factor (EGF)-induced generation of hydrogen peroxide. Role in

EGF

receptor-mediated

tyrosine

phosphorylation.

J

Biol

Chem.

1997;272:217-221. (168) Mahadev K, Zilbering A, Zhu L, Goldstein BJ. Insulin-stimulated hydrogen peroxide reversibly inhibits protein-tyrosine phosphatase 1b in vivo and enhances the early insulin action cascade. J Biol Chem. 2001;276:21938-21942. (169) Bae YS, Sung JY, Kim OS, Kim YJ, Hur KC, Kazlauskas A, Rhee SG. Plateletderived growth factor-induced H(2)O(2) production requires the activation of phosphatidylinositol 3-kinase. J Biol Chem. 2000;275:10527-10531. (170) Salmeen A, Barford D. Functions and mechanisms of redox regulation of cysteine-based phosphatases. Antioxid Redox Signal. 2005;7:560-577. (171) Chiarugi P, Cirri P. Redox regulation of protein tyrosine phosphatases during receptor tyrosine kinase signal transduction. Trends Biochem Sci. 2003;28:509514. (172) Park HS, Lee SH, Park D, Lee JS, Ryu SH, Lee WJ, Rhee SG, Bae YS. Sequential activation of phosphatidylinositol 3-kinase, beta Pix, Rac1, and Nox1 in growth factor-induced production of H2O2. Mol Cell Biol. 2004;24:43844394. (173) Mahadev K, Motoshima H, Wu X, Ruddy JM, Arnold RS, Cheng G, Lambeth JD, Goldstein BJ. The NAD(P)H oxidase homolog Nox4 modulates insulinstimulated generation of H2O2 and plays an integral role in insulin signal transduction. Mol Cell Biol. 2004;24:1844-1854. (174) DeYulia GJ, Jr., Carcamo JM, Borquez-Ojeda O, Shelton CC, Golde DW. Hydrogen peroxide generated extracellularly by receptor-ligand interaction facilitates cell signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:5044-5049.

101

(175) Takeda S, Gapper C, Kaya H, Bell E, Kuchitsu K, Dolan L. Local positive feedback regulation determines cell shape in root hair cells. Science. 2008;319:1241-1244. (176) Ritsick DR, Edens WA, Finnerty V, Lambeth JD. Nox regulation of smooth muscle contraction. Free Radic Biol Med. 2007;43:31-38. (177) Pozzan T, Rizzuto R, Volpe P, Meldolesi J. Molecular and cellular physiology of intracellular calcium stores. Physiol Rev. 1994;74:595-636. (178) Li Y, Camacho P. Ca2+-dependent redox modulation of SERCA 2b by ERp57. J Cell Biol. 2004;164:35-46. (179) Higo T, Hattori M, Nakamura T, Natsume T, Michikawa T, Mikoshiba K. Subtype-specific and ER lumenal environment-dependent regulation of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 by ERp44. Cell. 2005;120:85-98. (180) Csordas G, Hajnoczky G. SR/ER-mitochondrial local communication: calcium and ROS. Biochim Biophys Acta. 2009;1787:1352-1362. (181) Hamilton SL, Reid MB. RyR1 modulation by oxidation and calmodulin. Antioxid Redox Signal. 2000;2:41-45. (182) Tsien RY. New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: design, synthesis, and properties of prototype structures. Biochemistry. 1980;19:2396-2404. (183) Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 1985;260:3440-3450. (184) LeBel CP, Ischiropoulos H, Bondy SC. Evaluation of the probe 2',7'dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress. Chem Res Toxicol. 1992;5:227-231. (185) Rhee SG, Chang TS, Jeong W, Kang D. Methods for detection and measurement of hydrogen peroxide inside and outside of cells. Mol Cells. 2010;29:539-549.

102

(186) Henderson LM, Chappell JB. Dihydrorhodamine 123: a fluorescent probe for superoxide generation? Eur J Biochem. 1993;217:973-980. (187) Keller A, Mohamed A, Drose S, Brandt U, Fleming I, Brandes RP. Analysis of dichlorodihydrofluorescein and dihydrocalcein as probes for the detection of intracellular reactive oxygen species. Free Radic Res. 2004;38:1257-1267. (188) Rothe G, Valet G. Flow cytometric analysis of respiratory burst activity in phagocytes with hydroethidine and 2',7'-dichlorofluorescin. J Leukoc Biol. 1990;47:440-448. (189) Zhou M, Diwu Z, Panchuk-Voloshina N, Haugland RP. A stable nonfluorescent derivative of resorufin for the fluorometric determination of trace hydrogen peroxide: applications in detecting the activity of phagocyte NADPH oxidase and other oxidases. Anal Biochem. 1997;253:162-168. (190) Chen

CS,

Gee

KR.

Redox-dependent

trafficking

of

2,3,4,5,

6-

pentafluorodihydrotetramethylrosamine, a novel fluorogenic indicator of cellular oxidative activity. Free Radic Biol Med. 2000;28:1266-1278. (191) Marchesi E, Rota C, Fann YC, Chignell CF, Mason RP. Photoreduction of the fluorescent dye 2'-7'-dichlorofluorescein: a spin trapping and direct electron spin resonance study with implications for oxidative stress measurements. Free Radic Biol Med. 1999;26:148-161. (192) Maeda H, Fukuyasu Y, Yoshida S, Fukuda M, Saeki K, Matsuno H, Yamauchi Y, Yoshida K, Hirata K, Miyamoto K. Fluorescent probes for hydrogen peroxide based on a non-oxidative mechanism. Angew Chem Int Ed Engl. 2004;43:23892391. (193) Chang MC, Pralle A, Isacoff EY, Chang CJ. A selective, cell-permeable optical probe for hydrogen peroxide in living cells. J Am Chem Soc. 2004;126:1539215393.

103

(194) Miller EW, Albers AE, Pralle A, Isacoff EY, Chang CJ. Boronate-based fluorescent probes for imaging cellular hydrogen peroxide. J Am Chem Soc. 2005;127:16652-16659. (195) Miller EW, Tulyathan O, Isacoff EY, Chang CJ. Molecular imaging of hydrogen peroxide produced for cell signaling. Nat Chem Biol. 2007;3:263-267. (196) Srikun D, Albers AE, Nam CI, Iavarone AT, Chang CJ. Organelle-targetable fluorescent probes for imaging hydrogen peroxide in living cells via SNAP-Tag protein labeling. J Am Chem Soc. 2010;132:4455-4465. (197) Schwarzer C, Illek B, Suh JH, Remington SJ, Fischer H, Machen TE. Organelle redox of CF and CFTR-corrected airway epithelia. Free Radic Biol Med. 2007;43:300-316. (198) Malinouski M, Zhou Y, Belousov VV, Hatfield DL, Gladyshev VN. Hydrogen peroxide probes directed to different cellular compartments. PLoS One. 2011;6:e14564. (199) Mishina NM, Tyurin-Kuzmin PA, Markvicheva KN, Vorotnikov AV, Tkachuk VA, Laketa V, Schultz C, Lukyanov S, Belousov VV. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally? Antioxid Redox Signal. 2011;14:1-7. (200) Hanson GT, Aggeler R, Oglesbee D, Cannon M, Capaldi RA, Tsien RY, Remington SJ. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J Biol Chem. 2004;279:13044-13053. (201) Tsien RY. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 1998;67:509-544. (202) Cannon MB, Remington SJ. Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate. Protein Sci. 2006;15:45-57. (203) Dooley CT, Dore TM, Hanson GT, Jackson WC, Remington SJ, Tsien RY. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J Biol Chem. 2004;279:22284-22293.

104

(204) Belousov VV, Fradkov AF, Lukyanov KA, Staroverov DB, Shakhbazov KS, Terskikh AV, Lukyanov S. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 2006;3:281-286. (205) Nagai T, Sawano A, Park ES, Miyawaki A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98:3197-3202. (206) Markvicheva KN, Bilan DS, Mishina NM, Gorokhovatsky AY, Vinokurov LM, Lukyanov S, Belousov VV. A genetically encoded sensor for H2O2 with expanded dynamic range. Bioorg Med Chem. 2011;19:1079-1084. (207) Poburko D, Santo-Domingo J, Demaurex N. Dynamic Regulation of the Mitochondrial Proton Gradient during Cytosolic Calcium Elevations. J Biol Chem. 2011;286:11672-11684. (208) Inoue T, Heo WD, Grimley JS, Wandless TJ, Meyer T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat Methods. 2005;2:415-418. (209) Czirjak G, Enyedi P. Targeting of calcineurin to an NFAT-like docking site is required for the calcium-dependent activation of the background K+ channel, TRESK. J Biol Chem. 2006;281:14677-14682. (210) Mezghrani A, Fassio A, Benham A, Simmen T, Braakman I, Sitia R. Manipulation of oxidative protein folding and PDI redox state in mammalian cells. EMBO J. 2001;20:6288-6296. (211) Nagai T, Ibata K, Park ES, Kubota M, Mikoshiba K, Miyawaki A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 2002;20:87-90. (212) Rizzo MA, Springer GH, Granada B, Piston DW. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat Biotechnol. 2004;22:445-449.

105

(213) Nagai T, Yamada S, Tominaga T, Ichikawa M, Miyawaki A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:10554-10559. (214) Pedruzzi E, Fay M, Elbim C, Gaudry M, Gougerot-Pocidalo MA. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colonystimulating factor. Br J Haematol. 2002;117:719-726. (215) Miyawaki A. Development of Probes for Cellular Functions Using Fluorescent Proteins and Fluorescence Resonance Energy Transfer. Annu Rev Biochem. 2010. (216) Bunt G, Wouters FS. Visualization of molecular activities inside living cells with fluorescent labels. Int Rev Cytol. 2004;237:205-277. (217) Wang L, Li SJ, Sidhu A, Zhu L, Liang Y, Freedman RB, Wang CC. Reconstitution of human Ero1-Lalpha/protein-disulfide isomerase oxidative folding pathway in vitro. Position-dependent differences in role between the a and a' domains of protein-disulfide isomerase. J Biol Chem. 2009;284:199-206. (218) Takemura H, Thastrup O, Putney JW, Jr. Calcium efflux across the plasma membrane of rat parotid acinar cells is unaffected by receptor activation or by the microsomal calcium ATPase inhibitor, thapsigargin. Cell Calcium. 1990;11:11-17. (219) Putney JW, Jr. Recent breakthroughs in the molecular mechanism of capacitative calcium entry (with thoughts on how we got here). Cell Calcium. 2007;42:103-110. (220) Thorneloe KS, Sulpizio AC, Lin Z, Figueroa DJ, Clouse AK, McCafferty GP, Chendrimada TP, Lashinger ES, Gordon E, Evans L, Misajet BA, Demarini DJ, Nation JH, Casillas LN, Marquis RW, Votta BJ, Sheardown SA, Xu X, Brooks DP,

Laping

NJ,

Westfall

106

TD.

N-((1S)-1-{[4-((2S)-2-{[(2,4-

dichlorophenyl)sulfonyl]amino}-3-hydroxypropa noyl)-1-piperazinyl]carbonyl}3-methylbutyl)-1-benzothiophene-2-carboxamid e (GSK1016790A), a novel and potent transient receptor potential vanilloid 4 channel agonist induces urinary bladder contraction and hyperactivity: Part I. J Pharmacol Exp Ther. 2008;326:432-442. (221) Rosen GM, Freeman BA. Detection of superoxide generated by endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984;81:7269-7273. (222) Cadenas E, Sies H. Oxidative stress: excited oxygen species and enzyme activity. Adv Enzyme Regul. 1985;23:217-237. (223) Kim JH, Johannes L, Goud B, Antony C, Lingwood CA, Daneman R, Grinstein S. Noninvasive measurement of the pH of the endoplasmic reticulum at rest and during calcium release. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95:2997-3002. (224) Chakravarthi S, Jessop CE, Willer M, Stirling CJ, Bulleid NJ. Intracellular catalysis of disulfide bond formation by the human sulfhydryl oxidase, QSOX1. Biochem J. 2007;404:403-411. (225) Chen K, Kirber MT, Xiao H, Yang Y, Keaney JF, Jr. Regulation of ROS signal transduction by NADPH oxidase 4 localization. J Cell Biol. 2008;181:11291139. (226) Petry A, Djordjevic T, Weitnauer M, Kietzmann T, Hess J, Gorlach A. NOX2 and NOX4 mediate proliferative response in endothelial cells. Antioxid Redox Signal. 2006;8:1473-1484. (227) Yang Y, Song Y, Loscalzo J. Regulation of the protein disulfide proteome by mitochondria in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104:1081310817. (228) Kornmann B, Currie E, Collins SR, Schuldiner M, Nunnari J, Weissman JS, Walter P. An ER-mitochondria tethering complex revealed by a synthetic biology screen. Science. 2009;325:477-481.

107

(229) Singh DK, Kumar D, Siddiqui Z, Basu SK, Kumar V, Rao KV. The strength of receptor signaling is centrally controlled through a cooperative loop between Ca2+ and an oxidant signal. Cell. 2005;121:281-293. (230) Kwon J, Shatynski KE, Chen H, Morand S, De D, X, Miot F, Leto TL, Williams MS. The nonphagocytic NADPH oxidase Duox1 mediates a positive feedback loop during T cell receptor signaling. Sci Signal. 2010;3:ra59. (231) Murphy MP, Holmgren A, Larsson NG, Halliwell B, Chang CJ, Kalyanaraman B, Rhee SG, Thornalley PJ, Partridge L, Gems D, Nystrom T, Belousov V, Schumacker PT, Winterbourn CC. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 2011;13:361-366. (232) Gutscher M, Sobotta MC, Wabnitz GH, Ballikaya S, Meyer AJ, Samstag Y, Dick TP. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. J Biol Chem. 2009;284:31532-31540. (233) Nathan CF. Neutrophil activation on biological surfaces. Massive secretion of hydrogen peroxide in response to products of macrophages and lymphocytes. J Clin Invest. 1987;80:1550-1560. (234) Splettstoesser WD, Schuff-Werner P. Oxidative stress in phagocytes--"the enemy within". Microsc Res Tech. 2002;57:441-455. (235) Babior BM. NADPH oxidase: an update. Blood. 1999;93:1464-1476. (236) Moskwa P, Lorentzen D, Excoffon KJ, Zabner J, McCray PB, Jr., Nauseef WM, Dupuy C, Banfi B. A novel host defense system of airways is defective in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 2007;175:174-183.

108

12. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE A tézisek alapjául szolgáló közlemények és kézirat: Enyedi B, Varnai P, Geiszt M.: Redox state of the endoplasmic reticulum is controlled by Ero1l-alpha and intraluminal calcium. Antioxid Redox Signal. 2010 Sep 15;13(6):721-9 IF : 8,209 Donkó A, Ruisanchez E, Orient A, Enyedi B, Kapui R, Péterfi Z, de Deken X, Benyó Z, Geiszt M. : Urothelial cells produce hydrogen peroxide through the activation of Duox1. Free Radic Biol Med. 2010 Dec 15;49(12):2040-8. IF : 5,707 Enyedi B, Donkó A, Geiszt M.: Spatial and temporal analysis of NADPH oxidasegenerated hydrogen peroxide signals by novel fluorescent protein reporters. 2011 (közlésre előkészítve) Egyéb közlemények: Rosenzweig, S. D., Schaffer, A. A., Ding, L., Sullivan, R., Enyedi, B., Yim, J. J., Cook, J. L., Musser, J. M., Holland, S. M : "Interferon-gamma receptor 1 promoter polymorphisms: population distribution and functional implications." Clin Immunol. 2004 Jul;112(1):113-9. IF: 3,034 Illes, A., B. Enyedi, P. Tamas, A. Balazs, G. Bogel, Melinda, Lukacs, and L. Buday. : ”Cortactin is required for integrin-mediated cell spreading.” Immunol Lett. 2006 Apr 15;104(1-2):124-30. IF: 2,352 Illes A, Enyedi B, Tamas P, Balazs A, Bogel G, Buday L. : “Inducible phosphorylation of cortactin is not necessary for cortactin-mediated actin polymerisation.” Cell Signal. 2006 Jun;18(6):830-40. IF: 4,887 Tőke, J.; Czirják, G.; Patócs, A.; Enyedi, B.; Gergics, P.; Csákváry, V.; Enyedi, P.; Tóth, M.: Neonatal severe hyperparathyroidism associated with a novel de novo heterozygous R551K inactivating mutation and a heterozygous A986S polymorphism of the calcium-sensing receptor gene. Clin Endocrinol (Oxf). 2007 Sep;67(3):385-92. IF: 3,370

109

13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Mindenekelőtt témavezetőmnek, Dr. Geiszt Miklósnak szeretnék köszönetet mondani, hogy diákkörösként bekapcsolódhattam a laboratóriumában folyó tudományos munkába, majd kezdő kutatóként munkacsoportjába fogadott. Köszönöm neki, hogy a tudomány iránti érdeklődésemet megerősítette, és kritikus szemléletével, kifogyhatatlan ötleteivel valamint töretlen optimizmusával segítette és irányította munkámat. Köszönettel tartozom az Élettani Intézet korábbi és jelenlegi igazgatójának, Spät András és Hunyady László professzor uraknak, hogy munkámat diákkörösként és doktorandusz hallgatóként lehetővé tették, illetve Ligeti Erzsébet professzor asszonynak, aki a Celluláris és molekuláris élettan program vezetőjeként támogatta és figyelemmel kísérte PhD munkámat és doktori tanulmányaimat. Szeretném megköszönni Molnár Beáta és Szosznyák Tünde megbízható és alapos asszisztensi munkáját. Hálás vagyok közvetlen munkatársaimnak, Dr. Donkó Ágnesnek, Orient Annának és Dr. Péterfi Zalánnak segítőkészségükért, a szakmai eszmecserékért és laborunk kellemes, baráti hangulatáért. Köszönöm továbbá az Élettani Intézet valamennyi dolgozójának azt a családias légkört, melyben öröm volt dolgozni. Hálás vagyok minden kollégámnak, akihez kérdéssel fordulhattam, külön kiemelve Dr. Várnai Pétert, aki munkám minden fázisában segítséget nyújtott. Köszönöm Dr. Czirják Gábor, Dr. Petheő Gábor és Dr. Szanda

Gergő

ötleteit

és

tanácsait,

valamint

az

Élettani

Intézet

összes

munkacsoportjának mindennemű segítségét. Méltán kerülhetett volna köszönetnyilvánításomban első helyre Édesapám, akinek szakmai karrieremhez nyújtott támogatását és egész életemet végigkísérő tanítását nem tudom szavakkal meghálálni. Végül, de nem utolsósorban hálával tartozom családomnak és barátaimnak, szerető biztatásukért és támogatásukért, mely nélkül ez a munka nem valósulhatott volna meg.

110