Emlős sejtek tenyésztése
A sejttenyészetek fenntartása Tápfolyadék (médium) • • • • •
Sók (NaCl, KCl, CaCl2, stb.) Esszenciális aminosavak Glükóz Vitaminok Puffer (pl.: Na-bikarbonát, HEPES) • Antibiotikum+gombaölő • Indikátor (fenolvörös) • + tápfolyadék kiegészítők – supplements (szérum /FCS/, B27 stb.)
A tápfolyadékok (médiumok) összetétele ismert és a szállító cég honlapján elérhető
Ismertebb médiumok: 1. Minimum Essential Medium (MEM), developed by Harry Eagle, is one of the most widely used of all synthetic cell culture media. Early attempts to cultivate normal mammalian fibroblasts and certain subtypes of HeLa cells revealed they had specific nutritional requirements that could not be met by Eagle’s Basal Medium (BME). Subsequent studies using these and other cells in culture indicated additions to BME could be made to aid growth of a wider variety of fastidious cells. MEM, which incorporates these modifications, includes higher concentrations of amino acids so the medium more closely approximates the protein composition of cultured mammalian cells. MEM has been used for cultivation of a wide variety of cells grown in monolayers. Optional supplementation of non-essential amino acids to the formulations that incorporate either Hanks’ or Earle’s salts has broadened the usefulness of this medium. The formulation has been further modified by optional elimination of calcium to permit growth of cells in suspension culture.
2. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) is a modification of Basal Medium Eagle (BME) that contains a 4-fold higher concentration of amino acids and vitamins, as well as additional supplementary components. The original DME formula, first reported for culturing embryonic mouse cells, contained 1,000 mg/L of glucose. An alteration with 4,500 mg/L glucose is optimal in cultivating certain cell types.
Ismertebb médiumok: 3. RPMI-1640 medium was developed by Moore et al., at Roswell Park Memorial Institute, hence the acronym RPMI. The formulation is based on the RPMI-1630 series of media utilizing a bicarbonate buffering system and alterations in the amounts of amino acids and vitamins. RPMI-1640 medium has been used for the culture of human normal and neoplastic leukocytes. RPMI-1640 when properly supplemented, has demonstrated wide applicability for supporting growth of many types of cell cultures, including fresh human lymphocytes in the 72-hour phytohemagglutinin (PHA) stimulation assay.
4. Ham’s Nutrient Mixtures (F12) were originally developed to support clonal growth of several clones of Chinese hamster ovary (CHO) cells, as well as clones of HeLa and mouse L-cells. Both mixtures were formulated for use with or without serum supplementation, depending on the cell type being cultured. Ham’s F-10 has been shown to support the growth of human diploid cells, white blood cells for chromosomal analysis, primary explants of rat, rabbit and chicken tissues. Ham’s F-12 has been used for the growth of primary rat hepatocytes and rat prostate epithelial cells.
5. Neurobasal® Medium is a basal medium that meets the special cell culture requirements of pre-natal and embryonic neuronal cells when used with GIBCO® B-27® Supplement. Neurobasal® Medium can be used to grow neuronal cells from hippocampus, cortex and other regions of the brain. Neurobasal® Medium allows for both long and short term maintenance of homogeneous populations of neuronal cells without the need of an astrocyte feeder layer.
Table 2. Different types of culture medium and their uses Media Type
Examples
Uses
Balanced salt solutions
PBS, Hanks’ BSS, Earle’s salts DPBS HBSS EBSS
Form the basis of many complex media
Basal media
MEM
Primary and diploid culture
DMEM
Modification of MEM containing increased level of amino acids and vitamins. Supports a wide range of cell types including hybridomas
GMEM
Glasgows modified MEM was defined for BHK-21 cells
RPMI 1640
Originally derived for human leukaemic cells. It supports a wide range of mammalian cells including hybridomas
Iscoves DMEM
Further enriched modification of DMEM which supports high density growth
Leibovitz L-15
Designed for CO2 free environments
TC 100 Graces insect medium Schneider's Insect medium
Designed for culturing insect cells
CHO HEK293
For use in serum free applications
Ham F10 and derivatives Ham F12 DMEM/F12
Note: these media must be supplemented with other factors such as insulin, transferrin and epidermal growth factor. These media are usually HEPES buffered
Serum-Free Insect Medium 1 (Cat no. S3777)
Specifically designed for use with Sf9 insect cells
Complex media
Serum free media
Insect cells
6.1 Basic Constituents of Media
A leggyakoribb médiumtípusok és alkalmazásuk
A sejttenyészetek fenntartása CO2 inkubátor • 37°C • 5% CO2 atmoszféra • 100% páratartalom
A sejttenyészetek fenntartása Steril fülke: • HEPA (high efficiency particulate air) szűrő 99.99%-ban kiszűri a levegőből a 0.3 µm méretű részecskéket • A szűrt levegőt a rendszer folyamatosan áramoltatja a munkafelületen • A munkafelület sterilizálható
Sejttenyészet típusok HeLa
Jurkat
CHO
• Felülethez kitapadó tenyészetek (pl: HeLa) • Sejtszuszpenzióban lévő tenyészetek (pl: fehérvérsejtek – Jurkat, tumorsejtek)
• Kitapadva és szuszpenzióban is fenntartható tenyészetek (pl: CHO)
A sejtek morfológiája a tenyészetben Fibroblaszt szerű (fobroblastic/fibroblast-like) sejtek (bi- vagy multipolárisak, elnyújtott alakúak; letapadva növekednek)
Epitélium szerű (epithelial-like) sejtek (multipolárisak, általában szabályozottabb sejtalakkal; letapadva foltszerűen növekednek)
Az egyik legismertebb humán sejtvonal: HeLa: Henrietta Lacks méhnyak karcinómájából származó biopsziából kitenyésztve (Dr. George Otto Gey, 1951.) Ez volt az első in vitro körülmények között jól fenntartható emberi sejtvonal
Sejtkultúrák készítése • Szövet izolálás (szerv
explantátum, vér, embrió)
• A sejtek szétválasztása •
(darabolás szikével, késes homogenizátor, enzimatikus emésztés) Primer sejtkultúra: Az eredeti szervből/szövetből frissen eltávolított sejtekből készült kultúra
• Szelekciós hatások (migrációs képesség, osztódási sebesség, médium, stb.)
Szekunder sejtkultúra, sejtvonal • Passzálás: Bizonyos sejtszám elérése után a
• • •
•
sejtosztódás leáll. Ilyenkor új felületet/teret kell adni a sejteknek. A tenyészet egy részét új tenyésztőedénybe visszük át és friss médiumot adunk hozzá. Generációs szám: osztódási ciklusok száma. Nem egyenlő a passzázs-számmal. Szekunder kultúra: A primer kultúra sejtjeinek egyszeri passzálása (átoltása) révén jön létre. Sejtvonal: A primer kultúrából néhány passzálás után kialakult véges élettartamú, korlátolt növekedésű (40100 passzálás) sejtkultúra. pl. fibroblaszt tenyészet Hayflick-limit: Az emlős sejtek szaporodása korlátozott. Humán embrionális sejtek ált. 40-60 osztódáson mehetnek keresztül. Ezt a kromoszómák folyamatos rövidülése okozza.
Korlátlanul osztódó sejtek • Folyamatos sejtvonal: Korlátlan ideig fenntartható
sejtkultúra, mert sejtjei folyamatos osztódó képességgel rendelkeznek. Az ilyen sejtekben gyakran a normálisnál több kromoszóma van, vagy más genetikai elváltozás van.
• Korlátlanul osztódó emlős sejtek: Ø Ø Ø Ø Ø
Természetesen előfordulók: őssejtek és csírasejtek Immortalizáció = korlátlan osztódó képesség elnyerése Spontán imortalizáció (pl: hámsejt-, fehérvérsejt-kultúrák) Mutáció vagy vírus okozta immortalizáció (pl: tumorsejtek) Mesterséges immortalizáció (gének bevitele, hibridóma)
• Sejttörzs: Megfelelő tulajdonságok alapján szelektált sejtekből kiinduló sejtkultúra. A sejtek azonos típusúak.
Sejt klónok • Klón: Egyetlen sejtből származó utódsejtek populációja, amelyek genetikailag teljesen azonosak.
Tenyésztőedények Petri-csésze Flaska Plate Lombik
Speciális tenyésztőedények Chamber Slide:
Live cell imaging dish:
Sejtkultúrák befertőződése • Okozhatja: baktérium, élesztő, gomba, mycoplasma • Jellemzők: – – – –
Médium zavarosodása Hirtelen pH csökkenés (baktérium) pH növekedés (gomba) Nagyon lassú sejtnövekedés (mycoplasma)
• Mikroszkóppal 100x-os nagyításban már látható (kivéve: mycoplasma – fluoszcens DNS festés ill. orcein vagy Giemsa festés)
microscope, the bacteria appear as tiny granules between the cells, and observation under a high-power microscope can resolve the shapes of individual bacteria. The simulated images below show an adherent 293 cell culture contaminated with E. coli.
bakteriális fertőzés
A
B
Figure 2.2 Simulated phase contrast images of adherent 293 cells contaminated with E. coli. The spaces between the adherent cells show tiny, shimmering granules under low power microscopy, but the individual bacteria are not easily distinguishable (panel A). Further magnification of the area enclosed by the black square resolves the individual E. coli cells, which are typically rod-shaped and are about 2 µm long and 0.5 µm in diameter. Each side of the black square in panel A is 100 µm.
stage the pH usually increases. Under microscopy, yeast appear as individual ovoid or spherical particles, that may bud off smaller particles. The simulated image below shows adherent 293 cell culture 24 hours after plating that is infected with yeast.
élesztő fertőzés
Figure 2.3 Simulated phase contrast images of 293 cells in adherent culture that is contaminated with yeast. The contaminating yeast cells appear as ovoid particles, budding off smaller particles as they replicate.
with decreased rate of cell proliferation, reduced saturation density, and agglutination in suspension cultures; however, the only assured way of detecting mycoplasma contamination is by testing the cultures periodically using fluorescent staining (e.g., Hoechst 33258), ELISA, PCR, immunostaining, autoradiography, or microbiological assays.
micoplazma fertőzés
A
B
C
Figure 2.4 Photomicrographs of mycoplasma-free cultured cells (panel A) and cells infected with mycoplasma (panels B and C). The cultures were tested using the MycoFluor™ Mycoplasma Detection Kit, following the kit protocols. In fixed cells, the MycoFLuor™ reagent has access to the cell nuclei, which are intesensely stained with the reagent, but the absence of fluorescent extranuclear objects indicates that the culture is free from mycoplasma contamination (panel A). In fixed cells infected with mycoplasma, the MycoFluor™ reagent stains both the nuclei and the mycoplasma, but the intense relative fluorescence of the nuclei obscure the mycoplasma on or near the nuclei. However, the mycoplasma separated from the bright nuclei are readily visible (panel B). In live cells, the MycoFluor™ reagent does not have access to the nuclei, but readily stains the mycoplasma associated with the outside of cells (panel C). The emission spectra of the MORFS are designed to have a homogeneous intensity that closely matches that of mycoplasma stained according to the MycoFluor™ mycoplasma detection protocol, allowing the researchers to discriminate between stained mycoplasma and other forms of background luminescence, including viruses, bacteria and cellular autofluorescence. The images were obtained using 365 nm excitation and a 100/1.3 Plan Neofluar objective lens coupled with a 450 ± 30 nm bandpass filter.
Biosafety szintjei (Biosafety Levels = BL, vagy BS)
• 4 szint • NIH Guidelines: „Research Involving Recombinant DNA” • A gazdaszervezet veszélyességétől függ • Lehetséges patogén hatások figyelembe vételével
1. védelmi szint Def.: Emberi megbetegedést vélhetően nem okozó, környezetre nem veszélyes ágensekkel való munka. Nulla vagy nagyon alacsony szintű egyéni és társadalmi kockázat. pl. középiskolai, egyetemi oktató laborok. pl. Bacillus subtilis Naegleria gruberi E. coli
1. védelmi szint • Személyi feltételek: • Laborvezető általános laboratóriumi gyakorlattal és a megfelelő szakmai hátérrel rendelkezzen. • Laboránsok: a munkafolyamatoknak megfelelő specifikus tréningen kell résztvenniük.
1. védelmi szint
2. védelmi szint Def.: Az emberi egészségre és a környezetre mérsékelten veszélyes ágensekkel való munka. Olyan patogén, ami emberi vagy állati fertőzést képes okozni, de várhatóan nem jelent komoly kockázatot az egyénre, közösségre, állatokra és a környezet egyéb részeire. A laboratóriumi fertőzés komoly betegséget okozhat, de rendelkezésre áll hatékony és megfelelő kezelés, valamint a fertőzés továbbterjedésének kockázata igen alacsony.
pl. Salmonellae, Hepatitis B virus
2. védelmi szint
Személyi feltételek: • Laborvezető: A felelőssége tudatában lévő, a patogénekkel kapcsolatos szakmai tudás birtokában van. • Laboráns: Megfelelő gyakorlattal kell rendelkeznie a patogénekkel való munkában, melyet a hozzáértő laborvezető irányít.
2. védelmi szint
biológiai veszélyt jelző tábla
2. védelmi szint
Biztonsági berendezések •Arc védelme: ha fülkén kívül dolgozunk és fertőző vagy más veszélyes anyag kifröcskölődése várható. (védőszemüveg, maszk) • Köpeny vagy egyenruha viselése kötelező. Ezt az öltözéket a laborban kell hagyni távozáskor. Tilos hazavinni, helyben kell biztosítani a tisztításukat. • Egyszer használatos kesztyűt kell viselni, ha fertőzött állattal vagy fertőző anyaggal, fertőzött felületen vagy eszközzel dolgozunk. A munka végén helyben kell a kesztyűt levenni, es a fertőzésbiztos tárolóedénybe helyezni.
3. védelmi szint
Def.: Belélegzéssel terjedő súlyos vagy halálos betegséget okozó ágensekkel való munka. Olyan patogén, mely várhatóan súlyos betegséget okoz állatban vagy emberben, de továbbterjedése egyénről egyénre nem valószínű. Hatékony kezelési módszer és megelőzési lehetőség rendelkezésre áll.
3. védelmi szint
Személyi feltételek § Labor vezető: Felügyeli a dolgozókat, ezen ágensek terén megfelelően jártas legyen mind az elméletben, mind a gyakorlatban. § Labor személyzet: Speciális oktatáson kell részt venniük, mely a patogén vagy letalitást okozó ágensekkel való munkára készít fel.
3. védelmi szint
4. védelmi szint
Def.: Veszélyes és idegen ágensekkel való munka, melyek életveszélyes betegségekkel járnak. A fertőzés valószínűsége egyénről egyénre igen magas. Általában nem állnak rendelkezésre a megbetegedés kezelésére alkalmas módszerek.
Szükséges laboratóriumi eszközök * ajánlott biológiai biztonsági szint
1.
2.
3.
4.
labor izolálása
-
-
*
+
hermetikus lezárás lehetősége
-
-
+
+
szellőztetés be
-
*
+
+
sz. épület rendszerével
-
*
+
-
sz. elkülönítve
-
*
+
+
kimenő HEPA sz.
-
-
*
+
dupla-ajtós bejárat
-
-
+
+
légzár zuhannyal
-
-
-
+
előtér öltöző
-
-
+
-
előtér zuhannyal
-
-
*
-
elfolyó anyagok kezelése
-
-
*
+
