Epiteliális eredetű sejtek ionszekréciójának vizsgálata

Epiteliális eredetű sejtek ionszekréciójának vizsgálata Doktori értekezés

Demeter Irma Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Varga Gábor egyetemi tanár, az MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Sperlágh Beáta, az MTA doktora Dr. Kecskeméti Valéria, az orvostudomány kandidátusa Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Vincze Zoltán, az MTA doktora Dr. Simon György, az orvostudomány kandidátusa Dr. Hegyi Péter, Ph. D.

Budapest 2009

Tartalomjegyzék

TARTALOMJEGYZÉK

TARTALOMJEGYZÉK ............................................................................................... 2 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ....................................................................................... 4 A nyálmirigyek............................................................................................................ 9 Fehérjeszekréció..................................................................................................... 11 A folyadék- és ionszekréció mechanizmusa ............................................................ 12 A szekréció szabályozása........................................................................................ 15 A hasnyálmirigy........................................................................................................ 18 A fehérjeszekréció mechanizmusa .......................................................................... 19 Folyadék- és elektrolitszekréció ............................................................................. 19 A szekréció szabályozása........................................................................................ 24 CÉLKITŰZÉSEK ........................................................................................................ 27 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK .................................................................................. 28 Felhasznált sejtvonalak ............................................................................................ 28 Anyagok..................................................................................................................... 29 Oldatok tartalma .................................................................................................... 29 Módszerek ................................................................................................................. 30 Sejttenyészet fenntartása, előkészítése a méréshez................................................. 30 Kiültetés.................................................................................................................. 30 Molekuláris biológia .............................................................................................. 31 Rövidzárlati áram mérés ........................................................................................ 32 Mikrofluorometria .................................................................................................. 32 Statisztika................................................................................................................ 34 EREDMÉNYEK ........................................................................................................... 35 Par-C10 sejtek ionszekréciójának vizsgálata ......................................................... 35 Az intracelluláris pH visszatérése acidózisból ....................................................... 37 A HCO3¯ szekréció vizsgálata ................................................................................ 40 Anion-kicserélők jelenlétének vizsgálata................................................................ 42 A Par-C10 sejtek intracelluláris Ca2+-szint szabályozó mechanizmusainak vizsgálata ................................................................................................................... 44

–2–

Tartalomjegyzék

A hasnyálmirigy duktuszból származó HPAF sejtvonal ionszekréciójában résztvevő mechanizmusok vizsgálata...................................................................... 50 Az ATP hatása a szekrécióra .................................................................................. 50 Acidózis kompenzálása ........................................................................................... 52 Gátlószerek hatása ................................................................................................. 54 Transzepiteliális HCO3¯ szekréció ......................................................................... 58 MEGBESZÉLÉS .......................................................................................................... 60 Patkány parotisz acinusból származó sejtek vizsgálata........................................ 60 Par-C10 sejtek ionszekréciójának vizsgálata......................................................... 60 A patkány parotisz eredetű Par-C10 sejtek Ca2+ clearance vizsgálata .................. 63 Hasnyálmirigy duktuszból származó sejtvonal ionszekréciójának vizsgálata.... 66 KÖVETKEZTETÉSEK............................................................................................... 69 ÖSSZEFOGLALÁS ..................................................................................................... 71 SUMMARY................................................................................................................... 72 IRODALOMJEGYZÉK .............................................................................................. 73 PUBLIKÁCIÓS JEGYZÉK ........................................................................................ 84 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS...................................................................................... 85

–3–

Rövidítések

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACh

–

acetil-kolin

ADP

–

adenozin-difoszfát

AE

–

anion kicserélő

Ag

–

ezüst

AgCl

–

ezüst-klorid

AQP

–

aquaporin, vízcsatorna

ATCC

–

Amerikai Típusú Sejtkultúra Gyűjtemény

ATP

–

adenozin-5’-trifoszfát

BCECF-AM –

2’,7’-bisz-(2-karboxietil)-5-(és-6)-karboxifluoreszceinacetoximetil észter

BEST

–

Bestrophin-típusú ioncsatorna

Br¯

–

bromid ion

BzATP

–

3-O-(4-benzoil)benzoil-ATP

CA

–

karboanhidráz

Ca2+

–

kalcium ion

[Ca2+]i

–

intracelluláris kalcium ion koncentráció

CaCl2

–

kalcium-klorid

cAMP

–

ciklikus adenozil-monofoszfát

Capan-1

–

egy sejtvonal neve

CCh

–

karbakol, karbamil-kolin

CCK

–

kolecisztokinin

cDNS

–

kópia dezoxiribonukleinsav

CFPAC-1

–

egy sejtvonal neve

CFTR

–

cisztikus fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor

CFTRinh-172 –

CFTR inhibitor-172

CGRP

–

kalcitonin génhez kapcsolt fehérje

Cl¯

–

klorid ion

CLC

–

Klorid ioncsatorna

CLCA

–

Kalcium ion-aktivált klorid ioncsatorna

CO2

–

szén-dioxid

–4–

Rövidítések

CPA

–

ciklopiazonsav

DAG

–

diacil-glicerol

DMEM/F12

–

Dulbecco féle módosított Eagle féle médium és Ham féle F12 tápláló keverék keveréke

DNDS

–

4,4’-dinitrostilbén-2,2’-diszulfonsav

E3KARP

–

nátrium-hidrogén kicserélő 3-as altípus kináz A szabályozó fehérje

EDTA

–

etiléndiamin-tetraecetsav

EGF

–

epidermális növekedési faktor

EGTA

–

etilénglikol-tetraacetát

EIPA

–

5-(N-etil-N-izopropil) amilorid

ENaC

–

epiteliális nátrium ioncsatorna

ER

–

endoplazmás retikulum

EtBr

–

etídium-bromid

FBS

–

fötális borjúszérum

FGF

–

fibroblaszt növekedési faktor

GRP

–

gasztrointesztinális szekréciós fehérje

H2DIDS

–

4,4’-diizotiocianatodihidrostilbén- 2,2’-diszulfonsav

H2R

–

hisztamin-receptor 2-es altípus

hBest

–

emberi bestrophin fehérje

HCO3¯

–

bikarbonát ion

HEPES

–

4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetánszulfonsav

HOE-694

–

3-metilszulfonil-4-piperidinbenzoil-guanidin

HPAF

–

egy emberi hasnyálmirigy adenokarcinómából izolált sejtvonal neve

IK

–

befelé irányuló kálium ioncsatorna

IP3

–

inozitol-triszfoszfát

IRBIT

-

az IP3-mal együtt felszabaduló IP3-receptor kötő fehérje

ISC

–

rövidzárlati árammennyiség

K+

–

kálium ion

KCl

–

kálium-klorid

KCC

–

kálium-klorid kotranszporter család

–5–

Rövidítések

KCNK

–

a kálium csatornák K alcsaládja

KCNMA

–

nagy konduktanciájú kalcium ion-aktiválta kálium ioncsatorna M alcsaládja

KCNN

–

közepes konduktanciájú kalcium ion-aktiválta kálium ioncsatorna N alcsaládja

kNBC

–

veséből izolált nátrium-bikarbonát kotranszporter típus

La3+

–

lantán ion

mAChR

–

muszkarinos acetil-kolin receptor

MaxiK

–

magas konduktanciájú Ca2+-aktiválta K+ csatornacsalád

MEM

–

Minimális esszenciális médium

Mg2+

–

magnézium ion

Mg-ATP

–

magnézium-adenozin-triszfoszfát

MgCl

–

magnézium-klorid

mRNS

–

messenger, hírvivő RNS

MSD

–

membránon átvezető régió

Na+

–

nátrium ion

NaCl

–

nátrium-klorid

NaHCO3

–

nátrium-bikarbonát

NANC

–

nem-adrenerg nem-kolinerg

NBC

–

nátrium-bikarbonát kotranszporter

NBCn1

–

elektroneutrális nátrium-bikarbonát kotranszporter 1-es altípus

NBD

–

nukleotid-kötő régió

NCX

–

nátrium-kalcium kicserélő

NEAA

–

nem esszenciális aminosavak

NGF

–

neurogén növekedési faktor

NH4+

-

ammónium ion

NH4Cl

–

ammónium-klorid

NHE

–

nátrium-hidrogén kicserélő

NHERF

–

nátrium-hidrogén kicserélő szabályozó faktor

NK

–

neurokinin

NKCC

–

nátrium-kálium-2 klorid kotranszporter

NMDG+

–

N-metil-D-glukamin ion

–6–

Rövidítések

NO

–

nitrogén-monoxid

NO3¯

–

nitrát ion

NSF

–

N-etilmaleimid-érzékeny faktor

O2

–

oxigén

PACAP

–

hipofízis adenilil-cikláz aktiváló peptid

Par-C10

–

egy patkány parotisz acináris eredetű sejtvonal neve

PAT

–

putatív anion transzporter

PBS

–

foszfát puffer

PCR

–

polimeráz láncreakció

PDZ

–

glicin-leucin-glicin-fenilalanin aminosav sorrend

pHi

–

intracelluláris pH

PKA

–

protein kináz A

PKC

–

protein-kináz-C

PLCβ

–

foszfolipáz Cβ

PMCA

–

plazmamembránban található kalcium ion ATP-áz

pNBC

–

hasnyálmirigyben azonosított nátrium-bikarbonát kotranszporter típus

PP

–

hasnyálmirigy polipeptid

PYY

–

peptid-tirozin-tirozilamid

P2X

–

egy purinerg receptorcsalád neve

P2Y

–

egy purinerg receptorcsalád neve

R domain

–

szabályozó régió

RNS

–

ribonukleinsav

RT-PCR

–

reverz-transzkriptáz polimeráz láncreakció

RyR

–

rianodin receptor

S. E. M.

–

standard error of mean, az átlag szórása

SK

–

közepes konduktanciájú kalcium ion-aktiválta kálium ioncsatorna

SLC

–

oldott anyagot szállító transzporter család

SLO

–

nagy konduktanciájú kalcium ion-aktiválta kálium ioncsatorna

SNAP

–

NSF kötő fehérje

SNARE

–

SNAP receptor

STE

–

élesztőben kifejeződő ATP-kötő transzporter

–7–

Rövidítések

TASK

–

TWIK-kel (két pórusú gyenge befelé irányuló K+ csatornával) rokon savérzékeny K+ csatorna

TER

–

transzepiteliális ellenállás

t-SNARE

–

target (célpont)-asszociált SNARE

UTP

–

uridin-trifoszfát

VAMP

–

vezikula-asszociált membrán fehérje

VIP

–

vazoaktív intesztinális fehérje

Vm

–

transzepitél potenciálkülönbség

v-SNARE

–

vezikula-asszociált SNARE

2MeSADP

–

2-metiltio-ADP

5-HT

–

5-hidroxitriptamin, szerotonin

–8–

Bevezetés

BEVEZETÉS

Az emésztés folyamatát különböző exogén mirigyek szekrétuma segíti. A szájban a három pár nagy nyálmirigy és a kis nyálmirigyek együttes szekrétuma, a nyál fontos szerepet játszik a táplálék aprításában és lebontásában. A gyomorban a gyomornedv fő feladata a fehérjék emésztését, majd a táplálék a patkóbélbe kerül, ahol a zsírok emulgeálását végző epével, az emésztőenzimeket tartalmazó hasnyállal és a duodenum falában található mirigyek szekrétumával találkozik. Ezután a vékonybél és a vastagbél egész hosszán a bélfal mirigyei váladékot termelnek, segítve a különböző tápanyagok felvételét. A mirigyeket felépítő hámsejtek közös feladata, hogy a táplálék lebontása és az emésztőenzimek

működése

számára

megfelelő

környezetet

biztosítsanak

az

emésztőtraktusban, ugyanakkor óvják a szervezetet ezen emésztőenzimek káros hatásaitól. A mirigyek nem megfelelő működése – akár örökölt betegség (pl. cisztikus fibrózis) akár károsodás (pl. pancreatitis, besugárzás miatt elhalt nyálmirigy acinusok) következtében – súlyos következményekkel járhatnak a mirigyállomány épsége és az emésztés egésze tekintetében (pl. a duodenumba nem kijutó emésztőenzimek a hasnyálmirigyben aktiválódva megemészthetik a mirigyállományt). Ezért nagyon fontos megismernünk az exokrin mirigyek fiziológiás és patológiás működésének molekuláris részleteit is. A nyálmirigyek A nyál termelését három pár nagy nyálmirigy: a fültőmirigy (parotisz), az állkapocs alatti- (szubmandibuláris), és a nyelvalatti (szublingvális) nyálmirigy; és a száj nyálkahártyájában található számtalan kis nyálmirigy végzi (1. ábra). A mirigyszövet alapvetően két sejttípusból tevődik össze: a szekréciós végkészülékből (acinusok), és a kivezetőcső-rendszerből (duktusz). Az acinusok piramis alakú, polarizált sejtek, amelyek egy lument vesznek körül (2. ábra). Sejtmaguk a piramis alapjához közel helyezkedik el, kiterjedt endoplazmás retikulummal és Golgi apparátussal rendelkeznek.

–9–

Bevezetés

A piramis csúcsánál sok érett vagy érőben lévő szekréciós granulum található, amelyekből exocitózissal szabadul fel a raktározott fehérjetartalom.

1. ábra: A nyálmirigyek elhelyezkedése emberben. (forrás: http://3.bp.blogspot.com)

2. ábra: A nyálmirigy sejtszerkezete. (forrás: http://www.nanomedicine.com)

– 10 –

Bevezetés

A duktuszt alkotó henger-, és köbhámsejtek ugyancsak polarizáltak, a nukleusz a bazolaterális oldalhoz közel helyezkedik el, a bazális oldalon sok mitokondriumot lehet látni, szekréciós granulumaik nincsenek. A Thaysen és mtsai által megfogalmazott „kétlépcsős hipotézis” szerint az acinusokban izotóniás, a plazmához nagyon hasonló ion-összetételű elsődleges nyál képződik, mely a duktuszon való áthaladás során hipotóniássá alakul a Na+ és Cl¯ visszaszívása, illetve a vízfelvétel hiánya következtében (1). Az alacsony Na+-koncentráció jelentősége abban rejlik, hogy megnöveli a fehérje-oldékonyságot és csökkenti az ízérző receptorok NaCl iránti érzékenységének küszöbét. A nyálszekréció két funkciót foglal magában: a só- és víztranszportot, valamint a fehérjeelválasztást. A primer nyál termelését végző acinusok granulumainak mérete és összetétele alapján megkülönböztetünk mucinózus és szerózus sejteket. A mucinózus sejtek mucinban és Ca2+-kötő glikoproteinekben gazdag, nagyméretű granulumokat tartalmaznak, míg a szerózus sejtek granulumai kisebbek, és magas amiláz koncentrációjú, elektrolitban gazdag nyálat szekretálnak. A kis és szublingvális nyálmirigyek mucinózus mirigyek, stimulus nélkül is folyamatosan szekretálnak, feladatuk, hogy nedvesen tartsák a száj nyálkahártyáját. A szubmandibuláris mirigy keverten tartalmaz szerózus és mucinózus acinusokat egyaránt, és szintén az alapszekrécióban

játszik

szerepet.

A

parotisz

tisztán

szerózus

mirigy,

az

alapszekrécióban csak kismértékben vesz részt (2), stimuláció hatására azonban nagy mennyiségű, amilázban gazdag nyálat választ el. Stimuláció hatására a nagy nyálmirigyek nyáltermelése 10-20-szorosára is megnő, míg a kis nyálmirigyek kevéssé reagálnak a szekréciós jelekre. Fehérjeszekréció A nyál nem csak a táplálék pépesítésében, az emésztésben, a nyelésben, az ízlelésben, és a beszédben, hanem a nyálkahártya és a fogak épségének védelmében is szerepet játszik (3, 4). A nyálmirigyek a mucin és amiláz mellett immunglobulinokat, lizozimet, peroxidázt, laktoferrint, hisztatint, epidermális (EGF), fibroblaszt (FGF), és idegi (NGF) növekedési faktort, és endorfint is szekretálnak (5, 6). Az acinusok a szekretált fehérjék

– 11 –

Bevezetés

mintegy 85%-át termelik, néhány fehérjét azonban a duktuszok választanak el, például lizozimeket, laktoferrint, szénsav-anhidrázt (7). A nyálmirigy fehérjéi vektoriális transzporton keresztül kerülnek szintézisük helyéről, az endoplazmatikus retikulumból a poszttranszlációs módosító kompartmentekbe (Golgi apparátus, kondenzációs vakuólák), majd a szekréciós granulumokba. A granulumok a sejtek apikális oldalán halmozódnak fel, és exocitózissal ürülnek a lumenbe (8). Az exocitózis mechanizmusa három lépésre tagolható: a granulum dokkolása, majd a granulum és az apikális membrán kapcsolódása, végül a fúzió, amellyel a granulum a lumen felé kinyílik, és a fehérjék kiürülnek a lumenbe. Negyedik lépésként a granulum membránja visszazáródik és elválik az apikális felszíntől. A mechanizmus létrejöttét a granulumok felszínén található SNARE fehérjék (SNAP receptorok), például a VAMP2 (vezikulum-asszociált SNARE, v-SNARE), és az apikális membránban található target membrane SNARE (t-SNARE) fehérjék közötti kapcsolat segíti. Ugyancsak szükség van a G fehérjék és a citoszkeleton segítségére az apikális felszín megközelítéséhez és a dokkoláshoz (8). A folyadék- és ionszekréció mechanizmusa A nyál folyadéktartalmának szekréciója aktív anionszekréciót követő passzív víz és kation áramlás eredménye. Az acinus sejtek bazolaterális membránjában Na+/K+ ATPáz, és K+ csatorna biztosítja a befelé irányuló Na+ gradienst. Stimuláció hatására megnyílnak a bazolaterális membránban található K+, valószínűleg KCNMA1 (SLO1) és KCNN4 (korábban IK1-ként vagy SK4-ként ismert) transzporterek (9, 10), és az apikális oldalon található Cl¯ csatornák, így Cl¯ szekretálódik a lumenbe (9) (3. ábra). Az aniont paracellulárisan követik kationok, Na+ és K+. A víz transzportja paracellulárisan és vízcsatornákon keresztül történik, tehát a folyadékszekréciót az aniontranszport irányítja. Közvetlen Cl¯ felvételt tesz lehetővé egy másodlagos aktív transzporter, a Na+-K+-2Cl¯ kotranszporter (NKCC). „Szekretoros” transzporternek nevezik az NKCC1-es izoformát, amely epitél és nem-epitél sejtekben is előfordul, és a sejttérfogat szabályozásban illetve a szekrécióhoz elengedhetetlen Cl¯-felvételben játszik szerepet (9, 11). Az NKCC1 a kis, elektroneutrális SLC12A transzportercsaládba tartozik, és

– 12 –

Bevezetés

családjának molekuláris szinten leginkább ismert tagja (9, 11, 12). Immunhisztokémiai vizsgálatok kimutatták az SLC12A család kálium-klorid kotranszporter 1-es tagját (KCC1) is nyálmirigy acinus sejtek bazolaterális membránjában, szerepe azonban még nem ismert (9). Cl¯ felvételt tesz lehetővé a Na+/H+ kicserélő (NHE) és HCO3¯/Cl¯ kicserélő együttműködése a bazolaterális membránban. H+ és HCO3¯ leadása mellett Na+ és Cl¯ kerül felvételre (8, 9). Valószínűleg a minden sejtben megtalálható, a sejt pH-jának fenntartásában fontos szerepet játszó NHE1 izoforma látja el ezt a feladatot (9). Nyálmirigy acinusban ezen kívül az NHE2, NHE3 és NHE4 formákat azonosították, ezek közül az NHE2 és az NHE3 az apikális membránban fejeződik ki, az NHE4 funkciója pedig még nem ismert (9). Az anion-kicserélők közül az SLC4 családba tartozó AE2-es és AE4-es izoformát mutatták ki emberi és patkány parotisz acinusok bazolaterális oldalán (9, 10). Az AE2 majdnem minden szövettípusban kifejeződik (13), míg az AE4 valószínűleg csak a nyálmirigy duktuszok bazolaterális membránjában jelenik meg (14), tehát az anionszekrécióban nincs szerepe.

3. ábra: A nyálmirigy acinus iontranszporter-rendszere.

– 13 –

Bevezetés

Az apikális oldalon ciklikus adenozil monofoszfát- (cAMP-), Ca2+-, hiperpolarizáció-, vagy sejtduzzadás-aktiválta Cl¯-csatornák biztosítják az anion kijutását a lumenbe (9). A cAMP-függő CFTR csatornát szubmandibuláris nyálmirigyek acinusában molekulárisan és funkcionálisan is kimutatták (15). A Ca2+-aktivált csatornák közül a CLCA1 (9) és a bestrophin-2

(BEST-2)

(10)

csatornákat

azonosították

nyálmirigyekben.

A

bestrophinokat a Best betegség kutatása során fedezték fel (16). Az eddig azonosított négy izoformáról leírták, hogy klorid csatornaként működnek, és valószínűleg oligomerként jelennek meg a membránban (17). Egér parotisz acinusokon hiperpolarizációra érzékeny CLC-2 (18) és CLC-3 (19) csatornákat is azonosítottak. A HCO3¯ szekréció pontos mechanizmusa még nem ismert. Bazolaterális oldalon HCO3¯ felvételét segítheti a karboanhidráz enzim és az NHE1 közös munkája. A karboanhidrázok (CA) cink-metalloenzimek, amelyek a CO2 és H2O reakcióját katalizálják (20). A reakció során HCO3¯ és H+ keletkezik. A H+-t Na+/H+ kicserélő juttatja ki a sejtből (21). Az enzimnek több izoformáját azonosították, amelyek között található citoplazmában szabadon, membránhoz kötötten, vagy szekretált izoenzim is (20). Az eddig azonosított 10 izoenzim közül a CA VI jelenlétét igazolták nyálmirigy sejtekben, amely kizárólag a parotisz és szubmandibuláris mirigyek szerózus sejtjeiben expresszálódik, és szekretálódik a nyálba is (22). Az acinusok apikális felszínén a HCO3¯ szekréciója egyes publikációk szerint a CFTR csatornán keresztül is megvalósulhat (23-25), azonban pontos leírás még nem áll rendelkezésre a transzport mechanizmusáról. A víz szekréciója paracellulárisan, a szoros kapcsolatokon keresztül (26) és transzcellulárisan (3) valósul meg. A sejten keresztül történő kicsi és erősen poláros vízmolekulák áramlását aquaporin (AQP) fehérjék segítik. Az AQP család 12 tagja közül az AQP1, AQP3, AQP5, és AQP8-as izoformát azonosították emlős nyálmirigyben (3, 27), amelyek közül az AQP5 az acinusok apikális membránjában fejeződik ki (3, 28, 29). Az AQP1-es változatát a kapillárisok endotél felszínén mutatták ki, míg az AQP8 a mioepitél sejteken és a nyálmirigy acinusok bazolaterális felszínén jelenik meg (30). Acinusok bazolaterális felszínén mutatták ki az AQP3-as csatornát is, de funkcióját még nem sikerült megfejteni (27). Az izozmotikus primer nyálból Na+ és Cl¯ szívódik fel a duktuszok apikális membránjában található epiteliális Na+-csatornán (ENaC) és Cl¯ csatornákon keresztül.

– 14 –

Bevezetés

Cl¯/HCO3¯ és Na+/H+ kicserélők (valószínűleg NHE3) (9) ugyancsak találhatók a duktusz sejtek apikális membránjában (31). A bazolaterális oldalon klorid csatorna és Na+/H+ kicserélő (NHE2) (9) kifejeződését mutatták ki (31) (4. ábra). A duktusz sejtekben nem találhatók vízcsatornák, így vizet nem vesznek fel, a nyál hipozmotikussá és lúgossá válik. Amikor a nyáltermelődés fokozódik, a nyál ionösszetétele egyre hasonlóbbá válik a plazmáéhoz. Ez a jelenség annak köszönhető, hogy a duktuszokon gyorsan áthaladó primer nyál összetételét a duktuszok kevésbé képesek megváltoztatni, mint nyugalmi állapotban.

4. ábra: A nyálmirigy duktusz iontranszport-rendszerének modellábrája.

A szekréció szabályozása A nyálelválasztás kizárólag az autonóm idegrendszer szabályozása alatt van, intenzitását az acinus sejtek szekréciója szabja meg. Mivel a duktuszok inkább felszívnak ionokat a primer nyálból, mint szekretálnak, illetve víztranszportra nem képesek, a nyál mennyiségét nem képesek megváltoztatni. Az acinus sejtek bazolaterális membránjában

– 15 –

Bevezetés

M3 muszkarinos acetil-kolin- (mACh), β2- és α-adrenerg-, hisztamin- (H2R), vazoaktív intesztinális peptid- (VIP), és neurokinin1 (NK1) (3) és purinerg (32) receptorokat mutattak ki. A nyáltermelés elsősorban a táplálékfelvétel valamelyik mozzanatával kezdődik, például látási, szaglási, ízérző receptorok, vagy a szájüreg mechanoreceptorai indítják el a nyálelválasztási reflexet. A paraszimpatikus rendszer idegrostjaiból kiszabaduló mACh receptorokon fejti ki hatását, és az 1,4,5-inozitol-triszfoszfát (IP3)/diacil-glicerol (DAG) rendszert aktiválva Ca2+ jelet vált ki a sejtekben, amely egy folyadékban gazdag, bő nyáltermelést idéz elő. A paraszimpatikus rendszer aktiválása vazodilatációval is jár, amelyet egy nem adrenerg-nem kolinerg (NANC) transzmitter, valószínűleg a VIP vált ki. A szimpatikus idegrendszer az acinus sejtek bazolaterális membránjában kimutatott β2 receptorokon keresztül hat a nyálszekrécióra. A noradrenalin a sejten belül a ciklikus cAMP szint emelkedését váltja ki, amelynek hatására kis térfogatú, viszkózus, magas fehérje-koncentrációjú nyál termelődik.

5. ábra: A nyálmirigyben előforduló P2 receptorok működési mechanizmusai. ADP, adenozin-difoszfát, ATP, adenozin-trifoszfát, UTP, uridin-trifoszfát, 2MeSADP, 2-metiltio-ADP, PLC-β, foszfolipáz-Cβ, DAG, diacil-glicerol, PKC, protein-kináz-C, IP3,

inozitol-triszfoszfát,

ER,

endoplazmatikus

retikulum,

BzATP,

3-O-(4-

benzoil)benzoil-ATP, EtBr, etídium-bromid. (módosítva (32)–ből)

Nyálmirigyeken kimutattak purinerg receptorokat is. A ligand-függő ioncsatornaként működő P2X család P2X7 és P2X4 tagját, valamint a Gq-fehérjét kötő P2Y család P2Y1 és P2Y2 tagját azonosították (32). Mindegyik receptortípus emeli az intracelluláris Ca2+ szintet. A P2X receptorok ATP jelenlétében nem szelektív ioncsatornaként működnek,

– 16 –

Bevezetés

Na+-t és Ca2+-t engednek be a sejtbe. Stimulálják az NHE és NKCC működését és az amiláz szekréciót, valamint szabályozzák a sejttérfogatot (33). A P2X7 receptor homomert képez (33), és 900 Da méretig képes molekulákat is átengedni, így akár az etídium-bromidot is átereszti (5. ábra). A Mg2+ a P2X7 működését gátolja, a P2X4 receptorra azonban nincs hatással (32). A P2Y receptorok az IP3/DAG rendszer aktiválásával fejtenek ki Ca2+-szint emelkedést (32). A receptorok endogén ligandjai az ATP és egyéb nukleotidok, amelyek autokrin és parakrin módon, esetleg ACh, noradrenalin, VIP vagy Y neuropeptid mellett másodlagos neurotranszmitterként szabadulnak fel (33). A szimpatikus és paraszimpatikus idegrendszer a nyálelválasztás esetében kiegészítik egymást.

A

paraszimpatikus

Ca2+-jel

fokozható

cAMP-szint

emelő

ágens

alkalmazásával. Sikerült kimutatni, hogy ez a hatás a protein kináz A-nak (PKA) köszönhető, amely foszforilálja az IP3 receptorokat (34). A két rendszer összefonódása ugyanakkor nem csak a Ca2+-jel erősítésében, hanem szigorú szabályozásában is jelen van. A cAMP serkenti a Ca2+ clearance-t is a parotisz acináris sejtekben. Hatása a plazmamembránban található Ca2+ ATP-áz (PMCA) serkentésével valósul meg (35). A PMCA egy minden sejtben megtalálható, Ca2+-ot erősen kötő, P-típusú ATP-áz, amely valószínűleg fő szabályozója a sejten belüli nyugalmi Ca2+ koncentráció fenntartásának. Négy PMCA kódoló gént (PMCA 1-4), és ezek néhány szövet-specifikus splice variánsát sikerült azonosítani és klónozni. A Ca2+-szint különböző térbeli és időbeli emelkedései szerteágazóan befolyásolják a sejt működését. Ezek az egyszerre térbeli és időbeli változások számos szignálátviteli útvonal következetes aktiválásának eredményei. Például a cAMP szint emelése, amely a PKA aktiválását eredményezi, közvetlenül befolyásolja a fő Ca2+-transzport fehérjéket számos nem-excitábilis sejtben. A parotisz acináris sejtekben az elégséges folyadékszekréció elengedhetetlen feltétele a szigorú Ca2+-szint szabályozás. Az apikális Ca2+-aktiválta Cl¯-csatornák és a bazolaterálisan található Ca2+-függő K+csatornák a folyadéktranszport fő irányítói.

– 17 –

Bevezetés

A hasnyálmirigy A hasnyálmirigy a gyomor mögött helyezkedik el, szekrétumát, a hasnyálat, az őt körülölelő patkóbélbe üríti (6. ábra). Jelentős homogenitást mutat a nyálmirigyekkel szerkezetileg és funkciójában egyaránt. Összetett mirigy, amely külső elválasztású egységei között belső elválasztású szigeteket, Langerhans-szigeteket is tartalmaz.

6. ábra: A hasnyálmirigy szerkezete és elhelyezkedése. (forrás: http://www.gopetsamerica.com)

Endokrin részei főként inzulint és glukagont választanak el, amelyek a vérbe ürülnek, és a vér glukóz-tartalmát szabályozzák. Exokrin funkciója emésztési enzimek és megfelelő pH-jú nedv termelése, amely a gyomorból a patkóbélbe kerülő táplálék savasságát semlegesíti. A mirigyet kötőszöveti tok veszi körül, amely a mirigyállományba is benyúlik, és azt lebenykékre osztja. Az exokrin állomány a teljes mirigy mintegy 80%át teszi ki. Elrendezése a nyálmirigyhez hasonló tubuloacináris rendszer, mely a lument körülvevő piramis alakú acinusokból és kivezetőcsövek hálózatából, köbhám sejtekből tevődik össze. A szőlőfürtszerűen rendeződő acinusok granulumokban tárolják az emésztőenzimeket, és exocitózissal juttatják azokat a lumenbe. Az acinusok termékét a duktuszfalat képező sejtek bikarbonát ionban gazdag, nagymennyiségű folyadékkal egészítik ki. A szekrétum előbb a centroaciner, majd az interkaláris duktuszba jut, végül az egyre nagyobb duktuszokon keresztül a fő hasnyálmirigy vezetéken (ductus pancreaticus major) keresztül a patkóbélbe kerül.

– 18 –

Bevezetés

A fehérjeszekréció mechanizmusa A hasnyálmirigyben termelődnek a vékonybélben végbemenő lebontó folyamatokhoz szükséges emésztőenzimek. A hasnyálmirigy acinus sejtek proenzim-, vagy megkötött formában termelnek tripszinogént, kimotripszinogént, proteázokat, amilázt, lipázokat, foszfolipázokat, nukleázokat, amelyek a különböző tápanyagok (fehérjék, szénhidrátok, zsírok, és nukleinsavak) lebontását végzik a patkóbélben, és a vékonybél egész hosszán. A hasnyálmirigy acinusai a nyálmirigyekhez hasonlóan zimogén granulumokban koncentráltan tárolják a termelt enzimeket. Hogy az enzimek az őket körülvevő sejteket ne bontsák, proenzimként vagy Ca2+-hoz, egyéb többértékű kationhoz kötötten halmozódnak fel a sejtben. Aktivációjuk csak a duodenumban valósul meg, a bélfalsejtek által termelt enteropeptidáz és a tripszin autokatalitikus kaszkádon keresztül. A korai, hasnyálmirigyen belüli tripszin-autoaktivációt az ugyancsak szekretált tripszin inhibitor akadályozza meg. A zimogén granulumok az acinussejtek apikális felszínéhez közel halmozódnak fel, és onnan neurogén vagy hormonális jelre ürül tartalmuk a lumenbe. Hasonlóan a nyálmirigyeknél leírtakhoz, a vezikulumok dokkolnak az apikális membránhoz, fúzionálnak, a fehérjék a vezikulumból a lumenbe kerülnek, majd a vezikulum visszazáródik és elválik a felszíntől (36). Folyadék- és elektrolitszekréció A hasnyálmirigy másik fő feladata az enzimszekréció mellett, hogy a szekretált enzimek számára optimális, enyhén lúgos pH-jú közeget biztosítson a patkóbélben. A gyomor felől érkező erősen savas táplálék lúgosítására ezért egy nagy, akár 150 mM HCO3¯ koncentrációjú folyadékot termel (37), amely a patkóbél falában található Brunner mirigyek segítségével képes a tápanyag körülbelül 8-as pH-ra való beállítására. Az emberi hasnyálmirigy naponta mintegy 2,5 liter folyadékot termel, ezt a feladatot a duktuszfalat képező sejtek végzik. A duktusz sejtek aktív, bazolaterális-luminális irányú aniontranszportot folytatnak, és ezt a kationok paracellulárisan, a víz transzcellulárisan, vízcsatornákon keresztül, passzívan követnek. Ez az aktív anionszekréció főként Cl¯ és HCO3¯ transzportjából tevődik össze. A sejtek bazolaterális oldalán a Na+/K+ ATP-áz és

– 19 –

Bevezetés

a K+ csatorna teremtette befelé irányuló Na+-gradiens segítségével, másodlagos aktív transzporttal kerülnek felvételre az anionok. Közvetlen Cl¯-felvételt tesz lehetővé a bazolaterális membránban található Na+-K+-2Cl¯ kotranszporter (NKCC). Hasnyálmirigyben az NKCC1-es izoforma expresszálódik, jelenlétét egérben, patkányban (38) és különböző emberi sejtvonalakban is igazolták (39, 40). Epitél és nem epitél sejtekben is expresszálódik, és a sejttérfogat szabályozásában is szerepet játszik (11, 41). Cl¯ áramlik a sejtbe a Na+/H+ kicserélő és bazolaterális anion-kicserélők együttműködésével is. Ebben az esetben a Na+/H+ kicserélőn keresztül Na+, és az anionkicserélőn keresztül Cl¯ áramlik a sejtbe, míg H+ és HCO3¯, azaz víz és szén-dioxid áramlik ki onnét. A Na+/H+ kicserélők 1-es altípusa (NHE1) minden sejtben megtalálható, így a hasnyálmirigy duktusz sejtekben is, az intracelluláris pH szabályozás fontos eleme (42). Anion-kicserélők jelenlétét igazolták patkányban (42), és tengerimalacban (43). A megfigyelések szerint a bazolaterális oldalon működő anionkicserélők

konstitutívan

működnek.

CFPAC-1

emberi

hasnyálmirigy

duktusz

sejtvonalon sikerült kimutatni, hogy az AE2 izoforma működik a bazolaterális membránban (44). A HCO3¯ felvétel elsősorban a Na+-HCO3¯-kotranszporteren (NBC) keresztül valósul meg, amely másodlagos aktív transzportként Na+ mellett HCO3¯-t juttat a sejtbe. A hasnyálmirigyben a pNBC1-es izoformát azonosították, amely az SLC4 családhoz tartozik (45). A vesében expresszálódó kNBC1-es izoformától szerkezetileg az Nterminusban különbözik (46). Valószínűleg egy Na+ mellett két HCO3¯-t transzportál (42). A legújabb kutatási eredmények szerint az IP3-mal együtt felszabaduló IP3receptor kötő fehérje (IRBIT) aktiválni képes az NBC transzportert (47). A nyálmirigyekhez hasonlóan HCO3¯ felvétel valósul meg a karboanhidráz enzim és a Na+/H+ kicserélő közreműködésével is. A hasnyálmirigy intra- és interlobuláris duktuszokon (48) és a Capan-1 sejtvonalon (49) a citoplazmában működő CA-II izoenzimet mutatták ki. A membránhoz kötött CA-IX és CA-XII változatot acinuson és duktuszon is kimutatták (50). Az anionszekrécióval egyidőben K+ csatornák nyílnak meg a bazolaterális oldalon. A cAMP, a fehérje foszforilációján keresztül, valószínűleg MaxiK csatornákat nyit meg.

– 20 –

Bevezetés

Emellett feltételezik a pH- és sejttérfogat-érzékeny KCNK5 (más néven TASK2) és Ca2+-függő KCNN4 csatornák jelenlétét is (51). Apikális oldalon a Cl¯ főként a CFTR csatornán keresztül hagyja el a sejtet, a potenciál grádienssel megegyező irányban. A csatorna mutációi okozzák a cisztikus fibrózis nevű örökletes betegséget, amelynek előfordulási esélye 0,04% körül mozog a fehér népesség körében (52). A transzporter felépítését, működését és kapcsolatait széleskörűen vizsgálták.

7. ábra: A CFTR csatorna domain-szerkezete. MSD, membránon átvezető régió; NBD, nukleotid-kötő régió; R, szabályozó régió; PKA, cAMP-függő protein kináz. (forrás: (54))

A fehérje egy 250 kilobázisból álló gén terméke. Szerkezete leginkább a multidrogrezisztencia fehérjéhez és egy élesztőproteinhez, az STE6-hoz hasonlít, amelyek mindegyike az ATP-kötő transzportfehérjék szupercsaládjához tartozik (53). Két hidrofób részekben gazdag régiót tartalmaz, mindkét részben 6 transzmembrán szegmenssel. Két ATP-kötő motívumot (NBD, nukleotid-kötő domain) tartalmaz, amelyeket egy szabályozó szegmens (R domain) köt össze (7. ábra). Az R domainen több foszforilációs hely és töltéssel rendelkező aminosav található. A csatorna egyértelműen anion-csatornaként működik. Br¯-ra és Cl¯-ra nézve körülbelül azonos mértékben permeábilis, a jodid már nem jut át a póruson (54). A többatomos ionok

– 21 –

Bevezetés

közül a Cl¯-nál könnyebben jut át a póruson a NO3¯, de a kloridnál kevésbé engedi át a HCO3¯, formát, acetát ionokat.

8. ábra: A hasnyálmirigy kivezetőcsövek ionszekréciójában szerepet játszó transzporterek.

Nagyobb molekulák, mint a piruvát vagy a propanoát, nem jutnak át a csatornán (55). A csatorna megnyílásához Mg-ATP jelenléte, és a csatorna foszforilált állapota szükséges. Az NBD domainekhez kötődő ATP-t a fehérje hasítja, de magához az iontranszporthoz nincs szükség ATP-re. Az R domainen megtalálható foszforilációs helyeken a PKA foszforilálja, és ezzel a kinázok-foszfatázok egyensúlya a sejtben szigorú szabályozást biztosít (54). Újabb kutatások szerint az IRBIT az NBC mellett a CFTR csatornát is képes aktiválni, így ez a molekula egy bazolaterális-luminális oldalak közötti kommunikációt tesz lehetővé (47). A CFTR mellett más Cl¯-csatornák is működnek a hasnyálmirigy duktusz sejtjein, ezek molekuláris azonosítása azonban még ma is folyik. A CLC-2-es és a Ca2+-aktiválta Cl¯csatornák jelenléte a legvalószínűbb (56). Marsey és munkatársai bestrophin (Best) fehérjéket mutattak ki CFPAC-1 emberi hasnyálmirigy duktusz sejtvonalon. Mind a négy izoforma expresszióját sikerült kimutatniuk, azonban a membránban csak az emberi bestrophin 1-es fehérje (hBest-1) jelenik meg (57).

– 22 –

Bevezetés

További anion-transzporterek az apikális felszínen az anion-kicserélők, amelyek a Cl¯csatornákon kijutott kloridot felvéve HCO3¯-t juttatnak a lumenbe. A CFTR és az anionkicserélők szoros kapcsolatban állnak, a CFTR aktivációja serkenti az anion-kicserélők aktivitását is (42). Valószínű az SLC26 családba tartozó PAT-1 (putatív aniontranszporter-1, SLC26A6) és az SLC26A3 jelenléte a hasnyálmirigy duktuszok apikális membránjában (58, 59). Az SLC26A6-ról kimutatták, hogy ugyanolyan PDZ domaineket tartalmaz, mint amelyeket a CFTR-ről leírtak (60), következésképpen a CFTR-hez hasonlóan a PDZ domainekkel rendelkező NHERF és E3KARP scaffold fehérjékhez kapcsolódik (42). Mindkét SLC26 izoforma elektrogén, az SLC26A3 2:1 vagy nagyobb arányban cserél Cl¯-t HCO3¯-ra, míg az SLC26A6 esetén ez az arány 1:2 vagy kevesebb. Ez a megfigyelés vezetett ahhoz a feltételezéshez, hogy az SLC26A6 a proximális duktuszokban, a másik izoforma inkább a nagyobb duktuszok falában található. Mivel az anion-kicserélők a potenciál grádiensnek megfelelően szállítanak ionokat, és működésük megfordulni is képes, ezért valószínű, hogy nagyobb HCO3¯ koncentrációknál működésük gátolt (43). Egyes fajokban és a CFPAC-1 humán sejtvonalban igazolták, hogy a nagyobb duktuszok apikális oldalán is megjelenik NHE aktivitás (21, 42). Valószínűleg NHE3 expresszálódik az apikális felszínen, amely az NHE1 transzporterhez képest kevésbé érzékeny az HOE-694 gátlószerre (42). Feladata feltehetően nyugalmi állapotban a HCO3¯-szekréció szabályozása. A CFTR aktiválása PDZ domainen keresztül az NHE3 működését gátolja (42). Egér hasnyálmirigyben kimutatták az NBCn1 transzporter és a CFTR csatorna kolokalizációját (42). Működését az NHE3-hoz hasonlóan az anionszekréció fokozása gátolta (42). A víztranszport része minden folyadékszekréciónak. A hasnyálmirigyben az acinusok és duktuszok egyaránt szekretálnak, és mindkét folyamat része a vízszekréció is. Kizárólag az acinusok apikális membránjában találtak AQP8 kifejeződést, habár ezen csatornák jelentősége kétséges (30, 61). A kisebb duktuszok bazolaterális és apikális felszínén megjelenik az AQP1 (62), a nagyobb duktuszokban azonban már nincs jelen (61). Az interkaláris duktuszok apikális felszínén az AQP5 is megjelenik, és ez a transzporter a nagyobb duktuszokban is kifejeződik (61) (8. ábra).

– 23 –

Bevezetés

A szekréció szabályozása A hasnyálmirigy exokrin szekréciója neuronális, hormonális és parakrin befolyás alatt áll. Több gasztroenterális hormon és az idegrendszer (főként a paraszimpatikus idegrendszer) szabályozza a működését. Az emésztőrendszerben kialakuló szekréciós válasz a kiváltó ingerek szerint három főcsoportba osztható. A cefalikus fázisban a szaglási, ízlelési és látási, gasztrikus fázisban valószínűleg a gyomorfal mechanikus ingerlése, míg az intesztinális szakaszban a tápanyag duodenumba kerülésével a lebontott tápanyagok aktiválják kolinerg stimuláción keresztül a mirigyekben az enzimszekréciót. A hasnyálmirigy szekréciójára legerősebb ingerként a duodenumba jutott, részlegesen lebontott tápanyagok szolgálnak (63). Az efferens idegvégződésből ACh, gasztrointesztinális releasing fehérje (GRP), és VIP szabadul fel, és serkenti a fehérjeszekréciót (64). A szimpatikus idegrendszer gátló hatása indirekt úton, a hasnyálmirigyet ellátó erek szűkítésével jön létre (65). Közvetlen szimpatikus idegvégződések is találhatók a hasnyálmirigy duktuszokon, amelyek különböző fajokban különbözőképpen hatnak az elválasztásra. A β-adrenerg utak aktivációja kutyában, macskában gátolja, patkányban serkenti a HCO3¯ szekréciót (65). A peptiderg idegvégződésekből felszabaduló VIP, GRP, nitrogén-monoxid (NO) és hipofízis adenilil-cikláz aktiváló peptid (PACAP) serkenti, a P anyag, kalcitonin génhez kapcsolt fehérje (CGRP) és az YY peptid gátolja a duktusz folyadékszekrécióját (65). A VIP legfőbb hatása az erek kitágítása, így a hasnyálmirigy sejtek vérellátásának segítése. A NO, PACAP és a bombezin-analóg GRP a szekretin- és CCK-hatás közvetítésében, a P anyag, YY peptid és CGRP a szekréció negatív feedback mechanizmusában játszik szerepet (66). A vegetatív idegrendszer befolyása mellett ismert sok hormon természetű anyag jelentősége is a regulációban: számos tanulmány igazolta, hogy a hormonális rendszerben történt változások jelentős hatással vannak a mirigysejtek működésére endokrin és parakrin módon egyaránt (66, 67). A szekretin, kolecisztokinin (CCK) és motilin gasztrointesztinális hormonok, a neurotenzin és a hasnyálmirigy Langerhans szigeteiből származó inzulin serkenti a hasnyálmirigy működését. A szekretin a vékonybél villusaiban található S-sejtek terméke. Felszabadulását főleg a duodenális pH változás, az epe, és a szérum

– 24 –

Bevezetés

olajsavtartalma szabályozza. A szekretin, a vele egyidőben szecernált CCK és ACh jelenlétében, a hasnyálmirigy folyadékszekréciójának fő szabályozója, hatását a centroaciner és duktusz sejteken a cAMP-útvonal serkentésével fejti ki (37).

A

kolecisztokinin felszabadulását főként az emésztés során keletkező aminosavak és zsírsavak váltják ki. A hasnyálmirigyre a CCK1 receptoron fejti ki hatását (37). A CCK1 receptor a PLCβ aktiválásával intracelluláris Ca2+-szint emelkedést vált ki. A CCK serkenti az acinusok szekrécióját, és szabályozza a hasnyálmirigy növekedését (68). Fontos neurális hatása, hogy csökkenti az étvágyat (69). A motilin a vékonybél falában található M sejtek terméke. Valószínűleg ez a hormon tartja fent a hasnyálmirigy-ürülés ciklikusságát az étkezések között (37, 66). A neurotenzint a vékonybélfalban elhelyezkedő enteroendokrin sejtek termelik, főként a zsírdús táplálék hatására. A hasnyálmirigy fehérje- és folyadékelválasztását is serkenti (66). Az inzulin helyi hatása valószínűleg a szekretin és CCK-érzékenység fenntartása (66). A szomatosztatin, peptid-tirozin-tirozilamid (PYY), szerotonin, pankreasztatin, ghrelin, leptin és a hasnyálmirigy polipeptid (PP) gátolja a hasnyálmirigy enzimtermelését (66, 70). A szomatosztatin a szekretin és a CCK elválasztását is csökkenti, és parakrin módon a hasnyálmirigy szekrécióját közvetlenül is gátolja (66). A Langerhans-szigetek és a bélfalsejtek terméke (66). Nem ismert, hogy hatását közvetlenül a hasnyálmirigyen vagy a bélfal sejteken fejti ki (70). A Langerhans-sziget sejtek másik terméke a PP, amelynek a PYY-hoz hasonlóan valószínűleg a posztprandiális negatív visszacsatolásban van szerepe (70). A szerotonin 5-HT1P receptoron keresztül gátolja az amiláz elválasztást, míg 5-HT3 receptoron keresztül stimulálja folyadék- és ionszekréciót (67). A ghrelint mint „éhséghormon”, a leptint mint „jóllakottság hormon” lehet definiálni (37, 71). A ghrelin szintje étkezések közben emelkedik, és étkezés hatására lecsökken, míg a leptin szintje az étkezés alatt emelkedik, mindkét hormon a hipotalamuszban hat (71). Hasnyálmirigy acináris és duktális sejtekben is kimutattak mRNS szinten P2 purinerg receptorokat (33). A receptorhoz kötődő ATP felszabadulhat másodlagos neurotranszmitterként az idegvégződésekből, a Langerhans sziget sejtjeiből, vagy az acinusok zimogén granulumaiból (33). Az acinusok felszínén egyedül az alacsony szinten jelenlévő P2X4 receptort sikerült kimutatni. Ezekben a sejtekben tehát valószínűleg nincs autokrin aktiváció, ami az emésztőenzimek korai aktivációjához vezethetne (33).

– 25 –

Bevezetés

A duktuszok szekrécióját az acinusok szekretumában található ATP és adenozin apikális receptorokon is serkenti (65). Felszínükön számos P2 receptort sikerült kimutatni, így a P2Y2, P2Y4, P2X4 és P2X7 receptorokat. Az idegvégződésekből, a szigetsejtekből, az acinusok bazolaterális transzportereitől vagy szivárgásából származó interstíciális ATP, valószínűleg P2Y2 vagy P2Y4 receptoron keresztül, gátolja a bazolaterális K+ csatorna működését, és ezen keresztül az anionszekréciót (33). Az apikális oldalon valószínűleg P2X receptorok expresszálódnak. Stimulációjuk elindítani nem képes a szekréciós folyamatokat, de erősítik a szekretin-kiváltotta ionszekréciót (33). Az acinusok ATP felhalmozása és szekréciója a granulumokból, és a duktuszokban megfigyelt membránspecifikus receptor expresszió arra enged következtetni, hogy az ATP lehet az acinusok és duktuszok közötti információáramlás hírvivője (33).

– 26 –

Célkitűzések

CÉLKITŰZÉSEK

Vizsgálatainkban a következő kérdésekre kerestünk választ: 1. A Par-C10 parotisz acináris sejtvonalban van-e transzepiteliális HCO3¯ szekréció, és ha igen, milyen mechanizmusok segítik. 2. Par-C10 sejtekben az intracelluláris Ca2+-szintet milyen mechanizmusok szabályozzák. 3. HPAF emberi hasnyálmirigy adenokarcinómából származó, duktális eredetű, funkcionális CFTR-t nem tartalmazó sejtvonalban létrejön-e transzepiteliális HCO3¯ transzport, és ha igen, milyen transzporterek segítségével valósul meg.

– 27 –

Anyagok és módszerek

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

Felhasznált sejtvonalak Egészséges emberi mirigyszövetet nagyon nehéz gyűjteni funkcionális vizsgálatok számára, ezért vizsgálati modellként kézenfekvő lehet olyan nyálmirigyből és hasnyálmirigyből származó sejtvonalak alkalmazása, melyek polarizált monolayer-ként növekednek, és fenotípus tekintetében a natív szövetre rendkívül hasonlítanak. Méréseinket jól differenciált sejtvonalakon végeztük, amelyek lehetőséget adtak az alapos vizsgálatokra. Kísérleteinkhez a patkány eredetű, parotisz acinusból származó, immortalizált sejtvonalat, név szerint Par-C10 sejteket és egy hasnyálmirigyből izolált duktális adenokarcinómából kitenyésztett sejtvonalat (HPAF) választottuk. Mindkét sejtvonal jól differenciált és stabilan fenntartható sejttenyészetet alkot, és Transwell membránra ültetve polarizált monolayer-ként növekszik (72, 73). A Par-C10 sejtvonal volt az első olyan nyálmirigy sejtvonal, amely az immortalizációt követően is megtartotta acináris tulajdonságait (72, 74). Kimutatták, hogy elektrolitokat szekretál és reagál adrenerg illetve muszkarinerg stimulusokra (72, 75). Az anionszekrécióhoz elengedhetetlen transzporterek mRNS-eit expresszálja (72). Az HPAF sejtvonal polarizált, jól differenciálódott monolayer-t alkot. Magas szinten expresszál funkcionális G-fehérje kapcsolt purinerg (P2Y) és bombezin (GRP) receptorokat (76). Habár mRNS szinten kimutatható az HPAF sejtekben CFTR, a fehérje kis mértékben expresszálódik, és valószínűleg kis mértékben járul hozzá az ionszekrécióhoz (73). Ennek ellenére ezek a sejtek Ca2+-aktiváló stimulusok hatására jelentős mértékű Cl¯ szekrécióra képesek, amely valószínűleg a Ca2+-aktiválta Cl¯csatornákon keresztül valósul meg (73). Keveset tudunk az HPAF sejtek HCO3¯ transzportjáról, és hogy ezek a sejtek milyen mértékben képesek HCO3¯-t szekretálni.

– 28 –


Anyagok A Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture Ham F-12 (DMEM/F-12) 1:1 arányú keverék médiumot, a foszfát-puffer (PBS) oldatot, 0,25%-os tripszin-EDTA oldatot,

nem esszenciális

borjúszérumot acetoximetil

(FBS), észtert

a

aminosav

keveréket

(NEAA),

L-glutamint,

fötális

2’,7’-bisz-(2-karboxietil)-5-(és-6)-karboxi-fluoreszcein-

(BCECF-AM),

4,4’-diizotiocianatodihidrostilbén-

2,2’-

diszulfonsavat (H2DIDS), 4,4’-dinitrostilbén-2,2’-diszulfonsav (DNDS) és a Fura-2AM-et az Invitrogen-től vásároltuk (most Life Technologies, Carlsbad, CA). A Minimal Essential Medium (MEM) tápoldat, penicillin-streptomycin keverék, 4-(2-hidroxietil)1-piperazinetánszulfonsav (HEPES), 5-(N-etil-N-izopropil) amilorid (EIPA), 3metilszulfonil-4-piperidinbenzoil-guanidin (HOE-694), nigericin, bumetanid, forskolin, ATP, Na-piruvát, ciklopiazonsav (CPA) a Sigma cégtől származott (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). Oldatok tartalma A HCO3¯-mentes, HEPES-pufferelt oldat a következőket tartalmazta: 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glukóz, 10 mM HEPES; az oldatot 100% oxigénnel buborékoltattuk át. A HCO3¯-tartalmú puffer a következőket tartalmazta: 116 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 D-glukóz, 5 mM HEPES, és 95% O2-5% CO2 tartalmú gázzal buborékoltattuk át. A NH4+-tartalmú oldatokban az ozmolaritás megtartása érdekében a Na+ mennyiségét az NH4+ mennyiségének megfelelően csökkentettük. A Na+-mentes oldatok ekvimoláris mennyiségű N-metil-D-glukamin iont (NMDG+) tartalmaztak Na+ helyett. A Cl¯ mentes oldatokban glutonát ionnal helyettesítettük a Cl¯-t.

– 29 –


Módszerek Sejttenyészet fenntartása, előkészítése a méréshez A sejtvonalak tenyésztése minden esetben 37ºC-os, párásított, 5% CO2-vel dúsított levegőn, tenyésztőszekrényben történt. HPAF A sejtek az ATCC-től származtak. Tápoldatuk L-glutamint és NEAA-t, Na-piruvátot, 10% FBS-t, 100 NE/ml penicillint és 1 μg/ml streptomycint tartalmazó MEM. A sejteket hetente 1:10 arányban passzáltuk. Par-C10 A Par-C10 patkány parotisz sejtek Dr. David Quissel (School of Dentistry, University of Colorado Health Sciences Center, Denver) nagylelkű adománya volt. DMEM/F-12 1:1 arányú keverék tápfolyadékban tenyésztettük a sejteket, melyet 10% fötális borjúszérummal, 0,1 μM retinsavval, 2 nM trijódtironinnal, 0,4 μg/ml hidrokortizonnal, és 100 IU/ml penicillinnel, 1 μg/ml streptomycinnel egészítettünk ki. A sejteket hetente 1:50 arányban passzáltuk. Kiültetés A sejteket egy poliészter membrán (Costar, Transwell-CLEAR) felületére ültettük, 500k sejtszámmal. Tápfolyadékukban, steril körülmények között inkubáltuk őket. A tápfolyadékot 2 naponta cseréltük. A konfluens monolayer létrejöttét a transzmembránrezisztencia (TER) rendszeres mérésével ellenőriztük. A kísérleteket 10-12 nap elteltével, HPAF sejtek esetén 1000 /cm2, Par-C10 sejteknél 3000 /cm2 ellenállás elérésekor végeztük el.

– 30 –


Molekuláris biológia A vizsgált sejtvonalakból Qiagen RNeasy Plus kittel (Qiagen, Düsseldorf, Németország) RNS-t izoláltunk, és ebből reverz-transzkriptáz (RT) segítségével kópia DNS-eseket (cDNS) hoztunk létre. Polimeráz láncreakció (PCR) módszerrel vizsgáltuk a sejtekben a transzporter gének mRNS expressziós szintjét. A reakciót Diamond Mixszel készítettük (Bioline Co., London, UK), és magunk-tervezte primer párokkal dolgoztunk (1. táblázat). A PCR reakció Eppendorf Mastercycle Gradient PCR készülékben zajlott (Eppendorf AG, Hamburg, Németország), a primereknek és a DNS polimeráznak megfelelően írt program alapján. A termékeket agaróz gélben, etídiumbromid jelenlétében elektroforézissel szétválasztottuk, és méret alapján azonosítottuk. 1. táblázat: A különböző patkány transzporterek kimutatásához használt primerek. Vizsgált

Termék

Bal primer (3’)

Jobb primer (5’)

CFTR

TTATGACATTCACACCCAGCTC

TGTTAAGAATCCCACCTGCTTT

609 bp

NBC1

AGGAGAACAAGCTGAGGAAGG

CCACACCCATGTAGAGGAAGA

552 bp

NKCC1

TCTGCTGCATAGTGATGTTCG

ATCCGAGGACAAGTGTGTTTG

498 bp

NKCC2

AGGAAAGCTCCCTTGTCTGAG

GACTGCTTCCAGTTCTGCATC

732 bp

NHE1

GCAACTGGAGCAGAAGATCAC

CTGAGGCAGCGTTGTATTCTC

369 bp

NHE2

CATCCAGACCGTAGACGTGTT

TCCCTGTCTCTGCCATCTCTA

920 bp

NHE3

CACTCTGGTGGGTGTCATCTT

GCTGAAGTCCACATTGACCAT

937 bp

NHE4

AGATGTATGTGGGCAGTGGAG

TTCTCACTTGTTTGGGGTTTG

348 bp

AE1

GGTCGTCCACATCTCTCTTACC

GTGCACAGTACAGCTTGGTCTC

325 bp

AE2

AACTCTGGTGGAGGAGATGGT

CTGTCCTCTGCTTTGATCTGG

657 bp

AE3

AGCCCAGGTCTTTCTATCAAGG

GTCTCCTCCTCCACATCCTCTT

539 bp

AE4

AGGTCTGCTTTGGGTAATCAAG

GTGTCTGTTTCCTGAGGTCTCC

398 bp

transzporter

– 31 –

mérete


Rövidzárlati áram mérés Az epiteliális sejtvonalak ion- és folyadékszekréciójának mérésére standard elektrofiziológiai módszereket használtunk. A rövidzárlati áram (ISC) az aktív elektrolit transzportfolyamatokkal arányosan változik. A méréshez a konfluens monolayer-eket egy Warner-féle két-csatornás Ussing-kamrába helyeztük (U-2500, Warner Instrument Co., Hamden, CT). A transzepitél potenciálkülönbséget (Vm) folyamatosan mértük Ag/AgCl elektródokon és agaróz-KCl hidakon keresztül. Az elektródok egy epiteliális voltage-clamp erősítőhöz kapcsolódtak (EC-825, Warner Instrument Co., Hamden, CT). A bazolaterális oldalhoz viszonyítva az apikális oldal feszültségét ábrázoltuk. A rövidzárlati áramot (ISC) Par-C10 sejteknél folyamatosan, HPAF sejteknél 5 másodperces idő intervallumban mértük, az Ag/AgCl elektródokon 0 mV-ra állítva a feszültséget. Az agonisták hatását az ISC értékre (µA/cm2) az agonista adása után mérhető csúcs és az alapvonal közti különbségéből számoltuk. A pozitív eltérések negatív ionok bazolaterális-apikális irányú vándorlását vagy pozitív ionok apikálisbazolaterális irányú vándorlását jelzik. Mikrofluorometria Mikrofluorometriás módszerek segítségével nagy pontossággal lehet akár élő sejten belül is ionok vagy molekulák koncentrációját vizsgálni. Az általunk használt módszer alapja a fluoreszcein származékának acetoximetil-észter formában történő sejtbe juttatása, ahol az észterázok hatására keletkező poláros molekula a sejtben reked. A festékmolekula gerjesztés hatására a rá jellemző ion koncentrációjától függő és ettől nem függő intenzitással képes fényt emittálni. Kalibrációt követően a két érték arányából következtethetünk az adott ion festékmolekulától független koncentrációjára. Intracelluláris pH mérés Az intracelluláris pH (pHi) változásán keresztül vizsgálni tudtuk az epitél sejtek bikarbonátszekrécióját. Indikátorként BCECF-AM-et használtunk, amely pH függő módon emittál fényt. A mérés kezdetén a sejteket 37ºC-os oldattal átmostuk, majd 30 percig 37ºC-on BCECF-AM indikátorral töltöttük, és egy Nikon TE200-as inverz

– 32 –


mikroszkóp tárgylemezén nyitott perfúziós kamrába helyeztük. A vizsgálandó sejtek bazolaterális és apikális oldalát 2 ml/min sebességgel, perisztaltikus pumpa segítségével, különböző oldatokkal perfundáltuk. Az epitél kis részletét 440 és 490 nmes hullámhosszúságú fénnyel váltakozva, 5 másodpercenként 1-1 másodpercre megvilágítottuk. Az emissziót detektálva a pHi értékét az F490/F440 arányból kalibráció segítségével számoltuk. A kalibrációt külön kísérletekben, korábban leírt módszer szerint végeztük (77). Röviden, a sejteket ugyanúgy töltöttük BCECF-AM indikátorral, mint más kísérletekben, majd a mérés során nigericinnel kezeltük. Magas K+ koncentrációjú, különböző pH-ra beállított oldatokat adtunk a sejtekhez. A kezelés hatására a perfúziós oldatok pH-ja egyenes arányosságban volt a mért F440/F490 aránnyal. Az eredményekből kalibrációs egyenest vettünk fel, és ennek segítségével számoltuk az intracelluláris pH-t. A pHi változás mértékét lineáris regresszióval vagy negyedik hatványú görbeillesztés utáni egy kezdeti pontban történő deriválással számoltuk. Az HPAF kísérletekben ezeket az értékeket korábban leírt pufferkapacitás mérés után átszámoltuk ionfluxus értékekre (78). Röviden összefoglalva, a belső pufferkapacitást a következőképpen határoztuk meg: A sejteket Na+-mentes közegben különböző (0-20 mM) NH4+ koncentrációjú oldatoknak tettük ki, és a pHi változást regisztráltuk. A teljes pufferkapacitást a pHi függvényeként határoztuk meg, a mért értékekhez hozzáadva az intracelluláris HCO3¯ és CO2 prediktált hozzájárulását a pufferkapacitáshoz. Az ionfluxus értékeket (JB) a pHi változás meredeksége és a megfelelő pHi értéknél leolvasott teljes pufferkapacitás szorzatából kaptuk. A pozitív JB értékek bázis influxot (vagy sav effluxot) jelölnek. Ca-imaging Mikrofluorometriás módszerrel vizsgáltuk a sejten belüli Ca2+-szint változásait. Indikátorként Fura-2-AM molekulát alkalmaztunk, amely Ca2+-koncentrációtól függő módon emittál fényt. Az előkészített sejteket egy Nikon TE2000-es inverz epifluoreszcens mikroszkóp tárgylemezén gravitáció-hajtóerős (Harvard Apparatus Ltd., Kent, UK) perfúziós kamrába helyeztük. Az objektív egy CoolSNAP HQ interline progresszív-szkennelő kamerához (Roper Scientific Photometrics, Tucson, AZ), és egy monokromatikus illuminációs rendszerhez (Cairn Research, Kent, UK) kapcsolódott. A

– 33 –


képadat gyűjtését és kiértékelését MetaFluor/MetaMorph imaging szoftverrel végeztük (Molecular Devices, Downington, PA). A háttér kivonással mért 340 és 380 nm-es fluoreszcens képeket a számítógépen számolt 340/380-as arányra alakítottuk át. Minden mérést szobahőmérsékleten végeztünk (20-22°C). A Par-C10 sejteket üveglemezen és Transwell-CLEAR membránon vizsgáltuk. Üveglemezre ültetve a sejteket 2 napos tenyészeteket vizsgáltunk. A sejteket 5 μM Fura-2-AM-mel HEPES oldatban, 30 percig szobahőmérsékleten töltöttük, majd két mosás után 30 percig szérummentes tápoldatban hagytuk deészterifikálódni a festékmolekulát. Ezután a lemezt mikroszkóp alatt 40x-es nagyításon, immerziós olajos optikával, 3 x 3 binning módban és 1 Hz-es adatgyűjtési frekvenciával mértük. A Transwell membránra ültetett sejtek vizsgálatához a festékkel való feltöltést és a mikroszkóp beállításait is változtatni kellett. A sejteket 5 μM Fura-2-AM-mel 60 percig volt szükséges töltenünk bikarbonát pufferben, 37°C-on. A töltődést egy 30 perces deészterifikálódási szakasz követte, szérummentes tápoldatban, szintén 37°C-on. Mindkét oldat 2 mM probenacidot tartalmazott, amely gátolja a Fura-2 gyors kilökődését a sejtből. A Transwell membránt nyitott perfúziós kamrába helyeztük, és a sejtek két oldalát külön perfundáltuk. 40x-es, extra hosszú munkatávolságú objektívet használtunk, hogy a bazolaterális folyadékrétegen (2-3 mm) és a membránon keresztül is fókuszálni tudjuk a sejteket. Ez az obejktív (NA, 0,6) lényegesen kevesebb fényt tudott gyűjteni, mint az előzőekben használt x40 S-Fluor objektív (NA, 1,3), ezért 8 x 8 binninget alkalmaztunk a zaj kiszűrésére. A háttérsugárzást a kísérletek végén a sejteket lemosva mértük. Statisztika Az adatokat átlag ± átlag szórása (standard error, S. E. M.) formátumban adtuk meg. Statisztikai összehasonlításra az ionszekréciós méréseknél kétmintás Student t-próbát, vagy ahol szükséges volt, Bonferroni utóteszttel kiegészített ANOVA tesztet használtunk. A Ca-imaging vizsgálatoknál szükség szerint párosított t-próbát vagy Mann-Whitney tesztet végeztünk.

– 34 –

Eredmények

EREDMÉNYEK

Par-C10 sejtek ionszekréciójának vizsgálata Rövid-zárlati áramméréseink során egy kis alap Isc értéket regisztráltunk (átlag értéke 0,875 ± 0,110 μA, maximum 5,071 μA és minimum -0,825 μA HCO3¯-t tartalmazó közegben). Ez arra mutat, hogy nyugalmi állapotban a Par-C10 sejtek kismértékben szekretálnak anionokat. ATP apikális alkalmazása (50 μM) az alap ISC értéket közel négyszeresére, 382 ± 21%-ára emelte HCO3¯ jelenlétében (9. ábra). Mivel az ATP egy intracelluláris Ca2+-szignált hoz létre, ezért az eredményből arra következtethetünk, hogy Ca2+-függő aniontranszport folyamat működik a sejtben. B

Isc(µA/cm2)

A

4 3

Isc(µA/cm2)

5

b a 0 5

10

15

20

25

Ap

30

35

2 1

t (min) 0

ATP

a

-5

b

9. ábra: ATP hatása Par-C10 rövidzárlati árammérése során HCO3¯/CO2 jelenlétében. Az A panel 50 µM ATP apikális alkalmazásakor mérhető jellemző egyedi kísérletet mutat be. A B panelen a nyugalmi (a) és a stimuláció során jelentkező csúcs (b) átlagértékei láthatók. Ap, apikális.

Forskolinnal (10 μM) stimulálva a sejteket az ATP-hez hasonló stimulációt kaptunk. A forskolin intracellulárisan hat, az adenilil ciklázt stimulálja, így a cAMP szintet növeli a sejtben. A sejtekben ez a kezelés gyors ISC emelkedéshez vezetett, amely egy csúcs után emelkedett szintre állt be. A forskolin elvétele után az ISC érték az alapszinthez közelített. A csúcs értékével számolva a forskolin kezelés HCO3¯ hiányában 350 ± 66%os (10.A ábra), HCO3¯ jelenlétében 773 ± 46%-os ISC növekedést eredményezett (10.B ábra). Ezen eredményekből arra következtethetünk, hogy a Par-C10 sejtekben működik egy cAMP-függő anion szekréció, amelynek mechanizmusában a HCO3¯ szerepet játszik.

– 35 –

Eredmények

Az ISC érték növekedése az anion szekréció mellett kation abszorpciót is jelenthet, ezért külön kísérletben vizsgáltuk az ATP vagy forskolin hatását alacsony koncentrációjú, apikálisan adott amilorid mellett (10 µM), amelyről ismert, hogy az elektrogén Na+ csatornákat (ENaC) blokkolja. Eredményeink szerint ebben a koncentrációban az amilorid nincs hatással sem az ATP (124 ± 19% a 100 ± 9%-hoz viszonyítva, mikor amiloridot nem alkalmaztunk), sem a forskolin (83 ± 6,8% a 100 ± 26%-hoz viszonyítva, mikor amiloridot nem alkalmaztunk) ISC emelő hatására (ábra nélkül). Az eredmények azt mutatják, hogy HCO3¯ jelenlétében a mérhető ionáramot főként az anionok bazolaterális apikális irányú transzportja okozza.

10. ábra: Forskolin és bumetanid hatása az ISC értékre Par-C10 sejtekben HCO3¯ jelenlétében és hiányában. 10 µM forskolin hatása HCO3¯/CO2 hiányában (A panel) és jelenlétében (B panel). 100 µM bumetanid hatása HCO3¯/CO2 mentes környezetben a forskolin-kiváltott ISC érték növekedésre (C panel). A D panel összefoglalva mutatja az átlag ISC változásokat forskolin hatására HCO3¯ mentes (a) és HCO3¯-t tartalmazó (b) közegben, illetve bumetanid jelenlétében (c). Ap, apikális; Bl, bazolaterális. * P < 0,05.

HCO3¯ mentes környezetben vizsgáltuk, hogy a bazolaterálisan alkalmazott bumetanid (100 µM; a Na+-K+-Cl¯ kotranszporter, NKCC1 gátlószere) milyen hatással van a

– 36 –

Eredmények

forskolin stimulációra. Eredményeink szerint a forskolin stimuláló hatását 48 ± 15%-ára csökkentette a bumetanid előkezelés (10.C ábra), és így igazolva látjuk, hogy NKCC1 működik a sejtek bazolaterális membránjában. Az intracelluláris pH visszatérése acidózisból

11. ábra: A pHi visszatérés sebességének mérése, mikor a sejtek oldatában 3 perces 20 mM NH4Cl bilaterális kezelés után NMDG+-nal helyettesítettük a Na+-t HCO3¯/CO2 jelenlétében és hiányában. A, A Na+ visszaadásának hatása a sejtek apikális (b szakasz) és bazolaterális (c szakasz) oldalán HCO3¯/CO2 mentes környezetben. B, A Na+ visszaadásával egyidejűleg EIPA (30 µM) alkalmazása (d szakasz) bazolaterális oldalon HCO3¯/CO2 mentes oldatban. C, A Na+ visszaadásának hatása a sejtek apikális (f szakasz) és bazolaterális (g szakasz) oldalán HCO3¯/CO2 jelenlétében. A D panel a jelölt szakaszok meredekségeinek átlagértékeit mutatja. Ap, apikális; Bl, bazolaterális. ** P < 0,001; * P < 0,05 az (a)-hoz, illetve (e)-hez viszonyítva; ## P < 0,001 (c)-hez viszonyítva.

A HCO3¯ felvételét és H+ kilökését végző, pH szabályozó mechanizmusok azonosítását, és hogy acidózisból apikális, illetve bazolaterális oldalon Na+-függő módon képes-e a

– 37 –

Eredmények

sejt visszatérni, a következőképp vizsgáltuk: 3 percig 20 mM NH4Cl-t adtunk a perfúziós oldathoz, amit utána Na+-mentes oldatra cseréltük. 20 mM NH4Cl adása a perfúziós oldathoz a sejtekben gyors alkalizációt okozott, amelyet az NH4Cl elvétele után acidózis követett. A sejtek a savterhelést protonok leadásával vagy HCO3¯ felvétellel tudják kompenzálni.

A pH visszatérésének sebességét HCO3¯/CO2

hiányában és jelenlétében mértük. Mindkét-oldali Na+-elvétel HCO3¯ mentes közegben teljes gátlást okozott a pH visszatérésben (11.A ábra a szakasz). Az apikális Na+ visszaadása nem okozott változást (11.A ábra b szakasz). Azonban amikor a Na+-t bazolaterálisan adtuk vissza a perfúziós oldathoz, nagymértékű pH visszatérést mértünk (11.A ábra c szakasz). Az eredmények egy HCO3¯-tól független, Na+-függő pH szabályozó transzport mechanizmus jelenlétére utalnak a bazolaterális membránban. A leginkább valószínű, hogy ez a Na+-függő pH szabályozó mechanizmus egy Na+/H+ kicserélő (NHE), az NHE1. Egy NHE specifikus gátlószer, az 5’-(N-etil-N-izopropil)amilorid (EIPA, 30 µM) alkalmazásával vizsgáltuk az NHE jelenlétét a bazolaterális membránban korábban leírt módszer alapján (40, 79). A Na+ bazolaterális visszaadásakor tapasztalt pH emelkedés gátolható volt EIPA alkalmazásával (11.B ábra d szakasz). Az NHE-t gátló EIPA elvételekor pH visszatérést mérhettünk (11.B ábra). Amikor a kísérleteket HCO3¯-tartalmú közegben ismételtük, hasonló jelenséget tapasztaltunk. A pH visszatérés mindkét oldali Na+-mentes közegben teljesen elmaradt (11.C ábra e szakasz). A Na+ apikális visszaadásakor nem észleltünk pH emelkedést (11.C ábra f szakasz), míg a bazolaterális oldali Na+ visszaadásakor 0,546 ± 0,053 s-1 kezdeti sebességgel tért vissza acidózisból az intracelluláris pH (11.C ábra g szakasz). Mindezen eredményekből arra következtetünk, hogy pH-emelő transzport mechanizmus a Par-C10 sejtek apikális membránjában nem működik. HCO3¯/CO2 jelenlétében a transzporterek azonosításához párosított NH4+-pulzus kísérleteket végeztünk (12. ábra). Ezekben a kísérletekben a Na+ végig jelen volt a perfúziós oldatban, és kontrollként az első NH4+ pulzus utáni pH visszatérés szolgált. Két egymást követő, gátlószer-mentes NH4+ pulzus utáni pH visszatérés sebessége nagyon hasonló volt (12.A ábra). A HCO3¯/CO2 mentes környezetben végzett kísérletekkel ellentétben, az EIPA nem volt képes gátolni a pH visszatérést (12.B ábra). Mikor azonban az EIPA-t H2DIDS-szel (500 µM), a Na+-2HCO3¯ kotranszporter-1

– 38 –

Eredmények

(NBC1) szelektív gátlószerével (80), együttesen alkalmaztuk, a pH emelkedés 70 ± 10%-kal csökkent (n = 6, 12.C ábra). NH4+

NH4+

Bl

8

NH4+

NH4+ EIPA

Bl

8

a

b

c

7

7

Ap

NH4+ 0

5

NH4+ 10

15

20

25

30

NH4+ EIPA

0

10

15

20

25

Bl

30

t (min)

D

H2DIDS

8

5

NH4+

dpH/dt

NH4+

Ap

NH4+

t (min)

pHi

C

pHi

B

pHi

A

NS

0.2

d

*

0.1

7

Ap

NH4+ 0

5

NH4+ 10

15

20

0 25

30

a

b

c

d

t (min)

12. ábra: A pHi visszatérésének mérése HCO3¯/CO2-t tartalmazó oldatban 3 perces 20 mM NH4Cl bilaterális perfúziója utáni acidózisból az NHE-t gátló 30 µM EIPA és az NBC transzportert gátló 500 µM H2DIDS bazolaterális jelenlétében vagy hiányában. A, Az NH4Cl-mentes HCO3¯/CO2 oldat adásának hatása a sejten belüli pHra. B, EIPA bazolaterális alkalmazásának hatása NH4Cl pulzus és azutáni szakaszon. C, EIPA és H2DIDS együttes bazolaterális adásának hatása NH4Cl pulzus közben és után. D, A pHi változás átlagos értékei a megjelölt szakaszokon. Ap, apikális, Bl, bazolaterális, NS, nem szignifikáns. * P < 0,05 az (a)-hoz viszonyítva.

Mivel a gátlás nem teljes, felmerül a lehetőség, hogy további HCO3¯ felvételi mechanizmusok működhetnek a Par-C10 sejtek bazolaterális membránjában. Korábbi tapasztalataink alapján azonban ez a jelenség annak a következménye, hogy a H2DIDS nem képes az NBC1-et teljes mértékben gátolni. Összefoglalva, a 11. és 12. ábra adataiból arra következtethetünk, hogy a Par-C10 sejtekben H+-efflux mechanizmusok csak a bazolaterális oldalon vannak, más szóval a sav/bázis transzport erősen polarizált, és kedvez a HCO3¯ szekréciónak. Ugyancsak

– 39 –

Eredmények

valószínű, hogy a bazolaterális membránban található fő savas közeget kompenzálni képes transzporterek az NHE1 és az NBC1. A HCO3¯ szekréció vizsgálata Előbbi eredményeink alapján megvizsgáltuk, hogy a bazolaterális NBC és NHE milyen szerepet játszik a pHi megtartásában, és így a HCO3¯ utánpótláshoz a transzepitél szekrécióban. Elképzelésünk szerint a HCO3¯ szekréciót a bazolaterális Na+-HCO3¯ kotranszporteren keresztüli HCO3¯ felvétel, és Na+/H+ kicserélőn keresztül történő H+ leadás ellensúlyozza. Ha specifikus gátlószerekkel meggátoljuk ezen bazolaterális transzporterek működését, az apikális membránon keresztüli folyamatos HCO3¯ efflux a pHi csökkenését okozza, hiszen a sejt bázikus ionokat veszít. Ilyen módon a pH csökkenés kezdeti meredeksége jól mutatja a kifelé irányuló HCO3¯ áram aktivitását. Ennek a módszernek a segítségével fiziológiás körülmények között vizsgálhattuk a vektoriális HCO3¯ transzport szabályozását. H2DIDS és EIPA 8 perces bazolaterális alkalmazása a kontrollhoz képest a pHi lassú csökkenését váltotta ki a sejtekben (13.A ábra). A forskolin önmagában nem okozott pH változást. Azonban H2DIDS és EIPA bazolaterális alkalmazása forskolin apikális jelenlétében gyors pHi csökkenést eredményezett (13.B ábra). ATP apikális alkalmazása önmagában ugyancsak nem okozott pHi változást a sejtekben, de mikor jelenlétében a két gátlószert is adtuk a sejteknek, a pHi lényegesen gyorsabban csökkent (13.C ábra), mint ATP hiányában. Korábban vizsgálták a HCO3¯ apikális transzport mechanizmusát egy CFTR inhibitor, a CFTRinh-172 segítségével (58, 81). Az előzőekhez hasonló elrendezésben, de CFTRinh172 apikális alkalmazása mellett a forskolin stimuláció a CFTRinh-172 nélküli forskolin hatás 72 ± 5%-ának bizonyult (n = 6). Amennyiben a CFTRinh-172-t bazolaterálisan adtuk, annak nem volt szignifikáns gátló hatása a forskolinra (CFTRinh-172 és forskolin együtt: dpH/dt = 0,044 ± 0,002 s-1, 167 ± 9%; forskolin egyedül: 171 ± 8% pHi változás a stimulálatlanhoz képest, ábra nélkül). Mindezen eredmények arra utalnak, hogy a sejtekben működik egy vektoriális, bazolaterális-apikális irányú HCO3¯ transzport, amely cAMP- vagy Ca2+-függő módon stimulálható, és a CFTR csatorna fontos szerepet

– 40 –

Eredmények

játszik a mechanizmusban. Eredményeink alapján következtethetünk arra is, hogy a CFTR csatorna csak a sejtek apikális membránjában működik.

13. ábra: A HCO3¯-felvételi mechanizmusok gátlásával kiváltott savasodás vizsgálata Par-C10 sejtekben nyugalmi állapotban, és ATP vagy forskolin jelenlétében. A, A pHi változás regisztrátuma H2DIDS (500 µM) és EIPA (30 µM) bazolaterális alkalmazásakor. B, A pHi változása bazolaterálisan adott H2DIDS és EIPA adásakor, apikálisan alkalmazott forskolin (10 µM) jelenlétében. C, A pHi változása bazolaterálisan adott H2DIDS és EIPA adásakor, ATP jelenlétében (50 µM, apikálisan adagolva). D, A pHi változása bazolaterálisan adott H2DIDS és EIPA adásakor, forskolin és CFTRinh-172 (5 µM) apikális jelenlétében. E, A pHi változások átlag értékei. * P < 0,05 az (a)-hoz viszonyítva, # P < 0,05 a (b)-hez viszonyítva.

– 41 –

Eredmények

Anion-kicserélők jelenlétének vizsgálata Mivel a nyálmirigyekben az anionszekréció része az anion-kicserélő jelenléte a bazolaterális membránban (9), meg kívántuk vizsgálni, hogy a Par-C10 sejtekben milyen aktivitással és polaritással működnek anion-kicserélők. A perfúziós oldatban impermeábilis ionnal, glukonáttal helyettesítettük a Cl¯-t, és a pHi változást mértük.

14. ábra. Bazolaterális oldalon alkalmazott Cl¯-mentes oldattal kiváltható alkalizáció mérése Par-C10 sejteken. A, A pHi változások regisztrálása 5 perces bazolaterálisan adott Cl¯-mentes oldat kezelés hatására. B, A bazolaterális oldalon 3 perces DNDS (3 mM) előkezelés után alkalmazott Cl¯-mentes oldat hatása a sejtek pHi értékére. A pHi változása Cl¯-mentes oldat bazolaterális alkalmazásakor 50 µM ATP (C) vagy 10 µM forskolin (D) előkezelés mellett.

Amennyiben anion-kicserélő van a membránban, a Cl¯ helyettesítése megfordítja a normális Cl¯ grádienst, és a sejt Cl¯-t fog szekretálni. Ennek következtében az anionkicserélőn HCO3¯-t vesz fel a sejt citoplazmába, amely pHi emelkedést idéz elő.

– 42 –

Eredmények

Amikor a sejtek bazolaterális oldalát tettük ki Cl¯-mentes körülményeknek, erőteljes pHi emelkedést tapasztaltunk (0,16 ± 0,015 pH egység, n = 38). A Cl¯ visszaadását követően a pHi visszatért a normális értékéhez (14.A ábra). A pHi emelkedés szignifikánsan kisebb volt 3 mM 4,4’-dinitrostilbén-2,2’-diszulfonsav (DNDS) jelenlétében (0,056 ± 0,013 pH egység, n = 12, p < 0,05, 14.B ábra). A DNDS nélkül és DNDS jelenlétében mérhető pHi változás kezdeti meredeksége is arra mutat, hogy egy Cl¯/HCO3¯ anionkicserélő található a sejtek bazolaterális membránjában (0,074 ± 0,008 dpH min-1 DNDS nélkül és 0,039 ± 0,008 dpH min-1 DNDS jelenlétében). ATP (50 µM, 14.C ábra) vagy forskolin (10 µM, 14.D ábra) előkezelés nem volt szignifikáns hatással sem a pHi emelkedés mértékére, sem annak kezdeti sebességére. Következtetésünk, hogy bazolaterális oldalon jelen van egy Cl¯/HCO3¯ anion-kicserélő a sejtekben, azonban ez nem serkenthető sem Ca2+-, sem cAMP-függő módon. Molekuláris biológiai vizsgálatok A funkcionálisan kimutatott iontranszporterek mRNS szintű expresszióját RT-PCR módszerrel vizsgáltuk, Par-C10 sejtekből és pozitív kontrollként patkány veséből (az NBC1, NKCC1 és -2, NHE-k, és AE-k vizsgálatához) és tüdőből (CFTR vizsgálathoz) izolált cDNS mintákon.

15. ábra: Par-C10 minták RT-PCR-es vizsgálatának pozitív eredményei.

A Par-C10 mintából a várt méretű transzkriptumokat CFTR, NBC1 (SLC4A4), NKCC1, NHE1, NHE2, és AE2 vizsgálatánál kaptunk (15. ábra).

– 43 –

Eredmények

A Par-C10 sejtek intracelluláris Ca2+-szint szabályozó mechanizmusainak vizsgálata Először megvizsgáltuk, hogy a Par-C10 a korábban vizsgált egér parotisz sejtekhez hasonló Ca2+-szignált mutat-e (35). Az üveglemezen növesztett Par-C10 sejtek, az egér parotisz acinushoz hasonlóan (35), karbakol (CCh) hatására forskolinnal stimulálható Ca2+ oszcillációt mutattak (16.A ábra).

16. ábra: [Ca2+]i változások Par-C10 sejtekben agonisták hatására. A, A CCh-kiváltott [Ca2+]i jelet a forskolin erősíti üveglemezre növesztett Par-C10 sejteken (az ábra három független kísérlet egy reprezentatív példáját mutatja, 98 sejtet mértünk). B, Transwell membránra növesztett Par-C10 sejtekben a CCh megemelte a [Ca2+]i szintet, de csak bazolaterális alkalmazásakor, miközben az ATP [Ca2+]i szint emelő hatása csak apikális adáskor mutatkozott (az ábra négy független kísérlet egy reprezentatív példáját mutatja, összesen 152 sejtet mértünk).

A forskolin hatása mind amplitúdóban, mind frekvenciában megmutatkozott, azt mutatva, hogy mind a Ca2+ felszabadulás, mind a kiürülés fokozódott forskolin

– 44 –

Eredmények

jelenlétében. Azonban a Par-C10 sejtek sokkal kevésbé érzékenynek bizonyultak CChra (100 µM), mint az egér parotisz acinusok (0,1-1 µM) (35). A parotisz acinus sejtek kifejeznek mind muszkarinerg, mind purinerg receptorokat, ám muszkarinos receptorok csak a bazolaterális, purinerg receptorok csak az apikális oldalon találhatók (72).

17. ábra: Az apikális és bazolaterális PMCA aktivitás funkcionális elkülönítése Par-C10 sejteken. Az apikális és a bazolaterális PMCA működését Transwell membránra növesztett ParC10 sejteken végeztük el, a két oldalt külön perfundáltatva 1 mM La3+-nal. A, Bemutató felvétel a teljes [Ca2+]i clearance-ről, mikor nem volt La3+ jelen, a szinte teljes [Ca2+]i clearance gátlásról (reziduális clearance), mikor La3+ adagoltunk a sejtek mindkét oldalára, és az apikális PMCA aktivitás elkülönítéséről, mikor a La3+-t a bazolaterális oldalon alkalmaztuk. Az eredmény kvalitatívan jelzi a clearance mértékét különböző körülmények között, ugyanazon a sejten. B, sematikus ábra a különböző körülmények bemutatására: teljes [Ca2+]i clearance, mikor nincs La3+ jelen a rendszerben (panel i), a [Ca2+]i clearance gátlása (reziduális clearance), mikor La3+ adtunk a sejtek mindkét oldalára (panel ii), az apikális PMCA funkcionális elkülönítése (panel iii), és a bazolaterális PMCA funkcionális elkülönítése (panel iv).

Ennek megfelelően viselkedtek a Transwell-Clear membránra ültetett, polarizált ParC10 tenyészetek is, a CCh (100 µM) nem emelte az intracelluláris Ca2+-szintet apikális oldalról, de robusztus választ váltott ki bazolaterális oldalon, míg ATP (10 µM) éppen

– 45 –

Eredmények

fordítva, apikális oldalról hatásos volt, ám nem váltott ki Ca2+-szint emelkedést, ha bazolaterális oldalról adtuk (n = 4, 152 sejt, 16.B ábra). Ezen adatok alapján elmondhatjuk, hogy a Par-C10 sejtvonalon az ACh és purinerg receptorok elhelyezkedése membránspecifikus. A PMCA inhibitor La3+-t (1 mM) külön-külön a bazolaterális és apikális oldalon alkalmaztuk, így lehetőséget kaptunk a bazolaterális és apikális PMCA aktivitás szeparált mérésére egy tipikus Ca2+-clearance assay-ben. Ebben a koncentrációban a La3+ a Ca2+ beáramlását és kiáramlását is gátolja, gyakorlatilag lezárva a sejtet a Ca2+ mozgás tekintetében (82, 83). Amennyiben mindkét oldalon adtunk La3+-t a sejteknek, szinte teljesen megakadályoztuk a Ca2+ kiürülést azután, hogy eltávolítottuk a perfundáló oldatból a Ca2+-t (17.A ábra). A La3+ EGTA-val történő eltávolítása feloldotta a PMCA gátlását, amely ezután gyors ütemben távolította el a sejtben rekedt Ca2+-t. Az extracelluláris Ca2+ visszaadása növelte az intracelluláris Ca2+ szintet, valószínűleg amiatt, hogy aktiválta a raktár-függő Ca2+-csatornákat. A La3+ bazolaterális alkalmazása lassította, de nem teljesen függesztette fel a Ca2+-clearance-t (17.A ábra). Ez a sebességcsökkenés valószínűleg annak tudható be, hogy ebben az esetben a Ca2+ kényszerűségből az egyetlen elérhető úton, az apikális oldalon hagyta el a sejtet, így tehát sikerült izolálnunk egy apikális PMCA aktivitást. Ezt a módszert használva funkcionálisan elkülönítve tudtuk vizsgálni a bazolaterális és apikális PMCA aktivitást. Az in situ kalibrációs módszerünk, hogy a 340/380 arányt Ca2+ koncentrációra átszámolhassuk, nem járt sikerrel. Az ionomycinnel perfundáltatott membránon nagyon sok sejt lizálódott vagy a perfúzóval lemosódott, így a clearance eredményekkel ezek a kísérletek nehezen összehasonlíthatókká váltak, főleg ha a clearance előtti, kezdeti Ca2+ koncentrációt szerettük volna kiszámolni. Ezért a clearance-t egy állandó kezdeti 340/380 arányra normalizáltuk. Azokban az esetekben, mikor a Ca2+ clearance görbéjére nehéz volt exponenciális görbét illeszteni, mert inkább lineárisan változott a Ca2+ koncentráció, egy 30 másodperc ideig tartó szakaszra egyenest illesztettünk, és a Ca2+ clearance-t az arányváltozás meredekségével jellemeztük (ΔR·min-1). Végezetül, nagyon nagy különbség adódott még egy kísérleten belüli sejtek között is a clearance értékekben. Ez a variabilitás véleményünk szerint a fluoreszcens festék felvétellel és az extra hosszú távolság miatti alacsony beütésszámmal van összefüggésben. Ez azt is jelenti, hogy bármely clearance-beli változást eltakarhatott a nagy variabilitás, ezért

– 46 –

Eredmények

párosított kísérleti elrendezést alkalmaztunk. Időben egyeztetett kontroll kísérleteket végeztünk, ahol két sikeres Ca2+-clearance fázist indukáltunk ciklopiazonsav (CPA) jelenlétében. Ezekben a kísérletekben azt tapasztaltuk, hogy a második Ca2+-clearance (RTot2, τ = 51 ± 3) nem különbözött szignifikánsan az első méréstől (RTot1, τ = 48 ± 4). Ebből arra következtettünk, hogy az endoplazmás retikulumból passzívan csordogáló Ca2+ nem mértékadó jelentőségű. Ez az eredményünk abban a kontextusban is fontos volt, hogy így adhattunk La3+-t az egyik vagy másik oldalra a második clearance-nél, és normalizálhattuk az eredményünket az első clearance adatra, az eredményt százalékos formában megadva. Ily módon alkalmas módszert találtunk a kvantitatív mérésre és az apikális és bazolaterális PMCA funkció elkülönítésére mind forskolin nélkül, mind annak jelenlétében. Az időben párosított méréseinkben, ahol La3+-t nem adtunk, ott a második clearance konzekvensen az első 104 ± 7%-ának adódott, és képviselte a „maximális PMCA aktivitást” (18.A ábra). Hasonló kísérleteket végeztünk, mikor a második clearance mérésnél La3+-t adtunk bazolaterális és apikális oldalon egyaránt. A maradék clearance 5 ± 1%-a volt az első clearance-nek (n = 4, 49 sejt), amely egy kis érték, de mégsem teljes gátlás (p < 0,05, egymintás t próbával), ezt neveztük „minimális PMCA aktivitásnak”. Mindazonáltal ez a maradék PMCA aktivitás szignifikánsan különbözik a maximális PMCA aktivitástól, amikor La3+ nem volt a rendszerben (p < 0,001, MannWhitney teszttel, 18.B ábra). A kezeletlen sejtekben az apikális PMCA aktivitás 39 ± 4%-a volt a teljes clearance-nek (n = 6, 148 sejt, 18.C ábra). Ez szignifikánsan kisebb, mint a maximális PMCA aktivitás, de szignifikánsan nagyobb a minimális aktivitástól. A bazolaterális PMCA aktivitás, amely a teljes clearance 20 ± 4%-ának adódott (n = 6, 127 sejt, 18.E ábra), ugyancsak szignifikánsan különbözött a maximális és minimális PMCA aktivitástól egyaránt. Így tehát kvantitatív bizonyítékot kaptunk arra nézve, hogy az apikális és bazolaterális PMCA aktivitás elkülöníthető egymástól. Továbbá azt is sikerült megállapítani, hogy a bazolaterális PMCA aktivitás kisebb, mint az apikális. A forskolinnal kezelt sejtekben az apikális PMCA aktivitás jelentősen fokozódott, elérte a maximális clearance 149 ± 9%-át is (n = 4, 76 sejt, 18.D ábra), míg a bazolaterális PMCA aktivitásra a forskolin nem volt befolyással (a maximális clearance 19 ± 3%-át mértük, n = 4, 88 sejt, 18.F ábra). Ez a megfigyelés alátámasztja, hogy a PKA aktiváció megkülönböztető jelleggel aktiválja az apikális PMCA transzportereket.

– 47 –

Eredmények

18. ábra: A PKA megkülönböztetett módon fokozza az apikális PMCA aktivitását. A, reprezentatív görbe a párosított kontroll kísérletekről, ahol 30µM CPA adása mellett eltávolítottuk a perfúziós oldat Ca2+ tartalmát. A [Ca2+]i clearance mérését minden esetben azonos értékről kezdtük, és egyszerű exponenciális görbét illesztettünk az eredményekre, hogy meghatározzuk a mért idő állandót. A görbéket azonos scale mellett ábrázoltuk. A második clearance (RTot2, τ = 51 ± 3 s) párosított t próbával számolva nem különbözött szignifikánsan az első clearance-től (RTot1, τ = 48 ± 4 s). Ezért, mikor az apikális (C és D) illetve a bazolaterális (E és F) PMCA aktivitásokat funkcionálisan elválasztottuk, minden egyes sejtben a második lineáris clearance-t (RApical or RBaso) az első mért clearance-hez (teljes clearance, RTot) viszonyítva normalizáltuk, mint a teljes clearance százalékos arányát. Az átlag adatokat a B panel mutatja be. A „teljes” clearance-t (maximális PMCA aktivitás) La3+ adagolása nélküli párosított kontroll kísérletben állapítottuk meg (az első, szürke oszlopdiagram a B panelen). A „reziduális” clearance-t (minimális PMCA aktivitás) mindkét oldali La3+ adagolása mellett határoztuk meg (a második, fehér oszlopdiagram a B panelen). Tipikus eredmények mutatják be az elkülönített apikális (C és D panelek) és bazolaterális PMCA aktivitást (E és F panelek) kezeletlen (C és E panel) és forskolin-kezelt sejteken (D és F panel).

– 48 –

Eredmények

19. ábra: További bizonyítékok, hogy a mért [Ca2+]i clearance a PMCA aktivitásának köszönhető. A [Ca2+]i clearance mérés a Ca2+ eltávolításával indítottuk a perfúziós oldatból a CPA-kiváltott [Ca2+]i válasz csúcsánál, és az eredményekre illesztett exponenciális görbéből számoltuk az időkonstanst ( ). 10 µM Ru360 30 perces előkezelésével mértük a mitokondriális Ca2+ felvétel hozzájárulását a Ca2+ clearance-hez (B panel). A Na+/Ca2+ kicserélő hozzájárulását minden oldatra vonatkozóan

a Na+

NMDG+-re való cseréjével vizsgáltuk (C panel). Végezetül a specifikus PMCA inhibitor 5-(és-6)-karboxieozin 10 µM-os, illetve 30 µM-os 30 perces előkezelését alkalmaztuk a [Ca2+]i clearance indítása előtt (D panel).

– 49 –

Eredmények

Mivel a Ca2+ clearance gátlása nem volt teljes bilaterálisan adott La3+ mellett sem, és mivel a La3+ nem specifikus gátlószere a PMCA transzportereknek, szükségesnek éreztük, hogy megerősítsük, a mért Ca2+ clearance a PMCA-n keresztül történik. A szabad Ca2+-t a mitokondriumok Ca2+ felvétele és az esetlegesen előforduló Na+/Ca2+ kicserélők (NCX) működése is eltávolíthatja a citoplazmából. Először a mitokondriumok Ca2+ felvételét vizsgáltuk. A sejteket Ru360-nal (10 µM) előkezeltük a Ca2+ clearance assay előtt 30 percig (19.B ábra). Korábban kimutatták, hogy ez a kezelés meggátolja a mitokondriális Ca2+ felvételt egér parotisz acinus sejtekben (84). Az NCX jelenlétét Na+-mentes közegben is vizsgáltuk (19.C ábra). Egyik kísérleti elrendezésben sem különbözött szignifikáns mértékben a Ca2+ clearance a kontroll kísérletektől (kontroll: τ = 58 ± 9, n = 5, 83 sejt; Ru360 jelenlétében: τ = 63 ± 8, n = 4, 62 sejt; NMDG+ kezelés hatására: τ = 64 ± 5, n = 5, 96 sejt). Egy PMCA specifikus inhibitor, a karboxieozin alkalmazásával még inkább validálni tudtuk eredményeinket (85, 86). A kezelés dózis-függő Ca2+ clearance gátlást idézett elő (10 perces 10 µM karboxieozin jelenlétében: τ = 239 ± 26, n = 3, 53 sejt; 30 perces 10 µM karboxieozin jelenlétében: τ = 350 ± 59, n = 3, 42 sejt; 19.D ábra). 30 perces 30 µM dózisú karboxieozin alkalmazása esetén a Par-C10 sejtek teljesen rezisztenssé váltak a CPA kezelésre, valószínűleg meghaltak a feltöltés alatt. A nyugalmi [Ca2+]i erősen emelkedett ugyancsak dózis-függően a növekvő karboxieozin koncentrációknál. A hasnyálmirigy duktuszból származó HPAF sejtvonal ionszekréciójában résztvevő mechanizmusok vizsgálata Hogy bizonyosak legyünk abban, hogy a sejtek konfluens, polarizált sejtréteget hoztak létre a membránon, rendszeresen mértük a TER értéküket a tenyésztés folyamán. Kísérleteinket a kiültetés utáni 10-15. napon végeztük, ekkor a TER érték 590  48 Ω·cm2-nek adódott (n = 111). Az ATP hatása a szekrécióra HCO3¯ mentes közegben nyugalmi állapotban egy kicsi, apikális irányban negatív transzepiteliális potenciálkülönbséget mértünk az HPAF sejteken (-0,616  0,139 mV,

– 50 –

Eredmények

n = 18). Amikor nullára egészítettük ki a potenciálkülönbséget, a megfelelő rövidzárlati áram 1,60  0,216 µA/cm2-nak adódott (n = 18).

A

B

4 2 0

4 2 0

Ap

ATP -2

6

Isc(µA/cm2)

Isc(µA/cm2)

6

ATP -2

//

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 t (min)

C

Ap

//

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 t (min)

D bumetanide

6

Bl Isc(µA/cm2)

Isc(µA/cm2)

6 4 2 0

Bl

4 2 0

Ap

ATP -2

bumetanide

-2

//

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 t (min)

Isc(µA/cm2)

E

ATP //

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 t (min)

5

ATP stimulation

4

Bumetanide + ATP stimulation

3

Ap



2 1 0 HCO3

HEPES

20. ábra: Bumetanid hatása HPAF sejtekre az ATP-vel kiváltott rövidzárlati árammennyiségre. Az A-D paneleken az eltérések a megfelelő ISC értékeket mutatják, mikor fél percenként 5 másodperces nulla-feszültség clampelést hajtottunk végre. Az eredményekre jellemző görbék mutatják az ATP (50 μM) hatását az ISC -re HCO3¯ hiányában (HEPES pufferben, A és C panel) és jelenlétében (B és D panel). A C és D panelen a sejtek 5 perces bumetanid (100 μM) előkezelést kaptak az ATP serkentés előtt. Az E panel összefoglalva mutatja az átlag ISC változásokat (n = 4-9) ATP hatására bumetanid jelenlétében és hiányában. Ap, apikális; Bl, bazolaterális. ** P < 0,001.

– 51 –

Eredmények

50 µM ATP apikális alkalmazása egy bifázisos növekedéshez vezetett, valószínűleg az anionszekréció serkentése révén, és megnövelte az ISC értékét. A csúcs ISC emelkedés (ΔISC) 1-2 percen belül történt, 3,51  0,387 µA/cm2 értékű volt, ezután az érték a kiindulási értékhez közelire csökkent (20.A ábra). Vizsgáltuk az NKCC1 hozzájárulását az anionszekrécióhoz, mivel ez a sejtek Cl¯felvételének fő útvonala. Az NKCC1 szelektív gátlószerét, bumetanidot alkalmaztunk HCO3¯ mentes környezetben, 5 perccel a stimuláció előtt és az apikálisan adott ATP stimuláció alatt (20.C ábra). Az ATP hatására kialakuló ISC változás mértékét a bumetanid kezelés 60%-ban gátolta. Amikor a méréseket HCO3¯-tartalmú oldatban végeztük, az ATP stimuláció hasonló mértékű volt a HCO3¯-mentes környezetben mértnél (20.B ábra). A bumetanid kezelés ugyanakkor nem volt szignifikáns hatással a stimulációra (20.D ábra). Ezekből az eredményekből arra következtetünk, hogy a HCO3¯ jelenlétében az anionszekréció jelentős hányada HCO3¯-függő módon történik, amelyben az NKCC1 transzporter nem játszik fontos szerepet (20.E ábra). Acidózis kompenzálása Az

NKCC1-től

független,

HCO3¯-függő

anionszekréció

vizsgálatához

pHi

változtatásával tanulmányoztuk a HCO3¯-transzport mechanizmusait. A HCO3¯-felvétel és a H+ leadási vizsgálatokhoz NH4+-pulzus technikát alkalmaztunk. Standard HEPESpufferelt oldatban az acidózisból a sejtek gyors ütemben regenerálódtak (21.A ábra), nagy valószínűséggel H+ szekréció segítségével. Azonban mikor az NH4Cl elvételét egy mindkét oldali Na+ elvétel (NMDG+-nal helyettesítettük a Na+-t) is kísérte, a pH emelkedés elmaradt (21.B ábra a szakasz). Az apikális oldali Na+ visszaadása egy kisebb mértékű pH regenerációt eredményezett (21.B ábra b szakasz), amelyet tovább erősített ha a bazolaterális oldalon is visszaadtuk a Na+-t. Hasonló eredményt kaptunk, ha előbb a bazolaterális és később az apikális oldalon adtuk vissza a Na+-t a perfúziós oldathoz (21.C ábra). HCO3¯-t is tartalmazó közegben az acidózisból való visszatérés sebessége mintegy háromszorosa volt a HCO3¯-mentes közegben mértnél (22.A ábra). Na+-mentes oldat

– 52 –

Eredmények

alkalmazása a pHi visszatérését savas közegből ebben az esetben is teljes mértékben gátolta (22.B ábra).

A

B 8.0

NH4+

8.0

Bl

7.5 pHi

7.5 pHi

NH4+ 0 Na+

Bl

7.0

7.0

C 6.5 NH4+

a

6.0 0

b

6.5

Ap

5

10 15 t (min)

6.0

0

5

10

15

20 25 t (min)

D

C 8.0

NH4+ 0 Na+

8 

6 JB (mM/min)

7.0 c a

6.5

0

5

4

2 Ap

NH4+ 0 Na+ 6.0



Bl

7.5 pHi

Ap

NH4+ 0 Na+

10

15



20 t (min)

0 C

a

b

c

-2

21. ábra: A pHi visszatérése acidózisból HCO3¯ hiányában HPAF sejteken. Bemutató ábrák mutatják, hogy 3 perces 20 mM-os NH4Cl kezelést követően a sejtek hogyan reagálnak HCO3¯ mentes oldatban (A panel); amennyiben bilaterálisan helyettesítjük a Na+-ot NMDG+-vel a perfúziós oldatban (0 Na+), majd apikálisan (B panel), illetve bazolaterálisan (C panel) feloldjuk a Na+-mentességet. A D panel az A-C panelen jelölt szegmensek (a-c) ionfluxusban kifejezett (JB) átlagát mutatja (n = 16-23). Ap, apikális; Bl, bazolaterális. ** P < 0,001 és * P < 0,05 a kontrollhoz viszonyítva (C).

Az eredményből arra következtettünk, hogy az HPAF sejtek pH-szabályozó mechanizmusai Na+-függőek, nem működik például H+ ATP-áz ezekben a sejtekben. A Na+ visszaadása nagy mértékű pHi emelkedést váltott ki mindkét oldalról (21.B és C ábra). A HCO3¯-mentes oldatban mérteknél a pHi visszatérés gyorsabbnak mutatkozott (21.D ábra).

– 53 –

Eredmények

A

B

8.0

NH4+

Bl

Bl

7.5

7.5 pHi

pHi

NH4+ 0 Na+

8.0

7.0

b

7.0

C

a

6.5

6.5 NH4+

6.0 0

C

5

10

NH4+ 0 Na+

8.0

NH4+ 0 Na+

Ap 6.0

15 t (min)

0

Ap

10

5

15

D

25 t (min)



35

Bl

20

 25 JB (mM/min)

pHi

7.5 c

7.0

15

a 6.5 Ap

NH4+ 0 Na+ 6.0

0

5

10

15

5

20 t (min)

-5

 C

a

b

c

22. ábra: A pHi visszatérése acidózisból HCO3¯ jelenlétében HPAF sejteken. Reprezentatív görbék mutatják, hogy 3 perces 20 mM-os NH4Cl kezelést követően a sejtek hogyan reagálnak normáls HCO3¯-pufferelt oldatban (A panel); bilaterálisan NMDG+-vel helyettesítjük a Na+-ot a perfúziós oldatban (0 Na+), majd apikálisan (B panel), illetve bazolaterálisan (C panel) feloldjuk a Na+-mentességet. A D panel az egyedi görbéken megjelölt szegmensekből (a-c) számolt ionfluxus értékek (JB) átlagait mutatja (n = 3-11). Ap, apikális; Bl, bazolaterális. ** P < 0,001 és * P < 0,05 a kontrollhoz viszonyítva (C).

Gátlószerek hatása HCO3¯-mentes oldatban a savterhelést követő pHi visszatérés erőteljesen gátolható volt az amilorid-analóg EIPA alkalmazásával. A hatás apikális (23.A ábra) és bazolaterális (23.B ábra) alkalmazás esetén is megfigyelhető volt. Az eredmények azt mutatják, hogy mindkét oldalon működik NHE a sejtmembránban.

– 54 –

Eredmények

A

NH4+ 0 Na+

B

Bl

8.0

EIPA Bl

8.0

7.5 pHi

pHi

7.5

NH4+ 0 Na+

7.0

7.0

6.5

6.5

Ap

Ap

NH4+ 0 Na+

NH4+ 0 Na+ EIPA 6.0

6.0 0

5

10

15

20 25 t (min)

0

5

10

15

20 25 t (min)

C 8

JB (mM/min)

6  

4

2  



0 APICAL EIPA conc.

0 µM

1 µM

3 µM 10 µM

BASOLATERAL 0 µM

3 µM 10 µM 30 µM

23. ábra: A Na+/H+ kicserélőt gátló EIPA hatása acidózist követő pHi visszatérésre HPAF sejteken HCO3¯ hiányában. Bemutató ábrák mutatják, hogy 3 perces 20 mM-os NH4Cl kezelést követően a sejtek hogyan viselkednek, ha mindkét oldalon helyetesítettük a Na+-t NMDG+-vel (0 Na+), majd a Na+ mentességet feloldottuk: A panel, apikálisan, EIPA jelenlétében (10 μM); B panel, bazolaterálisan, EIPA jelenlétében (30 μM). A C panel a különböző EIPA koncentrációknál mérhető pHi visszatérés meredekségek átlagát mutatja (n = 4-7), ionfluxusban kifejezve (JB). ** P < 0,001 és * P < 0,05 a kontrollhoz viszonyítva (C).

A két különböző oldali NHE teljes (legalább 85%-os) gátlásához különböző koncentrációjú EIPA volt szükséges: apikális oldalon 3 µM, bazolaterális oldalon 30 µM EIPA volt hatásos (23.C ábra). Mindkét esetben gátló hatás csak lassan oldódott az EIPA elvétele után.

– 55 –

Eredmények

NH4+ 0 Na+

8

NH4+ 0 Na+

HOE-694 Bl

Bl

pHi

pHi

8

7

7

Ap NH4+ 0 Na+

6 0

5

10

Ap

HOE-694

NH4+ 0 Na+

6 15

20 25 t (min)

30

0

5

10

15

20 25 t (min)

30

dpH/dt

0,18





0,09







0 APICAL HOE-694 conc.

0 µM

1 µM

10 µM

BASOLATERAL 50 µM

0 µM

1 µM

10 µM

50 µM

24. ábra: HOE-694 hatása acidózist követő pHi visszatérésre HPAF sejteken HCO3¯ hiányában. Bemutató ábrák mutatják, hogy 3 perces 20 mM-os NH4Cl kezelést követően a sejtek hogyan viselkednek, ha mindkét oldalon helyetesítettük a Na+-t NMDG+-vel (0 Na+), majd a Na+ mentességet feloldottuk: A panel, apikálisan, HOE-694 jelenlétében (10 μM); B panel, bazolaterálisan, HOE-694 jelenlétében (50 μM). A C panel a különböző HOE-694 koncentrációknál mérhető pHi visszatérés meredekségek átlagát mutatja (n = 35). ** P < 0,001 és * P < 0,05 a kontrollhoz viszonyítva (C).

A benzil-guanidin származék HOE-694 gátlószerrel is megismételtük a méréseket (87),. Az EIPA hatásához hasonlóan viselkedett a sejtvonal HOE-694 alkalmazásakor (24.A és B ábra). Apikálisan alkalmazva az HOE-694-et a Na+ visszaadásakor 10 µM gátlószer, míg bazolaterálisan 50 µM inhibitor volt szükséges a pH visszatérésének gátlásához (24.C ábra). A gátlószer elvételekor megfigyeltük, hogy a gátló hatás a gátlószer elvétele után is megmaradt. HCO3¯ jelenlétében az EIPA bazolaterális alkalmazása nem járt szignifikáns gátló hatással a pHi acidózisból való visszatérésére. Ellenben EIPA (30 µM) és H2DIDS (500 µM) együttes alkalmazása szignifikáns gátló hatást fejtett ki (25. ábra). A két gátlószer együtt a pH visszatérést mintegy 90%-os hatásfokkal gátolta.

– 56 –

Eredmények

A

B

8.0 NH4+

EIPA

pHi

pHi

7.5

7.0

6.5

7.0

6.5 Ap

NH4+ EIPA

Ap

NH4+ EIPA

6.0

6.0 0

JB (mM/min)

Bl

H2DIDS

Bl

7.5

C

NH4+ EIPA

8.0

5

10

25 20 t (min)

15

0

5

10

15

20 25 t (min)

15

10

5  0 C

E

E+H

25. ábra: Az EIPA és a Na+- HCO3 kotranszporter gátló H2DIDS hatása acidózist követő pHi visszatérésre HPAF sejteken HCO3¯ jelenlétében. Bemutató ábrák mutatják, hogy 3 perces 20 mM-os NH4Cl kezelést követően a sejtek hogyan viselkednek HCO3¯-pufferelt oldatban: A, bazolaterálisan jelenlévő EIPA (30 μM) jelenlétében; B, EIPA mellett adott H2DIDS (500 μM) esetén. Mindkét esetben 10 μM EIPA apikális alkalmazásával blokkoltuk az apikális NHE működését. A C panel a pHi visszatérés meredekségének ionfluxusban kifejezett átlag értékeit (n = 5-11) ábrázoltuk bazolaterálisan jelenlévő EIPA jelenlétében (E), EIPA és H2DIDS jelenlétében (E+H) és gátlószerek nélkül (C). Ap, apikális; Bl, bazolaterális. * P < 0,05 a kontrollhoz viszonyítva.

Az eredményekből arra következtetünk, hogy fiziológiás körülmények között (HCO3¯ jelenlétében) egy Na+- és HCO3¯-függő, H2DIDS-érzékeny, valószínűleg NBC1 is fontos szerepet játszik a pH szabályozásban a Na+/H+ kicserélők mellett.

– 57 –

Eredmények

A

B 7.6

7.6

EIPA H2DIDS

7.4

EIPA

Bl

Bl

H2DIDS

7.4 7.2 pHi

pHi

7.2 7.0

7.0

6.8

6.8

Ap

ATP 6.6

6.6 0

3

6

9

12

0

15

3

6

9

12

15

t (min)

D

C EIPA

7.6

4

Bl

H2DIDS 7.4



-JB (mM/min)

3

pHi

7.2 7.0 Ap

forskolin

6.8

2

1

6.6

0 0

3

6

9

12

15

C

A

F

26. ábra: HPAF sejtek intracelluláris savasodásának mérése a bazolaterális HCO3 felvétel gátlásakor. Reprezentatív ábrák mutatják a pHi változását EIPA (30 μM) és H2DIDS (500 μM) együttes bazolaterális alkalmazásakor: A panel, nem stimulált sejtekben; B panel, apikálisan alkalmazott ATP (50 μM) stimuláció után; C panel, forskolin (10 μM) stimuláció esetén. A szaggatott vonal a meredekséget emeli ki, amelyet az ionfluxus számolásához alapul vettünk a bazolaterális HCO3 felvétel gátlása során. A D panel az ionfluxus (JB) értékek átlagát mutatja stimulálatlan (C), ATP- (A), illetve forskolin-stimulált (F) sejtekben. Ap, apikális; Bl, bazolaterális. * P < 0,05 a stimulálatlan kontrollhoz viszonyítva.

Transzepiteliális HCO3¯ szekréció Mivel erős HCO3¯ felvételt találtunk a sejtek bazolaterális oldalán, megvizsgáltuk, hogy ez a nagymennyiségű HCO3¯ képes-e a transzepiteliális HCO3¯ szekrécióra. A vizsgálatokat EIPA és H2DIDS bazolaterális alkalmazásakor mérhető intracelluláris savasodásának mérésével végeztük (26. ábra). Mivel az HPAF sejtekben működő NHE aktivitás elfedné a bazolaterálisan adott gátlószerek hatását, ezért az összes kísérletben

– 58 –

Eredmények

szükséges az apikális oldali NHE-t is gátolnunk EIPA-val (10 µM). EIPA és H2DIDS együttes bazolaterális alkalmazása egy lassú pHi csökkenést eredményezett (26.A ábra). Ezt okozhatta egy kismértékű nyugalmi HCO3¯ szekréció vagy olyan savasodást okozó mechanizmusok, amelyek folyamatosan jelen vannak a sejtben. Azonban ATP (50 µM) apikális alkalmazása a pHi csökkenés sebességét kétszeresére fokozta, mikor EIPA-t és H2DIDS-et is adtunk a rendszerhez (26.B ábra). A cAMP-rendszert serkentő forskolin (10 µM) apikális alkalmazása viszont nem okozott szignifikáns változást a pHi csökkenésében, mikor az EIPA-H2DIDS koktélt adtuk bazolaterálisan (26.C ábra). A stimulált és nyugalmi méréseink átlag eredményeit a 26.D ábrán foglaltuk össze.

– 59 –

Megbeszélés

MEGBESZÉLÉS

Patkány parotisz acinusból származó sejtek vizsgálata Több tanulmány kimutatta, hogy egyes in vitro tenyésztett acináris vagy duktális epitél sejtek konfluens monolayer-t alkotnak, illetve alkalmas modellként szolgálnak a transzepiteliális elektrolit szekréció vizsgálatához (21, 40, 78). A Par-C10 sejtvonalat körülbelül egy évtizede tenyésztették ki (74). A sejtek polarizált monolayer-ként növekszenek (75), muszkarinerg ACh és adrenerg stimulusokra is reagálnak és kifejezik a legfontosabb a nyálmirigy acinusra jellemző transzporterek mRNS-eit (72). Nem ismert azonban, hogy a sejtekben kimutatható anionszekréció (72) egyedül Cl¯ szekréciót, vagy a Cl¯ és HCO3¯ együttes transzportját foglalja magába. Kísérleteink egyik részében a HCO3¯ aniontranszportban játszott szerepét vizsgáltuk. Az aniontranszport szabályozásának egyik legfontosabb szereplője a Ca2+, ezért a sejten belüli Ca2+ koncentráció szigorú szabályozás alatt áll. Egér parotisz acináris sejteken kimutatták, hogy a forskolin-kiváltotta cAMP stimuláció PKA aktiváció révén a Ca2+ clearance-t aktiválja, valószínűleg a PMCA foszforilációján keresztül (35). A foszforiláció csak forskolin és egy Ca2+-szint emelő ágens (pl. CCh vagy CPA) együttes jelenlétében volt megfigyelhető (35). A Par-C10 sejtekkel végzett kísérleteink másik részében

a

sejtvonalban

kimutatható

Ca2+

clearance–ben

résztvevő

PMCA

transzporterek membrán-specificitását vizsgáltuk. Par-C10 sejtek ionszekréciójának vizsgálata Az

elektrolit-transzportot

vizsgáló

kísérleteinkben

rövidzárlati

áramméréssel

transzepiteliális anionszekréció volt kimutatható. Megfigyeléseink szerint nem csak az ATP, de a cAMP-szint emelő forskolin is stimulálta az anionszekréciót. Korábbi vizsgálatok a forskolin hatását változónak találták (72), valószínűleg azért, mert az ott használt sejttenyésztő médium koleratoxint is tartalmazott, amely kimeríthette az intracelluláris cAMP aktivációs útvonalat. Hogy a sejtek cAMP-aktivációs útvonalát is vizsgálhassuk, kerültük a koleratoxin használatát a sejttenyésztés során. Eredményeink

– 60 –

Megbeszélés

a CFTR funkcionális jelenlétét támasztják alá a Par-C10 sejtekben. A CFTR megjelenése mRNS szinten acináris és duktális nyálmirigy sejtekben is általánosan elfogadott, bár a CFTR szerepe az anionszekrécióban valószínűleg kisebb, mint a Ca2+aktiválta Cl¯-csatornáké (9). Vizsgálataink szerint a Par-C10 sejtekben megfigyelt Cl¯ transzport mind Ca2+-, mint cAMP-aktiválta útvonalon keresztül stimulálható. Ugyancsak megfigyeltük, hogy az NKCC gátlószereként ismert bumetanid gátolja a forskolin ISC–re kifejtett hatását. Ez a megfigyelés összhangban van korábbi eredményekkel, melyek szerint a parotisz Cl¯ szekréciója nagymértékben függ a bazolaterális membránban megjelenő NKCC1 aktivitásától (9, 88). Kísérleteinkben, hasonlóan korábbi megfigyelésekhez (72), a HCO3¯ jelenléte mintegy kétszeresére emelte a forskolin ISC emelő hatását. Azonban egyedül rövidzárlati árammérések alapján nehéz megállapítani, hogy ilyen esetekben a HCO3¯ együtt szekretálódik a Cl¯-nal, vagy csak segíti a Cl¯ szekrécióját. Hogy erre a kérdésre választ kapjunk, mikrofluorometriás vizsgálatokat végeztünk. Hogy azonosítani tudjuk a HCO3¯-felvételben szerepet játszó transzportereket, savterheléses

vizsgálatokat

végeztünk,

és

vizsgáltuk,

milyen

mechanizmusok

segítségével tudnak a sejtek savterhelés után regenerálódni. HCO3¯ mentes közegben a regeneráció bazolaterálisan Na+-függőnek és EIPA-érzékenynek mutatkozott, amely az NHE1

transzporter

jelenlétére

utal

a

sejtek

bazolaterális

membránjában.

Megfigyelésünk egybevág az NHE1 korábbi leírásával, mint a gasztrointesztinális epitél sejtekben általánosan előforduló pH szabályozó transzporter (89). HCO3¯ jelenlétében is Na+-függő volt a pH visszatérés, amelyet gátolt az EIPA és H2DIDS együttes jelenléte. Eredményünk bizonyítja, hogy az NBC1 transzporternek ugyancsak fontos szerepe van a sejtek HCO3¯ felvételében. Ily módon eredményeink összhangban vannak Perry és mtsai eredményeivel, amelyek elektrogén és elektroneutrális NBC transzporter jelenlétét igazolják Par-C5 sejtvonalon (90). Ez a sejtvonal és az általunk vizsgált ParC10 sejtvonal ugyanabból laboratóriumból származik (75). Az NBC1 jelenlétét ezen kívül RT-PCR, immunoblotting és pHi mérések is igazolják tengerimalac, egér, patkány és emberi nyálmirigyeken egyaránt (91-93). Izolált, nem polarizált emberi parotisz sejtekben azonban az NBC1 transzporter minimális szerepet játszott az intracelluláris pH szabályozásban (10). Mindazonáltal adataink kimutatták, hogy a Par-C10 sejtek

– 61 –

Megbeszélés

HCO3¯ felvétele Na-függő, és a bazolaterális Na+/H+ kicserélő és Na+-HCO3¯ kotranszporter végzi a feladatot. Korábbi,

hasnyálmirigy

duktuszok

végzett

HCO3¯

szekréciós

kísérleteinkben

módszereinkhez kihasználtuk a HCO3¯ bazolaterális oldali felvétele és apikális oldali szekréciója közti szoros kapcsolatot (40, 79). Ennek értelmében mikor a bazolaterális oldalon EIPA és H2DIDS adásával meggátoltuk a HCO3¯ felvételét, a folytatólagos apikális oldali HCO3¯ leadás miatt a sejt pH-ja esni kezdett. A pH csökkenés kezdeti meredekségéből következtethetni tudunk a HCO3¯ szekréció aktivitására. A Par-C10 sejtekben EIPA és H2DIDS bazolaterális alkalmazása pH csökkenést eredményezett, és ez a hatás fokozható volt forskolinnal. Az eredmény mutatja, hogy cAMP-aktiváción keresztül stimulálható a HCO3¯ efflux a sejtekben. Adataink erősen sugallják, hogy ezekben a sejtekben van transzepiteliális HCO3¯ szekréció, amely stimulálható cAMPon keresztül. A forskolin-indukált savasodás gátolható volt apikális CFTRinh-172 adásával, ami igazolja, hogy a CFTR csatorna valamilyen szerepet játszik a sejtek HCO3¯ szekréciójában. A CFTRinh-172 csak apikális adásakor fejtett ki gátló hatást, bazolaterális alkalmazásakor nem, ami alátámasztja, hogy CFTR csatornák csak a sejtek apikális felszínén jelennek meg, és hogy a HCO3¯ efflux az apikális oldalon történik. Eredményeink szerint a Par-C10 sejtek a hasnyálmirigy duktuszsejtek elektrolitszekréciójához hasonlóan működnek (40, 79). A HCO3¯ szekréciót ugyancsak fokozza a Ca2+-jelet kiváltó, apikálisan adott ATP. Egy valószínűleg újfajta ATP-függő Cl¯ csatornát mutattak ki egér parotisz acináris sejteken (94). Saját, Par-C10 sejteken végzett, intracelluláris Ca2+-szint méréseink szerint az ATP Ca2+-szint emelkedést csak apikális adásakor eredményez, bazolaterálisan adva nincs hatása a sejtek Ca2+ koncentrációjára. Ezeket az eredményeket összegezve vonzó arra következtetnünk, hogy jelen esetben a cAMP- és Ca2+-szignál transzdukciós rendszerek szinergista módon befolyásolják egymást. Az ATP a szekréciós granulumokból szabadul fel, és ha ATP-függő Cl¯ csatornák vannak jelen az apikális felszínen, akkor ezen csatornák parallel aktivációja tovább serkenti a szekréciót. Az emelkedett szintű folyadékszekréció pedig segíti a szekréciós granulumokból a lumenbe jutott fehérjék továbbítását a duktuszok felé (9). Cl¯ szubsztitúciós kísérleteink alapján egy Cl¯/HCO3¯ kicserélő mechanizmus működik a Par-C10 sejtek bazolaterális membránjában. A kicserélő aktív nyugalmi állapotban, és

– 62 –

Megbeszélés

nem érzékeny a cAMP- vagy a Ca2+-szint emelkedésére. DNDS gátolta az anionkicserélő

működését,

ezért

valószínűleg

a

legtöbb

epitél

sejt

bazolaterális

membránjában megtalálható (95) AE2 izoformát sikerült kimutatnunk. Nyálmirigyek acináris sejtjeiben a bazolaterális Cl¯/HCO3¯ kicserélők fontos alternatív útvonalat biztosítanak a Cl¯ elektrokémiai grádiensük ellenében történő felvételhez (9). Funkcionális eredményeinket molekuláris biológiai módszerrel is alátámasztottuk. Vizsgálataink szerint az NKCC1, NHE1, NBC1, CFTR és AE2 transzporterek mRNS szinten is kimutathatók a Par-C10 sejtekben. Összegfoglalva eredményeinket, a Par-C10 sejtek konfluens tenyészetet hoznak létre permeábilis felületen, és egy jó kísérleti modellrendszerként szolgálnak nyálmirigyek HCO3¯ szekréció vizsgálatához. A sejtekben szabályozott, vektoriális HCO3¯ szekréció mutatható ki. Bazolaterális oldalon valószínűleg az NHE1 és NBC1 az elsődleges, a HCO3¯ felvételét végző transzporterek, míg a Cl¯ felvétele az NKCC1 és AE2 transzportereken keresztül valósul meg. Apikális oldalon funkcionálisan is kimutatható CFTR csatorna. A szekréció mind cAMP-, mind Ca2+-függő módon stimulálható. A patkány parotisz eredetű Par-C10 sejtek Ca2+ clearance vizsgálata A szekréció megfelelő működéséhez elengedhetetlen az intracelluláris Ca2+-szint szigorú szabályozása. Ennek közelebbi megismerése érdekében intracelluláris Ca2+-szint mérésekkel vizsgáltuk a plazma membránban jelen lévő, a Ca2+ clearanceben résztvevő transzporterek elhelyezkedését és aktivitását. Kihasználva a Par-C10 sejtek szoros monolayer tulajdonságát (72), vizsgálni tudtuk a bazolaterálisan és apikálisan lokalizálódó PMCA transzporterek közötti különbségeket. A másik fontos tulajdonság, hogy a natív egér parotisz sejtekhez hasonlóan (35), Par-C10 sejtekben a forskolin növelte a CCh-kiváltotta intracelluláris Ca2+-jelet. Valószínű tehát, hogy korábban vizsgált natív egér parotisz sejtekhez hasonló intracelluláris Ca2+-szint szabályozó mechanizmusok működnek a patkány eredetű Par-C10 sejtekben. Továbbá, a Transwell membránra ültetett sejtekben robusztus Ca2+-jelet eredményezett az ATP apikális vagy a CCh bazolaterális alkalmazása. Ebből következtethető, hogy a P2Y2 purinerg és a muszkarinerg receptorok polarizáltan fejeződnek ki a sejteken. Hasonló eredményeket figyeltek meg rövidzárlati árammérés során korábban (72), azonban

– 63 –

Megbeszélés

eredményeink az elsők, amelyek Ca2+-szinten igazolják az agonista-kiváltott Ca2+ válasz polarizáltságát ezeken a sejteken. A Par-C10 sejtek ugyanakkor kevésbé érzékenynek bizonyultak CCh-ra, mint a natív egér parotisz acináris sejtek. Ennek oka valószínűleg a stabil sejttenyészet fenntarthatósága miatti valamilyen fokú dedifferenciálódás következményeként a muszkarinerg receptorok számának csökkenése. Ennek ellenére az adatok azt mutatják, hogy a Par-C10 sejtekben, hasonlatosan az egérből izolált parotisz acinusokhoz, a Ca2+-szignációs útvonal működik, ezért a sejtvonal alkalmas modellként az összehasonlító vizsgálatokhoz. La3+ gátlás segítségével el tudtuk különíteni az apikális és bazolaterális PMCA aktivitást. Eredményeink szerint a funkcionálisan izolált apikális PMCA a teljes PMCA aktivitás mintegy 40%-át adja, míg a bazolaterális transzporter a teljes aktivitás körülbelül 20%-át biztosítja. Tehát az apikális felszínen kifejeződő PMCA nagyobb aktivitású, hasonlóan szubmandibuláris és hasnyálmirigy acinus sejteken végzett immunfluoreszcens és funkcionális eredményekhez (96, 97). Nehéz figyelmen kívül hagyni, hogy az izolált PMCA aktivitások összege nem tesz ki 100%-ot, hanem csak körülbelül 60%-ot. Ennek oka lehet az, hogy egyéb Ca2+ clearance útvonalak is szerepet játszanak a mechanizmusban, mint például a mitokondriális Ca2+ felvétel vagy a NCX kicserélő. A mitokondriális Ca2+ felvétel alacsony affinitású, és főként az agonistakiváltott Ca2+ felszabadulás utáni Ca2+ clearance-ben játszik szerepet (98). A NCX kicserélő ugyancsak alacsony affinitású, nagy kapacitású, amelyet a Na+ befelé irányuló elektrokémiai grádiense hajt, ezért elsődleges szerepe van az elektromosan ingerelhető sejtekben, így a szívizomsejtekben (99). Jelenlegi tudásunk szerint parotisz acináris sejtekben nem fejeződik ki NCX, habár a rokon hasnyálmirigy duktusz sejtekben kimutatták a jelenlétét, és a Ca2+ clearance-ben betöltött szerepét az acináris régióban (100), ezért elképzelhető, hogy hasonló mechanizmus a Par-C10 sejtekben is megjelenik. Kísérleteink szerint azonban sem a mitokondriális Ca2+ felvétel gátlása (Ru360-nal), sem a lehetséges NCX kicserélő gátlása (Na+ mentes közeg alkalmazásával) nem volt hatással a sejteken mért Ca2+ clearance mértékére. Továbbá, a PMCA-ra specifikus gátlószer karboxieozin (85, 86) alkalmazása a La3+-hoz hasonló eredményeket hozott, igazolva, hogy a La3+-érzékeny Ca2+ clearance a PMCA aktivitásának köszönhető. Lehetséges azonban, hogy az 1 mM La3+ nem okozza a PMCA transzporterek teljes gátlását, és a maradék clearance a gátlás nélkül maradt

– 64 –

Megbeszélés

PMCA aktivitásnak köszönhető. Hasonló szituáció nyert bizonyságot T sejtek esetén, ahol 2 mM La3+ a Ca2+ clearance 90%-át volt csak képes gátolni, miközben az összes egyéb clearance útvonalat is egyidejűleg gátolták (82). Tulajdonképpen, egy kis (~5%) maradék Ca2+ clearance a mi rendszerünkben is mérhető volt még akkor is, mikor a La3+-t a sejtek mindkét oldalára adtunk, így valószínűleg ez a nem teljes gátlás áll a probléma hátterében. Egy másik lehetőség a különbség magyarázatára, ha a La3+ a szoros kapcsolatok fellazulása miatt képes volt átdiffundálni a sejtek másik oldalára, és ott részlegesen gátolni a PMCA transzportereket. Mindenesetre a legfontosabb megfigyelés, hogy forskolinnal az apikális oldali PMCA aktivitása fokozható volt, míg a bazolaterális PMCA nem reagált a forskolin kezelésre. Amennyiben a La3+ átszivárgott volna a szoros kapcsolatokon, úgy ilyen mértékű különbségek forskolin jelenlétében nem lettek volna mérhetők. Ugyancsak, ha a forskolin a mitokondriális Ca2+ clearance mértékét növelte volna, úgy a különböző oldalra adagolt La3+ ugyanazt az eredményt hozta volna, lévén a mitokondrium transzportereit a La3+ nem befolyásolja. Korábbi eredményeink szerint a forskolin nem befolyásolja a Ca2+ clearance-t, ha La3+-nal gátoljuk a PMCA aktivitást (35). Összességében ezek a funkcionális eredmények meggyőzően támasztják alá, hogy az apikális oldali PMCA aktivációja megkülönböztetett, és PKA aktiváción keresztül történik a Par-C10 sejtekben, hasonlatosan az egér parotisz acináris sejtekben megfigyeltekkel. A bazolaterális oldali PMCA nem aktiválható a PKA-rendszeren keresztül. A PMCA általánosan expresszált fehérje, és nagy affinitással köti a Ca2+-t, így valószínű, hogy alapvető része van a nyugalmi intracelluláris Ca2+ koncentráció szabályozásában és fenntartásában (101, 102). Emellett bizonyítékok támasztják alá, hogy a PMCA a normál Ca2+ szignalizáció során dinamikus szabályozás alatt áll (82, 103). Kimutatták, hogy a PKA-általi PMCA foszforiláció emeli a kalmodulin kötés affinitását, és ezzel a PMCA aktivitását (104). Továbbá, parotisz acináris sejtekben a PKA aktivációja [Ca2+]i-függő módon eredményez PMCA aktivációt (35), finoman a Ca2+ koncentrációhoz hangolva annak aktivitását. Összefoglalva, az adatok alapján a PKA-mediált PMCA foszforiláció fontos kapocs lehet a cAMP- és Ca2+-szabályozó útvonalak között, ahol a cAMP aktiváció átmenetileg formálja az intracelluláris Ca2+ szignalizációt.

– 65 –

Megbeszélés

Összefoglalva eredményeinket elmondhatjuk, hogy a Ca2+ clearance és a Ca2+ efflux a Par-C10 sejtek acináris oldalán megkülönböztetett, PKA-n keresztül aktiválható PMCA transzporteren keresztül valósul meg. Ez a polarizált mechanizmus valószínűleg fontos szereplője a parotisz acináris sejtek Ca2+-szignalizációjának, és jól reprezentálja az exocitózis és folyadékszekréció időbeli és térbeli szabályozását. Hasnyálmirigy duktuszból származó sejtvonal ionszekréciójának vizsgálata Az HPAF sejtvonal egyike azon emberi hasnyálmirigy adenokarcinómából származó sejtvonalaknak, amelyet alkalmas lehet in vitro ionszekréciós vizsgálatokhoz modellként. Mindezek a sejtvonalak megtartották a duktális epitélsejtek egyes jellemzőit, de vannak bizonyos defektusai is, és egyiket sem találták minden szempontból tökéletesnek. Az HPAF sejtvonalról korábban megállapították, hogy szövettenyészetben konfluens, polarizált monolayer-t alkot, és hogy kifejez egyes duktális markereket (105). Permeábilis felületre növesztve egy relatív magas transzepiteliális ellenállású monolayer-t alkot, a sejtek között szoros kapcsolatokkal (106). A sejtek Ca2+ stimulusra transzepiteliális Cl¯ szekrécióval válaszolnak (73), összhangban korábbi funkcionális megfigyelésekkel, miszerint CaCC-k vannak jelen a membránjában (107). A hasnyálmirigy duktális anionszekrécióban központi szerepet játszó CFTR csatornát csupán kis mértékben expresszálják. HCO3¯ szekréciós kapacitását alacsonyra becsülték (73), ami a duktuszok legfontosabb feladata volna in vivo. Tanulmányunk célja ezen sejtek HCO3¯ szekréciós kapacitásának pontos vizsgálata volt. Ehhez először azonosítanunk kellett a legfontosabb sav/bázis transzportereket, amelyek a

sejt

intracelluláris

pH-jának

szabályozását

végzik.

Elsőként

végeztünk

mikrofluorometriás pHi méréseket polarizált, apikális-bazolaterális oldalon külön perfundált HPAF sejteken. Eredményeink szerint a sejtekben magas szinten expresszálódik NBC transzporter, ami a transzepiteliális HCO3¯ szekréció számára a legfontosabb hajtóerőt adja. Az HPAF sejtek alaptulajdonságai megegyeztek a korábban leírtakkal (73, 106, 108). Az előzetes eredményekhez hasonlóan az apikálisan adott ATP ISC emelkedést váltott ki (73). A válasz, ami valószínűleg egy általánosan stimulált Cl¯ szekréció eredménye,

– 66 –

Megbeszélés

gátolható volt az NKCC1 gátlószereként ismert bumetanid bazolaterális alkalmazásával. Az eredmény szerint az NKCC1 valószínűleg fontos szerepet játszik a sejtek bazolaterális oldalán a Cl¯ felvételben, ahogy ezt egy másik hasnyálmirigy duktális sejtvonal, a Capan-1 esetében is megfigyeltük (40). A bumetanid gátlása azonban nem volt teljes, amiből arra következtetünk, hogy a Cl¯ más mechanizmuson keresztül is bejut a sejtbe, esetleg az intracelluláris Cl¯ koncentrációnak valamennyi időre van szüksége, hogy az NKCC gátlása esetén kialakuló új egyensúlyi állapotot elérje. HCO3¯ jelenléte a perfúziós oldatban korábbi vizsgálatok alapján nem befolyásolta az alap, illetve az ATP-vel stimulált ISC értéket (73). Saját eredményeink is alátámasztják ezt, de a bumetaniddal végzett kísérletek egy nem várt eredményt hoztak. HCO3¯ jelenlétében a bumetanidnak nem volt szignifikáns hatása az ATP stimulált ISC értékre. Feltételezve, hogy ezen körülmények között is kialakult a bumetanid gátló hatása az NKCC1 transzporteren, eredményeink szerint a HCO3¯ jelenléte megnyitott egy új anionszekréciós útvonalat, amely a Cl¯ bazolaterális felvételétől függetlenül is működik. Ez a megfigyelés azonban nem pontosítja, hogy jelen esetben a HCO3¯ szekréciójáról, vagy egy HCO3¯-függő Cl¯ szekrécióról van szó. Ezen kérdés tisztázása érdekében szükséges volt azonosítani az HPAF sejtekben a sav/bázis egyensúly fenntartásában szerepet játszó transzportereket. Az NH4+ pulzusos kísérletekben HCO3¯ mentes környezetben a pHi visszatérés apikális és bazolaterális oldali H+-transzporttal is megvalósult. A folyamat Na+-függőnek, és EIPA-, illetve HOE-694-érzékenynek mutatkozott, ezért következtetésünk szerint NHE közvetítette. Hasonló megfigyelésekről számoltak be kaptak CFPAC-1 hasnyálmirigy duktusz sejtvonalon is (21). Az NHE kicserélők (SLC9 transzportercsalád), főként az NHE1, széleskörűen expresszálódnak epitél sejtek bazolaterális membránjában. Egyes sejtekben, például egér és patkány hasnyálmirigy nagyobb duktuszokban, azonban az apikális felszínen is megjelennek NHE transzporterek, főként az NHE2 és/vagy az NHE3. Funkciójuk valószínűleg nyugalmi állapotban a HCO3¯ visszaszívásában van (109, 110). Az apikális és bazolaterális NHE aktivitás különböző mértékű EIPA- és HOE-694 érzékenysége nem egyezik a leírt NHE elrendezéssel, és további vizsgálatokat kíván. Az apikális oldali NHE megjelenéséből azonban következtethetünk arra, hogy az HPAF sejtvonal az emberi hasnyálmirigy nagyobb duktuszaiból származik (61, 111).

– 67 –

Megbeszélés

HCO3¯ jelenlétében a pHi visszatérését savterhelés után nagymértékben segítette egy H2DIDS-érzékeny, Na+- és HCO3¯-függő transzporter mechanizmus a bazolaterális membránban. Ez nagy valószínűséggel az NBC1 transzporternek köszönhető. A transzporter az SLC4 család tagja, és jelenlétét több rágcsáló hasnyálmirigy duktuszában (42, 79, 109) és az emberi Capan-1 (40) és CFPAC-1 (21) duktális sejtvonalban is igazolták. Az ilyen nagyfokú bazolaterális NBC1 aktivitás mindenképpen felveti a vektoriális HCO3¯ szekréció lehetőségét. Ugyanakkor az NBC1 és egy lehetséges Cl¯/HCO3¯ kicserélő összehangolt munkája révén, indirekt úton a Cl¯ szekréciót is segítheti. Hogy eldönthessük, hogy az HPAF sejtek képesek-e HCO3¯ szekrécióra, a Par-C10 sejteknél használt technikát alkalmaztunk, melynek értelmében a sejtek HCO3¯ felvételi és H+ leadási transzportereit gátolva a pHi változás kezdeti sebességéből megbecsülhetjük az apikális HCO3¯ efflux aktivitását. Vizsgálataink eredménye szerint míg az ATP fokozta az inhibitorok kiváltotta savasodás kezdeti sebességét, a forskolin nem volt hatással az pH változásra. Ez ellentmond a korábbi Capan-1 vagy CFPAC-1 sejtvonalakban mért hatásokkal (21, 40), de beleillik az HPAF sejtekről leírt korábbi elképzelésel (73), mely szerint az HPAF sejtek anionszekréciója nem érzékeny a cAMP szint változásaira. Eredményeink emellett alátámasztják, hogy a purinerg receptorok aktivációja, valószínűleg az apikális membránon keresztüli, HCO3¯ kiáramlást vált ki a sejtekben. Habár az össz anionszekréció mértéke, amelyet az ISC mérés mutatott meg, nem változik, ha HCO3¯-t adunk a sejtek körüli folyadékhoz, eredményeink szerint a HCO3¯ mégis fontos részét képezi az aniontranszportnak fiziológiás körülmények között. Következtetésünk tehát, hogy az HPAF sejtek expresszálják a transzepiteliális Cl¯ és HCO3¯ szekrécióhoz szükséges bazolaterális oldali kulcstranszportereket, név szerint az NKCC1 és NBC1 transzportereket, és igazoltuk, hogy az HPAF monolayer-ek képesek Ca2+-szint emelő stimulus mellett bizonyos fokú HCO3¯ szekrécióra (a Cl¯ szekréció mellett). Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a Cl¯ szekréció apikális oldali CaCC csatornákon keresztül valósul meg (73, 107), de a HCO3¯ szekrécióban résztvevő apikális transzporter azonossága még nem ismert.

– 68 –

Következtetések

KÖVETKEZTETÉSEK

Eredményeink alapján megerősíthetjük, hogy a Par-C10 sejtvonal jó kísérleti modellrendszerként

szolgál

patkány

vagy

emberi

nyálmirigy

ionszekréciós

vizsgálatokhoz. A sejtekben kimutatható HCO3¯ és Cl¯ transzport szabályozott és vektoriális módon történik. A Cl¯ felvételét a bazolaterálisan elhelyezkedő NKCC1 és AE2 segíti. A HCO3¯ bazolaterális felvételét főként az NHE1 és NBC1 közvetíti. Apikális oldalon CFTR csatorna és Ca2+-függő Cl¯-csatornák helyezkednek el (27. ábra). A HCO3¯ apikális oldali kijutása CFTR-függő folyamat, de pontos mechanizmusa nem ismert. Az anionszekréció cAMP- vagy Ca2+-jelen keresztül is stimulálható.

27. ábra: A Par-C10 sejtekben azonosított transzporterek elhelyezkedése.

Az intracelluláris Ca2+ szintet különböző, bazolaterálisan és apikálisan elhelyezkedő plazma membrán Ca2+ ATP-áz (PMCA) transzporterek szabályozzák. Az apikális oldali PMCA PKA-n keresztül stimulálható, így funkcionálisan elkülöníthető a bazolaterális membránban működő transzportertől. Ez a polarizált mechanizmus fontos szereplője a

– 69 –

Következtetések

Ca2+ szignalizációnak, és jól reprezentálja a parotisz acináris sejtekben az exocitózis és folyadékszekréció időbeli és térbeli szabályozását. Eredményeink alapján elmondható, hogy a Par-C10 sejtvonal alkalmas a parotisz acinusok folyadékszekréciójának és a Ca2+ szignalizációjának modellezésére.

28. ábra: Iontranszport mechanizmusok az HPAF sejtvonalban.

A funkcionális CFTR-t nem tartalmazó hasnyálmirigy duktuszból származó HPAF sejtvonalban sikerült vektoriális HCO3¯ szekréciót kimutatnunk. A sejtek HCO3¯ felvételét a bazolaterális oldalon elhelyezkedő NHE és NBC1 transzporterek segítik, és purinerg receptoron keresztül aktiválható, de cAMP-szint emelő ágens a szekrécióra nincs hatással (28. ábra). Apikális oldalon is megjelenik egy NHE transzporter, amely eredményből arra következtettünk, hogy a sejtvonal valamelyik nagyobb duktuszból származik. Az HPAF sejtvonal a funkcionális CFTR hiánya ellenére aktívan transzportál HCO3¯ ionokat, így alkalmas a CFTR hiányos elektrolit transzport modellezésére.

– 70 –

Összefoglalás

ÖSSZEFOGLALÁS Parotisz acináris eredetű Par-C10 és hasnyálmirigy duktusz eredetű HPAF sejtvonal ionszekrécióját, és Par-C10 sejtekben az intracelluláris Ca2+-szint szabályozását vizsgáltuk. A sejtek Transwell-Clear membránra ültetve konfluens monolayert alkotnak. Rövidzárlati árammérés (ISC) során ATP-vel mindkét, forskolinnal a Par-C10 anionszekréciója stimulálható. Par-C10 sejtekben HCO3¯-mentes közegben a Na+-K+2Cl¯-1 kotranszportert (NKCC1) gátló bumetanid gátolja a forskolin hatását. Az intracelluláris pH-t (pHi) mérve savterhelésből a pHi visszatérése Na+-függő és a Na+/H+ kicserélő-1-re (NHE1) szelektív EIPA-ra érzékeny. HCO3¯-ot tartalmazó közegben a pHi emelkedést a Na+-HCO3¯ kontranszporter-1 (NBC1) inhibitor H2DIDS és EIPA gátolja. Az inhibitorok adásakor a pHi csökken, és ez forskolinnal vagy ATP-vel fokozható. A CFTRinh-172 csak apikálisan gátolja a forskolin hatását. Bazolaterálisan adott Cl¯-mentes közegben forskolin- és ATP-független pHi emelkedést mérhetünk, melyet az anion kicserélő-2-re (AE2) szelektív DNDS gátol. Karbakol bazolaterális vagy ATP apikális adása Ca2+-jelet vált ki. A Ca2+ clearance forskolinnal csak apikálisan fokozható. A La3+ alkalmazása melletti maradék Ca2+ clearance-t a mitokondriális Ca2+-felvételt gátló Ru360, és Na+-mentes közeg nem, de a plazma membrán Ca2+ ATP-ázt (PMCA-t) gátló karboxieozin csökkenti. HPAF sejtekben az ATP ISC-re gyakorolt hatását a bumetanid csak HCO3¯-mentes közegben gátolja. A sejtek savterhelésből való visszatérése Na+-függő, és az apikális és bazolaterális oldalon eltérő mértékűen EIPA-érzékeny. HCO3¯-tartalmú oldatban a pHi visszatérés H2DIDS és EIPA együttes adásával gátolható. A HCO3¯-felvétel és H+-leadás gátlásakor a pHi csökken. A hatást ATP igen, forskolin nem fokozza. Eredményeink alapján mindkét sejttípus aktívan szekretál HCO3¯-ot. A Par-C10 sejtekben bazolaterálisan NHE1, NBC1, NKCC1 és AE2, apikálisan CFTR mutatható ki. A szekréció cAMP- és Ca2+úton serkenthető. Bazolaterálisan mAChR, apikálisan purinerg receptorok találhatók. A Ca2+ clearance-t a két oldalon különböző PMCA-k irányítják. Az apikális PMCA protein kináz A-n keresztül stimulálható. Az HPAF sejtek bazolaterális oldalán NHE, NBC, és NKCC1 működik. A sejtek apikális felszínén is található NHE transzporter, így a sejtvonal valószínűleg nagyobb duktuszokból származik. A szekréció purinerg úton stimulálható, a cAMP szint emelkedése nincs hatással.

– 71 –

Summary

SUMMARY We investigated the HCO3¯ secretion of the parotid acinar Par-C10 and pancreatic ductal HPAF cell line, and the Ca2+ clearance in Par-C10 cells. The cells seeded onto TranswellClear membranes form confluent monolayers. In short circuit current (ISC) measurements anion secretion is stimulated by ATP in both cell lines, and by forskolin in Par-C10 cells. In Par-C10 cells bumetanide, an inhibitor of Na+-K+-2Cl¯ cotransporter-1 (NKCC1), prevented the effect of forskolin in HCO3¯-free solution. Measuring the intracellular pH (pHi), the recovery from acid load is Na+-dependent and sensitive to EIPA, an inhibitor of Na+/H+ exchanger-1 (NHE1). In HCO3¯ solution basal EIPA and H2DIDS, inhibitor of Na+-HCO3¯ cotransporter-1 (NBC1), inhibits the pHi recovery from acid load. Basal application of the inhibitors results in a pHi drop, which can be enhanced by ATP or forskolin. CFTRinh-172 prevents the effect of forskolin only apically. Withdrawal of Cl¯ from the basal side re-sults in an ATP- and forskolin-insensitive pHi elevation that can be inhibited by DNDS, inhibitor of anion exchanger-2 (AE2). Basal carbachol or apical ATP application results in an elevation of intra-cellular Ca2+ level. Ca2+ clearance is only enhanced by forskolin apically. The clearance in the pre-sence of La3+ cannot be further inhibited either by Ru360, an inhibitor of mitochondrial Ca2+ uptake, or by Na+-free solution; only the plasma membrane membrane Ca2+ ATP-ase (PMCA) selective carboxyeosin is effective. In HPAF cells bumetanide inhibits the effect of ATP on ISC only in HCO3¯-free solution. The pH recovery from acid load is Na+-dependent, and sensitive to a different degree on the two sides to EIPA. In HCO3¯ solution application of H2DIDS and EIPA inhibits the pH recovery. The inhibition of HCO3¯ influx and H+ efflux results in a pH drop that can be enhanced by ATP but not by forskolin. Our conclusion is that both cell lines secrete HCO3¯. In Par-C10 cells NHE1, NBC1, NKCC1 and AE2 are located on the basal, and CFTR on the apical side. HCO3¯ secretion is enhanced by intracellular cAMP- and Ca2+. mAChR is expressed on the basal, and purinergic receptors on the apical side. The Ca2+ clearance is handled through PMCA transporters on both sides, but only the apical clearance is stimulated by protein kinase A. HPAF cells express NHE, NBC, and NKCC1 on the basal, and NHE on the apical side, thus HPAF cells are suggested to originate from large ducts. The anion secretion is stimulated by ATP but not by forskolin.

– 72 –

Irodalomjegyzék

IRODALOMJEGYZÉK

1.

Thaysen J H, Thorn N A, and Schwartz I L: Excretion of sodium, potassium, chloride and carbon dioxide in human parotid saliva. Am J Physiol 1954; 178 (1): 155-9.

2.

Proctor G B and Carpenter G H: Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci 2007; 133 (1): 3-18.

3.

Ishikawa Y, Cho G, Yuan Z, Skowronski M T, Pan Y, and Ishida H: Water channels and zymogen granules in salivary glands. J Pharmacol Sci 2006; 100 (5): 495-512.

4.

Nagy A, Nagashima H, Cha S, Oxford G E, Zelles T, Peck a B, and HumphreysBeher M G: Reduced oral wound healing in the NOD mouse model for type 1 autoimmune

diabetes

and

its

reversal

by

epidermal

growth

factor

supplementation. Diabetes 2001; 50 (9): 2100-4. 5.

Nagy A, Barta A, Varga G, and Zelles T: Changes of salivary amylase in serum and parotid gland during pharmacological and physiological stimulation. J Physiol Paris 2001; 95 (1-6): 141-5.

6.

Groschl M: The physiological role of hormones in saliva. Bioessays 2009; 31 (8): 843-52.

7.

Castle D and Castle A: Intracellular transport and secretion of salivary proteins. Crit Rev Oral Biol Med 1998; 9 (1): 4-22.

8.

Turner R J and Sugiya H: Understanding salivary fluid and protein secretion. Oral Dis 2002; 8 (1): 3-11.

9.

Melvin J E, Yule D, Shuttleworth T, and Begenisich T: Regulation of fluid and electrolyte secretion in salivary gland acinar cells. Annu Rev Physiol 2005; 67 445-69.

10.

Nakamoto T, Srivastava A, Romanenko V G, Ovitt C E, Perez-Cornejo P, Arreola J, Begenisich T, and Melvin J E: Functional and molecular characterization of the fluid secretion mechanism in human parotid acinar cells. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2007; 292 (6): R2380-90.

– 73 –

Irodalomjegyzék

11.

Gerelsaikhan T and Turner R J: Transmembrane topology of the secretory Na+K+-2Cl- cotransporter NKCC1 studied by in vitro translation. J Biol Chem 2000; 275 (51): 40471-7.

12.

Nagy A and Turner R J: The membrane integration of a naturally occurring alpha-helical hairpin. Biochem Biophys Res Commun 2007; 356 (2): 392-7.

13.

Nguyen H V, Stuart-Tilley A, Alper S L, and Melvin J E: Cl(-)/HCO(3)(-) exchange is acetazolamide sensitive and activated by a muscarinic receptorinduced [Ca(2+)](i) increase in salivary acinar cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2004; 286 (2): G312-20.

14.

Ko S B, Luo X, Hager H, Rojek A, Choi J Y, Licht C, Suzuki M, Muallem S, Nielsen S, and Ishibashi K: AE4 is a DIDS-sensitive Cl(-)/HCO(-)(3) exchanger in the basolateral membrane of the renal CCD and the SMG duct. Am J Physiol Cell Physiol 2002; 283 (4): C1206-18.

15.

Zeng W, Lee M G, Yan M, Diaz J, Benjamin I, Marino C R, Kopito R, Freedman S, Cotton C, Muallem S, and Thomas P: Immuno and functional characterization of CFTR in submandibular and pancreatic acinar and duct cells. Am J Physiol 1997; 273 (2 Pt 1): C442-55.

16.

Hartzell C, Qu Z, Putzier I, Artinian L, Chien L T, and Cui Y: Looking chloride channels straight in the eye: bestrophins, lipofuscinosis, and retinal degeneration. Physiology (Bethesda) 2005; 20 292-302.

17.

Tsunenari T, Sun H, Williams J, Cahill H, Smallwood P, Yau K W, and Nathans J: Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. J Biol Chem 2003; 278 (42): 41114-25.

18.

Nehrke K, Arreola J, Nguyen H V, Pilato J, Richardson L, Okunade G, Baggs R, Shull G E, and Melvin J E: Loss of hyperpolarization-activated Cl(-) current in salivary acinar cells from Clcn2 knockout mice. J Biol Chem 2002; 277 (26): 23604-11.

19.

Wang G X, Hatton W J, Wang G L, Zhong J, Yamboliev I, Duan D, and Hume J R: Functional effects of novel anti-ClC-3 antibodies on native volume-sensitive osmolyte and anion channels in cardiac and smooth muscle cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003; 285 (4): H1453-63.

– 74 –

Irodalomjegyzék

20.

Breton S: The cellular physiology of carbonic anhydrases. Jop 2001; 2 (4 Suppl): 159-64.

21.

Rakonczay Z, Jr., Fearn A, Hegyi P, Boros I, Gray M A, and Argent B E: Characterization of H+ and HCO3- transporters in CFPAC-1 human pancreatic duct cells. World J Gastroenterol 2006; 12 (6): 885-95.

22.

Kivela J, Parkkila S, Parkkila a K, Leinonen J, and Rajaniemi H: Salivary carbonic anhydrase isoenzyme VI. J Physiol 1999; 520 Pt 2 315-20.

23.

Shcheynikov N, Kim K H, Kim K M, Dorwart M R, Ko S B, Goto H, Naruse S, Thomas P J, and Muallem S: Dynamic control of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator Cl(-)/HCO3(-) selectivity by external Cl(-). J Biol Chem 2004; 279 (21): 21857-65.

24.

Paradiso a M, Coakley R D, and Boucher R C: Polarized distribution of HCO3transport in human normal and cystic fibrosis nasal epithelia. J Physiol 2003; 548 (Pt 1): 203-18.

25.

Ishiguro H, Steward M C, Naruse S, Ko S B, Goto H, Case R M, Kondo T, and Yamamoto A: CFTR functions as a bicarbonate channel in pancreatic duct cells. J Gen Physiol 2009; 133 (3): 315-26.

26.

Murakami M, Shachar-Hill B, Steward M C, and Hill a E: The paracellular component of water flow in the rat submandibular salivary gland. J Physiol 2001; 537 (Pt 3): 899-906.

27.

Delporte C and Steinfeld S: Distribution and roles of aquaporins in salivary glands. Biochim Biophys Acta 2006; 1758 (8): 1061-70.

28.

Murakami M, Murdiastuti K, Hosoi K, and Hill a E: AQP and the control of fluid transport in a salivary gland. J Membr Biol 2006; 210 (2): 91-103.

29.

Kawedia J D, Nieman M L, Boivin G P, Melvin J E, Kikuchi K, Hand a R, Lorenz J N, and Menon a G: Interaction between transcellular and paracellular water transport pathways through Aquaporin 5 and the tight junction complex. Proc Natl Acad Sci U S A 2007; 104 (9): 3621-6.

30.

Matsuzaki T, Tajika Y, Ablimit A, Aoki T, Hagiwara H, and Takata K: Aquaporins in the digestive system. Med Electron Microsc 2004; 37 (2): 71-80.

31.

Melvin J E: Chloride channels and salivary gland function. Crit Rev Oral Biol Med 1999; 10 (2): 199-209.

– 75 –

Irodalomjegyzék

32.

Turner J T, Landon L A, Gibbons S J, and Talamo B R: Salivary gland P2 nucleotide receptors. Crit Rev Oral Biol Med 1999; 10 (2): 210-24.

33.

Novak I: ATP as a signaling molecule: the exocrine focus. News Physiol Sci 2003; 18 12-7.

34.

Bruce J I, Shuttleworth T J, Giovannucci D R, and Yule D I: Phosphorylation of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors in parotid acinar cells. A mechanism for the synergistic effects of cAMP on Ca2+ signaling. J Biol Chem 2002; 277 (2): 1340-8.

35.

Bruce J I, Yule D I, and Shuttleworth T J: Ca2+-dependent protein kinase--a modulation of the plasma membrane Ca2+-ATPase in parotid acinar cells. J Biol Chem 2002; 277 (50): 48172-81.

36.

Cho S J, Quinn a S, Stromer M H, Dash S, Cho J, Taatjes D J, and Jena B P: Structure and dynamics of the fusion pore in live cells. Cell Biol Int 2002; 26 (1): 35-42.

37.

Konturek S J, Pepera J, Zabielski K, Konturek P C, Pawlik T, Szlachcic A, and Hahn E G: Brain-gut axis in pancreatic secretion and appetite control. J Physiol Pharmacol 2003; 54 (3): 293-317.

38.

Fernandez-Salazar M P, Pascua P, Calvo J J, Lopez M A, Case R M, Steward M C, and San Roman J I: Basolateral anion transport mechanisms underlying fluid secretion by mouse, rat and guinea-pig pancreatic ducts. J Physiol 2004; 556 (Pt 2): 415-28.

39.

Shumaker H and Soleimani M: CFTR upregulates the expression of the basolateral Na(+)-K(+)-2Cl(-) cotransporter in cultured pancreatic duct cells. Am J Physiol 1999; 277 (6 Pt 1): C1100-10.

40.

Szucs A, Demeter I, Burghardt B, Ovari G, Case R M, Steward M C, and Varga G: Vectorial bicarbonate transport by Capan-1 cells: a model for human pancreatic ductal secretion. Cell Physiol Biochem 2006; 18 (4-5): 253-64.

41.

Dehaye J P, Nagy A, Premkumar A, and Turner R J: Identification of a functionally important conformation-sensitive region of the secretory Na+-K+2Cl- cotransporter (NKCC1). J Biol Chem 2003; 278 (14): 11811-7.

42.

Steward M C, Ishiguro H, and Case R M: Mechanisms of bicarbonate secretion in the pancreatic duct. Annu Rev Physiol 2005; 67 377-409.

– 76 –

Irodalomjegyzék

43.

Ishiguro H, Naruse S, Kitagawa M, Suzuki A, Yamamoto A, Hayakawa T, Case R M, and Steward M C: CO2 permeability and bicarbonate transport in microperfused interlobular ducts isolated from guinea-pig pancreas. J Physiol 2000; 528 Pt 2 305-15.

44.

Greeley T, Shumaker H, Wang Z, Schweinfest C W, and Soleimani M: Downregulated in adenoma and putative anion transporter are regulated by CFTR in cultured pancreatic duct cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2001; 281 (5): G1301-8.

45.

Satoh H, Moriyama N, Hara C, Yamada H, Horita S, Kunimi M, Tsukamoto K, Iso O N, Inatomi J, Kawakami H, Kudo A, Endou H, Igarashi T, Goto A, Fujita T, and Seki G: Localization of Na+-HCO-3 cotransporter (NBC-1) variants in rat and human pancreas. Am J Physiol Cell Physiol 2003; 284 (3): C729-37.

46.

Abuladze N, Lee I, Newman D, Hwang J, Boorer K, Pushkin A, and Kurtz I: Molecular cloning, chromosomal localization, tissue distribution, and functional expression of the human pancreatic sodium bicarbonate cotransporter. J Biol Chem 1998; 273 (28): 17689-95.

47.

Yang D, Shcheynikov N, Zeng W, Ohana E, So I, Ando H, Mizutani A, Mikoshiba K, and Muallem S: IRBIT coordinates epithelial fluid and HCO3secretion by stimulating the transporters pNBC1 and CFTR in the murine pancreatic duct. J Clin Invest 2009; 119 (1): 193-202.

48.

Nishimori I, Fujikawaadachi K, Onishi S, and Hollingsworth M A: Carbonic anhydrase in human pancreas: hypotheses for the pathophysiological roles of CA isozymes. Ann N Y Acad Sci 1999; 880 5-16.

49.

Alvarez L, Fanjul M, Carter N, and Hollande E: Carbonic anhydrase II associated with plasma membrane in a human pancreatic duct cell line (CAPAN-1). J Histochem Cytochem 2001; 49 (8): 1045-53.

50.

Kivela a J, Parkkila S, Saarnio J, Karttunen T J, Kivela J, Parkkila a K, Pastorekova S, Pastorek J, Waheed A, Sly W S, and Rajaniemi H: Expression of transmembrane carbonic anhydrase isoenzymes IX and XII in normal human pancreas and pancreatic tumours. Histochem Cell Biol 2000; 114 (3): 197-204.

51.

Heitzmann D and Warth R: Physiology and pathophysiology of potassium channels in gastrointestinal epithelia. Physiol Rev 2008; 88 (3): 1119-82.

– 77 –

Irodalomjegyzék

52.

Mcintosh I and Cutting G R: Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and the etiology and pathogenesis of cystic fibrosis. Faseb J 1992; 6 (10): 2775-82.

53.

Suzuki M, Morita T, and Iwamoto T: Diversity of Cl(-) channels. Cell Mol Life Sci 2006; 63 (1): 12-24.

54.

Sheppard D N and Welsh M J: Structure and function of the CFTR chloride channel. Physiol Rev 1999; 79 (1 Suppl): S23-45.

55.

Linsdell P, Tabcharani J A, Rommens J M, Hou Y X, Chang X B, Tsui L C, Riordan J R, and Hanrahan J W: Permeability of wild-type and mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator chloride channels to polyatomic anions. J Gen Physiol 1997; 110 (4): 355-64.

56.

Jentsch T J, Stein V, Weinreich F, and Zdebik a A: Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev 2002; 82 (2): 503-68.

57.

Marsey L L and Winpenny J P: Bestrophin expression and function in the human pancreatic duct cell line, CFPAC-1. J Physiol 2009; 587 (Pt 10): 221124.

58.

Stewart a K, Yamamoto A, Nakakuki M, Kondo T, Alper S L, and Ishiguro H: Functional coupling of apical Cl-/HCO3- exchange with CFTR in stimulated HCO3- secretion by guinea pig interlobular pancreatic duct. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2009; 296 (6): G1307-17.

59.

Ishiguro H, Steward M, and Naruse S: Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and SLC26 transporters in HCO3(-) secretion by pancreatic duct cells. Sheng Li Xue Bao 2007; 59 (4): 465-76.

60.

Lohi H, Lamprecht G, Markovich D, Heil A, Kujala M, Seidler U, and Kere J: Isoforms of SLC26A6 mediate anion transport and have functional PDZ interaction domains. Am J Physiol Cell Physiol 2003; 284 (3): C769-79.

61.

Burghardt B, Nielsen S, and Steward M C: The role of aquaporin water channels in fluid secretion by the exocrine pancreas. J Membr Biol 2006; 210 (2): 143-53.

62.

Burghardt B, Elkaer M L, Kwon T H, Racz G Z, Varga G, Steward M C, and Nielsen S: Distribution of aquaporin water channels AQP1 and AQP5 in the ductal system of the human pancreas. Gut 2003; 52 (7): 1008-16.

– 78 –

Irodalomjegyzék

63.

Keller J and Layer P: Human pancreatic exocrine response to nutrients in health and disease. Gut 2005; 54 Suppl 6 vi1-28.

64.

Konturek S J, Zabielski R, Konturek J W, and Czarnecki J: Neuroendocrinology of the pancreas; role of brain-gut axis in pancreatic secretion. Eur J Pharmacol 2003; 481 (1): 1-14.

65.

Garcia M, Hernandez-Lorenzo P, San Roman J I, and Calvo J J: Pancreatic duct secretion: experimental methods, ion transport mechanisms and regulation. J Physiol Biochem 2008; 64 (3): 243-57.

66.

Chey W Y and Chang T: Neural hormonal regulation of exocrine pancreatic secretion. Pancreatology 2001; 1 (4): 320-35.

67.

Chandra R and Liddle R A: Neural and hormonal regulation of pancreatic secretion. Curr Opin Gastroenterol 2009; 25 (5): 441-6.

68.

Miyasaka K, Ohta M, Tateishi K, Jimi A, and Funakoshi A: Role of cholecystokinin-A (CCK-A) receptor in pancreatic regeneration after pancreatic duct occlusion: a study in rats lacking CCK-A receptor gene expression. Pancreas 1998; 16 (2): 114-23.

69.

Dourish C T, Ruckert a C, Tattersall F D, and Iversen S D: Evidence that decreased feeding induced by systemic injection of cholecystokinin is mediated by CCK-A receptors. Eur J Pharmacol 1989; 173 (2-3): 233-4.

70.

Morisset J: Negative control of human pancreatic secretion: physiological mechanisms and factors. Pancreas 2008; 37 (1): 1-12.

71.

Neary M T and Batterham R L: Gut hormones: implications for the treatment of obesity. Pharmacol Ther 2009; 124 (1): 44-56.

72.

Turner J T, Redman R S, Camden J M, Landon L A, and Quissell D O: A rat parotid

gland

cell

line,

Par-C10,

exhibits

neurotransmitter-regulated

transepithelial anion secretion. Am J Physiol 1998; 275 (2 Pt 1): C367-74. 73.

Fong P, Argent B E, Guggino W B, and Gray M A: Characterization of vectorial chloride transport pathways in the human pancreatic duct adenocarcinoma cell line HPAF. Am J Physiol Cell Physiol 2003; 285 (2): C433-45.

74.

Quissell D O, Turner J T, and Redman R S: Development and characterization of immortalized rat parotid and submandibular acinar cell lines. Eur J Morphol 1998; 36 Suppl 50-4.

– 79 –

Irodalomjegyzék

75.

Quissell D O, Barzen K A, Redman R S, Camden J M, and Turner J T: Development and characterization of SV40 immortalized rat parotid acinar cell lines. In Vitro Cell Dev Biol Anim 1998; 34 (1): 58-67.

76.

Burghardt B, Wenger C, Barabas K, Racz G, Olah A, Flautner L, Coy D H, Gress T M, and Varga G: GRP-receptor-mediated signal transduction, gene expression and DNA synthesis in the human pancreatic adenocarcinoma cell line HPAF. Peptides 2001; 22 (7): 1119-28.

77.

Thomas J A, Buchsbaum R N, Zimniak A, and Racker E: Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry 1979; 18 (11): 2210-8.

78.

Szalmay G, Varga G, Kajiyama F, Yang X S, Lang T F, Case R M, and Steward M C: Bicarbonate and fluid secretion evoked by cholecystokinin, bombesin and acetylcholine in isolated guinea-pig pancreatic ducts. J Physiol 2001; 535 (Pt 3): 795-807.

79.

Ishiguro H, Steward M C, Lindsay a R, and Case R M: Accumulation of intracellular HCO3- by Na(+)-HCO3- cotransport in interlobular ducts from guinea-pig pancreas. J Physiol 1996; 495 ( Pt 1) 169-78.

80.

Hayashi S, Nakamura E, Kubo Y, Takahashi N, Yamaguchi A, Matsui H, Hagen S J, and Takeuchi K: Impairment by allyl isothiocyanate of gastric epithelial wound repair through inhibition of ion transporters. J Physiol Pharmacol 2008; 59 (4): 691-706.

81.

Akiba Y, Jung M, Ouk S, and Kaunitz J D: A novel small molecule CFTR inhibitor attenuates HCO3- secretion and duodenal ulcer formation in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2005; 289 (4): G753-9.

82.

Bautista D M, Hoth M, and Lewis R S: Enhancement of calcium signalling dynamics and stability by delayed modulation of the plasma-membrane calciumATPase in human T cells. J Physiol 2002; 541 (Pt 3): 877-94.

83.

Carafoli E: Calcium pump of the plasma membrane. Physiol Rev 1991; 71 (1): 129-53.

84.

Bruce J I, Giovannucci D R, Blinder G, Shuttleworth T J, and Yule D I: Modulation of [Ca2+]i signaling dynamics and metabolism by perinuclear

– 80 –

Irodalomjegyzék

mitochondria in mouse parotid acinar cells. J Biol Chem 2004; 279 (13): 1290917. 85.

Schuh K, Cartwright E J, Jankevics E, Bundschu K, Liebermann J, Williams J C, Armesilla a L, Emerson M, Oceandy D, Knobeloch K P, and Neyses L: Plasma membrane Ca2+ ATPase 4 is required for sperm motility and male fertility. J Biol Chem 2004; 279 (27): 28220-6.

86.

Shmigol A, Eisner D A, and Wray S: Carboxyeosin decreases the rate of decay of the [Ca2+]i transient in uterine smooth muscle cells isolated from pregnant rats. Pflugers Arch 1998; 437 (1): 158-60.

87.

Masereel B, Pochet L, and Laeckmann D: An overview of inhibitors of Na(+)/H(+) exchanger. Eur J Med Chem 2003; 38 (6): 547-54.

88.

Paulais M and Turner R J: Activation of the Na(+)-K(+)-2Cl- cotransporter in rat parotid acinar cells by aluminum fluoride and phosphatase inhibitors. J Biol Chem 1992; 267 (30): 21558-63.

89.

Kiela P R, Xu H, and Ghishan F K: Apical NA+/H+ exchangers in the mammalian gastrointestinal tract. J Physiol Pharmacol 2006; 57 Suppl 7 51-79.

90.

Perry C, Quissell D O, Reyland M E, and Grichtchenko, Ii: Electrogenic NBCe1 (SLC4A4), but not electroneutral NBCn1 (SLC4A7), cotransporter undergoes cholinergic-stimulated endocytosis in salivary ParC5 cells. Am J Physiol Cell Physiol 2008; 295 (5): C1385-98.

91.

Li J, Koo N Y, Cho I H, Kwon T H, Choi S Y, Lee S J, Oh S B, Kim J S, and Park K: Expression of the Na+-HCO3- cotransporter and its role in pHi regulation in guinea pig salivary glands. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006; 291 (6): G1031-40.

92.

Gresz V, Kwon T H, Vorum H, Zelles T, Kurtz I, Steward M C, Aalkjaer C, and Nielsen S: Immunolocalization of electroneutral Na(+)-HCO cotransporters in human and rat salivary glands. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2002; 283 (2): G473-80.

93.

Kim Y B, Yang B H, Piao Z G, Oh S B, Kim J S, and Park K: Expression of Na+/HCO3- cotransporter and its role in pH regulation in mouse parotid acinar cells. Biochem Biophys Res Commun 2003; 304 (4): 593-8.

– 81 –

Irodalomjegyzék

94.

Arreola J and Melvin J E: A novel chloride conductance activated by extracellular ATP in mouse parotid acinar cells. J Physiol 2003; 547 (Pt 1): 197208.

95.

Romero M F, Fulton C M, and Boron W F: The SLC4 family of HCO 3 transporters. Pflugers Arch 2004; 447 (5): 495-509.

96.

Lee M G, Xu X, Zeng W, Diaz J, Kuo T H, Wuytack F, Racymaekers L, and Muallem S: Polarized expression of Ca2+ pumps in pancreatic and salivary gland cells. Role in initiation and propagation of [Ca2+]i waves. J Biol Chem 1997; 272 (25): 15771-6.

97.

Belan P V, Gerasimenko O V, Tepikin a V, and Petersen O H: Localization of Ca2+ extrusion sites in pancreatic acinar cells. J Biol Chem 1996; 271 (13): 7615-9.

98.

Collins T J, Lipp P, Berridge M J, and Bootman M D: Mitochondrial Ca(2+) uptake depends on the spatial and temporal profile of cytosolic Ca(2+) signals. J Biol Chem 2001; 276 (28): 26411-20.

99.

Reuter H, Pott C, Goldhaber J I, Henderson S A, Philipson K D, and Schwinger R H: Na(+)--Ca2+ exchange in the regulation of cardiac excitation-contraction coupling. Cardiovasc Res 2005; 67 (2): 198-207.

100.

Ankorina-Stark I, Amstrup J, and Novak I: Regulation of the Na+/Ca2+ exchanger in rat pancreatic ducts. J Membr Biol 2002; 186 (1): 43-53.

101.

Monteith G R, Wanigasekara Y, and Roufogalis B D: The plasma membrane calcium pump, its role and regulation: new complexities and possibilities. J Pharmacol Toxicol Methods 1998; 40 (4): 183-90.

102.

Herscher C J, Rega a F, and Garrahan P J: The dephosphorylation reaction of the Ca(2+)-ATPase from plasma membranes. J Biol Chem 1994; 269 (14): 10400-6.

103.

Caride a J, Penheiter a R, Filoteo a G, Bajzer Z, Enyedi A, and Penniston J T: The plasma membrane calcium pump displays memory of past calcium spikes. Differences between isoforms 2b and 4b. J Biol Chem 2001; 276 (43): 39797804.

104.

Gromadzinska E, Lachowicz L, Walkowiak B, and Zylinska L: Calmodulin effect on purified rat cortical plasma membrane Ca(2+)-ATPase in different phosphorylation states. Biochim Biophys Acta 2001; 1549 (1): 19-31.

– 82 –

Irodalomjegyzék

105.

Kim Y W, Kern H F, Mullins T D, Koriwchak M J, and Metzgar R S: Characterization of clones of a human pancreatic adenocarcinoma cell line representing different stages of differentiation. Pancreas 1989; 4 (3): 353-62.

106.

Rajasekaran S A, Gopal J, Espineda C, Ryazantsev S, Schneeberger E E, and Rajasekaran a K: HPAF-II, a cell culture model to study pancreatic epithelial cell structure and function. Pancreas 2004; 29 (3): e77-83.

107.

Winpenny J P, Harris A, Hollingsworth M A, Argent B E, and Gray M A: Calcium-activated chloride conductance in a pancreatic adenocarcinoma cell line of ductal origin (HPAF) and in freshly isolated human pancreatic duct cells. Pflugers Arch 1998; 435 (6): 796-803.

108.

Rajasekaran S A, Barwe S P, Gopal J, Ryazantsev S, Schneeberger E E, and Rajasekaran a K: Na-K-ATPase regulates tight junction permeability through occludin phosphorylation in pancreatic epithelial cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2007; 292 (1): G124-33.

109.

Zhao H, Star R A, and Muallem S: Membrane localization of H+ and HCO3transporters in the rat pancreatic duct. J Gen Physiol 1994; 104 (1): 57-85.

110.

Lee M G, Ahn W, Choi J Y, Luo X, Seo J T, Schultheis P J, Shull G E, Kim K H, and Muallem S: Na(+)-dependent transporters mediate HCO(3)(-) salvage across the luminal membrane of the main pancreatic duct. J Clin Invest 2000; 105 (11): 1651-8.

111.

Adler G K H, The human exocrine pancreas in health and disease, in Ultrastructure of the Extraparietal Glands of the Digestive Tract, M.P. Riva A, Editor. 1990, Kluwer: Boston. p. 115–46.

– 83 –

Publikációs jegyzék

PUBLIKÁCIÓS JEGYZÉK

A doktori értekezés alapját képező közlemények: Demeter I., Hegyesi O., Nagy Á., R. M. Case, M. C. Steward, Varga G., Burghardt B. Bicarbonate transport by the human pancreatic ductal cell line HPAF. Pancreas; 38(8):913-20, 2009 E. Baggaley, S. McLarnon, Demeter I., Varga G., J. I. E. Bruce Differential regulation of the apical plasma membrane Ca(2+)-ATPase by protein kinase A in parotid acinar cells. J Biol Chem; 282(52):37678-93, 2007 Demeter I., Szűcs Á., Hegyesi O., Földes A., Rácz G. Z., Burghardt B., M. C. Steward, Varga G. Vectorial bicarbonate transport by Par-C10 salivary cells – a model for epithelial electrolyte secretion. J Physiol Pharmacol; elfogadva A dolgozathoz közvetlenül nem kapcsolódó közlemények: Szűcs Á., Demeter I., Burghardt B., Óvári G., R. M. Case, M. C. Steward, Varga G. Vectorial bicarbonate transport by Capan-1 cells: a model for human pancreatic ductal secretion. Cell Physiol Biochem; 18:253-264, 2006 Demeter I., Szűcs Á., Óvári G., Varga G. Capan-1 sejtek HCO3⎯ szekréciójában szerepet játszó transzportfolyamatok vizsgálata. EME Orvostudományi Értesítő, 78 (1): 56-60, 2005 Varga G., Demeter I., Óvári G., Rácz G. Z., Burghardt B. Peptide Receptor Agonists and Antagonists: From Research Tools to Established Drugs. 11th Conference on Ulcer Research, 2003

– 84 –

Köszönetnyilvánítás

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönöm témavezetőmnek, Dr. Varga Gábornak szakmai irányítását és rengeteg segítségét. Hálával tartozom Martin C. Stewardnak meghívásáért Manchesterbe, a megosztott szakmai tapasztalataiért és a szíves fogadtatásért. Köszönöm Jason I. Bruce-nak a Ca2+-imaging módszer megismertetését és hogy társszerzője lehettem a parotisz acináris sejtek PMCA transzportereiről szóló cikkének. Köszönöm munkatársaimnak: Dr. Burghardt Beának, Jobbágy-Óvári Gabriellának, Dr. Hegyesi Orsolyának, Földes Annának, Dr. Szlávik Vandának, Bori Erzsébetnek, Király Mariannának, Dr. Kerémi Beának, Dr. Szűcs Ákosnak, Dr. Rácz Gábornak, Dr. Jász Máténak, Dr. Kádár Kristófnak, Dr. Molnár Bálintnak, Dr. Nagy Ákosnak, Dr. Nagy Krisztiánnak, Porcsalmy Balázsnak és a Semmelweis Egyetem Orálbiológiai Tanszék összes dolgozójának segítségüket, hogy megosztották velem tapasztalataikat, tudásukat, ötleteiket, gondolataikat. Külön köszönet Dr. Burghardt Beának sokrétű segítségéért. Külön köszönöm Dr. Simon György professzor úrnak szakmai és emberi támogatását. Végül köszönöm családomnak és barátaimnak, hogy szeretnek, támogatnak, óvnak, és hogy kitárták előttem a világot.

– 85 –

Epiteliális eredetű sejtek ionszekréciójának vizsgálata

Recommend Documents