A Legionella jelenlétének kimutatása

A Legionella jelenlétének kimutatása Diagnosztikai lehetőségek Kari András

Budapest 2016. 04.07.

Legionella új közegészségügyi tényező mesterséges és vizes környezetben

Legionella nemzetség: ▫ ▫ ▫ ▫ ▫

aerob „coccoid-pálca” Gram – (gyengén festődik) kataláz +, oxidáz +, hippurátot hidrulizálja tenyésztéséhez speciális igények : L- cisztein, vas (BCYE) ▫ lassan növekednek

Szabványos módszerek (Környezeti Legionella vizsgálatok) • ISO 11731:1998 (Water quality-Detection and enumeration of Legionella) ▫ ivóvizek, ipari és természetes vizek

• MSZ EN ISO 11731-2:2008 (Vízminőség. Legionella kimutatása és megszámlálása 2.rész: Közvetlen membránszűréses módszer kis baktériumszámú vizek esetén)

▫ emberi fogyasztásra és használatra szánt vizek esetében ▫ kezelt fürdővizek esetében Legionella új közegészségügyi tényező mesterséges és vizes környezetben

ISO 11731:1998 (Water quality-Detection and enumeration of Legionella) I.

II.

Koncentrálás

Közvetlen szélesztés

Membránszűrőn Centrifugálással

III.

IV.

A) Savkezelés B) Hőkezelés C) Kezelés nélkül Legionella szelektív táptalajra való szélesztés (GVPC/GVPN) 0,1 mL- 0,5 mL Legionella új közegészségügyi tényező mesterséges és vizes környezetben


MSZ EN ISO 11731-2:2008 (Vízminőség. Legionella kimutatása és megszámlálása 2.rész: Közvetlen membránszűréses módszer kis baktériumszámú vizek esetén) •a legtöbb hazai laboratórium alkalmaz

II. Koncentrálás: membránszűrés

I.

III. Savkezelés IV.


Mintafeldolgozás • Vizsgálati térfogatok:    

Ivóvíz/használati melegvíz: 10-100 mL Fertőtlenített fürdővíz: 10-100 mL Nem fertőtlenített fürdővíz: 0,1 mL szélesztés, 10 mL szűrés Hűtőtorony, klíma kondenzvíz : 0,1- 0,5 mL szélesztés, 10 mL szűrés

Minta feldolgozás ideális esetben 24 h belül, de maximum 48 h !

Membránfilter: •fekete •nitrocellulóz

Savkezelés: •Ph 2,2 ± 0,2 ; 5 perc öblítés foszfát pufferrel, vagy Ringer oldattal •Sterilitás !


Azonosítás Telepmorfológia: • GVPC/GVPN szelektív táptalaj (glicin, vancomicin hidroklorid, polimixin-B szulfát, • tejfehér színű( zöld, cikloheximid/natamicin) barna, keresztül rózsaszín) • Inkubálás : 36 ± 2 °C 10 napon • szabályos köralakú • Leolvasás a 3. naptól kezdődően (sztereomikroszkóp) • épszélű • irizáló szél •UV fény alatt sok faj kékesfehéren, sárgászölden, vörösesen autofluoreszkál


Azonosítás • megerősítés: 5-5 telep levétele • cisztein-auxotrófia:  ciszteines BCYE (pufferolt aktív szén és élesztőkivonat táptalaj) pozitív  BCYE-Cys (L-cysteint nem tartlmaz)/nutrient/véres agar negatív

• szerotipizálás: (Legionella latex teszt kit)  szerocsoport szintű azonosítás:  L. pneumophila 1  L. pneumophila 2-14  L. species


Molekuláris biológiai eljárások • Polimeráz láncreakció (PCR)  Egy nap alatt megbízható eredményt ad (szemben a tenyésztés 10 napjával)  rt-PCR (real time, vagy kvantitatív)- nem csak kvalitatív , hanem kvantitaív infromációk is.  Repetitív-PCR faj alatti genotipizálás (PFGE, SBT)

• In situ hibridizáció (ISH)  radioaktív vagy fluoreszcens (FISH) festékkel jelölt DNS / RNS próbák.


További laboratóriumi módszerek • Immunfluoreszcencia ▫ DFA (direkt immunfluorszcencia) ▫ Dot-blot immunteszt ▫ Immunenzim módszer- immunperoxidázzal való festés ▫ Klinikai minták esetében ál pozitív eredmények más baktériumokkal való keresztreakció miatt (Bordatella, Francisella ).


További laboratóriumi módszerek • Antigénmeghatrozás : ▫ ▫ ▫ ▫

Radioimmunesszé ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Immunkromatográfiás membránvizsgálat Latex agglutináció  Nagy szenzitivitás és specificitás  Legionella szerocsoportok között keresztreakció

• Szerológia: ▫ MAT (mikroagglutinációs teszt) ▫ IIFT (Indirekt immunfluoreszcencia ) ▫ ELISA


Köszönöm a figyelmet!

1211 Budapest Szállító u 6. Tel.: 06-1-261-29-78, 06-70-398-33-52 [email protected]

A Legionella jelenlétének kimutatása

Recommend Documents