Szöllősi Attila
A jelátviteli folyamatok tanulmányozása sejtbiológiai, biokémiai és molekuláris biológiai technikák segítségével – II.
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Molekuláris Medicina Kutató Központ, Élettani Intézet
RT-PCR
RT-PCR Általánosan - a sejtalkotók kimutatása mRNS szinten (génexpresszió) - minden olyan sejtalkotó kimutatható, amit a sejt termel, tehát kódol - enzimek, receptorok, citoszkeletális komponensek, mediátorok, etc, - csak szemikvantitatív, de kvantitálható (belső kontroll)
Alapfeltétel
- nagyfokú molekuláris biológiai műszerezettség - sterilitás, RNA-ase mentesség - mindig legyen stabil belső kontroll (pl. b-actin, GAPDH)!
Módszer
- a primerek tervezése & szintézise - teljes RNS preparálása (Trizol) - cDNS előállítása reverz transzkripcióval (RT) - a vizsgálni kívánt cDNS szakaszok amplifikálása a szintetizált primerek segítségével, PCR alkalmazásával
A PCR reakció elve
Példa az RT-PCR technikára 1 2 3
z
q
l
547 418 359
5
bp
TGFb2
565
b-actin
420
TGFb2 expression (% of control)
PKC IZOFORMA
4
220 200 180
Control Caps
*
160 140 120 100 80 60 40 20 0 1
Culturing days
2
Q-PCR
Alapismeretek • PCR: egy DNS függő polimeráz két specifikus oligonukleotid primer segítségével a primerek közötti target DNS szekvenciát amplifikálja • Q-PCR: a primerek mellett a targetre specifikus próbákat is használ, melynek: – 5’ végén Reporter – 3’ végén Quencher
• R-Q Fluoreszcencia • Polimerizáció Q + R Fluoreszcencia • Fluoreszcencia ~ amplifikált DNS mennyiség
Példa: primer & próba
*
Exon -exon határ
primerek
Consensus szekvencia
próba
A primerek és próbák tulajdonságai Primer Tm 58 - 60ºC 20 - 80% GC Hosszúság: 9 - 40 <2ºC különbség a két primer Tm-je között Maximum 2/5 G vagy C a 3’ végen
Próba 10ºC –kal a primerek Tm-je fölött 20 - 80% GC Hosszúság: 13-20 MGB (non-fluor.) 9-40 TAMRA™
<4 G egymás után
Ne legyen G az 5’végen (Ne legyen több G mint C)
Amplicon 50 - 150 bp hosszú Minél közelebb a próbához
Mi szükséges a Q-PCR reakció végrehajtásához? • • • • • • • • • •
PÉÉÉÉÉÉNZ!!!! DNS vagy cDNS H2O MgCl2, egyéb pufferek dNTP-ok AmpliTaq Gold DNS Polimeráz Specifikus próba Forward Primer Reverse Primer Q-PCR műszer
TaqMan Universal PCR MasterMix
Quantitációs követelmények • Abszolút – Standardre van szükség, melynek ismerjük a koncentrációját – Standard görbét használ – A legtöbb kísérlet nem igényli
• Relatív – A génexpresszió vizsgálata – Endogén referenciát használ – Standard görbe vagy comparatív CT
Abszolút Quantitáció - Standard görbe
Abszolút Quantitáció - Standard görbe
Endogén kontroll használata • • • • •
18S rRNA Acidic ribosomal protein b- Actin Cyclophilin Glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase
• Phosphoglycerokinase • b2-Microglobulin • b-Glucuronidase • Hypoxanthine ribosyl transferase • Transcription factor IID, TATA binding protein • Transferrin receptor
Komparatív Ct módszer(DDCt)
Kontroll
PKCα
Ct=26 GAPDH amplifikáció PKCα amplifikáció
Ct=36
DCt = pkcα Ct - gapdh Ct DCt = 10
Komparatív Ct módszer (DDCt) DCt = pkc Ct - gapdh Ct
DCt=10
PKC
Ct=26 Ct=36
PKCβ
DCt=5
DCt=7.5
Ct=25 Ct=32.5
PKCβ
Ct=27 Ct=32
DCt=6
Ct=26.5 Ct=32.5
Steroid
Kontroll
PKC
Komparatív Ct módszer (DDCt) • Ha kétszeres cDNS mennyiséget alkalmazunk, mindkét target egy ciklussal hamarabb éri el a küszöböt • A DCt viszont állandó marad, tehát független a kiindulási cDNS mennyiségétől 10ng cDNA
20ng cDNA
PKCα
PKCα
Ct=26 Ct=36
Ct=25 Ct=35
DCt=10
DCt=10
Komparatív Ct módszer (DDCt) • Hogy összehasonlítsuk a kezelés hatására bekövetkező expressziós szintek változásait, a steroid DCt értékekből ki kell vonni a kontroll DCt értékeket
K: S:
PKCα
PKCβ
PKCδ
PKCε
DCt=10 DCt=10
DCt=7.5 DCt=5
DCt=5 DCt=0
DCt=6 DCt=2
DDCt = DCt[steroid]- DCt[kontroll] DDCt= 0
DDCt= -2.5
DDCt= -5
DDCt= -4
Komparatív Ct módszer (DDCt) A DDCt értékeket használva az alábbi egyenlet segítségével megkaphatjuk a PKC izoformák szintjeinek a steroid kezelés hatására bekövetkező változását a kontrollra normálva PKCα
DDCt=0
PKCβ
DDCt=-2.5
PKCδ
PKCε
DDCt=-5
DDCt=-4
Normalizált PKC a kontrollhoz viszonyítva = 2 -DDCT
2 -DDCT=1
2 -DDCT=5.6
2 -DDCT=32
2 -DDCT=16
A KÜLÖNFÉLE SEJTVÁLASZOK VIZSGÁLATI LEHETŐSÉGEI
A ligand-receptor interakció vizsgálata a kötődési (binding) assay Általánosan - elsősorban farmakológiai megközelítés - dózis-hatás görbék & kompetíciós assay-k
Alapfeltétel
- radioaktivitás használatának lehetősége és képessége
Módszer
- receptor a sejtben vagy kémiailag tisztítva - inkubáció a radioliganddal - a kapcsolódás leállítása - a non-specifikus kötődés csökkentése (non-radioaktív liganddal)
Probléma
- gyakran pM nagyságrendű receptor-protein szint meghatározása
A ligand-receptor interakció vizsgálata a kötődési (binding) assay Fig. 2A
1,2
1,2
1,0
1,0
Fraction of control
Percent of maximal binding
Fig. 1A
0,8 0,6 0,4 0,2
0,8 0,6 0,4 0,2
0,0 1
10
100 3
[ H]RTX, pM
1000
0,0 0,01
0,1
1
10
[CAP], M
100
1000
Az enzimek vizsgálata Az enzim, mint fehérje azonosítása - Western blot, immuncito- és -hisztokémia, RT-PCR, Q-PCR
Az enzimaktivitás mérése - a kináz assay - enzim (sejtben vagy tisztítva vagy immunkomplexben – IP) - aktivátor - szubsztrát, mely foszforilálódik - ATP, ami 32P jelölt - RADIOAKTÍV!!! - lehet farmakológiai alkalmazása is
Az enzim intracelluláris lokalizáció-változásának meghatározásával 1. Szubcelluláris frakcionálás
- a citoszol, membrán és citoszkeletális kompartmentek elválasztása - Western blot
2. Konfokális mikroszkópia - immunfluoreszcens festést követően - a mozgás nem (nincs real-time), de az eredmény látható
Példa a transzlokációra (PKC)
Control BRX-235
Citoszkeleton
Membrán
Citoszól
Példa a transzlokációra Frakcionálást követő Western-blot
Példa a transzlokációra - konfokális mikroszkópia Kontroll
PMA
PKC
PKCh PKCq PKCg
TRANSZLOKÁCIÓ
PKCz
Az enzimek vizsgálata IGF-I RTK Gab-1
PI 3-kináz
GRB-2 Ras
PLC-g
IP3 & DAG
Raf-1
PKC MAPKK
Sejtmag
Az enzimek vizsgálata Az enzim-szubsztrát foszforilációjának vizsgálata Az IGF-I hatására nem foszforilálódik az Erk-1, ellentétben az FGF pozitív hatásával
Erk-1 pErk-1
A sejtproliferáció vizsgálata Növekedési görbék – sejtszámolás, sejtmagszámolás 0.1 nM
kontroll
1 nM
10 nM
300
1 M
1.0
250
0.8
200
Fúziós index
Sejtmagszám
100 nM
150
0.6
0.4
100 0.2
50 0
0.0 3
5
7
9
6
Tenyésztési napok
7
8
9
A sejtproliferáció vizsgálata Kettőződési idő
Szaturációs denzitás
= D/log2(N/N0)
A maximális sejtszám meghatározása a konfluencia elérése után 3 nappal.
D: tenyésztési napok N0: kezdő sejtszám N: maximális sejtszám
Kettőződési idő (óra)
Szaturációs denzitás (sejtszám/ cm2)
Kontroll
23,2
1,4 x 105
cPKCb
16,5
2,1 x 105
nPKC
13,2
2,8 x 105
cPKC
27,4
1,0 x 105
nPKC
30,5
0,8 x 105
A sejtproliferáció vizsgálata Növekedési görbék – szőrtüsző szervkultúra
A sejtproliferáció vizsgálata Növekedési görbék – szőrtüsző szervkultúra
L - Lo Elongatio (%) = Lo
A sejtproliferáció vizsgálata Ki67 festés – immunhisztokémia
VIP
Rhodamide
A sejtproliferáció vizsgálata Nukleotid analógok beépülésének vizsgálata 1. 3H-timidin inkorporációs assay - radioaktív
2. BrdU (és MTT) kolorimetriás assay - bróm-deoxi-uridin (BdrU), mint timidin-analóg - inkubáció, beépülés - DNS denaturálás - jelölés anti-BrdU monoklonális, peroxidáz-konjugált antitesttel - inkubáció a szubsztráttal - kolorimetriás meghatározás 450 nm-en - előnyök: - NEM radioaktív - könnyen ismételhető - ELISA módszer, akár farmakológiai felhasználásra is
A kolorimetriás ELISA assay-k (BrdU, MTT)
Példa a BrdU assay-re 100
Sejtproliferáció (a kontroll %-a)
Sejtproliferáció (a kontroll %-a)
100
80
60
40
20
80
60
40
20
0 -2 -1 0 1 2 3 4 10 10 10 10 10 10 10
0 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 10 10 10 10 10 10 10 10
PMA [nM]
GF109203X [nM]
Példa az MTT assay-re nPKC cPKCb
Sejtproliferáció (A550nm)
1,4 1,2
Kontroll
1,0 0,8
cPKC nPKC
0,6 0,4 0,2
átlag SEM
0,0 0
2
4
6
8
Tenyésztési idő (nap)
10
12
A differenciálódás vizsgálata A differenciálódási markerek kimutatása - Western blot, immunhisztokémia, áramlási citometria, RT-PCR, Q-PCR
DESMIN
36d
28d
24d
16d
14d
10d
9d
8d
5d
tenyésztési napok
A differenciálódás vizsgálata – Western blot
A
B
PMA [nM]
0
1
10
100
1000
200 175
K10 K17 INV FIL TG
Normalized OD (%)
150 125 100 75 50
K10 K17 INV FIL TG
25 0
0
1
10
PMA [nM]
100
1000
A differenciálódás vizsgálata – hisztológia Dimetil-metilénkék festés
220
K
GF
K+OA
GF+OA
A porcosodás mértéke (%)
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
Gö
Gö+OA
A differenciálódás vizsgálata Oil-Red festés 0% FCS
10% FCS
Oil Red O festés 40x
A sejthalál vizsgálata Necrosis - a sejttenyésztő médium mikroszkópos vizsgálata - sejtszámolás - az MTT assay - az élő sejtszám meghatározása - MTT - tetrazólium gyűrű - mitokondriális hasítás - az élet jele - oldhatatlan formazán - kolorimetriás meghatározás - az LDH assay – a sejtekből necrosis hatására felszabaduló laktát-dehidrogenáz kolorimetriás mérése
Apoptosis
1. Korai apoptosis - membránperturbáció - annexin-V, FITC, áramlási citometria - DNS fragmentáció - specifikus ELISA
2. Késői apoptosis - necroticus jelleg - propidium-jodid - magfestés, flow cytometry
Az apoptosis vizsgálata Annexin-V meghatározása áramlási citometriával
Apoptotic cell number (% of total)
70
Basal Vitamin D3 TNF
60 50 40 30 20 10 0 1
C
2
b
3
4
5
Az apoptosis vizsgálata TUNEL – immunhiszto- és -citokémia
• Terminal
deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling
Sejtproliferáció és apoptosis együttes vizsgálata Ki67 és TUNEL kettős festés
MK MK DP DP
*
Percentage of positive cells
22
Ki-67 TUNEL
20 18
*
16 14 12 10 8 6 4 2 0
Control
Capsaicin
A mediátortermelés vizsgálata Általánosan - vazoaktív metabolitok (pl. hisztamin) - növekedési faktorok - citokinek (pl. interleukinok)
Módszerek - RT-PCR, Q-PCR - Western blot - Immunhiszto- és -citokémia - Áramlási citometria - RIA, EIA, ELISA - citotoxicitás assay sejtkultúrában (pl. TNF-)
MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI TECHNIKÁK
Molekuláris biológiai technikák Általánosan - rekombináns technikák - vektorok, mint cDNS hordozók - rezisztencia - bevitel baktériumba: transzformáció - bevitel eukariótába: transzfekció - módok: Ca-foszfát, detergens - nukleofekció - stabil - klónok szelektálása - tranziens - “tag” - azonosítás & megkülönböztetés & ellenőrzés (Western, IH) - elméletileg minden expresszálható, ami nem toxikus - mutánsok, domináns-negatív mutánsok - ???fiziológiás???
Transzfekció lipid detergens segítségével
Nukleofekció
Nukleofekció
Molekuláris biológiai technikák Expressziós rendszerek 1. Homológ rendszer - az adott sejt működésének vizsgálata a cél - a rekombináns sejtalkotó(k) overexpressziójának hatása - lehet primer kultúrákban is (csak tranziens)
2. Heterológ rendszer - az adott overexpresszált sejtalkotó működésének vizsgálata a cél - általában host-sejtek (cos-7, CHO, tSA-HEK), melyek “üresek” - lehetőség (ajánlott) stabilan transzfektált klónok szelektálása - általában csatornák, receptorok, enzimek overexpressziója - farmakológiai lehetőségek
Molekuláris biológiai technikák A Green Fluorescent Protein (GFP) rendszer - speciális vektorok - X-GFP fúziós protein expressziója - N- vagy C-terminális fúzió (nem mindegy!) - tranziens & stabil expressziós lehetőségek - van BFP & RFP is - előny: - azonosítás egyedi sejtszinten - sejtélettan - “real-time”: a mozgás vizsgálatának lehetősége!!! - hátrány: - nagy (30 kD), tehát befolyásolhat mozgást, aktivációt - megfelelő műszerezettséget igényel - nálunk: - TRPV1 - DHPR - PKC izoformák
Példa a GFP-kapcsolt fúziós proteinekre A vanilloid receptor (VR1) funkcionális expressziója cos-7 sejtekben 4
CAPSAICIN Fluorescent ratio
3
2
1
0
100
200
800
1200
1600
2000
Time [s]
Konfokális kép
Funkcionális kalciummérés
Molekuláris biológiai technikák A pMTH vektor - MTH vektor – metallotionein promoter (Zn) - a PKC specifikus 12 aminosav szekvenciája - C-terminális fúzió - stabil expressziós klónok szelektálhatók (G418) - előny: - tranziens és stabil expresszió - indukálhatóság, az expresszió fokozása - kicsi, ezért nem befolyásol mozgást és aktivitást - endogén-exogén megkülönböztethetőség - immunprecipitáció - hátrány: - nem látható egyedi sejtszinten - nálunk: - PKC izoenzimek - VR1
Példa az pMTH-PKCx vektorokra PKC overexpresszor HaCaT klónok endogén PKC
PKC overexpressers C b
C
b
rekombináns PKC izoforma
Kinase activity (% of control)
500
H-III MLCK20
400
300
200
100
0
C
b
T
Molekuláris biológiai technikák A Tet-Off vektor rendszer - pTet-Off regulátor plazmid - pUHG-102-3 plazmid a kivánt cDNS szekvenciával - folyamatos tenyésztés tetraciklin jelenlétében – represszió - tetraciklin elhagyása - indukció - előny: - indukálhatóság - szabályozható az expresszió mértéke (toxicitás) - stabil expresszió - hátrány: - nem látható egyedi sejtszinten - nálunk: - VR1
Példa a Tet-Off expressziós rendszerre VRI-CHO sejtek 0
12
24
48
VR1 A tetraciklin „megvonás” hatása
(hrs)
Molekuláris biológiai technikák – siRNA
