A humán szívizom kontraktilitását befolyásoló celluláris és molekuláris folyamatok tanulmányozása

EGYETEMI DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS

A humán szívizom kontraktilitását befolyásoló celluláris és molekuláris folyamatok tanulmányozása Dr. Molnár Andrea

DEBRECENI EGYETEM LAKI KÁLMÁN DOKTORI ISKOLA Debrecen, 2010

Tartalomjegyzék 1. Rövidítések jegyzéke ........................................................................................................... 2 2. Bevezetés ............................................................................................................................ 3 2.1. A szívizom kontraktilitás alapjai ................................................................................. 3 2.2. Szívelégtelenség .......................................................................................................... 4 2.3. A szívizom kontraktilitás szabályozásának molekuláris mechanizmusai .................... 14 3. Célkitőzések ...................................................................................................................... 20 4. Módszerek ........................................................................................................................ 21 4.1. Etikai vonatkozások .................................................................................................. 21 4.2. A miokardiális sejtek sérülésének markerei szívelégtelenségben ............................... 21 4.3. A protein kináz C (PKC) szerepe a humán miokardium kontraktilitásában ................ 25 4.4. Statisztikai módszerek ............................................................................................... 35 5. Eredmények ...................................................................................................................... 36 5.1. Oxidatív károsodások kimutatása szívelégtelenségben............................................... 36 5.2. Az oxidatív hatások következményeinek vizsgálata ................................................... 37 5.3. Protein kináz C szerepe a humán miokardiális kontraktilitásban ................................ 42 5.4. PKC izoenzimek expressziója humán szívizomsejtekben........................................... 48 5.5. Humán miokardiális fehérjék in vitro foszforilációja PKC-vel ................................... 48 5.6. PKCα intracellularis target fehérjéinek kimutatása .................................................... 49 5.7. Ca2+-függı cTnI és PKCα kölcsönhatás (kötıdés) ..................................................... 51 5.8. PKCα és cTnI együttes elıfordulásának (kolokalizáció) kimutatása humán kamrai izomzatban....................................................................................................................... 52 6. Megbeszélés...................................................................................................................... 53 7. Összefoglalás.................................................................................................................... 62 8. Tudományos eredmények hasznosíthatósága..................................................................... 63 9. Irodalom........................................................................................................................... 64 9.1. Hivatkozott közlemények jegyzéke ........................................................................... 64 9.2. Saját publikációk jegyzéke ........................................................................................ 82 10. Köszönetnyilvánítás ........................................................................................................ 85 11. Bekötött publikációk ....................................................................................................... 86

1

1. Rövidítések jegyzéke AIF: apoptózis indukáló faktor ß-ARK: béta-adrenerg receptorkináz cAMP: ciklikus adenozin-monofoszfát CARD: caspase activity recruitment domain cTnI: cardiális troponin I DNPH: dihidrofenilhidrozon DISC: death initiation signal complex, sejthalált kiváltó jelátviteli komplex ECL: felerısített kemilumineszcencia Fo: Ca2+-aktivált maximális erı Fpasszív: passzív erı MDA: malondialdehid MHC: miozin nehéz lánc NADH: nikotinsavamid-adenin-dinukleotid NADPH: nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát NO: nitrogén monoxid NOS: nitrogén monoxid szintáz NYHA: New York Heart Association PAR: poli-(ADP-ribóz) PARP-1: poli-(ADP-ribóz) polimeráz-1 pCa: Ca2+ koncentráció 10-es alapú negatív logaritmusa pCa50: félmaximális erı létrejöttéhez szükséges pCa érték PKA: protein kináz A PKC: protein kináz C PLC: foszfolipáz C PMA: forbol-mirisztil-acetát RACK: receptors for activated C-kinase RCD: reactive carbonyl derivatives RICK: receptors for inactivated C-kinase ROS: reactive oxigen species SEM: mintaközép hibája SOD: szuperoxid-dizmutáz TNF: tumornekróis faktor

2

2. Bevezetés 2.1. A szívizom kontraktilitás alapjai A kontraktilis rendszer vékony és vastag filamentumokból, a vékony filamentumok regulatórikus rendszerébıl és citoszkeletális komponensekbıl épül fel. Mikroszkóp alatt kivehetı, hogy a filamentumok a szívizomsejtekben egymáshoz viszonyítva meghatározott helyzetben találhatók (Huxley és Niedergerke, 1954). Mőködési egysége a szomszédos Zvonalak között található szarkomer. A Z-vonalban helyezkednek el a horgonyzó fehérjék, ahol a citoszkeletális filamentumok kapcsolódnak az aktin filamentumokhoz (Frank és munkatársai, 2006). A vastag filamentumok miozinból épülnek fel, amelyek képesek az ATPben tárolt kémiai energiát térszerkezeti átalakulásokon keresztül mechanikai munkává alakítani, és így az aktin filamentum mentén elırehaladó mozgást végezni. A miozin több alegységbıl felépülı fehérje, melynek N-terminálisán helyezkedik el a globularis feji régió, amely aktivitásához köthetı az aktin és az ATP ciklikus kötése, a kapcsolódó α-helikális „nyak”, mely erıgenerálás során az emelıkar funkcióját látja el és a C-terminalis α-helikális „farok” amely a miozin dimerizációja során coiled-coil szerkezetet képezve lehetıvé teszi a miozin filamentum kialakulását. Ezen kívül minden miozin fejhez két miozin könnyő lánc asszociálódik. A vékony filamentumokat az aktin és a regulatórikus fehérjék, a tropomiozin és a troponin komplex alkotják. Az aktin filamentumok kettıs lánca G-aktinból polimerizálódik. A tropomiozin is kettıs alfa-helix protein láncból épül fel, amelyek a vékony filamentum hosszában futnak. Az aktin szálak által alkotott hosszanti árokba simuló tropomiozin úgy helyezkedik el, hogy minden hetedik G-aktin egységenként ismétlıdve található troponin komplexhez kapcsolódik (Ebashi és munkatársai, 1974) (1. ábra). Amikor az izom relaxált állapotban van, a tropomiozin molekula fedi az aktin molekulák miozinkötı helyeit, ezért ekkor a vékony miofilamentum nem tud kölcsönhatásba kerülni a vastag miofilamentummal. Az izom kontrakció kezdetén a tropomiozint a troponin elmozdítja a helyérıl, és így lehetıvé válik az aktin és a miozin kölcsönhatása. A troponin komplexet a troponin C (TnC), troponin T (TnT) és a troponin I (TnI) fehérjék 1:1:1 arányban alkotják. A TnT a tropomiozin kötı alegység, a TnI a komplex gátló alegysége, mely az aktinhoz kapcsolódva helyben tartja a TnT-tropomiozin komplexet (Zot és Potter, 1987). A kalcium ionokat a TnC képes megkötni, ami által az aktin-miozin komplex kialakulását regulálja (Palmer és Kentish, 1994). A szívizom kontrakciója az intracelluláris fehérjékhez tartósan nem asszociált, úgynevezett 2+

„szabad” Ca

koncentráció változásainak függvénye, melyet a rövidülésre képes kontraktilis 3

fehérje rendszer alakít át erıvé (Solaro és munkatársai, 1971; Zot és Potter, 1987). A kalcium ionokat a TnC képes megkötni, ami által az aktin-miozin komplex kialakulását regulálja 2+

(Palmer és Kentish, 1994). A szisztole alatt felszabaduló Ca

az extracelluláris térbıl és a

szarkoplazmatikus retikulum (SR) raktáraiból származik. A troponin-kalcium komplex a troponin és tropomiozin helyzetváltozását eredményezi az aktin filamentumon, melynek következtében az aktin miozinkötıhelyei szabaddá válnak. A folyamat végeredményeképpen a vékony filamentumok elcsúsznak a vastag filamentumokon (sliding mechanizmus) és létrejön a kontrakció. A relaxáció során a Ca2+ a troponin C-rıl disszociál, visszaáll a troponin C eredeti konformációja, és ismét blokkolódik az aktin felszínén a keresztkötések kialakításához szükséges felület (Sonnenblick, 1968).

1. ábra A vékony filamentumot az aktin, a tropomiozin és a troponin komplex alkotja

2.2. Szívelégtelenség A szívelégtelenség világszerte jelentıs, rohamosan növekvı társadalom-egészségügyi problémát jelent. A betegség a felnıtt lakosság 1-2 %-át érinti, az ötéves halálozási rátája meghaladja az 50 %-ot. A Framingham Study adatai alapján az éves incidencia az életkor elırehaladtával fokozatosan növekszik: 35-65 év között 3, míg 65-94 év között 10 megbetegedés fordul elı évente, 1000 lakosra vonatkoztatva (Palmer és Kentish, 1994). Az elmúlt évtizedek terápiás sikerei ellenére a szívelégtelenség mortalitása napjainkban is a közepes malignitású daganatos betegségek halálozásának felel meg. A szívelégtelenség összetett tünetcsoport, ami a szív pumpatevékenységét gátló strukturális vagy mőködési rendellenességek hatására alakul ki. A szívelégtelenség felosztása történhet fellépésének idıbeli jellegzetességei (akut, krónikus), a pumpafunkció károsodása

4

(szisztolés, diasztolés), a dominálóan érintett szívfél, a perctérfogat, a tünetek súlyossága és az etiológia alapján. A bal kamra megromlott szisztolés funkciójával járó forma a szisztolés szívelégtelenség, amely az esetek körülbelül 60-65%-ában mutatható ki. A krónikus szívelégtelenség másik, típusos megjelenési formája a diasztolés szívelégtelenség, amikor a szisztolés balkamra-funkció megtartott (az ejekciós frakció több mint 40%), a nem vagy alig tágult bal kamra, a koncentrikus hipertrófia és a diasztolés mőködési zavar kimutathatók (Zile és munkatársai, 2004). Ez a forma hipertóniás, illetve diabeteses betegek, elsısorban nık körében a leggyakoribb. A kórkép molekuláris háttere, hogy egy myofilamentalis struktúrfehérje, a titin merevebbik, izoformájának az expressziója növekszik a rugalmasabb, izoforma rovására. Az is felmerült, hogy diasztolés szívelégtelenségben csökken a kontraktilis fehérjék foszforiláltsága (LeWinter, 2004). Mind etiológiáját, mind kezelését tekintve teljességgel külön formának tartjuk az akut szívelégtelenséget. Számos betegség vezethet a szívizom összehúzódó erejének csökkenéséhez. A leggyakoribb kórok a szív saját vérellátásának útjában álló akadály, vagyis a koszorúerek szőkülete. Ebben a folyamatban nagy szerepet játszik a magas vérnyomás, cukorbetegség. Egy másik gyakori betegségcsoport, mely a szív munkáját megnöveli, a szívbillentyők hibás mőködésébıl adódik. Mérgezés, kardiotoxikus gyógyszerek, alkohol is elıidézıi lehetnek a szívizom

károsodásának.

Vírusfertızések

(pl.

HIV

fertızés)

is

okozhatnak

szívelégtelenséghez vezetı szívizomgyulladást, de anyagcsere-betegségek (pl. kezeletlen pajzsmirigy-túlmőködés, vérszegénység) is elıidézhetik. Mindenesetre, a szívelégtelenség patomechanizmusának hátterében számos tényezı áll. Kialakulásában a szívizom kóros átépülése, a nem megfelelı szerkezető kontraktilis fehérjék megjelenése, a kalcium felszabadító és -szekvesztráló folyamatok megváltozása, kalciumforgalommal szoros kapcsolatban álló protein kináz C megváltozott izoforma aránya, a

kontraktilis

rendszer

kalcium

érzékenységének

és/vagy

kalcium

ionra

adott

válaszkészségének módosulása, a neurohumorális rendszer aktivációja, citokinek fokozott termelıdése, az endothel kóros mőködése, az oxidatív és nitrozatív károsodások mellett a sejthalálnak is szerepe van (Édes, 2000, Douglas és Mann 1999). Míg korábban a hemodinamikai koncepció volt uralkodó, napjainkra a hangsúly áttevıdött a neurohormonális rendszer szerepére. A neurohormonok célszervek sejtjeinek felszínén található specifikus receptorokhoz kötıdnek és ennek hatására intracelluláris jelátviteli utak aktiválódnak. Ezek egyrészt azonnali sejtválaszokat hoznak létre, másrészt

5

hosszabb távon sejtproliferációs, differenciálódási és apoptotikus folyamatokat szabályoznak, amelyeknek végsı közös eredménye a megnövekedett fehérjeszintézis és a következményes, szövettanilag is kimutatható hipertrófia, amely a remodeling néven is ismert folyamatok egyik alapvetı megjelenése. A

krónikus

szívelégtelenség

patofiziológiájában

a

szívizomsérülés

okozta

ellenregulációs mechanizmus legfontosabb vazokonstriktor elemei a fokozott szimpatikus idegrendszeri aktivitás, a renin-angiotenzin-aldoszteron-tengely fokozott tónusa. A tartós szimpatikus aktivitás azonban a szívizomsejtek károsodását idézi elı, a béta-1 receptorok down-regulálódnak, amely a szimpatikus ingerre adott válaszkészség, tehát a terhelhetıség csökkenésében nyilvánul meg. A keringésben felszaporodó angiotenzin-II az AT1 receptorokon keresztül hatva fokozza a vazokonstrikciót (afterload növekedés), fokozza az aldoszteron szekréciót, és ezen keresztül nátrium-retenciót, mely volumenexpanzióhoz vezet (preload növekedés). A miokardiumban lokálisan termelıdı angiotenzin-II fokozza a miociták apoptózisát, hipertrófiáját, és az aldoszteronhoz hasonlóan intersticialis fibrózist indukál. A szívelégtelenségben egyéb neurohormonális rendszerek is részt vesznek. Ezek közül a vazokonstriktorok közé tartoznak az arginin-vazopresszin rendszer, az endotél termelte endothelin-1, a neuropeptid-y. Vazodilatátor hatású az atrialis natriureticus peptid, agyi típusú natriureticus peptid, az endotélbıl felszabaduló nitrogén-monoxid, a kallikreinkinin rendszer és a citokinek. A szívelégtelenség progressziója során az egyensúly a két rendszer között megbomlik, és a vazokonstrikció válik dominánssá. A szívelégtelenség gyógyszeres kezelése ezen káros neuroendokrin aktiváció (maladaptáció) befolyásolására irányul (Mark, 1995). A miofibrilláris fehérjék szívelégtelenség kapcsán kialakuló változásai régóta intenzív kutatás tárgyát képezik. Ismert, hogy elırehaladott szívelégtelenségben a kontraktilis apparátus miozin ATPáz aktivitása csökken. Kis állatokban (egér, patkány) a gyors (α) miozin nehéz lánc (MHC) izoenzim típus helyett fokozódik a lassú (β) MHC expressziója (Mercadier és munkatársai, 1981). Következményként a kontraktilis filamentumok mőködése ugyan gazdaságosabbá válik, ennek azonban az ára, hogy csökken a kontrakció sebessége (Vmax). A kis emlısöknél leírt miozin izoenzim váltás (switch) humán szívizomban valószínőleg csak kisebb mértékben kap szerepet (az eleve meglévı β-MHC dominancia miatt). A miokardium ökonomikusabb „üzemmódra” való beállása azonban a humán szívre is jellemzı. Valószínősítik, hogy itt a fötális troponin T és a pitvari miozin könnyő lánc balkamrai izomzatban történı expressziója is hozzájárulhat a fentebb leírt eltérésekhez (Anderson és

6

munkatársai, 1991). Mindezen eredmények mellett is elmondható ugyanakkor, hogy a humán krónikus szívelégtelenség során kialakuló miofibrilláris fehérje eltérések csak részben tekinthetık tisztázottnak. Az oxidatív stressz elmélet (vagy szabad gyök teória) jelenleg az egyik legelfogadottabb magyarázat arra, hogy a szívelégtelenség hogyan vezet progresszív sejtkárosodáshoz

a

biokémiai

mechanizmusok

szintjén.

Ezen

elmélet

szerint

a

kardiovaszkuláris funkció beszőkülése a miokardiumban és a koronária-érrendszerben fokozatosan

felhalmozódó

irreverzíbilis

oxidatív

károsodások

következményének

tulajdonítható, melyeket reaktív oxigén- és nitrogéngyökök okoznak (Mariani és munkatársai, 2005).

2.2.1. Szabadgyökök termelıdése A szabadgyököknek alapvetıen két csoportja van, az oxigén eredető (ROS) és a nitrogén eredető (RNI) szabadgyökök. Oxigén eredetőek a szuperoxid gyök (O2-), az aktív hidroxil gyök (OH•), a hidroperoxil gyök (OH2-), a peroxil gyök (RO2-), az alkoxil gyök (RO-), a szinglet oxigén (1O2) és az ózon (O3) (Cheeseman és Slater, 1993). A nitrogén eredető szabadgyökök közé a nitrogén monoxid (NO-), a nitrogén dioxid (NO2-), a peroxinitrit (ONOO) és az alkil peroxinitritek (ROONO) tartoznak (Gutteridge, 1995; Halliwell és Whiteman, 2004). Mindezek mellett vannak olyan molekulák is, amelyek ugyan nem rendelkeznek párosítatlan elektronnal, mégis reaktívak, képesek kapcsolatba lépni más molekulákkal, például a hidrogén peroxid (H2O2) és a hipoklórsav (HOCl) (Halliwell és Gutteridge, 1986). Szabadgyökök keletkeznek fiziológiás körülmények között is az emberi szervezetben a mitokondriális oxidatív metabolizmus, a mikroszomális drogmetabolizáló enzimrendszer, a prosztaglandin szintézis, a konstitutív és az indukálható NO-szintáz aktivitása, a monocitamacrophag rendszer képviselıinek oxigéntıl függı ölı mechanizmusai, a peroxiszomális hidrogén-peroxid autooxidációja és a lipidperoxidáció során. Ennek megfelelıen hypoxiában, hyperoxiában és normális oxigéntenzió mellett is keletkezhetnek reaktív oxigén szabad gyökök (Fridovich, 1986; Sies és Murphy, 1991). Szigorúan szabályozott védekezı mechanizmusok biztosítják azt, hogy ezek az élettani folyamatok bizonyos keretek között, a sejtstruktúrák károsodása nélkül menjenek végbe. Léteznek az oxigén szabad gyökök kóros felszaporodását megakadályozó 7

enzimrendszerek, így a szuperoxid-dizmutázok (SOD-ok), a kataláz, a peroxidáz, a glutationS-transzferáz és a különféle reduktázok. Az enzimek tevékenységét kiegészítik az antioxidáns, scavengerkapacitással rendelkezı vitaminok (C, A, E, K); a kofaktorok; a tiol-, foszfor-, amin-, poliamintartalmú vegyületek; a fenolok, kinolonok, az ubidekarenon; a flavonoidok, poliének; a glükóz, az urát, a bilirubin stb. (Beyer, 1990; Halliwell, 1987; Mortensen, 1993; Pryor, 1982; Slater, 1984). Ezenkívül számos nyomelem is (szelén, mangán, réz, cink) fontos szerepet tölt be a redox egyensúly fenntartásában (Bollag, 1983). Az albumin, a cöruloplazmin, a transzferrin és a tetramer SOD az extracelluláris tér védelmét biztosítja. Ezzel összhangban, szívelégtelenségben szenvedı betegekben összefüggést találtak a szívelégtelenség klinikai stádiumai és az antioxidánsok és oxidánsok szintje között: A NYHA (New York Heart Association) III stádiumban lévı betegekben szignifikánsan alacsonyabb A vitamin, E vitamin és lutein szinteket, míg magasabb malondialdehid értékeket mértek, mint a NYHA II. állapotban lévı betegekben (Polidori és munkatársai, 2002). Ha

a

szabadgyökök

mennyisége

megnı

(akár

az

elimináló

folyamatok

hatékonyságának csökkenése, akár a termelıdés fokozódása miatt), akkor DNS, fehérje és lipid károsodások következhetnek be. A károsodott molekulák eltakarításában enzimatikus hibajavító mechanizmusok szolgáltatnak védelmet. Így a károsodott DNS eliminálásában exonukleázok, endonukleázok vesznek részt, míg a károsodott fehérjéket proteinázok, proteázok, peptidázok bontják le. A módosított lipideket foszfolipázok, glutationperoxidáz, transzferázok, reduktázok alakítják át kevésbé toxikus formákká (Fridovich, 1986). Amennyiben az élettani kontrollmechanizmusok alól kiszabadulnak és kórosan felszaporodnak a szabadgyökök, oxidatív stresszrıl beszélünk. A szabadgyökök fıként a szabad funkciós csoporttal rendelkezı peptideket, polipeptideket és fehérjéket támadják meg. Ennek következtében a molekulák kémiai szerkezete megváltozik, az enzimfunkcióval rendelkezı fehérjék inaktívvá válnak, a kóros lipidperoxidációs folyamatok a sejtmembrán permeabilitásának megváltozásához vezetnek, a nukleinsavak károsodása pedig a DNS láncok törésén keresztül apoptózist vált ki (Beckman és munkatársai, 1990; Bors és munkatársai, 1990). A szabadgyökök alapvetıen befolyásolják a kardiovaszkuláris rendszer funkcióit, mind fiziológiás, mind kóros állapotokban. A nitrogén monoxid szabadgyök (NO) termelıdésének felfedezése és kardiovaszkuláris szabályozó szerepének felismerése alapjaiban változtatta meg nézeteinket a vérkeringés szabályozásáról. A konstitutív NO szintázok (cNOS) által termelt NO fıként fiziológiás szerepet játszik, biológiai életideje is viszonylag hosszú (másodpercekben mérhetı), ezért ezt a molekulát a szervezet másodlagos 8

hírvivınek, vagyis biológiai jelzések közvetítıjének használja fel a szív és érrendszerben, és az idegrendszer számos területén is. A NO biológiai szerepeinek felismerése az utóbbi évtized egyik legfontosabb felfedezése volt, amelyért 1998-ban három amerikai kutató Nobel-díjat kapott (Ignarro és munkatársai, 2002). Számos szív- és érrendszeri betegség patogenezisében a nitrogén monoxid egyes káros melléktermékei (pl. a peroxinitrit, amely a NO és a szuperoxid gyök reakciójából származik), fontos szerepet játszanak. A peroxinitrit több aminosav oxidatív módosítására képes, ami enzimek és ioncsatornák inaktiválódásához vezethet. A peroxinitrit által kiváltott nitrálódás tirozin és triptofán oldalláncokon történik. A reakcióban képzıdı nitrotirozint az in vivo termelıdı peroxinitrit indikátorának tekintik (Szabo, 2003). A szakirodalomban adatokkal rendelkezünk a peroxinitrit miofibrilláris mechanikát károsító hatásáról is. Szívizomsejt tenyészetekben megfigyelték a peroxinitrit kontraktilis funkciót csökkentı hatását (Ishida és munkatársai, 1996). Korábban laboratóriumunkban folyó humán izolált szívizomsejteken végzett kísérletekben peroxinitrit hatására a Ca2+aktivált erı csökkenését tapasztalták (Borbely és munkatársai, 2005). Ezen kísérletekben a Zvonalakban elhelyezkedı fehérje, az α-actinin fokozott nitrotirozinilációját figyelték meg, mely ezáltal hozzájárulhat a kontraktilis funkció romlásához fokozott peroxinitrit termelıdéssel járó állapotokban. Igazolták, hogy a peroxinitrit-indukált szerkezeti és funkcionális változások a miokardiális fehérjékben létrejövı nitrotirozin oldalláncok mennyiségével összefüggést mutatnak. Peroxinitrittel vagy citokinekkel kezelt patkány dolgozó szív preparátumokon csökkent a szívizomzat ATP felhasználása, amely alapján a peroxinitrit kontraktilis funkcióra kifejtett közvetlen hatása feltételezhetı. Kimutatták, hogy iszkémiás-reperfúziós károsodásban megemelkedik a NO szintje, mely mivel a peroxinitrit keletkezésének egyik fı meghatározója, a peroxinitrit mennyiségét is megnövelheti. Az eddigi kísérletes eredmények alapján megállapítható, hogy a peroxinitrit által kiváltott nitrotirozinoldallánc képzıdés nem csak egyetlen célfehérje károsodását jelenti. A fehérjék oxidatív módosulásait (a fentebb részletezett nitrálódással szemben) általában a H2O2 indítja el. A fehérjék oxidálódása számos hatással járhat: 1. A fehérjék fragmentációjához vezetı oxidálódás. 2. Fehérje-fehérje keresztkötések kialakulása. 3. Az aminosav oldalláncok oxidációja. 4. Reaktív karbonil származékok (RCD) keletkezése. A szabadgyökök támadásának a fehérjék minden aminosav maradéka ki van téve. A fehérjék oxidatív módosulása fémionok által katalizált folyamat. Az aminosavak közül az 9

arginin, lizin, prolin, aszparagin és glutamin oxidatív módosulása eredményezi a RCD kialakulását, amit kísérletesen dihidrofenilhidrazonnal (DNPH) lehet kimutatni (Nakamura és Goto, 1996). Habár a karboniláció elkerülhetetlen fiziológiás következmény az aerob szervezetekben, gyakran használt markere a szabad gyökök okozta fehérjekárosodásoknak is. A kardiovaszkuláris betegségek kialakulásának hátterében gyakran áll ateroszklerózis és a hipertenzió. Ezekben a kórfolyamatokban fontos szerepe van a szabadgyököknek, mint ahogy a szív- és érrendszeri betegségek rizikófaktorai (diabetes, elhízás, dohányzás) is fokozott szabadgyök képzıdéssel járnak. Számos tanulmány foglalkozik a kardiovaszkuláris betegségek és az oxidatív stressz kapcsolatával, például érelmeszesedésben (Harrison és munkatársai, 2003), akut és krónikus koszorúér szindrómákban (Valgimigli és munkatársai, 2003), hipertenzióban (Taniyama és Griendling, 2003), szívelégtelenségben (Berry és Hare, 2004; Ferrari és munkatársai, 2004), diabetes szívszövıdményeiben (Pennathur és Heinecke, 2004), érkárosodásban és krónikus veseelégtelenségben (Himmelfarb és munkatársai, 2002). Bizonyították a szívizomsejteket érı oxidatív stressz kontraktilis funkcióra kifejtett káros hatását is, és vizsgálták ennek szerteágazó molekuláris hátterét (Dhalla és munkatársai, 2000; Singal és munkatársai, 1998). Így például a szívizomsejtekben H2O2 hozzáadása után csökkent alfa-aktin, troponin I, miozin könnyő lánc 2, és kreatin kináz M izoformáját kódoló mRNS szint figyelhetı meg (Waring és munkatársai, 2001). Számos szarkoplazmatikus retikulum fehérje képzıdése is zavart szenved H2O2 jelenlétében, valamint több csatorna és receptor is károsul, így például a Ca2+-csatornák, ryanodin-receptorok, valamint a Ca2+-pumpa ATP-áz (Dhalla és munkatársai, 2000).

2.2.2. Sejthalál: nekrózis - apoptózis A sejtelhalált morfológiai jellemzıi szerint alapvetıen két csoportba szokás sorolni: az apoptózis során a sejt jellemzıen zsugorodik, citoplazma kitüremkedések jelennek meg, a kromatin kondenzálódik, fragmentálódik, de a sejttartalom membránokkal történı határoltsága nem sérül. Ezzel szemben nekrózis során a sejt duzzad és a lipid-membránok sérülése folytán a sejttartalom egy része kiszabadul a sejtek közötti térbe. Az apoptotikus sejt maradványait a makrofágok vagy parenchymasejtek bekebelezik, lebontják, anélkül, hogy a sejtalkotórészek a környezetbe kerülnének. Ezért a nekrotikus sejtekkel ellentétben az apoptózis nem vált ki gyulladást, bár a fagocitáló sejteket aktiválhatja, és így az immunrendszert stimulálhatja. Feltételezések szerint az apoptózis és a nekrózis bekövetkeztét 10

az határozza meg, hogy a sejtben a sejtpusztulás programjához elegendı ATP áll-e rendelkezésre. Ha igen, akkor apoptózis következik be; a sejtmembrán és a sejtorganellumok egy ideig még mőködıképesek, míg ha nem áll elegendı ATP rendelkezésre, akkor a sejtek nekrózissal halnak el. Fontos azonban szem elıtt tartani azt is, hogy a két sejthalálforma nem különíthetı el teljesen egymástól, hanem valójában egy folyamat két végpontjának tekinthetjük azokat. Az apoptózis alapvetı molekuláris mechanizmusa viszonylag jól ismert. Apoptózis során általában aktiválódnak a kaszpázoknak nevezett proteáz család tagjai, amelyek célfehérjéik hasításával beindítják a sejt morfológiai átalakulását (Nicholson és Thornberry, 1997; Palmer és Kentish, 1994; Stennicke és Salvesen, 1999). A kaszpázok aktiválódási körülményei alapján két alapvetı útvonalat lehet megkülönböztetni: a külsı jelút során, plazmamembrán receptorokon (halálreceptor) keresztül történik a kaszpáz aktiválódás; míg a belsı jelút során egy citoplazmatikus fehérjekomplex, az úgynevezett apoptoszóma kialakulása segíti elı a kaszpáz aktiválódást. A belsı jelút legfontosabb szabályozó elemei a mitokondriummal állnak szoros kapcsolatban (Dorn, 2008). 2.2.2.1. Halálreceptor út A halálreceptorok az evolúció legmagasabb szintjén jelennek meg. A halálligandok olyan

citokinek

amelyek

specifikus

receptorukkal

összekapcsolódva

elindítják

az

apoptózishoz vezetı jelátviteli utat. A halálreceptorok és a halálligandok fontos szerepet játszanak a szöveti homeosztázis fenntartásában. A halálreceptorok transzmembrán receptorok, melyek a TNF-receptor családba tartoznak. A fehérjecsalád elsıként felfedezett tagja a tumornekrózis faktor (TNF). Legtöbbjükben található egy homológ citoplazmatikus fehérjerész (haláldomén), ezen keresztül közvetítik az apoptotikus jelet a sejt belseje felé (Gruss és Dower, 1995). A halálreceptor-halálligand kötıdést követıen kialakuló sejthalált kiváltó jelátviteli komplex (DISC) hatására aktiválódhatnak az iniciátor kaszpázok (kaszpáz2, -8, -10), melyek továbbíthatják az apoptotikus jelet az effektor kaszpázok felé (Dorn, 2008). 2.2.2.2. Kaszpázok A kaszpázok legfontosabb tulajdonságaikat nevükben rejtik, az enzimcsalád tagjai ugyanis kivétel nélkül P1 aszpartát specifikus cisztein proteázok (Caspase = cystein-

11

dependent aspartate–specific protease) (Palmer és Kentish, 1994; Stennicke és Salvesen, 1999). Az eddig azonosított 14 emlıs kaszpáz szerepe sokféle, részt vesznek az apoptózisban iniciátorként

és

effektorként

egyaránt,

valamint

a

gyulladásos

folyamatokban.

Szekvenciaelemzésekbıl és biokémiai tesztek alapján a kaszpázokat két nagy családba sorolják: 1.) gyulladásos folyamatokban szerepet játszók (kaszpáz-1, -4, -5, -11, -13) és 2.) apoptotikus folyamatokban szereplık (kaszpáz-2, -3, -6, -7, -8, -9, -10, -12). A kaszpázok aminosav szerkezete hasonló (Nicholson és Thornberry, 1997). A haláldoménnel, illetve a kaszpáz aktiváló doménnel (CARD) rendelkezı szabályozó fehérjék segítik az aktiválódásukat. A kaszpáz enzimeknek eltérı a hasítási szekvenciája, ezzel magyarázható, hogy a sejt legkülönbözıbb fehérjéit képesek hasítani, hozzájárulva így a sejtalkotók lebomlásához, a sejt apoptotikus testekre való széteséséhez. A szubsztrátok között találunk DNS lebomlás gátlót (ICAD) (Enari és munkatársai, 1998), a Bcl-2 család antiapoptotikus tagjait (Cheng és munkatársai, 1997), szerkezeti fehérjéket (laminok, gelsolin) (Kothakota és munkatársai, 1997) és kinázokat (FAK, PAK2, DNS-PK). Ez mind hozzájárul a sejtalkotók degradálódásához és a sejt apoptotikus testekre való széteséséhez. A kaszpázok mőködésének szabályozása más proteolítikus rendszerekéhez hasonlóan meglehetısen komplex, tartalmaz szabályozó proteázokat, kofaktorokat, visszajelzéseket, küszöbértékeket. Összességében mindenesetre elmondható, hogy a kaszpázok proenzim formában termelıdnek és aktiválásukhoz proteolítikus hasítás szükséges, továbbá, hogy a mőködésüket gátlófehérjék függeszthetik (Richter és Duckett, 2000) fel. 2.2.2.3. Az apoptózis mitokondriális útja A mitokondrium, mint energiatermelı központ, nélkülözhetetlen szerepet játszik az eukarióta sejtek életében, de a halálában is fontos szerephez juthat. Egyesek szerint a mitokondrium a sejt Pandora-szelencéje (Brenner és Kroemer, 2000), mivel olyan fehérjéket tartalmaz, melyek a citoplazmába kerülve elindítói, sokszor elengedhetetlen résztvevıi lehetnek az apoptotikus folyamatnak. Ezek között a fehérjék között találhatók például a prokaszpázok, az apoptózis indukáló faktor (AIF), az adenilát-cikláz 2, vagy például a légzési láncban is résztvevı citokróm-c (amely kaszpáz aktivátor is egyben), a Smac/Diablo (nemrégen felfedezett kaszpáz koaktivátor) és néhány hısokk fehérje (Hsp10, Hsp60). E fehérjék a citoplazmába kerülését pedig más, például a Bcl-2 családba tartozó mitokondriális fehérjék szabályozhatják, serkenthetik vagy gátolhatják. A mitokondriális membrán

12

permeabilitásának fokozódása szükséges az apoptózist kiváltó fehérjék kiszabadulásához, és ettıl függ, hogy a programozott sejthalál mitokondriális útja elindul-e vagy sem. Ezekben a folyamatokban a proapoptotikus jelek a mitokondriumban összegzıdnek, az energiakrízisnek megfelelı változások indulnak meg, melyek a sejtlégzés sebességének változásától az energiatermelés csökkenésén át egészen a mitokondrium pusztulásáig terjedhetnek (Kirshenbaum, 1998). Az utóbbi években megismert mitokondriális apoptózis szignál során a citokróm c és az apoptózis indukáló faktor (AIF) kiszabadul a két membrán közti térbıl, ami úgy lehetséges, hogy a mitokondriális transzmembrán potenciál összeomlik és az úgynevezett mitokondriális transition pore complex megnyílik (Crompton, 1999). A mitokondriumból kikerülı citokróm-c, a citoplazmában az apoptotikus proteáz aktiváló faktor-1-gyel (APAF-1), valamint a dATP-vel vagy az ATP-vel és a prokaszpáz-9-cel együtt alkotja az apoptoszómát. Ennek az enzimkomplexnek a feladata a prokaszpáz-9 aktiválása és ezen keresztül a kaszpáz kaszkád elindítása. 2.2.2.4. PARP-1 Egy másik fontos, oxidánsok által kiváltott, sejtkárosodáshoz vezetı folyamat a sejtmagban elhelyezkedı, poli(ADP-ribóz) polimeráz-1 (PARP-1) aktivációjával kapcsolatos. A PARP-1 a DNS kötı enzimek családjának tagja, a sejtmagban és a mitokondriumban helyezkedik el számos sejttípusban, így a szívizomsejtekben is. Az aktivált PARP-1 a NAD+ot hasítja, nikotinamid és ADP-ribóz jön létre. Az enzim ADP-ribóz alegységeket polimerizál a sejtmagban lévı fehérjékre, hisztonokra és a PARP-1 enzimre magára. A PARP-1 enzim aktivációját a szabadgyökök és oxidánsok kiváltotta DNS károsodás váltja ki. Toxikus anyagok, genotoxikus, vagy citotoxikus drogok, az ionizáló sugárzás, valamint nitrogénmonoxid és szuperoxid anion keletkezésével járó folyamatok a kiváltói a DNS szál törésnek (Szabo, 2003). A DNS-károsodás súlyosságától függıen különbözı intracelluláris reakcióutakat indít be. Enyhe fokú DNS-sérülés esetében a PARP-1 DNS-repair enzimként mőködve a keletkezett sérülés kijavítását, a genom integritását, a sejt túlélését segíti elı. Súlyos DNS-károsodás viszont nagymértékő PARP-1 aktivációt vált ki, amely egy óriási energiaigényő metabolikus ciklust indít be a sejtben. A folyamat rövid idı alatt kimeríti a sejt teljes NAD+- és ATP-készletét, lelassítja a glikolízis folyamatát és a mitokondriális légzést, végül a sejt funkciózavarához, majd elhalásához vezet. A PARP-1 enzim túlzott aktivációját leírták többek között szívizom infarktus (Thiemermann és munkatársai, 1997), iszkémia-reperfúzió (Szabo és Bahrle, 2005),

13

szívelégtelenség (de Boer és munkatársai, 2000) és szívtranszplantáció (Szabo és munkatársai, 2002b) eseteiben. Korábbi tanulmányokban bizonyítást nyert, hogy a cukorbeteg állatok és emberek szívizomszövetében és érfalában a poli(ADP-ribozil)ált fehérjék mennyisége emelkedett, valamint károsodott a pumpafunkció (Pacher és munkatársai, 2002b). Állatkísérletekben a PARP enzim specifikus gátlószereivel csökkenteni lehetett a károsodás során elhalt szívizomterület nagyságát, a szövetkárosodás mértékét (Pacher és munkatársai, 2002b; Szabo és munkatársai, 2004b). Újabb tanulmányok kimutatták, hogy a PARP-1 képes aktiválni a DNS-fragmentáció bizonyos effektorait is. Ezen eredmények szerint szívizom sejtekben és érfali sejtekben a PARP-1 irányítja az apoptózis-indukáló faktor (AIF) mitokondriumból sejtmagba történı transzlokációját (Xiao és munkatársai, 2005). Az oxidoreduktáz aktivitással rendelkezı AIF hatására mitokondrium membrán depolarizáció, citokróm-c-kiszabadulás, a sejtmagban a kromatin kondenzációja, valamint a plazmamembrán fosztatidilszerinjeinek a külsı lipidrétegbe vándorlása tapasztalható. E folyamat élettani jelentısége abban rejlik, hogy a kijavíthatatlan DNS-károsodást elszenvedett sejtek ezzel a mechanizmussal biztonságosan eliminálódhatnak. Fontos megjegyezni, hogy az AIF kaszpáz- és Bcl-2-függetlenül vált ki apoptózist.

2.3.

A

szívizom

kontraktilitás

szabályozásának

molekuláris

mechanizmusai 2.3.1. Frank-Starling mechanizmus 1895-ben, illetve 1915-ben írták le Frank és Starling az úgynevezett „szívtörvényt” (Zimmer, 2002), melynek lényege, hogy a fokozott igényekhez (növekvı vénás visszaáramlás) a bal kamra a végdiasztolés térfogat növekedésével válaszol, ami a megnövekedett

nyugalmi

rosthosszúság

miatt

erıteljesebb

kontrakciókat

(nagyobb

verıtérfogatot) eredményez. Ez végeredményben növeli a perctérfogatot és így a szív mintegy alkalmazkodik

a

megnövekedett

igényekhez.

Ugyanakkor

a

bal

kamra

alkalmazkodóképessége korlátozott, mivel a nyugalmi rosthosszúság növekedése csak egy optimális pontig (2,2 µm-es szarkomerhossz) biztosítja a kontrakciós erı növekedését. Ezen érték felett a bal kamra tágulata mintegy “passzív” folyamattá válik és inkább káros a szívizom adaptációja szempontjából. A Frank–Starling mechanizmus szabályozásában 14

kitüntetett szerepet kap a vastag filamentumokat a szarkomer Z-lemezéhez rögzítı titin, mely fontos szerepet játszik a szarkomer szerkezeti integritásának fenntartásában és a relaxált izom megnyújtásakor kifejlıdı passzív erı szabályozásában. Emellett az aktin és miozin alkotta filamentumok közti oldalirányú tér („lateral spacing”) nyújtás hatására bekövetkezı csökkenését is feltételezik a jelenség hátterében. Ezen mechanizmusok szabályozzák az aktin és miozin közti átfedı terület nagyságát, ezáltal a kereszthidak számát, valamint fokozzák a troponin C kalciumérzékenységét, következményesen a kontrakciós erıt. A szarkomeren belül hosszfüggést biztosító fehérjerendszer mőködése ma még nem kellıen ismert.

2.3.2. Béta adrenerg szabályozás A β- és α-adrenerg rendszer mőködése között lényeges eltérések tapasztalhatók. Az α1-adrenoreceptorok ingerülete simaizom-kontrakciót, illetve vazokonstrikciót vált ki, a szívizomban pedig enyhe pozitív inotrop hatást fejt ki, sejtnövekedést és hipertrófiát eredményez.

A

β2-receptorok

által

mediált

adrenerg

válasz

eredményeként

simaizomrelaxáció, illetve vazodilatáció jön létre. A β1-adrenerg receptorok ingerülete a szívizomban pozitív inotrop és chronotrop hatást, sejtnövekedést, hipertrófiát, a vesék juxtaglomerularis apparátusából pedig reninfelszabadulást vált ki. A β2-receptor sőrősége a normál kamraizomzatban körülbelül harmada a béta-1 receptor mennyiségének. A β2-receptorrendszer miokardiális hatása és szabályozása hasonló a β1 receptorokhoz. Ugyanakkor a normál miokardiumban, egyszerően a β2-receptorok alacsonyabb sőrősége miatt szerepük kevésbé lényeges a kontraktilitás növelése szempontjából. Ugyanez a helyzet az α1-adrenerg receptorokkal, amelyek kontraktilitást növelı szerepe a normál humán miokardiumban alig mérhetı. A szív sejtjeinek sejtfelszíni adrenerg receptorai a G-fehérjéken keresztül szabályozzák a szívritmust, a szívizom kontraktilitását és a szívizomsejtek méretét. Az α1 adrenerg receptor Gq, míg a β adrenerg receptorok a Gs GTP-kötı fehérjét képesek aktiválni, valamint a β2-adrenerg receptor a Gi fehérjével is kapcsolt. A Gs az adenil-cikláz aktiválásán keresztül, a cAMP-termelést fokozva, a cAMP-függı protein kinázt (PKA) stimulálja, és ezáltal éri el célmolekuláit (Schaub és munkatársai, 2006). A Gq-fehérje esetében a kaszkád elsı lépése a foszfolipáz C (PLC) aktiválása, majd az inozitol-triszfoszfát és a diacil-glicerol mint másodlagos hírvivık termelése, végül a protein kináz C (PKC) aktiválása történik. Ezek a másodlagos hírvivık aktiválják a sejtmag transzkripciós faktorait, melyek végsı soron a 15

szív adaptációs válaszának következtében szívizomhipertrófia, fibrózis, fötális gének expressziója által nyilvánulnak meg (Anversa és munkatársai, 1992; Liew és Dzau, 2004). A kinázok

katalitikus

alegysége

számos

fehérjét

foszforilál.

A

szívizom-hipertrófia

szempontjából mindegyik említett receptor gátlása elınyös hatású, kísérletesen és klinikailag egyaránt. A hipertrófiához vezetı végsı közös utat mindkét esetben a mitogén aktiválta proteinkinázok (MAPK) hatása alkotja. A hipertrófiás válasz lényege, hogy a miocita mérete megnı, a szarkomer reorganizálódik, és fötális gének expresszálódnak (Dorn és Force, 2005). A szimpatikus aktivációnak patogenetikai és progressziót elıidézı szerepe van szinte valamennyi kardiovaszkuláris kórképben, így a krónikus szívelégtelenségben is. A magas katekolamin szint egyúttal a β1-receptorok deszenzibilizálódását, a receptorszám (sőrőség) csökkenését eredményezi (Fowler és munkatársai, 1986). Az α1-receptorok abszolút sőrősége, hasonlóan

a

β2-receptorokhoz

nem

csökken

a

szívelégtelenség

kialakulásával.

Szívelégtelenségben tehát a szívizom legfontosabb inotrop szabályozó mechanizmusa (β1receptorok) válik elégtelenné és a kontraktilitás szabályozását részben egyéb, kevésbé hatékony rendszerek veszik át (β2- és α1-receptorok). Ennek a patológiás folyamatnak a magyarázatára több elmélet szolgál, amelyek közül a legfontosabb a receptorfehérje foszforilációja a β-adrenerg receptorkináz (β-ARK) által. A foszforiláció szétkapcsolja a receptorfehérjét a G-proteinektıl és az adenil-cikláztól, ami miatt a rendszer funkcionálisan inaktiválódik

(Ungerer és munkatársai,

1993).

Végül endocitózis

segítségével

a

receptorstruktúra eltőnik a membrán felszínérıl. A mőködıképes kalciumcsatornák megnövekedett száma okozta fokozott aktivitás hatására transzgénikus állatmodellekben a βreceptorok deszenzitizációja alakul ki, változatlan receptorszám mellett (Muth és munkatársai, 1999). Ez a jelenség egy kalciumfüggı β-receptor-inaktiválási folyamatra utal. Párhuzamosan ezzel együtt csökken a stimulálás során keletkezı cAMP mennyisége, illetve kórosan emelkedik a gátló jellegő G-protein szintje, ami befolyásolhatja a receptorok funkcióját (Dorn és Force, 2005). Ennek a túlaktivált neuroendokrin rendszernek a gátlásán alapul a szívelégtelenség terápiája.

2.3.3. Protein kináz C - függı szabályozás

A protein kináz C izoenzimcsalád a szerin/treonin kinázok egyik képviselıje. A mai napig legalább 11 különbözı PKC izoenzimet azonosítottak, melyeket szerkezeti jellegzetességeik, valamint aktivációs mechanizmusaik alapján négy nagyobb csoportba 16

sorolhatunk. A „klasszikus” csoportba (cPKC) 4 izoenzim tartozik: a PKCα, βI, βII és γ. Ezen izoenzimek közös jellemzıje, hogy kalcium- és diacil-gricerol- (DAG), illetve annak exogen megfelelıjeként mőködı forbolészter-dependensek, vagyis aktiválódásukhoz ezen anyagokat kofaktorként igénylik. A második csoportba a nem kalcium függı PKCδ, ε, η, θ izoenzimek tartoznak, melyeket szokás „novel” PKC-nek is (nPKC) nevezni. Közös jellemzıjük, hogy forbol-észter jelenlétében, kalcium nélkül is maximálisan aktiválhatóak. Harmadik csoportba az „atípusos” (aPKC) izoenzimek sorolhatók, melyek közé a PKCζ és λ/ι izoenzimek tartoznak, melyek aktiválódásukhoz sem kalciumot, sem forbol-észtert nem igényelnek. Végezetül külön csoportba sorolható a PKCµ, mely mind aktivációját mind szerkezetét tekintve rendhagyó izoformának tekinthetı. A PKC aktivitásának egy fontos szabályozója in vivo az enzim és szubsztrátjainak sejten belüli eloszlása. Immunhisztokémiai vizsgálatok kimutatták, hogy a különbözı izoenzimek eltérı sejten belüli kompartmentekben találhatók. Számos olyan fehérjét azonosítottak, amelyek kötıdnek a PKC-hez, s ezen kötıfehérjék közül több az enzim szubsztrátja is lehet. Ahhoz, hogy a PKC a másodlagos hírvivık koncentrációjának változására hatékony választ adjon és szubsztrátjaihoz könnyen hozzáférjen, megfelelı sejten belüli lokalizáció szükséges. A PKC szabályozó doménjéhez kötıdı fehérjék egyik fontos csoportját a RACK (Receptors for Activated C-Kinase) fehérjék alkotják (Mochly-Rosen, 1995; Mochly-Rosen és Gordon, 1998). Ezek az enzim aktív konformációját stabilizálják, csak az aktivált PKC enzimhez kötıdnek, de maguk nem szubsztrátjai az enzimnek. Az emberi szervezetnek nincs olyan sejttípusa amely ne rendelkezne valamely PKC izoformával. Fontos tény ugyanakkor, hogy nem mindegyik izoenzim található meg minden sejttípusban, azaz a PKC izoenzimek a szervezetben az adott speciesre, szövetre, sejtre jellemzı megoszlást és mintázatot hoznak létre. Ebbıl fakadóan a PKC enzimek az élettani szabályozó folyamatok széles skáláját képesek befolyásolni. Alapvetı és központi szereppel bírnak a sejtek proliferációjának és differenciációjának szabályozásában, az apoptózis folyamatában,

a

szervezet

védekezı

mechanizmusaiban,

mediátorok

szintézisében,

miofibrilláris kontraktilitás szabályozásában. A humán szívizomban 6 izoforma azonosítható, PKCα, βI/βII, δ, ε, η, és λ/ι (Sodha és munkatársai, 2008). Krónikus szívelégtelenség kapcsán ismert a kalcium függı izoformák, PKCα, βI és βII szelektív upregulációja (Bowling és munkatársai, 1999; Wang és munkatársai, 2003). Az utóbbi idıben egyre több bizonyíték szól amellett, hogy a PKC izoenzimek nemcsak szerkezeti, aktivációs és megoszlási heterogenitást mutatnak, hanem regulációjuk és biológiai szerepük is különbözhet egymástól. Bebizonyosodott emellett az is, hogy egy adott 17

sejtválasz kialakításában a különbözı izoenzimek nemcsak eltérı aktivitással vehetnek részt, de hatásuk sokszor ellentétesnek adódhat. Ezen megállapítás egyik kiváló példája, hogy in vivo és in vitro iszkémia indukált szívizom károsodás során izolált szívizomsejtekben, perfundált szívben és transzgénikus egér modellben egyaránt ellentétes a PKCδ és PKCε hatása. A PKCδ aktiváció a szívizom károsodás mértékét fokozza, ugyanakkor a PKCε a kardioprotekció kialakulásáért felelıs. Ezen túlmenıen, kísérletes eredmények és a klinikai megfigyelések szerint a hipertrófiás program fenntartásáért PKCδ és ε mediálta mechanizmusok egyaránt felelısek (Chen és munkatársai, 2001). Ezen hatások hátterében minden valószínőség szerint a különbözı PKC izoenzimek egyedi szerepe és eltérı sejten belüli lokalizációja (targeting) áll. A krónikus szívelégtelenség területén folytatott korábbi vizsgálatok számos sejtszintő szignalizációs útvonal érintettségét igazolták. A hipertrófiás transzformáció szempontjából kitüntetett jelentıségőnek tőnnek azok a kapcsolatok, melyek a szarkolemma angiotenzin II, endotelin és katekolaminok G-fehérje-kapcsolt receptorain keresztül az intracelluláris foszfolipáz C és PKC izoenzimek aktiválásán át közvetítenek szignálokat. Nem világos azonban, hogy az aktivált PKC rendszer milyen szerepet játszik a kontraktilis fehérjerendszer foszforilációjában, és az hogyan hat az elégtelen funkciójú miokardium kontraktilis mechanikájára. Annak ellenére, hogy számos PKC izoenzim expresszálódik például patkány szívizomban, kalcium kezelés hatására csak PKCα transzlokációja figyelhetı meg a citoszólból a kontraktilis rendszerhez, mely feltételezi a PKCα kiemelkedı szerepét a kalcium-dependens miofibrilláris-kontraktilitás szabályozásában. A miofibrilláris rendszer Ca-érzékenységére vonatkozó adatok is ellentmondásosak, változatlan (Noland és munkatársai, 1995), csökkent (Burkart és munkatársai, 2003; Sakthivel és munkatársai, 2005) és/vagy

növekedett

(Pi

és

munkatársai,

2003)

Ca-érzékenységrıl

számolnak

be

szívelégtelenségben. Nincs összhang abban sem, hogy az intracellularis foszforilációs folyamatok mely strukturális fehérjéket érintik, ezek milyen módon viszonyulnak a megváltozott miofibrilláris funkcióhoz. In vitro kísérletekben bebizonyosodott, hogy a troponin I (TnI), a troponinT (TnT), a miozin könnyőlánc-2 (MLC-2) és kardiális miozin-kötı C fehérje (cMyBP-C) egyaránt szubsztrátjai a PKC-nek (Noland és munkatársai, 1989; Noland, Jr. és munkatársai, 1996; Noland, Jr. és Kuo, 1993). Továbbá, a speciális TnI foszforilációs helyein kívül (Ser 43/45, Thr144) a PKC képes a PKA Ser 23/24 pozícióban levı foszforilációs helyét is foszforilálni (Noland és munkatársai, 1995; Noland, Jr. és munkatársai, 1996). A molekula PKC-mediált foszforilációja rágcsálókban csökkenti a miozin ATPáz aktivitását és a 18

maximális erıt. Egerekben megfigyelték PKCε aktivációját szívelégtelenségben valamint szívizom hipertrófiában, PKCα-dependens TnI foszforilációt és a foszforilált TnI molekula transzlokációját a kontraktilis rendszerhez (Rybin és Steinberg, 1994).

19

3. Célkitőzések Munkánk során az alábbi két témakör köré csoportosítottuk kérdéseinket: 1. A protein kináz C szerepe a humán miokardium kontraktilitásában Az iszkémia/reperfúziót követı kontraktilis változásokban milyen szereppel bírnak a PKC izoenzimek? 2. A miokardiális sejtek sérülésének markerei szívelégtelenségben Szívelégtelenségben megfigyelhetı-e reaktív oxigén vagy nitrogén gyökök megjelenése? Amennyiben igen, ezek aktiválják-e az apoptózis mitokondriális kaszpáz függı vagy kaszpáz független útvonalát?

20

4. Módszerek 4.1. Etikai vonatkozások Humán szívizom minták feldolgozása a World Medical Assosiation által kiadott Helsinki Deklarációnak megfelelıen történt. A kísérletek végrehajtását a Magyar Egészségügyi Minisztérium (No. 323- 8/2005-1018EKU) és a Debreceni Egyetem Tudományos Tanács Regionális és Intézményi Kutatásetikai Bizottsága (No. DEOEC RKEB/IKEB 2553-2006) is jóváhagyta.

4.2. A miokardiális szívelégtelenségben

sejtek

sérülésének

markerei

4.2.1. Szívizom biopsziák A kísérletek során felhasznált humán bal kamrai szívizom minták egyrészt dilatatív kardiomiopátiában szenvedı, Battista mőtéten átesett betegekbıl (NYHA IV), másrészt 18 és 56 év közötti, férfi és nıi agyhalál állapotában levı szervdonorokból származtak (1. táblázat). A halál oka baleset vagy szubarachnoidális vérzés miatt bekövetkezı cerebrális kontúzió és vérzés volt. A szív pulmonális és aorta billentyő-homograft készítése céljából lett eltávolítva. A graftok készítéséhez fel nem használt bal kamrai miokardiumot kapta meg laboratóriumunk. A donorok kardiális megbetegedésben nem szenvedtek, és egyedül rövid idejő dobutamin és diuretikum kezelésben részesültek. A mintákat kardioplégiás oldatban (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 1,6 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 5 mM NaHCO3; pH 7,4) szállították 4 ºC-on, majd cseppfolyós nitrogénben fagyasztottuk, és felhasználásukig -80 ºCon tároltuk.

21

Esetszám

Státusz

Diagnózis

Kor

Nem

Gyógyszeres terápia

1

NYHA IV

ISZB

40

♀

diuretikum, ASA, Dob., Dop., III. osztályú antiaritmiás szer, Naheparin,

2

NYHA IV

HCM

49

♂

ACEI, BB, OAC

3

NYHA IV

DCM

54

♂

digoxin, ACEI, BB, diuretikum

4

NYHA IV

ISZB

49

♀

ACEI, CCB, OAC, BB, diuretikum

5

NYHA IV

DCM

50

♂

ACEI, OAC, BB, diuretikum, III. osztályú antiaritmiás szer

6

NYHA IV

ISZB

48

♀

ACEI, BB, nitrát, diuretikum

7

NYHA IV

DCM

49

♂

digoxin,OAC, diuretikum

8

NYHA IV

DCM

49

♂

OAC, diuretikum

1

Donor

RIND

46

♂

diuretikum, dobutamin, dopamin

2

Donor

apoplexia cerebri

56

♂

dobutamin, dopamin

3

Donor

SAV

18

♀

dobutamin, dopamin

4

Donor

SAV

37

♀

nincs adat

5

Donor

apoplexia cerebri

39

♀

dobutamin, dopamin

1. táblázat. A vizsgálatba bevont egyének adatai. NYHA: New York Heart Association stádiumok; ISZB: iszkémiás szívbetegség; DCM: dilatatív kardiomiopátia; HCM: hipertrófiás kardiomiopátia; RIND: reverzibilis iszkémiás neurológiai defektus; SAV: szubarachnoidális vérzés; ACEI: angiotenzin konvertáz enzimgátló; CCB: kalcium csatorna-blokkoló; BB: béta-blokkoló; OAC: orális antikoaguláns; ASA: acetil-szalicilsav

22

4.2.2. Szívizom homogenizátum A szívizom mintákat -80 ºC-ról kivéve relaxáló oldatban olvasztottuk fel (1 mM szabad Mg2+, 145 mM KCl, 2 mM EGTA, 4 mM ATP, 10 mM imidazol; pH 7,0). A mintákból a kontraktilitás mérésekhez szükséges szívizomsejteket mechanikusan izoláltuk. A kardiomiocitákat tartalmazó szuszpenziót 5 percig 0,5%-os triton-X-100-zal (relaxáló oldatban) kezeltük. A triton kezelés eredményeként a sejtek membránrendszerei átjárhatóvá váltak, vagyis „kémiailag nyúzott” szívizomsejteket nyertünk, és így lehetıség nyílt a miofibrilláris funkciók kontrollált intracelluláris körülmények között történı vizsgálatára. A preparátumokat ezt követıen 3-szor mostuk és centrifugáltuk egy percig 1000 rpm-en a tritonX-100 eltávolítása céljából. Az így nyert izolált, permeabilizált kardiomiocitákat szilikon ragasztóval egy érzékeny erımérıhöz és egy piezoelektromos motorhoz rögzítettük. Továbbá a

biokémiai

kísérleteinkben

ugyanilyen

módon

elıállított

izolált,

permeabilizált

szívizomsejteket tartalmazó homogenizátumokat használtuk.

4.2.3. Immunhisztokémia Az acetonban fixált szöveteket paraffinba ágyaztuk és 5 µm vastag metszeteket készítettünk (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA). A deparaffinált metszeteket 0,3% hidrogénperoxiddal kezeltük, hogy az endogén peroxidáz aktivitást gátoljuk. A metszeteket 1,5% normál kecske szérummal (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) szobahımérsékleten blokkoltuk 1 órán keresztül, majd 4°C-on inkubáltuk egy éjszakán át 1:100 hígitásban PAR és AIF ellenes nyúlban termeltetett poliklonális elsıdleges antitesttel (mindkettı Calbiochem, San Diego, CA, USA). Ezt követıen fajspecifikus biotinilált szekunder antitesttel (1:200), és ABC reagenssel (mindkettı Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) inkubáltuk a metszeteket. A peroxidáz aktivitást DAB kromogénnel (DAB substrate kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) detektáltuk, majd Gill’s hematoxylinnal (Accustain; Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA) végeztünk háttérfestést. A negatív kontrollként szolgáló metszeteket nem inkubáltuk elsıdleges antitesttel.

23

4.2.4. Western immunoblot 4.2.4.1. Poli-ADP riboziláció vizsgálata A miofibrilláris fehérjék Poli-ADP ribozilációjának mértékét izolált permeabilizált szívizomsejteket tartalmazó homogenizátumból határoztuk meg. A homogenizátumot SDSmintapufferben (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) 10 percig fıztük. A fehérje koncentrációt dot blot módszerrel ellenıriztük, majd 20 µg protein homogenizátumot vittünk fel 10%-os gradiens gélre (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). A molekulasúly szerint szétválasztott fehérjéket 1%-os tejporban blokkoltuk 1 óráig, majd az 1%-os tej-PBSben hígított elsıdleges PAR ellenes antitesttel (1:10 000; Calbiochem, Gibbstown, NJ, USA) inkubáltuk. A membránokat ezt követın megfelelı másodlagos torma-peroxidázzal kapcsolt antitesttel (1:10 000; Calbiochem, Gibbstown, NJ, USA) inkubáltuk. A jeleket felerısített chemiluminescencia (ECL) (PerkinElmer Life Science, Waltham, MA, USA) segítségével autoradiographiás filmen (Primax RTG-B) vizualizáltuk. A filmeken kapott sötét sávok reprezentálták a poli-ADP ribozilált fehérjéket. 4.2.4.2. Fehérjék karboniláltságának vizsgálata A 4.2.2. pontban leírtaknak megfelelıen szívizom izolálást végeztünk, azzal a különbséggel, hogy izoláló oldat helyett RIPA-puffert használtunk (1% Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA), 0,5% Na-deoxikolát (Reanal Finechemical, Budapest, Hungary), 0,1% Na-dodecilszulfát (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA), 2 v/v% protein inhibitor koktél (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA), 0.5 mM PMSF (Fluka, Buchs, Switzerland), and 1 mM benzamidine-hidroklorid hidrát (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA)). A frakciók fehérjetartalmát BioRad Protein Assay-vel határoztuk meg. A fehérjeoldalláncok karboniláltságának vizsgálatát OXYBLOT kittel (Oncor, Gaithersburg, MD, USA) végeztük. A meghatározás során az elektroforézist és transzfert követıen a módosult (karbonilált) oldalláncokat elıször dinitrofenilhidrazinnal (DNPH) reagáltattuk, majd DNPH-ra specifikus elsıdleges antitesttel inkubáltuk. Ezt követıen hagyományos immunoblot metodikával mutattuk ki a karbonilált fehérjéket.

24

4.2.4.3. A minták PARP-1, kaszpáz-9 és nitrotirozin oldallánc tartalmának vizsgálata A PARP-1 és kaszpáz-9 jelenlétét 10%-os SDS-poliakrilamid gélelektroforézist, a donor illetve beteg mintákban meglevı, valamint a peroxinitrit kezelés (10-500 µM) hatására a miofibilláris fehérjékben létrejövı nitrotirozin oldalláncok képzıdését 5-20%-os SDSpoliakrilamid grádiens-gél elektroforézisét követıen Western-immunoblottal vizsgáltuk. Mintánként 15-30 µg proteint választottunk el az elektroforézis során. A membrán szabad kötıhelyeit 1%-os sovány tejport tartalmazó PBS-ben (tej-PBS) 1 óráig blokkoltuk, majd 1%os tej-PBS-ben hígított megfelelı elsıdleges (PARP-1 (1:10 000, Calbiochem, Gibbstown, NJ, USA), kaszpáz-9 (1:1 000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), nitrotirozin oldallánc (1:10 000, Calbiochem, Gibbstown, NJ, USA) felismerı) antitesttel inkubáltuk. A membránokat ezt követıen megfelelı másodlagos biotinált (Vectastain ABC kit; Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA), vagy torma-peroxidáz kapcsolt antitesttel (SigmaAldrich Corp., St. Louis, MO, USA) inkubáltuk, végül az immunreakciók eredményét kemilumineszcens módszerrel (PerkinElmer Life Science, Waltham, MA, USA) tettük láthatóvá.

4.3. A protein kináz C (PKC) szerepe a humán miokardium kontraktilitásában 4.3.1. PKC és troponin I kimutatása immunhisztokémiával A humán szívizom mintákból -20°C-on kryostatban készítettünk 10 µm-es metszeteket, melyeket 5 percre hideg acetonba helyezve fixáltunk. A fixált metszeteket PBSben mostuk szobahımérsékleten, majd 1 órán át kecske szérum albumint tartalmazó blokkoló oldatban blokkoltuk. A metszeteket PKCα ellenes nyúlban termeltetett elsıdleges antitesttel (1:100, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA), majd FITC-konjugált kecskében termeltetett nyúl ellenes antitesttel (1:100, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) inkubáltuk. A TnI vizualizálására TnI ellenes egérben termeltetett elsıdleges antitesttel (clone 22B11, 1:100, Research Diagnostics Laboratories Inc., Louisville, TN, USA) inkubáltuk a metszeteket, melyeket végül egy háromlépéses sztreptavidin-biotin komplex alapú (1:100, JacksonLaboratories, Bar Harbor, ME, USA) immunhisztokémiai eljárás segítségével festettük meg.

25

4.3.2. Biokémiai módszerek A vizsgált kontraktilis változások biokémiai hátterének tisztázásához többféle módszert alkalmaztunk. A miofibrilláris fehérjék in vitro foszforilációjával és Western blot analízisével az egyes fehérjék szintjén bekövetkezı változásokat detektáltuk. A mechanikai és biokémiai méréseinkbıl származó adatok megbízható összevethetısége érdekében hasonló kísérleti körülmények (hımérséklet, inkubációk idıtartama) megteremtésére törekedtünk a különbözı módszerek alkalmazása során. Továbbá a mechanikai és biokémiai kísérleteinkben ugyanolyan

módon

elıállított

izolált,

permeabilizált

szívizomsejteket

tartalmazó

homogenizátumot használtuk. 4.3.2.1. Humán szívizomsejtek „rekonstrukciója” Az izolált, permeabilizált kardiomiocitákhoz visszaadtuk az izolálás során eltávolított citoszólt ~1 mg miocita protein/ml koncentrációt beállítva. Az aktivációk során a „rekonstruált„ szívizomsejteket 10 (erımérések) illetve 30 (biokémiai módszerek) percig inkubáltuk forbol-mirisztil-acetát (PMA, PKC aktivátor; Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA), GF 109207X (LC Laboratories, Woburm, MA, USA) és Gö 6976 (Calbiochem, San Diego, CA, USA; PKC inhibitorok, valamennyit 10 µM koncentrációban) jelenlétében vagy hiányában. A különbözı biokémiai mérések során sejteket 3 alkalommal mostuk 450 µl izoláló oldattal (centrifugálás: 1000 rpm, 2 perc), az inkubáció során alkalmazott kalcium és PMA koncentrációt is figyelembe véve. Ezt követıen a homogenizátumot 5 percig fıztük 60 µl SDS-mintapufferrel (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA), majd 30 µl mintát felhasználva molekulasúly szerint SDS-elektroforézissel szétválasztottuk és Western immunoblottal detektáltuk a fehérjéket. 4.3.2.2. In vitro foszforiláció A humán szívizom homogenizátumokat feleslegben alkalmazott rekombináns PKA, PKCα, γ, δ, ε és η (Biomol, Plymouth Meeting, PA, USA) izoenzimekkel 60 percig 37°C–on inkubáltuk 10 mM magnézium és 100 µM [ γ-32P] ATP (ICN, Costa Mesa, CA, USA) jelenlétében HEPES pufferben. A rekombináns PKC izoenzimek kináz aktivitásának mérésére 1 mg/ml hiszton IIIS (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) szubsztrátot alkalmaztunk. A foszforiláció autoradiográfiával történı kimutatásához a reakciót hideg (jégben hőtött)

26

aceton hozzáadásával állítottuk le. Az elegyet 10 percig jégen tartottuk, majd a kicsapódott fehérjéket centrifugálással választottuk el. A csapadékot 50 µl SDS mintapufferrel (SigmaAldrich Corp., St. Louis, MO, USA) 5 percig forraltuk, majd a fehérjéket SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel elválasztottuk. A géleket ezután Coomassie festékkel festettük. A fehérjékbe épült 32P-t a gélek szárítását követıen autoradiográfiával detektáltuk. Ezzel párhuzamosan 5 µl mintát P81 foszfocellulóz papírra (Whatmann, Fairfield, NJ, USA) cseppentettünk. A szubsztrátfehérjékbe épült

32

P mennyiségét a papírok 0,5% -os

foszforsavas mosása (3x5 perc) és acetonnal történı szárítása után TriCarb (PerkinElmer Life Science Inc., Waltham, MA, USA) szcintillációs számlálóban határoztuk meg.

4.3.3. Western immunoblot A 4.2.2. pontban leírtaknak megfelelıen szívizom homogenizátumot izoláltuk, azzal a különbséggel, hogy izoláló oldat helyett RIPA-puffert használtunk (1% Igepal CA-630, 0,5% Na-deoxikolát, 0,1% Na-dodecilszulfát, 2 v/v% protein inhibítor koktél; pH 7,4). A frakciók fehérjetartalmát BCA assay-vel (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) határoztuk meg, BSA standard alapján, és azt 4 mg/ml-re állítottuk be RIPA hozzáadásával. A homogenizátumot SDS-mintapufferben (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) 10 percig fıztük. Minden mintából 50 µg protein homogenizátumot, illetve kontrollként humán rekombináns PKC izoenzimeket (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) vittünk fel 10%-os gradiens gélre (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). A molekulasúly szerint szétválasztott fehérjéket 1%-os tejporban blokkoltuk 1 óráig, majd az 1%-os tej-PBS-ben hígított elsıdleges PKCα (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA, hígítás 1:5 000) PKCδ és PKCε (mindkettı Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA, hígítás 1:1 000) ) ellenes antitesttel inkubáltuk. A membránokat ezt követın megfelelı másodlagos torma-peroxidázzal kapcsolt antitesttel (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA, hígítás 1:50 000) inkubáltuk. A jeleket felerısített chemiluminescencia (ECL) (PerkinElmer Life Science Inc., Waltham, MA, USA) segítségével autoradiographiás filmen (Primax RTG-B) vizualizáltuk. A kapott jel intenzitása arányos a membránon levı fehérje mennyiségével.

27

4.3.4. PKC izoenzimek transzlokációja A membránrendszerüktıl megfosztott szívizomsejtekhez visszaadtuk a citoszólt (1 mg/ml, 450 µl/csı) és szobahımérsékleten 30 percig inkubáltuk kalcium jelenlétében (5 mM) vagy hiányában, valamint forbol-mirisztát-acetát (PMA, 10 µM; Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) jelenlétében vagy hiányában. A sejteket 3 alkalommal mostuk izoláló oldattal (centrifugálás: 1000 rpm, 2 perc), az inkubáció során alkalmazott kalcium és PMA koncentrációt is figyelembe véve. Ezt követıen a mintákat 5 percig fıztük 60 µl SDSmintapufferrel (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) majd 30 µl mintából a PKCα, β1, δ és ε fehérjék mennyiségét határoztuk meg. A fehérjék kimutatására ebben az esetben is peroxidáz konjugált másodlagos antitesteket és ECL módszert alkalmaztunk. A sávok intenzitását ImageJ software felhasználásával mértük, az értékeket OD-ben határoztuk meg.

4.3.5. Citoszól szabad kalcium koncentrációjának meghatározása A kísérletekben célunk annak meghatározása volt, hogy a mechanikai mérésekben alkalmazott kezelések során a szabad kalcium koncentrációkat hogyan befolyásolja a citoszol szolubilizálása során használt oldat. Ebben az oldatban (relaxáló oldat) ugyanis a citoszolikus fehérjék mellett 2 mM EGTA is volt, ami természetszerőleg módosította a szabad kalcium koncentrációt. A transzlokáció kalcium függése kapcsán ezért erıfeszítéseket tettünk annak érdekében, hogy a transzlokáció során alkalmazott kalcium kezelések során a szabad kalcium koncentrációt meghatározzuk. Ennek érdekében a kezeléseket Flou-3 (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) fluoreszcens kalcium indikátor jelenlétében is elvégeztük és a kapott fluoreszcencia értékeket egy kalibrációs görbe (Fluo-3 fluoreszcencia ismert szabad kalcium tartalmú oldatokban) alapján értékeltük. A fluoreszcencia intenzitásokat fluorescence plate reader (BMG NOVOstar fluorescent plate reader) használatával 10 és 30 perces inkubációs idıvel 520 nm-en detektáltuk. Így kerültek mérés alapján meghatározásra a 19. ábra B panelén látható kalcium-függési ábra X-tengelyének értékei. Az eredmények és a kalibrációs görbe értékelése Microsoft Excel és a Graphpad Prism software segítségével történt.

28

4.3.6. Gel-overlay assay PKCα-kötı fehérjék kimutatására Az izolált, permeabilizált kardiomiocitákat SDS-mintapuferben fıztük, nitrocellulóz membránra cseppentettük. A membránok blokkolását követıen 2 órán át inkubáltuk azokat 1%-os tej-TBS-ben 2µg/ml tisztított, rekombináns PKCα (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) 10 µM forbol-mirisztil-acetát (PMA, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) és 5 mM Ca2+ jelenlétében. A kontroll membránokhoz nem adtunk tisztított, rekombináns PKCα-t. A membránokat 3 alkalommal mostuk 5 mM Ca2+-mal kiegészített TBS-ben, majd PKCα ellenes elsıdleges antitesttel inkubáltuk (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA, hígítás 1:20 000). A rPKCα-kötı fehérjék kimutatására ebben az esetben is peroxidáz konjugált másodlagos antitesteket és ECL módszert alkalmaztunk.

4.3.7.

Rekombináns

humán

PKCα

in

vitro

kötıdésének

vizsgálata

rekombináns kardiális TnI-hez és troponin komplexhez Rekombináns, tisztított PKCα-t (0,1 µg, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) inkubáltunk rekombináns, tisztított TnI (0.1 µg/ml TnI) és rekonstruált troponin komplex (0.3 µg/ml, 1:1:1 sztöchiometriai arányban TnI:TnC:TnT) molekulákkal Ca2+ jelenlétében (5 mM) és hiányban szobahımérsékleten 2 órán át. A TnI és a Tn complex immunprecipitációjához a homogenizátumokat 30 µl protein A sepharose CL-4B gyanta (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) jelenlétében szobahımérsékleten 60 percig 1 µg anti-TnI antitesttel (Research Diagnostics Laboratories Inc., Louisville, TN, USA) vagy kontrollként ugyanilyen mennyiségő egér IgG-vel (Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA, USA) inkubáltuk. A gyantához kötött komplexeket 5 alkalommal mostuk immunprecipitációs pufferrel (centrifugálás: 1800 rpm, 1 perc), az inkubálásnak megfelelı kalcium jelenlétében. Ezt követıen az immunkomplexeket tartalmazó üledékeket 10 percig fıztük SDS-mintapufferrel (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA), majd a minták egyik felébıl a TnI fehérjék mennyiségét határoztuk meg, másik felébıl az immunprecipitáció hatékonyságát ellenıriztük. A fehérjék kimutatására ebben az esetben is peroxidáz konjugált streptavidint és ECL módszert alkalmaztunk.

29

4.3.8. Mechanikai mérések izolált szívizomsejteken Az izolált, permeabilizált kardiomiocitákat szilikon ragasztóval (Dow Corning, Midland, USA) egy érzékeny erımérıhöz (SensoNor, Horten, Norway) és egy piezoelektromos motorhoz (Aurora Scientific Inc., Aurora, Canada) rögzítettük (2., 3. ábra).

2. ábra. Az izolált szívizomsejtek rögzítése az erımérı rendszerhez Az izolált szívizomsejt egyik végét olyan rovartőhöz ragasztottuk, mely egy érzékeny erımérı toldaléka (jobb oldal), másik végét ugyanilyen módszerrel egy piezoelektromos motorhoz (bal oldal) rögzítettük. A tők mozgását elektromotoros mikromanipulátorokkal illetve a motor számítógépes vezérlésével valósítottuk meg. A szívizomsejtet övezı oldatok cseréjét a tárgyasztal oldalirányú mozgatása révén értük el, melynek során a preparátumot az egyik kis volumenő oldatcseppbıl (kb. 55 µl) a másikba vittük át. A mérıkád folyamatos hőtésével biztosítottuk a mérésekhez szükséges hımérsékletet.

30

3. ábra. Izolált és membránrendszereitıl megfosztott szívizomsejt A vizsgálni kívánt izolált kardiomiocitát invertáló mikroszkóp tárgyasztalán szilikon ragasztóval a két vékony rozsdamentes acéltőhöz ragasztottuk. Az átlagos szarkomerhosszt relaxáló oldatban 2,2 µm-re állítottuk. A

szívizomsejtek

a

tritonos

(detergenses)

kezelést

követıen

elvesztik

membránrendszerüket és természetesen fizológiai tulajdonságaik jelentıs részét is. Ennek ellenére ezen preparátumok jól mérhetı kontraktilis tulajdonságokkal rendelkeznek és így a szívizomkontrakció miofibrilláris szintjén jó modellnek tekinthetıek. Hangsúlyozzuk, hogy ebben a tekintetben a membránfosztott jelleg szükséges a kísérletek elvégzéséhez, hiszen a miofibrilláris kalcium-kiváltott kontrakció mérése során a kalcium penetranciáját, a steady state kalcium koncentráció beállását biztosítani kell. Összefoglalva tehát a preparátum a mifibrilláris kontraktilitás mérésére alkalmas, erre elfogadott rendszer, azonban az adatok értékelése során figyelembe kell venni, hogy a fiziológiás kontrakcióban a membránokon keresztüli kalcium áramlás alapvetı. A sejtek membránrendszerének eltávolítását egyébként a kontraktilitás mérés technikája is szükségessé teszi, amennyiben a membránrendszerrel rendelkezı sejtek az erımérı

rendszeren

nem

rögzíthetıek.

A

rögzítés

ugyanis

két

rovartő

között

akváriumragasztóval történik. A ragsztás során pedig a sejtek nemcsak elveszítik membrán integritásukat, hanem rosszul tapadva a rovartőkhöz nagyobb összehúzódások esetén onnan le is válnak. A mérésekhez szükséges relaxáló és aktiváló oldatok összetételét számítógépes program (Fabiato és Fabiato, 1979) szerint határoztuk meg. A kiindulási relaxáló és aktiváló oldatok Ca2+-koncentrációja pCa (Ca2+-koncentráció 10-es alapú negatív logaritmusa) 10 és pCa 4,75 volt. A pCa 4,75 értéknél kisebb Ca2+-koncentrációjú aktiváló oldatokat ezen

31

kiindulási oldatok elegyítésével állítottuk elı. A szívizomsejtek Ca2+-kontraktúráit izometriás körülmények között 15°C-on mértük. A sejtek aktiválása elıtt a sarcomerek átlagos hosszát a mikroszkóphoz kapcsolt számítógépes videojel feldolgozó rendszer segítségével 2,2 µm-re állítottuk be. A mérések során a szívizomsejt relaxáló oldatból aktiváló oldatba történı átvitelét a kontraktilis erı fokozódása követte (4. ábra). A maximális Ca2+ aktivált erı kifejlıdése után egy úgynevezett „release-restretch” manıvert végeztünk, melynek során a sejtet eredeti hosszának 20%-ával megrövidítettük, majd ezt követıen visszaállítottuk a kiindulási hosszat. Ezt a mérırendszer az elızetesen beállított protokoll szerint az elektromágneses motorhoz rögzített rovartő mozgatásával hajtotta végre. Az igen nagysebességő, 20 ms alatt kivitelezett, hossz-változtatás során a kialakult aktin-miozin keresztkötések döntı többsége felszakadt, majd azok újból felépültek. Ezt az eseményt a regisztrátumon a kontraktilis erı megszőnése, majd annak gyors regenerációja kísérte. Az erı regenerációjának üteme elsısorban az aktin-miozin ciklus sebességétıl függött, melyet a ktr paraméterrel jellemeztünk. A ktr paramétert az erı görbék „release-restretch” manıvert követı részének illesztésével lehetett becsülni. Az izometriás csúcserıt, mely az aktív (Fo) és passzív (Fpasszív) komponensek összege, a gyors rövidüléssel párhuzamos hirtelen erıcsökkenésbıl határoztuk meg. Ezt követıen a relaxáló oldatban kivitelezett, lényegesen hosszabb ideig tartó „release-restretch” manıver révén a sejt passzív erıkomponensét mértük (4. ábra).

32

Aktív erı (Fo)

ktr Passzív erı (Fpasszív)

4. ábra. Kontraktilis paraméterek mérése egyetlen szívizomsejten A fenti reprezentatív kísérlet során a Ca2+-kontraktúrákat a szívizomsejt relaxáló oldatból (pCa 10) magas Ca2+-tartalmú aktiváló oldatba (pCa 4,75) történı átvitelével idéztük elı. Az aktiváció alatti gyors hosszváltozást („release-restretch” manıver) a kontraktilis erı megszőnése, majd gyors regenerációja kísérte. A relaxáló oldatban végrehajtott hosszváltoztatás révén a sejt passzív feszítettségét ítéltük meg. Az izometriás erımérés során a kialakult maximális feszülést mind analóg módon, mind digitális jelek formájában egyedi fejlesztéső komputer program segítségével regisztráltuk. Az ASCII formátumú mérési eredményeket egyesével olvastuk be az Origin grafikus program erre a célra definiált adatfeldolgozó rutinjába. A beolvasott adatokat grafikusan megjelenítettük. A kontraktúra amplitudóját különbözı, egyre csökkenı Ca2+koncentrációjú (pCa 4,75 - pCa 7,0) aktiváló oldatokban határoztuk meg. Ezek segítségével szerkesztettük meg a sejtre jellemzı Ca2+-érzékenységi görbét. A félmaximális erıt eredményezı Ca2+-koncentráció, az úgynevezett pCa50 érték, a Ca2+-érzékenységet önmagában jellemzı számadat (5. ábra).

33

Erõ (relatív)

1

pCa50

0 6

5

pCa

5. ábra. Az izometriás erı Ca2+-érzékenységének mérése egyetlen szívizomsejten Az aktivációk során kialakuló aktív erıt a Ca2+-koncentráció (pCa) függvényében ábrázolva minden egyes sejtnek megszerkesztettük a Ca2+-érzékenységi görbéjét. A félmaximális erı létrejöttéhez szükséges Ca2+-koncentráció (pCa50) a sejt Ca2+-érzékenységét közvetlenül jellemzı adat.

4.3.9. PKC aktiváló és gátló ágensek hatásának tanulmányozása mechanikai mérırendszeren A különbözı kontraktilis paramétereket kontroll körülmények között, PKC aktiváló és gátló szerek alkalmazása elıtt, és ezek alkalmazását követıen is meghatároztuk. Kísérleteinkben PKC aktiváló szerként kalciumot, PMA-t (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA), gátlószerként GF 109207X-t (LC Laboratories, Woburn, MA, USA; nem szelektív PKC inhibitor) és Gö 6976-t (Calbiochem, Gibbstown, NJ, USA; szelektív Cadependens PKCα és βI inhibitor) használtunk. Az inkubációs idı 10 perc volt. További kísérleteinkben ezen szerek alkalmazásával tanulmányoztuk a kontraktilis változásokat (Ca2+érzékenység, aktin-miozin ciklus sebessége). Ehhez kontroll körülmények között felvett Ca2+erı összefüggés meghatározását követıen, 10 µM PMA és 10 µM GF 109207X illetve 10 µM Gö 6976 koncentrációk mellett inkubáltuk a preparátumokat. Majd ismételt Ca2+-erı összefüggés felvételét követıen ezek hatását egy második Ca2+-erı összefüggés

34

regisztrálásával vizsgáltuk. Sajnos, ezen anyagokkal (GF 109207X illetve Gö 6976) szívizomsejtek vonatkozásában (különösen membránrendszerüktıl megfosztott sejtek esetében) semmilyen tapasztalat sem áll rendelkezésre. Ennek megefelelıen az alkalmazott dózisok kiválasztásánál célunk az érintett enzimrendszerek nagy valószínőséggel történı gátlása volt. Ilyen körülmények között az alkalmazott PKC gátló kezelések esetében a PKC gátlása valószínőleg teljes volt, azonban további enzimek (pl. miozin könnyőlánc kináz) gátlása sem kizárható. A rendszerbe az endogén PKC molekulákat a felülúszó (citoszól) visszaadásával biztosítottuk.

4.4. Statisztikai módszerek A nyert adatokat Microsoft Excel program segítségével táblázatos formában rendeztük. Az ábrákat és az illesztéseket részben az Origin (MicroCal Software Inc., Piscataway, NJ, USA), részben a Graph Pad program segítségével készítettük el. A disszertációban bemutatott adatokat átlag ± SEM formában tüntettük fel. Az egyes kísérletekhez tartozó elemszámot a megfelelı ábrák alatt tüntettük fel. Az átlagok közötti különbségeket akkor tekintettük szignifikánsnak, ha a Student-féle t-próba (ugyanazon sejten végzett kísérletek esetében páros, egyéb esetekben páratlan próbát használva) eredményeként a kapott p érték kisebb volt 0,05-nél. A Western immunoblot során az egyes minták fehérjemennyiségét -ellenırzésképpen Ponceau-vörös festés után denzitometriás analízissel hasonlítottuk össze. Az eredményeket 410 független kísérlet elvégezése alapján kvantitáltuk. Az értékeket átlag ± S.E.M. formában fejeztük ki. A különbségeket a Student-féle t-próba segítségével P<0,05-es szignifikancia szint mellett tekintettük szignifikánsnak.

35

5. Eredmények 5.1. Oxidatív károsodások kimutatása szívelégtelenségben 5.1.1. Fehérje oxidáció Az in vivo fehérje oxidáció követésére az egyik széles körben alkalmazott, könnyen mérhetı tulajdonság az aminosavak karbonilációjának kimutatása. Az aminosavak közül az arginin, lizin, prolin, aszparagin és glutamin oxidatív módosulása eredményezi a reaktív karbonil származékok kialakulását, amit dihidrofenilhidrazonnal (DNPH) lehet kimutatni. Méréseink alapján a kardiális fehérjék oldalláncainak karboniláltsága szívelégtelenségben 118.3±22.3 OD (n=8), míg a donorokban 38.7±12.1 OD (n=5) volt (6. ábra). Ezen adatok fokozott oxidatív stressz jelenlétére utaltak szívelégtelenségben.

6. ábra karbonilált fehérjék kimutatása Az SDS-poliakrilamid gélen elválasztott jelölt karbonilált fehérjéket immunoblottal mutattuk ki. A bal oldali képen az immunoblot analízist, míg a grafikonon annak értékelését láthatjuk (donor, n = 5; failing, n = 8; P = 0.02). Az értékelés során a csíkok optikai denzitását a háttérre korrigált értékként fejeztük ki.

5.1.2. Fehérje nitrálódás Az oxidatív stressz igen gyakran együtt jelentkezik nitrogén tartalmú szabadgyökök képzıdésével is. Jól ismert, hogy ezen esetekben szuperoxid anionból és nitrogén monoxidból peroxinitrit képzıdik, mely molekula képes a fehérjék (pl. alfa-aktinin) tirozin oldalláncainak nitrálására (Borbely és munkatársai, 2005). Szívelégtelen betegekbıl és a donorokból származó mintáinkban a nitrált fehérjék tekintetében nem találtunk különbséget. Ugyanakkor

36

az in vitro peroxinitrit kezelés hatására számos fehérjében is erıteljes nitrotirozin képzıdést detektáltunk, ami a kísérletes rendszerünk érzékenységét igazolta (7. ábra).

7. ábra Nitrotirozin oldalláncok kimutatása A tirozin oldalláncok nitráltságára érzékeny immunoblot analízis eredményei láthatóak az ábrán. Bal oldalon a kezeletlen, míg jobb oldalon peroxinitrit (5 perc, 500 µM) kezelt minták láthatóak.

5.2. Az oxidatív hatások következményeinek vizsgálata 5.2.1. Poli(ADP-ribóz)-polimeráz aktiváció Az oxidatív stressz következtében kialakuló DNS-lánctörések a legtöbb sejttípusban aktiválják a poli(ADP-ribóz)-polimeráz (PARP) enzimet. Az aktiváció következtében fokozódik az ADP-riboziláció mértéke. Az oxidatív hatásokkal összhangban poli(ADPribozilált) fehérjék mennyiségében mintegy 2,3-szeres növekedés volt megfigyelhetı (8. ábra) a szívelégtelen betegek mintáiban (49,0 ± 16,2, n=8) a donor mintákkal összevetésben (21,4 ± 8,8, n=5, P=0,005). 37

8. ábra Poli(ADP-ribóz)polimeráz aktiváció A poli(ADP-ribozilált) fehérjéket immunoblottal mutattuk ki. A bal oldalon az elıhívott blotok láthatóak, míg a jobb oldali grafikonon az egyedi kísérletek eredményeinek értékelése látható. Az immunfestési mintázat alapján a poli(ADP-ribozilált) fehérjék sejten belüli megoszlása egyértelmően a sejtmagra lokalizálódott a szívelégtelen betegek és a donorok szövetmintáinak metszetein. A PAR-pozitív sejtmagok aránya 20,8% ± 7,1% volt a kontroll csoportban, szemben a szívelégtelen csoportban, ahol ez 64,0% ± 2,2% volt. A növekedés 3,1-szeresnek adódott (9. ábra).

38

9. ábra A poli-ADP-ribozilált fehérjék szubcelluláris lokalizációja A poli-ADP-ribozilált fehérjéket immunhisztokémiával mutattuk ki. Az ábra bal oldalán egy reprezentatív kép (barna színnel láthatóak a pozitív sejtmagok, míg a nem festıdı sejtmagok lilák), a grafikonon az átlagolt értékek láthatóak.

5.2.2. AIF lokalizáció Irodalmi

adatok

alapján

kardiomiocitákban

és

érfali

sejtekben

a

PARP

aktiválódásának egyik következménye az apoptózis-indukáló faktor (AIF) mitokondriumból sejtmagba történı transzlokációja. Kísérleteink szerint azonban AIF kiáramlás a mitokondriumból sem donor, sem szívelégtelen szívizomzatban nem volt megfigyelhetı immunhisztokémiai módszerrel (10. ábra).

39

10. ábra AIF transzlokáció vizsgálata Az AIF-et immunhisztokémiai módszerrel mutattuk ki. A diffúznak tőnı barna festıdés mutatja az AIF lokalizációját a mitokondriumban a lila sejtmagokhoz képest.

5.2.3. PARP expresszió A PARP-1 enzim által katalizált fokozott poli-ADP-riboziláció megvalósulhat az enzim katalitikus aktivitásának sokszorozódása, vagy expressziójának fokozódása révén. A PARP-1 aktivitást a PARP-1 izoenzimet specifikusan felismerı ellenanyaggal, immunoblot kísérletekkel mutattuk ki teljes sejthomogenátumokon. Az immunoblot nem mutatott szignifikáns expressziónövekedést a szívelégtelen betegek mintáiban (11. ábra). Az aktív PARP-1 aránya a donorokban 13,1 ± 6.7 (n=5), míg szívelégtelenségben 19,9 ± 3,1 (n=7) volt, P=0,33. Ezen túlmenıen azonban, az irodalmi adatokkal megegyezıen mi is nagymértékő PARP-1 degradációt detektáltunk mind a donor, mind a szívelégtelen szívekben (11. ábra).

40

11. ábra PARP-1 expresszió A PARP-1-et immunoblot technika segítségével mutattuk ki. Felül egy reprezentatív blot, míg alul az egyedi kísérletekból származó átlagolt értékek láthatóak. Az immunoblot nem mutatott szignifikáns expressziónövekedést a szívelégtelen betegek mintáiban.

5.2.4. Kaszpáz-9 aktiváció Mintáinkban az iniciátor kaszpáz-9 aktivitását vizsgáltuk. Immunoblot jelölést végeztünk egy olyan anti-kaszpáz-9 ellenanyaggal, ami a fehérje proformáját, és a proteolízis során keletkezı aktív kaszpáz-9-t egyaránt felismeri (12. ábra). Az aktív kaszpáz-9 tekintetében nem volt különbség a két csoportban. A kontroll donor mintákhoz képest a szívelégtelen betegekbıl származó mintákban háromszorosára nıtt a proforma mennyisége. Az inaktív, prokaszpáz aránya szívelégtelenségben 12,3 ± 2,2 (n=8), míg a donorokban 3,7 ± 0,6 (n=5) volt.

Elmondhatjuk, hogy az oxidatív stressz az apoptózis kaszpáz függı

mitokondriális útvonalát nem aktiválta.

41

12. ábra Kaszpáz-9 aktiváció A szívmintákban a kaszpáz-9-et immunoblot technikával mutattuk ki. Felül egy reprezentetív blot, alul az átlagolt adatok láthatók. A kontroll donor mintákhoz képest a szívelégtelen betegekbıl származó mintákban háromszorosára nıtt az inaktív proforma mennyisége.

5.3. Protein kináz C szerepe a humán miokardiális kontraktilitásban 5.3.1. Endogén PKC által kifejtett hatás a humán kamrai szívizom sejtek kalcium aktiválta kontraktilis erejére A permealizált humán kamrai szívizomsejteket félmaximális kontrakciót kiváltó Ca2+ koncentráció mellett (pCa 5,8; a kifejlıdı aktív erı a maximum 62±1%-a) inkubáltuk 2 percig. Ez a kezelés a maximális Ca2+ aktivált kontrakciós erı 37±5%-os csökkenését eredményezte (n=6 kísérlet, 13B. és 14. ábrák). Ezzel szemben, a citoszól jelenlétében hasonló módon kezelt sejtek (kontrakciós erı az inkubáció alatt: a maximum 56±8%-a) az erıcsökkenéstıl teljes mértékben védettek voltak (2±3%-os erı növekedés a kezelés végére, n=5, 13C és 14. ábrák). A citoszól jelenlétében a szívizomsejtek rekonstrukciójának 42

paramétereit részletesen nem értékeltük. Kísérleteinkben megelégedtünk azzal, hogy a funkcionális mérések során az általunk alkalmazott rekonstrukciós eljárással a szívizom preparátum mechanikai tulajdonságai a fiziológiás jelleghez váltak hasonlóvá. A továbbiakban csupán

ezen

modellrendszer elemeit tanulmányoztuk,

a

kontraktilis

tulajdonságok megırzésének mechanizmusait vizsgálva. A mechanikai változásokkal párhuzamosan a sejtek szerkezetében (harántcsíkolat) bekövetkezı változásokat is rögzítettük. Mint az a 13. ábra képein látható, a fénymikroszkópos harántcsíkolat mindkét kezelést követıen jelentısen elmosódott. A továbbiakban a citoszolikus fehérjék hozzájárulását vizsgáltuk. Az általános PKC aktiválószer PMA (10 perces kezelés) nem volt hatással sem a kontraktilis erıre, sem a citoszól mediált védelemre (15. ábra). PKC inhibítorok jelenlétében elvégezve a kísérleteket azt tapasztaltuk, hogy a citoszól mediált protekció mintegy harmadával csökkent (16. ábra). Mindemellett a GF 109203X nem mutatott hatást a 10 perces Ca2+ kontraktúra hiányában (a maximális erı 2±3%-os növekedése, n=5, lásd 1. táblázat).

43

13. ábra Citoszól kezelés hatása a kontraktilis erıre A vizsgálni kívánt izolált kardiomiocitát invertáló mikrószkóp tárgyasztalán szilikon ragasztóval a két vékony rozsdamentes acéltőhöz ragasztottuk (A panel). Az átlagos szarkomerhosszt relaxáló oldatban 2,2 µm-re állítottk. A mechanikai tulajdonságokat ugyanazon a sejten Ca2+ kezelés elıtt, közben és után mértük a citoszól frakció hiányában (B panel,) illetve jelenlétében (C panel).

44

14. ábra Citoszól kezelés hatása a kontraktilis erıre: pCa-erı összefüggés Az ábra bal oldalán Ca2+ jelenlétében (n=6), míg a jobb oldalán Ca2+ és citoszól (n=5) jelenlétében mért reltív Ca-erı értékeket tüntettük föl. (*p<0,05 vs. kontroll) A reperfúziót követı kálcium anyagcsere változást permeabilizált humán kamrai szívizomsejteken modellezve-a sejteket 2 percig inkubáltuk félmaximális kontrakciót kiváltó Ca2+ koncentráció mellett-látható a kontrakciós erı közel 40%-os csökkenése. Ezzel szemben, a citoszól jelenlétében hasonló módon kezelt sejtek az erıcsökkenéstıl teljes mértékben védettek voltak.

15. ábra PKC szerepe a kontraktilis erı szabályozásában: aktiváció Az elızı ábránál leírtakhoz hasonló kísérletes körülmények között mért szubmaximális erı értékeket normalizáltuk a maximális erıértékekre. Az ábra bal oldalán a PKC aktivátor PMA hatása látható citoszól jelenlétében és Ca2+ hiányában (n=5, citoszól+PMA), a jobb oldalán pedig (n=10, citoszól+PMA+ Ca 2+) Ca 2+ jelenlétében. (*p<0,05 vs. Kontroll). Az általános PKC aktiválószer PMA sem Ca2+ hiányában, sem jelenlétében (10 perces kezelés) nem volt hatással sem a kontraktilis erıre, sem a citoszól mediált védelemre.

45

16. ábra PKC szerepe a kontraktilis erı szabályozásában: gátlás 14. ábránál leírtakhoz hasonló kísérletes körülmények között mért szubmaximális erı értékeket normalizáltuk a maximális erıértékekre. Az ábra bal oldalán PKC inhibitor Gö6976 (n=8) jobb oldalán a PKC inhibitor GF109203X (n=6) hatása látható (*p<0,05 vs. kontroll), azt tapasztaltuk, hogy a citoszól mediált protekció mintegy harmadával csökkent.

5.3.2. Endogén PKC által kifejtett hatás a humán kamrai szívizom sejtek passzív fesszülésére Az izolált szívizomsejtek kalcium független passzív erejét 2,2 µm szarkomerhosszon vizsgáltuk. Ellentétben a Ca2+ aktiválta maximális aktív erıvel a humán kardiomiocitákban a passzív erı szignifikánsan magasabb értéket vett fel 1 mM Ca-ot tartalmazó oldattal végzett inkubáció hatására (F

passzív:

302±46%, p<0,05, n=6, 6.és 10. ábrák). A citoszól hozzáadása

szignifikáns mértékben antagonizálta ezt a hatást (F

passzív:

146±9 %, p<0,05, n=5, 13. és 17.

ábrák). Ugyanakkor kísérleteinket PKC aktivátor PMA és nem szelektív PKC inhibítor GF 109203, valamint Gö 6976 hozzáadásával megismételve sem Ca2+ jelenlétében, sem hiányában nem tapasztaltunk további változást a passzív erıben (17. ábra).

46

17. ábra. PKC szerepe a kontraktilis erı szabályozásában: statisztika A maximális kontraktilis erı változása: az aktív feszülés a bal oldali, a passzív feszülés a jobb oldali oszlopdiagrammon van feltüntetve. (*p<0,05 vs. kontroll), (# p<0,05 vs. kalciumkezelés). Bal oldali oszlopdiagrammon látható, hogy a citoszól mediálta védelem körülbelül 40 %-os, ennek egy része, kb 1/3-a köthetı a PKC enzimekhez.

5.3.3. Endogén PKC által kifejtett hatás a humán kamrai szívizom sejtek kalcium érzékenységére A kontraktilis rendszer kalcium érzékenysége (pCa50) és a Ca2+-erı összefüggés meredekségére jellemzı paraméter (nHill) nem változott szignifikánsan sem a PKC aktivációt (PMA) sem az inaktivációt (GF 109203 és Gö 6976) kiváltó kezeléseket követıen (2. táblázat).

47

2. táblázat. A kontraktilis paraméterek értékei A kísérletek során meghatározott kontraktilitás értékek láthatók a táblázatban. Az aktív erı a Ca2+ hozzáadását követı kontraktilis erı fokozódást, a passzív erı a preparátum feszülését, a pCa50 a félmaximális kontraktilis erı növekedéshez szükséges Ca2+ koncentrációt, míg a Hill érték az adatok illesztése során kapott szigmoidális görbe meredekségét (a Ca2+ kötıhelyek közötti kooperativitást) jellemzi. Némely esetben az abszolút egység változását (a kezelés elıtti érték százalékában) tüntettük fel. Az értékeket átlag±SEM értékben fejeztük ki.

5.4. PKC izoenzimek expressziója humán szívizomsejtekben Három PKC izoforma expressziós szintjét (α, δ és ε) vizsgáltuk humán szívizomhomogenizátumokban immunoblot módszerrel, specifikus antitesteket alkalmazva. Az elvégzett kísérletek igazolták, hogy a humán szívizomban legnagyobb mennyiségben elıforduló izoforma, a PKC α expressziós szintje közel húszszor nagyobb, mint a vizsgált másik két izoformáé, a PKC deltáé és epsziloné (189 ±31, 7±3, 7±2 ng/mg, az említés sorrendjében).

5.5. Humán miokardiális fehérjék in vitro foszforilációja PKC-vel Következı lépésben meghatároztuk rekombináns PKC felhasználásával a humán szívizom kontraktilis fehérjéinek foszforilálhatóságát és autoradiográfiával azonosítottuk a szubsztrátok molekulaméreteit. A kísérlet során feleslegben adtuk a preparátumokhoz az exogén rekombináns PKC izoenzimeket, így az endogén PKC-k aktivitása elhanyagolható volt. Erre bizonyíték az is, hogy az exogén PKC hozzáadása nélkül a foszforilációs

48

reakcióban ugyanilyen körülmények között nem tudtunk foszfát beépülést detektálni. Az izoenzimek közötti különbségek nemcsak az aktiváló kofaktorok iránti igényben, szöveti expresszióban, lokalizációban mutatkoznak meg, hanem az eltérı szubsztrátokban is. A Ca2+dependens PKCα és γ közel azonos aktivitást (4,3 ± 0,9 és 4,4 ± 2,1 pmol/min) és szubsztrát specificitást mutatott, míg a Ca-független izoformák meglehetısen egyedi mintázattal bírtak. A PKCδ izoenzimnek volt a legnagyobb kináz aktivitása (6,6 ± 3,3 pmol/min), és szelektíven foszforilált egy 26 kDa molekulatömegő fehérjét. Míg a PKCε aktivitása adódott a legalacsonyabbnak (1,6 ± 0,3 pmol/min), és ez a kináz egy 60 kDa molekulatömegő fehérjét foszforilált specifikusan. A PKCη által foszforilált két fehérje molekulamérete is eltérı, >200 kDa és 48 kDa volt (18. ábra).

18. ábra Miokardiális fehérjék in vitro foszforilációja különbözı PKC izoformákkal és PKA-val Az oszlopdiagrammon a foszfát beépülés (aktivitás), míg az autoradiogrammon az SDS gélelektroforézissel elválasztott foszforilált fehérjék (fekete csíkok) láthatóak.

5.6. PKCα intracellularis target fehérjéinek kimutatása Kísérleteinket endogén PKCα, βI, δ és ε izoformák citoszólból a kontraktilis fehérjékhez történı transzlokációjának vizsgálatával folytattuk. Kontroll körülmények között, Ca2+ hiányában az izoenzimeket túlnyomórészt a citoszólban lehetett kimutatni, csak csekély mértékő asszociáció volt megfigyelhetı a PKC izoenzimek és a kontraktilis fehérje rendszer között (19A ábra). Ca2+ jelenlétében a PKCα kötıdése a kontraktilis rendszerhez szelektíven nıtt (19A ábra). A széles körben használt diacil glicerol analóg PMA-nak egymagában nem

49

volt megfigyelhetı szignifikáns hatása a PKC izoenzimek és a kontraktilis apparátus közti interakcióra. Ca2+ és PMA együttes jelenlétében PKCα és ε szignifikáns transzlokációja volt megfigyelhetı. Eredményeink egyértelmően azt sugallják, hogy döntıen a Ca2+-nak van szerepe a PKCα transzlokációjának szabályozásában. A PKCα transzlokáció Ca-függésének vizsgálatakor a félmaximális aktivációhoz szükséges Ca2+ koncentráció (EC50) EC50=645 nMnak adódott (19B ábra).

19. ábra PKC izoenzimek Ca2+ függı transzlokációja humán szívizomsejtek citoszóljából a kontraktilis rendszerhez Az A panelen látható sávok alapján a membránrendszerüktıl megfosztott miociták kontraktilis rendszeréhez kötıdı PKC izoenzimek mennyisége ítélhetı meg. A Ca2+-mentes közegben inkubált kontroll minta esetén halvány jelölıdést látunk. Ca2+ hozzáadására a PKC α-nak megfelelı sáv intenzivitásának mértéke fokozódik. A B panel felsı részén látható, hogy a PKCα kontraktilis rendszerhez való asszociációjának jelentıs Ca2+-függése van. A 80 kDa molekulatömegő fehérjének megfelelı sáv intenzitása fokozódik a Ca2+ koncentráció növelésével.

50

5.7. Ca2+-függı cTnI és PKCα kölcsönhatás (kötıdés) PKCα

és

lehetséges

horgonyzó

fehérjéit

overlay

assay-vel

vizsgáltuk

membránrendszerüktöl megfosztott humán szívizomsejteken. A miofibrilláris rendszer öt fehérjéjét azonosítottuk lehetséges PKCα kötı fehérjének. Ezek közül az egyik motilitása a ~ 27 kDa tömegő TnI motilitásával egyezett meg (20A ábra). In vitro fehérjekötéses analízissel megállapítottuk, hogy a tisztított, rekombináns TnI és PKCα molekulák között Ca-dependens kölcsönhatás van (20B és 20C ábra). Ugyanakkor ezt a hatást nem befolyásolta az a tény, ha a TnI molekula Tn-komplexben (TnI:TnT:TnC aránya 1:1:1) szerepelt (20B ábra).

20. ábra Humán kardiális Tn I, mint PKCα kötı protein A PKCα és potenciális horgonyzó fehérjéit overlay assay-vel vizsgáltuk membránrendszerüktöl megfosztott humán szívizomsejteken. A miofibrilláris rendszer egyik PKCα kötı fehérjéje a ~ 27 kDa tömegő TnI-vel mozgott együtt (A panel). Immunprecipitációval kimutattuk, hogy a tisztított, rekombináns TnI és PKCα molekulák között Ca-függı kölcsönhatás van (B és C panel). Ugyanakkor ezt a hatást nem befolyásolta az a tény, ha a TnI molekula Tn-komplexben (TnI:TnT:TnC aránya 1:1:1) szerepelt (B panel).

51

5.8. PKCα és cTnI együttes elıfordulásának (kolokalizáció) kimutatása humán kamrai izomzatban Habár a PKCα többsége a citoszólban expreszálódik, ami megegyezik az alacsony kalcium

koncentrációjú,

nyugvó

állapotú

sejtekben

megfigyelttel,

a

biokémiai

eredményeinkkel összhangban az immunfluoreszcens felvételeken megfigyelhetı PKCα és cTnI kolkalizáció is humán kamrai szövet mintákban (21. ábra).

21. ábra PKC alfa és cTnI együttes elıfordulásának (kolokalizáció) kimutatása humán kamrai izomzatban A TnI vörös, a PKCα zöld fluoreszcencens festékkel jelölt antitesttel került kimutatásra, míg az átlapolt kép esetében, a közös elıfordulás helyén sárga színt kaptunk.

52

6. Megbeszélés Egyre növekszik azoknak az experimentális és klinikai bizonyítékoknak a száma, melyek szerint az oxidatív stressz szerepet játszik a szívmőködés rendellenességei és a szívelégtelenség kialakulásában. A fokozott lipidperoxidációt jelzı plazma malondialdehid (MDA) emelkedés kifejezett iszkémiás és nem-iszkémiás dilatatív cardiomyopathiaban, koncentrációja korrelál a tünetek súlyosságával, fordított arányban áll az ejekciós frakcióval és a terhelhetıséggel (Rochette és munkatársai, 2008). Állatkísérletben a kontraktilitás csökkenésével egyidejőleg megnövekedett malon-dialdehid szintet mértek, ami reaktív oxigéngyökök jelenlétére, lipid peroxidációra utal (Nakamura és munkatársai, 2002). Napjaink megfigyelése, hogy az oxidatív stressz markerének tartott F2-izoprosztán (8-epiPGF2) szintjének emelkedése a perikardiális folyadékban arányos a szívelégtelenség súlyosságával, direkt kapcsolat áll fenn koncentrációjának nagysága és a bal kamra végdiasztolés és végszisztolés átmérıi között (Mallat és munkatársai, 1998). Számos kísérletben bizonyították a szívizomsejteket érı oxidatív stressz kontraktilis funkcióra kifejtett káros hatását, és vizsgálták ennek szerteágazó molekuláris hátterét (Ide és munkatársai, 2000). A miokardiális oxigéngyökök legfontosabb forrásai az ismétlıdı iszkémia/reperfúziós periódusok, gyulladásos citokinek, katekolamin auto-oxidáció, prosztaglandinok (Sorescu és Griendling, 2002). A szervezet elégtelen antioxidáns enzimrendszerei (szuperoxid dizmutáz, kataláz és glutation peroxidáz) valamint a védelmi rendszer mőködéséhez szükséges vitaminok és ásványi anyagok hiánya (E vitamin, C-vitamin, cisztein) következtében felszabadulnak

a

reaktív

szabadgyökök

a

szívizomsejtekben

(Giordano,

2005).

Szívelégtelenségben szenvedı betegekben összefüggést találtak a szívelégtelenség klinikai stádiumai, az antioxidánsok és oxidánsok szintje között: A NYHA III stádiumban lévı betegekben szignifikánsan alacsonyabb A vitamin, E vitamin és lutein szinteket, míg magasabb malondialdehid értékeket mértek, mint a NYHA II állapotban levı betegekben (Polidori és munkatársai, 2002). Szívelégtelenségben ROS forrás lehet a sejtben számos speciális enzim: a nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NAD(P)H) oxidáz, a xantinoxidáz, a cyclooxgenázok, a nitrogén-monoxid szintáz; a mitokondriális elektrontranszport lánc; gyulladásos környezetben aktivált neutrofil granulociták (Berry és Hare, 2004; Ferrari és munkatársai, 2004; Giordano, 2005; Li és Feldman, 2001; Sorescu és Griendling, 2002; Szabo és munkatársai, 2004a; Tyagi és Hayden, 2003). Méréseink alpján humán szívelégtelen mintákban szignifikáns oxidatív károsodás mutatható ki, szemben a kontroll humán donor

53

mintákkal. Ez igazolja azt, hogy a mintavétel, a tárolás és a feldolgozás folyamata nem járt jelentıs oxidatív stresszel. A szívizomsejtek, az endokardium, a koronáriák endothelje, a szív idegei mind kalciumfüggı nitrogén-monoxid-szintázt tartalmaznak. A nitrogén-monoxid kulcsszerepet játszik a keringési rendszer élettani szabályozásában, mint például a vazodilatáció, a trombocita- és fehérvérsejt-aktiváció gátlása, a szívizom kontraktilis funkciójának szabályozása, az oxigénfogyasztás csökkentése, de antiapoptotikus és gyulladásgátló hatásai is ismertek (Massion és munkatársai, 2003). A nitrogén-monoxid kulcsfontosságú a különféle szív-, illetve keringési betegség káros következményei elleni védelemben is. Mindaddig pozitív, védı, szabályozó hatású mediátorként viselkedik, amíg a peroxinitrit-képzıdés fokozódása következtében nem ez utóbbi hatása kerül elıtérbe (Pacher és munkatársai, 2005; Szabo, 2003). Korábbi vizsgálatok eredményei szerint kis emlısökben a szívelégtelenség kialakulásában szerepet játszik a nitrogén-monoxidból és szuperoxid anionból fiziológiás körülmények között is képzıdı reaktív nitrogén gyök, a peroxinitrit megnövekedett termelıdése. Szívelégtelenségben a fokozott NO képzıdés hátterében az indukálható nitrogénmonoxid szintetáz (iNOS) enzim expressziós szintjének és aktivitásának növekedése áll (Fukuchi és munkatársai, 1998). Állatkísérletes modellekben iNOS overexpresszió és a peroxinitrit megnövekedett termelıdése valamint dilatatív kardiomiopátia, vezetési zavarok, hírtelen szívhalál és nem utolsó sorban a szívelégtelenség között szoros összefüggést mutattak ki (Mungrue és munkatársai, 2002). Patkányokon végzett kísérletek is megerısítették, hogy a miokardiális iNOS aktivitás fokozódás hatására romlik a szív pumpafunkciója és károsodik a β-adrenerg válaszkészség (Gealekman és munkatársai, 2002). Humán szívelégtelenségben kimutatták a neuronalis (nNOS vagy NOS1) nitrogén-monoxid-szintáz fokozott aktivitását is (Damy és munkatársai, 2004). Annak ellenére, hogy a peroxinitrit indukált nitrotirozin oldallánc képzıdést állatokból származó (Ferdinandy és munkatársai, 2000; Pacher és munkatársai, 2003; Szabo és munkatársai, 2002a) és humán (Frustaci és munkatársai, 2000; Hunt és munkatársai,

2002)

szívizompreparátumokban

is

kimutatták,

eredményeink

szerint

szívelégtelen betegekbıl és a donorokból származó mintáinkban a nitrált fehérjék tekintetében nincs különbség. A szívelégtelenség kialakulásában nagy jelentıséggel bír a PARP-1 aktivációja. Reaktív nitrogén intermedierek és oxigén származékok, illtve ezek hatására aktiválódó matrix metalloprotinázok, valamint kaszpázok és az oxidatív károsodások okozta DNS lánc törések legfontosabb hatása a poli(ADP-ribóz) polimeráz enzimek aktiválása (Virag és Szabo, 2002).

54

Korábbi vizsgálatok eredményei szerint (Pacher és munkatársai, 2002a; Pacher és munkatársai, 2002b; Pillai és munkatársai, 2005; Szabo és munkatársai, 2004a; Xiao és munkatársai, 2005) kis emlısökben a PARP enzim túlaktivációja megfigyelhetı többek között iszkémia-reperfúzió, diabetes és kardiotoxikus szerek indukálta szívelégtelenségben. Széles körben vizsgált a kaszpázok szerepe, krónikus szívelégtelenség és az apoptózis vonatkozásában a megfigyelések azonban ellentmondásosak (Di Napoli és munkatársai, 2003; Hughes, 2003; Kumar és Jugdutt, 2003). A mátrix metalloproteinázok aktivációja is imert krónikus szívelégtelenségben (Ducharme és munkatársai, 2000; Kwan és munkatársai, 2004). Mind a kaszpázok, mind az MMP-k képesek PARP-1 enzim hasítása révén annak inaktiválására szívelégtelenségben (Di Napoli és munkatársai, 2003; Ducharme és munkatársai, 2000; Hughes, 2003; Kumar és Jugdutt, 2003; Kwan és munkatársai, 2004). Eredményeink szerint megfigyelhetı a PARP-1 aktiváció szívelégtelen betegek szívizom mintáiban, ami további példával bıvíti azon humán betegségek sorát, melyekben PARP aktiváció kialakul. Megfigyeléseink megegyeznek Pillai, DiNapoli és munkatársai erdményével, mely szerint humán szívelégtelenségben fokozott a poli(ADP-ribozil)áció (Di Napoli és munkatársai, 2003; Pillai és munkatársai, 2005). Ugyanakkor mi nem tudtuk kimutatni szignifikáns PARP-1 expressziónövekedést a szívelégtelen betegek mintáiban, ami felveti, hogy a mintáinkban megfigyelt fokozott poliADP-riboziláció hátterében a PARP-1 katalítikus alegység aktivitásának fokozódása áll. A PARP-1 szabályozása elsısorban a DNS-törések vagy intracellularis kalcium koncentráció növekedés szintjén történik (Jagtap és Szabo, 2005; Virag és Szabo, 2002). Az apoptózis jelátviteli, majd végrehajtó szakaszában fontos szerepet játszanak a kaszpázok. Degradatív enzimsajátságaik miatt a kaszpázok prokaszpázok formájában találhatók – elsısorban – a sejtek citoplazmájában (Hengartner, 2000). Az „érett” kaszpázok heterotetramer szerkezetőek. A kaszpáz-8 és -9 a leggyakoribb úgynevezett iniciátor kaszpáz, amely a jelátviteli úton elindítja a kaszkádot, míg a legfontosabb végrehajtó kaszpáz a kaszpáz-3. A kaszpázok igen sok szubsztráttal rendelkeznek, ezek részben struktúrfehérjék, részben olyan enzimek, amelyek aktiválásuk után részt vesznek a sejt lebontásában (Hengartner, 2000). A PARP az apoptózis kialakulása során általában a kaszpáz-9 általi hasítás áldozatává válik (Soldani és Scovassi, 2002). Eredményeink azt mutatták, hogy a kaszpáz-9 overexpresszálódott (prokaszpáz mennyisége nıtt) humán szívizom sejtekben. A kapcsolat a PARP-1 aktiváció és hasítás, a sejthalál apoptotikus vagy nekrotikus formája között bonyolult, de valószínüsíthetı, hogy a PARP-1 túlzott aktivációja a sejtek NAD+ és ATP raktárainak kiürítése révén nekrózist eredményez. Míg a PARP-1 hasítása, ami az enzim 55

inaktiválódásához vezet, protektív mechanizmusként utat enged az apoptózisnak, mivel megırzi a sejtek NAD+ és energia készletét az energiaigényes további apoptotikus folyamatok számára (Virag és Szabo, 2002). Mindezek mellett figyelembe kell venni, hogy a vizsgált humán szívizom mintáink különbözı eredetőek voltak. Befolyásolhatja az apoptózis és a PARP-1 aktiváció kapcsolatát a betegek NYHA stádiuma, gyógyszeres kezelése, a mintavétel helye (endo-, epikardium) (Bartunek és munkatársai, 2002; Koda és munkatársai, 2003; Okada és munkatársai, 2005; Zorc és munkatársai, 2001; Zorc és munkatársai, 2003). A szívelégtelenség etiológiájának sokszínősége

hozzájárulhatott

az

eltérı

megfigyelésekhez

(az

iszkémiás

eredető

szívelégtelenségben az oxidatív stresszmarkerek által mediált diszfunkció figyelhetı meg, míg dilatatív kardiomiopátiát okozhatja alkohol, vagy vírusfertızés). Megfigyeléseink szerint humán szívelégtelenségben a PARP-1 aktiváció nem eredményez apoptózist, az AIF transzlokáció hiányának megfelelıen. Az azonban lehetséges, hogy enyhe DNS károsodás esetén a PARP-1 aktiválódik és szerepet játszik a DNShibajavításban, a genomikus stabilitás megırzésében. Spekuláció szintjén az is felvethetı, hogy mintáink végstádiumú szívelégtelenségben szenvedı betegekbıl származtak, akik talán sikeresen alkalmazkodtak a magasabb reaktív gyök szinthez és a kövekezményes PARP-1 aktivációhoz. Ezen megfigyeléseink ellenére nem vitatott, hogy állatkísérletekben a reaktív oxigén szabadgyökök által kiváltott DNS károsodások, melyek végsı soron apoptózishoz vezetnek, fontos szerepet játszanak betegségek kialakulásában (pl. szívelégtelenség). Állatkísérletekben a PARP-1 enzim specifikus gátlószereivel és antioxidánsokkal csökkenteni lehet az infarktus során elhalt terület nagyságát, a szöveti károsodásokat, a miokardium diszfunkciót (Jagtap és Szabo, 2005). Az a tény, hogy a PARP-1 inhibitorok csökkentik a citoplazmatikus NAD+ katabolizmust, és feltehetıleg mérséklik a szabadgyökök indukálta mitokondriális NAD+ vesztést, feltételez egy kapcsolatot az oxidatív mitokondriális károsodás és a PARP-1 aktiválódás között. Az oxidatív stressz vizsgálata humán kórképekben és experimentális modellekben közelebb vihet a szabadgyökök okozta kórfolyamatok megértéséhez, a kardiovaszkuláris betegségek megelızéséhez és kezeléséhez. További kísérleteinkben a protein kináz C funkcionális jelentıségét mutattuk ki a humán szívizomzat kontraktilis erejének fenntartásában, elnyújtott intracelluláris szabad Ca2+ koncentráció jelenlétében, mely az iszkémia/reperfuzió egyik jellegzetes eseménye (Karmazyn és Moffat, 1993).

56

Ismert, hogy a PKC izoenzimek részt vesznek a humán szívizomsejtek erıgenerálásának szabályozásában (Noguchi és munkatársai, 2004). In vitro kísérletekben bebizonyosodott, hogy troponin I (TnI), troponinT (TnT), miozin könnyőlánc 2 (MLC-2), kardiális miozin kötı C fehérje (cMyBP-C) és dezmin (Damron és munkatársai, 1995; Huang és munkatársai, 2002; Noland és munkatársai, 1989; Noland és Kuo, 1992) szubsztrátjai a PKC-nek. A molekulák PKC-mediált foszforilációja csökkenti a miozin ATPáz aktivitását (Jideama és munkatársai, 1996; Noland és munkatársai, 1995) és a maximális erıt, meghosszabbítja az izovolumetriás relaxáció idejét, növeli az utóterhelést (Bilchick és munkatársai, 2006), csökkenti a keresztkötések kialakulásának a sebességét (Burkart és munkatársai, 2003) és a kontraktilis erıt (Belin és munkatársai, 2007; Burkart és munkatársai, 2003; Montgomery és munkatársai, 2002; Pyle és munkatársai, 2002; Roman és munkatársai, 2004; Sakthivel és munkatársai, 2005; Scruggs és munkatársai, 2006; Takeishi és munkatársai, 1998). Patkány szívelégtelen modellen Belin és munkatársai megfigyelték, hogy a szívelégtelenség kísérı jelensége a fokozott PKC függı miofibrilláris fehérje foszforiláció és a csökkent kontraktilitás (Belin és munkatársai, 2007). Sıt valószínősítették, hogy a fentebb leírt eltérést a troponin fehérjék PKC mediálta foszforilációja okozza (Belin és munkatársai, 2006). Saját és irodalmi adatok közötti ellentmondás (növekvı versus csökkenı kontraktilitás) egyrészt adódhat a különbözı fajok szívizom sejtjeiben kifejezıdı izoformák eltérı jellegébıl, másrészt a PKC hatásait vizsgáló eltérı kísérletes modellekbıl. A PKC szerepével foglalkozó korábbi beszámolókban a PKC aktivitás jobbára jelentısen magasabb volt, mint az egészséges állapotban fiziológiás körülmények közötti érték. Így például szívelégtelenségben vagy transzgénikus állatmodellekben (Belin és munkatársai, 2006; Goldspink és munkatársai, 2004; Gu és Bishop, 1994; Takeishi és munkatársai, 1998) a magasabb PKC expresszió vezethet a PKC egészségesekben betöltött szerepének elfedéséhez. In vitro kináz kezelések hatására a miofibrilláris fehérjék foszforilációja jelentısen meghaladhatja a fiziológiás szintet (Belin és munkatársai, 2007; Burkart és munkatársai, 2003; van der Velden és munkatársai, 2006). Végül a szubsztrátok hely-specifikus mutagenezise is afiziológiás hatásokhoz vezethet (Burkart és munkatársai, 2003; Montgomery és munkatársai, 2002; Pyle és munkatársai, 2002; Roman és munkatársai, 2004; Sakthivel és munkatársai, 2005; Scruggs és munkatársai, 2006). Esetünkben a kardiomiociták „rekonstruálása” során a PKC izoenzimek egymáshoz viszonyított aránya fiziológiáshoz közeli helyzetet tükrözött, a kísérletekben fiziológiáshoz közeli módon foszforilált endogén miofibrilláris fehérjéket (közöttük PKC célfehérjéket) alkalmaztunk humán szívizomzaton 57

végzett kísérleteinkben. Ennek megfelelıen eredményeink is eltérnek a korábban találtaktól a PKC kontraktilitásban betöltött szerepére vonatkozóan. Adataink arra utalnak, hogy szívelégtelenségben, melynek kialakulását a PKC útvonal diszregulációjával jellemzünk, nem csak a fiziológiás szubsztrátok fokozott foszforilációját, hanem egyéb, fiziológiás körülmények között nem foszforilálódó fehérje foszforilációját is megfigyelhetjük, ami mintegy elrejtheti a fiziológiás hatásokat (22. ábra). Az eltérı kísérletes körülményeken túl szembetőnı különbségeket találtak rágcsálók valamint humán szívizom mintákban expresszálódó PKC izoformákban. Míg például kis állatokban (patkány, egér) a PKCε a túlsúlyban lévı izoforma (Bowling és munkatársai, 1999; Braun és munkatársai, 2003; Braz és munkatársai, 2004; Disatnik és munkatársai, 1994; Goldberg és Steinberg, 1996; Gu és Bishop, 1994; Murthy és munkatársai, 2004; Rybin és Steinberg, 1994), addig humán mintákban a PKCα (Hambleton és munkatársai, 2006). A saját elvégzett kísérleteink igazolták, hogy a humán szívizomban legnagyobb mennyiségben elıforduló izoforma, a PKCα expressziós szintje közel húszszor nagyobb, mint a vizsgált másik két izoformáé, a PKC deltáé és epsziloné. A fajok közötti közös vonás azonban, hogy magasabb PKC expresszió figyelhetı meg szívelégtelenségben, végstádiumú dilatatív kardiomiopátiában és súlyos aorta sztenózisban (Simonis és munkatársai, 2007). A PKC izoenzimek aktivitása három úton szabályozható, (i) szelektív expresszióval, (ii) különbözı szubsztrát specificitással (iii) vagy eltérı célra irányítással (targeting). Kísérleteinkben mindezen lehetıségeket vizsgáltuk humán szívizom mintákban. Saját kísérleteinkben a PKC izoenzimek szubsztrát specificitást in vitro foszforilációs assay-vel vizsgáltuk humán kamrai szívizomban. A kináz aktivitás mérésekor két szubsztrátot alkalmaztunk. Egyrészt a kináz aktivitásokat egy kontroll szubsztráton (hiszton IIIS) mértük és arra törekedtünk az adott reakcióelegyben az alkalmazott körülmények mellett hasonló aktivitása legyen valamennyi izoenzimnek. Ezt követıen a beállított körülményeknek megfelelıen humán szívizom homogenizátumot használtunk szubsztrátként és mértük a radioaktív foszfát beépülését (miokardiális fehérjékbe, szcintillációs számlálóval), valamint a foszforilálódó fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelektroforézist követıen autoradiogramon is láthatóvá tettük (azonosítás, gélkép). Eredményink szerint habár a különbözı izoenzimek esetében jelentıs különbségek voltak felismerhetıek, a jól ismert, funkcionálisan karakterizált fehérjéket (troponinok, miozin könnyő lánc) (Jideama és munkatársai, 1996; Mochly-Rosen és Gordon, 1998) valamennyi izoforma képes volt foszforilálni. Mindezek arra utalhatnak, hogy az in vivo specificitásban a különféle izoformák szubcelluláris lokalizációja, targetingje kulcsfontosságú. Végül, hangsúlyoznunk kell, hogy az in vitro foszforilációs kísérletekben 58

valamennyi esetben exogén rekombináns enzimmel végeztük a foszforilációt. Ennek megfelelıen a kapott eredmények pusztán arra utalnak, hogy hasonló mértékő hiszton IIIS foszforilációs

aktivitás

mellett

a

mifibrilláris

fehérjék

irányában

mért

aktivitás

izoenzimenként eltérı. Hangsúlyozni kell ugyanakkor, hogy az alkalmazott rekombináns PKC izoenzimek mennyisége és aktivitása ezen kísérletben nem mutat összefüggést az endogén kinázok mennyiségével/aktivitásával. A felhasznált izoenzimek egy része (pl. PKCγ) feltehetıleg nem expresszálódik a humán szívben, de a kísérlet célja annak bizonyítása volt, hogy a PKC mediált foszforilációban a katalitikus domén mellett központi szerepet játszanak egyéb tényezık (pl. célra irányítás, targeting) is. Kísérleteink java részében ezért a PKCα intracelluláris targetingjét vizsgáltuk részletesen. Korábbi kísérletekben bebizonyosodott, hogy a Ca2+-koncentráció emelése szelektíven a PKCα transzlokációját indukálta patkány szívekben (Rybin és Steinberg, 1994). Ez felveti a PKCα kiemelkedı szerepét a kalcium-függı miofibrilláris-kontraktilitás szabályozásában. Egyes adatok szerint a PKC aktiváció csökkenti a miofibrilláris rendszer kontraktilitását (Belin és munkatársai, 2006; Belin és munkatársai, 2007), míg saját eredményeink szerint a PKCα a kontraktilitás fenntartásához járul hozzá. Mindenesetre a PKCα ígéretes terápiás célpontnak tőnik a szívizom kontraktilitásának javítására (Belin és munkatársai, 2007; Braz és munkatársai, 2004; Hambleton és munkatársai, 2006). Ezt a potenciált azonban feltehetıen sejten belüli kötıhelyeinek (targeting) pontosabb feltárását követıen tudjuk kihasználni. Következı lépésben PKCα horganyzó fehérjéket vizsgáltuk. Kimutattuk a PKCα Ca2+ függı transzlokációját a miokardiális troponin I-hez, mely független a troponin komplex alkotóinak jelenlététıl. A biokémiai eredményeinkkel összhangban az immunfluoreszcens felvételeken PKCα és cTnI kolkalizációt figyelhettünk meg humán kamrai szövetmintákban. Fontos megemlíteni, hogy a PKC gátlása ex vivo körülmények között gyakran hatásos a különbözı szívbetegségek (pl. szívinfarktus során megjelenı iszkémiás/reperfúziós károsodás,

illetve

a

szívelégtelenség)

során

bekövetkezı

kontraktilitás

csökkenés

megelızésében. A PKC a szervezet minden sejttípusában expresszálódik és változatos funkciókat lát el. Ennek megfelelıen a PKC minden sejtre kiterjedı gátlása nem alkalmazható, és a PKC aktivitás modulálásán alapuló terápiás eljárások a megfelelı specifitás eléréséig váratnak magukra. Kísérleteink ezen a téren jelentıs elırelépéssel szolgáltak, amennyiben kimutattuk, hogy a PKCα miofibrilláris hatásainak közvetítésében részt vesz a troponin I általi célra irányítása (targeting). Így felmerül annak a lehetısége, hogy

59

a PKCα troponin I asszociációjának gátlása/segítése révén a PKCα miofibrilláris rendszerre gyakorolt hatása szelektíven modulálható. A jelátviteli folyamatok térbeli szabályozása horganyzó fehérjék segítségével az intracelluláris tér egy adott kompartmentére korlátozza a jelátviteli folyamatot, egyúttal több jelátviteli láncban szereplı molekulát is helyhez köthet, ami lehetıvé teszi a jelátviteli útvonalak konvergálását. A PKC-hez kötıdı fehérjék három nagy csoportba sorolhatóak. Egyik fontos csoportját a STICK (Substrates That Interact with C-Kinase) fehérjék alkotják, a második csoportba a RACK (Receptors for Activated C-Kinase) fehérjék tartoznak, melyek az enzim aktív konformációját stabilizálják, valamint az ellentétes hatású RICK (Receptors for Inactivated C-Kinase) fehérjék (Mochly-Rosen és Gordon, 1998). Miután a különbözı kötı szekvenciák az izoenzimekre specifikusak, izgalmas lehetıségeket rejt magában a PKC izoenzimek szelektív aktiválására vagy gátlására. Általában, a PKC aktiválás magába foglalja a DAG kötıdését (vagy exogén megfelelıjének, a PMA-nak) a citoszkeletonban található szolubilis enzimhez, amely rögzíti azt a membránstruktúrához. Amíg a TnI kétségtelenül a STICK-ek egyike az emberi szívben, addig, úgy tőnik, hogy az interakciót a TnI és a PKCα között egyedül a Ca2+ szabályozza, függetlenül a lipidektıl. Az sdr fehérje, mely a caveolinokhoz kötıdik, hasonló tulajdonsággal rendelkezik, mint a TnI, ugyanis DAG vagy annak analógjának hiányában, Ca2+-dependes módon kötódik a PKCα-hoz (Mineo és munkatársai, 1998). Ez a felfedezés is azt mutatja, hogy a Ca2+ olyan szerkezetváltozást idéz elı a PKC-ban, amely szabaddá teszi azokat a szekvenciákat, amelyek lehetıvé teszik az interakciót a közeli/szomszédos proteinekkel. Ugyanakkor kimutatták, hogy amíg az sdr-PKCα kötıdést a Ca2+ elısegíti, addig a foszfatidil szerin stabilizálja azt. Saját kísérleteinkben kétségtelenül stabil interakciót találtunk a TnI és a PKCα között lipidek hiányában, habár lehet, hogy a foszfatidil szerin in vivo részt vesz a komplex stabilitásának növelésében. Masch megfigyelései rámutattak arra, hogy az intracellularis szabad kalcium konentráció idıbeli és térbeli változásai meghatározó szerepet játszanak a PKCα lokalizációjában érfali simaizom sejtekben (Maasch és munkatársai, 2000). Hasonló elképzekés alkalmazható kamrai szívizomsejtek esetében is. Adataink szerint a PKCα szubcellularis lokalizációja jelentısen megváltozik az intracellularis szabad Ca2+ koncentráció megemelése által. Eredményeink ezen felül arra is rámutattak, hogy a kontrakció/relaxáció ciklus során a PKCα lokalizációja megváltozhat, transzlokálódhat a vékony filamentumhoz, átmenetileg kötıdhet a TnI-hez Ca2+-függı módon, mely hozzájárulhat a kontraktilitás fenntartásához iszkémia/reperfúzió során. Másrészrıl, patológiás körülmények között a PKCα 60

mennyisége jelentısen megnı, amely feltehetıen elvezet a fiziológiás (saját adataink szerint troponin I-vel történı asszociáción keresztüli) szabályozás megbomlásához, számos miofibrilláris fehérje foszforilációja pedig a kontraktilitás csökkenéséhez (Belin és munkatársai,

2006; Belin és munkatársai, 2007) vezethet (22.

ábra).

Krónikus

szívelégtelenség kapcsán (Bowling és munkatársai, 1999; Wang és munkatársai, 2003; van Velden és munkatársai, 2006) kimutatták a kalcium függı izoformák, PKCα, βI és βII szelektív upregulációját. Nincs összhang abban, hogy az intracellularis foszforilációs folyamatok mely strukturális fehérjéket érintik. In vitro kísérletekben (Noland és munkatársai, 1989, 1993, 1996) bizonyították, hogy a troponin I (TnI), a troponinT (TnT), a miozin könnyőlánc 2 (MLC-2) és kardiális miozin kötı C fehérje (cMyBP-C) egyaránt szubsztrátjai a PKC-nek.

22. ábra A PKC szabályozása fiziológiás és patológiás körülmények között. Fiziológiás körülmények között a kontrakció során megemelkedı intracelluláris Ca2+ koncentrációk hatására a PKC a troponin I-hez kötıdik, és a környezetben elhelyezkedı fehérjék foszforilációja révén hozzájárul a kontraktilis erı fenntartásához. Ezzel szemben patologiás körülmények között túltermelıdik, ami nem csak a fiziológiás szubsztrátok fokozott foszforilációját, hanem egyéb, fiziológiás körülmények között nem foszforilálódó fehérje foszforilációját is kiválthatja. Ezen túlzott mőködés eredménye a kontraktilitás csökkenése lehet.

61

7. Összefoglalás Méréseink alapján humán szívelégtelen mintákban szignifikáns oxidatív károsodás mutatható ki, szemben a kontroll humán donor mintákkal. Eredményeink szerint szívelégtelen betegekbıl és a donorokból származó mintáinkban a nitrált fehérjék tekintetében nincs különbség. Megfigyelhetı a PARP-1 aktiváció és következményes fokozott poli(ADPribozil)áció szívelégtelen betegek szívizom mintáiban, ami további példával bıvíti azon humán betegségek sorát, melyekben PARP-1 aktiváció kialakul. Ugyanakkor mi nem tudtuk kimutatni szignifikáns PARP-1 expressziónövekedést a szívelégtelen betegek mintáiban, ami felveti, hogy a mintáinkba megfigyelt fokozott poli-ADP-iboziláció hátterében a PARP-1 katalitikus alegység aktivitás fokozódása áll. Kaszpáz-9 expresszió szignifikánsan nagyobb volt szívelégtelen mintáinkban, mint a donorokban. Ezen adatok felvetik, hogy enyhe DNS károsodás esetén a PARP-1 aktiválódik és szerepet játszik a DNS-hibajavításban, a genomikus stabilitás megırzésében. Spekuláció szintjén az is felvethetı, hogy mintáink végstádiumú szívelégtelenségben szenvedı betegekbıl származtak, akik talán sikeresen alkalamzkodtak a magasabb reaktív gyök szinthez és a következményes PARP-1 aktivációhoz. Eredményeink ezen felül arra is rámutattak, hogy a kontrakció/relaxáció ciklus során a PKCα lokalizációja megváltozhat, transzlokálódat a vékony filamentumhoz, átmenetileg kötıdhet a TnI-hez Ca2+-függı módon, mely hozzájárulhat a kontraktilitás fenntartásához iszkémia/reperfúzió során. Úgy tőnik, hogy az interakciót a TnI és a PKCα között egyedül a Ca2+ szabályozza, függetlenül a lipidektıl. A PKCα miofibrilláris hatásainak közvetítésében részt vesz a troponin I általi célra irányítása (targeting). Így felmerül annak a lehetısége, hogy a PKCα troponin I asszociációjának gátlása/segítése révén a PKCα miofibrilláris rendszerre gyakorolt hatása szelektíven modulálható. Mindenesetre a PKCα ígéretes terápiás célpontnak tőnik a szívizom kontraktilitásának javítására. Ezt a potenciált azonban feltehetıen sejten belüli kötıhelyeinek (targeting) pontosabb feltárását követıen tudjuk kihasználni. Fontos azt is megemlíteni, hogy patológiás körülmények között a PKCα mennyisége jelentısen megnı, amely feltehetıen elvezet a fiziológiás (saját adataink szerint troponin I-vel történı asszociáción

keresztüli) szabályozás megbomlásához,

számos

miofibrilláris fehérje

foszforilációja pedig a végsı közös úthoz, a kontraktilitás csökkenéséhez vezethet.

62

8. Tudományos eredmények hasznosíthatósága A szívelégtelenség relatív gyakorisága miatt sok embert érintı malignus betegség (a betegség prevalenciája 1-2%). Ezért fontos kutatási feladat a miokardium kontraktilitását befolyásoló miofibrilláris és intracelluláris hatásmechanizmusok tisztázása, mert további adatokat nyújt a betegség jobb megértésére és az újabb terápiás lehetıségek kialakítására. Vizsgálatainknak jelentıségét az adta, hogy kísérleteinket humán preprátumokon végeztük. Így az általunk észlelt mechanikai és biokémiai eltérések direkt módon adaptálhatók. A szívizom kontraktilitásának szabályozása egy fontos élettani funkció a szívizom mőködése szempontjából. Az élettani szabályozás pontos megértése elengedhetetlen a patológiás történések követéséhez.

63

9. Irodalom 9.1. Hivatkozott közlemények jegyzéke Anderson, P. A., Malouf, N. N., Oakeley, A. E., Pagani, E. D., and Allen, P. D. (1991), Troponin T isoform expression in humans. A comparison among normal and failing adult heart, fetal heart, and adult and fetal skeletal muscle Circ.Res. (69): 1226-1233. Anversa, P., Capasso, J. M., Olivetti, G., and Sonnenblick, E. H. (1992), Cellular basis of ventricular remodeling in hypertensive cardiomyopathy Am.J.Hypertens. (5): 758770. Bartunek, J., Vanderheyden, M., Knaapen, M. W., Tack, W., Kockx, M. M., and Goethals, M. (2002), Deoxyribonucleic acid damage/repair proteins are elevated in the failing human myocardium due to idiopathic dilated cardiomyopathy J.Am.Coll.Cardiol. (40): 1097-1103. Beckman, J. S., Beckman, T. W., Chen, J., Marshall, P. A., and Freeman, B. A. (1990), Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. (87): 1620-1624. Belin, R. J., Sumandea, M. P., Allen, E. J., Schoenfelt, K., Wang, H., Solaro, R. J., and de Tombe, P. P. (2007), Augmented protein kinase C-alpha-induced myofilament protein phosphorylation contributes to myofilament dysfunction in experimental congestive heart failure Circ.Res. (101): 195-204. Belin, R. J., Sumandea, M. P., Kobayashi, T., Walker, L. A., Rundell, V. L., Urboniene, D., Yuzhakova, M., Ruch, S. H., Geenen, D. L., Solaro, R. J., and de Tombe, P. P. (2006), Left ventricular myofilament dysfunction in rat experimental hypertrophy and congestive heart failure Am.J.Physiol Heart Circ.Physiol. (291): H2344-H2353. Berry, C. E. and Hare, J. M. (2004), Xanthine oxidoreductase and cardiovascular disease: molecular mechanisms and pathophysiological implications J.Physiol (555): 589-606.

64

Beyer, R. E. (1990), The participation of coenzyme Q in free radical production and antioxidation Free Radic.Biol.Med. (8): 545-565. Bilchick, K. C., Duncan, J. G., Ravi, R., Takimoto, E., Champion, H. C., Gao, W. D., Stull, L. B., Kass, D. A., and Murphy, A. M. (2006), Heart failure-associated alterations in troponin I phosphorylation impair ventricular relaxation-afterload and force-frequency responses and systolic function Am.J.Physiol Heart Circ.Physiol. (292): H318-H325. Bollag, W. (1983), Vitamin A and retinoids: from nutrition to pharmacotherapy in dermatology and oncology Lancet. (1): 860-863. Borbely, A., Toth, A., Edes, I., Virag, L., Papp, J. G., Varro, A., Paulus, W. J., van, der, V, Stienen, G. J., and Papp, Z. (2005), Peroxynitrite-induced alpha-actinin nitration and contractile alterations in isolated human myocardial cells Cardiovasc.Res. (67): 225233. Bors, W., Heller, W., Michel, C., and Saran, M. (1990), Flavonoids as antioxidants: determination of radical-scavenging efficiencies Methods Enzymol. (186:343-55.): 343-355. Bowling, N., Walsh, R. A., Song, G. J., Estridge, T., Sandusky, G. E., Fouts, R. L., Mintze, K., Pickard, T., Roden, R., Bristow, M. R., Sabbah, H. N., Mizrahi, J. L., Gromo, G., King, G. L., and Vlahos, C. J. (1999), Increased protein kinase C activity and expression of Ca2+-sensitive isoforms in the failing human heart Circulation (99): 384-391. Braun, M. U., Szalai, P., Strasser, R. H., and Borst, M. M. (2003), Right ventricular hypertrophy and apoptosis after pulmonary artery banding: regulation of PKC isozymes Cardiovascular Research (59): 658-667. Braz, J. C., Gregory, K., Pathak, A., Zhao, W., Sahin, B., Klevitsky, R., Kimball, T. F., Lorenz, J. N., Nairn, A. C., Liggett, S. B., Bodi, I., Wang, S., Schwartz, A., Lakatta, E.

65

G., DePaoli-Roach, A. A., Robbins, J., Hewett, T. E., Bibb, J. A., Westfall, M. V., Kranias, E. G., and Molkentin, J. D. (2004), PKC-alpha regulates cardiac contractility and propensity toward heart failure Nat.Med. (10): 248-254. Brenner, C. and Kroemer, G. (2000), Apoptosis. Mitochondria--the death signal integrators Science. (289): 1150-1151. Burkart, E. M., Sumandea, M. P., Kobayashi, T., Nili, M., Martin, A. F., Homsher, E., and Solaro, R. J. (2003), Phosphorylation or glutamic acid substitution at protein kinase C sites on cardiac troponin I differentially depress myofilament tension and shortening velocity J.Biol.Chem. (278): 11265-11272. Cheeseman, K. H. and Slater, T. F. (1993), An introduction to free radical biochemistry Br.Med.Bull. (49): 481-493. Chen, L., Hahn, H., Wu, G., Chen, C. H., Liron, T., Schechtman, D., Cavallaro, G., Banci, L., Guo, Y., Bolli, R., Dorn, G. W., and Mochly-Rosen, D. (2001), Opposing cardioprotective actions and parallel hypertrophic effects of delta PKC and epsilon PKC Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. (98): 11114-11119. Cheng, E. H., Kirsch, D. G., Clem, R. J., Ravi, R., Kastan, M. B., Bedi, A., Ueno, K., and Hardwick, J. M. (1997), Conversion of Bcl-2 to a Bax-like death effector by caspases Science. (278): 1966-1968. Crompton, M. (1999), The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death Biochem.J. (341): 233-249. Damron, D. S., Darvish, A., Murphy, L., Sweet, W., Moravec, C. S., and Bond, M. (1995), Arachidonic Acid-Dependent Phosphorylation of Troponin-I and Myosin LightChain-2 in Cardiac Myocytes Circulation Research (76): 1011-1019.

66

Damy, T., Ratajczak, P., Shah, A. M., Camors, E., Marty, I., Hasenfuss, G., Marotte, F., Samuel, J. L., and Heymes, C. (2004), Increased neuronal nitric oxide synthasederived NO production in the failing human heart Lancet (363): 1365-1367. de Boer, R. A., van Veldhuisen, D. J., van der, Wijk J., Brouwer, R. M., de Jonge, N., Cole, G. M., and Suurmeijer, A. J. (2000), Additional use of immunostaining for active caspase 3 and cleaved actin and PARP fragments to detect apoptosis in patients with chronic heart failure J.Card Fail. (6): 330-337. Dhalla, N. S., Temsah, R. M., and Netticadan, T. (2000), Role of oxidative stress in cardiovascular diseases J.Hypertens. (18): 655-673. Di Napoli, P., Taccardi, A. A., Grilli, A., Felaco, M., Balbone, A., Angelucci, D., Gallina, S., Calafiore, A. M., De Caterina, R., and Barsotti, A. (2003), Left ventricular wall stress as a direct correlate of cardiomyocyte apoptosis in patients with severe dilated cardiomyopathy Am.Heart J. (146): 1105-1111. Disatnik, M. H., Buraggi, G., and Mochly-Rosen, D. (1994), Localization of Protein-KinaseC Isozymes in Cardiac Myocytes Experimental Cell Research (210): 287-297. Dorn, G., W. (2009), Apoptotic and non-apoptotic programmed cardiomyocyte death in ventricular remodelling Cardiovasc.Res. (81):465-73. Dorn, G., W. and Force, T. (2005), Protein kinase cascades in the regulation of cardiac hypertrophy J.Clin.Invest. (115): 527-537. Douglas, L., and Mann, M., D. (1999) Mechanisms and Models in Heart Failure: A Combinatorial Approach Circulation. (100):999-1008 Ducharme, A., Frantz, S., Aikawa, M., Rabkin, E., Lindsey, M., Rohde, L. E., Schoen, F. J., Kelly, R. A., Werb, Z., Libby, P., and Lee, R. T. (2000), Targeted deletion of matrix metalloproteinase-9 attenuates left ventricular enlargement and collagen accumulation after experimental myocardial infarction J.Clin.Invest. (106): 55-62.

67

Ebashi, S., Masaki, T., Tsukui, R. (1974) Cardiac contractile proteins Adv.Cardiol. (12): 5969. Edes, I. (2000) A szív- és simaizom Ca2+-anyagcseréje: elmélet,klinikum Budapest: Golden Book Kiadó.

Enari, M., Sakahira, H., Yokoyama, H., Okawa, K., Iwamatsu, A., and Nagata, S. (1998), A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD Nature. (391): 43-50. Fabiato, A. and Fabiato, F. (1979), Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned muscle cells J.Physiol (Paris). (75): 463-505. Ferdinandy, P., Danial, H., Ambrus, I., Rothery, R. A., and Schulz, R. (2000), Peroxynitrite is a major contributor to cytokine-induced myocardial contractile failure Circ.Res. (87): 241-247. Ferrari, R., Guardigli, G., Mele, D., Percoco, G. F., Ceconi, C., and Curello, S. (2004), Oxidative stress during myocardial ischaemia and heart failure Curr.Pharm.Des. (10): 1699-1711. Fowler, M. B., Laser, J. A., Hopkins, G. L., Minobe, W., and Bristow, M. R. (1986), Assessment of the beta-adrenergic receptor pathway in the intact failing human heart: progressive receptor down-regulation and subsensitivity to agonist response Circulation. (74): 1290-1302. Frank, D., Kuhn, C., Katus, H. A., Frey, N. (2006) The sarcomeric Z-disc: a nodal point in signalling and disease J.Mol.Med. (84): 446-68. Fridovich, I. (1986), Biological effects of the superoxide radical Arch.Biochem.Biophys. (247): 1-11.

68

Frustaci, A., Kajstura, J., Chimenti, C., Jakoniuk, I., Leri, A., Maseri, A., Nadal-Ginard, B., and Anversa, P. (2000), Myocardial cell death in human diabetes Circ.Res. (87): 11231132. Fukuchi, M., Hussain, S. N., and Giaid, A. (1998), Heterogeneous expression and activity of endothelial and inducible nitric oxide synthases in end-stage human heart failure: their relation to lesion site and beta-adrenergic receptor therapy Circulation (98): 132-139. Gealekman, O., Abassi, Z., Rubinstein, I., Winaver, J., and Binah, O. (2002), Role of myocardial inducible nitric oxide synthase in contractile dysfunction and betaadrenergic hyporesponsiveness in rats with experimental volume-overload heart failure Circulation (105): 236-243. Giordano, F. J. (2005), Oxygen, oxidative stress, hypoxia, and heart failure J.Clin.Invest (115): 500-508. Goldberg, M. and Steinberg, S. F. (1996), Tissue-specific developmental regulation of protein kinase C isoforms Biochemical Pharmacology (51): 1089-1093. Goldspink, P. H., Montgomery, D. E., Walker, L. A., Urboniene, D., McKinney, R. D., Geenen, D. L., Solaro, R. J., and Buttrick, P. M. (2004), Protein kinase Cepsilon overexpression alters myofilament properties and composition during the progression of heart failure Circ.Res. (95): 424-432. Gruss, H. J. and Dower, S. K. (1995), The TNF ligand superfamily and its relevance for human diseases Cytokines Mol.Ther. (1): 75-105. Gu, X. and Bishop, S. P. (1994), Increased protein kinase C and isozyme redistribution in pressure-overload cardiac hypertrophy in the rat Circ.Res. (75): 926-931. Gutteridge, J. M. (1995), Lipid peroxidation and antioxidants as biomarkers of tissue damage Clin.Chem. (41): 1819-1828.

69

Halliwell, B. (1987), Oxidants and human disease: some new concepts FASEB J. (1): 358364. Halliwell, B. and Gutteridge, J. M. (1986), Oxygen free radicals and iron in relation to biology and medicine: some problems and concepts Arch.Biochem.Biophys. (246): 501-514. Halliwell, B. and Whiteman, M. (2004), Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? Br.J.Pharmacol. (142): 231-255. Hambleton, M., Hahn, H., Pleger, S. T., Kuhn, M. C., Klevitsky, R., Carr, A. N., Kimball, T. F., Hewett, T. E., Dorn, G. W., Koch, W. J., and Molkentin, J. D. (2006), Pharmacological- and gene therapy-based inhibition of protein kinase Calpha/beta enhances cardiac contractility and attenuates heart failure Circulation. (114): 574-582. Harrison, D., Griendling, K. K., Landmesser, U., Hornig, B., and Drexler, H. (2003), Role of oxidative stress in atherosclerosis Am.J.Cardiol. (91): 7A-11A. Hengartner, M. O. (2000), The biochemistry of apoptosis Nature (407): 770-776. Himmelfarb, J., Stenvinkel, P., Ikizler, T. A., and Hakim, R. M. (2002), The elephant in uremia: oxidant stress as a unifying concept of cardiovascular disease in uremia Kidney Int. (62): 1524-1538. Huang, X. P., Li, J., Foster, D., Lemanski, S. L., Dube, D. K., Zhang, C., and Lemanski, L. F. (2002), Protein kinase C-mediated desmin phosphorylation is related to myofibril disarray in cardiomyopathic hamster heart Experimental Biology and Medicine (227): 1039-1046. Hughes, S. E. (2003), Detection of apoptosis using in situ markers for DNA strand breaks in the failing human heart. Fact or epiphenomenon? J.Pathol. (201): 181-186.

70

Hunt, M. J., Aru, G. M., Hayden, M. R., Moore, C. K., Hoit, B. D., and Tyagi, S. C. (2002), Induction of oxidative stress and disintegrin metalloproteinase in human heart endstage failure Am.J.Physiol Lung Cell Mol.Physiol (283): L239-L245. Huxley, A. F., Niedergerke, R. (1954), Structural changes in muscle during contraction Nature (173): 971-973. Ide, T., Tsutsui, H., Kinugawa, S., Suematsu, N., Hayashidani, S., Ichikawa, K., Utsumi, H., Machida, Y., Egashira, K., and Takeshita, A. (2000), Direct evidence for increased hydroxyl radicals originating from superoxide in the failing myocardium Circ.Res. (86): 152-157. Ignarro, L. J., Napoli, C., and Loscalzo, J. (2002), Nitric oxide donors and cardiovascular agents modulating the bioactivity of nitric oxide: an overview Circ.Res. (90): 21-28. Ishida, H., Ichimori, K., Hirota, Y., Fukahori, M., and Nakazawa, H. (1996), Peroxynitriteinduced cardiac myocyte injury Free Radic.Biol.Med. (20): 343-350. Jagtap, P. and Szabo, C. (2005), Poly(ADP-ribose) polymerase and the therapeutic effects of its inhibitors Nat.Rev.Drug Discov. (4): 421-440. Jideama, N. M., Noland, T. A., Raynor, R. L., Blobe, G. C., Fabbro, D., Kazanietz, M. G., Blumberg, P. M., Hannun, Y. A., and Kuo, J. F. (1996), Phosphorylation specificities of protein kinase C isozymes for bovine cardiac troponin I and troponin T and sites within these proteins and regulation of myofilament properties Journal of Biological Chemistry (271): 23277-23283. Karmazyn, M. and Moffat, M. P. (1993), Role of Na+/H+ exchange in cardiac physiology and pathophysiology: mediation of myocardial reperfusion injury by the pH paradox Cardiovasc.Res. (27): 915-924. Kirshenbaum, L. A. (1998), Regulators of apoptosis in the heart: a matter of life and death Can.J.Cardiol. (14): 457-460.

71

Koda, M., Takemura, G., Kanoh, M., Hayakawa, K., Kawase, Y., Maruyama, R., Li, Y., Minatoguchi, S., Fujiwara, T., and Fujiwara, H. (2003), Myocytes positive for in situ markers for DNA breaks in human hearts which are hypertrophic, but neither failed nor dilated: a manifestation of cardiac hypertrophy rather than failure J.Pathol. (199): 229-236. Kothakota, S., Azuma, T., Reinhard, C., Klippel, A., Tang, J., Chu, K., McGarry, T. J., Kirschner, M. W., Koths, K., Kwiatkowski, D. J., and Williams, L. T. (1997), Caspase-3-generated fragment of gelsolin: effector of morphological change in apoptosis Science. (278): 294-298. Kumar, D. and Jugdutt, B. I. (2003), Apoptosis and oxidants in the heart J.Lab Clin.Med. (142): 288-297. Kwan, J. A., Schulze, C. J., Wang, W., Leon, H., Sariahmetoglu, M., Sung, M., Sawicka, J., Sims, D. E., Sawicki, G., and Schulz, R. (2004), Matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) is present in the nucleus of cardiac myocytes and is capable of cleaving poly (ADPribose) polymerase (PARP) in vitro FASEB J. (18): 690-692. LeWinter, M., M. (2004), Titin isoforms in heart failure: are there benefits to supersizing? Circulation. (110):109-11. Li, Y. Y. and Feldman, A. M. (2001), Matrix metalloproteinases in the progression of heart failure: potential therapeutic implications Drugs (61): 1239-1252. Liew, C. C. and Dzau, V. J. (2004), Molecular genetics and genomics of heart failure Nat.Rev.Genet. (5): 811-825. Maasch, C., Wagner, S., Lindschau, C., Alexander, G., Buchner, K., Gollasch, M., Luft, F. C., and Haller, H. (2000), Protein kinase C alpha targeting is regulated by temporal and spatial changes in intracellular free calcium concentration [Ca2+](i) Faseb Journal (14): 1653-1663.

72

Mallat, Z., Philip, I., Lebret, M., Chatel, D., Maclouf, J., and Tedgui, A. (1998), Elevated levels of 8-iso-prostaglandin F2alpha in pericardial fluid of patients with heart failure: a potential role for in vivo oxidant stress in ventricular dilatation and progression to heart failure Circulation (97): 1536-1539. Mariani, E. Polidori, M., C., Cherubinia, A., and Mecocci, P. (2005), Oxidative stress in brain aging, neurodegenerative and vascular diseases: an overview J.Chromatogr.B.Analyt.Technol. Biomed. Life. Sci. (827): 65-75. Massion, P. B., Feron, O., Dessy, C., and Balligand, J. L. (2003), Nitric oxide and cardiac function: ten years after, and continuing Circ.Res. (93): 388-398. Mercadier, J. J., Lompre, A. M., Wisnewsky, C., Samuel, J. L., Bercovici, J., Swynghedauw, B., and Schwartz, K. (1981), Myosin isoenzyme changes in several models of rat cardiac hypertrophy Circ.Res. (49): 525-532. Mineo, C., Ying, Y. S., Chapline, C., Jaken, S., and Anderson, R. G. W. (1998), Targeting of protein kinase C alpha to caveolae Journal of Cell Biology (141): 601-610. Mochly-Rosen, D. (1995), Localization of Protein-Kinases by Anchoring Proteins - A Theme in Signal-Transduction Science (268): 247-251. Mochly-Rosen, D. and Gordon, A. S. (1998), Anchoring proteins for protein kinase C: a means for isozyme selectivity Faseb Journal (12): 35-42. Montgomery, D. E., Wolska, B. M., Pyle, W. G., Roman, B. B., Dowell, J. C., Buttrick, P. M., Koretsky, A. P., Del Nido, P., and Solaro, R. J. (2002), alpha-Adrenergic response and myofilament activity in mouse hearts lacking PKC phosphorylation sites on cardiac TnI Am.J.Physiol Heart Circ.Physiol. (282): H2397-H2405. Mortensen, S. A. (1993), Perspectives on therapy of cardiovascular diseases with coenzyme Q10 (ubiquinone) Clin.Investig. (71): S116-S123.

73

Mungrue, I. N., Gros, R., You, X., Pirani, A., Azad, A., Csont, T., Schulz, R., Butany, J., Stewart, D. J., and Husain, M. (2002), Cardiomyocyte overexpression of iNOS in mice results in peroxynitrite generation, heart block, and sudden death J.Clin.Invest (109): 735-743. Murthy, K. G., Xiao, C. Y., Mabley, J. G., Chen, M., and Szabo, C. (2004), Activation of poly(ADP-ribose) polymerase in circulating leukocytes during myocardial infarction Shock (21): 230-234. Muth, J. N., Yamaguchi, H., Mikala, G., Grupp, I. L., Lewis, W., Cheng, H., Song, L. S., Lakatta, E. G., Varadi, G., and Schwartz, A. (1999), Cardiac-specific overexpression of the alpha(1) subunit of the L-type voltage-dependent Ca(2+) channel in transgenic mice. Loss of isoproterenol-induced contraction J.Biol.Chem. (274): 21503-21506. Nakamura, A. and Goto, S. (1996), Analysis of protein carbonyls with 2,4-dinitrophenyl hydrazine and its antibodies by immunoblot in two-dimensional gel electrophoresis J.Biochem. (119): 768-774. Nakamura, K., Kusano, K., Nakamura, Y., Kakishita, M., Ohta, K., Nagase, S., Yamamoto, M., Miyaji, K., Saito, H., Morita, H., Emori, T., Matsubara, H., Toyokuni, S., and Ohe, T. (2002), Carvedilol decreases elevated oxidative stress in human failing myocardium Circulation (105): 2867-2871. Nicholson, D. W. and Thornberry, N. A. (1997), Caspases: killer proteases Trends Biochem.Sci. (22): 299-306. Noguchi, T., Hunlich, M., Camp, P. C., Begin, K. J., El Zaru, M., Patten, R., Leavitt, B. J., Ittleman, F. P., Alpert, N. R., LeWinter, M. M., and VanBuren, P. (2004), Thin filament-based modulation of contractile performance in human heart failure Circulation (110): 982-987.

74

Noland, T. A., Guo, X. D., Raynor, R. L., Jideama, N. M., Averyhartfullard, V., Solaro, R. J., and Kuo, J. F. (1995), Cardiac Troponin-I Mutants - Phosphorylation by ProteinKinase-C and Protein-Kinase-A and Regulation of Ca2+-Stimulated Mgatpase of Reconstituted Actomyosin S-1 Journal of Biological Chemistry (270): 25445-25454. Noland, T. A. and Kuo, J. F. (1992), Protein-Kinase-C Phosphorylation of Cardiac TroponinT Decreases Ca-2+-Dependent Actomyosin Mgatpase Activity and Troponin-T Binding to Tropomyosin-F-Actin Complex Biochemical Journal (288): 123-129. Noland, T. A., Jr. and Kuo, J. F. (1993), Phosphorylation of cardiac myosin light chain 2 by protein kinase C and myosin light chain kinase increases Ca(2+)-stimulated actomyosin MgATPase activity Biochem.Biophys.Res.Commun. (193): 254-260. Noland, T. A., Jr., Raynor, R. L., Jideama, N. M., Guo, X., Kazanietz, M. G., Blumberg, P. M., Solaro, R. J., and Kuo, J. F. (1996), Differential regulation of cardiac actomyosin S-1 MgATPase by protein kinase C isozyme-specific phosphorylation of specific sites in cardiac troponin I and its phosphorylation site mutants Biochemistry. (35): 1492314931. Noland, T. A., Raynor, R. L., and Kuo, J. F. (1989), Identification of Sites Phosphorylated in Bovine Cardiac Troponin-I and Troponin-T by Protein Kinase-C and Comparative Substrate Activity of Synthetic Peptides Containing the Phosphorylation Sites Journal of Biological Chemistry (264): 20778-20785. Okada, H., Takemura, G., Koda, M., Kanoh, M., Kawase, Y., Minatoguchi, S., and Fujiwara, H. (2005), Myocardial apoptotic index based on in situ DNA nick end-labeling of endomyocardial biopsies does not predict prognosis of dilated cardiomyopathy Chest. (128): 1060-1062. Pacher, P., Liaudet, L., Bai, P., Mabley, J. G., Kaminski, P. M., Virag, L., Deb, A., Szabo, E., Ungvari, Z., Wolin, M. S., Groves, J. T., and Szabo, C. (2003), Potent

75

metalloporphyrin peroxynitrite decomposition catalyst protects against the development of doxorubicin-induced cardiac dysfunction Circulation (107): 896-904. Pacher, P., Liaudet, L., Mabley, J., Komjati, K., and Szabo, C. (2002a), Pharmacologic inhibition of poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase may represent a novel therapeutic approach in chronic heart failure J.Am.Coll.Cardiol. (40): 1006-1016. Pacher, P., Liaudet, L., Soriano, F. G., Mabley, J. G., Szabo, E., and Szabo, C. (2002b), The role of poly(ADP-ribose) polymerase activation in the development of myocardial and endothelial dysfunction in diabetes Diabetes (51): 514-521. Pacher, P., Obrosova, I. G., Mabley, J. G., and Szabo, C. (2005), Role of nitrosative stress and peroxynitrite in the pathogenesis of diabetic complications. Emerging new therapeutical strategies Curr.Med.Chem. (12): 267-275. Palmer, S. and Kentish, J. C. (1994), The role of troponin C in modulating the Ca2+ sensitivity of mammalian skinned cardiac and skeletal muscle fibres J.Physiol. (480): 45-60. Pennathur, S. and Heinecke, J. W. (2004), Mechanisms of oxidative stress in diabetes: implications for the pathogenesis of vascular disease and antioxidant therapy Front Biosci. (9:565-74.): 565-574. Pi, Y., Zhang, D., Kemnitz, K. R., Wang, H., and Walker, J. W. (2003), Protein kinase C and A sites on troponin I regulate myofilament Ca2+ sensitivity and ATPase activity in the mouse myocardium J.Physiol. (552): 845-857. Pillai, J. B., Russell, H. M., Raman, J., Jeevanandam, V., and Gupta, M. P. (2005), Increased expression of poly(ADP-ribose) polymerase-1 contributes to caspase-independent myocyte cell death during heart failure Am.J.Physiol Heart Circ.Physiol (288): H486H496.

76

Polidori, M. C., Savino, K., Alunni, G., Freddio, M., Senin, U., Sies, H., Stahl, W., and Mecocci, P. (2002), Plasma lipophilic antioxidants and malondialdehyde in congestive heart failure patients: relationship to disease severity Free Radic.Biol.Med. (32): 148152. Pryor, W. A. (1982), Free radical biology: xenobiotics, cancer, and aging Ann.N.Y.Acad.Sci. (393:1-22.): 1-22. Pyle, W. G., Sumandea, M. P., Solaro, R. J., and de Tombe, P. P. (2002), Troponin I serines 43/45 and regulation of cardiac myofilament function Am.J.Physiol Heart Circ.Physiol. (283): H1215-H1224. Richter, B. W. and Duckett, C. S. (2000), The IAP proteins: caspase inhibitors and beyond Sci.STKE. (2000): E1Rochette, L., Tatou, E., Vergely, C., Maupoil, V., Bouchot, O., Mossiat, C., Jazayeri, S., Benkhadra, S., Brenot, R., Girard, C., and David, M. (2008), Regional heterogeneity of decreased myocardial norepinephrine and increased lipid peroxidation levels in patients with end-stage failing heart secondary to dilated or ischemic cardiomyopathy J.Heart Lung Transplant. (27): 767-774. Roman, B. B., Goldspink, P. H., Spaite, E., Urboniene, D., McKinney, R., Geenen, D. L., Solaro, R. J., and Buttrick, P. M. (2004), Inhibition of PKC phosphorylation of cTnI improves cardiac performance in vivo Am.J.Physiol Heart Circ.Physiol. (286): H2089-H2095. Rybin, V. O. and Steinberg, S. F. (1994), Protein-Kinase-C Isoform Expression and Regulation in the Developing Rat-Heart Circulation Research (74): 299-309. Sakthivel, S., Finley, N. L., Rosevear, P. R., Lorenz, J. N., Gulick, J., Kim, S., VanBuren, P., Martin, L. A., and Robbins, J. (2005), In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation J.Biol.Chem. (280): 703-714.

77

Schaub, M.,C., Hefti, M.,A., and Zaugg, M. (2006) Integration of calcium with the signaling network in cardiac myocytes J.Mol.Cell.Cardiol. (41): 183–214. Scruggs, S. B., Walker, L. A., Lyu, T., Geenen, D. L., Solaro, R. J., Buttrick, P. M., and Goldspink, P. H. (2006), Partial replacement of cardiac troponin I with a nonphosphorylatable mutant at serines 43/45 attenuates the contractile dysfunction associated with PKCepsilon phosphorylation J.Mol.Cell Cardiol. (40): 465-473. Sies, H. and Murphy, M. E. (1991), Role of tocopherols in the protection of biological systems against oxidative damage J.Photochem.Photobiol.B. (8): 211-218. Simonis, G., Briem, S. K., Schoen, S. P., Bock, M., Marquetant, R., and Strasser, R. H. (2007), Protein kinase C in the human heart: differential regulation of the isoforms in aortic stenosis or dilated cardiomyopathy Mol.Cell Biochem. (305): 103-111. Singal, P. K., Khaper, N., Palace, V., and Kumar, D. (1998), The role of oxidative stress in the genesis of heart disease Cardiovasc.Res. (40): 426-432. Slater, T. F. (1984), Free-radical mechanisms in tissue injury Biochem.J. (222): 1-15. Sodha, N. R., Clements, R. T., Bianchi, C., and Sellke, F. W. (2008), Cardiopulmonary bypass with cardioplegic arrest activates protein kinase C in the human myocardium J.Am.Coll.Surg. (206): 33-41. Solaro, R. J., Pang, D. C., and Briggs, F. N. (1971), The purification of cardiac myofibrils with Triton X-100 Biochim.Biophys.Acta. (245): 259-262. Soldani, C. and Scovassi, A. I. (2002), Poly(ADP-ribose) polymerase-1 cleavage during apoptosis: an update Apoptosis. (7): 321-328. Sonnenblick, E. H. (1968) Correlation of myocardial ultrastructure and function Circulation. (38): 29-44.

78

Sorescu, D. and Griendling, K. K. (2002), Reactive oxygen species, mitochondria, and NAD(P)H oxidases in the development and progression of heart failure Congest.Heart Fail. (8): 132-140. Stennicke, H. R. and Salvesen, G. S. (1999), Catalytic properties of the caspases Cell Death.Differ. (6): 1054-1059. Szabo, C. (2003), Multiple pathways of peroxynitrite cytotoxicity Toxicol.Lett. (140-141:10512.): 105-112. Szabo, C., Liaudet, L., Hagl, S., and Szabo, C. (2004a), Poly(ADP-ribose) polymerase activation in the reperfused myocardium Cardiovasc.Res. (61): 471-480. Szabo, C., Mabley, J. G., Moeller, S. M., Shimanovich, R., Pacher, P., Virag, L., Soriano, F. G., Van Duzer, J. H., Williams, W., Salzman, A. L., and Groves, J. T. (2002a), Part I: pathogenetic role of peroxynitrite in the development of diabetes and diabetic vascular complications: studies with FP15, a novel potent peroxynitrite decomposition catalyst Mol.Med. (8): 571-580. Szabo, G. and Bahrle, S. (2005), Role of nitrosative stress and poly(ADP-ribose) polymerase activation in myocardial reperfusion injury Curr.Vasc.Pharmacol. (3): 215-220. Szabo, G., Bahrle, S., Stumpf, N., Sonnenberg, K., Szabo, E. E., Pacher, P., Csont, T., Schulz, R., Dengler, T. J., Liaudet, L., Jagtap, P. G., Southan, G. J., Vahl, C. F., Hagl, S., and Szabo, C. (2002b), Poly(ADP-Ribose) polymerase inhibition reduces reperfusion injury after heart transplantation Circ.Res. (90): 100-106. Szabo, G., Soos, P., Mandera, S., Heger, U., Flechtenmacher, C., Bahrle, S., Seres, L., Cziraki, A., Gries, A., Zsengeller, Z., Vahl, C. F., Hagl, S., and Szabo, C. (2004b), INO-1001 a novel poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor improves cardiac and pulmonary function after crystalloid cardioplegia and extracorporal circulation Shock. (21): 426-432.

79

Takeishi, Y., Chu, G. X., Kirkpatrick, D. M., Li, Z. L., Wakasaki, H., Kranias, E. G., King, G. L., and Walsh, R. A. (1998), In vivo phosphorylation of cardiac troponin I by protein kinase C beta 2 decreases cardiomyocyte calcium responsiveness and contractility in transgenic mouse hearts Journal of Clinical Investigation (102): 72-78. Taniyama, Y. and Griendling, K. K. (2003), Reactive oxygen species in the vasculature: molecular and cellular mechanisms Hypertension. (42): 1075-1081. Thiemermann, C., Bowes, J., Myint, F. P., and Vane, J. R. (1997), Inhibition of the activity of poly(ADP ribose) synthetase reduces ischemia-reperfusion injury in the heart and skeletal muscle Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. (94): 679-683. Tyagi, S. C. and Hayden, M. R. (2003), Role of nitric oxide in matrix remodeling in diabetes and heart failure Heart Fail.Rev. (8): 23-28. Ungerer, M., Bohm, M., Elce, J. S., Erdmann, E., and Lohse, M. J. (1993), Altered expression of beta-adrenergic receptor kinase and beta 1-adrenergic receptors in the failing human heart Circulation. (87): 454-463. Valgimigli, M., Merli, E., Malagutti, P., Soukhomovskaia, O., Cicchitelli, G., Macri, G., and Ferrari, R. (2003), Endothelial dysfunction in acute and chronic coronary syndromes: evidence for a pathogenetic role of oxidative stress Arch.Biochem.Biophys. (420): 255-261. van der Velden, J., Narolska, N. A., Lamberts, R. R., Boontje, N. M., Borbely, A., Zaremba, R., Bronzwaer, J. G., Papp, Z., Jaquet, K., Paulus, W. J., and Stienen, G. J. (2006), Functional effects of protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in human myocardium Cardiovasc.Res. (69): 876-887. Virag, L. and Szabo, C. (2002), The therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors Pharmacol.Rev. (54): 375-429.

80

Wang, J., Liu, X., Sentex, E., Takeda, N., and Dhalla, N. S. (2003), Increased expression of protein kinase C isoforms in heart failure due to myocardial infarction Am.J.Physiol Heart Circ.Physiol. (284): H2277-H2287. Waring, W. S., Webb, D. J., and Maxwell, S. R. (2001), Systemic uric acid administration increases serum antioxidant capacity in healthy volunteers J.Cardiovasc.Pharmacol. (38): 365-371. Xiao, C. Y., Chen, M., Zsengeller, Z., Li, H., Kiss, L., Kollai, M., and Szabo, C. (2005), Poly(ADP-Ribose) polymerase promotes cardiac remodeling, contractile failure, and translocation of apoptosis-inducing factor in a murine experimental model of aortic banding and heart failure J.Pharmacol.Exp.Ther. (312): 891-898. Zile, M., R., Baicu, C., F., and Gaasch, W., H. (2004) Diastolic heart failure –abnormalities in active relaxation and passive stiffness of the left ventricle. N.Engl.J.Med.(350):19539. Zimmer, H., G. (2002) Who Discovered the Frank-Starling Mechanism? News Physiol Sci (17): 181-184. Zorc, M., Porenta, O. V., Pleskovic, R., Radovanovic, N., Cijan, A., Milosavijevic, A., and Petrovic, D. (2001), Myocytes' apoptosis and proliferation in endomyocardial biopsy as prognostic factors in terminal heart failure Pflugers Arch. (442): R163-R164. Zorc, M., Vraspir-Porenta, O., Zorc-Pleskovic, R., Radovanovic, N., and Petrovic, D. (2003), Apoptosis of myocytes and proliferation markers as prognostic factors in end-stage dilated cardiomyopathy Cardiovasc.Pathol. (12): 36-39. Zot, A. S. and Potter, J. D. (1987), Structural aspects of troponin-tropomyosin regulation of skeletal muscle contraction Annu.Rev.Biophys.Biophys.Chem. (16:535-59.): 535-559.

81

9.2. Saját publikációk jegyzéke Az értekezés alapjául szolgáló in extenso közlemények: Molnár A, Tóth A, Bagi Z, Papp Z, Édes I, Vaszily M, Galajda Z, Papp G, Varró A, Szüts V, Domokos G, Lacza Z, Szabó C Activation of the poly(ADP-ribose) polymerase pathway in human heart failure. Mol Med. 2006;12(7-8):143-52.

impakt faktor: 2,708

Molnár A, Borbély A, Czuriga D, Siket I M, Szilágyi S, Hertelendi Z, Pásztor E T, Galajda Z, Szerafin T, Jaquet K, Papp Z, Edes I, Tóth

A Protein kinase C contributes to the

maintenance of contractile force in human ventricular cardiomyocytes J.Biol. Chem. 2009; impakt faktor: 5,520

284(2):1031-9. Idézhetı absztraktok:

Molnár A, Szilágyi S, Vaszily M, Papp Z, Édes I, Tóth A. The role of PKC isozymes on the regulation of contraction of human cardiomyocytes. Cardiologia Hungarica, 2004; 34, C87. Molnár A, Szilágyi S, Papp Z, Vaszily M, Édes I, Tóth A. PKC mediated phosphorylation of human myofibrillar proteins. J. Muscle Res. Cell Motil. 2004; 25, 219. Molnár A, Szilágyi S, Borbély A, Vaszily M, Édes I, Papp Z, Tóth A. Translocation and substrate specificity of protein kinase C alpha isozyme in human myocardium. Cardiologia Hungarica, 2005; 35, A24. Molnár A, Szilágyi S, Borbély A, Vaszily M, Varró A. Papp J Gy, Édes I, Papp Z, Tóth A. PKC alpha in the human myocardium: expression, translocation and possible functions. J. Muscle Res. Cell Motil. 2005 ; 26(1), 82. Molnár A, Tóth A, Bagi Z, Papp Z, Édes I, Vaszily M, Galajda Z, Papp G, Varró A, Szüts V, Domokos G, Lacza Z, Szabó C. Activation of the poly(ADP-ribose) polymerase pathway in human heart failure. Cardiologia Hungarica, 2006; 36, A23.

82

Molnár A, Tóth A, Bagi Z, Papp Z, Édes I, Vaszily M, Galajda Z, Papp G, Varró A, Szüts V, Domokos G, Lacza Z, Szabó C. Activation of the poly(ADP-ribose) polymerase pathway in human heart failure. Exp. Clin. Cardiol. 2006; 11, 3. Elıadások: Molnár A., Szilágyi S., Vaszily M., Papp Z., Édes I., Tóth A. The role of PKC isozymes on the regulation of contraction of human cardiomyocytes. Annual Meeting of the Hungarian Society of Cardiologists, Balatonfüred, Hungary. 2004 Molnár A., Szilágyi S, Papp Z., Vaszily M., Édes I., Tóth A. PKC mediated phosphorylation of human myofibrillar proteins. 6th Meeting France-New CEE members, La Grande-Motte, France. 2004 Molnár A., Szilágyi S., Borbély A., Vaszily M., Édes I., Papp Z., Tóth A. Translocation and substrate specificity of protein kinase C alpha isozyme in human myocardium. Annual Meeting of the Hungarian Society of Cardiologists, Balatonfüred, Hungary. 2005 Molnár A., Tóth A., Bagi Z., Papp Z., Édes I., Vaszily M., Galajda Z., Papp G., Varró A., Szüts V., Domokos G., Lacza Z., Szabó C. Activation of the poly(ADP-ribose) polymerase pathway in human heart failure. Annual Meeting of the Hungarian Society of Cardiologists, Balatonfüred, Hungary. 2006 Molnár A., Pásztorné Tóth E., Jaquet K., Szüts V., Varró A., Papp G., Vaszily M., Galajda Z., Bagi Z., Papp Z., Édes I., Blumberg P. M., Tóth A. Ca 2+ dependent anchoring of PKC alpha to the contractile system of human ventricular cardomyocytes. 70 th Meeting of the Hungarian Physiological Society, Szeged, Hungary. 2006 Poszterek: Molnár A., Szilágyi S., Papp Z., Vaszily M., Édes I., Tóth A. PKC mediated phosphorylation of human myofibrillar proteins. XXXIII. European Muscle Conference, Isola d’Elba, Italy. 2004

83

Molnár A., Szilágyi S., Papp Z., Vaszily M., Édes I. Tóth A. PKC mediated phosphorylation of human myofibrillar proteins. 6th Meeting France-New CEE members, La Grande-Motte, France. 2004 Molnár A., Szilágyi S., Borbély A., Vaszily M., Varró A., Papp J.Gy., Édes I., Papp Z., Tóth A. PKC alpha in the human myocardium: expression, translocation and possible functions. XXXIV European Muscle Conference, Máta, Hungary. 2005 Molnár A., Tóth A., Bagi Zs, Papp Z., Édes I., Vaszily M., Galajda Z., Papp J. Gy., Varró A., Szüts V., Domokos G., Lacza Zs., Szabó Cs. Activation of poly(ADP-ribose) polymerase pathway in human hear failure. V. International Symposium on Myocardial Cytoprotection, Pécs, Hungary. 2006

84

10. Köszönetnyilvánítás Értekezésem végén szeretném megköszönni mindazoknak a segítségét, akik az eddigi többéves munkámban a segítségemre voltak: Köszönöm a Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum Kardiológiai Intézet munkatársainak, kiemelten Professzor Dr. Édes István Intézet Igazgató Úrnak, hogy a Debreceni Egyetem Laki Kálmán Doktori Iskola keretében végzett munkámat mindenkor támogatták. Köszönettel tartozom a Klinikai Fizológia Tanszék vezetıjének, Dr. Papp Zoltánnak, illetve köszönet illeti a közleményekben szereplı minden szerzıtársat, a Klinikai Fiziológiai-labor és a Szívsebészeti Tanszék munkatársait, hogy támogatták munkámat. Külön köszönetet mondok témavezetımnek Dr. Tóth Attilának a munkámhoz nyújtott pótolhatatlan segítségéért. Végezetül, de nem utolsó sorban köszönöm Balogh Attilának, kedvesemnek a bíztató szavait, a mellettem való kitartását és szüleimnek a sok türelmet, a sok éves bíztatást.

85

11. Bekötött publikációk

86