A hármas kromoszóma „sokpontos” interfázis –FISH vizsgálata gyermekkori leukémiákban
Ph. D. értekezés Készítette: Haltrich Irén Témavezető: Dr. Fekete György egyetemi tanár
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Tudományági Doktori Iskola: Molekuláris Orvostudományok Vezető: Dr. Mandl József egyetemi tanár Program: A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai Programvezető: Dr. Falus András egyetemi tanár Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar II. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika Budapest, 2005
Szigorlati bizottság:
Hivatalos bírálók:
Dr. Papp Zoltán egyetemi tanár
Dr. Bodó Imre főorvos
Dr. Sasvári Mária egyetemi tanár
Dr. Tóth András osztályvezető
Dr. Kriván Gergely osztályvezető főorvos
TARTALOMJEGYZÉK 1. Bevezetés
1. oldal
2. Célkitűzések
9. oldal
3. A vizsgált betegek és az alkalmazott módszerek 3. 1. A vizsgált betegek
11. oldal 11. oldal
3. 2. Az alkalmazott módszerek 3. 2. 1. Hagyományos citogenetikai vizsgálatok
12. oldal
3. 2. 2. FISH tanulmányok
13. oldal
4. Eredmények
16. oldal
4. 1. Az ALL esetek hármas kromoszóma vizsgálatának eredménye
16. oldal
4. 2. Az AML esetek hármas kromoszóma vizsgálatának eredménye
22. oldal
4. 2. 1. Hármas kromoszóma triszómiás esetek
30. oldal
4. 2. 2. 3q13-q21 deléció
30. oldal
4. 2. 3. 3q26.3-q28 tetraszómia
30. oldal
4. 2. 4. A hármas kromoszóma szerkezeti rendellenességei
33. oldal
4. 3. A CML-es eset hármas kromoszóma vizsgálatának eredménye 4. 3. 1. Hagyományos citogenetikai vizsgálatok, a DualColor és multicolor-FISH eredményei 4. 3. 2. „Sokpontos” I-FISH vizsgálat eredménye
35. oldal 38. oldal
5. Megbeszélés 5. 1. Az eliminációs teszt értékelése akut gyermekkori leukémiában: 3p deléció, 3q többlet, teljes 3-as triszómia
41. oldal
5. 2. A hármas kromoszómát érintő szerkezeti rendellenességek mieloid leukémiában
47. oldal
6. Következtetések
53. oldal
7. Rövidítések
57. oldal
8. Köszönetnyilvánítás
59. oldal
9. Irodalomjegyzék
61. oldal
10. Saját közlemények jegyzéke
81. oldal
10. 1. Az értekezés témakörében készült saját közlemények
81. oldal
10. 1. 1. Lektorált közlemények
81. oldal
10. 1. 2. Idézhető absztraktok
81. oldal
10. 2. Az értekezés témaköréhez szorosan nem kapcsolódó egyéb saját közlemények
84. oldal
11. Összefoglaló
87. oldal
12. Summary
88. oldal
Bevezetés 1. Bevezetés A leukémiára jellemző a hematopoietikus rendszer zavara, a normális fejlődési program
megszakadása.
Ennek
gyakori
oka
a
vérképzésben,
a
sejtek
differenciálódásában szerepet játszó gének szerzett hibája, sérülése. A malignitás irányába történő progresszió olyan másodlagos elváltozásoktól is függ, melyek a fejlődésükben megakadályozott, fenntartott sejtek életbenmaradását, túlélését elősegítik. Alfred Knudson (1) zseniális felfedezése (1971) óta tudjuk, hogy a sejtciklus szabályozásában, az apoptózisban szerepet játszó tumorszuppresszor gének (TSG) védik a szervezetet a kóros sejtek szaporodásától, a tumorok kialakulásától. Az utóbbi két évtizedben számos TSG-t azonosítottak és egyre több génről feltételezik, hogy tumor szuppresszor szerepe van. A TSG leggyakoribb hibája a deléció és pontmutáció. A TSG expressziója csökkenhet promoterének metilációjával vagy transzlokációk által képződött negatív transzkripciós faktorok működésével is. Knudson „két találat elmélete”, mindkét allél funkcióvesztése (a heterozigótaság elvesztése -loss of heterozigosity-LOH) a TSG-k nagy részére máig érvényes, bár néhány TSG védő funkciója már az egyik allél elvesztésével (haploinszufficiencia) vagy hibájával is károsodhat. A TSG-k azonosításában jelentős szerepet játszott a szomatikus sejthibridizációs- és kromoszóma transzfer technikák bevezetése (2, 3, 4, 5). A mikrosejt transzfer lehetővé tette, hogy egyetlen ép kromoszómát vigyenek be különféle tumorsejtekbe és annak malignus fenotípusra gyakorolt hatását kövessék (6). Imreh István kutatócsoportja a humán 3-as kromoszómát vitte át egér és emberi daganatsejtekbe (7, 8). Az így keletkezett mikrosejthibrideket egymás után többször inokulálták immundeficiens (SCID) egerekbe és a bevitt kromoszómát „tumor szuppresszor tesztként” tanulmányozták különféle daganat sejtvonalakban (7, 9). A hármas kromoszóma rövid karján két mindig kilökődő szakaszt azonosítottak a 3p21 régióban (≈39-46 Mb között), melyet az angol kezdőbetűk alapján (Common Eliminated Region) CER1 és CER2 régiónak neveztek el. Egy harmadik gyakran elvesző 3-as kromoszóma rövid kar régió (Frequently Eliminated Region) a 3p14.33p21.2 között a FER elnevezést kapta. (9,10). A 3p deléciókkal párhuzamosan a hosszú karon egy ~ 40 cM terjedelmű mindig megmaradó régiót (Common Retained Region) azonosítottak az összes daganatban, mely a CRR rövidítést nyerte el (9). A kísérleti modell eliminációs teszt (Et) néven lett ismert a szakirodalomban. Az Et 1
Bevezetés arra engedett következtetni, hogy a 3p karon a tumor fejlődését gátló gének találhatók, ezek elvesztése szelektív növekedési előnyt biztosít a daganat számára. Ezzel szemben a hármas hosszú karon, a CRR régióban a tumor növekedését pozitív irányban befolyásoló gének fordulnak elő (1. ábra).
1.
ábra.
A
humán
hármas
kromoszóma/egér
A9
fibroszarkóma
mikrosejthibridjei. Az ép hármas kromoszóma csak „darabokra törve” maradt meg és transzlokálódott az egér kromoszómákra (kimérikus transzlokáció). A SCID egerekben keletkező tumor panelben a FISH technikával összerakott humán hármas kromoszómából mindig hiányzott a CER régió és mindig megmaradt a CRR régió.
Az Et eredménye megegyezik számos malignus betegség citogenetikai, komparatív genomiális hibridizáció (CGH) és LOH módszerekkel történő vizsgálataival. A 3p21 kart érintő intersticiális deléciót 23 különféle tumorban írtak le (tüdő-, vese-, emlő-, petefészek-, hasnyálmirigy- és gyomordaganatokban). (11, 12, 13). A hármas rövid kar CER és FER régióinak intersticiális deléciója és a hosszú kar CRR régió többletének
szimultán
előfordulása
több
daganattípusban,
mint
pl.
vese-,
húgyhólyag-, tüdő-, petefészek-, emlő- és prosztata karcinómában (13, 14, 15) azt a lehetőséget veti fel, hogy ezek a régiók nem szövetspecifikusak, hanem általában szerepet játszanak a tumor keletkezésében és progressziójában.
2
Bevezetés
20 9 32 20
107
88
77 44 30
2. ábra. A 3p intersticiális deléció előfordulási gyakorisága 23 különféle malignus betegségben a Mitelman adatbázis alapján. A fekvő oszlopon lévő szám azt jelöli, hogy a régió deléciójára hány irodalmi adat van nyilvántartva az említett katalógusban.
A malignus betegségekben a TSG-k hibáinak széles spektrumát ismerjük. A gyermekkori daganatos betegségek közel 30%-át kitevő leukémiák túlnyomó része akut formában jelentkezik. Az akut leukémiák 80-82%-a limfoid (ALL), 15-20%-a mieloid leukémia (AML). A krónikus mieloid leukémia (CML) a gyermekkori leukémiás esetek ~ 1%-át teszi ki (16). Az LOH vizsgálatok alapján feltételezett TSG kromoszóma régiókat ALL-ben, AML-ben és CML-ben az irodalmi adatokkal együtt az 1. táblázatban foglaltam össze.
3
Bevezetés
Sor
Kromoszóma
Hematológiai
szám
lokalizáció
malignitás
Irodalmi hivatkozás
1.
1p32
T-ALL
Iolascon et al., 1997
2.
1p36
CML BC
Mori et al., 1998
3.
4p
CML BC
Mori et al., 1997
4.
4p25-27
HD
Dohner et al., 1992
5.
5p
B-ALL
Chambon-Pautas et al., 1998
6.
5q13.3
HCL; AML/MDS
Wu et al., 1999, Castro et al., 1998
7.
5q31
AML/MDS
Horrigan et al., 1996
8.
5q31-33
ALL
Faderl et al., 2001
9.
6q15-21
T-ALL
Hatta et al., 1999
10.
6q21-22
ALL; NHL
Gerard et al.,1997;Takeuchi et al., 1998, Starostik et al., 2000
11.
7p
CML BC
Mori et al., 1997
12.
7q22
AML/MDS
Liang et al., 1998
13.
7q31.1
AML
Koike et al., 1999, Liang et al., 1998
14.
7q33-34
AML
Koike et al., 1999
15.
9p21
ALL, NHL
Stegmaier K et al., 1995, Drexler HG., 1998, Calero Moreno T.M, 2002.
16.
10p
B-ALL
Chambon-Pautas et al., 1998
17.
11p15.5
AML/MDS
Krskova-Honzatkova et al., 2001
18.
12p12.3
ALL
Stegmaier K et al., 1995, Takeuchi et al., 1996, Aissani et al., 1999,
19.
17p13.3
Leukémia, limfóma
Sankar et al., 1998, Zhou et al., 2000
20.
18q
CML BC
Mori et al., 1997
21.
19p
CML BC
Mori et al., 1997
22.
20q12
MPD/AML/MDS
Bench et al., 2000; MacGrogan et al., 2001
23.
20q
CML BC, ALL
Mori et al., 1997, Chambon-Pautas et al., 1998
1. táblázat Az LOH vizsgálatokkal feltételezett TSG kromoszóma régiók hematológiai malignitásokban. T-ALL=T-sejtes ALL, CML BC=CML blasztos transzformáció, leukémia,
HD=Hodgkin-limfóma,
MDS=Mielodiszpláziás
B-ALL=B-sejtes szindróma,
MPD=Mieloproliferatív megbetegedések.
4
ALL,
HCL=Hajassejtes
NH=Non-Hodgkin
limfóma,
Bevezetés A hármas kromoszómán található TSG-k és az ALL közti összefüggéssel kapcsolatos irodalmi adatot nem találtam. A hármas kromoszómával kapcsolatos aberrációk gyermekkori ALL-ben ritkák (17), részletes modern citogenetikai tanulmányok célzottan a hármas kromoszómáról, legjobb ismereteim szerint nem készültek. Prigonina 103 gyermekkori ALL részletes citogenetikai tanulmánya alapján 81 kóros kariotípusú esetet azonosított és két 3-as triszómiát talált. (18). Két nem régi M-FISH tanulmány 29 pre-B-sejtes (19) illetve 28 B-sejtes és 2 T-sejtes (20) gyermekkori ALL-ben egyetlen hármas kromoszóma rendellenességet sem észlelt. Forestier és munkatársai (21) az északi országok 787 klonális elváltozást mutató ALL esetét elemezve egyetlen 3-as kromoszóma elváltozást, egy t(3;12)-es transzlokációt említenek. Andreasson és mtsai (22) hagyományos citogenetikával és FISH vizsgálattal 152 kóros ALL esetből három hiperdiploid kariotípusban hármas triszómiát is azonosítottak. Emellett még két deléciót, egyiket a rövid, másikat a hosszú hármas karon [del(3)(p21), del(3)(q12;q25)] valamint egy szokatlan 3;21-es transzlokációt [der(3)t(3;21)t(p25;q22)] is detektáltak. A 3-as kromoszóma rövid kar delécióinak szempontjából legrészletesebb hematológiai tanulmány Johansson és munkatársaitól származik (23). A saját eredményeik mellett a Mitelman kromoszóma katalógus (11) adatait dolgozták fel. 3589 ALL esetből 1381-et találtak citogenetikailag kórosnak és ebből 13 esetben azonosítottak 3p deléciót (0,9%) Bsejtes ALL-ben. 401 T sejtes ALL-ből mindössze 3-ban figyelték meg a 3p rendellenességét, parciális deléciót (23). Néhány gyermekkori ALL-ből származó in vitro tenyésztett sejtvonalban (SUP-B7, CCRF-CEM2, HUT-78 és Jurkat) különböző 3p kromoszóma szegment deléciót, illetve 3q többletet figyeltek meg (24, 25, 26). A hármas kromoszómához kapcsolódó aberrációkat 28 gyermekkori AML-ben és egy gyermekkori CML-ben is tanulmányoztam. AML-ben és CML-ben a hármas kromoszóma számbeli és szerkezeti rendellenességei viszonylag gyakoribbak. A hármas kromoszóma hosszú karjának szerkezeti rendellenességeit és a humán mieloid leukémia közötti összefüggéseket már a 70-es években, szinte a sávozási technikák bevezetésével egyidőben azonosították a különböző citogenetikai 5
Bevezetés laboratóriumokban (27, 28). Hamar felismerték, hogy a 3q rearrangementek jellegzetes
klinikai-morfológiai
tünetekkel
társulnak,
és
általában
rossz
prognózisúak. Normális vagy emelkedett trombocita szám mellett rendszerint kóros morfológiájú megakariociták láthatók (29, 30). A betegek a kemoterápiára rosszul vagy egyáltalán nem reagálnak. A citogenetikai vizsgálat 3q21 és 3q26 töréspontokat érintő paracentrikus inverziót, inv(3)(q21q26), reciprok transzlokációt, t(3;3)(q21;q26) vagy hármas inszerciót, ins(3)(q26;q21q26) igazol, de más 3q kart érintő szerkezeti rendellenesség is előfordulhat. Ez a jellegzetes
tünetcsoport
”3q21q26
szindrómaként”
ismert
a
citogenetikai
szakirodalomban (30). A kórképet felnőtt AML valamennyi FAB (French-AmericanBritish Cooperative Group ajánlása) (31, 32) szubtípusában (legritkábban AML-M3ban), mielodiszpláziás szindrómában (MDS), illetve CML megakarioblasztos fázisában azonosították (27, 33, 34, 35, 36). A szindróma az esetek 30%-ában 7-es monoszómiával társul (11). A 3q26 töréspontot érintő más kromoszómákkal történő kiegyensúlyozott transzlokációk, mint például a t(3;12)(q26;p13); p23;q26),
t(3;6)(q26;q14);
t(3;21)(q26;22);
t(2;3)(p13-
t(3;17)(q26;q22) is okozhatnak a „3q21q26
szindrómára” jellemző klinikai tüneteket. A Mitelman adatbázis (11) alapján ezek előfordulási gyakorisága viszonylag alacsonyabb. Grimwade és mtsai (37) 1612 AML eset citogenetikai eredményének prognosztikai értékelése során 40 betegnél (2,5%) állapították meg a 3q rendellenességet. A 3q rearrangementek a 7-es és 5-ös monoszómiával együtt a rossz prognózisú csoportba kerültek, mivel össztúlélési mutatóik szignifikánsan rosszabbak voltak a t(8;21), t(15;17) vagy inv(16)-ot hordozó vagy normál kariotípusú pácienseknél. Mauritzon és mtsai (38, 39) 372 saját eset mellett a Mitelman adatbázis 4230 citogenetikailag kóros felnőtt AML eredményét analizálva 82 hármas kromoszóma rendellenességet azonosítottak (1,4%), ebből 50 kiegyensúlyozatlan elváltozás, 3p deléció és 32 kiegyensúlyozott szerkezeti átrendeződés. A terápiával összefüggő szekundér
AML
(t-AML)
esetekben
a
3p
deléciót,
akárcsak
a
többi
kiegyensúlyozatlan elváltozást, lényegesen gyakoribbnak találták, mint de novo AML-ben. 6
Bevezetés
A Mitelman adatbank 6260 citogenetikailag kóros AML esetet átfogó hármas rövid kar tanulmányában Johansson és mtsai (23) a 3p parciális delécióját 76 betegnél regisztrálták (1,2%). Az esetek~30%-a t-AML volt. A 3p deléciót hat esetben egyedülálló citogenetikai rendellenességnek találták, 70 esetben más anomáliával társult, leggyakrabban 7-es monoszómiával. 1894 CML-ből 13 esetben írtak le a Philadelphia kromoszóma mellett 3p deléciót is. Gyermekkori AML-ről két nagyobb összefoglaló tanulmány született. Raimondi és mtsai (40) 280 gyermekkori AML kóros citogenetikai eredményét értékelve a leggyakoribb hármas kromoszómát érintő elváltozásnak a t(3;5)(q25;q34)-et találták. Ezen kívül, 2 hármas rövid kar deléciót [del(3)(p13p14), del(3)(p13)] és egy t(3;21)et azonosítottak (8 eset-2,8%). Forestier és mtsai (41) 211 kóros citogenetikájú gyermekkori AML esetet értékelve 10 (4,7%) hármas kromoszóma rendellenességet találtak: két teljes és egy hosszú kar triszómiát, egy monoszómiát, két 3q deléciót, 4 q kart érintő transzlokációt [t(3;21)(q26;q22), t(3;13)(q25;q24), t(3;17)(q25;q21) és der(17)t(3;17)(q21;q25)]. A hármas kromoszómával kapcsolatos összefoglaló tanulmányok alapján felnőttkori és gyermekkori AML-ben a 3q többlet ritkán fordul elő.(11, 41). Részleges 3q triszómiát (3q13→3qter és 3q21→3qter) juvenilis myelomonocytás leukémiában azonosítottak (42, 43, 44). Annak ellenére, hogy a citogenetikai vizsgálatok klinikai jelentősége a molekuláris genetikai érában is fokozódott, bizonyos hematológiai malignitások jellegzetes kromoszóma elváltozásai WHO osztályozási szemponttá váltak (45), az eddigi AML-lel
kapcsolatos
információk
elsősorban
felnőttkori
tanulmányokra
támaszkodnak, kevés a gyermekkori AML-lel kapcsolatos citogenetikai adat. Az irodalomból ismert, ~ 200 különböző szerkezeti és számbeli AML-re jellemző klonális aberráció nagy része mintegy 10 000, 15 év feletti betegtől származik (11). A kóros kariotípusok incidenciája ~20%-kal alacsonyabb a felnőttkori, mint a gyermekkori de novo AML esetekben. Habár ennek a különbségnek a pontos okát nem ismerjük, valószínű, hogy a gyermekkori és felnőttkori betegségek biológiai különbségével kapcsolatos. Például a 3q átrendeződések a felnőtt AML esetek 2%7
Bevezetés ában, a gyermekkoriban szélsőségesen ritkán fordulnak elő, 12 év alatti de novo AML-ben pedig egyáltalán nem azonosították ezeket. (11, 46). A hármas kromoszómához kapcsolódó gyermekkori AML publikációk vagy esetleírások, vagy csak 3-4 azonos citogenetikai kórképet feldolgozó tanulmányok (47, 48). Másrészt a szakirodalom nagy része a FISH korszak előtti évtizedek eredményeit dolgozza fel. Az I-FISH technikával végzett saját vizsgálataim lehetővé tették, hogy a hármas kromoszóma hagyományos citogenetikával nem mindig követhető, finomabb elváltozásait is azonosítsam. Az elektronikusan feltérképezhető szakirodalom alapján egyetlen olyan tanulmány sem született, mely gyermekkori AML-ben a hármas kromoszómát részletesen, megabázisról-megabázisra vizsgálja.
8
Célkitűzés 2. Célkitűzések A 3p gyakori deléciója szolid tumorokban valamint az Et kísérleti modellben arra enged következtetni, hogy a hármas kromoszóma rövid karján olyan TSG-ék találhatók, melyek nem tumorspecifikusak, hanem szövettől függetlenül szerepet játszhatnak a tumor keletkezésében és/vagy progressziójában. A hármas hosszú karon a tumor növekedését pozitív irányba befolyásoló gének jelenlétét szolid tumorokban, limfomákban és különböző daganat sejtvonalakban igazolták. Az Et hipotézisének akut leukémiákban történő tesztelésével arra kerestem a választ, hogy a hármas kromoszóma említett régiói érintettek-e hematológiai malignitásokban? Az egész hármas kromoszómát „befedő” 84 BAC és PAC klón valamint a nagy felbontóképességű és specifikusságú FISH technika egyedi lehetőséget kínált a hármas kromoszómához kapcsolódó rendellenességek feltárására. Korábban, egy kevésbé érzékeny módszerrel, hagyományos G-sáv technikával az ALL esetekben hármas kromoszóma aberrációt nem találtam. Vizsgálataimat kiegészítettem egy gyermekkori CML eset I-FISH és M-FISH analízisével, mivel korábban G-sáv technikával a hármas kromoszómát is érintő komplex átrendeződést csak részben tudtam feltárni. A fenti megfontolások alapján az alábbi kérdéseket, feladatokat tűztem ki: 1.
A hármas rövid kar CER régióiban feltételezett TSG-ék elveszhetnek-e
gyermekkori ALL-ben, ezzel egyidőben vagy ettől függetlenül a hármas kromoszóma hosszú kar CRR régiója duplikálódik-e? 2.
A hármas kromoszómához kapcsolódó rendellenességek azonosítása I-
FISH technikával gyermekkori ALL-ben. 3.
Et-ből ismert CER (3p21.2), FER (3p14.3) és más, az AML-hez kapcsolódó
szakirodalomban leírt 3p deléciós forró pontok, valamint gyakoribb deléciós régiók (3p25-26, 3p13-14) elvesznek-e gyermekkori AML-ben?
9
Célkitűzés 4.
Az Et-ben mindig megmaradó CRR régió vagy más 3q többlet azonosítása
gyermekkori AML-ben. 5.
A vizsgált gyermekkori AML esetek hármas kromoszómához kapcsolódó
valamennyi rendellenességének azonosítása GTG-sáv alapú- és I-FISH technika kombinálásával és az eltérések prognosztikai-klinikai összefüggéseinek értékelése és összehasonlítása hasonló felnőttkori esetekkel. 6.
Egy akcelerált fázisban diagnosztizált gyermekkori CML komplex variáns
transzlokációjának és hármas kromoszómát érintő átrendeződésének analízise multiplex-FISH
(M-FISH)
és
I-FISH
technikával;
az
eltérés
klinikai
jelentőségének értékelése. 7.
A hármas kromoszómához kapcsolódó szerkezeti rendellenességek
töréspontjainak meghatározása sokpontos I-FISH vizsgálattal, specifikus génhibák azonosítása.
10
A vizsgált betegek és az alkalmazott módszerek 3. A vizsgált betegek és az alkalmazott módszerek 3. 1. A vizsgált betegek A 32 új vagy recidivált ALL-es beteget a Semmelweis Egyetem II. Sz. Gyermekgyógyászati Klinikáján diagnosztizáltuk a klinikai, hematológiai, morfológiai, immunológiai és citogenetikai paraméterek alapján 1997 és 2003 között. A páciensek a következő FAB (31) besorolást kapták: ALL-L1 (18 eset), ALL-L2 (9 eset), ALL-L3 (3 eset) és ALL recidiva (2 eset). A 9 lány és 23 fiú ALL-es beteg életkora 2 hónapos kortól 18 éves korig terjedt, 5,7 év átlag életkorral. 7 beteget T-sejtes ALL miatt kezeltünk, 25 beteget B-sejtes ALL miatt. Az ALL-es páciensek legfontosabb klinikai adatait a 2. és 3. táblázatban (16. és 17. old) foglaltam össze. A 28 AML-es gyermekből 18 beteget a II. sz. Gyermekgyógyászati klinikán, 10 beteget pedig más budapesti gyermek-hematológiai központban diagnosztizáltak. A diagnózis a FAB szempontok szerint történt (32), szintén a 1997 és 2003 közötti időszakban. A 16 lány és 12 fiú betegből áll AML-es csoport életkora 7 hónaptól 16 éves korig terjedt, 9,8 év átlag életkorral. A vizsgált AML-es betegek diagnóziskor megállapított klinikai, hematológiai és citogenetikai adatait a 4. táblázatban (23. old) foglaltam össze. Mindkét csoportban az egyetlen válogatási lehetőség az volt, hogy maradt-e vagy sem sejtszuszpenzió a korábbi citogenetikai vizsgálatból. Egy 12 éves CML-es beteget szintén a II. sz. Gyermekklinikán diagnosztizáltuk, 2003ban. Vérképében 73, 3 G/l-es fehérvérsejtszámot (1% blaszt, 3% promielocita, 29% mielocita, 8% stáb, 16% szegment, 2% eozinofil, 9% limfocita sejttípussal), 102,7 g/l hemoglobinértéket, 215 G/l trombocitaszámot találtak. Csontvelőkenetében 37% blasztot észleltek, háttérbe szorult eritropoesissel. A flow citometriás immuntipizálás alapján 2 populáció volt elkülöníthető: 1. Limfocita-blaszt méretű sejtek, magas arányú CD19+ sejtekkel, melyek csaknem valamennyien CD 34 és CD 10 antigént is expresszáltak; 2. Egy nagyobb méretű és más strukturájú sejtekből álló populáció, CD13, CD 33, CD14 pozitivitással. A CD33+/CD34+ korai mieloid sejtek magas %-os aránya mellett CD19+/CD33+ kóros immunfenotípusú sejtek jelenléte volt 11
A vizsgált betegek és az alkalmazott módszerek kimutatható. A megakariociták kissé felszaporodtak, polimorfak, köztük sok mikro- és hipolobulált alakkal (mikromegakariociták). A real time kvantitativ polimeráz láncreakción alapuló vizsgálat Philadelphia (Ph) kromoszóma jelenlétét igazolta. A reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció (RT-PCR) a BCR-ABL fúziós génre a minor töréspontot mutatta ki. A hagyományos citogenetikai vizsgálat a Ph kromoszóma variáns transzlokációja mellett egy ugráló szegment transzlokációt (SJTsegmental jumping translocation) és a 3q szerkezeti rendellenességét is feltárta. A morfológiai, immunhisztokémiai, áramlásos citometriai, citogenetikai és molekuláris genetikai eredmények, valamint a klinikai paraméterek alapján a betegséget CML blasztos fázisaként diagnosztizáltuk. 3. 2. Alkalmazott módszerek 3. 2. 1. Hagyományos citogenetikai vizsgálatok A diagnózis idején 24 órás, esetenként 48 órás, rövid idejű spontán tenyésztést végeztem a csontvelői sejtekből és perifériás vérből standard technikával (49). A sejteket 15% fötális borjúsavó, penicillin és streptomycin tartalmú RPMI-1640 oldatban tenyésztettem. GTG sávozás (Giemsa sáv Tripszin emésztéssel és Giemsa festéssel) (50, 51) után az értékelést Cohu CCD kamerával (Herrsching, Germany) felszerelt mikroszkóppal (Olympus BH-2-RFCA) végeztem. A metafázis képeket Mac Ktype version 5.5.1 (PSI; Scientific Systems,Newcastle, UK) szoftverrel dolgoztam fel. Az esetek 92%-ában értékelhető metafázisokat nyertem. A kariotípust a nemzetközileg elfogadott ISCN 1995-ös nomenklatúra alapján írtam le (52), álalában 20-25 metafázis alapján. 3. 2. 2. FISH tanulmányok A 3-as kromoszóma FISH analízisét –20°-on tárolt fixált sejtszuszpenzióból végeztem el a stockholmi Karolinska Intézet Mikrobiológiai és Tumorbiológiai Központjában. A FISH vizsgálatokat kisebb módosításokkal, standard metodika szerint (53, 54), gyári próbák esetén a cég ajánlásai alapján végeztem.
12
A vizsgált betegek és az alkalmazott módszerek A 3-as kromoszóma esetleges számbeli eltéréseit Spectrum Red CEP3 α-szatellita FISH (Vysis, Abbot GmbH and Company, KG, Germany) próbával ellenőriztem. A CER régió vizsgálatához a P1-bakteriofág alapú (PAC) mesterséges kromoszóma klónjait használtam fel, melyeket a pPAC4 könyvtár szűrésével nyertünk (55, 56, 57). A PAC-ok DNS-ét Qiagen oszlop felhasználásával izoláltuk (QIAGEN, Inc Hilden, Germany). A CRR kópia számot a 3q27-ben térképezett BCL6 dual color (Vysis, Abbot GmbH and Company, KG, Germany) gyári próbával ellenőriztem. A T-ALL esetekben 42 (3. ábra-19. old.), az AML-es betegeknél 84 (4. ábra-24. old), az egész hármas kromoszómát befedő FISH próbával dolgoztam, sokpontos IFISH technikát alkalmazva. A CML-es beteg 3 q kar rendellenességeinek vizsgálatához, a töréspontok azonosításához összesen 16 FISH próbát használtam (5. ábra-39. old), melyek az egész hosszú kart befedték. Ezzel a módszerrel átlagban 10 megabázisonként
„letapogattam”
a
hármas
kromoszómát,
töréspontok
azonosításához megabázisról-megabázisra haladva hibridizáltam (6. ábra-14. old.). A próbákat a” BACPAC Resources Center at the Children ’s Hospital Oakland Research Institute, USA” nevű kutató központból szereztem be és a National Center for Biotechnology Information (NCBI) fizikai és genetikai térképezésének megfelelően
a
számítógépes
honlap
(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/
guide/human) felhasználásával választottam ki. A próbákat biotin-dUTP (Bionick labeling system, BRL) és digoxigenin –dUTP (DIG-Nick translation mix, Roche Molecular Biochemicals) gyári kittekkel jelöltem a gyártó által meghatározott metodika alapján. A biotinnal jelölt próbákat Cy3 konjugált sztreptavidinnel (Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont Buckinghamshire, England) és a digoxigeninnel jelölt próbákat FITC konjugált anti-digoxigenin (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Németország) ellenanyaggal detektáltam. A diagnózis idején bizonyos betegeknél FISH vizsgálat történt még TEL/AML1, BCR/ABL, MLL-transzlokáció specifikus dual-color próbákkal (Vysis, Abbot GmbH and Company, KG, Germany), centroméra specifikus 5, 6, 12, 19, X αszatellita (D5Z3, D6Z3, D12Z3, D19Z3; QBIOgene), 7-es kromoszóma α-szatellita
13
A vizsgált betegek és az alkalmazott módszerek
84 FISH PRÓBA RP11-204c23;RP11-121d3; RP11-1k16; RP11-8p14; RP11-91k4; RP11-57d6; RP11-0d24; RP11-79e6; RP11-91i6; RP11-89f18; RP11-86g5; RP11-0m23; RP6-33o7; RP6-153f14; RP6-123i13; RP6-32g23; RP6-08d10; RP6-91p17; RP11-1p19; RP6-102f2; CTD-78f18; RP-189k24; RP11-0h18; RP11-9k17; RP11-8p20; RP1189o2; RP11-79b9; RP11-9c12; RP11-1n13; RP11-89a12; RP11-90h15,RP11-154h23; RP11-89h10; RP11-79o5; RP11-81d17; RP11-80h24; RP11-81p15; RP11-91a15 CENTROMÉRA-CEP3 RP11-91m15;RP11-90i19; RP11-69n24;RP11-12p11; RP11-79h17;RP11-153k9; RP11-5k13;RP11-214a5; RP11-79m2;RP11-217p4; RP11-95h16; RP11-59j16; RP11-79l21;RP11-220j13; RP11-220-j13; RP11-219p10; RP11-88h10;RP11-229g6; RP11-145f16; RP11-79a14; RP11-89f24; RP11-91l9; RP11-209h21;RP11-91-f17; RP11-264d7;RP11-449b7; RP11-91b7;RP11-24l16; RP11-141c2;RP11-79o17; RP11-151p12;RP11-91k9; RP11—89b3;RP11-118F4; RP11-79k10;RP11-79k10; RP11-640p3;RP11-67e18; RP11-178k17;RP11-53d15; RP11-54l9;RP11-88h6; RRP11-88m1;RP11-91m9; RP11-233n20; RP11-451c20A
6. ábra. A sokpontos I-FISH vizsgálat illusztrációja. Baloldalt a hármas kromoszóma ideogramja, középen a hibridizációhoz használt dual-color probák neve, jobboldalt
a
hibridizáció
eredménye 14
metafázisban
és
interfázisban.
A vizsgált betegek és az alkalmazott módszerek (Spectrum Red CEP7,Vysis, Abbot GmbH and Company, KG, Germany), valamint teljes kromoszóma festő X és Y (WCPX, WCPY, QBIOgene) próbákkal. A FISH jeleket 200 interfázis sejtmagban számoltam meg, metafázisok értékelésére csak akkor került sor, ha rendelkezésre álltak a hibridizációs területen. A hiba százalék (cut-off level) megállapításához valamennyi próbával 3 egészséges donortól származó mintán is elvégeztem a hibridizációt. A jelek számát két egymástól független szakember számolta meg. A normálistól eltérő jelek számát százalékosan minden próbára nézve kiszámoltam. Az egészséges egyénektől származó mintákban kettőtől eltérő számú jelet kevesebb, mint 6%-ban találtam. Ennek alapján a páciensek mintáiban a 6%-nál magasabb számbeli eltérést kórosnak tekintettem, azaz a normál és kóros esetek közti hiba határt (cut-off level) 6%-nál állapítottam meg. Multicolor-FISH vizsgálatot a CML-es betegnél a komplex variáns transzlokáció és a szekundér rendellenességek azonosításához végeztem –20C °-on tárolt, fixált sejtszuszpenzióból, a Spectra Vision Assay (Vysis, Inc., Downers Grove, IL) protokollnak megfelelően. Az eredményeket Genus (Applied Imaging Corporation, Santa Clara, CA) softver segítségével dolgoztam fel.
15
Eredmények 4. Eredmények 4. 1. Az ALL esetek hármas kromoszóma vizsgálatának eredménye A 2. és 3. táblázat a 32 ALL beteg klinikai, citogenetikai, molekuláris genetikai adatait valamint a CER1, CRR régió és hármas centroméra FISH vizsgálatának eredményeit tartalmazza. G-sávos kariotípus analízissel az esetek 53%-ában találtam ALL-re jellemző klonális kromoszóma elváltozást. Ezzel a módszerrel a hármas kromoszómával kapcsolatos eltérést egyetlen esetben sem azonosítottam. Három esetben (9%) ismételt tenyésztéssel sem jutottam osztódó sejtekhez. Az értékelt esetek 38%-ában marker kromoszómát, nem klonális aberrációt vagy normális kariotípust találtam.
2. táblázat. A vizsgált T-sejtes ALL betegek klinikai, citogenetikai és molekuláris genetikai jellemzői, valamint a CER1, centroméra és CRR régiókra vonatkozó I-FISH eredmények, F= lány, M= fiú, CER= mindig kilökődő régió (common eliminated region), CRR= mindig megmaradó régió (common retained region), TCR= T-sejt receptor átrendeződés, NV= nem történt vizsgálat. A CER és CRR régiók vizsgálatához használt FISH –próbákat a 3-as ábrán (19. old) mutatom be.
Prednisolon válasz
Fvs szám x109L
Citogenetikai vizsgálat eredménye
Molekularis genetika TEL/AML1 ABL/BCR, TCR, MLL
CER1
Centroméra 3
CRR
Eset
Kor (év)/ nem
1
3/M
Jó
4,9
Nincs metafázis
NV
2
2
2
2
0,2/M
Jó
77,9
46,XY,-9,+12[5]/46,XY[20]
TCR pozitív
2
2
2
3
7/F
Jó
286
46,XX [18]
TCR pozitív
2
2
2
4
12/F
Jó
3
46,XX[20]
NV
2
2
3
5
14/M
Jó
41,5
46,XY [22]
TCR pozitív
2
2
3
6
11/M
Rossz
234
Nincs metafázis
TCR pozitív
2
3
3
7
13/M
Rossz
349
47,XY,+mar [3]/46,XY [33]
NV
2
3
3
_____________________________________________________________________
16
Eredmények 3. táblázat. A vizsgált B-sejtes ALL betegek klinikai, citogenetikai és molekuláris genetikai jellemzői, valamint a CER1, centroméra és CRR régióra vonatkozó IFISH eredmények. F= lány, M= fiú, CER= mindig kilökődő régió (common eliminated region), CRR= mindig megmaradó régió (common retained region), NV= nem történt vizsgálat. A CER és CRR régiók vizsgálatához használt FISH –próbákat a 3-as ábrán (19. old) mutatom be.
Citogenetikai vizsgálat eredménye
Molekuláris genetika: TEL/AML, BCR/ABL MLL
CER1
Centroméra
CRR
2,9
46,XY[25]
TEL/AML fúzió
2
2
2
Jó
19,0
45∼46,X,-X,-20,+1-3mar,dm,ace[8]/46,XX[20]
negatív
2
2
2
Jó
5,4
46,XY[23]
NV
2
2
2
negatív
2
2
2
Eset
Kor (év)/ nem
Prednisolon válasz
Fvs. szám x109L
1.
10/M
Rossz
2.
4/F
3
6/M
4.
4/M
Jó
11,5
54∼58,XY,+6,+8,+9,+10,+11,+15, +17,+18, +21,+21[18]/46,XY[10]
5.
18/M
Jó
47,8
nincs metafázis
negatív
2
2
2
6.
3/M
Jó
29,8
45,XY,-9[20]
negatív
2
2
2
7.
2/M
Rossz
33,9
47,XY,+11[2]/46,XY[15]
negatív
2
2
2
8.
3/M
Jó
8,9
46,XY[20]
negatív
2
2
2
negatív
2
2
2
9.
4/F
Jó
1,7
53∼55,XX,+X,+6,+10,add(14)(q32),+17,+18, +21,+21,+mar1,+mar2[cp19]/46,XX[11]
10.
3/F
-
17,0
46,XX[24]
TEL/AML fúzió
2
2
2
11.
3/F
Jó
3,1
46,XX,del(11)(q23)[5]/46,XX[20]
MLL hasadt
2
2
2
12.
4/F
-
1,1
47,XX,+22[6]/48,idem,+mar[3]/46,XX[33]
negatív
2
2
2
13.
10/M
-
3,4
47,XY,t(14;18)(q32;q21),+mar[2]
NV
2
2
2
14.
4/M
Rossz
2,6
46,XY[26]
NV
2
2
2
47,XY,add(4)(q35),del(6)(q21),t(7;12)(q?;q?), -8,+22,+mar[8]/46,XX[11] 46,XY,t(9;12)(q21;p13)[8]/47,idem,+mar1[3]/ 46,X,-Y,+6[7]/47,XY,+mar2[4]/46,XY[12] 47,XY,t(5;8;14)(q33;q24;q32),+ring[16]/ 48,idem,+mar[2]/46,XY[4]
negatív
2
2
2
TEL/AML fúzió
2
2
2
negatív
2
2
2
15.
6/M
Rossz
16.
4/M
Jó
4,6
17.
11/M
-
151,4
18.
0,3/F
Jó
68,9
46,XX,del(11)(q23)[20]
MLL hasadt
2
2
2
19.
0,4/M
Jó
41,7
46,XY[20]
negatív
2
2
2
20
0,4/M
Jó
1,9
46,XY[25]
NV
2
2
2
21.
1/M
Jó
27,0
46,XY[20]
NV
2
2
2
22.
13/M
Jó
11,4
46,XY[20]
NV
2
2
2
23.
3/M
Jó
2,3
46,XY,del(7)(q21),-14,+mar[5]/46,XY[27]
NV
2
2
2
24.
3/M
Jó
62,7
46,XY,add(2)(q?)[5]/46,XY[20]
NV
2
2
3
25.
3/F
Jó
9,1
46,XX[9]
negatív
2
2
1
17
Eredmények Az elsődleges I-FISH szűrővizsgálat során 25 B-sejtes ALL-ből 2 esetben találtam CRR régiót érintő rendellenességet: egy CRR triszómiát és egy CRR monoszómiát (3. táblázat-24. illetve 25. eset-17. old). E rendellenességek ellenőrzéséhez további hibridizációkat végeztem: 2-2 próbával a 3p és 3q telomerikus régióból (1. és 2. illetve 39. és 40. próba-3. ábra-19. old) és újabb 2 próbával a CER régióból. A 24. esetben valamennyi 3q próbával 3 jelet kaptam a sejtek 20%-ában, ami a CRR régióra nézve triszómiás szubpopuláció jelenlétét igazolta. A 25. esetben 3q monoszómiát jelző egy FISH jel volt látható a sejtek 24%-ában. Ugyanazt a régiót érintő ellentétes irányú változás (deléció az egyik, kromoszóma többlet a másik esetben) nem indokolta további vizsgálatok elvégzését B-sejtes ALL esetekben. A 7 T-sejtes ALL elsődleges szűrővizsgálatával (2. táblázat-16. old) 4 esetben találtam CRR triszómiát. A 3-as kromoszóma ilyen magas arányú érintettsége, a kópiaszám egyirányú változása szükségessé tette a T-sejtes esetek részletes vizsgálatát. Ehhez a vizsgálathoz összesen 42 próbával hibridizáltam (3. ábra-17. old) és a sokpontos I-FISH analízis technikát választottam. A vizsgálattal a 4 T-sejtes ALL-ben teljes 3q kar triszómiát azonosítottam a sejtek 11-18%-ában. Két esetben 3p deléciót találtam a sejtek 19 illetve 34%-ában. Mind a 4 esetben 2 vagy 3 szubpopuláció jelenléte igazolódott (3. ábra-19. old, 7. ábra-20. old). A 4. esetben 3-as kromoszóma hosszú kar triszómiát találtam a sejtek 12%-ában. Az 5. esetben 3 szubpopuláció volt azonosítható: a sejtek ~ 70%-ában a 3-as kromoszóma normál diszómiás, 11%-ában a hármas hosszú kar triszómiás, a sejtek 19%-ában ~12 Mb nagyságú intersticiális deléció látható a 3p12 régióban. A 6. esetben normál diszómiás 3-as kromoszómát azonosítottam a sejtmagok 52%-ában. Mellette 2 kóros szubpopulációt találtam: a 3p12-3p14 régióban egy nagyobb, ~23 Mb nagyságú intersticiális deléciót hordozó szubpopulációt (32%), mely átfedi az 5-ös eset 3p delécióját. A harmadik szubpopuláció (15%) a teljes hármas kromoszómára nézve triszómiás volt. (8. ábra-21. old). A 7. esetben a sejtek 12%-ában 3p21.31-3qter parciális triszómia volt látható. A 3p karon azonosított 5 töréspont egyedi volt. A 3q két töréspontját a pericentrikus régióban azonosítottam. A 4. esetben a 30-as próbával történő hibridizációhoz, a töréspont pontos azonosításához már nem állt rendelkezésre megfelelő számú sejtmag.
18
Eredmények Eset 4
hármas
kromoszóma
2 2 2
2 2 2
2 2 2
2
2
2
2 2
2 2
2 2
2 2 2
2 2 2
3 3 3
2
2
2
2
3
2 2 2 2
2 2 2 2
3 3 3 3
2 2 2 2 2 2 2 2
2 2 2 2 2 2 2 2
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
2 2 2 2 2 2 2 2
2 2 2 3 3 3 3 3
2 2 2
3 3 3
2 2 2
3 3 3
2
2
3
2
3
2 2
2 2
3 3
2 2 2 2 2
2 2 2 2 2
3 3 3 3 3
2 2 2 2 2 2
3 3 3 3 3 3
2
3 12
A
2
2 2
86
ábra.
2
2 2
2 2 2 2
2
2
2 2
3 3
3 3 3 3 3 3 3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2 2 2 2 2 2 2
specifikus
2 2 2 2
2 2 2 2 2 2 2
2 2 2 2 2 2 2
2 2 2 2 2 2 2
2
2
2
2 2 2 2
2 2 2 2
2 2 2 2
2 2
2 1
2 2
2
2
2
2
2
2
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
2
2
3
2
2
3 15
3.
2
2
32
A szubpopulációk %-os aránya
2 2 2 2
1
53
96,28 112,88 123,24 136,64 146,85 158,75 168,84 178,81 188,76 188,69 190,4 191,16 193,47
2 2 2 2
3
11
3q11.2 3q13.2 3q21.1 3q22.2 3q24 3q25.32 3q26.1 3q26.32 3q27.3 3q27.3 3q28 3q28 3q28
2 2 2 2
2
19
BP BP BP BP BP BP BP BP CP BP BP BP BP
2
1
71
RP11-91m15 RP11-79h17 RP11-79m2 RP11-220j13 RP11-88h10 RP11-79a14 RP11-91b7 RP11-91k9 LSI-BCL6 RP11-640p3 RP11-178k17 RP11-54l9 RP11-91m9
2
3
12
30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42
2
2
86
95,32
2
Eset 7
1
95
3p11.1
Eset 3
CP
2
Eset 6
2
97
CEP3
Eset 2
29
2
Eset 5
1
96
1,86 6,78 17,18 23,40 36,35 39,30 44,1 45,39 45,59 45,91 46,24 46,37 46,64 47,92 54,68 58,13 62,44 64,16 67,86 67,86 68,12 71,01 71,46 75,91 83,39 83,50 86,88 89,50
Eset 1
3p26.3 3p26.1 3p24.3 3p24.3 3p24.3 3p22.2 3p21.33 3p21.33 3p21.31 3p21.31 3p21.31 3p21.31 3p21.31 3p21.2 3p14.3 3p14.3 3p14.2 3p14.1 3p14.1 3p14.1 3p14.1 3p13 3p13 3p12.3 3p12.2 3p12.1 3p12.1 3p11.1
CRR
BP BP BP BP BP OS OS OS OS OS OS OS BP OS BP BP BP BP BP BP BP BP BP BP BP BP BP BP
cen
RP11-204c23 RP11-28p14 RP11-80d24 RP11-89f18 RP11-286g5 RP6-11o3 RP6-60a24 RP6-236b8 RP6-33o7 RP6-153f14 RP6-32g23 RP6-108d10 RP11-91p19 RP6-102f2 RP11-89k24 RP11-80h18 RP11-88p20 RP11-179b9 RP11-79c12 RP11-81n13 RP11-89a12 RP11-90h15 RP11-154h23 RP11-89h10 RP11-81d17 RP11-80h24 RP11-81p15 RP11-91a15
CER 1
Próba forrása
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Mb pozició
Régió
FISH próba
Kromoszóma sáv
BAC-PAC
próbákkal
történő
hibridizációjának eredménye a T-sejtes ALL esetekben. A próba neve mellé a negyedik és ötödik oszlopba a megfelelő kromoszóma sávot és Mb pozíciót tüntettem fel. A próba forrása: BP-BACPAC Resources Center; OS-saját klónozás, CP-kommerciális próba; CER-mindig kilökődő régió (common eliminated region), CRR-mindig megmaradó régió (common retained region), cen-centroméra. A különböző szubpopulációkban azonosított FISH jelek számát külön oszlopokban ábrázoltam. A fekete szín kópia szám többletet, a szürke vesztést jelöl. Az üresen hagyott kockáknál nem történt hibridizáció. Az ábra utolsó sora a szubpopulációk százalékos arányát mutatja, melyet a 4. ábra alapján számítottam ki.
19
Eredmények
4.eset .
100% 80% 60%
42
41
40
39
38
37
36
31 32
12
11
10
9
2
1
40% 20% 0%
100% 80%
5.eset
60% 40% 20%
30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 42
1 2 7 8 9 10 11 12 14 18 19 20 21 23 24 26 27
0%
100%
6.eset
80% 60% 40% 20%
37 38 39 42
32 33 35 36
19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
1 2 3 5 9 10 11 12 15 16 17 18
0%
100%
7.eset
80% 60% 40% 20% 0%
7.
ábra.
T-sejtes
ALL
esetek
sokpontos
I-FISH
vizsgálattal
azonosított
szubpopulációi. A kép a különböző próbákkal eltérő számú FISH jeleket (1-szürke, 2fehér, 3-fekete) adó sejtmagok arányát mutatja be. A FISH próbák számozása a 3. ábra alapján történt. 1-28 próbák a p karnak, 30-42 próbák pedig a q karnak felelnek meg. A fekete gömb (29-es próba) a centromérát azonosítja. 20
Eredmények 8. ábra. A T-sejtes ALL (3. ábra-6. eset) dualcolor-FISH vizsgálatának illusztrációja. a) 3 piros-zöld jel az LSIBCL6 dual-color probával
a
3q27
CRR
régiójából. b)
Az
RP11-81n13
(piros) és RP11-89a12 (zöld) BAC próbákkal történt hibridizáció egy dual color piros-zöld jele mindkét próbára vonatkozó deléciót bizonyít. c)
Az
RP11-89h10
(zöld) és RP11-179b9 (piros) BAC próbával történő
hibridizáció
három különböző szubpopulációt azonosított: 3 dual.color jelet mutató triszómiásat, a 3p12-p13 régióra nézve monoszómiásat (1 zöld jel a RP11-89h10 próbával és 2 piros jel a RP11-179b9 próbával) és normális diszómiásat (2 piros-2 zöld jel).
21
Eredmények 4. 2. Az AML esetek hármas kromoszóma vizsgálatának eredménye Az 4. táblázatban (23. old) a vizsgált 28 gyermekkori AML–es beteg klinikai adatait, FAB besorolását és elsődleges citogenetikai eredményét foglaltam össze. Sikeres citogenetikai vizsgálat 27 esetben történt (96%), klonális aberrációt az esetek 67%-ában azonosítottam. A 19 citogenetikai eltérést mutató esetből 8 hiperdiploid (32%), 8 pseudodiploid (28%), 2 hipodiploid (7%) volt. A hiperdiploid esetekben a nyolcas (4 esetben-14%) és a hármas (3 esetben-10%) triszómia volt a leggyakoribb kromoszóma többlet. A betegség diagnosztizálásakor elvégzett rutin citogenetikai vizsgálat során hat esetben azonosítottam a hármas kromoszómával kapcsolatos rendellenességet: ennek fele számbeli eltérés, teljes 3-as kromoszóma triszómia, másik fele q kart érintő szerkezeti rendellenesség volt. A hármas kromoszóma beható, részletes vizsgálatát 84 lokusz- specifikus próba felhasználásával, ”sokpontos” interfázis-FISH technikával végeztem el. A 4. ábra 24. old) a klónok nevét, megabázis (Mb) pozícióját és az interfázis magokban, illetve metafázisokban azonosított FISH jelek számát mutatja. Ezzel a módszerrel hármas kromoszómára vonatkozó eltérést 9 esetben detektáltam. (9. ábra-29. old). A rendellenességek négy csoportba sorolhatók: 1) hármas triszómia – 4 esetben; 2) 3q13-q21 deléció – 1 esetben; 3) 3q26.3-q28 többlet – 1 esetben); 4) 3q21 és/vagy 3q26 lókuszt, RPN1/MDS1-EVI1 géneket érintő szerkezeti rendellenesség - 3 esetben.
22
Eredmények 4. táblázat. A vizsgált AML-es betegek klinikai, hematológiai és citogenetikai adatai a diagnózis felállításakor. A vastag harántvonal a kóros hármas kromoszóma eseteket választja el. 26.*=Női beteg férfi, donor eredetű vérsejtképzéssel. Fvs szám ×109L
FAB csoport
M/13,9
9,7
M4
46,XY[25]
2.
F/2,7
41,9
M4
46,XX,t(11;22)(q23;q11)[19]/47,XX,idem,+mar[3]
3.
M/12, 8
10,0
M2
46,XY[25]
4.
F/2,2
4,3
M3
46,XX,del(22)(q11)[5]/46,XX,idem,add(13)(p13)[3]/46,XX[10]
5.
M/11,2
11,8
M1
46,XY,add(10)p15)[3]/46,XY[26]
6.
M/2,1
9,3
M5
46,XY[20]
7.
F/8,2
38,0
M1
46,XX[24]
8.
F/13,8
39,96
M1
46,XX[10]
9.
M/0,7
10,2
M4
46,XY,t(11;17)(q23;q21)
10.
M/14,1
16,5
M1
48,XY,+19,+22[26]/48,XY,idem,dup(1q)
11.
F/8,o
3,6
M4
47,XX,+8[2]/46,XX[30]
12.
F/17
5,6
M5
46,XX,t(9;11)(p11;q23)[30]
13.
F/12,8
37,8
M1
46,XX[24]
14.
F/12,4
4,0
M1
46,XX[25]
15.
M/12,9
8,4
M4
46,XY,del(9q)[25]/46,XY[5]
16.
F/12,1
11,3
M4
46,XX,inv(16)(p13q22)[26]
17.
F/13,2
11,9
M4
47,XX,+8[29]
18.
M/1
19
F/16,9
4,7
M1
46,XX[25]
M/18
31,2
M4
50,XY,+2,+3,+6,+19[25]
21.
F/1,36
38,5
M5
50,XX,+3,+8,+15,+21[16]/46,XX[10]
22.
F/9,8
14,1
M1
47,XX,del(1q32),+3[6]/46,XX,idem,-7[10]/46,XX[[10]
23.
M/17
0,9
M0
45,XY,der(16)t(16;18)(q11;q11),-18[27]
24.
M/13,4
1,8
M5
46,XY,t(6;11)(q27;q23)[16]/47,XY,idem,+8[3]
25.
F/13,4
116,4
M3
-
26.*
M/17,8
41,3
sAML
27
F/15, 4
23,2
M5
46,XY,t(3;21)(q26;q22)[12]/47,XY,idem,+12[24]
28.
F/8,64
11,8
M4
46,XX,t(3;8))(q21;q24),add(11)(p15),del(22)(q12),mar[18]
Eset
Nem/kor
1.
20
Citogenetikai vizsgálat eredmény
46,XY[25]
45,XY,inv(3)(q21q26),-7[20]
23
Eredmények
4. ábra. Az AML-es betegek 84 BAC-PAC hármas kromoszóma specifikus próbával történő sokpontos I-FISH vizsgálata A hármas oszlopban a próbák megfelelő Mb pozíciója, a négyesben a kromoszóma régiója van megnevezve. A FISH jelek száma a 4. táblázat sorszámozása alapján, minden betegnél külön oszlopban van feltüntetve. A fekete szín a megfelelő kromoszóma régió többletét, a szürke pedig a hiányát jelöli. A kockák közötti vízszintes, vastag vonal a töréspontot jelképezi. A megfelelő próbánál üresen maradt kockák esetében nem történt hibridizáció. Az utolsó vízszintes sor a sejtek FISH jelei alapján kiszámított kóros szubpopulációk %-ban kifejezett nagyságát jelöli.
1 2 3 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Klónok neve RP11204c23 RP11121d3 Rp1191k16 RP1128p14 RP1191k4 RP1157d6 RP1180d24 Rp1179e6 RP1191i6 RP1189f18 RP11286g5 RP1190m23 RP633o7 RP6153f14
Mb
FISH adatok
1
2
3
4
1,87
3p.26
2,13
3p26
4,34
3p26
6,79
3p25.26
9,23
3p25
13,16
3p25
17,19
3p24.3
20,14
3p24
22,91
3p24
23,27
3p24.3
2
2
2
2
2
2
3
3
37,97
3p22
2
2
2
2
2
2
3
3
38,17
3p22
45,59
3p21.31
2
2
2
2
2
2
2
45,91
3p21.31
2
2
2
2
2
2
2
2
5
6
2
7
2
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
2
19
20
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2 2
2
2
2
2 2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
24
25
26
27
28
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
3
2 2
2
2
3
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
2
3
2
3
2
2
2
23
2
2 2
22
2 2
2
21
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
24
3
2
2
Eredmények
14 15 16 17 182 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
Klónok neve RP6123i13 RP632g23 RP6108d10 RP1191p19 RP691p17 RP6102f2 CTD2278f18 RP1189k24 RP1180h18 RP1179k17 RP1188p20 RP1189o2 RP11179b9 RP1179c12 RP1181n13 RP1189a12 RP1190h15 RP11154h23 RP1189h10 RP1179o5 RP1181d17
Mb
FISH adatok
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
46,75
3p21.31
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
46,24
3p21.31
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
46,37
3p21.31
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
46,44
3p21.2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
2
2
2
46,53
3p21.31
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
47,92
3p21.31
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
49,99
3p22
2
2
2
2
2
2
2
54,58
3p21.2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
2
2
2
2
58,02
3p21
2
2
2
2
2
2
3
3
3
2
2
2
2
58,63
3p14
62,33
3p14.3
2
2
2
63,95
3p14
64,06
3p14.1
2
2
67,74
3p12-
2
2
67,75
3p14.1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
68,01
3p14.1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
70,85
3p13
71,34
3p14.1
75,79
3p12.3
76,17
3p12
83,27
3p12
2
2
2
2 2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2 3
3
2 2
2 2
2
3
2
3
3
2
2 2
2
2
3
2
2
2
2 2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3 3
25
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2 3
2
2
2
2
Eredmények
35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
Klónok neve RP1180h24 RP1181p15 RP1191a15* CEP3
Mb
FISH adatok
83,38
1
2
3
4
5
6
7
8
3p12.1
2
86,84
3p12
2
89,4
3p11
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
24
25
2
2
2 3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
RP1191m15 RP1190i19 RP1169n24 RP1112p11 RP1179h17 RP11153k9 RP115k13 RP11214a5 RP1179m2 RP11217p4 RP1195h16 RP1159j16
96,2
3q11.2
105,7
3q13.1
105,9
3q13.1
112,5
3q13.2
112,8
3q13.2
113,9
3q13.2-3
114,2
3q13.2
116,4
3q13.2
123,2
3q13.3
124,3
3q13.3-2
125.3
3q21
128,9
3q21
2
2
RP1179l21 RP11220j13 RP11220-j13 RP11219p10 RP1188h10
133,8
3q22
2
2
136,4
3q22
136,5
3q22
137,4
3q22
146,8
3q24
2
2
2
2
2
2 2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2 2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
3
2
2
2
2 2
2
2
2
2
2
2
2 2
2
2
2
2
2
2
2
2
1
2
2
2
2
3 1
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2 2
2
2
2
2
3 3
2
2
2
2
1
2
2
2
2
2 2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3 3
3
3
2
2
2
2 2
2
2 3
26
2
1
2 2
2
3
2 2
2
2 3
2
3 2
2
3
2 2
2
2
2
2
28
3
3 2
26
3
2 2
27
3
2
2 2
3
2
3
2
2
2
2
2
2
3
3
2 2
2
3 3
2
2
2
23
3
2
2
2
Eredmények
56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66
Klónok neve RP11229g6 RP11145f16 RP1179a14 RP1189f24 RP1191l9 RP11209h21 RP1191-f17 RP11264d7 RP11449b7 RP1191b7 RP1124l16
Mb
FISH adatok
150,0
3q24
151,3
3q24
158,7
3q25
158,8
3q25
159,4
3q25
160,5
3q24-25
167,4
3q25
168,5
3q26.1
168,6
3q26.2
168,9
3q26.1
169,6
3q26.2
1
2
2
2
2
2
2
12
13
14
15
16
17
19
20
2
2
2
2
2
2
2
2
21
2
2
2
2
2
22
3 2
23
24
25
3
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3 3
171,5
3q26.2
178,8
3q26.3
180,7
3q26.3
180.8
3q26.3-2
186,0
3q27
188,6
3q27
2
2
188,7
3q27.3
2
2
189,8
3q28
3 3
2
2
3
3
2 2
2
2
2
3
3
2
2 2
2
2
2
2
2 2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3 2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
27
2
2
2
2 2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
4
2
2 2
2
2
2
3
3 2
2
2
3 2
28
3
2
2
27
3
2
2 2
3
2
2
2
3
2
2
2
26
3 3
2
2
18
2
2
2
11
2
3q26.2
76
2
10
2
170,7
75
2
9
2
RP1179o17 RP11151p12 RP1191k9 RP1189b3 RP11118F4 RP1179k10 RP1188p6 RP11640p3 Rp1167e18
74
8
2
68
73
7
2
3q26.1
72
6
2
170,3
71
5
2
RP11141c22
70
4
2
67
69
3
3
3 3 3
3
2 2
2
3
2
4
2
2
2
3
2
4
2
2
2
Eredmények
77 78 79 80 82 83 84
Klónok neve RP11178k17 RP1153d15 RP1154l9 RP1188h6 RRP1188m1 RP1191m9 RP11233n20
Mb
FISH adatok
1
2
3
4
5
6
7
8
2
2
2
2
2
2
9
190,4
3q28
191,0
3q28
11
12
13
14
15
16
17
18
191,2
3q28
2
2
192,4
3q28
2
2
193,0
3q28
193,5
3q28
198,4
3q29
19
2 2
2 2
10
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
20
21
3
3
22
2
2
23
24
25
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
A szubpopulációk %-os aránya
28
28
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
91
94
3 3
2
27
3
2 2
26
3
3
75
15
3 12
30
22
92
90
Eredmények
Deléció-4%
Teljes triszómia-14% 3q transzlokáció14%
Duplikáció-4% A hármas kromoszómára nézve normális esetek-64%
9. ábra. A hármas kromoszóma rendellenességek gyakorisága a vizsgált 28 AML esetben.
29
Eredmények 4. 2. 1. Hármas kromoszóma triszómiás esetek A 4. táblázat (23. old) 20., 21. és 22. eseteiben, hagyományos citogenetikai vizsgálattal a sejtek 60-100%-ában kimutatott hármas kromoszóma triszómiáját az IFISH vizsgálat is igazolta. (4. és 10. A ábra -24, 31 old). A hármas triszómia egyetlen esetben sem volt egyedüli anomália (4. táblázat-23. old). A 20. és a 21. esetben a modális kromoszóma szám 50 volt, 2-es, 6-os, 19-es illetve 8-as, 15-ös, 21-es volt a társult triszómia. A 22. esetben, a hármas triszómia del(1)(q32)-vel és egy szubklónban 7-es monoszómiával társult. A 23. esetben standard citogenetikai módszerrel az összes értékelt
metafázisban
18-as
monoszómia
mellett
egy
kiegyensúlyozatlan
der(16)t(16;18)(q11;q11) transzlokáció volt kimutatható és csak az I-FISH vizsgálattal detektáltam a magok 12%-ában hármas triszómiát. 4. 2. 2. 3q13-q21 deléció A 4. táblázat (23. old) 24. betegében a hármas kromoszóma hosszú karján egy megközelítőleg 10 Mb nagyságú deléciót azonosítottam 105,7 és 125,3 Mb között. Az e régióba eső RP11-12p11, RP11-153k9, RP11-214a5 és RP11-217p4 próbákkal egy hibridizációs jelet kaptam az interfázisban lévő magok 20%-ában (4. ábra-24. old.). A deléció töréspontja a 3q21 régióban, a Ribophorin I (RPN1) gén közvetlen szomszédságában található, de nem érintette a gént. 4. 2. 3. 3q26.3-q28 tetraszómia A 25. betegben (4. táblázat-23. old) mintegy 9 Mb hosszúságú 3q26.3-q28 szegmentális tetraszómiát azonosítottam a sejtek 92%-ában, a 186,04 - 189,83 Mb között, az RP11-79k10 és RP11-67e18 próbákkal. Az I-FISH mintázat alapján az feltételezhető, hogy a tetraszómia izodiszómiának felel meg. (10. D ábra-31. old). Az említett 3q26.3-q28 próbák normális diszómiás mintázatot (két piros-zöld jel) eredményeztek az összes többi e próbákkal vizsgált esetben (4. táblázat, 10. B ábra23. 31. old). A többi hármas kromoszóma próbával történt FISH vizsgálat ennél a páciensnél normális, diszómiás jeleket eredményezett (10. C ábra-31. old).
30
Eredmények
10. ábra.
Az AML
esetek hármas kromoszóma FISH vizsgálatának
illusztrációja
(szövegmagyarázat következő oldalon).
31
a
Eredmények Az AML esetek hármas kromoszóma FISH vizsgálatának illusztrációja (10. ábraelőző oldalon). A.
BCL6 specifikus próba a 20. AML esetben (4. táblázat) hármas triszómiát igazolt
(3 piros-zöld jel 2 sejtmagban). B.
A 26. esetben a 3q27-28-as próbák normális diszómiás mintázatot mutatnak (2
piros-zöld jel mindhárom sejtmagban). C.
A 3q13 próbák normális diszómiás mintázatot mutatnak a 25. esetben (2 piros-
zöld jel mindhárom sejtmagban). D.
A 25. esetben a 3q27-28-as próbák mindkét jel duplikációját jelzik (2 dupla
piros-zöld jel a magok többségében). E.
Az EVI1 gént körülvevő 3q26 próbákkal történő hibridizáció hasadt zöld jele a
t(3;21)-es transzlokáció töréspontját azonosítja a 27-es számú betegnél. A sárga nyíl a normális hármas kromoszóma piros-zöld jelét mutatja. A piros nyíl a derivátum hármas kromoszómán a normális piros és „kicsiny” zöld jelét, a zöld nyíl a derivátum 21-es kromoszómán látható zöld jelet jelzi. Balra a négy interfázis mag ugyanazt a töréspontot illusztrálja: három szín csatornán, piros és zöld csatornán, kék és zöld illetve kék és piros csatornán. F.
A 27. esetnél TEL/AML1 próbával történő hibridizáció az AML1 lokuszon belüli
transzlokációt igazolja. A normális 21-es kromoszómán egy nagy piros jel látható (piros nyíl); a két kisebbre hasadt második piros jel a derivátum hármas és 21-es kromoszómán látható (sárga nyíl); a két normális 12-es kromoszómán a két zöld TEL gén látható. Ugyanaz a jelmintázat látható az interfázis magon is, azzal a különbséggel, hogy a három zöld jel a beteg 12-es triszómiás szubklónját is igazolja. G.
A TEL/AML1 és EVI1 specifikus próba (RP11-141c22) kombinációja az
AML1/EVI1 fúziót igazolja (sárga nyíl). H.
A 26. számú betegnél az EVI1 gént körülvevő 3q26 próbákkal történő
hibridizáció a piros és zöld jelek közötti megnövekedett távolsággal a 3q inverzió EVI1 génhez közeli töréspontját azonosítja (bal oldali sejtmag) összehasonlítva a normális mintázatú jobb oldali sejtmaggal. I.
A töréspont az EVI1 gén centromérához közeli részén található mivel, mivel az
EVI1 specifikus (RP11-141c22) próba és a telomerikus RP11-151p12 próba együttes hibridizációja nem eredményezett távol eső jeleket. J.
Az RPN1 gént körülvevő 3q21 próbákkal történő hibridizáció piros és zöld
jeleinek eltávolodása ebbe a régióba eső töréspontra utal. 32
Eredmények 4. 2. 4. A hármas kromoszóma szerkezeti rendellenességei Hármas kromoszómával kapcsolatos szerkezeti rendellenességeket a 4. táblázat (23. old) 26., 27. és 28. eseteiben azonosítottam. Ezek a következők: inv(3)(q21q26); 26. PÁCIENS
der(3)inv3(q21q26) 11. ábra. A 3q szerkezeti rendellenességet mutató három
27. PÁCIENS
AML eset parciális kariotípusa. A 26. eset: paracentrikus inverzió. A 27. és 28. eset: 3q26;21q22 valamint 3q21;8q24 töréspontokat érintő transzlokáció. Az esetek számozása
der(3)t(3;21)(q26;q22)
táblázatéval. átrendeződött
28. PÁCIENS
megegyezik A
nyíllal
a
4.
jelölt,
kromoszómák
mellett a normális homológ párjuk látható.
der(3)t(3;8)(q21;q24)
33
Eredmények t(3;21)(q26;q22) és t(3;8)(q21;q24). Ezen rendellenességek részleges kariotípusa a 11. ábrán (33. old) látható. inv(3)(q21q26) A 26. esetben a sokpontos I-FISH vizsgálat a 3q21-ben és 3q26-ban 1-1 intersticiális töréspontot azonosított, mely a citogenetikailag feltételezett paracentrikus inverziót igazolta. Az RPN1 gént körbefogó RP11-59j16 (piros) és RP11-79l21 (zöld) klónpár piros és zöld jelei közti nagy távolság az interfázis magok nagy részében, 3q21 töréspontra utal (10. J ábra - 31. old). Az EVI1 (ecotropic virus integration site-1) gént körülvevő RP11-24l16 (piros) és RP11-79o17 (zöld) próbák segítségével azonosítottam a 3q26-ban, az EVI1 génhez közeli töréspontot. Összehasonlítva egy normális eset ugyanazon próbákkal végzett FISH mintázatával a két próba közti távolság jelentősen megnövekedett az interfázisban lévő magok többségében (10. H ábra - 31. old). A töréspont az EVI1 gén centroméra felé eső végén található, mivel az EVI1 specifikus próba (RP11-141c22-zöld) és a hozzá közeli, telomerikus RP11-151p12 (piros) próba együttes hibridizációjának FISH mintázata egymáshoz nagyon közeli vagy átfedő jeleket eredményezett (10. I ábra - 31. old). A 3-as kromoszóma q kar átrendeződését inv(3)(q21q26)-ként értelmeztem az RP11-59j16 (piros) és RP11-79l21 (zöld) szomszédos klónpár (169,61-170,72 Mb) FISH jeleinek látványos eltávolodása valamint a G-sáv mintázat alapján (11. ábra-33. old). t(3;21)(q26;q22) A 27. (4. táblázat-23. old) betegnél t(3;21)(q26;q22) hordozó alapklónnak volt egy 12-es triszómiás szubklónja is. A 3q26 régió töréspontjának meghatározásához a 4. ábrán (24. old) látható klónokat használtam fel és a transzlokációs töréspontot RP11-79o17 klónon belül azonosítottam. A RP11-79o17 klónt csak részben szekvenálták és megközelítőleg 170,8 Mb magasságban lokalizálták. Az RP11 vektor alapú BAC klónok méretét átlagolva egy 250 kb nagyságot kaptak, ennél fogva e klónon belüli törés az EVI1/MDS1 transzkriptum törését jelentheti, amely 200 kilobázisra található a centroméra irányában. A BAC klón jelek a klón centroméra felé eső végén törtek el, ami az MDS1/EVI1 poziciójának felel meg igazolva a transzkriptum törését. Annak bizonyítására, hogy az EVI1 gén lehetséges fúziós partnere az AML1 gén, mely a 21-es kromoszómán található és gyakran vesz részt fúziós fehérjék (pl a TEL/AML1) képzésében, a zöld fluorescens színnel jelölt RP11-141c22 EVI1 gén lókusz specifikus próba és a TEL/AML1 dual-color gyári próba kombinációját használtam. A TEL/AML1 34
Eredmények próba AML1 génje piros, a translocation ets leukemia-TEL része zöld spektrumú fluorescens festékkel volt jelölve. Kontrollként a TEL/AML1 dual-color/t(12;21) próbát külön is hibridizáltam és ez nem eredményezett egyetlen fúziós jelet sem. (10. F ábra- 31. old). Az I-FISH képek alapján a jelek a klón centromérához közelebbi részén „törtek el.” (10 E ábra- -31. old). Az EVI1 gént képviselő, zöld fluoreszcens jelölésű RP11-141C22 klón és a TEL/AML1 próba (melyben a 21-es kromoszóma AML1 génje piros) egyidejű hibridizációjával kimutattam az AML1/EVI1 fúziós gént (10. G ábra- -31. old). Az AML1 próba az egész gént, a töréspont mindkét oldaláról átfogja. A normális 21-es kromoszóma AML1 génje nagy piros jelt adott, a második piros jel „eltört” két kisebbre, egyik a derivátum hármason, másik a derivátum 21-esen látható. (10. F ábra- -31. old). Az EVI1/MDS1 génen belül elhelyezkedő RP11-141c22 klónnal hibridizálva apró addicionális jel látható néhány interfázisban lévő magban (10 G ábra- -31. old), mely szintén az EVI1/MDS1 transzkriptum törésére utal. t(3;8)(q21;q24) A 4. táblázat (23. old) 28-as számú betegénél az osztódó sejtek 90%-ban t(3;8)(q21;q24) transzlokációt mutattam ki. A transzlokáció azonosítása a hagyományos citogenetika metafázis elemzésével történt (11. ábra -28. páciens-33. old), mivel a töréspontok meghatározására alkalmas multipoint –FISH vizsgálathoz nem állt rendelkezésre elegendő sejtszuszpenzió. 4. 3. A CML-es eset hármas kromoszóma vizsgálatának eredménye 4. 3. 1. Hagyományos citogenetikai, Dual-color és Multicolor-FISH vizsgálatok eredményei. A CML-es betegünk standard G-sáv- és modern citogenetikai vizsgálatai mozaikszerű eredményeinek összerakásából 4 kóros klón jelenléte igazolódott (12. A ábra - 36. old): #1: 46,XY,t(9;14;22)(q34;q32,q11) #2: 46,idem,der(20)t(17;20)(q11;q13) #3: 46,XY,der(14)t(9;14;22)(q34;q32;q11)t(17;22)(q11;q13) #4: 46,idem,der(3)dup(3;3)(q?;q?). 35
Eredmények
12. ábra: A CML-es beteg 4 kóros klónjának azonosítása. A.
Parciális
páciens
kariotípus.
komplex
A
variáns
transzlokációjából és szekundér rendellenességeiből aberráns
származó
kromoszómák.
Középen
látható
valamennyi
körben
metafázisban
azonosított der(22), Philadelphia
9
kromoszóma és a normál G-sáv mintázatú
der(22)
9-es
kromoszóma,
alatta és fölötte a 4 különböző klónra
jellemző
derivátum
kromoszómák láthatók.
Valamennyi metafázisban jelen volt a BCR-ABL fúzióból származó kóros 22-es, Ph kromoszóma. Az ABL-BCR reciprok fúziós szegmens viszont a megszokott helyéről, a 9q34-ről a 14-es kromoszóma hosszú karjára transzlokálódott. Ezenkivül egy 17q11-qter szegmens vagy a 20-as kromoszóma q karjának a terminális végéhez (#2 sejtvonalban) vagy a der(14)-hez (#3 sejtvonalban) kapcsolódott és létrehozott egy kiegyensúlyozatlan „ugráló szegment transzlokációt” („unbalanced segmental jumping translocation” -SJT) (59) (12. B ábra -38. old). A negyedik klónban (#4) előforduló 3q átrenendeződésről a fenti citogenetikai módszerek segítségével csak az igazolódott, hogy a 3q többlet 3-as kromoszóma eredetű.
36
Eredmények
B 12. ábra. B. Multicolor-FISH vizsgálat eredménye. A vizsgálattal a különböző klónokra jellemző derivátum kromoszómák transzlokációs partnereit azonosítottam. Fent a kromoszómák jelölésének sémáját ábrázoltam, középen különböző színcsatornán kinagyítva, alul a multicolor metafázisokba ágyazva a klónokra jellemző derivátum kromoszómák láthatók.
37
Eredmények 4. 3. 2. „Sokpontos” I-FISH vizsgálat eredménye „Sokpontos” I–FISH vizsgálattal a citogenetikailag észlelt 3-as q kar szerkezeti rendellenességét és annak töréspontjait azonosítottam. A CEP3 centroméra próbával elvégzett FISH vizsgálat a 3-as kromoszómára nézve normális, diploid sejtmagokat mutatott. Az 5. ábra (39. old) a vizsgálathoz használt klónok nevét, Mb- és FISH pozicióját szemlélteti, valamint azt, hogy bizonyos klónpárokkal elvégzett in situ hibridizációval, milyen számú FISH jelet kaptunk sejtmagonként: a szürke mezőkben a 3 jel a megfelelő klónra vonatkozó triszómiát, a fehéren maradt kockák normális diploid sejtmagokat jelölnek. A sokpontos I-FISH vizsgálattal a 3q21-ben (RP11-59j16 -piros és RP11-79l21-zöld próbákkal) és a 3q26-ban (RP11-24L16 -piros és RP11-79O17-zöld próbákkal) 1-1 intersticiális töréspontot azonosítottam, mely a citogenetikailag feltételezett paracentrikus inverziót igazolta. Ezek a töréspontok megegyeznek az inv(3)(q21q26) inverziót mutató AML-es eset töréspontjaival (4. táblázat-26.eset; 10. H, J ábra- 23., 31. old). Az I-FISH vizsgálattal az inverzió mellett, a citogenetikai vizsgálat alapján feltételezett, 3q kar részleges duplikációját is kimutattam. A 3q kar triszómiáját az RP11-79l21 és RP11-24l16 valamint az RP11-79o17 és RP11-67e18 klónok közti szegmensekre bizonyítottam (5. ábra-39. old; 13. ábra-38. old).
A
B
C
D
E
13. ábra: A CML-es beteg 3q duplikációjának FISH vizsgálata. G-sáv mintázat (A) által sugallt 3q duplikáció az RP11-209h21 (piros) és RP11-91f17 (zöld) próbákkal metafázisban (B) és interfázisban (C) is igazolódott. D. Az EVI1gént körülvevő 3q26 FISH próbákkal (RP11-24116 és RP11-79o17) történő hibridizáció 3-3 piros-zöld jele e klónokra vonatkozó triszómiát jelöl. Az egyik egymást átfedő zöld-piros jel a normál 3-as kromoszómáról, a másik a (3)(q21q28) duplikációból származik. A harmadik zöld-piros pár közti nagy távolság az EVI1 génhez közeli inverziós töréspontot igazol. E. A 3q28 régió piros- zöld klónpárjával történő hibridizáció a duplikációs töréspontot jelöli (3 piros és 2 zöld jel). 38
Eredmények
Klónok CEP3 RP11- RP11- RP11- RP11- RP11- RP1112p11
Mb pozició FISH pozició Jelek száma 2 Érintett gének
79h17
214a5
112,54 112,83 116,4
59j16
79l21
RP11209h21 91f17
128,99 133,85 160,52
RP1124l16
RP11- RP11141c22 79o17
RP11- RP11151p12 91k9
167,46 169,61 170,32 170,72 171,56
3q13.2 3q13.2 3q13.2 3q21
3q22
3q24-25 3q25
3q26.2 3q26.1 3q26.2 3q26.2
2
3
3
3
2
2
3
3
Ribophorin -4,087bp 129,611-129,615
2
3
3
RP1179k10
RP1167e18
RP1154l9
RP1188h6
178,89 186,04 189,83 191,24 192,41 3q26.3 3q27
3q28
3q28
3q28
3
3
2
2
3
EVI1-164,229bp 170,122-170,186
Inszerció (3;3)(q21;q21q26)
Inszerció (3;3)(q26;q26q28)
Inverzió (3)(q21q26) 5. ábra. A hármas kromoszóma sokpontos I-FISH vizsgálata a CML-es betegnél. Az első vízszintes sor a 3-as kromoszóma sokpontonos I-FISH vizsgálatára használt 3-as centroméra (CEP3) illetve a16 BACPAC próba nevét, a második a megabázis (Mb), a harmadik a FISH- pozicióját, a negyedik sor a hibridizációs jeleinek a számát nevezi meg. A gömbbel végződő vastag vonal 3q duplikációt, a nyíllal végződő vastagabb vonal pedig 3q inverziót jelöl.
39
Eredmények
Valószínű, hogy az inv(3)(q21q26) kialakulását egy másik átrendeződés, a dup(3)(q21q28) régió duplikációja követte. Az inverzió során az EVI1 gént tartalmazó és az RP11-141c22-klónnal azonosítható 3q26 szegmens a 3q21 régióval lett szomszédos és a tőle lefelé, telomérikusan elhelyezkedő régió duplikálódott a 3q21-3q28 között (5. ábra-39. old).
40
Megbeszélés 5. Megbeszélés 5. 1. Az eliminációs teszt értékelése akut gyermekkori leukémiában: 3p deléció, 3q többlet, teljes 3-as triszómia. Az Et hipotézisének tesztelésére az akut leukémia kiválóan alkalmas. Egyrészt a hármas kromoszómát részletesen nem tanulmányozták ebben a betegségben, mivel a hármas kromoszóma aberrációk nem jellemzőek ebben a malignitásban. Másrészt, az eddigi irodalmi adatok leginkább a hagyományos citogenetikára támaszkodó évtizedek eredményeit összegzik és ezzel a nagyfelbontású metodikával a kisebb elváltozások rejtve maradhattak. A sávtechnikák segítségével azonosított legkisebb érzékelhető eltérés is több megabázist érint, míg FISH technikával a kilobázis nagyságrendű eltérések is detektálhatók. Hogy elkerüljem az in vitro sejttenyésztés hátrányait (csak az osztódó sejtek értékelésének lehetőségét vagy a normál sejtek esetleges szelektálódását), interfázis FISH (I-FISH) technikát választottam. Ez gyors és érzékeny módszer (60, 61, 62), mely lehetővé teszi az osztódó és a nem-osztódó sejtek egyidejű értékelését és ezáltal teljes kép feltérképezését a normális és kóros sejtfrakciókról, ezek arányairól. Bizonyos rendellenességek feltárása, mint pl. a kisebb szubpopulációk azonosítása, csak olyan jól megválasztott metodikával lehetséges, mint éppen a sokpontos I-FISH vizsgálat. A G-sáv technika és a multiplex-FISH (M-FISH) azért nem alkalmas, mert általában nem áll rendelkezésre megfelelő számú metafázis a kisebb sejtfrakciók klonális jelenlétének bizonyításához (63). A hagyományos citogenetikai elemzés során egy metafázisban azonosított hármas triszómiát, monoszómiát, deléciót könnyen preparálási vagy kiszórási technikai hibának tekinthetünk. Ugyanakkor a G-sáv technika és az M-FISH nem elég érzékeny kisebb mikrodeléciók detektálásához. Más, a tumor teljes DNSének analízisére épülő módszerek esetében, mint pl. a CGH, microarray vagy LOH, a kisebb sejtpopulációk rendellenességeit a nagyobb 3-as kromoszóma diszómiás sejtpopuláció mintegy elfedi, maszkírozza, vagy az ellentétes irányú változások kiegyenlítik egymást (63). Az I-FISH metodika másik előnye az, hogy alkalmas transzlokációs vagy deléciós töréspontok meghatározására. Ugyanakkor a FISH alkalmazásakor figyelembe kell venni a technika korlátait is: nem az egész kariotípusról kapunk információt, hanem csak célkérdésekre célválaszokat, a kromoszómák közti aberrációk azonosításához elméleti és/vagy előzetes kariotipizálásból származó információk szükségesek (63, 64).
41
Megbeszélés Az Et eredményét, a 3p kar CER régióiban található, a tumor fejlődését gátló gének delécióját, illetve a hármas hosszú kar CRR régiójában található, a tumor növekedését pozitív irányban befolyásoló gének esetleges többletét összesen 60 gyermekkori akut leukémiában ellenőriztem: 32 ALL-ben (25 B-sejtes és 7 T-sejtes ALL-ben) és 28 AML-ben. I-FISH vizsgálataim a 25 B sejtes ALL-ben a CER régió vesztését, illetve a CRR régió kópiaszám növekedését nem mutatták ki. Az analizált 7 T-sejtes ALL-ből kettőben 3p deléciót és 4-ben CRR régiót érintő duplikációt találtam. A T-sejtes ALL 3p deléciói nem érintették az Et következetesen elvesző CER1 és CER2 régióját. A két T sejtes ALL esetben a két egymást átfedő intersticiális deléciót a 3p12p13-as régióban azonosítottam. A deléció (3. ábra-5. és 6. eset-19. old.) helye megfelel egy ismert, feltételezett tumor szuppresszor gén helyének. Rabbits és mtsai (65) a D3S3 marker körül, a 3p12-p13 régióban egy homozigóta deléciót azonosítottak kissejtes tüdő karcinóma (SCLC) U20U20 nevű sejtvonalban. A méretét 4-8 Mb-ra becsülték. (66, 67). A későbbiekben ugyanaz a munkacsoport még két új, egymást átfedő homozigóta deléciót talált emlő- és tüdő tumor biopsziás mintáiban (68). A deléciók által megszakított, feltételezett tumor szuppresszor gént klónozták és elnevezték „Deleted in–U-Twenty-Twenty”, DUTT1 génnek (69). A gén homológ az ecetmuslica Roundabout (ROBO1) nevű génjével (70). LOH vizsgálatokkal a munkacsoport igazolta, hogy a 3p deléció megelőzi a p53 mutációját premalignus bronchiális léziók esetében (71). A 7 T-sejtes ALL-ből négyben CRR régiót érintő triszómiát találtam. Ezek a triszómiák viszonylag kis sejtpopulációban (11-15%) fordultak elő és a hosszú kart vagy az egész hármas kromoszómát érintették. Két esetben a töréspontot a 3q pericentromérikus régiójában térképeztem. A centromérához közeli régió evolucionárisan is gyakori töréspont, genetikai instabiliáshoz vezető szekvencia átrendeződési hely (72). A harmadik, triszómiás töréspontot a 3p21.2 régióban azonosítottam. Ezt a töréspontot néhány felnőttkori és gyermekkori ALL esetben már leírták (11, 73). A 14. ábra (43. old) a hármas kromoszóma szempontjából kórosnak talált 4 T-sejtes ALL esetet összegzi. A kromoszóma átrendeződések a valóságban sokkal komplexebbek lehettek, mint ahogyan azt az idiogramon ábrázolni lehetett. Az alkalmazott sokpontos I-FISH metodika
42
Megbeszélés nem volt alkalmas a transzlokációk feltérképezésére. M-FISH vizsgálathoz nagyobb számú metafázisra lett volna szükség.
14. ábra. Az eliminációs teszt sokpontos I-FISH vizsgálati eredményének sematikus megjelenítése T-sejtes ALL-ben. Ez egy képzeletbeli idiogram, a valóságban a deletált hármas kromoszómák más kromoszómákkal történő komplex transzlokációk részesei is lehetnek. A Mb pozíciók és a felhasznált próbák hibridizációs lokuszai az ábra bal oldalán vannak feltüntetve. A mindig kilöködő (common eliminated region) CER régió, a mindig megmaradó (common retained region) CRR régió és DUTT1/ROBO1 tumor szuppresszor gént tartalmazó U2020 homozigóta deléciós régió a kép jobb oldalán látható. A viszonylag kisebb (11-32%) kóros populációk mellett egy nagyobb (53-86%) normális hármas kromoszómát tartalmazó diszómiás populáció is jelen van. (Az ábrát a „Deletions in he DUTT1/ROBO1 tumor suppressor gene region at 3p12-p13 and 3q trisomy in childhood T-cell-lineage ALL” című cikkemből vettem át).
43
Megbeszélés A T-ALL esetekben 3p12-p14 deléciós szubpopulációkat 3q triszómiás szubpopulációk és normális diszómiás populációk mellett találtam. Az eredményeim, egymástól független, kóros hármas kromoszóma szubpopulációk kialakulását igazolják ugyanabban a tumorban. Feltételezhető, hogy a kisebb szubpopulációk a tumor divergenciája következtében alakultak ki. A kisebb szubpopulációk összefüggése a tumor kialakulásával és progressziójával kellőképpen még nincs tisztázva. A szubpopulációk szerepének tisztázáshoz további, nagyobb esetszámot átfogó vizsgálatok szükségesek. A vizsgált viszonylag alacsony T-sejtes ALL esetszám csak korlátolt klinikai következtetésre ad lehetőséget. A négy 3q többletet hordozó beteg átlag életkora jóval magasabb volt (11-14 év), mint a többi T-sejtes ALL betegé (0, 2-7 év). A 3q többlet rossz prognózissal társult, a négy beteg közül hármat a diagnózis után 1,6-12 hónappal elveszítettünk. Az elemzett 28 gyermekkori AML-ben 3p deléciót nem találtam. A hagyományos citogenetikára épülő nagy összefoglaló tanulmányok alapján a 3p deléció incidenciája 1-1,2% a felnőttkori AML-ben. Johansson és mtsai (23) 6260 esetből 76-ban, Mauritzon és mtsai (39) 5098 AML esetből 50-ben találtak 3p deléciót. Gyermekkori AML esetekben ennél is alacsonyabb az előfordulási gyakorisága (0,71%), Raimondi és mtsai (40) 280 gyermekkori AML-ből csak 2-ben talált 3p deléciót. A 28 AML esetből CRR régiót érintő kromoszóma többlet 5 esetben fordult elő. Négy betegnél teljes hármas triszómiát, egynél 3q26.3-q28 tetraszómiát azonosítottam. A hármas triszómia a 8-as triszómia után a második leggyakoribb rendellenesség volt. A Mitelman adatbázis valamint magas esetszámot átfogó összefoglaló tanulmányok alapján (11, 41) AML-ben legismertebb triszómiák gyakorisági sorrendben a következők: +8, +21, +19 és + 4. Saját eredményeim és az irodalmi adatok közti eltérés esetleg a kromoszóma rendellenességek földrajzi különbözőségével, etnikai és környezeti tényezők genetikai aberrációkra gyakorolt hatásával magyarázható (74, 75). A viszonylag alacsony esetszám is hozzájárulhatott az eredmények eltérő értékeihez. Habár klinikai jellemzőit tekintve ez a citogenetikai csoport heterogénnek bizonyult (4. táblázat-20., 21., 22., 23. eset-23. old), a kezelés eredményessége szempontjából -egy kivételével- mindegyik sikeres volt. Három esetben teljes remissziót értünk el, a betegek ez idáig nem jutottak relapszusba. A 4. táblázat 22. számú betegénél, ahol a hármas triszómia 7-es 44
Megbeszélés monoszómiával társult, a beteget nem sikerült remisszióba hozni. Az alapbetegség stagnálása, a kezelés szövődményei (aszpergillózis, súlyos bakteriális infekciók) következtében a beteget hat hónap után elveszítettük. 3q26.3-q28 tetraszómiát egy AML esetben azonosítottam (4. táblázat-25. eset-23. old). Valószínű, hogy a tetraszómia az említett régió duplikációjával majd a kóros hármas megkettőződésével és a normális hármas kromoszóma deléciójával keletkezett (izodiszómia). A hármas hosszú kar AML-ben történő isodiszómiájára egyetlen irodalmi adatot találtam. Walter és mtsai ugyanazon töréspontokat érintő, mindkét homológ 3-as kromoszóma inverzióját írták le egy felnőttkori AML esetben (76). A 3q isodiszómiás eset akut promielocitás leukémia AML-M3 variáns (mikrogranuláris forma) FAB besorolást kapta. A t(15;17) transzlokáció specifikus próba PML/RARA fúziós gént mutatott ki. A betegség klinikai manifesztációja rendkívül súlyos volt, extrém magas fehérvérsejtszámmal, gastrointestinális vérzéssel. A beteget agyállományban történő vérzés miatt, az indukciós terápia alatt veszítettük el. Az isodiszómia prognosztikai hatását csak egy hosszabb idejű remisszó elérése esetén tudtuk volna követni. Tönnies és mtársai (77) 35 Fanconi anémiás betegből 18-ban 3q26-q29 triszómiát vagy tetraszómiát azonosítottak; MDS vagy AML kialakulásának rizikója szignifikánsabban magasabb volt a 3q többletet hordozó betegcsoportban. Nagyszámú esetet értékelő citogenetikai tanulmányok alapján gyermekkori AML-ben a 3q többlet ritkán fordul elő (11, 41). Részleges 3q triszómiát (3q13→3qter és 3q21→3qter) juvenilis mielomonocitás leukémiában azonosítottak (78, 79, 80). Érdekes módon a 3q tetraszómiás AML-es beteg (4. táblázat-25. eset-23. old) is morfológiailag monocitoid differenciálódást mutatott. A korábbi monokromoszóma hibrid sejteken alapuló „eliminációs teszt” azt igazolta, hogy szövettípustól és fajhatároktól függetlenül bizonyos 3q26-qter régió (CRR) mindig megmarad a sejtekben – miközben a hármas rövid kar bizonyos régiói (CER1, CER2 és FER) rendszeresen elvesznek. Hasonló eredmények igazolódtak CGH-vizsgálattal különböző szolid tumorokban (14, 81, 82), köpenysejtes limfómában (83, 84), CD-5-pozitiv diffúz nagy B-sejtes limfómában (85). Marginális zóna B-sejtes limfómában az említett 3q szegment többlete egyike a leggyakoribb klonális elváltozásnak (86).
45
Megbeszélés A 3q többlete, az általam vizsgált CRR régióval méhnyakrákban (87), a fej és a nyak laphámsejtes karcinómáiban (88) rossz prognózissal társul. A 3q25 és a 3q27-q29 többlet köpenysejtes limfómában szignikánsan rövidebb túléléssel asszociálódott (84). E régió kópiaszám növekedése olyan (onko) génekkel állhat összefüggésben, amelyek nem szövetspecifikusak, hanem általában a tumor iniciációban és progresszióban játszanak szerepet (9). A 3q26-3q28 régióban több feltételezett onkogént térképeztek: 1)
Az EVI1 gént, melynek szokatlan aktivációja MDS-t, mieloid leukémiát indukál
(89, 90). Az EVI1 onkogén egy többfunkciós transzkripciós faktor, mely a csontvelői őssejtek
differenciálódásában
szerepet
játszó
transzkripciós
coaktivátorokkal
és
corepresszorokkal van kölcsönhatásban (89, 91, 92). Az EVI1 gén a 3q26 töréspontot érintő átrendeződés nélkül is fokozott expressziót mutat az AML esetek 14-30%-ában (93, 94, 95). Az EVI1 gén fokozott expresszióját független prognosztikai tényezőként tartják számon és rövid túléléssel hozzák összefüggésbe (96). 2)
Az apoptózist indukáló tumornekrózis –faktor géncsaládot (TNFSF10 -tumor
necrosis factor ligand superfamily member 10) (97). 3)
A humán telomeráz RNS gént (TERC/hTR- human telomerase RNA gene), mely a
legtöbb szolid tumorban fokozott expressziót mutat, amplifikációját 4 különböző szolid tumorban detektálták (98, 99). 4)
A limfómákban gyakran átrendeződő BCL6/LAZ3 (Lymphoma Associated Zinc
finger on Chromosome 3) protoonkogént, mely szekvencia specifikus transzkripciós represszor funkciójú fehérjét kódol, melynek az apoptózis (alul)szabályozásában is szerepe van. (100, 101, 102). 5)
Az LPP (Lipoma Preferred Partner) nevű gén az MLL gén transzlokációs partnereként
ismert AML-M5 -ben (103). Az AML-lel kapcsolatos tanulmányokban a 3p deléciót, a 3q többletet az esetek nagy részében más anomáliák mellett, szubklónokban, relapszusban vagy a betegség progressziója során azonosították (11, 23). Az általam vizsgált AML esetekben a 3q többlet illetve a 3-as triszómia más triszómiákkal vagy szerkezeti rendellenességekkel társult. A T-sejtes ALL esetekben 3q többlet és a 3p deléció kisebb szubpopulációkban egy terjedelmesebb normális, diszómiás populáció mellett volt látható. Ez arra enged következtetni, hogy a hagyományos citogenetikával nehezen követhető 3p deléciónak és a 3q többletnek a klonális evolucióban vagy a tumor progressziójában is lehet szerepe. 46
Megbeszélés
5. 2. A hármas kromoszómát érintő szerkezeti rendellenességek mieloid leukémiában A vizsgált 61 gyermekkori leukémiában előforduló hármas kromoszómával kapcsolatos szerkezeti rendellenességek nagyrészét (71%-át) mielod leukémiában azonosítottam. Ezek az átrendeződések a 3q kart érintették. A többi, kisebb sejtpopulációkat érintő rendellenesség Tsejtes leukémiában fordult elő és az eliminációs teszttel volt kapcsolatos, melyet az előző fejezetben értékeltem. Szintén az előző fejezetben értékeltem teljes hármas triszómiás eseteket és a CRR régiót érintő 3q tetraszómiás AML esetet. A 3q21 és/vagy a 3q26 töréspontokat érintő szerkezeti rendellenességet 4 AML és egy CML esetben azonosítottam (4. táblázat -26., 27. és 28. eset; 5., 11. és 13 ábra - 23.,39., 33., 38. old). Két esetben mindkét töréspont érintett volt. A mindkét töréspontot egyszerre érintő kórkép, a „3q21q26 szindróma” (28, 29, 35) a t-AML-re illetve a CML blasztos és akcelerált fázisára jellemző, gyakran társul 7-es monoszómiával (11). A 3q21 töréspontot érintő átrendeződéseket leggyakrabban a GR6, RPN1 génekkel hozzák összefüggésbe, míg a 3q26 töréspontnál az EVI1 és az MDS1 lehetnek az érintett gének. A 3q21 génekben gazdag régió (104), mutagén expozicióra érzékeny fragilis hely (105). E régióban 10 léukémiával összefüggő töréspontot azonosítottak (105). A 3q21 töréspontok nagy része egy 30 kb hosszúságú „breakpoint cluster régióban” helyezkedik el az RPN 1 gén enhancer eleme mellett, kisebb része pedig ettől 10 - 100 kilobázisig terjedő, váltakozó távolságra, a centroméra irányában. (106, 107, 108). A szindróma másik töréspontját főleg az EVI1 gén kódoló régióját követő (downstream, lefelé) 3’ vég irányában azonosították, de a töréspont akár több száz kilobázis hosszúságon „szóródhat” és az EVI1 gén, mint az 5’(upstream, fölfelé) mint a 3’ végéről aktiválódhat. (109, 110). Az ember és az egér EVI1 génjének cDNS-e és aminosav szekvenciája 91-94% homológiát mutat (111). Az EVI1 gént először az egér 3-as kromoszómájában azonosították és mivel az egérnél retrovírus inszerciójával aktiválódott „ecotropic virus integration site-1” nevet kapta (112, 113). A gén cinkujj típusú magi DNS kötő fehérjét kódol. A fehérje amino-terminális végén 7-, karboxi-terminális végéhez közel 3cinkujj ismétlődést tartalmazó motivum található. Ez a típusú cinkujj gyakran fordul elő olyan transzkripciós faktorokban, melyek leukémiával asszociált kromoszóma transzlokációkban vesznek részt.(113, 114). Ilyen például a BCL6/LAZ3 - B-Cell Lymphoma6/Lymphoma Associated Zinc finger, a PLZF-promyelocytic leukemia zinc finger vagy az ETO- eigth twenty one, melyek a t(3;var)(q27;var); t(11;17)(q23;q21); t(8;21)(q22;q22) transzlokációkban 47
Megbeszélés érintettek (115, 116, 117, 118). Az EVI1 gén szokatlan expressziója in vitro csontvelői progenitor sejtekben cinkujj doménje révén megakariocita irányú elkötelezettséget határoz meg (119) és gátolja a sejtek normális differenciálódását (120). Feltételezhető, hogy a „3q21q26 szindrómában” a (3)(q21q26) inverzió vagy t(3;3)(q21;q26) transzlokáció révén a 3q21 egy olyan elemet visz az EVI1 gén közelébe, mely annak fokozott aktivációjához vezet. A 3q21q26 átrendeződések nagy részében az EVI1 gén kódoló régiója a konstitutívan expresszálódó RPN1 (Ribophorin 1) enhancer, erősítő eleme mellé helyeződik (89). A GR6-EVI1 fúziós gént is összefüggésbe hozták az EVI1 fokozott expressziójával. (121). A harmadik lehetséges onkogén hatás a normál MDS1-EVI1 fehérje megzavarása, mely promoter aktivátorként működik, de az EVI1 fokozott aktivációjával egy erős represszor hatás éri. Az EVI1 gén szokatlan expressziója ezáltal megakadályozza a granulociták, eritroid sejtek és csontvelői progenitor sejtek terminális differenciálódását. (109, 122). Több munkacsoport igazolta, hogy szintetikus promoter használata esetén az EVI1 transzkripciós represszor hatást fejt ki, de a célzott promoterek egyelőre ismeretlenek (89). A szindrómát a felnőtt AML esetek 2%-ában, a CML blasztos fázisának 20%-ában írták le (11, 123). A 3q21q26 szindróma előfordulása gyermekkori de novo AML-ben és CML-ben alacsony, a Mitelman adatbázis (11) 317 hármas inverzió esetéből mindössze 6 gyermekkori eredetű, köztük csak három 12 év alatti gyermek (124, 125, 126, 127, 128). AML esetünkben (4. táblázat-26. eset-23. old) a szindróma mielodiszpláziás talajon alakult ki és 7-es monoszómia kisérte. A betegnek eritro- és mielopoiesise diszpláziás volt, a megakariociták
diffúzan,
mérsékelten
felszaporodtak,
kóros
trombocitaképződés
(mikromegakariocitosis) volt megfigyelhető. A beteg a kemoterápiás kezelésre nem reagált, a legkorszerűbb terápiás protokoll alkalmazása ellenére sem lehetett a beteget remisszióba hozni. Megfelelő donor hiányában az őssejttranszplantáció nem volt lehetséges. Az elhúzódó szeptikus állapot és az alapbetegség további progressziója miatt a beteget diagnózis után 14 hónappal elveszítettük. Mindhárom sejtvonal érintettségét, konvencionális kemoterápiás kezelésre megszokott válasz hiányát felnőttkori AML „3q21q26 szindrómában” is megfigyelték (35, 33, 126). A CML-lel diagnosztizált betegnél a ”sokpontos” I–FISH” vizsgálat inv(3)(q21q26) inverziót, dup(3)(q21q26) és dup(3)(q26q28) duplikációt is igazolt. A CML-es beteg bizonyos klinikai paraméterei,
mint
pl
az
emelkedett
trombocita 48
szám,
dismegakariocitopoesis,
Megbeszélés micromegakariociták jelenléte, több sejtvonal érintettsége, konvencionális kemoterápiára való rezisztencia,
összhangban
voltak
a
3q
szindrómával.
Citoredukciós
kezelését
hydroxycarbamide adagolással kezdtük meg, mely hatására a fehérvérsejtszám csökkent. Mivel egy hónappal később a fehérvérsejtszám ismét emelkedni kezdett, imatinib kezelést indítottunk el. Figyelembe véve a rossz prognosztikai jegyeket (Ph kromoszóma, ugráló szegment transzlokáció, 3q szindróma, hagyományos terápiára való válasz hiánya) és a betegség agresszív lefolyását, haladéktalan donorkeresést kezdeményeztünk. Diagnózis után 5 hónappal HLA-identikus testvérdonorával allogén őssejtátültetést (SCT) végeztünk. A többször ismételt kiméra, citogenetikai és molekuláris genetikai vizsgálatok teljes donor típusú kimérizmust, hematológiai és citogenetikai remissziót mutattak ki. A betegnél súlyos, IV-es fokozatú akut graft betegség (GVHD) fejlődött ki, és az agresszív immunszuppresszív kezelés ellenére a beteget öt hónap múlva elveszítettük. A 3q21 és 3q26 azonos fenotípusú variáns átrendeződései a CML-es esetek megakarioblasztos vagy akcelerált fázisára jellemzőek. Gyermekkori előfordulásuk ritka, a Mitelman adatbázis (11) 40 regisztrált 3q inverziós CML esetéből csak három gyermekkori eredetű (124, 127, 128). A CML szekundér elváltozásainak nagy része specifikus fenotípussal összefüggő, genetikailag kiegyensúlyozatlan aberráció (triszómia, monoszómia, deléció), mely rendszerint nem társul a Philadelphia kromoszómát kísérő jellegzetes elváltozásokkal, mint például a +8, i(17q) és +Ph (129). A diagnózis idején jelenlévő szekundér elváltozásokat általában rövidebb túlélési eséllyel hozzák összefüggésbe (130). A 3q21q26 inverzió és duplikáció együttes előfordulásával sem a gyermekkori, sem a felnőttkori hematológiai malignitások szakirodalmában nem találkoztunk. A Philadelphia kromoszómával együttesen előforduló 3q szindróma azonosítása prognosztikai jelentőségű mind gyermekkori mind felnőttkori CML-ben. Az EVI1, MDS/EVI1 és a BCR/ABL együttes expressziója a mieloid irányú differenciálódást teljesen blokkolja és rövid idő alatt acut mieloblasztos leukémiát indukál. (131). A 3q21q26 szindróma azonosítása gyermekkorban különösen jelentős eszköz lehet klinikus számára a megfelelő rizikó csoportú terápia megválasztásában és a transzplantáció időbeli megtervezésében.
49
Megbeszélés A t(3;21)(q26;q22) transzlokációt egy terápiával összefüggő szekundér AML-ben (t-AML) azonosítottam (4. táblázat-27.eset-23. old). A Mitelman adatbázis (11) 59 t(3;21)(q26;q22) esetet tart számon. Nagyrészük CML blasztos fázisához kapcsolódik, kisebb részük t-AML vagy MDS-ben fordul elő (t-MDS), melyet egy korábbi malignitás miatti kemoterápiás kezelés előzött meg (34, 132, 133). De novo AML-ben csak 3 esetre van irodalmi adat (134, 135, 136). A 14 éves lány beteg klinikai tünetei a t(3;21) azonosításakor a t-AML diagnózisnak feleltek meg. Két és féléves korában súlyos aplasztikus anémiája (SAA) miatt HLA-azonos (fiú) testvérdonoros csontvelőtranszplantáción esett át. A beteg kondicionáló kezelésként nagy dózisú cyclophosphamidot illetve a GVHD (graft versus host disease) megelőzésére cyclosporint kapott. A transzplantáció után 12 évvel mielodiszpláziás szindrómával került vissza klinikánkra. Súlyos citopéniája miatt donor limfocita infúzióban (DLI) részesült ugyanattól a fiútestvérétől, mint 12 évvel korábban. Néhány hónap múlva a betegség klinikailag sokkal agresszívebbé vált. A hagyományos citogenetika és I-FISH vizsgálat egyaránt
új
kóros
klón
megjelenését
és
donor
eredetű
hemopoiesist
igazolta,
46,XY,t(3;21)(q26;q22)+12. A továbbiakban a beteget EWOG-MDS 98 protokoll szerint kezelték, de a terápiára nem válaszolt és súlyosbodó citopéniája és visszatérő fertőzései miatt, 6 héttel később a beteget elveszítettük. A csontvelő átültetéssel megoldott aplasztikus anémia és a t-AML között eltelt 13 év az eddig ismert leghosszabb lappangási idő, és mint donor sejtes gyermekkori t-AML egyetlen a szakirodalomban. (137). A t(3;21) tipikusan felnőtt betegekre jellemző citogenetikai átrendeződés, a szakirodalom az itt értékelt eseten kívül, mindössze két gyermekkori esetet tart számon (134, 138). A 3;21-es transzlokációban mindkét partner kromoszóma részéről a normális hemopoiesisben kulcsszerepet játszó gének sérülnek meg. A 21q22-be térképezett acute myeloid leukemia 1 (AML1) nevű gén, mely Core binding facor α (CBFα) néven is ismert, egyike a leggyakoribb olyan géneknek, melyek leukémiával kapcsolatos kromoszóma transzlokációkban vesznek részt, mint például a t(3;21)(q26;q22) (133, 139), t(8;21)(q22;q22) (140) és a t(12;21)(p13;q22) (141) transzlokáció. A legutóbbi genetikai tanulmányok feltárták a transzlokáció molekuláris genetikai szintű eseményeit. (118). A transzlokáció során a törés az AML1 génen belül történik: a gén promotere és runt doménje fúziót képez a különböző transzlokációs partnerek génjeivel. A t(3;21) esetén a 3q26 régióból a telomérától a centroméráig három különböző gén (EAP,MDS1, EVI1) vehet részt a fúzióban és az AML1gyel három alternatív terméket eredményezhet. Az EAP (Epstein-Barr-associated protein) 50
Megbeszélés nevű gén, mely egy riboszomális fehérje kódolásáért felelős, az AML1-gyel összekapcsolódva elveszti leolvasási keretét és stop kodonja révén egy AML1/EAP nevű trunkált fúziós terméket eredményez. Ez idáig ismeretlen funkciójú fehérjét kódoló MDS1, myeloysplasia syndrome-1 gén a runt doménhez 127 tagú maradványával kapcsolódik szintén egy csonkolt fehérjét eredményezve. Az AML1/EAP és AML1/MDS1 fúziós termékek myeloid- specifikus promoterük révén represszorként hatnak a normál AML1 transzaktiváló funkciójára. Az AML1/EVI1 fúziós gén az AML1 runt doménjéből és az EVI1 gén teljes kódoló régiójából keletkezik. Mivel AML1 transzkripciója a telomerától a centroméra felé történik, a der(3)-on elhelyezkedő AML1/MDS1/EVI1 fúziós gén az AML1 promoteréről íródik át. A keletkező kimérikus fehérje minimálisan két különböző potenciális DNS-kötő domént tartalmaz (egyiket az AML1-ről, másikat az EVI1-ről) és mivel mindkettő más –más célszekvenciát ismer fel, elképzelhető, hogy két különböző típusú promoter normál működését befolyásolja. Egyrészt zavarja a normál AML1 által szabályozott promoter aktivációt, másrészt az AML1 promotere aktiválja az EVI1 gén működését (142). A t(3;8)(q21;q24) transzlokációt egy 12 éves leánygyermeknél azonosítottam (4. táblázat-28. eset; 11. ábra, 23., 33. old). Az irodalmi adatok alapján ez a transzlokáció rendkívül ritka, a Mitelman-féle adatbázis egyetlen gyermekkori esetet sem tart számon és mindössze egy felnőtt, 74 éves t-AML-es betegről tesz említést, ahol t(3;8)-t számos más átrendeződés kíséri (11, 143). A betegnél AML-BFM-97 protokoll szerinti kezeléssel értek el teljes remissziót és a kórkép az azóta eltelt 4 év alatt nem recidivált. Hármas hosszú kar inersticiális deléciót, del(3)(q13q21)-et egy AML–es betegnél azonosítottam (4. táblázat-24. eset-23 old). A deléció töréspontja a 3q21 régióban, a RibophorinI (RPN1) gén közvetlen szomszédságában található, de nem érinti a gént. A 3q21 az inv (3)(q21q26), t(3;3)(q21;q26) és t(1;3)(p36;q21) rendellenességek ismert töréspontja. Ezekben az esetekben a RPN1 gén szabályozó régiója fuzionál a 3q26-ban lokalizálódó EVI1, MDS1/EVI1 vagy az 1p36.1 -ben elhelyezkedő és az előbbiekkel nagyfokú homológiát mutató MEL1 génnel.(144, 145). A 3q21 AML valamennyi FAB szubtípusában ismert, gyakrabban előforduló terminális és intersticiális deléciós töréspont, ellentétben a 3q13 deléciós törésponttal, mely csak ritkán azonosítható AML-ben és más hematológiai malignitásokban. (11, 36, 41). A 3q21-el kapcsolatos átrendeződések olyan mechanizmusokat indítanak el, melyek onkogén hatásukat bizonyos genetikai távolságról is képesek kifejteni.
51
Megbeszélés Esetünkben a betegség lefolyása súlyos volt. A 15. napi csontvelő vizsgálat részleges remissziót írt le, mivel a 3 q deléció a rossz prognózisú t(6;11)(q27;q23)-hoz társult, a beteget magas rizikójú (HR) protokollnak megfelelően kezelték és csontvelő transzplantációra javasolták. Hat hónappal később a beteg HLA-identikus, nem rokon, allogén őssejt transzplantáción esett át. Bár a transzplantáció után teljes remissziót értek el, a beteget súlyos, IV -es fokozatú akut graft versus host betegsége (GVHD) miatt, az agressziv immunszuppressziós terápia ellenére elveszítettük.
52
Következtetések 6. Következtetések Összefoglalva a 61 gyermekkori leukémiás csontvelő hármas kromoszómára vonatkozó vizsgálataimat, a következőket állapítom meg: 1. A sokpontos I-FISH technikát elsőként vezettem be hematológiai rendellenességek azonosítására. Ez az egyedi metodika alkalmas volt hagyományos citogenetikával és
más
DNS-alapú
korszerű
technikákkal
nem
azonosítható,
rejtett
rendellenességek kimutatására, töréspontok azonosítására. 2. I-FISH vizsgálataim a 25 B sejtes ALL-ben eliminációs teszttel kapcsolatos elváltozásokat, a CER régió vesztését, illetve a CRR régió kópiaszám növekedését nem mutatták ki. Az analizált 7 T-sejtes ALL-ből kettőben 3p deléciót és 4-ben CRR régiót érintő duplikációt találtam. Az Et következetesen elvesző régiója, CER1 és CER2 az általam vizsgált T sejtes ALL esetekben nem deletálódott. A két T-sejtes ALL-ben a 3p intersticiális deléciót a 3p12-p13 régióban találtam. A deléció helye megfelel egy ismert, feltételezett tumor szuppresszor gén, a „Deleted in–U-Twenty-Twenty”, DUTT1 gén helyének, melynek elvesztését szolid tumorok premalignus fázisában írták le. 3. A triszómiák viszonylag kis sejtpopulációban (11-15%) fordultak elő és a hármas kromoszóma hosszú karját vagy az egész hármas kromoszómát érintették. Az eredményeim, egymástól független, kóros hármas kromoszóma szubpopulációk kialakulását igazolják ugyanabban a tumorban. A kisebb szubpopulációk összefüggése a tumor kialakulásával és progressziójával kellőképpen még nincs tanulmányozva. A szubpopulációk szerepének tisztázáshoz további, nagyobb esetszámot átfogó vizsgálatok szükségesek. 4. Habár irodalmi adatok alapján 3p deléció az AML esetek 1-1,2%-ában előfordul, CER régióra vonatkozó vagy más 3p deléciót az analizált 28 gyermekkori AMLben nem találtam. Öt AML esetben azonosítottam a CRR régió kópia szám növekedését, ebből 4 teljes hármas triszómia és egy, a CRR régiót magába foglaló 3q tetraszómia. Ebben a régióban olyan onkogének találhatók, mint pl. a TNFSF10, TERC/hTR, BCL6/LAZ3, melyek nem szövetspecifikusak, hanem általában 53
Következtetések játszanak szerepet a tumor iniciációban és progresszióban, vagy mint pl. az EVI1, mely többféle leukemogenezissel kapcsolatos sajátsággal rendelkezik. 5. A 32 gyermekkori ALL esetből 6-ban találtam 3-as kromoszóma rendellenességet a csontvelő I-FISH vizsgálatával. Ez a gyakoriság (8%) magasabb, mint amit a Mitelman adatbázisban regisztráltak (3,4%). Ez a magasabb gyakoriság a nagy felbontóképességű és specificitású sokpontos I-FISH technikának tudható be, mely alkalmas volt a sejtek osztódó képességétől függetlenül a kisebb kóros populációk detektálására 6. 28 gyermekkori AML esetből, 9-ben hármas kromoszómával kapcsolatos rendellenességet azonosítottam. A rendellenességek egy része (3 eset) azzal magyarázható, hogy az alkalmazott sokpontos – I-FISH sokkal érzékenyebb metodika, mint a korábbi G-sáv alapú citogenetikai vizsgálat, mellyel 28/6 hármas kromoszóma rendellenesség volt kimutatható. 7. Három mieloid leukémia esetben, a 3q26 régióban az EVI1 gént érintő töréspontot azonosítottam. A töréspontok nem volt azonosak, két különböző leukemogenezissel kapcsolatos mechanizmust indítottak el. A 3q inverziós töréspont az EVI1 gén centromérához közeli, a 3;21 transzlokációs töréspont a gén teloméra felé eső végét érintette. Sérülése az inverzió esetén fokozott expresszióját, transzlokáció esetén a normális EVI1/MDS1 és a partner kromoszóma AML1 génjének megzavarását okozta. 8. Négy mieloid leukémia esetben a töréspontot a 3q21 régióban térképeztem. A 3q21 mutagén expozicióra érzékeny fragilis hely, leggyakrabban t-AML-ben érintett. A töréspontot az RPN1 gén közvetlen szomszédságában azonosítottam. Az RPN1 olyan konstitutívan expresszálódó gén, mely erős enhancer eleme révén bizonyos genetikai távolságról is képes onkogén hatást kifejteni, pl. a 3q21q26 inverzió esetén az EVI1 gén kóros expresszióját eredményezve. 9. A rendkívül rossz prognózisú, felnőttkori t-AML-re és CML blasztos fázisára jellemző „3q21q26 szindrómát” két esetben azonosítottam: egy de novo AML-ben és egy akcelerált fázisban diagnosztizált gyermekkori CML-ben. 54
Következtetések
10. Egy gyermekkori t-AML esetben az AML1/EVI1 fúziós gént azonosítottam. Az AML1 és EVI1 gének szabályozást irányító („master regulator”) szerepet játszanak a normális hematopoietikus őssejtek képződésében. A transzlokáció esetén keletkező kimérikus fehérje mindkét eleme sérült és gátolja a sejtek normális differenciálódási képességét. 11. Gyermekkori
AML-ben
a
felnőttekével
azonos
citogenetikai
eltéréseket
azonosítottam, de különbséget találtam előfordulási gyakoriságukban. A teljes hármas triszómia gyakoribb a gyermekeknél, az inv(3)(q21q26), t(3;21)(q26;q22) inkább felnőttekre jellemző. Ez egyrészt magyarázható a fiatalabb korosztály eltérő fogékonyságával, másrészt azzal, hogy a t-AML gyermekeknél ritkábban fordul elő, mint felnőtteknél. 12. A 3q-t érintő átrendeződések prognosztikai értéke egységesnek tűnik mind felnőtteknél, mind gyermekeknél. Az inv(3)(q21q26), t(3;21), 3q többlet és 3q deléció esetén nem lehetett teljes remisszióba hozni a betegeket. Az össztúlélés rendkívül rövid volt, átlagosan 6,2 hónap, annak ellenére, hogy valamennyi beteg magas rizikójú csoportnak megfelelő kezelést kapott. 13. Egy gyermekkori AML-re nézve új transzlokációt, t(3;8)(q21;q24)-et is találtam. Mivel a szakirodalom is csak egyetlen felnőtt esetet tart számon, ezen eset publikálása után a transzlokáció AML-re nézve visszatérő transzlokációnak tekinthető. 14. A vizsgált CML esetben hagyományos citogenetika, M-FISH és sokpontos I-FISH technika kombinálásával hematológiai esetekben ritkán előforduló ugráló szegment transzlokációt és 3q duplikációt illetve 3q21q26 inverziót azonosítottam. 15. A molekuláris genetikai módszerek (PCR-alapú) rendkívül gyors segítséget nyújtanak
a
diagnózis
felállításában,
a
minimális
reziduális
betegség
kimutatásában, de nem helyettesítik sem a klasszikus (GTG-sáv alapú), sem a modern citogenetikai (FISH-alapú) módszereket. A hagyományos és molekuláris citogenetikai módszerek kombinálása lehetőséget ad olyan magas rizikójú 55
Következtetések genotípus azonosítására, mint a rendkívül rossz prognózisú „3q21q26 szindróma”, mely a konvencionális kemoterápiától eltérő kezelést igényel.
56
Rövidítések 7. Rövidítések ABL= ”v-abl Abelson murine leukemia viral” onkogén ALL= akut limfoid leukémia AML= akut mieloid leukémia AML1= ”acute myeloblastic leukemia 1„ gén BAC= bacterial artificial chromosome, bakteriális alapú mesterséges kromoszóma BCL6/LAZ3= ”B-Cell Lymphoma6/Lymphoma Associated Zinc finger” gén BCR = ”breakpoint cluster region isoform2” gén BMT= Csontvelőátültetés CCD= Charged Coupled Device kamera cDNS= komplementer vagy kópia-DNS CER= common eliminated region, mindig kilöködő régió (3p karon) CGH= comparative genomic hybridization, komparatív genomiális hibridizáció CML= krónikus mieloid leukémia CRR=common retained region, mindig megmaradó régió (3q karon) DAPI= 4’-6-diamino-2-phenylindole nevű magfestő DLI= donor limfocita infúzió DNS= dezoxiribonukleinsav DUTT1= „Deleted-in-U-Twenty-Twenty 1” gén EAP= „Epstein-Barr-associated protein” gén Et= eliminációs teszt ETO= ” eigth twenty one” gén EVI1= ”ecotropic virus integration site-1” gén EWOG-MDS 98 =”European Working Group of MDS 98” ajánlása FAB= French-American-British klasszifikáció FER= Frequently Eliminated Region - gyakran elvesző 3-as kromoszóma rövid kar régió FISH= fluoreszcens in situ hibridizáció G-sávozás= Giemsa sávozás, GTG sávozás, Giemsa sáv Tripszin emésztéssel és Giemsa festéssel GVHD= graft-versus host disease hTR= ”human telomerase RNA” gén I-FISH= interfázis–fluoreszcens in situ hibridizáció Kb= kilo base pairs-kilobázis pár 57
Rövidítések LOH= loss of heterozygosity – heterozigótaság elvesztése Mb= Mega base -megabázis MDS1=” myelodysplasia syndrome 1” gén MEL1= ”MDS1/EVI1 like gene” gén M-FISH= multiplex vagy multicolor-FISH MLL=” myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia” gén Old= oldal PAC= P1-phage derived artificial chromosome, P1-fágalapú mesterséges kromoszóma PLZF= ”promyelocytic leukemia zinc finger” gén ROBO1= Drosophila sp. „Roundabout” nevű génje, homológ a humán DUTT1 génnel RPN1= ”Ribophorin I” gén RT-PCR= reverz-transzkriptáz polimeráz láncreakció SCID= severe combined immunodeficient -súlyos kombinált immunhiányos szindróma SCLC= kissejtes tüdő karcinóma SCT= stem cell transplantation –őssejt átültetés SJT= segmental jumping translocation-ugráló szegment transzlokáció t-AML= terápiával összefüggő szekundér AML TEL= ”ets variant gene 6”gén TSG= tumor szuppresszo gén(ek) WHO= „World Health Organization” klasszifikáció YAC= Yeast derived artificial chromosome, élesztő-alapú mesterséges kromoszóma
58
Köszönetnyílvánítás 8. Köszönetnyílvánítás Munkámat a Semmelweis Egyetem II. Sz. Gyermekgyógyászati Klinikáján és a stockholmi Karolinska Intézet, Mikrobiológia és Tumorbiológia Központjában (MTC) végeztem 1997 és 2003 között. Hálás köszönetemet fejezem ki Dr. Fekete György professzor úrnak, témavezetőmnek, aki mind klinikai, mind tudományos munkámat maximálisan támogatta. Emberi hozzáállásával, nagyvonalú segítőkészségével és belém vetett bizalmával tudományos tevékenységemet folyamatosan segítette. Köszönettel tartozom Dr. Imreh István egyetemi docens úrnak, aki a stockholmi Karolinska
Intézet,
Mikrobiológiai
és
Tumorbiológia
Központjának
molekuláris
citogenetikai laboratóriumába vendégkutatóként meghívott és a Svéd Rákkutató Társaság alapjából ösztöndíjat bíztosított. Szerencsésnek tartom magam, hogy a munkacsoport kutatási témájához kapcsolodhattam és Klein György professzor vezette rangos tudományos összejövetelek részese lehettem. Köszönöm továbbá Dr. Maria Kost-Alimovának, a Karolinska Intézet szenvedélyes kutató docensének a módszertani segítséget, türelmet, szakmai és baráti kapcsolatot, mely mindvégig kutatómunkám stabil hátterét jelentette. Köszönetet mondok a Citogenetikai Laboratórium és a Klinikai Titkárság valamennyi munkatársának, személyesen Dr. Dobos Matild egyetemi docensnek, a laboratórium vezetőjének, Dr. Szabó Judit biológusnak, Pajer Ferencné, Kovácsné Bodnár Ildikó és Királyné Sterbik Márta kitűnő szakasszisztenseknek, valamint Patakyné Havasi Gabriella és Csótkáné Bársony Katalin titkárnőknek, akik odaadóan segítettek és támogattak munkám során. Hálával tartozom Dr. Fekete Sándornénak és Győrné Benyó Ilonának I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet szakasszisztenseinek, akik a más budapesti gyermekhematológiai központban AML-lel diagnosztizált gyermekek citogenetikai vizsgálatát elvégezték, és a mintagyűjtésben közreműködtek. Hasonlóképpen köszönettel tartozom
59
Köszönetnyílvánítás Dr. Jakab Zsuzsának, a gyermekleukémiás regiszter vezetőjének, aki a más központokban kezelt betegek klinikai adataival segítette munkámat. Köszönöm a Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika valamennyi dolgozójának az elmúlt öt évben nyújtott segítségét. Végül köszönöm férjem és gyermekeim megértő türelmét, szeretetét és bátorítását, mely nélkül ez a munka nem készülhetett volna el.
60
Irodalomjegyzék 9. Irodalomjegyzék 1. Knudson AG. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 1971; 68:820-823. 2. Harris H, Miller OJ, Klein G, Worst P, Tachibana T. Suppression of malignancy by cell fusion. Nature. 1969; 223:363-368. 3. Klein G. The approaching era of the tumor suppressor genes. Science. 1987; 238:1539-1545. 4. Stanbridge EJ. Human tumor suppressor genes. Annu Rev Genet. 1990; 24:615657. 5. Anderson MJ, Stanbridge EJ. Tumor suppressor genes studied by cell hybridization and chromosome transfer. FASEB J. 1993; 7:826-833. 6. Saxon PJ, Srivatsan ES, Leipzig GV, Sameshima JH, Stanbridge EJ. Selective transfer of individual human chromosomes to recipient cells. Mol Cell Biol. 1985; 5:140-146. 7. Imreh, S, Kholodnyuk I, Allikmetts R, Stanbridge JE, Zabarovsky RE, Klein G. Nonrandom Loss of Human Chromosome 3 Fragments From Mouse-Human Microcell Hybrids Following Progressive Growth in SCID Mice. Genes Chromosomes Cancer. 1994; 11:237-245. 8. Yang Y, Kost-Alimova M, Ingvarsson S, Qianhui Q, Kiss H, Szeles A, Kholodnyuk I, Cuthbert A, Klein G, Imreh S. Similar regions of human chromosome 3 are eliminated from or retained in human/human and human/mouse microcell hybrids during tumor growth in severe combined immunodeficient (SCID) mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 98:1136-1141. 9. Imreh S, Kost-Alimova M, Kholodnyuk I, Yang Y, Szeles A, Kiss H, Liu Y, Foster K, Zabarovsky E, Stanbridge E, Klein G. Differential elimination of 3p
61
Irodalomjegyzék and retention of 3q segments in human/mouse microcell hybrids during tumor growth Genes Chromosomes Cancer. 1997; 20:224-233. 10. Kholodnyuk ID, Kost-Alimova M, Yang Y, Kiss H, Fedorova L, Klein G, Imreh S. The microcell hybrid-based "elimination test" identifies a 1-Mb putative tumor-suppressor region at 3p22.2-p22.1 centromeric to the homozygous deletion region detected in lung cancer. Genes Chromosomes Cancer. 2002; 34:341-344. 11. Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer (2005). Mitelman F, Johansson B and Mertens F (Eds.), http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman 12. Zabarovsky ER, Lerman MI, Minna JD. Tumor suppressor genes on chromosome 3p involved in the pathogenesis of lung and other cancers. Oncogene. 2002; 21:6915-6935. 13. Imreh S, Klein G, Zabarovsky RE. Search for unknown tumor-antagonizing genes. Genes Chromosomes Cancer. 2003; 38:307-321. 14. Knuutila S, Aalto Y, Autio K, Bjorkqvist AM, El-Rifai W, Hemmer S, Huhta T, Kettunen E, Kiuru-Kuhlefelt S, Larramendy ML, Lushnikova T, Monni O, Tapper J, Tarkkanen M, Varis A, Wasenius VM, Wolf M, Zhu Y. et al. DNA copy number losses in human neoplasms. Am J Pathol. 1999; 155:683-694. 15. Alimov A, Kost-Alimova M, Liu J, Li C, Bergerheim U, Imreh S, Klein G, Zabarovsky ER. Combined LOH/CGH analysis proves the existence of interstitial 3p deletions in renal cell carcinoma. Oncogene. 2000; 19:1392–1399. 16. Kopper László, Jeney András. Onkológia. Medicina Könyvkiadó RT, Budapest, 2002. 17. Pui CH, Relling MV, Downing JR. Acute lymphoblastic leukaemia. N Eng J Med. 2004; 350:1535-1548.
62
Irodalomjegyzék 18. Prigonina EL, Puchkova GP, Mayakova AA. Nonrandom chromosomal abnormalities in acute lymphoblastic leukemia of childhood. Cancer Genet Cytogenet. 1988; 32:183-203. 19. Lu XY, Harris CP, Cooley L, Margolin J, Steuber PC, Sheldon M, Rao PH, Lau CC. The utility of spectral karyotyping in the cytogenetic analysis of newly diagnosed pediatric acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 2002; 16:22222227. 20. Mathew S, Rao PH, Dalton J, Downing JR, Raimondi SC. Multicolor spectral karyotyping identifies novel translocations in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 2001; 15:468-472. 21. Forestier E, Johansson B, Borgstrom G, Kerndrup G, Johansson J, Heim S. Cytogenetic findings in a population-based series of 787 hildhood acute lymphoblastic leukemias from the Nordiccountries. The NOPHO Leukemia Cytogenetic Study Group. Eur J Haematol. 2000; 64:194-200. 22. Andreasson P, Hoglund M, Bekassy AN, Garwicz S, Heldrup J, Mitelman F, Johansson B. Cytogenetic and FISH studies of a single center consecutive series of 152 childhood acute lymphoblastic leukemias. Eur J Haematol. 2000; 65:4051. 23. Johansson B, Billström R, Kristoffersson U, Åkerman M, Garwicz S, Ahlgren T, Malm C, Mitelman F. Deletion of chromosome arm 3p in hematologic malignancies. Leukemia. 1997; 11:1207-1213. 24. Smith SD, Morgan R, Galili N, Amylon MD, Link MP, Hecht F, Sklar J, Glader BE. Establishment and characterization of a common acute lymphoblastic leukemia cell line with a deletion of chromosome 3 band q26. Cancer Res. 1987; 47:1652-1656. 25. Gebhart E, Thoma K, Verdorfer I, Drexler HG, Efferth T. Genomic imbalances in T-cell acute lymphoblastic leukemia cell lines. Int J Oncol. 2002; 21:887-894. 63
Irodalomjegyzék
26. Muller S, Eder V, Wienberg J. A nonredundant multicolor bar code as a screening tool for rearrangements in neoplasia. Genes Chromosomes Cancer. 2004; 39:59-70.
27. Sweet D L, Golomb H M, Rowley JD, et al. Acute myelogenous leukemia and thrombocythemia associated with an abnormality of chromosome No. 3. Cancer Genet Cytogenet. 1979; 1:33-37. 28. Bitter MA, Neilly ME, Le Beau MM, et al. Rearrangements of chromosome 3 involving bands 3q21 and 3q26 are associated with normal or elevated platelet counts in acute nonlymphocytic leukemia. Blood. 1985; 66:1362-1370. 29. Jotterand Bellomo M, Parlier V, Muhlematter D, Grob JP, Beris P. Three new cases of chromosome 3 rearrangement in bands q21 and q26 with abnormal thrombopoiesis bring further evidence to the existence of a 3q21q26 syndrome. Cancer Genet Cytogenet. 1992; 59:138-160. 30. Grigg AP, Gascoyne RD, Phillips GL, Horsman DE. Clinical, haematological
and cytogenetic features in 24 patients with structural rearrangements of the Q arm of chromosome 3. Br J Haematol. 1993; 83:158-165. 31. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HR, Sultan C. Proposals for the classification of the acute leukaemias. FrenchAmerican-British (FAB) co-operative group. Br J Haematol. 1976; 33:451-458. 32. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HR, Sultan C. Proposed revised criteria for the classification of acute myeloid leukemia. A report of the French-American-British Cooperative Group. Ann Intern Med. 1985; 103:620-625. 33. Fonatsch C, Gudat H, Lengfelder E, Wandt H, Silling-Engelhardt G, Ludwig WD, Thiel E, Freund M, Bodenstein H, Schwieder G, et al. Correlation of 64
Irodalomjegyzék cytogenetic findings with clinical features in 18 patients with inv(3)(q21q26) or t(3;3)(q21;q26). Leukemia. 1994; 8:1318-1326. 34. Horsman DE, Gascoyne RD, Barnett MJ. Acute Leukemia with Structural Rearrangements of Chromosome 3. Leukemia and Lymphoma. 1995; 16:369377. 35. Testoni N, Borsaru G, Martinelli G, Carboni C, Ruggeri D, Ottaviani E, Pelliconi S, Ricci P, Pastano R, Visani G, Zaccaria A, Tura S. 3q21 and 3q26 cytogenetic abnormalities in acute myeloblastic leukemia: biological and clinical features. Haematologica. 1999; 84:690-694. 36. Charrin C, Belhabri A, Treille-Ritouet D, Theuil G, Magaud JP, Fiere D, Thomas X. Structural rearrangements of chromosome 3 in 57 patients with acute myeloid leukemia: clinical, hematological and cytogenetic features.Hematol J. 2002; 3:21-31. 37. Grimwade D, Walker H, Oliver F, Wheatley K, Harrison C, Harrison G, Rees J, Hann I, Stevens R, Burnett A, Goldstone A. The importance of diagnostic cytogenetics on outcome in AML: analysis of 1,612 patients entered into the MRC AML 10 trial. The Medical Research Council Adult and Children's Leukaemia Working Parties. Blood. 1998; 92:2322-2333. 38. Mauritzson N, Johansson B, Albin M, Rylander L, Billstrom R, Ahlgren T, Mikoczy Z, Stromberg U, Mitelman F, Hagmar L, Nilsson PG. Survival time in a population-based consecutive series of adult acute myeloid leukemia--the prognostic impact of karyotype during the time period 1976-1993. Leukemia. 2000; 14:1039-1043. 39. Mauritzson N, Albin M, Rylander L, Billstrom R, Ahlgren T, Mikoczy Z, Bjork J, Stromberg U, Nilsson PG, Mitelman F, Hagmar L, Johansson B. Pooled analysis of clinical and cytogenetic features in treatment-related and de novo adult acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes based on a
65
Irodalomjegyzék consecutive series of 761 patients analyzed 1976-1993 and on 5098 unselected cases reported in the literature 1974-2001. Leukemia. 2002; 16:2366-2378. 40. Raimondi SC, Chang MN, Ravindranath Y, Behm FG, Gresik MV, Steuber CP, Weinstein HJ, Carroll AJ. Chromosomal abnormalities in 478 children with acute myeloid leukemia: clinical characteristics and treatment outcome in a cooperative pediatric oncology group study-POG 8821. Blood. 1999; 94:3707-3716. 41. Forestier E, Heim S, Blennow E, Borgstrom G, Holmgren G, Heinonen K, Johannsson J, Kerndrup G, Andersen MK, Lundin C, Nordgren A, Rosenquist R, Swolin B, Johansson B; Nordic Society of Paediatric Haematology and Oncology (NOPHO); Swedish Cytogenetic Leukaemia Study Group (SCLSG); NOPHO Leukaemia Cytogenetic Study Group (NLCSG). Cytogenetic abnormalities in childhood acute myeloid leukaemia: a Nordic series comprising all children enrolled in the NOPHO-93-AML trial between 1993 and 2001. Br J Haematol. 2003; 121:566-577. 42. Reis MD, Dube ID, Pinkerton PH, Chen-Lai J, Robinson JB, Klock RJ, Senn JS. "Jumping" translocations involving band 3q13.3 in a case of acute monocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet. 1991; 51:189-194. 43. Michalova K, Bartsch O, Stary J, Jelinek J, Wiegant J, Bubanska E. Partial trisomy of 3q detected by chromosome painting in a case of juvenile chronic myelomonocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet. 1993; 71:67-70. 44. Tosi S, Mosna G, Cazzaniga G, Giudici G, Kearney L, Biondi A, Privitera E. Unbalanced t(3;12) in a case of juvenile myelomonocytic leukemia (JMML) results in partial trisomy of 3q as defined by FISH. Leukemia. 1997; 11:14651468. 45. Harris NL, Jaffe ES, Diebold J, Flandrin G, Muller-Hermelink HK, Vardiman J, Lister TA, Bloomfield CD. The World Health Organization classification of hematological malignancies report of the Clinical Advisory Committee Meeting, Airlie House, Virginia, November 1997. Mod Pathol. 2000; 13:193-207. 66
Irodalomjegyzék
46. Mrozek K, Heerema NA, Bloomfield CD. Cytogenetics in acute leukemia. Blood. 2004; 18:115-136. 47. Mahoney DH Jr, McClain KL, Hanson IC, Taylor LD, Steuber CP.Acquired immune deficiency, myelodysplasia, and acute nonlymphocytic leukemia associated with monosomy 7 and t(3;3) (q21;q26) in a child with Langerhans cell histiocytosis. Am J Pediatr Hematol Oncol. 1989; 11:153-157. 48. Stark B, Jeison M, Gabay LG, Mardoukh J, Luria D, Bar-Am I, Avrahami G, Kapeliushnik Y, Sthoeger D, Herzel G, Steinberg DM, Cohen IJ, Goshen Y, Stein J, Zaizov R, Yaniv I. Classical and molecular cytogenetic abnormalities and outcome of childhood acute myeloid leukaemia: report from a referral centre in Israel. Br J Haematol. 2004; 126:320-337. 49. Rowley JD, Potter D. Chromosomal banding patterns in acute nonlymphocytic leukemia. Blood 1976; 47:705-721. 50. Seabright M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet. 1971; 2:971-972. 51. Seabright M. Improvement of trypsin method for banding chromosomes. Lancet. 1973; 1:1249-1250. 52. Mitelman F, editor. An international system for human cytogenetic nomenclature. Basel:S.Karger, 1995. 53. Pinkel D, Straume T, Gray JW. Cytogenetic analysis using quantitative, highsensitivity, fluorescence hybridization Proc Natl Acad Sci U S A. 1986; 83:29342938. 54. Szeles A, Bajalica-Lagercrantz S, Lindblom A, Lushnikova T, Kashuba VI, Imreh S, Nordenskjold M, Klein G, Zabarovsky ER. Mapping of a new MAP kinase activated protein kinase gene (3PK) to human chromosome band 3p21.2
67
Irodalomjegyzék and ordering of 3PK and two cosmid markers in the 3p22-p21 tumour-suppressor region by two-colour fluorescence in situ hybridization. Chromosome Res. 1996; 4:310-313. 55. Yang Y, Kiss H, Kost-Alimova M, Kedra D, Fransson I, Seroussi E, Li J, Szeles A, Kholodnyuk I, Imreh MP, Fodor K, Hadlaczky Gy, Klein G, Dumanski J. P and Imreh S. 1-Mb PAC contig spanning the common eliminated region 1 (CER1) in microcell hybrid-derived SCID tumors. Genomics. 1999; 6:147-157. 56. Yang Y, Kost-Alimova M, Ingvarsson S, Qianhui Q, Kiss H, Szeles A, Kholodnyuk I, Cuthbert A, Klein G, Imreh S. Similar regions of human chromosome 3 are eliminated from or retained in human/human and human/mouse microcell hybrids during tumor growth in severe combined immunodeficient (SCID) mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 98:1136-1141. 57. Kiss H, Yang Y, Kiss C, Andersson K, Klein G, Imreh S, Dumanski JP. The transcriptional map of the common eliminated region (C3CER1) in 3p21.3. Eur J Hum Genet. 2002; 10:52–61. 58. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ guide/human 59. Lejeune J, Maunoury C, Prieur M, Van den Akker J. A jumping translocation (5p;5q), (8q;15q), and (12q;15q) Ann Genet. 1979; 22:210-213. 60. Nicole McNeil and Thomas Ried. Novel molecular cytogenetic techniques for identifying complex chromosomal rearrangements: technology and applications in molecular medicine. Exp. Rev. Mol. Med. 2000; http://www-ermm.cbcu.cam.ac.uk/00001940h.htm 61. Nordgren A, Schoumans J, Soderhall S, Nordenskjold M, Blennow E. Interphase fluorescence in situ hybridization and spectral karyotyping reveals hidden genetic aberrations in children with acute lymphoblastic leukaemia and a normal banded karyotype. Br J Haematol. 2001; 114:786-793.
68
Irodalomjegyzék 62. Nordgren A, Heyman M, Sahlen S, Schoumans J, Soderhall S, Nordenskjold M, Blennow E Spectral karyotyping and interphase FISH reveal abnormalities not detected by conventional G-banding. Implications for treatment stratification of childhood acute lymphoblastic leukaemia: detailed analysis of 70 casesEur J Haematol. 2002; 68:31-41. 63. Tonnies H. Modern molecular cytogenetic techniques in genetic diagnostics. Trends Mol Med. 2002; 8:246-250. 64. Gozzetti A, Le Beau MM. Fluorescence in situ hybridization: uses and limitations. Semin Hematol. 2000; 37:320-333. 65. Rabbitts P, Bergh J, Douglas J, Collins F, Waters J. A submicroscopic homozygous deletion at the D3S3 locus in a cell line isolated from a small cell lung carcinoma. Genes Chromosomes Cancer 1990; 2:231-238. 66. Latif F, Tory K, Modi WS, Graziano SL, Gamble G, Douglas J, HeppellParton AC, Rabbitts PH, Zbar B, Lerman MI. Molecular characterization of a large homozygous deletion in the small cell lung cancer cell line U2020: a strategy for cloning the putative tumor suppressor gene. Genes Chromosomes Cancer 1992; 5:119-127. 67. Drabkin HA, Mendez MJ, Rabbitts PH, Varkony T, Bergh J, Schlessinger J, Erickson P, Gemmill RM. Characterization of the submicroscopic deletion in the small-cell lung carcinoma (SCLC) cell line U2020. Genes Chromosomes Cancer. 1992; 5:67-74. 68. Sundaresan V, Chung G, Heppell-Parton A, Xiong J, Grundy C, Roberts I, James L, Cahn A, Bench A, Douglas J,Minna J, Sekido Y et al. Homozygous deletions at 3p12 in breast and lung cancer. Oncogene. 1998; 17:1723-1729. 69. Sundaresan V, Roberts I, Bateman A, Bankier A, Sheppard M, Hobbs C, Xiong J, Minna J, Latif F, Lerman M, Rabbitts P. DUTT1 gene, a novel NCAM family member is expressed in developing murine neural tissues and 69
Irodalomjegyzék has an unusually broad pattern of expression. Mol Cell Neurosci 1998; 11:2935. 70. Kidd T, Brose K, Mitchell KJ, Fetter RD, Tessier-Lavigne M, Goodman CS, Tear G. Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors. Cell. 1998; 2:205-215. 71. Xian J, Clark KJ, Fordham R, Pannell R, Rabbitts TH, Rabbitts PH. Inadequate lung development and bronchial hyperplasia in mice with a targeted deletion in the Dutt1/Robo1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98:15062-15066. 72. Mudge JM, Jackson MS. Evolutionary implications of pericentromeric gene expression in humans. Cytogenet Genome Res. 2005; 108:47-57. 73. Heim S, Bekassy AN, Garwicz S, Heldrup J, Kristoffersson U, Mandahl N, Wiebe T, Mitelman F. Bone marrow karyotypes in 94 children with acute leukemia Eur J Haematol. 1990; 44:227-233. 74. Johansson B, Mertens F, Mitelman F.Geographic heterogeneity of neoplasiaassociated chromosome aberrations. Genes Chromosomes Cancer. 1991; 3:1-7. 75. Arana-Trejo RM, Gomez-Morales E, Rubio-Borja ME, Kassack-Ipina JJ, Cervantes-Peredo A, Guerrero-Rivera S, Gonzalez-Llaven J, Gutierrez-Romero M, Pizzuto-Chavez J, Kofman-Alfaro S. Cytogenetic findings in 303 Mexican patients with de novo acute myeloblastic leukemia. Arch Med Res. 1997; 28:209-214. 76. Walter TA, Morgan R, Ondreyco S, Sandberg AA. Apparent duplication of inv(3)(q21q26) in one of five cases with inv (3) in myelodysplastic syndromes and acute leukemia. Am J Hematol. 1990; 33:210-214.
70
Irodalomjegyzék 77. Tönnies H, Huber S, Kuhl JS, Gerlach A, Ebell W, Neitzel H. Clonal chromosomal aberrations in bone marrow cells of Fanconi anemia patients: gains of the chromosomal segment 3q26q29 as an adverse risk factor. Blood. 2003; 101: 3872-3874. 78. Reis MD, Dube ID, Pinkerton PH, Chen-Lai J, Robinson JB, Klock RJ, Senn JS. "Jumping" translocations involving band 3q13.3 in a case of acute monocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet. 1991; 51:189-194. 79. Michalova K, Bartsch O, Stary J, Jelinek J, Wiegant J, Bubanska E. Partial trisomy of 3q detected by chromosome painting in a case of juvenile chronic myelomonocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet. 1993; 71:67-70. 80. Tosi S, Mosna G, Cazzaniga G, Giudici G, Kearney L, Biondi A, Privitera E. Unbalanced t(3;12) in a case of juvenile myelomonocytic leukemia (JMML) results in partial trisomy of 3q as defined by FISH. Leukemia. 1997; 11:14651468. 81. NCI
and
NCBI's
SKY/M-FISH
and
CGH
Database.
2001;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sky/skyweb.cgi" 82. http://www.helsinki.fi/cmg/cgh_data.html 83. Monni O, Oinonen R, Elonen E, Franssila K, Teerenhovi L, Joensuu H, Knuutila S. Gain of 3q and deletion of 11q22 are frequent aberrations in mantle cell lymphoma. Genes Chromosomes Cancer. 1998; 21:298-307. 84. Bea S, Ribas M, Hernandez JM, Bosch F, Pinyol M, Hernandez L, Garcia JL, Flores T, Gonzalez M, Lopez-Guillermo A, Piris MA, Cardesa A et al. Increased number of chromosomal imbalances and high-level DNA amplifications in mantle cell lymphoma are associated with blastoid variants. Blood. 1999; 93:4365-77. 85. Karnan S, Tagawa H, Suzuki R, Suguro M, Yamaguchi M, Okamoto M, Morishima Y, Nakamura S, Seto M. Analysis of chromosomal imbalances in de
71
Irodalomjegyzék novo CD5-positive diffuse large-B-cell lymphoma detected by comparative genomic hybridization. Genes Chromosomes Cancer. 2004; 39:77-81. 86. Gazzo S, Baseggio L, Coignet L, Poncet C, Morei D, Coiffier B, Felman P, Berger F, Salles G, Callet-Bauchu E. Cytogenetic and molecular delineation of a region of chromosome 3q commonly gained in marginal zone B-cell lymphoma Haematologica 2003; 88:31-38. 87. Heselmeyer K, Macville M, Schrock E, Blegen H, Hellstrom AC, Shah K, Auer G, Ried T. Advanced-stage cervical carcinomas are defined by a recurrent pattern of chromosomal aberrations revealing high genetic instability and a consistent gain of chromosome arm 3q. Genes Chromosomes Cancer 1997; 19:233-240. 88. Ashman JN, Patmore HS, Condon LT, Cawkwell L, Stafford ND, Greenman J. Prognostic value of genomic alterations in head and neck squamous cell carcinoma detected by comparative genomic hybridisation. British Journal of Cancer. 2003; 89:864-869. 89. Nucifora G. The EVI1 gene in myeloid leukemia. Leukemia. 1997; 11:20222031. 90. Buonamici S, Li D, Chi Y, Zhao R, Wang X, Brace L, Ni H, Saunthararajah Y, Nucifora G. EVI1 induces myelodysplastic syndrome in mice. J Clin Invest. 2004; 114:713-719. 91. Buonamici S, Chakraborty S, Senyuk V, Nucifora G. The role of EVI1 in normal and leukemic cells. Blood Cells Mol Dis. 2003; 31:206-212. 92. Buonamici S, Li D, Mikhail FM, Sassano A, Platanias LC, Colamonici O, Anastasi J, Nucifora G. EVI1 abrogates interferon-alpha response by selectively blocking PML induction. J Biol Chem. 2005; 280:428-436.
72
Irodalomjegyzék 93. Xi ZF, Russell M, Woodward S, Thompson F, Wagner L, Taetle R. Expression of the Zn finger gene, EVI-1, in acute promyelocytic leukemia. Leukemia. 1997; 11:212-220. 94. Langabeer SE, Rogers JR, Harrison G, Wheatley K, Walker H, Bain BJ, Burnett AK, Goldstone AH, Linch DC, Grimwade D; MRC Adult Leukaemia Working Party. EVI1 expression in acute myeloid leukaemia. Br J Haematol. 2001; 112:208-211. 95. Zoccola D, Legros L, Cassuto P, Fuzibet JG, Nucifora G, Raynaud SD. A discriminating screening is necessary to ascertain EVI1 expression by RT-PCR in malignant cells from the myeloid lineage without 3q26 rearrangement. Leukemia 2003; 17:643-645.
96. Sahar Barjesteh van Waalwijk van Doorn-Khosrovani, Claudia Erpelinck, Wim L. J. van Putten, Peter J. M. Valk, Sonja van der Poel-van de Luytgaarde, Ronald Hack, Rosalyn Slater, Elisabeth M. E. Smit, H. Berna Beverloo, Gregor Verhoef, Leo F. Verdonck, Gert J. Ossenkoppele, Pieter Sonneveld, Georgine E. de Greef, Bob Löwenberg, and Ruud Delwel. High EVI1 expression predicts poor survival in acute myeloid leukemia: a study of 319 de novo AML patients. Blood 2003; 101:837-845.
97. Wiley SR, Schooley K, Smolak PJ, Din WS, Huang CP, Nicholl JK, Sutherland GR, Smith TD, Rauch C, Smith CA, et al. Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis. Immunity. 1995; 3:673-682. 98. Soder AI, Hoare SF, Muir S, Going JJ, Parkinson EK, Keith WN. Amplification, increased dosage and in situ expression of the telomerase RNA gene in human cancer. Oncogene. 1997; 14:1013-1021.
73
Irodalomjegyzék 99. Heselmeyer-Haddad K, Janz V, Castle PE, Chaudhri N, White N, Wilber K, Morrison LE, Auer G, Burroughs FH, Sherman ME, Ried T. Detection of genomic amplification of the human telomerase gene (TERC) in cytologic specimens as a genetic test for the diagnosis of cervical dysplasia. Am J Pathol. 2003; 163:1405-1416. 100. Deweindt C, Albagli O, Bernardin F, Dhordain P, Quief S, Lantoine D, Kerckaert JP, Leprince D. The LAZ3/BCL6 oncogene encodes a sequencespecific transcriptional inhibitor: a novel function for the BTB/POZ domain as an autonomous repressing domain. Cell Growth Differ. 1995; 6:1495-1503. 101. Baron BW, Anastasi J, Thirman MJ, Furukawa Y, Fears S, Kim DC, Simone F, Birkenbach M, Montag A, Sadhu A, Zeleznik-Le N, McKeithan TW. The human programmed cell death-2 (PDCD2) gene is a target of BCL6 repression: implications for a role of BCL6 in the down-regulation of apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99:2860-2865. 102. Albagli-Curiel O. Ambivalent role of BCL6 in cell survival and transformation. Oncogene. 2003; 22:507-516. 103. Daheron L, Veinstein A, Brizard F, Drabkin H, Lacotte L, Guilhot F, Larsen CJ, Brizard A, Roche J. Human LPP gene is fused to MLL in a secondary acute leukemia with a t(3;11) (q28;q23). Genes Chromosomes Cancer 2001; 31:382389. 104. Rynditch A, Pekarsky Y, Schnittger S, Gardiner K. Leukemia breakpoint region in 3q21 is gene rich. Gene. 1997; 193:49-57. 105. Lindquist R, Forsblom AM, Ost A, Gahrton G. Mutagen exposures and chromosome 3 aberrations in acute myelocytic leukemia. Leukemia. 2000; 14:112-118. 106. Suzukawa K, Parganas E, Gajjar A, Abe T, Takahashi S, Tani K, Asano S, Asou H, Kamada N, Yokota J Kazuhiro Morishita, and James N. Ihle. 74
Irodalomjegyzék Identification of a breakpoint cluster region 3' of the ribophorin I gene at 3q21 associated with the transcriptional activation of the EVI1 gene in acute myelogenous leukemias with inv(3)(q21q26). Blood. 1994; 84:2681-2688. 107. Wieser R, Volz A, Schnittger S, Jager U, Gruner H, Meran JG, Wimmer K, Ziegler A, Fonatsch C. Mapping of leukaemia-associated breakpoints in chromosome band 3q21 using a newly established PAC contig. Br J Haematol. 2000; 110:343-350. 108. Wieser R. Rearrangements of chromosome band 3q21 in myeloid leukemia. Leuk Lymphoma. 2002; 43:59-65. 109. Morishita K, Parganas E, William CL, Whittaker MH, Drabkin H, Oval J, Taetle R, Valentine MB, Ihle JN. Activation of EVI1 gene expression in human acute myelogenous leukemias by translocations spanning 300-400 kilobases on chromosome band 3q26. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992; 89:3937-3941. 110. Martinelli G, Ottaviani E, Buonamici S, Isidori A, Borsaru G, Visani G, Piccaluga PP, Malagola M, Testoni N, Rondoni M, Nucifora G, Tura S, Baccarani M. Association of 3q21q26 syndrome with different RPN1/EVI1 fusion transcripts. Haematologica. 2003; 88:1221-1228. 111. Morishita K, Parganas E, Douglass EC, Ihle JN. Unique expression of the human Evi-1 gene in an endometrial carcinoma cell line: sequence of cDNAs and structure of alternatively spliced transcripts. Oncogene. 1990; 5:963-971. 112. Mucenski ML, Taylor BA, Ihle JN, Hartley JW, Morse HC 3rd, Jenkins NA, Copeland NG. Identification of a common ecotropic viral integration site, Evi-1, in the DNA of AKXD murine myeloid tumors. Mol Cell Biol. 1988; 8:301-308. 113. Morishita K, Parker DS, Mucenski ML, Jenkins NA, Copeland NG, Ihle JN. Retroviral activation of a novel gene encoding a zinc finger protein in IL-3dependent myeloid leukemia cell lines. Cell. 1988; 54:831-840.
75
Irodalomjegyzék 114. Matsugi T, Morishita K, Ihle JN. Identification, nuclear localization, and DNAbinding activity of the zinc finger protein encoded by the Evi-1 myeloid transforming gene. Mol Cell Biol. 1990; 10:1259-1264. 115. Chang CC, Ye BH, Chaganti RS, Dalla-Favera R. BCL-6, a POZ/zinc-finger protein, is a sequence-specific transcriptional repressor.Proc Natl Acad Sci U S A. 1996; 93):6947-6952. 116. Chen Z, Brand NJ, Chen A, Chen SJ, Tong JH, Wang ZY, Waxman S, Zelent A. Fusion between a novel Kruppel-like zinc finger gene and the retinoic acid receptor-alpha locus due to a variant t(11;17) translocation associated with acute promyelocytic leukaemia. EMBO J. 1993; 12:1161-1167. 117. Miyoshi H, Kozu T, Shimizu K, Enomoto K, Maseki N, Kaneko Y, Kamada N, Ohki M. The t(8;21) translocation in acute myeloid leukemia results in production of an AML1-MTG8 fusion transcript. EMBO J. 1993; 12:2715-2721. 118. Nucifora G, Rowley JD. AML1 and the 8;21 and 3;21 translocations in acute and chronic myeloid leukemia. Blood. 1995; 86:1-14. 119. Shimizu S, Nagasawa T, Katoh O, Komatsu N, Yokota J, Morishita K. EVI1 is expressed in megakaryocyte cell lineage and enforced expression of EVI1 in UT7/GM cells induces megakaryocyte differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 292:609-616. 120. Morishita K, Parganas E, Matsugi T, Ihle JN. Expression of the Evi-1 zinc finger gene in 32Dc13 myeloid cells blocks granulocytic differentiation in response to granulocyte colony-stimulating factor. Mol Cell Biol. 1992; 12:183189. 121. Pekarsky Y, Rynditch A, Wieser R, Fonatsch C, Gardiner K. Activation of a novel gene in 3q21 and identification of intergenic fusion transcripts with ecotropic viral insertion site I in leukemia. Cancer Res. 1997; 57:3914-3919.
76
Irodalomjegyzék 122. Kreider BL, Orkin SH, Ihle JN. Loss of erythropoietin responsiveness in erythroid progenitors due to expression of the Evi-1 myeloid-transforming gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993; 90:6454-6458. 123. Huret JL. inv(3)(q21q26),t(3;3)(q21;q26),ins(3;3)(q26;q21q26). Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. October 1997 .URL: http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer 124. Orazi A, Cattoretti G, Heerema NA, Sozzi G, John K, Neiman RS. Frequent p53 overexpression in therapy related myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias: an immunohistochemical study of bone marrow biopsies. Mod Pathol. 1993; 6:521-525. 125. Stark B, Jeison M, Shohat M, Goshen Y, Vogel R, Cohen IJ, Yaniv I, Kaplinsky C, Zaizov R Involvement of 11p15 and 3q21q26 in therapy-related myeloid leukemia (t-ML) in children. Case reports and review of the literature. Cancer Genet Cytogenet. 1994; 75:11-22. 126. Secker-Walker LM, Mehta A, Bain B. Abnormalities of 3q21 and 3q26 in myeloid malignancy: a United Kingdom Cancer Cytogenetic Group study. Br J Haematol. 1995; 91:490-501. 127. Asou H, Eguchi M, Suzukawa K, Morishita K, Tanaka K, Date M, Hamamoto K, Kamada N. Establishment of a myeloid leukaemia cell line (Kasumi-4) with t(9;22;11)(q34;q11;q13), inv(3)(q21q26) and the EVI1 gene activation from a patient with chronic myelogenous leukaemia in blast crisis. Br J Haematol. 1996; 93:68-74. 128. Meza Espinoza JP, Judith Picos Cardenas V, Gutierrez-Angulo M, Gonzalez Garcia JR. Secondary chromosomal changes in 34 Philadelphia-chromosomepositive chronic myelocytic leukemia patients from the Mexican West. Cancer Genet Cytogenet. 2004; 148:166-169.
77
Irodalomjegyzék 129. Johansson B, Fioretos T, Mitelman F. Cytogenetic and molecular genetic evolution of chronic myeloid leukemia. Acta Haematol. 2002; 107:76-94. 130. Sokal JE, Gomez GA, Baccarani M, Tura S, ClarksonBD, Cervantes F, Rozman C, Carbonell F, Anger B, Heimpel H. Prognostic significance of additional cytogenetic abnormalities at diagnosis of Philadelphia chromosomepositive chronic granulocytic leukemia. Blood. 1988; 72:294-298. 131. Cuenco GM, Ren R. Both AML1 and EVI1 oncogenic components are required for the cooperation of AML1/MDS1/EVI1 with BCR/ABL in the induction of acute myelogenous leukemia in mice. Oncogene. 2004; 23:569579. 132. Rubin CM, Larson RA, Bitter MA, Carrino JJ, Le Beau MM, Diaz MO, Rowley JD. Association of a chromosomal 3;21 translocation with the blast phase of chronic myelogenous leukemia. Blood. 1987; 70:1338-1342. 133. Rubin CM, Larson RA, Anastasi J, Winter JN, Thangavelu M, Vardiman JW, Rowley JD, Le Beau MM. t(3;21)(q26;q22): a recurring chromosomal abnormality in therapy-related myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia. Blood; 1990; 76:2594-2598. 134. Johansson B, Fioretos T, Garwicz S, Heim S, Mitelman F. t(3;21)(q26;q22) with AML1 rearrangement in a de novo childhood acute monoblastic leukaemia.Br J Haematol. 1996; 92:429-431. 135. Kaya H, Aoshima K, Okafuji K, Tanaka N, Ohtake S, Nakamura S, Matsuda T. De novo acute nonlymphoblastic leukemia (M5b) having a chromosomal 3;21 translocation with immunoglobin heavy-chain gene rearrangement. Am J Hematol. 1996; 53:142-143. 136. Motomura S, Fujisawa S, Tsunooka S, Fujimaki K, Harano H, Mohri H, Okubo T, Fujita H, Maruta A, Kodama F. Translocation (3;21)(q26;q22) in de novo acute myelogenous leukemia. Leukemia. 1997; 11:172-173. 78
Irodalomjegyzék
137. Haltrich I, Müller J, Szabó J, Kovács G, Koós R, Poros A, Dobos M, Fekete Gy Donor-cell myelodysplastic syndrome developing 13 years after marrow grafting for aplastic anemia. Cancer Genet and Cytogenet. 2003; 142:124-128. 138. Raimondi SC, Chang MN, Ravindranath Y, Behm FG, Gresik MV, Steuber CP, Weinstein HJ, Carroll AJ. Chromosomal abnormalities in 478 children with acute myeloid leukemia: clinical characteristics and treatment outcome in a cooperative pediatric oncology group study-POG 8821. Blood. 1999; 94:37073716. 139. Nucifora G, Begy CR, Erickson P, Drabkin HA, Rowley JD. The 3;21 translocation in myelodysplasia results in a fusion transcript between the AML1 gene and the gene for EAP, a highly conserved protein associated with the Epstein-Barr virus small RNA EBER 1.Proc Natl Acad Sci U S A. 1993; 90:7784-7788. 140. Miyoshi H, Shimizu K, Kozu T, Maseki N, Kaneko Y, Ohki M. t(8;21) breakpoints on chromosome 21 in acute myeloid leukemia are clustered within a limited region of a single gene, AML1. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991; 88:10431-10434. 141. Golub TR, Barker GF, Bohlander SK, Hiebert SW, Ward DC, Bray-Ward P, Morgan E, Raimondi SC, Rowley JD, Gilliland DG. Fusion of the TEL gene on 12p13 to the AML1 gene on 21q22 in acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995; 92:4917-4921. 142. Zent C, Kim N, Hiebert S, Zhang DE, Tenen DG, Rowley JD, Nucifora G. Rearrangement of the AML1/CBFA2 gene in myeloid leukemia with the 3;21 translocation: expression of co-existing multiple chimeric genes with similar functions as transcriptional repressors, but with opposite tumorigenic properties. Curr Top Microbiol Immunol. 1996; 211:243-252.
79
Irodalomjegyzék 143. Lindvall C, Nordenskjold M, Porwit A, Bjorkholm M, Blennow E. Molecular cytogenetic characterization of acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes with multiple chromosome rearrangements. Haematologica. 2001; 86:1158-1164. 144. Nishikata I, Sasaki H, Iga M, Tateno Y, Imayoshi S, Asou N, Nakamura T, Morishita K. A novel EVI1 gene family, MEL1, lacking a PR domain (MEL1S) is expressed mainly in t(1;3)(p36;q21)-positive AML and blocks G-CSF-induced myeloid differentiation. Blood. 2003; 102:3323-3332. 145. Mochizuki N, Shimizu S, Nagasawa T, Tanaka H, Taniwaki M, Yokota J, Morishita K. A novel gene, MEL1, mapped to 1p36.3 is highly homologous to the MDS1/EVI1 gene and is transcriptionally activated in t(1;3)(p36;q21)positive leukemia cells.Blood. 2000; 96:3209-3214.
80
Saját közlemények 10. Saját közlemények jegyzéke 10. 1. Az értekezés témakörében készült saját közlemények 10. 1. 1. Lektorált közlemények 1. Haltrich I, Müller J, Szabó J, Kovács G, Kóos R, Poros A, Dobos M, Fekete Gy. Donor cell myelodysplastic syndrome developing 13 years after marrow grafting for aplastic anemia. Cancer Genetics and Cytogenetics. 2003; 142:124-128. 2. Haltrich I, Kost–Alimova M, Kovács G, Kriván G, Dobos M, Stefan I, Fekete Gy. A „3q21q26 szindróma” azonosítása sokpontos-interfázis-FISH vizsgálattal gyermekkori myeloid leukémiában. Magyar Onkológia. 2005; 49:141-147. 3. Haltrich I, Kost–Alimova M, Kovács G, Kriván G, Tamáska J, Klein G, Fekete Gy, Imreh. S. Jumping translocation of 17q11-qter and 3q25q28 duplication in a variant Philadelphia chromosome t(9;14;22)(q34;q32;q11) carrying childhood CML. Cancer Genetics and Cytogenetics. 2005. (közlésre elfogadva). 4. Haltrich I, Kost–Alimova M, Kovács G, Klein G, Fekete Gy, Imreh S. Multipoint interphase FISH analysis of chromosome 3 abnormalities in 28 childhood AML patients. European Journal of Haematology. 2005. (közlésre elfogadva). 5. Haltrich I, Kost-Alimova M, Fekete Gy, Klein G, Imreh. S. Multipoint-FISH in childhood T-cell-lineage ALL detects subpopulations that carry 3q trisomies or deletions in the DUTT1/ROBO1 tumor suppressor gene region at 3p12-p13. (közlésre benyújtva) 10. 1. 2. Idézhető absztraktok
1. Haltrich I, Müller J. Donor eredetű juvenilis myelomonocytás leukémia kialakulásának
genetikai
háttere.
Magyar
81
Humángenetikai
Társaság
III.
Saját közlemények Kongresszusa. Debrecen, 2001. június 8-9. Absztrakt és poszter összefoglalók 55. old. 2. Müller J, Haltrich I, Koós R, Kriván G, Kovács GT. Juvenile Myelomonocyter Leukemia (JMMoL) of Donor Origin 12 Years after Successful Allogenic Bone Marrow Transplantation for Aplastic Anaemia. Medical and Pediatric Oncology. 2003; 41(4):389. 3. Müller J, Haltrich I, Koós R, Kriván G, Kovács GT. Case Presentation of a Juvenile Myelomonocytic Leukemia of Donor Origin after Successful Allogenic Bone Marrow Transplantation. Semmelweis Symposium–New Trends In Medical Genomics. Budapest, 2003. november 6-7. 4. Müller J, Haltrich I, Szabó J, Kovács G, Koós R, Garami M, Kriván G. Fekete Gy. Donor-derived acute myelomonocytic leukemia in a patient receiving allogenic bone marrow transplant for severe aplastic anaemia. 30th Annual Meeting of the European
Group
for
Blood
and
Marrow
Transplantation.
Barcelona,
Spanyolország, 2004. március 28-31. 5. Haltrich I, Kost –Alimova M, Müller J, Imreh S, Fekete Gy. A new variant Philadelphia jumping segment translocation with two unusual 3q unbalances in a childhood CML case. 1st International Conference on Basic and Clinical Immungenomics. 3-7 October, Budapest, Hungary. Tissue Antigens. 2004; 64:4. 6. Müller J, Haltrich I. Koós R. Kriván G, Kovács GT. Juvenile Myelomonocyter Leukemia (JMMoL) of Donor Origin 12 Years after Successful Allogenic Bone Marrow Transplantation for Aplastic Anaemia. 35th Congress of the International Society of Paediatric Oncology (SIOP). Kairó, 2003. október 8-11. Bone marrow transplantation. 2004; 33:Suppl 1. 7. Haltrich I, Kost-Alimova M, Imreh S, Fekete Gy. Gyermekkori krónikus myeloid leukémia
komplex
citogenetikai
vizsgálata.
Tudományos Napok 2004; 135. old.
82
Semmelweis
Egyetem,
PhD
Saját közlemények 8. Haltrich I, Kost-Alimova M, Müller J, Dobos M, Stefan I, Fekete Gy. A hármas kromoszóma vizsgálata gyermekkori akut myeloid leukémiában. Magyar Humángenetikusok V. Munkakonferenciája. Szeged, 2004. november 11-13. Absztrakt és poszter összefoglalók 55. old 9. Haltrich I, Kost–Alimova M, Müller J, Dobos M, Stefan I, Fekete Gy. Klasszikus és modern citogenetika egy gyermekkori CML-eset kapcsán. Gyermekgyógyászat. 2004; 55:Suppl 2. 10. Haltrich I, Kost-Alimova M, Müller J, Dobos M, Stefan I, Fekete Gy. DUTT1/ROBO1 tumorszuppresszor gén deléciójának azonosítása gyermekkori akut lymphoid T-sejtes leukémiában. VI. Magyar Genetikai Kongresszus XIII Sejtés Fejlődésbiológiai Napok, Eger, 2005. április 10-12. A konferencia előadásainak és posztereinek összefoglalója 146. old. 11. Haltrich I, Kost–Alimova M, Kovács G, Dobos M, Stefan I, Fekete Gy. A hármas kromoszóma vizsgálata gyermekkori akut lymphoid leukémiában. Semmelweis Egyetem, PhD Tudományos Napok 2005; 84. old. 12. Haltrich I, Kost–Alimova M, Stefan I, Fekete Gy. Analysis of chromosome 3 abnormality in 28 childhood AML cases. 5th. European Cytogenetics Conference. Madrid, 2005, júniús 4-7. Chromosome research. 2005; 13:Suppl 1. 13. Haltrich I, Kost-Alimova M, Kovács G, Dobos M, Stefan I, Fekete Gy. A hármas kromoszóma sokpontos FISH vizsgálata gyermekkori akut myeloid leukémiában. A Magyar Onkológusok Társaságának XXVI. Kongresszusa. Budapest, 2005. november 10-13.
83
Saját közlemények 10. 2. Az értekezés témaköréhez szorosan nem kapcsolódó egyéb saját közlemények 1. Haltrich I, Kovács G. Kromoszóma defektusok Burkitt-szerű ALL-L3 típusú leukémiában. Magyar Humángenetikusok Konferenciája. Szeged, 1998. október 18-21. A konferencia előadásainak és posztereinek összefoglalója 44-45. old. 2. Haltrich I, Dobos M, Török J. Familiáris kromoszóma átrendeződések csontvelőtranszplantált
betegekben.
Magyar
Humángenetikai
Társaság
II.
Kongresszusa. Pécs, 1999. augusztus 25-28. A konferencia előadásainak és posztereinek összefoglalója 26-27. old. 3. Haltrich I, Török J. Nemi kromoszóma rendellenességek akut myeloid leukémiában. IV. Magyar Genetikai Kongresszus. Siófok, 1999. április 11-14. A konferencia előadásainak és posztereinek összefoglalója 197. old. 4. Haltrich I, Ádám E, Kónya M, Szabó J, Páldi Haris P, Nahajevszky S, Rosta L, Földi J. A 15;17-es komplex variáns transzlokáció azonosítása különféle metodikai módszerekkel. Magyar Humángenetikai Társaság III. Kongresszusa. Debrecen, 2001. június 8-9. Összefoglalók 27. old. 5. Szabó J, Corrodi GY, Bogáthy B, Pájer E, Haltrich I, Kovács I, Dobos M. X;Y transzlokáció azzospermiás férfiban. Magyar Humángenetikai Társaság III. Kongresszusa. Debrecen, 2001. június 8-9. Összefoglalók 62. old. 6. Dobos M, Szabó J, Pájer E, Bogáthy B, Kovács I Haltrich I. Új stratégia a Turnerszindróma
diagnosztikájában.
Magyar
Humángenetikai
Társaság
III.
Kongresszusa. Debrecen, 2001. június 8-9. Összefoglalók 17. old. 7. Dobos M, Szabó J, Becker K, Török Zs, Bogáthy B, Kovács I, Pájer E, Haltrich I. Felderítetlen maradhat-e a mozaicizmus? Magyar Gyermekorvosok Társasága Évi Nagygyűlése. Debrecen, 2000. június 8-10. Összefoglalók 64.old.
84
Saját közlemények 8. Haltrich I. Új citogenetikai vizsgáló módszerek. Megújuló Gyermekgyógyászat. 2002. május 14. 9. Haltrich I, Pikó H. A sokarcú MLL gén. Magyar Humángenetikai Társaság 2002 Évi Nagygyűlése. Budapest, 2002. november 22-23. Programfüzet és abszraktkötet 81-82. old. 10. Dobos M, Sólyom J, Szabó J, Haltrich I, Pájer E, Bárány É, Kovács I, Fekete Gy. Nemi kromoszóma mozaicizmusok gonád dysgenesisek hátterében. Magyar Humángenetikai Társaság 2002 Évi Nagygyűlése. Budapest, 2002. november 2223. Programfüzet és absztrakkötet 55-56. old. 11. Erdélyi D, Daróczi K, Haltrich I, Kálmánchey R. Az ataxia teleangiectasiáról egy esetünk kapcsán. Gyermekgyógyászat. 2002; 53:443-447. 12. Haltrich I, Pikó H. Az Mll gén molekuláris genetikai vizsgálata. V. Magyar Genetikai Kongresszus. Siófok, 2003. április 13-15. A konferencia előadásainak és posztereinek összefoglalója 56. old. 13. Dobos M, Szabó J, Kovács I, Pájer E, Haltrich I, Fekete Gy. Semmi baj, megoperáljuk! A hypospadiasis. MGYT és MEAT közös Gyermekendokrinológiai Szekciója. Salgóbánya, 2003. május 16-18. 14. Haltrich I. Az MLL gén jelentősége. Cytogenetikai és FISH workshop. Budapest, 2004. január 21-22. 15. Erdélyi D, Daróczy K, Haltrich I, Kálmánchey R. Ataxia teleangiectasiaImmunogenetics of the disease and special aspects of medical managements of families based on a case report. 1st International Conference on Basic and Clinical Immungenomics, Budapest, 2004. október 3-7. Tissue Antigens. 2004; 64:4. 16. Dobos M, Szabó J, Pájer E, Kovács I, Sterbik M, Haltrich I, Fekete Gy. Citogenetikai
vizsgálatok
veleszületett
Gyermekgyógyászat. 2004; 55:suppl. 2.
85
szívfejlődési
rendellenességekben.
Saját közlemények 17. Szabó J, Dobos M, Pájer E, Kovács I, Sterbik M, Haltrich I, Muzsnai Á, Fekete Gy. Turner–szindróma X-gyűrű- kromoszómával Gyermekgyógyászat. 2004; 55:suppl. 2. 18. Dobos M, Haltrich I, Szabó J, Pajer E, Kovács I, Sterbik M, Kovács F, Fekete Gy. Ez is prevenció. Kiegyensúlyozott transzlokáció hordozás. VI. Magyar Genetikai Kongresszus XIII Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Eger, 2005. április 10-12. A konferencia előadásainak és posztereinek összefoglalója 135. old. 19. Haltrich I, Dobos M, Kovács I, Pajer F, Sterbik M, Kovács G, Fekete Gy. Háromévi
csontvelő
citogenetikai
vizsgálatának
elemzése.
Magyar
Gyermekorvosok Társasága 2005 Évi Nagygyűlése, Balatonszárszó, 2005. szeptember 29.-október 1. Gyermekgyógyászat. 2005; 56:suppl l.
86
Összefoglaló ÖSSZEFOGLALÓ A szerző arra kereste a választ, hogy a szolid tumorokból, illetve az eliminációs tesztből ismert 3p deléciós forrópontok tumor szuppresszor génjei elvesztődnek-e gyermekkori akut leukémiában és ezzel egyidőben vagy ettől függetlenül az onkogénekben „gazdag” hármas hosszú kar duplikálódik-e? A vizsgálatok további célja a hármas kromoszómához kapcsolódó valamennyi rendellenesség feltérképezése egy új és nagy felbontóképességű technikával, a sokpontos I-FISH-sel. A szerző az analizált 60 gyermekkori akut leukémia esetből kettőben 3p deléciót és 9 esetben 3q többletet azonosított. A két intersticiális deléciót T-sejtes ALL-ben, a 3p12-p13 régióban azonosította. A deléció helye megfelel egy ismert, feltételezett tumor szuppresszor gén, a „Deleted in–U-Twenty-Twenty”, DUTT1 gén helyének, melynek elvesztését szolid tumorok premalignus fázisában írták le. A teljes hármas triszómia, 3q triszómia vagy tetraszómia formában előforduló 3q többlet a 4 T-sejtes ALL-ben kisebb, míg az öt AML esetben nagyobb sejtpopulációkat érintett. A szerző hármas kromoszómát érintő szerkezeti rendellenességek nagy részét (71%-át) mieloid leukémiában azonosította. Az átrendeződések töréspontjait a 3q21 és/vagy a 3q26 régióban térképezte. A mindkét töréspontot egyszerre érintő kórképet, a „3q21q26 szindrómát” két esetben mutatta ki. A 3q26-ban a töréspont az EVI1 gént érintette. Az EVI1 olyan transzkripciós faktor, mely kulcsszerepet játszik a hematopoietikus őssejtek differenciálódásában. Az RPN1 gén közvetlen szomszédságában azonosított 3q21 töréspont bizonyos genetikai távolságról is képes onkogén hatást kifejteni. A szerző gyermekkori leukémiában ritkán előforduló AML1/EVI1 fúziós gént mutatott ki egy t-AML esetben. A transzlokáció esetén keletkező kimérikus fehérje mindkét eleme sérült és gátolja a sejtek normális differenciálódási képességét. A szerző egy gyermekkori AML-re nézve új transzlokációt, t(3;8)(q21;q24)-et is azonosított. A vizsgált CML esetben, hematológiai kórképben ritkán előforduló ugráló szegment transzlokációt és a 3q komplex átrendeződését identifikálta. A szerző a nagy felbontóképességű és specifikus sokpontos IFISH technikát elsőként vezette be hematológiai malignitások vizsgálatára és hagyományos citogenetikával, DNS–alapú korszerű technikákkal nem azonosítható rejtett rendellenességeket mutatott ki. A gyermekkori citogenetikai eltérések azonosak voltak a felnőttekével, de különbség volt előfordulási gyakoriságukban. Gyermekeknél a 3q-t érintő rearrangementek ugyanolyan rossz prognózissal társultak, mint a felnőtteknél. A hagyományos és molekuláris citogenetikai módszerek kombinálása lehetőséget adott olyan magas rizikójú genotípus azonosítására, mint a rendkívül rossz prognózisú „3q21q26 szindróma”, mely a konvencionális kemoterápiától eltérő kezelést igényel.
87
Összefoglaló SUMMARY In the model system called „elimination test” and in different solid tumors was proven that certain chromosome 3p regions are non-randomly deleted and 3q regions retained in a manner that transgresses tissue and species barriers. This finding suggests the possibility that deletion hot spots on 3p containing tumor suppressor genes and “oncogene rich”3q regions may be involved in childhood haematological malignancies including ALL, AML and CML. The further aim of this investigation was to identify chromosome 3 abnormalities at high resolution using a novel multipoint I-FISH technique. In the analyzed 60 childhood acute leukemia cases the author identified two cases of interstitial 3p deletions and 9 cases of 3q gains. The two deletions were detected at 3p12-p13 regions in T-ALL. The overlapping interstitial deletions harbor a known tumor suppressor region (72.6-78.8 Mb), described in solid tumors and contains the „Deleted in–UTwenty-Twenty “gene (DUTT1/ROBO1), associated with early phases of malignancy. Increased copy number of 3q including the trisomy of whole chromosome 3, 3q trisomy and 3q tetrasomy (isodisomy), in the 4 T-cell ALL was identified in smaller, in the 5 AML cases in larger subpopulations. The majority of chromosome 3 structural abnormalities (71%) were identified in myeloid leukemia, involving mostly 3q21 and/or 3q26 breakpoints. The cytogenetic syndrome involving bands 3q21 and 3q26 simultaneously, known as “3q21q26 syndrome” has been detected in two patients. The 3q26 breakpoint involved the EVI1 gene. The EVI1 protein is a zinc finger transcriptional factor which plays a key role in normal hematopoetic differentiation. The 3q21 breakpoint was identified close to the RPN1 gene, which exerts oncogenic effect through mechanism acting over some genomic distance. The author identified in a t-AML case an AML1/EVI1 fusion gene, which is extremely rare in childhood leukemia. Both partners of the chimeric protein may disturb the normal hematopoesis. The author identified also a t(3;8)(q21;q24), previously never reported in childhood AML and mentioned only in a single adult t-AML case. In the investigated CML case was revealed an unbalanced jumping translocation of 17q11-qter, which has never been reported in hematological malignancies and a complex 3q rearrangement. The high specificity and sensitivity of the interphase multipoint FISH method, introduced first by the author for the examination of hematological malignancies, identified subtle aberrations (small subpopulations, interstitial gain and loss) that would remain undetected by current methods based on total tumor DNA analysis and conventional cytogenetics. Similar cytogenetic changes of chromosome 3 could be identified in general in children and in adults, but differences in incidence have been noted. The poor outcome in patients with 3q rearrangements appears to be quite uniform. The combination of conventional and molecular cytogenetic techniques was helpful in identifying of high-risk groups like the “3q21q26 syndrome” that needs another treatment than conventional chemotherapy.
88
