A galektin-1, -3, -9 és a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor szerepe az allergiás asztma patomechanizmusában Doktori értekezés
Sziksz Erna
Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezetők: Prof. Dr. Szabó András, egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Vannay Ádám, tudományos munkatárs, Ph.D.
Hivatalos bírálók: Dr. Hídvégi Edit, egyetemi adjunktus, Ph.D. Dr. Balogh Ádám, klinikai orvos, Ph.D.
Szigorlati bizottság: Dr. Szalay Csaba, az MTA doktora Dr. Bősze Szilvia, tudományos főmunkatárs, Ph.D. Dr. Dérfalvi Beáta, tanársegéd, Ph.D.
Budapest 2010
TARTALOMJEGYZÉK 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ................................................................................... 5 2. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS ............................................................ 7 2.1. A túlérzékenységi reakciók áttekintése ............................................................. 7 2.1.1. Az allergia ...................................................................................................... 8 2.1.2. Az allergiás asztma ....................................................................................... 9 2.1.2.1. Az allergiás asztma definíciója ............................................................. 9 2.1.2.2. Az asztma prevalenciája ..................................................................... 10 2.1.2.3. Az asztma patomechanizmusa ............................................................ 10 2.1.2.3.1. Légúti hiperreaktivitás (AHR) .................................................... 11 2.1.2.3.2. Légúti gyulladás és a gyulladásos sejtek ..................................... 11 2.2. Gyulladásos mediátorok ................................................................................... 14 2.2.1. A hisztamin .................................................................................................. 15 2.2.1.1. A hisztamin jellemzői .......................................................................... 15 2.2.1.2. A hisztamin hatásai, receptora ........................................................... 16 2.2.1.3. A hisztamint előállító hisztidin dekarboxiláz (HDC) enzim ............ 18 2.3. Az allergiás asztma kísérletes állatmodellje .................................................... 18 2.4. A galektin molekulacsalád ................................................................................ 20 2.4.1. A galektinek definíciója és felosztásuk ..................................................... 20 2.4.2. A galektinek funkciói ................................................................................. 23 2.4.3. A Gal-1 molekula jellemzése ...................................................................... 26 2.4.4. A galektin-3 (Gal-3) molekula sajátságai ................................................. 27 2.4.5. A galektin-9 (Gal-9) molekula bemutatása .............................................. 29 2.5 A vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) .................................... 30 3. CÉLKITŰZÉSEK .................................................................................................... 32 3.1. A Gal-1 és -3 molekulákkal kapcsolatos kérdésfeltevéseink .......................... 32 3.2. A Gal-9 asztmában való részvételére irányuló kérdéseink ............................ 32 3.3. A VEGF asztmában betöltött szerepének vizsgálata kapcsán feltett kérdéseink ................................................................................................................. 33 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK .............................................................................. 34 4.1. Kísérleti állatok .................................................................................................. 34 4.2. Kísérleti protokoll, allergizálási procedúra..................................................... 34 4.3. Szteroid kezelés .................................................................................................. 36 4.4. Légúti reaktivitás és hiperreaktivitás (AHR) mérése ..................................... 36 4.5. Tüdőmosófolyadék (BAL) vétele ...................................................................... 37 4.6. Citokin mérések a BAL felülúszóból ............................................................... 38 4.7. A BAL limfociták Gal-1, -3, -9, VEGF fehérje szintjének FACS vizsgálata 38 4.8. Szövettan ............................................................................................................ 39 4.9. Valós idejű (real-time) reverz transzkripció-polimeráz láncreakció (RTPCR) mérések ........................................................................................................... 39 4.9.1. RNS izolálás ................................................................................................ 39 4.9.2. Komplementer DNS szintézis .................................................................... 39 4.9.3. SYBR Green alapú real time PCR Gal-1, -3, -9, VEGF mRNS mérésére ................................................................................................................................ 40 4.9.4. Real time PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzfer (FRET) GAPDH mérésére ................................................................................................. 41
2
4.9.5. A real time RT-PCR mérések értékelése .................................................. 42 4.10. Western blot Gal-1, -3, -9, VEGF és aktin fehérjék mérésére ..................... 42 4.10.1. Minta előkészítés ....................................................................................... 42 4.10.2. Antitestek ................................................................................................... 42 4.10.3. Nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) ................................................................................................................................ 43 4.10.4. Blottolás ..................................................................................................... 44 4.10.5. Immunoblotting ........................................................................................ 44 4.10.6. Az immunoreaktív helyek detektálása .................................................... 45 4.10.7. A Western blot-ok kiértékelése ............................................................... 45 4.11. Immunfluoreszcens festés a Gal-9 kimutatására .......................................... 45 4.12. Immunhisztológia a Gal-1 kimutatására ....................................................... 46 4.13. J774.2 egér alveoláris makrofág sejtkultúra és kezelés ............................... 46 4.14. Statisztika ......................................................................................................... 47 5. EREDMÉNYEK ....................................................................................................... 48 5.1. A Gal-1 molekulával kapcsolatos eredmények ............................................... 48 5.1.1. Gal-1 mRNS expresszió a tüdőben ............................................................ 48 5.1.2. A Gal-1 fehérje mennyisége a tüdőben ..................................................... 49 5.1.3. Gal-1 lokalizációja a tüdőben .................................................................... 50 5.1.4. A BAL sejtes összetétele ............................................................................. 51 5.1.5. Gal-1 pozitív sejtek aránya és intracelluláris Gal-1 tartalmuk a BALban .......................................................................................................................... 52 5.1.6. In vitro kísérlet J774.2 alveoláris makrofág sejtvonalon ........................ 54 5.2. A Gal-3 molekulával kapcsolatos eredmények ............................................... 56 5.2.1. A Gal-3 mRNS expressziója a tüdőben .................................................... 56 5.2.2. A Gal-3 fehérje mennyisége a tüdőben ..................................................... 57 5.2.3. A Gal-3 pozitív sejtek aránya és intracelluláris Gal-3 tartalmuk a BALban .......................................................................................................................... 58 5.2.4. A J774.2 alveoláris makrofág sejtek in vitro Gal-3 termelése ................ 60 5.3. A Gal-9 molekulával kapcsolatos eredmények ............................................... 62 5.3.1. Légúti hiperreaktivitás a kontroll, az OVA kezelt és az OVA+DEX kezelt állatokban ................................................................................................... 62 5.3.2. Nyáktermelő kehelysejtek kimutatása a tüdőszövetből .......................... 63 5.3.3. A BAL sejtes összetétele ............................................................................. 64 5.3.4. A Gal-9 pozitív sejtek aránya és intracelluláris Gal-9 tartalmuk a BALban .......................................................................................................................... 65 5.3.5. A BAL citokinek mérési eredménye ......................................................... 69 5.3.6. A Gal-9 mRNS expressziója a tüdőben .................................................... 70 5.3.7. A Gal-9 fehérje mennyisége a tüdőben ..................................................... 71 5.3.8. A Gal-9 lokalizációja a tüdőben ................................................................ 72 5.4. A VEGF molekulával kapcsolatos eredményeink .......................................... 73 5.4.1. A tüdő szövettan eredményei ..................................................................... 73 5.4.2. A VEGF mRNS expressziója a tüdőben ................................................... 74 5.4.3. A VEGF fehérje szintje a tüdőben ............................................................ 75 5.4.4. VEGF immunpozitivitás a BAL makrofágokban .................................... 76 5.4.5. VEGF immunpozitivitás a BAL limfocitákban ....................................... 78 5.4.6. VEGF immunpozitivitás a BAL eozinofil granulocitáiban .................... 79 6. EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE ..................................................................... 81
3
6.1. Az asztma állatmodell visszaigazolása ............................................................. 81 6.2. A Gal-1 molekulával kapcsolatos eredmények megvitatása .......................... 81 6.3. A Gal-3 molekulával kapcsolatos eredmények megbeszélése ........................ 86 6.4. A Gal-9 molekulával kapcsolatos eredmények megvitatása .......................... 89 6.5. A VEGF molekulával kapcsolatos eredmények megvitatása ........................ 91 7. KÖVETKEZTETÉSEK........................................................................................... 95 8. ÁBRÁK ÉS TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE ............................................................ 97 8.1. Ábrák jegyzéke .................................................................................................. 97 8.2. Táblázatok .......................................................................................................... 98 9. ÖSSZEFOGLALÁS ................................................................................................. 99 10. SUMMARY ........................................................................................................... 101 11. IRODALOMJEGYZÉK ...................................................................................... 103 12. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE ............................................................... 126 12.1. A doktori értekezés témájához kapcsolódó közlemények: ........................ 126 12.2. A doktori értekezés témájához nem kapcsolódó közlemények: ................ 126 12.3. Konferencia absztraktok: ............................................................................. 128 13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS .............................................................................. 132
4
1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
ADCC
Ellenanyagfüggő sejt közvetített citotoxicitás (Antibody-Dependent Cellmediated Cytotoxicity)
AHR
Légúti túlérzékenység, hiperreaktivitás (Airway Hyper-responsiveness)
Al(OH)3
Alumínium-hidroxid
ANOVA
Varianciaanalízis
BAL
Tüdőmosó folyadék (Bronchoalveolar lavage)
B.pertussis
Bordatella pertussis baktérium
CRD
Szénhidrát-felismerő domén (Carbohydrate recognising domain)
Der
Házi poratka (Dermatophagoides pteronyssinus) allergén
DEX
Dexametazon nátriumfoszfát
DMEM
Dulbecco’s módosított sejtmédium
DNS
Dezoxiribonukleinsav
ECP
Eozinofil kationos protein
EGTA
Etilén-glikol-tetraecetsav
EP
Eozinofil peroxidáz
FACS
Áramlási citofluoriméter
FcR
Fc receptor
FGF
Fibroblaszt növekedési faktor
FMH
-fluorometil hisztidin
FN
Fibronektin
FRET
Fluoreszcens rezonancia energia transzfer
Gal-1-,3-,9
Galektin-1,-3,-9
GAPDH
Glicerin – aldehid – 3 – foszfát – dehidrogenáz
GM-CSF
Granulocita-makrofág kolóniastimuláló faktor
HDC
Hisztidin dekarboxiláz
HDC-/-
Hisztidin dekarboxiláz génkiütött egér
H1R
Hisztamin receptor 1
HRPO
Tormaperoxidáz
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
5
ICAM
Intracelluláris adhéziós molekula
IL
Interleukin
IRES
Internális riboszóma belépési hely (internal ribosomal entry site)
LFA
Leukocita funkcionális antigén
LN
Laminin
LPS
Lipopoliszacharid
MBP
Fő bázikus protein
MCh
Metakolin, acetil-β metilkolin klorid
MCP
Makrofág kemotaktikus protein
MIP
Makrofág gyulladásos fehérje
NO
Nitrogén monoxid
PAGE
Poliakrilamid gélelektroforézis
PAS
Perjód-acid-Schiff festés
PBS
Foszfát pufferolt sóoldat
PMN
Polimorfonukleáris sejtek
PMSF
Fenil-metil-szulfonil fluorid
mRNS
Messenger ribonukleinsav
RT-PCR
Valós idejű polimeráz láncreakció
OVA
Ovalbumin
PS
Foszfatidil-szerin
ROS
Reaktív oxigén gyökök
SDS
Nátrium-dodecil-szulfát
SLE
Szisztémás lupus erythematosus
SPF
Specifikus patogénektől mentes
TGF
Tumor növekedési faktor
TIM-3
T sejt immunglobulin domén és mucin domén 3
TNF
Tumor nekrózis faktor
Th
Segítő (helper) T sejt
U
Egység (unit)
VEGF
Vaszkuláris endoteliális növekedési faktor
WT
Vad típusú egér
6
2. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS Munkánk során célul tűztük ki az asztma patomechanizmusának pontosabb megértését. Az irodalmi bevezetőben elsőként a betegségről adunk rövid átfogó képet, továbbá tárgyaljuk a hisztamin kitüntetett szerepét a folyamatban és a vizsgálataink során alkalmazott állatmodell sajátságait. Az elmúlt években előtérbe kerültek a cukorkötő molekulák, különösen a galektinek (Gal), melyek szerepét az adaptív és a természetes immunválasz kapcsán egyaránt leírták [1-3], azonban allergiás asztmában betöltött funkciójukkal kapcsolatos ismereteink meglehetősen hiányosak. A bevezetőben bemutatjuk az általunk vizsgált Gal -1, -3, -9-et valamint kutatásaink negyedik célmolekuláját, a vaszkuláris endoteliális növekedési faktort (VEGF). 2.1. A túlérzékenységi reakciók áttekintése Túlérzékenységi vagy hiperszenzitivitási reakcióról beszélünk, ha az immunrendszer aktivációja olyan nem kívánatos folyamatokat eredményez, melyek gyakran gyulladáshoz és szöveti roncsolódáshoz vezetnek. A túlérzékenységi reakciók négy fő típusát különböztetjük meg, melyeket szemléletesen az 1. táblázat mutat be.
1. Táblázat. A túlérzékenységi reakciók felosztása
Reakciótípus
Jellemzők
Válasz ideje:
Példa
IgE-mediált I.
Azonnali típusú
immunválasz,
1-2 perc
Asztma, ekcéma,
túlérzékenység
hízósejtek és bazofilek
múlva
ételallergia
aktivációja EllenanyagII.
mediált citotoxikus reakció
IgG- és IgM-mediált immunválasz, komplementaktiválás vagy ADCC útján sejtpusztítás
7
Fetális 4-8 óra múlva
eritroblasztózis, autoimmun hemolitikus anémia
Antigén-ellenanyag III.
Immunkomplex
komplex képződése,
2-8 óra
mediált reakció
komplement aktiváció,
múlva
gyulladás Késői típusú IV.
sejtközvetített reakció
Th1 sejt eredetű citokinek
1-3 nap
makrofágokat és Tc
múlva
sejteket aktiválnak
Arthus-reakció, szérumbetegség, SLE
Kontakt dermatitisz, graftkilökődés
A túlérzékenységi reakciókat négy fő csoportba sorolhatjuk. Az I., II. és III. típusúak az úgynevezett azonnali típusú reakciók, míg a IV. késői típusú választ jelent. A táblázatban feltüntettük az egyes reakciótípusok főbb jellemvonásait, a reakció kezdetének idejét valamint néhány példát is hozunk. Rövidítések az ábrán: Ig: Immunglobulin; ADCC: Ellenanyagfüggő sejt közvetített citotoxicitás; SLE: Szisztémás lupus erythematosus; Th: Segítő (helper) T sejt, Tc: citotoxikus T sejt. Gergely János és Erdei Anna: Immunológia tankönyv nyomán, Medicina Könykiadó, Budapest, 2000
2.1.1. Az allergia Az allergia kifejezés a gazdaszervezet megváltozott reaktivitását jelenti egy adott ágenssel való második vagy többszöri találkozás eredményeként [4]. Az ilyen ágenseket allergéneknek nevezzük, mint például a pollen, állati szőrök, atka, penészspórák, különböző állatok mérgei, mikroorganizmusok, élelmiszerek, gyógyszerek, vegyszerek, nehézfémek stb. A legtöbb allergén olyan fehérje, amely természetes körülmények között vagy enzimként működik, vagy meglehetősen nagy a mérete. Az enzimaktivitású allergének proteolízis révén növelhetik a nyálkahártya permeabilitását, a nagyobb mérettel rendelkező allergének pedig irritálhatják a légutakat [5]. Az allergia poligénes-multifaktoriális betegségeket foglal magában. Ez azt jelenti, hogy kölcsönhatás van a specifikus immunválaszt és az IgE termelést befolyásoló gének között, amelyre hatással vannak különböző nem genetikai tényezők is, különösképpen a környezeti allergének szintje és a velük való találkozás gyakorisága. Az allergia az I. típusú, azonnali túlérzékenységi reakciók közé tartozik. A mechanizmus lényege, hogy a szervezetbe jutó allergénhez immunglobulin (Ig) E
8
molekulák kapcsolódnak. Az így kialakult komplex az IgE receptorhoz kötődve (FcRε) előidézi a hízósejtek és bazofil granulociták aktivációját, degranulációját. Az így felszabadult anyagok (például különféle citokinek, hisztamin, prosztaglandinok) gyulladást váltanak ki a szövetekben. A tünetek nagymértékben változnak attól függően, hogy milyen szervben történik az allergiás reakció. Így azok az allergének, melyek levegőben terjednek (mint például a pollen vagy az atkák) elsősorban légúti gyulladást okozhatnak. Ilyen a szénanátha (allergiás rinitisz), melynek jellemző tünetei az orrnyálkahártya megvastagodása, orrváladékozás, tüsszentés, szem irritáció és könnyezés. Az allergén tüdőbe jutása allergiás asztma kialakulását is okozhatja.
2.1.2. Az allergiás asztma 2.1.2.1. Az allergiás asztma definíciója Az asztma bronchiale reverzibilis, obstruktív jellegű ventillációs zavarral, légúti gyulladással, nyálkahártya duzzanattal, és bronchiális hiperreaktivitással járó krónikus tüdőbetegség [6]. Jellemző tünetei a nehézlégzés, köhögés, mellkasi nyomásérzés, a tüdőtájéki sípolás, búgás. Az obstruktív jellegű ventillációs zavar hátterében a légutak azonnali típusú allergiás reakció által okozott gyulladása áll. Az asztmás tüdőben a gyulladásos válasz során limfociták és eozinofil granulociták infiltrációja figyelhető meg [7-8]. Feltételezik a 2-es típusú segítő (helper) T sejtek (Th2) által termelt citokinek (például az IL-4, -5, -6) [9] döntő szerepét, melyek részt vesznek az eozinofilek toborzásában és a gyulladás kiváltásában [10-11]. Ismert továbbá, hogy az eozinofil granulociták és a belőlük származó molekulák megjelenése a légutakban összefüggésbe hozható az allergiás asztma tüneteinek megjelenésével [12-13]. Az asztma és az atópia kialakulása korai stádiumban gátolható Th1 típusú citokinekkel (pl. interferon (IFN) -γ) [14].
9
2.1.2.2. Az asztma prevalenciája Számos, különböző populációkon végzett tanulmány kimutatta, hogy a fejlett ipari országokban az asztma prevalenciája az elmúlt 20 évben jelentős mértékben emelkedett [15-16]. Európa legtöbb országában az átlagos asztma-prevalencia 5-10% körüli [17]. Az asztma öröklésmenete nem követi a Mendel-törvényeket, genetikai vizsgálatok során eddig több mint 500 gént azonosítottak, melyeknek szerepe lehet az allergiás hajlam, és az asztma iránti fogékonyság kialakításában [18]. Mindezek ellenére elsősorban a környezeti tényezőket teszik felelőssé az asztma előfordulási gyakoriságának növekedéséért, mely összefüggésbe hozható a „nyugati életforma” vívmányainak terjedésével. Számos tényező szerepét kimutatták az allergiás betegségek és az asztma kialakulásában: ilyenek bizonyos allergének (pl.: házipor-atka, parlagfű) [19-20], környezetszennyező anyagok [21]; a táplálkozási szokások megváltozása [22]; és a túlzott antibiotikum-használat [23]. Az 1980-as évek végén született meg az úgynevezett
higiénia
hipotézis
[24],
amely
szerint
az
asztma
megjelenési
gyakoriságának növekedése összefüggésbe hozható a megváltozott, jobb lakóhelyi higiéniával, a védőoltások bevezetésével és az antibiotikumok használatával. A higiénia hipotézis immunbiológiai alapját az adja, hogy az immunrendszer normál érése során a Th1/Th2 egyensúly eltolódását az élettani Th1 irányba bakteriális és vírusos infekciók irányítják,
mintegy
ellensúlyozva
az
újszülött
kori
fiziológiás
Th2-típusú
immundominanciát [25]. Ha a szervezet mikrobiális terhelése a korai életkorban elmarad, az a Th1-típusú immunválasz gyengülését és az allergiás betegségek kialakulásához vezető kiegyensúlyozatlan Th2 túlsúlyt eredményezheti [26]. Azonban bizonyos gyermekkori vírusinfekciók (RSV, parainfluenza- és rhinovírusok) esetében ez a protektív hatás nem igazolható, ellenkezőleg, az IgE-termelődés fokozódását okozhatják [27].
2.1.2.3. Az asztma patomechanizmusa Az
asztmával
kapcsolatos
legkorábbi
ismereteink
kórbonctani
vizsgálatokból
származnak [28]. Dunnill és munkatársai 1960-ban húsz elhúnyt asztmás beteget
10
tanulmányozott. Tüdőemphysemát nem tapasztaltak, azonban nyákdugókat mutattak ki a légutakban. Leírták a csillós bronchiális epitélium és mukózasejtek károsodását valamint szubmukóza eredetű ödéma folyadék megjelenését a bronchiális lumenben. Mai ismereteink szerint azonban az asztma jóval bonyolultabb betegség, komplex kórélettani folyamatok összessége. Az alábbiakban a legfontosabb jellemzőket tekintjük át: úgy mint légúti túlérzékenység (hiperreaktivitás) [29], légúti gyulladás [30], gyulladásos mediátorok [31-32].
2.1.2.3.1. Légúti hiperreaktivitás (AHR) Az asztma jellemző tünete a mellkas tájéki szorító érzés és a köhögés, melynek hátterében a provokatív anyagok (pl. allergén) hatására kialakuló légúti simaizomgörcs állhat. A légúti hiperreaktivitás hozzájárul a légúti szűkület és az elzáródás (obstrukció) létrejöttéhez, ugyanis a hörgőhám meglehetősen duzzadt és a kehelysejtek nyákkiválasztása is erőteljes. A fokozott légúti válaszkészség és az asztmás légúti gyulladás között nem mutattak ki szoros kapcsolatot, így feltételezik, hogy más-más mechanizmus révén alakul ki a kétféle tünet [33-34]. A légúti hiperreaktivitás jól vizsgálható kísérletes körülmények között, ugyanis metakolin növekvő dózisának légutakba juttatásával asztmás reakció idézhető elő rágcsálókban.
2.1.2.3.2. Légúti gyulladás és a gyulladásos sejtek Az asztma egyik legfőbb sajátsága a pro-inflammatorikus sejtek és az általuk kiváltott gyulladás jelenléte a légutakban [28]. Ez a jelenség már az újonnan diagnosztizált betegek esetében is megfigyelhető. A légutak falába limfociták, eozinofil és neutrofil granulociták és hízósejtek vándorolnak [35]. A tüdőből származó biopszia mintákból és a légutak átmosásával nyerhető bronchoalveoláris folyadékból ezek a sejtek egyaránt kimutathatóak és aktivált állapotuk is bizonyított [30]. Egyes adatok szerint az általuk előidézett gyulladás mértéke szoros összefüggésben van az asztma klinikai súlyossági fokával [36]. Az asztma kapcsán megkülönböztethetjük az extrinsic (atópiás) és
11
intrinsic (nem atópiás) asztmát. Az előbbi az allergiás asztmát jelenti, az utóbbi rendszerint idős korban alakul ki és lefolyása is súlyosabb, de tüneteik nagyon hasonlóak [37]. Jellemző a túlzott mértékű immunaktiváció, mely az allergén hatására kialakuló fokozott IgE termelődés következménye, és amely idővel krónikus légúti gyulladást idézhet elő [38]. Az ebben a folyamatban szereplő tényezőket azonban még alig ismerjük. Bár az asztma patomechanizmusában az immunsejtek közül szinte valamennyi sejtféleség részt vesz, az alábbiakban a Th2 limfociták, hízósejtek, makrofágok, eozinofil és neutrofil granulociták szerepét emeljük ki. A Th2 sejtek mind az asztma kialakításában, mind fenntartásában alapvető fontosságúak [9]. A mesterségesen előidézett Th2 túlsúly önmagában elegendőnek bizonyult az asztmában tapasztalható AHR, légúti gyulladás és egyéb szövettani eltérések kialakulásához [39]. A gyulladásos sejtek közül kiemelt szerepet kapnak a hízósejtek, melyek krónikus aktivációja és degranulációja az asztma egyik tipikus jelensége. Számuk összefüggést mutat az AHR súlyosságával [40], ezen kívül kapcsolódni képesek simaizom sejtekkel és hozzájárulnak a légúti remodeling folyamatához is, ami a légutak szöveteinek fibrotikus elváltozását jelenti [41]. Szerepet játszanak a simaizom görcs kialakulásában és a kehelysejtek nyáktermelésének fokozásában, mely a légutak obstrukciójához vezethet [42]. A hízósejtek sejtfelszíni FcεRI-et fejeznek ki, melyhez ha az allergén-IgE komplex hozzákötődik, olyan sejten belüli jelátviteli folyamatok indulnak el, melyek a hízósejtek degranulációját eredményezik [43]. A folyamat során felszabaduló mediátorokat a következő részben részletesebben áttekintjük. A légutakban található alveoláris makrofágok felszínén ugyancsak találhatóak IgE megkötésére alkalmas receptorok (FcεRII). Bár ezek affinitása alacsonyabb, allergének hatására aktiválódhatnak és hozzájárulhatnak az asztmára jellemző citokinkörnyezet kialakításához [44]. Az asztma fontos jellemzője továbbá, hogy a tüdőszövetbe nagy számban eozinofil granulociták vándorolnak és jelenlétük a BAL folyadékban is kimutatható [45]. Ezek a sejtek közreműködnek az AHR kialakításában [46]. Sejtfelszínükön olyan adhéziós molekulák, integrinek találhatóak (pl.: leukocita funkcionális antigén-1 – LFA-1), melyek a vaszkuláris endotél sejtek felszínén található intercelluláris sejtadhéziós molekula
1-vel
(ICAM-1)
kapcsolódva
12
elősegítik
az
eozinofil
granulociták
extravazációját, szövetbe vándorlását [47]. Ez az extravazáció kemotaktikus anyagok, mint például eotaxin-1 és a makrofág kemotaktikus protein 4 (MCP-4) hatására valósul meg [48]. A légúti gyulladás mechanizmusát szemléletesen az 1. ábra mutatja be.
1. ábra. A légúti gyulladás kialakulásának folyamata Légút Csontvelő Antigén
Hízósejt
Th2 sejt
Eozinofil granulocita Légúti károsodás
Hisztamin, leukotriének
IL-4 GM-CSF IL-5
Túlélés
Granulum fehérjék, Leukotriének
Citokin aktiváció
Kemokinek (RANTES, eotaxin, MCP-1, MIP-1α
Szelektin VCAM-1 ICAM-1
Transzmigráció Adhézió Endotélium Vér
A belélegzett antigének hízósejteket és Th2 sejteket aktiválnak a légutakban és megkezdődik a gyulladásos mediátor molekulák (mint a hisztamin és a leukotriének) és gyulladásos citokinek (interleukin (IL)-4 és IL-
13
5) fokozott termelődése. Az IL-5 a csontvelőben elősegíti az eozinofil granulociták terminális differenciációját. A cirkuláló eozinofilek a gyulladásos területhez érve kilépnek a véráramból és megkezdődik bevándorlásuk a tüdőszövetbe. Ez a folyamat adhéziós molekulák (szelektinek; integrinek; vaszkuláris sejtadhéziós molekula (VCAM)-1; intercelluláris adhéziós molekula (ICAM)-1) közreműködésével zajlik. Amikor az eozinofil granulociták számos citokin és kemokin hatására a szövetbe lépnek, túlélésüket az IL-4 és a granulocita-makrofág kolóniastimuláló faktor (GM-CSF) biztosítja. Aktivációjukat követően az eozinofilekből újabb gyulladásos mediátorok (leukotriének, granulum fehérjék) szabadulnak fel, és ez a tüdőszövet károsodásához vezet. Továbbá az eozinofilek képesek GM-CSF-et is termelni, ezáltal saját elősegítik túlélésüket és fenntartják a légúti gyulladást. Rövidítések: MCP-1: monocita kemotaktikus fehérje; MIP-1α: makrofág gyulladásos fehérje. Forrás: Massachusetts Medical Society, 2001 nyomán
A neutrofil granulociták az asztmás betegek közül is elsősorban a súlyosan asztmások légutaiban találhatóak meg [49]. IL-8 hatására számuk a szövetben jelentősen megnő [50], és hozzájárulhatnak az akut asztma kialakulásához.
2.2. Gyulladásos mediátorok A gyulladásos sejtek által termelt mediátorok kulcsfontosságúak az asztma patomechanizmusában. A Th2-es citokinek (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13) szerepet játszanak a gyulladás kialakulásában, megemelkedett mennyiségüket a BAL-ban és a bronchusbiopszia mintákban egyaránt leírták [51]. Az IL-4 központi szerepet tölt be a B sejtek aktiválásában, az IgG és IgE irányú izotípusváltásban, az IL-5 fokozza az eozinofil granulociták proliferációját. Az IL-6 részt vesz a T és B sejtek differenciációjában, serkenti az ellenanyag termelést. Az IL-13 hatása az IL-4-hez hasonló [4]. A hízósejtekből gyulladást előidéző (interleukin – IL-4, IL-5, IL-13) és fibrózist kiváltó citokinek (transzformáló növekedési faktor-β – TGF-β, fibroblaszt növekedési faktor – FGF), és további tipikus gyulladásos mediátorok (hisztamin, prosztaglandinD2, leukotriénC4), valamint szerinproteázok (triptáz, kimáz) szabadulhatnak fel [42]. Az IL4 és IL-13 részt vesznek a krónikus gyulladás fenntartásában is. A hisztamin kiemelkedő, kulcsfontosságú szerepét külön fejezetben részletesebben tárgyaljuk. A makrofágok által termelt IL-10 és IL-12 mennyisége asztmában csökken, ami hozzájárul az asztmára jellemző Th2 típusú immunválasz kialakulásához [52]. Az eozinofil granulociták által termelt mediátorok - mint a fő bázikus protein (MBP), eozinofil kationos protein (ECP), és az eozinofil peroxidáz (EP) – súlyosbíthatják a
14
gyulladást azáltal, hogy hozzájárulnak az asztmában megfigyelhető légúti epiteliális károsodás kialakulásához [53]. A B sejtek plazmasejtekké differenciálódva IgE termelésre képesek, mely molekula kulcsfontosságú szerepet tölt be az asztmás reakciók során, ahogyan arra már a fentiekben is utaltunk. A B sejtek IgE termelő plazmasejtté differenciálódásához az IL-4 és IL-13 citokinek jelenléte nélkülözhetetlen [54]. Munkánk során több esetben is vizsgáltuk az általunk választott célmolekulák és a hízósejtek által termelt hisztamin közötti összefüggést, ezért a fent említett mediátor molekulák közül a hisztamint az alábbiakban részletesen tárgyaljuk, külön kitérve a hisztamin előállításáért felelős hisztidin dekarboxiláz enzimre is.
2.2.1. A hisztamin 2.2.1.1. A hisztamin jellemzői A hisztamin egy kismolekulás biogén amin. Kémiai értelemben az L-hisztidin aminosavnak karboxil-csoportját elvesztett, „csonka” módosulata (2. ábra).
2. ábra. A hisztamin keletkezése.
Hisztamin
L-hisztidin HDC enzim
Dekarboxiláció
A hisztamin L-hisztidinből alakul ki dekarboxiláció útján. A folyamatért a hisztidin-dekarboxiláz (HDC) enzim felelős.
15
2.2.1.2. A hisztamin hatásai, receptora A hisztamin hatását receptorain keresztül fejti ki. Jelenleg négy különböző hisztamin receptor ismert (H1R, H2R, H3R, H4R). Valamennyi integráns, 7 transzmembrán doménnel rendelkező, G-proteinhez kapcsolt plazmamembrán-receptor (3. és 4. ábra).
3. ábra. A humán H1R elsődleges szerkezete.
A hisztamin receptor egy 7 transzmembrán doménnel rendelkező plazmamembrán receptor. A jelátvitelhez szükséges lehetséges foszforilációs helyeket (szerin és treonin) fekete jelölés mutatja. Horio S. és mtsai.:J Pharmacol Sci. 94(4):410-419, 2004.
16
4. ábra. A hisztamin receptor vázlatos szerkezete.
β
γ Gα
A hisztamin receptor hét transzmembrán doménnel rendelkező, G-proteinhez kapcsolt plazmamembrán receptor. Az α,β,γ a G-fehérje három alegységét jelöli.
A H1R az érfal-endotél, a simaizom sejtek, a mellékvesevelő bizonyos sejtjei, a szívizomsejtek, a központi idegrendszer számos neuronja, és sok fehérvérsejt felszínén is megjelenik [55]. Az általa közvetített hatások jelentős része megfigyelhető az allergiás válasz során. A H1R-on keresztüli jelátvitel kiválthatja a hörgőkben és a tápcsatornában a simaizomzat összehúzódását, az érfal-permeabilitás növekedését, és végül az allergiás válaszra jellemző vazodilatációt [56]. Az azonnali típusú hiperszenzitivitás kezelésére alkalmazott H1R antagonisták („anti-hisztaminok”) a klinikumban nagy jelentőségűek [57]. A H2R erőteljes kifejeződése elsősorban a gyomornyálkahártyában
figyelhető
meg
[55],
legfontosabb
szerepe
a
gyomornyálkahártya sósav-szekréciójának szabályozása [58]. Kimutatták azt is, hogy a H2R főként immunszuppresszív, illetve részben Th2-jellegű immunmodulatórikus jeleket közvetít [59-60]. A H1R-hez hasonlóan a H2R is jelen van T-sejteken, azonban míg a H1R elsősorban Th1 sejteken, addig a H2R a Th2 sejteken expresszálódik [61]. A H3R mennyisége a szervezetben sokkal kevesebb, a neuronok által felszabadított hisztamin mennyiségét szabályozza negatív visszacsatolási hurok révén [62]. Továbbá szerepe van az étvágy, a figyelem, a memória, a cirkadián ritmus, és az alvás közbeni testhőmérséklet szabályozásában is [63-64]. A H4R kizárólag csontvelői eredetű sejteken, így bazofileken, eozinofileken, hízósejteken, dendritikus sejteken, és egyes Tlimfocitákon jelenik meg [65]. Ez a hisztamin receptor valószínűleg kemotaktikus jeleket közvetít az eozinofil granulociták és a hízósejtek számára, ugyanis ovalbuminszenzitizált H4R génkiütött állatok tüdejében az allergénprovokációt követően
17
jelentősen csökkent az eozinofil granulociták és hízósejtek szöveti infiltrációja a vad típusú állatokéhoz képest [66].
2.2.1.3. A hisztamint előállító hisztidin dekarboxiláz (HDC) enzim Jelen kísérleteinkben a kísérleti állatként használt háziegér szervezetében az emberéhez hasonlóan a hisztamin előállításáért egyetlen enzim, az L-hisztidin karboxilcsoportját eltávolító L-hisztidin dekarboxiláz (HDC) a felelős. Felnőtt szervezetben a legerőteljesebb HDC-expresszióért és hisztamin-szintézisért a szöveti hízósejtek felelősek [67]. Ezt bizonyítja, hogy a HDC-t kódoló gén kifejeződésének, expressziójának mértéke szövetmintákban általában szoros összefüggést mutat a lokális hisztamin-bioszintézis intenzitásával [68-69], illetve, hogy a gén célzott kiütése megszünteti az endogén hisztamin szintézist a genetikailag módosított, HDC génkiütött (HDC-/-) egerek szervezetében [69]. Az L-hisztidin dekarboxilázt kódoló gén emberben a 15. kromoszómán [70], egérben a 2. kromoszómán lokalizálódik, és mindkét esetben csak egyetlen kópiában van jelen a genomban [71]. Mivel a két faj között a kódoló régiók szekvencia azonossága viszonylag nagy, exononként közel 80-90% [72], a génkiütött állatmodell kapcsán tett felismerések alkalmasak lehetnek általános érvényű következtetések megállapítására is.
2.3. Az allergiás asztma kísérletes állatmodellje A kísérletes állatmodellek révén lehetőség nyílik betegségek patomechanizmusának tanulmányozására, így az asztma hátterében álló folyamatok feltérképezésére is. Az állatok az asztmára jellemző tüneteket produkálják: szövettani módszerrel kimutatható az eozinofil granulociták és hízósejtek infiltrációja a peribronchiális és perivaszkuláris térbe, a Th2-es típusú citokinek fokozott termelése, illetve a légúti túlérzékenység [73]. A modell előnye, hogy reprodukálható módon lehetővé teszi a betegség lefolyásának tanulmányozását, génkiütött állatok bevonásával pedig egy-egy gén illetve géntermék lehetséges
szerepe
is
vizsgálható,
ami
18
hozzájárulhat
új
terápiás
eljárások
kifejlesztéséhez. Az állatmodell esetleges hiányossága, hogy szervezetük az emberhez képest kissé eltérően reagál, ugyanis egerek esetében az asztma lefolyása gyorsabb [74] és feltehetően nem következik be a hízósejt és granulocita degranuláció sem [75]. A vizsgálatok többféle protokoll szerint történhetnek (2. táblázat). A különböző típusú allergének (pl. házipor-atka antigén (Der), ovalbumin (OVA) [76-77], a kezelés gyakorisága és időbeli variabilitása, az allergén bejuttatási módja [78], valamint eltérő adjuvánsok (pl. Alumínium-hidroxid (Al(OH)3), B. pertussis) [79] alkalmazása mind más környezeti hatást modellezhetnek. Az allergiás asztma „klasszikus” és legáltalánosabban elfogadott állatmodellje az úgynevezett OVA-indukált allergiás gyulladás és AHR kísérletes modell. Az OVA többféle módon eredményezhet asztmás tüneteket, illetve válthat ki Th2 típusú reakciót: szubkután adjuváns nélkül az állatba juttatva, orálisan kolera toxin adjuvánssal adva, illetve alumínium-hidroxid adjuváns kíséretében intraperitoneális (i.p) injekció [80-81] formájában alkalmazva. A kísérletes modellünkben alkalmazott BALB/c egerek erőteljes légúti hiperreaktivitást mutatnak provokációt követően [82], ezért alkalmazásuk előnyösebb más egértörzsekkel szemben.
2.
Táblázat.
Néhány,
az
asztmás
tünetek
előidézésére
szolgáló
protokoll
összehasonlítása. Szenzitizáló reagens
Adjuváns
OVA
-
OVA
-
Procedúra 3x1 hetes perkután szenzitizálás 2 hetente, majd porlasztott OVA inhaláció 10 napos antigén inhaláció naponta
Kiváltott betegség Asztma Asztma
OVA+Al(OH)3 szuszpenzió i.p. 0.és 14. OVA
Al(OH)3
nap, majd 1%-os OVA inhaláció a 28., 29., 30. napon. Végül 32. napon 5%-os
Asztma
OVA inhaláció Elölt B.pertussis+OVA+Al(OH)3 „T sejt”
-
szenzitizált állat T sejtjeinek i.p átadása másik egérbe
19
Késői asztmás reakció
Kísérleteink során a harmadik típusú protokollt használtuk. Rövidítések a táblázatban: OVA: ovalbumin; Al(OH)3: alumínium-hidroxid; B. pertussis: Bordatella pertussis baktérium
Szenzitizálás során az állatot „érzékenyítjük” az allergénnel szemben, és ha legközelebb a „provokáció” során találkozik az antigénnel, akkor arra kórosan fokozott válasszal reagál. Az eozinofil granulociták száma nő, tüdőbe vándorlásuk fokozódik, és megjelennek a BAL-ban is [83]. Továbbá T sejtek és neutrofil granulociták is kimutathatóak BAL-ban [84]. A légúti gyulladást végső soron a T limfociták irányítják, és ezek a sejtek felelősek az AHR kialakulásáért is. Az eozinofil granulociták, a hízósejtek és a termelt citokinek (pl. az IL-13) csupán csak közvetítő szerepet töltenek be. Feltételezhető, hogy az eozinofilek az AHR legfontosabb sejtes mediátorai közé tartoznak [73].
2.4. A galektin molekulacsalád 2.4.1. A galektinek definíciója és felosztásuk A galektin (Gal) családba olyan fehérjék tartoznak, melyek ß-galaktozid kötésére képesek és szénhidrát-felismerő doménjük (CRD) megközelítőleg 130 aminosavnyi konzervált szekvenciát tartalmaz [85]. A magas fokú homológiára utal, hogy filogenetikai analízis révén a galektin család több tagját megtalálták fonálférgekben, rovarokban és emlősökben egyaránt [86]. Jelenleg a család 15 tagja ismert. Szerkezetük és a bennük található CRD-k száma alapján három fő csoportba sorolhatóak: proto típusú, kiméra típusú és tandem-ismétlődésű galektinek [87]. A proto típusú galektinek (Gal-1,-2,-5,-7,-10) egy CRD-t tartalmaznak, és bár előfordulhatnak monomer formában is, rendszerint homodimereket képeznek, ezáltal két homológ szénhidrát megkötésére képesek [88]. A kiméra-típusba csupán egyetlen rendhagyó szerkezetű galektint, a Gal3-at soroljuk, mely egy CRD-vel rendelkezik és relatív hosszú N-terminusa egy nemlektin domént is tartalmaz. Ez utóbbi egy nem-szénhidrát típusú ligandumot köt. Multivalens szénhidrát kötődése esetén a Gal-3 multimert is képezhet [89] (5. ábra).
20
5. ábra. Példa a galektinek dimerizációjára illetve multimerizációjára.
Galektin-1
Ligandfüggetlen dimerizáció
Galektin-3
Ligandfüggő multimerizáció
A kötési képesség növelése céljából az egyes galektin monomer egységek között kölcsönhatás lép fel. A Gal-1 ligandfüggetlen módon képes monomerekből dimereket képezni, míg a Gal-3 egyedülálló módon ligand jelenlétében multimerizációra hajlamos.
A harmadik csoportba a tandem-ismétlődésű galektinek (Gal-4,-6,-8,-9) tartoznak, melyeknek két eltérő CRD-je két különböző típusú szénhidrát megkötésére szolgál. A két nem identikus CRD-t egy rövid, közel 70 aminosavat tartalmazó peptidszakasz kapcsolja össze [90]. A galektinek felosztását szemléletesen az 6. ábra mutatja be.
21
6. ábra. A galektinek csoportosítása.
Prototípus
Két azonos CRD
Galektin-1,2,5,7,10 Két homológ szénhidrát ligandumot köt
Kiméra-típus
Nem-lektin domén
Tandem-ismétlődésű
CRD
Galektin-3 Egy szénhidrát és egy nem-szénhidrát ligandumot köt
Két eltérő CRD
Galektin-4,6,8,9 Két eltérő szénhidrát ligandumot köt
Szerkezetük alapján a galektinek három típusát különböztetjük meg. A prototípusú galektinek (Gal-1,-2,5,-7,-10) két azonos szénhidrát-felismerő doménnel (CRD) rendelkeznek, és két homológ szénhidrát megkötésére képesek. A kiméra-típusba csak egyetlen galektin, a Gal-3 tartozik, mely egy CRD-t és egy nem-lektin domént tartalmaz. Ez utóbbi egy nem-szénhidrát típusú ligandumot köt. A tandemismétlődésű galektinek (Gal-4,-6,-8,-9) két eltérő CRD-je két különböző szénhidrát megkötésére szolgál. Forrás: Jun Hirabayashi. Galectin: Definition and History, GlycoWord nyomán
A galektinek szénhidrátkötése kalciumtól független módon történik [91]. A galektinek N-acetil-laktózaminokhoz kötődnek, leggyakrabban a Galb1,4GlcNAc (LacNAc) tartalmú glikokonjugátumokat ismerik fel, melyek számos N- vagy O-kapcsolt glikánon található közönséges diszaharidok [92-93]. Számos galektin bivalens vagy multivalens módon kötődik a szénhidrátokhoz, így lehetővé teszik a sejtfelszíni glikoproteinek keresztkötését, illetve azok átrendeződését [94]. Érdekes sajátságuk továbbá, hogy ezeknek a fehérjéknek nincs szignál peptidjük, és ebből adódóan nem a klasszikus, endoplazmatikus retikulum- és Golgi-függő úton kerülnek a sejten kívülre, hanem aktív módon szecernálódnak az extracelluláris térbe [95-96].
22
2.4.2. A galektinek funkciói A galektinek jelenlétét számos fajban sikerült kimutatni, a szivacsoktól kezdve egészen az emlősökig [97]. Mindez arra utal, hogy létfontosságú szerepet tölthetnek be az alapvető sejtes működésben. Munkánk során a Gal-1, Gal-3 és Gal-9 molekulákat vizsgáltuk, a továbbiakban az ezekkel kapcsolatos ismereteinkről szeretnénk egy keresztmetszeti képet adni. A Gal-1 és Gal-3 nukleáris lokalizációja arra utal, hogy ezek a molekulák részt vesznek a pre-mRNS splicing szabályozásában [98-99]. Wang J.L. és kutatócsoportja leírta, hogy a Gal-3 egyike azon fehérjéknek, melyek sok más fehérjével együtt azt a spliceosomaként ismert ribonukleoprotein komplexet képezik [100-101], amely a premRNS nem kódoló régióinak (intronok) eltávolításáért és a megmaradt kódoló exonok összekapcsolásáért, ezáltal a funkcionális mRNS létrejöttéért felelős. Gal-3 specifikus monoklonális anti-Mac-2 ellenanyag segítségével depletálták a molekulát [102], és jelentős mértékű splicing aktivitáscsökkenést tapasztaltak. Ezzel a módszerrel később kimutatták, hogy a Gal-3-hoz hasonlóan a Gal-1 is alkotóeleme a spliceosoma komplexnek [98]. Nukleáris hatásaik mellett a galektinek extracelluláris jelenléte arról tanúskodik, hogy részt vehetnek a sejt-sejt és sejt-mátrix interakciókban (7. ábra). Szerepüket a sejtes adhézió, migráció és túlélés folyamatában egyaránt kimutatták [94, 103].
7. ábra. Galektinek által mediált sejt-szubsztrát adhézió.
23
Galektin Integrin Más receptorok
A.) A szolúbilis (S) galektinek alacsony koncentrációban elősegítik a sejtek kötődését az extracelluláris mátrix fehérjéihez – pl. a lamininhez (LN) és fibrinektinhez (FN) - mintegy hidat képezve a sejt felszínén található különféle galektin sejtmembránreceptor és a LN/FN között. B.) Az immobilizált galektinek sejtadhéziót indítanak a sejtmembrán galektin receptorainak keresztkötése révén. Nagy koncentrációjú S galektin adása a sejtekhez azonban az adhézió megszűnését eredményezi azáltal, hogy kölcsönhatásba lép a receptorokkal. C.) A LN-hez és a FN-hez horgonyzott sejtek esetében az S galektin adása a meglévő adhézió megszűnését segíti elő. A galektinek kötődnek a LN-hez, a FN-hez, a galektin sejtmembrán receptorokhoz, valamint az integrinekhez, amik önmagukban is kötik a LN/FN-t. D.) Speciálisan tervezett, galektint fokozottan kifejező sejtek lektint szecernálnak az extracelluláris környezetbe. A galektin ezt követően elősegítheti a sejt adhézióját a LN/FN-hez, másrészt gátolhatja is az adhéziót azáltal, hogy kapcsolatba lép a LN/FN-nel és az integrinnel. Az, hogy melyik folyamat valósul meg, függ a galektin és a sejt típusától, a szecernált galektin mennyiségétől és a sejtfelszíni galektinreceptoroktól. A fenti modell egyszerűsített, ugyanis léteznek más sejtfelszíni galektinreceptorok is: lizoszóma-asszociált membrán fehérje 1 és 2 (LAMP-1 és LAMP-2), Thomsen-Friedenreich antigén (TFAg), glikoprotein 90K/Mac-2BP, daganat antigén CA125, karcinoembrionális antigén (CEA), GM1 gangliozid, stb. Elola MT. és mtsai.:Cell Mol Life Sci. 64:1679-1700, 2007 nyomán.
Az utóbbi évtizedben a galektinek számos olyan biológiai funkciójára is fény derült, melyek kapcsolatba hozhatóak az immunválasszal, a gyulladással (8. ábra), a celluláris
24
homeosztázissal és a tumor fejlődéssel [104]. Úgy vélik, hogy a galektinek regulációs szerepkörüket azáltal fejtik ki, hogy interakcióba lépnek intracelluláris fehérjékkel [105].
8. ábra. A galektin (Gal) -1, -3, és -9 által kontrollált mechanizmusok a gyulladás során.
T-sejt apoptózis Hízósejt degranuláció
Eozinofil adhézió Monocita aktiváció Neutrofil adhézió
Makrofágok általi fokozott neutrofil fagocitózis
T-sejt
Neutrofilek általi fokozott fagocitózis
A Gal-1, -3, -9 molekulák sokféle hatást gyakorolnak az érrendszerre. A Gal-1 gátolja a polimorfonukleáris leukociták (PMN) és T-sejtek adhézióját és migrációját. Ezzel szemben a Gal-3 elősegíti a PMN sejtek adhézióját az endoteliális sejtekhez és az extracelluláris mátrix komponenseihez. A Gal-9 az eozinofil granulociták toborzásában vesz részt. Mindhárom galektin T-sejt apoptózist indukál, míg a Gal-1 és Gal-3 apoptózis hiányában fokozza a foszfatidil-szerin (PS) megjelenését a PMN sejteken. A Gal-3 proinflammatórikus hatását mutatja, hogy serkenti a monociták IL-1 termelését, a hízósejtdegranulációt és a PMN sejtek reaktív oxigéngyök (ROS) és IL-8 képzését. A Gal-9 szintén fokozza az eozinofilek ROS termelését. A Gal-1 koncentrációfüggő módon hat. Nagy mennyiségben a Gal-1 a PMN
25
sejtek ROS termelését fokozza. A Gal-3 elősegíti továbbá az apoptotikus PMN sejtek makrofágok általi fagocitózisát, és hozzájárul a PMN sejtek baktérium-fagocitáló képességéhez is. Norling VL. és mtsai.:J Endocrinology. 201:169-184, 2009 nyomán.
2.4.3. A Gal-1 molekula jellemzése A Gal-1 az elsőként azonosított galektin az emlősökben, expresszióját kimutatták epitélsejtekben [106], neuronokban [107], és az immunrendszer többféle sejtjében, így makrofágokban [108], T és B limfocitákban is [109-110]. A proto típusú galektinek közé tartozik, két azonos CRD-vel rendelkezik, és két homológ szénhidrát megkötésére képes. Kristályszerkezetét a 9. ábra mutatja be.
9. ábra. A galektin-1 (Gal-1) kristályszerkezete.
A.
90°-kal elforgatott
Oldalnézet B.
Ligandot kötő CRD szerkezete
Ligand nélküli CRD szerkezete
26
Röntgen-krisztallográfiás eljárással felderített szerkezeti kép ligand (laktóz) jelenlétében. A.) A két azonos monomer (kék és sárga színnel jelölt) homodimert képez. Az alegységek közötti kapcsolat a karboxi- és amino-terminális domének kölcsönhatása révén valósul meg. B.) A Gal-1 szénhidrátfelismerő doménjének (CRD) szerkezete. A fő aminosav-maradékok interakciója ligand kötése esetén (bal oldali ábra) és ligand hiányában (jobb oldali ábra). Consortium of Glycobiology, La Jolla, Kalifornia, 2009 nyomán.
Az utóbbi évek kutatásai során fény derült arra is, hogy a Gal-1 specifikus apoptotikus [110-112], anti-adhéziós [113], immun szuppresszív és anti-inflammatórikus [114] sajátságokkal rendelkezik. Mindezek révén feltehetően fontos szerepet tölthet be az asztmás gyulladás gátlásában. Kimutatták azonban azt is, hogy ez a lektin az immunrendszer egyensúlyát Th2 irányba polarizálja azáltal, hogy fokozza az IL-5 produkciót [112-113], ami viszont az asztma progressziójának kedvezhet, ugyanakkor a Gal-1 pontos szerepe az asztmában részleteiben még kevéssé ismert.
2.4.4. A galektin-3 (Gal-3) molekula sajátságai Ahogy már a fentiekben utaltunk is rá, a Gal-3 (más néven Mac-2) szerkezetét tekintve rendhagyó a galektin család többi tagjához képest, ugyanis a kiméra-típusba tartozik. Egyetlen CRD-vel rendelkezik és N-terminusa relatív hosszú, ami egy nemlektin domént tartalmaz. Ez utóbbi nem-szénhidrát típusú ligandumot köt. További sajátossága, hogy multivalens szénhidrát kötődése esetén a Gal-3 multimert képezhet [89]. A molekula krisztallográfiás szerkezetét a 10. ábra mutatja.
27
10. ábra. A galektin-3 (Gal-3) kristályszerkezete.
Röntgen-krisztallográfiás eljárással felderített szerkezeti kép ligand jelenlétében. Consortium for Functional Glycomics, 2002-2003.
Egyre több irodalmi adat utal arra, hogy a Gal-3 szerepet játszik az asztma patogenezisében [115-117]. A Gal-3 sejtproliferációt idézhet elő [118], illetve megakadályozhatja az epitélsejtek [119], T sejtek [120-121], fibroblasztok [122], monociták, neutrofil granulociták, hízósejtek és bazofilek apoptózisát [123], melyek az asztma fontos effektor sejtjei. A Gal-3 a sejt-sejt és sejt-mátrix interakciók kialakításának elősegítésével [124-125] hozzájárulhat olyan, asztmás gyulladásban fontos sejtek kemotaxisához, mint például a neutrofil és eozinofil granulociták, monociták, makrofágok [115]. A Gal-3 befolyásolja a Th1/Th2 egyensúlyt [126] is azáltal, hogy csökkenti az eozinofil granulociták és az allergén specifikus T sejtek IL-5 termelését [127-128]. Az utóbbi évek kutatásai igazolták, hogy mind a Gal-3 hiánya, mind pedig a Gal-3-mal történő kezelés befolyásolja az asztmás tüneteket OVAindukált asztmamodellben [116]. López E. és munkatársai allergizált rágcsálók szervezetébe intranazálisan Gal-3 gént kódoló plazmidot juttattak, melynek hatására az eozinofil granulociták száma csökkent, a nyáktermelődés és a légúti hiperraktivitás enyhült és a krónikusan asztmás állatokban a fibrózis mértéke is csökkent [117]. A Gal3 jelenlétét számos szövetben kimutatták, különféle epitél és mieloid sejtekben [129]. A
28
Gal-3 fő forrásai az alveoláris makrofágok [130], de más immunsejtek is termelhetik: neutrofil [131], eozinofil [132], bazofil granulociták és hízósejtek [133], dendritikus sejtek [134]. A tüdőben a Gal-3 képes néhány IgE glikoformával interakcióba lépni, ami hízósejteket és bazofileket aktiválhat és hisztamin szecernálódását idézheti elő az asztma során [133]. A fentiek alapján a Gal-3-nak több ponton is szerepe lehet az asztma patogenezisében, de a Gal-3 regulációáért felelős pontos mechanizmussal kapcsolatban ismereteink meglehetősen hiányosak.
2.4.5. A galektin-9 (Gal-9) molekula bemutatása A Gal-9 egy tandem-repeat típusú, két CRD-t tartalmazó heterodimer fehérje. Demonstratív jelleggel az N-terminális CRD krisztallográfiás eljárással meghatározott szerkezetét a 11. ábra mutatja be.
11. ábra. A galektin-9 (Gal-9) N-terminális CRD-jének kristályszerkezete
Forrás: SMART adatbázis (http://smart.embl-heidelberg.de). Rövidítés: CRD: szénhidrát felismerő domén
29
A Gal-9-et elsőként Hodgkin-szindrómás betegek tumoros nyirokszövetéből és perifériás véréből izolált leukocitákból klónozták [135]. Tüdőben és immunkompetens sejtekben is expresszálódik [136]. Számos funkciója van, többek között, mint eozinofil kemoattraktáns [137], urát-transzporter [138], tumor antigén [135], timocita-epitél sejtinterakciók regulátora [139] és apoptózis mediátor [140] is szerepet játszik. Kimutatták, hogy a Gal-9 a Th1 sejtek apoptózisát indukálja T sejt immunglobulin domén és mucin domén (Tim)-3 dependens módon, a Th2 sejtekét azonban nem [141]. Más betegségek kapcsán leírták, hogy a Gal-9 szuppresszálja a Th17 sejtek képződését, előmozdítja a regulátoros T sejtek kialakulását és a Gal-9 deficiens egerek hajlamosabbak a kollagén indukált artritiszre [142]. Reumatoid artritiszben is kimutatták szerepét, ugyanis a szinoviális fibroblasztok apoptózisát indukálhatja [143]. Tumoros megbetegedésben a Gal-9 akadályozza a rákos sejtek endotéliumhoz és extracelluláris mátrix ligandokhoz kötődését, ezáltal csökkenti a metasztázist [144]. Feltételezik, hogy az immunválasz és az allergiás reakciók során a Gal-9 szabályozza az eozinofil forgalmat. Yamamoto és munkatársai tengerimalac modellben igazolták, hogy a Gal-9 a tüdőben hozzájárulhat az eozinofil akkumulációhoz [145], azonban ismeretink még hiányosak az asztma kapcsán.
2.5 A vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) A VEGF egy homodimer polipeptid, mely számos folyamat regulációjában részt vesz. Molekulaszerkezetét a 12. ábra mutatja be.
30
12. ábra. A vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) molekulaszerkezete.
A VEGF egy homodimer polipeptid. Forrás: RCSB Fehérje adatbázis (www.rcsb.org)
A VEGF egyike azon fontos angiogenikus faktoroknak, amelyek gátolják a vaszkuláris simaizom sejtek proliferációját [146-147]. A VEGF fokozza az endotél és epitél sejtek túlélését, azaz antiapoptotikus hatású [148], továbbá pro-inflammatorikus sajátságokkal is rendelkezik [149]. Ismert, hogy a VEGF fokozza a nitrogén-monoxid (NO) és a prosztaciklin szintézisét [150], valamint gátolja a trombusképződést [151]. Egyre több adat ismert, melyek szerint a NO fontos szerepet játszik az endotél sejtek VEGF által indukált migrációjában
[152-153]. A VEGF már az embrionális fejlődés során is
befolyásolja az angiogenezist, és születést követően is kifejti hatását [154-155]. Ugyanakkor a VEGF számos gyulladással járó betegség [149], így az allergiás megbetegedések patomehanizmusában is fontos szerepet játszhat [156]. A tartós gyulladás a légutak strukturális változásaihoz vezet, amit légúti remodeling néven tart számon az irodalom [157]. Mivel citokinek, kemokinek és növekedési faktorok egyaránt részt vehetnek a remodeling folyamatában, feltételezhetően a VEGF ilyen módon is szerepet játszhat az asztma patomechanizmusában [158].
31
3. CÉLKITŰZÉSEK Jelen munkánk során célul tűztük ki az asztma patomechanizmusának pontosabb megértését, ezen belül is egy speciális lektin család három fontos képviselőjének, a Gal -1, -3 és -9 molekulák potenciális szerepének vizsgálatát a betegség kapcsán. Továbbá tanulmányozni kívántuk az egyik legfontosabb angiogenikus faktorként nyilván tartott molekula, a VEGF lehetséges részvételét is az allergiás asztma patogenezisében. A legtöbb esetben az asztma egyik kulcsfontosságú mediátorának, a hisztaminnak hiányában is elvégeztük kísérleteinket és vizsgáltuk, kimutatható –e bármiféle összefüggés a vizsgált molekula és a hisztamin között. Az alábbi kérdésekre kerestük a választ:
3.1. A Gal-1 és -3 molekulákkal kapcsolatos kérdésfeltevéseink Egereknél hogyan változik a Gal-1 és Gal-3 mRNS szintű expressziója asztmában az egészséges egyedekhez képest? Tapasztalható–e a Gal-1 illetve a Gal-3 fehérje szintű változása a beteg állatok tüdejében, illetve tüdőmosó folyadékában? Mely immunsejtek bizonyulnak Gal-1 és Gal-3 pozitívnak és változik–e ezen pozitív sejtek száma, aránya asztmásítás hatására? Az endogén hisztamin megléte, illetve hiánya befolyásolja–e a sejtek Gal-1 illetve Gal-3 produkcióját? Amennyiben igen, milyen irányban? Befolyásolja–e az exogén módon adott hisztamin az alveoláris makrofágok Gal1 illetve Gal-3 termelő képességét?
3.2. A Gal-9 asztmában való részvételére irányuló kérdéseink Változik–e bármilyen irányban a Gal-9 mRNS expressziója és fehérje mennyisége az allergizált állatok tüdejében?
32
A BAL mely sejtjei mutatnak Gal-9 pozitivitást? Hogyan változik a Gal-9 immunpozitív sejtek száma és az általuk termelt Gal-9 mennyisége az asztmában? A tüdő mely területén mutatható ki Gal-9 lokalizáció ép és beteg állatban? Az asztma kezelésére alkalmazott gyulladáscsökkentő hatású szteroid (jelen esetben dexametazon) hatással van–e a Gal-9 mRNS szintű expressziójára és/vagy a Gal-9 fehérje mennyiségére?
3.3. A VEGF asztmában betöltött szerepének vizsgálata kapcsán feltett kérdéseink Kimutatható–e a VEGF mRNS expressziójának és/vagy a VEGF fehérjének bárminemű változása az OVA szenzitizált és légútilag provokált beteg állatok tüdejében ép kontrollokhoz képest? Hogyan alakul a VEGF pozitív immunsejtek aránya és azok intracelluláris VEGF tartalma beteg állatok BAL-jában? Létezik–e direkt kapcsolat asztmában a hisztamin és a VEGF produkció között? Befolyásolja-e az endogén hisztamin hiánya a VEGF mennyiségét? Amennyiben igen, mely sejtek esetében?
33
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Kísérleti állatok Kísérleteinket 6-8 hetes nőstény, specifikus patogénektől mentes (SPF), beltenyésztett vad típusú BALB/c (Charles River Laboratories, Isaszeg, Magyarország) és hisztidin dekarboxiláz „génkiütött" (HDC–/–) egereken végeztük, amelyek genotípusa – a HDC gén kivételével – azonosnak tekinthető. A génkiütött állatok Prof. Falus András és munkacsoportjának (Semmelweis Egyetem, Genetikai-, Sejt- és Immunbiológiai Intézet) nagylelkű ajándékai [159]. Az egereket 12/12 óra világos/sötét ciklusra beállított
fényviszonyok között, légkondicionált
térben
(hőmérséklet
24±2ºC,
páratartalom: 60±10%) tartottuk. Az állatok számára OVA-mentes rágcsálótápból (Ssniff, Soest, Németország) és ivóvízből szabad hozzáférést biztosítottunk. Az állatokat már 1 héttel a kísérletek megkezdése előtt hisztamin-mentes tápon tartottuk, hogy a hisztamin teljes hiányában fellépő késői allergiás reakciót vizsgálhassuk.
4.2. Kísérleti protokoll, allergizálási procedúra Kísérletünkben az allergiás asztma egyik legáltalánosabban alkalmazott állatmodelljét (13/A. ábra) illetve génkiütött állatokkal végzett vizsgálataink során annak módosított változatát (13/B. ábra) alkalmaztuk. Az egereket (n=7 állat/csoport) a kísérlet 1. és 14. napján 100-100 μL intraperitoneális OVA oltóanyaggal (állatonként 20 μg OVA foszfát pufferolt sóoldatban (PBS) oldva és 2,25 mg Al(OH)3 (Imject Alum szuszpenzió formájában) érzékenyítettük, szenzitizáltuk. A kontrollok 100 μL PBS-t és Al(OH)3-t kaptak placebóként. Ezt követően ugyanezen fehérjével végzett légúti provokációval eozinofil légúti gyulladást hoztunk létre a tüdőben. Ennek érdekében a kísérlet 28. 29. és 30. napján naponta 20 percig egy porlasztó segítségével (Laborex-Sanesco, Bécs, Ausztria)
1%
OVA-t
tartalmazó
aeroszolt
inhaláltattunk
az
állatokkal
(allergénprovokáció). A kontrollokat tiszta PBS aeroszollal kezeltük. A légúti reaktivitás (tüdőellenállás) mérése és a mintagyűjtés a kísérlet befejező, 31. napján történt. A HDC–/– állatok kapcsán végzett vizsgálatainkban a mintagyűjtésre a 32. napon
34
került sor, és közvetlenül 5 órával előtte egy további légúti provokációt (20 percen át 5% OVA) végeztünk.
13. ábra. Kísérleti protokoll.
A.
sc. DEX kezelés
ip. OVA + Al(OH)3 (szenzitizálás) 1% OVA inhaláció (provokáció)
mintagyűjtés
B.
ip. OVA + Al(OH)3 (szenzitizálás)
5% OVA inhaláció
1% OVA inhaláció (provokáció)
mintagyűjtés
A hagyományos, klasszikus allergizálási eljárással létrehozott kísérletes asztma állatmodell (A) és a génkiütött állatok kapcsán végzett kísérleteink során alkalmazott (B) kísérleti protokollok. Rövidítések az ábrán: OVA: ovalbumin; DEX: dexametazon nátriumfoszfát; Al(OH)3: alumínium-hidroxid; sc.: szubkután; ip.: intraperitoneális.
35
4.3. Szteroid kezelés A szteroiddal kezelt állatcsoport tagjai fiziológiás sóoldatban hígított dexametazon nátriumfoszfát (DEX) (Oradexon – Organon, Oss, Hollandia) szubkután (sc.) injekciót kaptak a kísérlet 29. és 30. napján (5 mg/kg dózis/nap) 100 μl végtérfogatban. Korábban kimutatták, hogy a DEX ebben a dózisban hasonló kísérleti rendszerben az allergiás légúti gyulladást és AHR-t jelentős mértékben gátolta [160]. A kontroll csoportokat 100 μl placebóként alkalmazott fiziológiás sóoldattal kezeltük.
4.4. Légúti reaktivitás és hiperreaktivitás (AHR) mérése A légúti reaktivitást – illetve AHR-t, – azaz a metakolin (MCh: acetil-β metilkolin klorid) hatására bekövetkező RL-változást invazív módon, géppel lélegeztetett állatokon mértük. Az egereket ip. adott 72 mg/kg nembutállal (pentobarbitál nátrium) elaltattuk. Ez az altatószer minimum 1 órás mély (sebészi) anesztéziát biztosít. A nyak bőrét elöl, a középvonalban egy kb. 1 cm-es hosszanti metszéssel nyitottuk meg, majd a lágyrészek tompa preparálását követően végeztük el a tracheotómiát. Az állatot 24G átmérőjű kanüllel (BD, San Jose, CA, USA) intubáltuk. Ezt követően a műtéti metszést bal haránt irányba meghosszabbítottuk egészen a véna jugularis várható helyéig. A tompán kipreparált vénát disztálisan lekötöttük, lumenébe egy kanült helyeztünk. A kanül végéhez (Y csatlakozó segítségével) 50 μL-es mikrofecskendőt (Hamilton, Reno, USA) és egy infúziós pumpát csatlakoztattunk. Ezt követően az állatot egy teljestestpletizmográfba helyeztük (Buxco Electronics, Sharon, CT, USA) és 150/perc frekvenciával, 6 ml/kg légzési térfogattal lélegeztettük (Inspira, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA). A tracheakanült 4-utas csatlakozó segítségével kötöttük össze a respirátor ki- és bemeneti szárával, valamint a berendezéshez tartozó folyadék/gáz nyomáskülönbség-mérő
száraz
(gázfázisú)
bemenetével.
Ugyanezen
szenzor
folyadékfázisú bemenetéhez egy vízzel telt nyomásmérő kanült csatlakoztattunk (BD, San Jose, CA, USA) melyet az egér nyelőcsövébe vezettünk a pleuraűr magasságáig. Ily módon – közelítőleg – a transzpulmonális nyomás értékét tudtuk leolvasni a nyomásszenzor kimenetén. Az állathoz csatlakozó kanülöket a pletizmográf
36
plexikamrájának erre a célra kialakított, légzáró ki- és bemeneti nyílásain vezettük keresztül, így biztosítva, hogy légáramlás csak a beépített pneumotachográf-membránon keresztül történjen. A mérések előtt végzett kalibrálás során a készülék meghatározta az 1 mL levegő befecskendezése alatti nyomásváltozás-görbét, a membrán aktuális ellenállását, így képessé vált az állat mellkasmozgása által keltett nyomásváltozásból a légátáramlás
kiszámítására.
A
fenti
paramétereket,
valamint
az
egységnyi
transzpulmonális nyomás hatására létrejövő légáramlás, azaz a tüdőellenállás (RL; H2Ocm/ml/s) értékét a szoftver (BioSystem XA, Buxco Electronics, Sharon, CT, USA) folyamatosan rögzítette. Az állatokat intravénás (iv.) MCh infúzióval provokáltuk, így határoztuk meg a légúti válaszkészséget (reaktivitást). Az alapvonal (fiziológiás sóoldat infúziója közben végzett) rögzítése után az egymást követő MCh dózisokat kétpercenként infundáltuk a vena jugularisba. Az egyes MCh adagok után minden esetben megvártuk, amíg az RL értéke újra stabilizálódik az alapvonal körül. A kezdődózis 43 μg/kg volt, ezután a MCh adagja mindig háromszorosára emelkedett, hasonlóan a korábban
leírt
protokollhoz [161]. Az egyes
MCh adagokat
mikrofecskendővel a kanülbe fecskendeztük, majd bemostuk a véna jugularisba. Ezt követően a RL meredeken emelkedett, majd elérte a csúcsértéket és rövid időn belül újra leesett közelítőleg az alapvonal értékéig. A kiértékelés során az egyes MCh dózisok beadása után mérhető RL csúcsértékét használtuk a válaszkészséget meghatározó mutatóként.
4.5. Tüdőmosó folyadék (BAL) vétele A légúti reaktivitás mérésekor az egerek tüdejét átmostuk, így nyertük a BAL-t. Az állatok tracheakanüljére csatlakoztatott fecskendővel 3x600 μl steril, izotóniás PBS-t injektáltunk a bronchoalveoláris térbe, majd 1 perc elteltével visszaszívtuk a folyadékot. Az így nyert folyadékot lecentrifugáltuk (700g, 10 perc, 4ºC), majd a felülúszót több részre osztva -80ºC-on tároltuk a további mérésekig. A sejteket felvettük PBS-ben, majd a sejtszuszpenzió egy részét azonos mennyiségű 0,4%-os tripánkék festékkel (Sigma, Budapest, Magyarország) elegyítettük. A sejteket Bürker-kamrában megszámoltuk, és meghatároztuk az összsejtszámot a hígítások figyelembe vételével.
37
4.6. Citokin mérések a BAL felülúszóból A BAL felülúszóból Cytomix gyöngyök segítségével [Flow Cytomix Multiplex egér Th1/Th2 10plex kit (Bender MedSystems, Vienna, Austria)] meghatároztuk az alábbi citokinek szintjét: IL-1α, IL-2, IL-5, IL-6, IL-10, IFNγ, tumor nekrózis faktor (TNF)α, granulocita-makrofág
kolóniastimuláló
faktor
(GM-CSF),
IL-4,
és
IL-17.
Mennyiségüket áramlási citofluoriméterrel (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) mértük a gyártó által megadott protokoll szerint.
4.7. A BAL limfociták Gal-1, -3, -9, VEGF fehérje szintjének FACS vizsgálata A BAL-ból származó sejteket PBS-el mostuk, majd Gal-1-re, Gal-3-ra, Gal-9-re és VEGF-re megfestettük az alábbi protokoll szerint. A nem specifikus Fc receptor kötőhelyeket 2,5 μl egérre specifikus CD16/CD32 antitesttel (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA,) blokkoltuk 4ºC-on 10 percig, majd a mintákat porcióztuk. A sejteket 10 percig 4%-os paraformaldehidben fixáltuk szobahőmérsékleten (pH=7,4), majd 500 μl PBS-ben centrifugáltuk (800 g, 5 perc, 24 ºC). Szaponinnal permeabilizáltunk (0,1 % szaponin, 1% FCS 0,1% NaN3) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, USA). Ezt követően a mintákat centrifugáltuk (800 g, 5 perc, 24 ºC) majd specifikus primer ellenanyaggal (az elsődleges antitestek azonosak a Western blot kapcsán használtakkal, melyek a 2. táblázatban találhatóak) inkubáltuk (0,5 μg), szaponinnal mostuk. Másodlagos antitestként FITC konjugált poliklonális IgG ellenanyagot használtunk (Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA) (0,5 μg, 20 perc, szobahőmérsékleten). A negatív kontrollokat csak másodlagos antitesttel inkubáltuk. Mosás után 300 μl 2%-os paraformaldehidben (pH=7,4) vettük fel a sejteket. A mérést FACSCalibur áramlási citométerrel (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) végeztük. Az alveoláris makrofágok, limfociták, eozinofil és neutrofil granulociták populációit anti-F4/80 (AbD Serotec, Oxford, UK), anti-ECP, -CD3, -B220 (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) antitestek segítségével határoztuk meg. Az eredményeket CellQuest Pro Software-rel (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) értékeltük.
38
4.8. Szövettan A BAL vételét követően az állatok mellkasát megnyitottuk, további kísérletek céljából tüdejüket kivettük. A szövetek egy részét azonnal fixáló oldatba (4% pufferolt formaldehid, pH 7,4) helyeztük, és 24 órán keresztül fixáltuk. Dehidratálást és paraffinba ágyazást követően 5 μm vastagságú metszeteket készítettünk, és megfestettük hematoxilin-eozin illetve PAS (Perjód-acid-Schiff) festési eljárással. A perivaszkuláris és peribronchiális eozinofil granulocita infiltrációt illetve a kehelysejtek fokozott
nyákszekrécióját
fénymikroszkóp
alatt
vizsgáltuk
és
értékeltük.
A
tárgylemezeket számkóddal láttuk el a vizsgálat előtt.
4.9. Valós idejű (real-time) reverz transzkripció-polimeráz láncreakció (RT-PCR) mérések
4.9.1. RNS izolálás Az egerekből származó tüdő szövetminták jelentős részét a mintagyűjtést követően azonnal folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és feldolgozásig -80°C-on tároltuk. A Qiagen protokollja alapján az RNeasy™ Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Németország) segítségével RNS-t izoláltunk. A kinyert RNS mennyiségét és minőségét fotometrálással határoztuk meg. Ezt követően az RNS mintákat felhasználásig -80°C-on tároltuk.
4.9.2. Komplementer DNS szintézis A reverz transzkripció során 1 μg RNS-t konvertáltunk komplementer DNS-sé (cDNS) 20 μl reakció-végtérfogatban, 200 egység (U) SuperScript II™ RNase H- reverz transzkriptáz, 40 U RNaseOUT™ inhibitor és 0,5 μg oligo-(dT)12-18 primer jelenlétében (Gibco/BRL, Eggenstein, Németország). A reakcióelegyet 20°C-on 10 percig, majd
39
42°C-on 45 percig és végül 99°C-on 5 percig inkubáltuk, ezután 4°C-ra lehűtöttük és felhasználásig -20°C-on tároltuk.
4.9.3. SYBR Green alapú real time PCR Gal-1, -3, -9, VEGF mRNS mérésére A SYBR Green alapú real time PCR-eket 20 μl végtérfogatú [10% LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Németország), 3mM MgCl2, 0,2-0,2 μM szensz és antiszensz primer] reakcióelegyben végeztük, 1 μl cDNS felhasználásával. A Gal-1, Gal-3, Gal-9 és VEGF specifikus primerek szekvenciáit, anellációs hőmérsékletüket és termékhosszukat az 3. táblázat tartalmazza. A kezdeti 8 perces 95°C-on végzett denaturáció után a cDNS templátokat 55-65 cikluson [95°C, 3 mp (denaturáció), 55°C (Gal-1 és Gal-9), 50°C (Gal-3), 56°C (VEGF) 5 mp (anelláció), 72°C 20 mp (extenzió)] keresztül szaporítottuk fel. A PCR termékek minőségét pozitív és negatív kontrollok felhasználásával ellenőriztük. A PCR termékeink olvadáspont analízisét a következő paraméterek szerint végeztük: 95°C 10 mp, majd 20°C/mp sebességű hűtés után 15 mp-ig 40°C-on tartottuk a mintákat. Ezt követően 20°C/mp sebességű fűtéssel 85°C-ra melegítettük fel azokat.
3. Táblázat. A real time polimeráz láncreakciók (RT-PCR) során használt primerek szekvenciái, illetve a PCR reakciók körülményei.
Gén Gal-1
Gal-3
Gal-9
VEGF
Primer szekvencia S: 5’- CTC CTG ACG CTA AGA GC -3’ AS: 5’- TGC AAC ACT TCC AGG C -3’ S: 5’- GCT GCT GGC CCT TAT GGT GTC C -3’ AS: 5’- TGG TTA GCG CTG GTG AGG GTTATG -3’ S: 5’- GCA GGA GGG ACT TCA GGT GA -3’ AS: 5’- GCC CCC ACT GTC CGT TCT -3’ S: 5’- GTG CAC TGG ACC CTG GCT TTA C -3’ AS: 5’- TTT TCT GGC TTT GTT CTA TCT TTC -3’
40
Anellációs
Termék
hőmérséklet
hossza
55 oC
372 bp
50 oC
370 bp
55 oC
173 bp
56 oC
398 bp
Gén GAPDH
Primer szekvencia S: 5’- CAC CAC CAT GGA GAA GGC TG -3’ AS: 5’- GTG ATG GCA TGG ACT GTG -3’
Anellációs
Termék
hőmérséklet
hossza
59 oC
240 bp
A táblázat a PCR-ek során használt primerek szekvenciáit, a primerek optimális anellációs hőmérsékletét, valamint a PCR során képződő termékek hosszadatait mutatja be. Rövidítések: S: szensz, AS: antiszensz, Gal: galektin, VEGF: vaszkuláris endoteliális növekedési faktor, GAPDH: glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz.
4.9.4. Real time PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzfer (FRET) GAPDH mérésére A FRET alapú real time PCR-eket 20 μl végtérfogatú [10% LC FastStart DNA Master hybridization Probe, 2mM MgCl2, 0,5-0,5 nΜ szensz és antiszensz primer, 0,17 nM mindkét próba] reakcióelegyben végeztük, 1 μl cDNS felhasználásával. A GAPDH specifikus mRNS szekvenciát az NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) nukleotid adatbázisa és Blast szolgáltatása segítségével választottuk ki. A primerek tervezéséhez a LightCycler Probe Design szoftvert használtuk (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Németország). A GAPDH specifikus primerek szekvenciáit az 1. táblázat tartalmazza. Az egyik próba 5’ végét Light Cycler Red 640 fluoroforral jelöltük: 5’ LCRed640- CCC TGG CCA AGG TCA TCC ATG A -PH-3’; a másik próba 3’ végét fluoreszceinnel jelöltük: 5’-TCC TGC ACC ACC ACC AAC TGC TTA GC -FL-3’ (Tibmolbiol, Berlin, Németország). A kezdeti 2 perces 95°C-on végzett denaturáció után a cDNS templátokat 45 cikluson [95°C, 20 mp (denaturáció), 59°C 10 mp (anelláció), 65°C 20 mp (extenzió)] keresztül szaporítottuk fel. A PCR-eket pozitív és negatív kontrollok felhasználásával ellenőriztük. A PCR termékeink olvadáspont analízisét a következő paraméterek szerint végeztük: 95°C 10 mp, majd 20°C/mp sebességű hűtés után 15 mpig 40°C-on tartottuk a mintákat. Ezt követően 20°C/mp sebességű fűtéssel 85°C-ra melegítettük fel azokat.
41
4.9.5. A real time RT-PCR mérések értékelése A real time PCR-ek eredményeit a LightCycler szoftver 3.5.3-as verziójának (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Németország) segítségével értékeltük ki.
4.10. Western blot Gal-1, -3, -9, VEGF és aktin fehérjék mérésére 4.10.1. Minta előkészítés A vizsgált tüdőszövetmintákat lízispufferben (10 μg/ml leupeptin, 10 μg/ml aprotinin, 1% Triton-X 100, 0,1 M Tris-HCl (pH=8), 1 mM etilén-glikol-tetraecetsav (EGTA), 5 mM NaF, 1 mM fenil-metil-szulfonil fluorid (PMSF), és 10 mM Na3VO4, Sigma, USA) homogenizáltuk (FastPrep FP120, Qbiogene Inc, Cedex, Franciaország), majd a homogenizátumot centrifugáltuk (10000g, 10 perc, 4°C). A felülúszó összfehérje koncentrációját spektrofotometriás módszerrel, Bradford reagenssel határoztuk meg. A mintákat felhasználásig -80°C-on tároltuk.
4.10.2. Antitestek A Western blothoz használt elsődleges (primer) és másodlagos (szekunder) antitesteket és azok alkalmazott higításait és forrását a 4. táblázat tartalmazza. Másodlagos antitestként torma-peroxidázzal (HRPO) konjugált ellenanyagokat használtunk.
42
4. Táblázat. A Western blot során használt specifikus antitestek, azok gyártói és alkalmazott higításaik.
Fehérje
Primer Antitest
Higítás
Kecske anti-egér poliklonális Gal-1
Gal-1 (K20) IgG
1:200
(Santa Cruz Biotechnology) Nyúl anti-egér poliklonális Gal-3
Gal-3 (H160) IgG
1:200
(Santa Biotechnology) KecskeCruz anti-egér poliklonális Gal-9
Gal-9 IgG
1:200
(R&D MN, USA) VEGF Systems, (C-1), egér monoklonális VEGF
ß -aktin
IgG2a
1:500
(Santa Biotechnology) KecskeCruz anti-egér poliklonális ß-aktin IgG
1:200
Szekunder antitest Egér anti-kecske IgG-HRPO (Santa Cruz Biotechnology) Kecske anti-nyúl IgG-HRPO (Santa Cruz Biotechnology) Egér anti-kecske IgG-HRPO (Santa Cruz Biotechnology) Kecske anti-egér IgG- HRPO (Santa Cruz Biotechnology) Egér anti-kecske IgG-HRPO (Santa Cruz Biotechnology)
Higítás 1:1000
1:1000
1:1000
1:1000
1:1000
(Santa Cruz Biotechnology) Rövidítések: Gal: galektin, VEGF: vaszkuláris endoteliális növekedési faktor, HRPO: torma-peroxidáz
4.10.3. Nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) A mintákhoz treatment puffert [30% glicerol, 20% merkapto-etanol, 0,7 M SDS, 0,25 M Tris-HCl pH=6,8] adtunk, majd 100°C-on 5 perc inkubálással denaturáltuk azokat. A 12 %-os SDS-poliakrilamid gél zsebeibe denaturált, 200 (Gal-1), 20 (Gal-3), 40 (Gal-9) illetve 15 (VEGF) μg összfehérjének megfelelő mennyiségeket vittünk fel. Koncentráló gélként 4%-os SDS-poliakrilamidot használtunk. A minták mellé molekulasúly markert (BenchMarkTM, Gibco/BRL, Eggenstein, Németország) és pozitív kontrollt vittünk fel. Az elektroforézist hűtött rendszerben (PenguinTM Dual-Gel Water Cooled Systems, Owl, NH, USA), 1,5 órán keresztül, 120 V-on 20 mA-rel végeztük 25 mM Tris, 192 mM glicin, 0,1% SDS tartalmú futtató pufferben.
43
4.10.4. Blottolás A szeparált fehérjéket az SDS-poliakrilamid gélről nitrocellulóz membránra (HybondTM ECLTM, AP Biotech, Buckinghamshire, UK) blottoltuk. A blottolást hűtött rendszerben (MiniTankTM Electroblotter, Owl, NH, USA), 2 órán keresztül, 70V-on, 220 mA-el végeztük, 25 mM Tris, 170 mM glicin és 20% metanol tartalmú transzfer pufferben. A fehérjetranszfer sikerességét 1% Ponceau (Sigma Chemical Co., MO, USA) és 25% ecetsav (Reanal, Budapest, Magyarország) tartalmú festékkel ellenőriztük.
4.10.5. Immunoblotting Az immunoblottinghoz szükséges ellenanyag koncentrációkat előzetesen dotblot technikával határoztuk meg. A blotmembránokat szobahőmérsékleten, 1,5 órán keresztül, óvatos rázatás mellett blokkoló oldatban (5% zsírmentes tejpor, 10% PBS puffer) inkubáltuk, azért, hogy a nem specifikus kölcsönhatások kialakulását gátoljuk a membránok és az antitest fehérjék között. A mosási lépéseket, valamint az antitestekkel való inkubálást is folyamatos, de óvatos rázatás mellett végeztük. Blokkolást követően a membránokat
az
elsődleges,
specifikus
ellenanyagokkal
inkubáltuk
szobahőmérsékleten, 1 órán keresztül mosó oldatban (1% zsírmentes tejpor, 0,1% Tween™ 20 detergens, 10% PBS puffer) higítva. Annak céljából, hogy ellenőrizzük, hogy az SDS-poliakrilamid gélek zsebeibe azonos mennyiség kerültek az egyes mintákból, ß-aktin (1 μg/ml koncentrációban) specifikus elsődleges ellenanyaggal inkubáltuk a membránokat, az előzőekben leírt körülményeknek megfelelően. Mosások után (szobahőmérsékleten, 3 x 10 perc) a másodlagos, HRPO konjugált ellenanyaggal (0,16 μg/ml), 30 percig inkubáltuk a blotmembránokat szobahőmérsékleten, majd további mosásokkal (3 x 20 perc) eltávolítottuk az ellenanyag feleslegét. A használt ellenanyagokat és higításaikat a 2. táblázat tartalmazza.
44
4.10.6. Az immunoreaktív helyek detektálása Az immunoreaktív helyek kemilumineszcens szignálját Amersham Pharmacia protokoll szerint ECLplus reagenssel, Hyperfilm ECL™-en (AP Biotech, Buckinghamshire, UK) detektáltuk.
4.10.7. A Western blot-ok kiértékelése A Western blot-ok eredményeit a Gel-Pro™ szoftverrel (Media Cybernetics, Inc., MD, USA) denzitometráltuk és értékeltük.
4.11. Immunfluoreszcens festés a Gal-9 kimutatására A fagyott tüdőmintákat Shandon kriomátrixba (ThermoElectron Co, Waltham, USA) ágyaztuk immunhisztokémiai analízis céljából, majd 5 μm vastagságú metszeteket vágtunk. A mintákat 60 percen keresztül szobahőméréskleten inkubáltuk kecskében termeltetett poliklonális anti-egér Gal-9 ellenanyaggal (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 1:100 higításban. Többszöri mosást követően a metszeteket szamárban előállított anti-kecske IgG Alexa Fluor® 488 jelölt F(ab’)2 fragmensével (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) inkubáltuk szintén 1:100 higításban 30 percen keresztül szobahőmérsékleten. A DNS-t Hoechst 33342-vel (Sigma-Aldrich Company Ltd, Gillingham, UK) festettük meg 10 percen keresztül szobahőmérsékleten 1:1000-es higításban. Végül a metszeteket PBS-ben mostuk és Vectashield médiummal (Vector Laboratories,
Burlingame,
CA,
USA)
fedtük
le.
Kontrollként
a
háttér
(autofluoreszcencia) kiküszöbölése céljából készítettünk csak másodlagos antitestet tartalmazó metszeteket is. A szöveti festődést Zeiss LSM 510 Meta konfokális pásztázó lézer mikroszkóppal (Carl Zeiss, Jena, Germany) beépített inverz Axiovert 200M mikroszkóppal, 20x Plan Apochromat (NA=0,80) és 63x Plan Apochromat olaj immerziós DIC objektívekkel (NA=1,4) vizsgáltuk, illetve tettük láthatóvá.
45
4.12. Immunhisztológia a Gal-1 kimutatására A Gal-1 immunreaktivitásának vizsgálata céljából az egér Gal-1 internális régiója (K20) ellen termeltetett kecske poliklonális ellenanyagot (Santa Cruz Biothechnology Inc., CA, USA) használtunk 1:50-es higításban. A tüdőszövet egy részét pufferolt (pH=7,4) formaldehidben fixáltuk és paraffinba ágyaztuk, majd 5 μm vastagságú metszeteket készítettünk. Deparaffinálást követően 20 percen keresztül Target Retrieval oldatban (pH=6,1) (DAKO, Glostrup, Denmark) mikrohullámokkal kezeltük. Az endogén peroxidáz aktivitást 0,03% hidrogén-peroxiddal (DAKO, Glostrup, Dánia) blokkoltuk, majd 30 percen keresztül PBS-ben (pH = 7,4) oldott 3%-os zsírszegény tejporral inkubáltuk szobahőmérsékleten. Ezt követően az elsődleges antitesttel 2 órán keresztül inkubáltunk. Az immunfestéshez affinitás tisztított biotinilált anti-kecske IgG-t (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) és peroxidáz/DAB kitet használtunk (ChemMate
TM
, DAKO, Glostrup, Denmark). A kontrollokat az elsődleges/másodlagos
antitesttel és pre-immun szérummal inkubáltuk. A metszeteket továbbá megfestettük hematoxilinnal is, végül Vecta médiummal lefedtük (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA). A mintákat kóddal láttuk el, és ily módon „vakon” vizsgáltuk azokat.
4.13. J774.2 egér alveoláris makrofág sejtkultúra és kezelés A J774.2 BALB/c egérből származó alveoláris makrofág sejteket (Sigma-Aldrich Co., ECACC No: 85011428) 4,5 mg/ml glükóz és 10% FBS tartalmú DMEM-ben tartottuk. 24 órával a kezelés előtt a J774.2 sejteket letapadós 24 lyukú platre helyeztük (Sarstedt Inc., Newton, NC, USA) 0,5 ml végtérfogatban különböző koncentrációkban (3x105/ml, 2x105/ml és 1,5x105/ml) hogy a kísérlet végére 60-80% konfluenciát érhessünk el. A sejteket az alábbi csoportokra osztottuk: csak médiumban tartott (kontrol, nem stimulált), vagy 0,5 g/lyuk lipopoliszacharid (LPS) kezelt, vagy 0,5 g/lyuk LPS és 105
M
-fluorometil hisztidin (LPS+FMH) kezelt, vagy 0.5
g/lyuk LPS és 10-5M
hisztamin (LPS+H) kezelt sejtek. Majd ezt követően a sejteket 12, 24 és 48 órával a kezelés után előkészítettük a FACS analízishez és vizsgálatainkat Gal-1-re illetve Gal-3-
46
ra specifikus antitestekkel végeztük (Az antitestek megegyeznek a Western blotnál használtakkal.).
4.14. Statisztika Eredményeink
statisztikai
analíziséhez
a
normalitást
Shapiro-Wilk’s
teszttel
ellenőriztük, majd egyutas illetve kétutas variancianalízist (ANOVA) és NewmanKeuls poszt-hoc tesztet használtunk a csoportok közötti különbségek kimutatására (Statistica 7.0, StatSoft, OK, USA). Szignifikáns eltérésnek azt tekintettük, ahol p≤0,05. Az értékeket átlag ± SD formában adtuk meg.
47
5. EREDMÉNYEK 5.1. A Gal-1 molekulával kapcsolatos eredmények Az alábbiakban a Gal-1-el kapcsolatos eredményeinket ismertetjük. Kísérleteinket vad típusú BALB/c (WT) és hisztidin dekarboxiláz génkiütött (HDC–/–) állatokon végeztük. Valós idejű RT-PCR eljárással meghatároztuk a Gal-1 mRNS expressziójának alakulását az egyes csoportokban. Western blot technika segítségével vizsgáltuk a Gal-1 fehérje mennyiségének alakulását a tüdőben. Immunhisztológiai eljárással azonosítottuk a Gal-1 termelő sejteket a tüdőszövetben. Az állatok tüdejét 3x0,6 ml PBS-sel kimostuk a kísérlet 32. napján, 5 órával az utolsó légúti provokációt követően. Az ily módon nyert BAL folyadékból meghatároztuk az összsejtszámot, a sejtes összetételt és a Gal-1 pozitív leukociták százalékos arányát és azok sejten belüli Gal-1 mennyiségét mind a négy vizsgálati csoportban (HDC–/–ova, HDC–/–control, WTova és WTcontrol). A továbbiakban ezen eredményeinket ismertetjük részletesebben.
5.1.1. Gal-1 mRNS expresszió a tüdőben A Gal-1 mRNS expressziót valós idejű RT-PCR metodikával mértük valamennyi csoportban (HDC–/–ova, HDC–/–control, WTova and WTcontrol). A kétutas ANOVA elemzés eredményeinek alapján az OVA kezelés (p<0,01) és a HDC–/– állatokban mutatkozó hisztamin hiánya egyaránt befolyásolta a Gal-1 mRNS expresszióját a tüdőben. OVA szenzitizálást és légúti provokációt követően a Gal-1 mRNS expressziója megnőtt a WTova (p<0,01) és HDC–/–ova (p<0,05) egerekben a kontroll csoportjaikhoz
(HDC–/–control, and WTcontrol) képest (14. ábra). Míg a két
kontroll csoport tüdejében mért Gal-1 mRNS expressziójában nem volt lényeges eltérés, a HDC–/–ova és WTova állatok Gal-1 mRNS expressziója szignifikáns módon különbözött (p<0,01). Az allergizált génkiütött állatokban a Gal-1 mRNS szinten alacsonyabb expressziót mutatott a vad típusú állatokhoz képest.
48
Gal-1/GAPDH relatív egységek
14. ábra. A Gal-1 mRNS expressziója a tüdőben
8,0
*
7,0 6,0
#
5,0
#
4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 WT control WT control
–/– KO control HDC control
WTWT sens. & ova chall.
KO sens. HDC&–/–chall. ova
A WT és HDC–/– állatok tüdejéből valós idejű RT-PCR technikával mértük a Gal-1 mRNS expresszióját. A mintákat a 32. napon gyűjtöttük, 5 órával az utolsó provokációt követően. Az ábrán az átlag és szórás (SD) értékeket tüntettük fel. * p<0,01; WTova vs. WTcontrol, # p <0,05; HDC–/–ova vs HDC–/–control
5.1.2. A Gal-1 fehérje mennyisége a tüdőben A tüdőben a Gal-1 fehérje mennyiségét Western blot technikával határoztuk meg. A kétutas ANOVA elemzés eredményeinek alapján az OVA kezelés (p<0,01) kimutatható módon befolyásolta a Gal-1 fehérje szintjét a tüdőben, míg a HDC–/– állatokban mutatkozó hisztamin hiánya nem volt hatással a Gal-1 fehérje mennyiségére. A Gal-1 fehérje szintje magasabb volt az OVA szenzitizált és légútilag provokált WTova állatokban a WTcontrol csoportéhoz képest (p<0,01). Hasonló tendenciát figyeltünk meg a HDC–/– állatok esetében, de az eltérés nem volt szignifikáns (15. ábra).
49
Gal-1 fehérje relatív egységek
15. ábra. A Gal-1 fehérje mennyisége a tüdőben
1200
**
1000
#
800 600 400 200 0 WT control
WTcontrol
WT sens. & WT ova chall.
KO control
HDC–/– control
KO sens. –/– & HDC chall. ova
A WT és HDC–/– állatok tüdejéből western blot technikával meghatároztuk a Gal-1 fehérje mennyiségét. A tüdőmintákat a 32. napon gyűjtöttük, 5 órával az utolsó provokációt követően. Az ábrán az átlag és szórás (SD) értékeket tüntettük fel. * p<0,01; WTova vs. WTcontrol
5.1.3. Gal-1 lokalizációja a tüdőben A Gal-1 forrásául szolgáló sejtek azonosítása végett a tüdőmintákból immunhisztológiai eljárás keretein belül specifikus Gal-1 ellenanyagot használtunk. A kontrollokban gyenge Gal-1 festődést tapasztaltunk a bronchiális epiteliális sejtekben. Az allergizált állatokban a bronchiális epiteliális sejteken túl alveoláris makrofágok és limfociták is Gal-1 pozitívaknak bizonyultak, és festődésük is sokkal intenzívebb volt. Ugyanakkor a WT és a hisztamin hiányos HDC–/– állatok Gal-1 festődése, lokalizációja között nem mutatkozott szembetűnő különbség (16. ábra).
50
16. ábra. Gal-1 lokalizációja a tüdőben
A tüdőmintákat a 32. napon, 5 órával az utolsó légúti provokáció után gyűjtöttük, formalinban fixáltuk, majd paraffinba ágyaztuk. A Gal-1 immunorektivitását Gal-1-re specifikus ellenanyaggal mutattuk ki immunhisztológiai módszer alkalmazásával. Eredeti nagyítás: 400x. A.: WTcontrol; B.: HDC–/–control; C.: WTova; D.: HDC–/–ova egerek tüdőszövetében a Gal-1 lokalizációját barna szín jelöli. A kontrollokban gyenge Gal-1 festődés látható a bronchiális epiteliális sejtekben. Az allergizált állatokban a bronchiális epiteliális sejteken túl alveoláris makrofágok és limfociták is Gal-1 pozitívaknak bizonyultak, és festődésük is sokkal intenzívebb volt. Viszont a WT és HDC–/– állatok Gal-1 festődése, lokalizációja között nem mutatkozott szembetűnő különbség.
5.1.4. A BAL sejtes összetétele A 32. napon, 5 órával az utolsó OVA provokációt követően az állatoktól BAL-t vettünk, és meghatároztuk annak összsejtszámát, valamint sejtes összetételét FACS módszer segítségével. Az OVA szenzitizálást követően az összsejtszám a WT és HDC –
51
/–
állatok BAL-jában megnőtt (p<0,01) a kontroll csoportokéhoz képest (78,1 + 36,2
sejt/ l WTcontrol; vs. 788,9 + 607,5 sejt/ l WTova) és (135,6 + 28,2 sejt/ l HDC–/–control vs. 988,7 + 699,0 sejt/ l HDC–/–ova). Allergizálást követően eozinofil és neutrofil populációk jelentek meg a BAL-ban, míg a kontrollokban csak limfocitákat és makrofágokat tudtunk kimutatni (17. ábra).
17. ábra. A BAL leukocita összetétele
Ne
100%
Eo Ly
80%
MF
60% 40% 20% 0% WT control WTcontrol
WT sens. & WTova chall.
KO control –/– HDC control
KO sens. –/– & HDC ova chall.
A kísérlet 32. napján az állatok tüdejét 3x0,6 ml PBS-el mostuk. Az így nyert BAL-ban meghatároztuk az összsejtszámot és azok sejtes összetételét FACS módszerrel. Az ábra mutatja, hogy míg a kontroll állatok BAL-jában csak limfocita (Ly) és alveoláris makrofág (MF) populációkat mutattunk ki, addig az OVA szenzitizált és provokált csoportokban megjelentek az eozinofil (Eo) és neutrofil (Ne) granulociták is.
5.1.5. Gal-1 pozitív sejtek aránya és intracelluláris Gal-1 tartalmuk a BAL-ban A 32. napon, 5 órával az utolsó OVA provokációt követően az állatok tüdejét 3x0,6 ml PBS-el kimostuk. Az így nyert BAL-ban meghatároztuk a Gal-1 pozitív sejtek százalékos arányát, és a pozitív sejtek intracelluláris Gal-1 mennyiségét. A Gal-1-et kimutattuk alveoláris makrofágokban (p<0,01) és limfocitákban (p<0,01), de az
52
eozinofil és neutrofil granulociták nem bizonyultak Gal-1 pozitívnak, nem voltak jelen detektálható mennyiségben, ezért ezeket nem tüntettük fel a diagramokon. A Gal-1 pozitív alveoláris makrofágok és limfociták százalékos aránya megnőtt a HDC–/–ova állatok BAL-jában más csoportokhoz képest (p<0,05; HDC–/–ova vs HDC–/– control
és vs. WTova). A Gal-1 pozitív sejtek száma a másik három csoportban relatív
kevés volt és szignifikáns eltérést nem mutatott (18. ábra).
18. ábra. A Gal-1 pozitív alveoláris makrofágok (MF) és limfociták (Ly) százalékos aránya a BAL-ban
WTcontrol WT control
Gal-1 pozitív sejtek aránya (%)
70
##
60 50
WTsens. WT OVA & chall. –/– HDC control KO control –/–
HDC OVA KO sens. & chall.
40
**
30 20 10 0 MF
Ly
A kísérlet 32. napján az állatok tüdejét 3x0,6 ml PBS-el kimostuk. Az így nyert BAL-ban meghatároztuk a Gal-1 pozitív sejtek arányát FACS módszerrel. A BAL-ban csak a limfocita (Ly) és az alveoláris makrofág (MF) populációk bizonyultak Gal-1 pozitívnak. Az eredményeket átlag + szórás alakban szemléltetjük. * p<0,05; HDC–/–ova vs HDC–/–control és vs. WTova alveoláris makrofágok tekintetében; # p <0,05; HDC–/–ova vs HDC–/–control és vs. WTova limfociták tekintetében.
A Gal-1 pozitív sejtek százalékos arányának meghatározása után mértük azok intracelluláris Gal-1 tartalmát is. A Gal-1 pozitív alveoláris makrofágok tekintetében a
53
HDC–/–ova állatok intracelluláris Gal-1 tartalma szignifikánsan magasabb volt a BALban mint más csoportok esetében (p<0,05; HDC–/–ova vs HDC–/–control és vs. WTova). A Gal-1 pozitív sejtek intracelluláris Gal-1 tartalma a másik három csoportban relatív kevés volt és szignifikáns eltérést nem mutatott. A Gal-1 pozitív limfociták Gal-1 tartalmát tekintve sem tudtunk különbséget kimutatni (19. ábra).
19. ábra. A Gal-1 pozitív alveoláris makrofágok (MF) és limfociták (Ly) intracelluláris Gal-1 tartalma a BAL-ban.
900
WT control WT
**
control
Fluoreszcencia intenzitás (relatív egység)
800
WT sens. & WT OVA chall. –/– KO control HDC control
700 600
–/– KO sens. & HDC OVA chall.
500 400 300 200 100 0
MF
Ly
A kísérlet 32. napján az állatok tüdejét 3x0,6 ml PBS-el kimostuk. Az így nyert BAL-ban meghatároztuk a Gal-1 pozitív sejtek intracelluláris Gal-1 tartalmát FACS módszerrel a fluoreszcencia intenzitás értékek alapján. A BAL-ban csak a limfocita (Ly) és az alveoláris makrofág (MF) populációk bizonyultak Gal-1 pozitívnak. Az eredményeket átlag + szórás (SD) alakban adtuk meg. * p<0,05; HDC–/–ova vs HDC–/–control és vs. WTova alveoláris makrofágok tekintetében.
5.1.6. In vitro kísérlet J774.2 alveoláris makrofág sejtvonalon Az állatmodell alkalmazásával kapott eredményeink alapján J774.2 alveoláris makrofág sejtvonalon végeztünk FMH és hisztamin kezelést. A kétutas ANOVA
54
elemzés azt mutatta, hogy a kezelés ideje (48 óra versus 12 és 24 óra; p<0.01) és a kezelés milyensége (kontroll csoport versus LPS, LPS+FMH és LPS+H kezelt csoportok; LPS stimulált csoport versus LPS+FMH kezelt csoport; LPS+FMH kezelt versus LPS+H kezelt csoport; p<0,01 minden esetben) egyaránt befolyásolta a J774.2 sejtek Gal-1 termelését. Az J774.2 sejtek LPS stimulálása fokozta a sejtek intracelluláris Gal-1 mennyiségét a kontrol csoporthoz képest 24 (p<0,01) és 48 (p<0,01) órával a stimulációt követően. Az LPS stimulációt követően a HDC-blokkolóként alkalmazott FMH szignifikánsan emelte a J774.2 sejtek Gal-1 produkcióját a hisztamin kezelt (p<0,01) és a csak LPS stimulált csoportokhoz képest 48 órával a kezelés után (p<0,01). Bár a hisztamin szignifikánsan eltérő ellentétes hatását nem mutattuk ki, de a tendencia (p=0,09) megfigyelhető az LPS kezelt és LPS+H kezelt csoportok kapcsán a Gal-1 szintek tekintetében 24 órával a kezelést követően (20. ábra).
20. ábra. A Gal-1 mennyisége J774.2 alveoláris makrofág sejtekben +
* #
55
A J774.2 alveoláris makrofág sejteket az alábbi csoportokra osztottuk: csak médiumban tartott (kontrol, nem stimulált), vagy 0,5 μg/lyuk lipopoliszacharid (LPS) kezelt, vagy 0,5 g/lyuk LPS és 10-5 M
-
fluorometil hisztidin (LPS+FMH) kezelt, vagy 0,5 μg/lyuk LPS és 10-5 M hisztamin (LPS+H) kezelt sejtek. A sejteket 12, 24 és 48 órával a kezelést követően előkészítettük a FACS analízishez és vizsgálatainkat Gal-1-re specifikus antitesttel végeztük. Eredményeinket több mérés átlagaként mutatjuk be, feltüntetve a szórást. * kontroll versus LPS (p<0,05) és LPS+FMH (p<0,05) csoportok 24 órával a kezelés után # kontroll versus LPS (p<0,01), LPS+FMH(p<0,01) és LPS+H (p<0,01) csoportok 48 órával a kezelés után + LPS+FMH versus LPS (p<0,01) és LPS+H (p<0,01) csoportok 48 órával a kezelés után
5.2. A Gal-3 molekulával kapcsolatos eredmények 5.2.1. A Gal-3 mRNS expressziója a tüdőben A Gal-3 mRNS expressziót valós idejű RT-PCR technika alkalmazásával mértük valamennyi csoportban (HDC–/–ova, HDC–/–control, WTova and WTcontrol). A kétutas ANOVA elemzés eredményeinek alapján az OVA kezelés (p<0,01) hatással van a Gal3 mRNS expressziójára a tüdőben, míg a HDC–/– állatokban mutatkozó hisztamin hiánya nem befolyásolta a Gal-3 expressziót. OVA szenzitizálást és légúti provokációt követően a Gal-3 mRNS expressziója megnőtt a WTova (p<0,01) (p<0,05) egerekben a kontroll csoportjukhoz (WTcontrol) képest (21. ábra). Hasonló tendenciát figyeltünk meg a HDC–/– állatokban, de szignifikáns különbséget nem tudtunk kimutatni. A két kontroll csoport tüdejében mért Gal-3 mRNS expressziójában nem volt lényeges eltérés.
56
21. ábra. A Gal-3 mRNS expressziója a tüdőben.
*
Gal-3/GAPDH relatív egységek
7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 WT control
WTcontrol
WT sens. & WT ova chall.
KO control –/–
HDC
control
KO sens.–/–& HDC chall. ova
A WT és HDC–/– állatok tüdejéből valós idejű RT-PCR technikával mértük a Gal-3 mRNS expresszióját. A mintákat a 32. napon gyűjtöttük, 5 órával az utolsó provokációt követően. Az ábrán az átlag és szórás értékeket tüntettük fel, az értékeket GAPDH-ra korrigáltuk. * p<0,01; WTova vs. WTcontrol
5.2.2. A Gal-3 fehérje mennyisége a tüdőben Gal-3 fehérje mennyiségét a tüdőben Western blot technikával határoztuk meg. A Gal-3 fehérje mennyiségének változása tendenciájában követte az mRNS expresszió alakulását. A kétutas ANOVA elemzés eredményeinek alapján az OVA kezelés (p<0,01) kimutatható módon befolyásolta a Gal-3 fehérje szintjét a tüdőben, míg a HDC–/– állatokban mutatkozó hisztamin hiánya nem volt hatással a Gal-3 fehérje mennyiségére. A Gal-3 fehérje szintje szignifikánsan magasabb volt az OVA szenzitizált és légútilag provokált WTova állatokban a WTcontrol csoportéhoz képest (p<0,001), és a HDC–/–ova egerekben a HDC–/–control állatokéhoz képest (22.ábra). Az WT és a hisztamin hiányos HDC–/– csoport között azonban nem volt szignifikáns különbség a Gal-3 fehérje tüdőbeli mennyiségét illetően.
57
22. ábra. A Gal-3 fehérje mennyisége a tüdőben
Gal-3 fehérje relatív egységek
900
#
*
800 700 600 500 400 300 200 100 0 WT control
WTcontrol
WT sens. & chall.
WTova
KO control –/– HDC control
KO sens.–/– & chall.
HDC
ova
A WT és HDC–/– állatok tüdejéből western blot technikával meghatároztuk a Gal-3 fehérje mennyiségét. A tüdőmintákat a 32. napon gyűjtöttük, 5 órával az utolsó provokációt követően. Az ábrán az átlag és szórás értékeket tüntettük fel. * p<0,01; WTova vs. WTcontrol, # p <0,01; HDC–/–ova vs HDC–/–control
5.2.3. A Gal-3 pozitív sejtek aránya és intracelluláris Gal-3 tartalmuk a BAL-ban A 32. napon, 5 órával az utolsó OVA provokációt követően az állatok tüdejét 3x0,6 ml PBS-el kimostuk. Az így nyert BAL-ban meghatároztuk az összsejtszámot, melynek eredményeit a Gal-1 kapcsán tárgyalt „BAL sejtes összetétele” fejezetben részleteztük. Ezt követően áramlási citofluorimetriával (FACS) meghatároztuk a Gal-3 pozitív sejtek százalékos arányát, és a pozitív sejtek intracelluláris Gal-3 mennyiségét. A Gal-3-at a BAL valamennyi sejtféleségében kimutattuk, azaz alveoláris makrofágokban (p<0,01), limfocitákban (p<0,01), eozinofil és neutrofil granulocitákban (p<0,01) is, viszont a kontroll csoportokban az eozinofil és neutrofil granulociták populációja hiányzott. A Gal-3 pozitív alveoláris makrofágok százalékos aránya megnőtt a WTova állatok BAL-jában más csoportokéhoz képest (p<0,05; WTova vs. WTcontrol and HDC–/–ova és HDC–/–control). A Gal-3 pozitív limfociták aránya szintén megnőtt az OVA szenzitizálás és légúti provokációt követően mindkét allergizált csoportban kontrolljaikhoz képest (p<0,01; WTova vs. WTcontrol és HDC–/–ova and HDC–/–
58
control).
Mint említettük az OVA szenzitizálás és légúti provokáció eozinofil és neutrofil
granulociták BAL-ba történő bevándorlását idézi elő. Ezen sejtek többsége Gal-3 pozitívnak bizonyult (eozinofil granulociták: WTova: 82 ± 15 %, HDC–/–ova: 86 ± 13 %; neutrofil granulociták: WTova 90 ± 6 %, HDC–/–ova: 88 ± 3 %), viszont a két allergizált csoportban (WTova és HDC–/–ova) arányukat tekintve nem volt különbség (23. ábra).
Gal-3 pozitív sejtek aránya (%)
23. ábra. A Gal-3 pozitív sejtek százalékos aránya a BAL-ban
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
*
WT control WT control
WT OVA& chall. WT sens.
#
HDC–/–
+
KO controlcontrol –/–
HDC
OVA KO sens. & chall.
MF
Ly
Eo
Ne
A kísérlet 32. napján az állatok tüdejét 3x0.6 ml PBS-vel kimostuk. Az így nyert BAL-ban meghatároztuk a Gal-3 pozitív sejtek arányát FACS módszerrel. A BAL-ban az alveoláris makrofág (MF), limfocita (Ly), eozinofil (Eo) és neutrofil (Ne) granulocita populációk egyaránt Gal-1 pozitívitást mutattak. Az eredményeket átlag ± szórás alakban ábrázoltuk. * p<0,05; WTova vs. WTcontrol, HDC–/–ova és HDC–/–control; # p<0.01; WTova vs. WTcontrol; + p<0,01; HDC–/–ova vs. HDC–/–control
A Gal-3 pozitív sejtek százalékos arányának meghatározása mellett ugyancsak FACS módszerrel megmértük ezen sejtek intracelluláris Gal-3 tartalmát is, melyre a fluoreszcencia intenzitás értékekből következtettünk. Eredményeink szerint a Gal-3 fő forrásai az alveoláris makrofágok, mivel a Gal-3 festődés fluoreszcencia intenzitása mintegy tízszerese volt a limfociták esetében tapasztaltaknál. A hisztamin hiányos HDC–/– állatokban a vad típusú egerekhez képest az alveoláris makrofágok intracelluláris Gal-3 mennyisége szignifikánsan csökkent az OVA szenzitizálást és
59
provokációt követően (p<0,05). A limfociták sejten belüli Gal-3 mennyisége minden csoportban közel azonos volt. Az eozinofil és neutrofil granulociták intracelluláris Gal-3 tartalmát tekintve nem volt különbség a WTova és HDC–/–ova állatok között (24. ábra).
24. ábra. A Gal-3 pozitív sejtek intracelluláris Gal-3 tartalma a BAL-ban.
1800
Fluoreszcencia intenzitás (relatív egység)
1600
WT control WTcontrol
*
WT sens. & chall. WT OVA
1400
HDC–/– KO control control HDC–/–OVA KO sens. & chall.
1200 1000 800 600 400 200 0 MF
Ly
Eo
Ne
A kísérlet 32. napján az állatok tüdejét 3x0,6 ml PBS-el kimostuk. Az így nyert BAL-ban meghatároztuk a Gal-3 pozitív sejtek intracelluláris Gal-3 tartalmát FACS módszerrel a fluoreszcencia intenzitás értékek alapján. A BAL-ban az alveoláris makrofág (MF), limfocita (Ly), eozinofil (Eo) és neutrofil (Ne) granulocita populációk egyaránt mutattak Gal-3 pozitívitást. Az eredményeket átlag + szórás alakban adtuk meg. * p<0,05; WTova vs. HDC–/–ova
5.2.4. A J774.2 alveoláris makrofág sejtek in vitro Gal-3 termelése In vivo állatmodell kapcsán kapott eredményeink alapján in vitro J774.2 alveoláris makrofág sejtvonalat kezeltünk FMH-el és hisztaminnal. Statisztikai elemzést követően megállapítottuk, hogy csak a kezelés időtartama (48 óra versus 12 és 24 óra; p<0.01) befolyásolta a J774.2 sejtek intracelluláris Gal-3 mennyiségét. Az eltérő
60
anyaggal történő kezelések (LPS, LPS+FMH és LPS+H) között azonban nem volt különbség a Gal-3 produkció tekintetében (25. ábra).
25. ábra. A Gal-3 mennyisége J774.2 alveoláris makrofág sejtekben
A J774.2 alveoláris makrofág sejteket az alábbi csoportokra osztottuk: csak médiumban tartott (kontroll, nem stimulált), vagy 0,5
g/lyuk lipopoliszacharid (LPS) kezelt, vagy 0,5
fluorometil hisztidin (LPS+FMH) kezelt, vagy 0,5
g/lyuk LPS és 10-5M
-
g/lyuk LPS és 10-5M hisztamin (LPS+H) kezelt
sejtek. A sejteket 12, 24 és 48 órával a kezelést követően előkészítettük a FACS analízishez és vizsgálatainkat Gal-3-ra specifikus antitesttel végeztük. Eredményinket több mérés átlagaként mutatjuk be, feltüntetve a szórást. * p<0,05 az LPS+FMH kezelt csoportok esetében 24 órával a kezelés után a 12 órás eredményhez képest # p<0,01 az LPS+FMH kezelt csoportok esetében 48 órával a kezelés után a 12 órás eredményhez képest + p<0,01 az LPS+H kezelt csoportok esetében 48 órával a kezelés után a 12 órás eredményhez képest
61
5.3. A Gal-9 molekulával kapcsolatos eredmények Vizsgálataink során a vad típusú BALB/c egereket három kategóriába soroltuk: kontroll (GPBS), OVA szenzitizált és provokált (GOVA), valamint OVA szenzitizált és provokált, valamint DEX kezelésen átesett (GOVA+DEX) állatok csoportjaiba. Mértük az állatok légúti reaktivitását, meghatároztuk a nyáktermelő kehelysejtek arányának változásait, valamint egyéb szövettani eltéréseket is. A bronchoalveoláris tüdőmosó folyadék (BAL) összsejtszámának és sejtes összetételének megállapítása után vizsgáltuk a Gal-9 pozitív limfociták százalékos arányának, illetve sejten belüli Gal-9 tartalmuknak változásait az egyes csoportokban. Továbbá információt nyertünk a BAL felülúszó citokinjeinek esetleges mennyiségi változásáról is. Az egerek tüdőszövetének részletesebb vizsgálata során meghatároztuk a Gal-9 mRNS szintű expressziós változásait, valamint a Gal-9 fehérje mennyiségének eltéréseit és szöveti lokalizációját is. A továbbiakban ezen eredményeinket ismertetjük részletesebben.
5.3.1. Légúti hiperreaktivitás a kontroll, az OVA kezelt és az OVA+DEX kezelt állatokban Az allergizálás hatására várt fokozott légúti válaszképesség (hiperreaktivitás) meghatározásához a növekvő dózisú metakolin adagolás hatására bekövetkező légúti ellenállás (RL) értékeit mértük. A metakolin három legmagasabb dózisának beadását követően (log dózis: 2,11, 2,59 and 3,07 μg kg-1) a GOVA állatok RL értékei szignifikáns emelkedést mutattak a GPBS csoportba tartozó egerekéhez képest (10,37 vs. 3,49 H2O cm mL-1 s-1; 35,81 vs. 7,11; és 39,46 vs. 9,00 H2O cm mL-1 s-1, értelemszerűen). A GOVA+DEX állatok RL adatai hasonlóak voltak a GPBS kontroll csoportéhoz (3,11 vs. 2,69; 4,46 vs. 3,49; 10,37 vs. 7,11 H2O cm mL-1 s-1), csupán a legnagyobb koncentrációjú metakolin (3,07 μg kg -1) adagolását követően mutattak a GOVA+DEX egerek RL értékei számottevő növekedést a GPBS csoportéhoz képest (35,74 vs. 9,00 H2O cm mL-1s-1) (26. ábra).
62
26. ábra. Az ovalbumin (OVA) hatása a légúti reaktivitásra.
-1 -1 mLs-1) RL (H O cm s ) mL-1 (H22Ocm RL
50 40 30
#
$
Control GPBS OVA GOVA DEX
GOVA+DEX *
20 10 0 Baseline Alapvonal
1.63
2.11
2.59
3.07
Metacholine Metakolin (log (logdose, dózis,μgμgkg-1) kg-1) Az egyre növekvő dózisú metakolin hatására bekövetkező tüdőellenállás (RL) változását mértük a légúti hiperreaktivitás kimutatása céljából. Az ábrán az átlag és szórás értékeket tüntettük fel. * p<0 ,05 GOVA vs. GPBS and GOVA+DEX; # p<0,01 GOVA vs. GPBS és GOVA+DEX; $ p<0,05 GPBS vs. GOVA és GOVA+DEX
5.3.2. Nyáktermelő kehelysejtek kimutatása a tüdőszövetből A kehelysejtek allergizálás hatására várható fokozott nyákszekrécióját hisztológiai eljárással mutattuk ki. A GOVA egerek tüdőszövetében gyulladásos sejtek infiltrációját figyeltük meg a peribronchiális és a perivaszkuláris részen a kontroll GPBS csoportéhoz képest. A PAS pozitív sejtek száma a GOVA állatokban megnőtt a GPBS egerek tüdejéhez képest, ami a kehelysejtek metapláziáját, illetve azok fokozott nyáktermelését jelzi (27/A,B ábra). A GOVA+DEX állatok tüdejében a peribronchiális és perivaszkuláris gyulladás csökkent a GOVA egerekéhez képest. A GOVA+DEX egerek tüdejének PAS festődése a kehelysejtek csökkent nyáktermelésére utal a GOVA állatoknál tapasztaltakhoz képest (27/C ábra).
63
27. ábra. A tüdő szövettani képe GPBS (A), GOVA (B) és GOVA+DEX (C) csoportokban. A.
B.
C.
A formalinnal (4%, pH=7,4) fixált tüdő mintákat paraffinba ágyaztuk. A metszeteket PAS festési eljárással festettük meg hagyományos protokoll szerint. A mintákat kóddal láttuk el és így elemeztük azokat. A nyilak a nyáktermelő kehelysejteket jelzik. 400x-os nagyítás.
5.3.3. A BAL sejtes összetétele A BAL sejtes összetételét, illetve annak változását FACS módszerrel határoztuk meg. Az allergizálást követően a GOVA egerek BAL-jában limfociták (Ly), alveoláris makrofágok (AM), eozinofiil (Eo) és neutrofil (Ne) granulociták jelenlétét mutattuk ki (Ly: 20,3 ± 6,7 %; AM: 21,1 ± 6,5 %; Eo: 42,5 ± 10,1 %; Ne: 6 ± 0,8 %). A GOVA+DEX csoportban az eozinofil és neutrofil granulociták populációi hiányoztak (Ly: 6,9± 3,0 %; AM: 90,4 ± 3,5%; Eo: 0 %; Ne: 0 %) csakúgy, mint a kontroll GPBS állatok BAL-jában (Ly: 5,3 ± 2,2 %; AM: 93,8 ± 2,4 %; Eo: 0 %; Ne: 0 %,) (28. ábra).
64
28. ábra. A bronchoalveoláris folyadék (BAL) sejtes összetétele.
(%) Százalék Percentage
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
GPBS Control OVA GOVA DEX G
OVA+DEX
*
*
Ly
AM MF
Eo
Ne
A limfocita (Ly), alveoláris makrofág (AM), eozinofil (Eo) és neutrofil (Ne) granulocita populációkat áramlási citofluoriméterrel (FACS) mutattuk ki. Az ábrán az átlag és szórás értékeket tüntettük fel. * p<0,01 GOVA vs. GPBS és GOVA+DEX
5.3.4. A Gal-9 pozitív sejtek aránya és intracelluláris Gal-9 tartalmuk a BAL-ban A GOVA egerek BAL-jában a Gal-9 pozitív limfociták aránya szignifikánsan megnőtt a GPBS és GOVA+DEX állatokéhoz képest (p<0,01; 45,7 ± 1,9% vs. 6,1 ± 1,4% és 4,3 ± 2,2% értelemszerűen). A Gal-9 pozitív alveoláris makrofágok százalékos aránya az OVA szenzitizálást és provokációt követően lecsökkent a GPBS és GOVA+DEX állatoknál tapasztalt értékekhez képest (p<0,01; 2,4 ± 1,0% vs. 57,3 ± 3,7% és 48,8 ± 6,7%). A Gal-9 pozitív eozinofil (0,8 ± 0,2%) és neutrofil granulociták (3,9 ± 3,0%) aránya a GOVA állatok BAL-jában viszonylag alacsony volt, míg a GPBS és GOVA+DEX egerek BAL-jából hiányzott ez a két populáció (29. ábra).
65
29. ábra. Gal-9 pozitív sejtek százalékos aránya a BAL-ban.
aránya (%) sejtekpositive Gal-9 pozitiv Percentage of Gal-9 cells Percentage
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
GPBS Control OVA GOVA DEX G
OVA+DEX
*
*
Ly
AM MF
Eo
Ne
A Gal-9 pozitivitást mutató sejtféleségeket, illetve azok százalékos arányát áramlási citofluorimetriával (FACS) határoztuk meg. Az ábrán az átlag és szórás értékeket tüntettük fel. * p<0 ,01 GOVA vs. GPBS és GOVA+DEX.
A Gal-9 pozitív sejtek százalékos arányán túlmenően meghatároztuk ezen sejtek összesített intracelluláris Gal-9 tartalmát is, melyet a FACS mérés során kapott fluoreszcencia intenzitás adatokból határoztunk meg. Eredményeinket relatív egységek formájában adtuk meg. Az eozinofil granulociták mintegy háromszor annyi intracelluláris Gal-9-et tartalmaztak (30,8 ± 10,1) mint a limfociták (9,6 ± 1,1) vagy a makrofágok (11,1 ± 10,1). A neutrofil granulociták sejten belüli Gal-9 mennyisége szintén nagy volt (24,1 ± 7,4). A százalékos értékelés során kapott adatokkal egybecsengően a limfociták intracelluláris Gal-9 mennyisége nőtt, míg a makrofágok Gal-9 tartalma csökkent az allergizálást követően (30. ábra).
66
30. ábra. A BAL sejtek intracelluláris Gal-9 tartalma.
90
Control GPBS
Fluoreszcencia intenzitás (relatív egység)
80
OVA G
OVA
70
DEX
GOVA+DEX
60 50 40
*
30 20
*
10 0 Ly
Mf AM
Eo
Ne
A BAL-ban található sejtpopulációk intracelluláris Gal-9 tartalmát áramlási citofluorimetriával (FACS) határoztuk meg. Az ábrán az átlag és szórás értékeket tüntettük fel. * p<0 ,01 GOVA vs. GPBS és GOVA+DEX.
A FACS-os mérés során kapott hisztogramokból bemutatunk két szemléltető ábrát is, melyeken jól látható a görbék eltolódása az egyes kezelési csoportokban (31. és 32. ábra).
67
Relatív egységek
31. ábra. Szemléltető FACS hisztogram a Gal-9 pozitív makrofágokról a BAL-ban.
É rt é k e k
Háttér GPBS GOVA GDEX
Kecske anti-egér Gal-9+Anti-kecske IgG FITC
Relatív egységek
32. ábra. Szemléltető FACS hisztogram a Gal-9 pozitív limfocitákról a BAL-ban.
Háttér
GPBS GOVA GDEX
Kecske anti-egér Gal-9+Anti-kecske IgG FITC
68
5.3.5. A BAL citokinek mérési eredménye Tíz féle citokin koncentrációját határoztuk meg a kontroll, az OVA szenzitizált és provokált, valamint a DEX kezelésen is átesett állatok BAL felülúszójából gyöngyök segítségével FACS módszerrel. Az IL-4, IL-5, és IL-6 citokinek mennyisége a GOVA egerek BAL-jában szignifikáns módon megnőtt a GPBS és GOVA+DEX állatokéhoz képest (33. ábra). A többi mért citokin szintje nem változott számottevően az OVA szenzitizáció és provokáció hatására. A GOVA+DEX egerekben az IL-10 szintje viszont emelkedett a kontroll GPBS csoportéhoz képest. (33. ábra).
33. ábra. Citokin koncentrációk a bronchoalveoláris folyadék (BAL) felülúszójában.
A citokin szinteket áramlási citofluoriméterrel (FACS) Flow Cytomix kit (Bender MedSystems, Vienna, Austria) segítségével határoztuk meg. Az ábrán az átlag és szórás értékeket tüntettük fel. * p<0 ,01 GOVA vs. GPBS és GOVA+DEX, # p<0,01 GOVA+DEX vs. GOVA és GPBS
69
5.3.6. A Gal-9 mRNS expressziója a tüdőben Kísérleteink során valós idejű RT-PCR technikával meghatároztuk a Gal-9 mRNS expressziójának változását a kontroll, az OVA szenzitizált és provokált, valamint a DEX kezelésen is átesett állatok tüdejében. A Gal-9 mRNS alacsonyabb expressziót mutatott a GOVA egerek tüdejében (p<0,01) a GPBS állatokéhoz képest. A GOVA egerekéhez hasonlóan, a DEX kezelt (GOVA+DEX) csoportban is csökkent mRNS expressziót mutattunk ki. Nem volt szignifikáns eltérés a GOVA és a GOVA+DEX állatok Gal-9 mRNS expresszióját illetően (34. ábra).
34. ábra. A Gal-9 mRNS expressziója a tüdőben.
Gal-9/GAPDH relatív egységek
*
A Gal-9 mRNS expressziójának változását valós idejű RT-PCR technikával határoztuk meg a kontroll (GPBS), az OVA szenzitizált és provokált (GOVA), valamint a DEX kezelésen is átesett állatok tüdejében (GOVA+DEX). * p<0,01 GPBS vs. GOVA és GOVA+DEX
70
5.3.7. A Gal-9 fehérje mennyisége a tüdőben Western blot eljárással meghatároztuk a Gal-9 fehérje mennyiségét a kontroll, az OVA szenzitizált és provokált, valamint a DEX kezelésen is átesett állatok tüdejében. A denzitometrálással kiértékelt szemléltető képeket a 35/A. ábrán mutatjuk be. Eredményeink szerint a GOVA egerek tüdejében a Gal-9 fehérje mennyisége szignifikánsan megnőtt a kontroll GPBS állatokéhoz képest (p<0,01) (35/B ábra). A DEX kezelésen is átesett (GOVA+DEX) egerek tüdejében a Gal-9 fehérje szintje alacsonyabb volt, mint a GOVA állatokéban. A GOVA+DEX és GPBS csoportok állatainak tüdejében mért Gal-9 fehérje mennyiségeit összevetve nem találtunk szignifikáns különbséget az értékek között.
35. ábra. A Gal-9 fehérje mennyisége a tüdőben. A. Galectin-9
36 kD
β-actin
43 kD
B. fehérje (relatívUnit) Gal-9 Gal-9 protein (Arbitrary egységek)
3,5
#
3
2,5 2
1,5 1
0,5 0 Control G PBS
GOVA OVA
DEX GOVA+DEX
A Western blot technika során 36 kD-nál detektáltunk jelet (A). A Gal-9 fehérje szintet a Western blot-ok denzitometriás analízisével határoztuk meg (B). Az ábrákon az átlag és szórás értékeket tüntettük fel. * p<0,01 GOVA vs. GPBS és GOVA+DEX, # p<0,01 GPBS vs. GOVA és GOVA+DEX
71
5.3.8. A Gal-9 lokalizációja a tüdőben A Gal-9 fehérje szöveti lokalizációját a kontroll, az OVA szenzitizált és provokált, valamint a DEX kezelésen is átesett állatok tüdejében immunfluoreszcens festési eljárással határoztuk meg. A
GPBS egerek tüdejében gyenge Gal-9
immunoreaktivitást figyeltünk meg (36/A ábra). A GOVA állatok tüdőszövetét tanulmányozva viszont erőteljes Gal-9 festődést mutattunk ki az alveoláris epiteliális sejtekben (36/B ábra) a kontrollokéhoz képest. A GOVA+DEX állatokban a GPBS csoportban tapasztaltakéhoz hasonlóan csak gyenge Gal-9 immunoreaktivitást észleltünk (36/C ábra).
36. ábra. A Gal-9 immunhisztokémiai lokalizációja a GPBS (A), GOVA (B) és GOVA+DEX (C) állatok tüdejében. A Gal-9
Sejtmagok
DIC
Egyesített
Sejtmagok
DIC
Egyesített
Sejtmagok
DIC
Egyesített
B Gal-9
C Gal-9
72
A konfokális mikroszkóppal készített képek a Gal-9 lokalizációját mutatják a tüdőben reprezentatív mintákból készült metszetek immunfluoreszcens festését követően. A mintákat Gal-9-re specifikus poliklonális IgG-vel inkubáltuk, majd szekunder antitestként Alexa Fluor® 488 jelölt IgG F (ab’) 2 fragmensét használtuk. A Gal-9 pozitivitást zöld szín jelöli az ábrán. A DNS festés Hoechst 33342 festékkel történt, mely révén a sejtmagok láthatóvá válnak (kék színnel). A képeket Zeiss Axiovert LSM 510 konfokális lézer mikroszkóp segítségével készítettük (63x /1,40 Oil DIC). DIC: differenciál interferencia kontraszt
5.4. A VEGF molekulával kapcsolatos eredményeink Az alábbiakban a VEGF-al kapcsolatos eredményeinket ismertetjük. Kísérleteinket vad típusú BALB/c (WT) és hisztidin dekarboxiláz génkiütött (HDC–/–) állatokon végeztük A tüdő szövettani vizsgálata során tanulmányoztuk az OVA szenzitizálás és légúti provokáció hatására bekövetkező változásokat, valós idejű RT-PCR eljárással meghatároztuk a VEGF mRNS expressziójának alakulását az egyes csoportokban. Western blot technikával elemeztük a VEGF fehérje mennyiségének alakulását a tüdőben a kezelést követően. Továbbá az állatok tüdejének előzetes kimosása révén nyert BAL folyadékból meghatároztuk a VEGF pozitív alveoláris makrofágok, limfociták és eozinofil granulociták százalékos arányát és azok sejten belüli VEGF mennyiségét mind a négy vizsgálati csoportban (HDC–/–ova, HDC–/–control, WTova és WTcontrol). A továbbiakban ezen eredményeinket ismertetjük részletesebben.
5.4.1. A tüdő szövettan eredményei Az OVA szenzitizált és provokált (HDC–/–ova and WTova) állatok tüdejéből készült metszeteket tanulmányozva a légutak falának fokozott ödémás elváltozását tapasztaltuk, valamint gyulladásos sejtek beáramlását figyeltük meg a peribronchiális és perivaszkuláris részekre a kontroll csoportokéhoz képest (HDC–/–control és WTcontrol). A korábbi megfigyelésekkel összhangban [159,162] ezek a változások kevésbé tűntek markánsnak a HDC–/–ova állatok esetében a WTova egereknél tapasztaltakhoz képest (37. ábra). A HDC–/–ova egerek tüdejében alacsony mértékű gyulladást mutató kis foltszerű
73
területeket találtunk, melyekben kevés mennyiségű eozinofil granulocita is látható. Szignifikáns eltérést tapasztaltunk az eozinofil granulociták számát tekintve a HDC–/–ova (1,1 + 1,6 /látótér, 400x-os nagyítás; p<0,01) és WTova állatokban.
37. ábra. Asztmásított vad típusú (WT) és hisztamin hiányos (HDC–/–) egér tüdejének szövettani képe
A WTova (A) és HDC–/–ova (B) állatok tüdejének szövettani képe. A kis nyilak az eozinofil granulocitákra mutatnak, melyek száma az allergizálási procedúrát követően megnőtt. A WTova állatok tüdejében nagyobb számban (1,1 + 1,6 /látótér, 400x-os nagyítás; p<0,01) vannak jelen eozinofil granulociták, mint a HDC–/–ova (1,0 + 1,7 /látótér; p<0,01) egerek esetében. Eredeti nagyítás: x 200.
5.4.2. A VEGF mRNS expressziója a tüdőben OVA szenzitizálást és provokációt követően a VEGF mRNS szintje nem szignifikáns módon, de kissé csökkent a HDC–/–ova és WTova állatok tüdejében egyaránt placebo kezelt kontrolljaikhoz képest (HDC–/–control és WTcontrol). A VEGF mRNS expresszió
74
mértéke nem különbözött a kontroll csoportok között (HDC–/–control vs. WTcontrol), sem pedig a szenzitizált és provokált csoportok között (HDC–/–ova vs. WTova) (38. ábra).
38. ábra. A VEGF mRNS expressziója a tüdőben.
units) (arbitrary VEGF / GAPDH egységek relatív VEGF/GAPDH
1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 WTcontrol WT control
WTova WT ova
–/– HDC–/–control HDC control
HDC–/–ova HDC–/–ova
A VEGF mRNS expresszióját valós idejű RT-PCR technikával határoztuk meg a WTcontrol, WTova, HDC–/– control
és HDC–/–ova állatok tüdejéből, majd az értékeket GAPDH-ra korrigáltuk. Az adatok 7-7 állatból
származnak. Az ábrán az átlag és szórás értékeket tüntettük fel. Szignifikáns eltérést nem tapasztaltunk.
5.4.3. A VEGF fehérje szintje a tüdőben A HDC–/–ova, HDC–/–control, WTova és WTcontrol állatok tüdejéből Western blot technikával meghatároztuk a VEGF fehérje szinteket, és egyetlen elkülönülő sávot találtunk 23 kD-nál. A HDC–/–ova és WTova egerek esetén megnövekedett Gal-9 fehérje szintet találtunk a kontrollokhoz (HDC–/–control and WTcontrol) képest (p<0,05; HDC–/–ova vs. HDC–/–control és WTova vs. WTcontrol). A VEGF fehérje mennyisége a kontrollok között (HDC–/–control vs. WTcontrol) és allergizált csoportok között (HDC–/–ova versus WTova) nem mutatott szignifikáns eltérést (39. ábra).
75
39. ábra. A VEGF fehérje mennyisége a tüdőben.
VEGF (arbitrary egységek relatívunits) VEGF fehérje
250
#
* 200
150
100
50
0 WTcontrol WT control
WTova WT ova
–/– HDC–/–control HDC control
–/– HDC–/–ova HDC ova
A VEGF fehérje mennyiségi változását a WTcontrol, WTova, HDC–/–control és HDC–/–ova állatokban Western blot technikával határoztuk meg. Egyetlen, jól elkülöníthető sávot kaptunk 23 kD-nál. A blotokat számítógépes denzitometrálással értékeltük ki, az adatokat átlag ± szórás formátumban ábrázoltuk, csoportonként 7 állat eredményéből számítva. A szignifikancia elemzést két utas varianciaanalízis alkalmazásával végeztük, ezt követte a páronkénti összehasonlítás a Newman-Keuls teszt szerint. *p<0,05; WTcontrol vs. WTova; # p <0,05; HDC–/–control vs. HDC–/–ova
5.4.4. VEGF immunpozitivitás a BAL makrofágokban A szenzitizálást és légúti provokációt követően a VEGF immunpozitivitást mutató alveoláris makrofágok aránya változatlan maradt a HDC–/–ova és WTova állatok BALjában a kontroll állatokéhoz képest (40/A ábra). Viszont az alveoláris makrofágok intracelluláris VEGF mennyisége megnőtt a HDC–/–ova (p<0,01; HDC–/–ova vs. HDC–/– control)
és WTova (p<0,01; WTova vs. WTcontrol) állatokban a kontroll csoportjaikhoz
viszonyítva. A kontrollok között (HDC–/–control vs. WTcontrol) és a szenzitizált és provokált állatok között (HDC–/–ova vs. WTova) nem tudtunk kimutatni szignifikáns különbséget a BAL alveoláris makrofágok sejten belüli VEGF mennyiségét illetően (40/B ábra).
76
40. ábra. VEGF immunpozitivitás a BAL makrofágokban
(%)(%) alveolar macrophages positive VEGF makrofágok alveoláris pozitív VEGF
A., 70 60 50 40 30 20 10 0 WTc WT control
WTsc WT ova
–/– HDC-KOc HDC control
–/– HDC-KOsc HDC ova
units) (arbitrary Fluorescence intensity egység) (relatív intenzitás Fluoreszcencia
B., 180
#
160 140
* 120 100 80 60 40 20 0
WTWTc control
WTsc WT ova
–/– HDC-KOc HDC control
–/– HDC-KOsc
HDC
ova
A tüdőt 3 x 0,6 ml PBS folyadékkal átmostuk, majd áramlási citofluoriméterrel meghatároztuk az így nyert BAL-ban a VEGF pozitív alveoláris makrofágok százalékos arányát (A) és azok intracelluláris VEGF tartalmát (B). Az adatokat átlag ± szórás alakban ábrázoltuk, csoportonként 7 állat értékeit felhasználva. * p<0,01; WTcontrol vs. WTova, # p<0,01; HDC–/–control vs. HDC–/–ova.
77
5.4.5. VEGF immunpozitivitás a BAL limfocitákban OVA szenzitizálást és légúti provokációt követően a VEGF immunpozitivitást mutató limfociták aránya megnőtt a HDC–/–ova és WTova egerekben a kontroll csoportjaikhoz képest (p<0,01; HDC–/–ova vs. HDC–/–control; p<0,01; WTova vs. WTcontrol) (41/A ábra). A VEGF pozitív limfociták intracelluláris VEGF mennyisége szintén több volt a HDC–/–ova (p<0,01; HDC–/–ova vs. HDC–/–control) és WTova (p<0,01; WTova vs. WTcontrol) állatokban a kontroll csoportokéhoz viszonyítva (41/B ábra).
41. ábra. VEGF immunpozitivitás a BAL limfocitákban.
A. 90
#
VEGF pozitív limfociták (%)
VEGF positive T lymphocytes (%)
80
*
70 60 50 40 30 20 10 0
WTWTc control
WTsc WT ova
–/– HDC-KOc HDC control
78
–/– HDC-KOsc HDC ova
intenzitás (relatív egység) Fluoreszcencia Flouorescence intensity (arbitrary units)
B. 18
#
16
*
14 12 10 8 6 4 2 0 WTc WT control
WTsc WT ova
–/– HDC-KOc HDC control
HDC-KOsc HDC–/–ova
3 x 0,6 ml PBS folyadékkal az állatok tüdejét átmostuk, majd áramlási citofluoriméterrel meghatároztuk az így nyert BAL-ban a VEGF pozitív limfociták százalékos arányát (A) és azok intracelluláris VEGF tartalmát (B). Az adatokat átlag ± szórás alakban ábrázoltuk, csoportonként 7 állat értékeit felhasználva. A szignifikancia elemzést két utas varianciaanalízis alkalmazásával végeztük, ezt követte a páronkénti összehasonlítás a Newman-Keuls teszt szerint. * p<0,01; WTcontrol vs. WTova; # p<0,01; HDC–/–control vs. HDC–/–ova.
5.4.6. VEGF immunpozitivitás a BAL eozinofil granulocitáiban OVA szenzitizálást és légúti provokációt követően VEGF immunpozitív eozinofil granulociták jelentek meg a HDC–/–ova és WTova állatok BAL-jában. A VEGF pozitív granulociták százalékos aránya (42/A ábra) és intracelluláris VEGF tartalmuk (42/B ábra) nagyfokú hasonlóságot mutatott a két allergizált csoportban (HDC–/–ova és WTova).
79
42. ábra. VEGF immunpozitivitás a BAL eozinofil granulocitáiban.
granulociták eozinofilgranulocytes pozitíveosinophil VEGF (%) (%) VEGF positive
A., 70 60 50 40 30 20 10 0 WTc WT control
WTsc WT ova
HDC-KOc –/– HDC control
HDC-KOsc –/–
WTc WT control
WTsc WT ova
HDC-KOc –/– HDC control
HDC-KOsc –/– HDC ova
HDC
ova
B.,
egység) (relatív intenzitás Fluoreszcencia units) (arbitrary Fluorescence intensity
40 35 30 25 20 15 10 5 0
A tüdőt 3 x 0,6 ml PBS folyadékkal átmostuk, majd áramlási citofluoriméterrel meghatároztuk az így nyert BAL-ban a VEGF pozitív eozinofil granulociták százalékos arányát (A) és azok intracelluláris VEGF tartalmát (B). Az adatokat átlag ± szórás alakban adtuk meg csoportonként 7 állat értékeinek felhasználásával. Nem találtunk szignifikáns eltérést a csoportok között. A kontroll csoportokban pedig nem volt kimutatható mennyiségű eozinofil granulocita populáció.
80
6. EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE Az allergiás asztma a légutak komplex gyulladásos betegsége, melyre jellemző a légutak különféle elzáródása és az AHR [163]. Az allergiás asztma kialakulásában számos molekula részt vesz, azonban előtérbe kerültek a cukorkötő molekulák, mint például a galektinek. A galektinek szerepét az adaptív és a természetes immunválasz kapcsán egyaránt leírták. [1-3]. Azonban a galektinek allergiás asztmában betöltött funkciójával kapcsolatos ismereteink korántsem mondhatóak teljesnek. Jelenlegi munkánk során célul tűztük ki a Gal-1,-3,-9 és VEGF expressziójának vizsgálatát az allergiás asztmában.
6.1. Az asztma állatmodell visszaigazolása Modellként az asztma klasszikusnak mondható, OVA indukált egér modelljét alkalmaztuk [164]. Az OVA szenzitizált és légútilag provokált állatok esetében fokozott AHR-t, a tüdőben jelentős peribronchiális és perivaszkuláris gyulladásos sejt infiltrációt, kehelysejt metapláziát és fokozott nyáktermelést tapasztaltunk. Továbbá a BAL sejtek száma növekedett, megjelentek olyan sejtpopulációk (eozinofil és neutrofil granulociták), melyek az egészséges állatok BAL-jában nem találhatóak meg, és melyek az asztmára jellemző elváltozások [164-165]. Az asztmás tüdőben zajló gyulladásos válaszra jellemző, hogy a légutakba limfociták [7-8], elsősorban aktivált Th2 sejtek infiltrálódnak [9,166]. A Th2 eredetű citokinek és kemokinek eozinofíliás gyulladást indukálnak, és kiemelt szerepet játszanak az allergiás asztma patogenezisében [10-11].
6.2. A Gal-1 molekulával kapcsolatos eredmények megvitatása Számos klinikai kórkép kapcsán leírták, hogy a Gal-1 kulcsfontosságú bizonyos immunológiai folyamatok szabályozásában [112,114,167-168], azonban az asztmában betöltött szerepe még nem teljesen tisztázott.
81
Az asztma a légutak betegsége, melynek során az aktivált limfocitákból, hízósejtekből, eozinofilekből
és
makrofágokból
származó
mediátoroknak
különösen
fontos
immunregulációs és effektor funkciójuk van [169-172]. Ezek közül a mediátorok közül az egyik legismertebb a hisztamin [159,172], de más molekulák is lényegesek a betegség patomechanizmusában. Jelenlegi munkánk során az asztma OVA-indukálta légúti gyulladással járó rágcsáló modelljében vizsgáltuk a Gal-1 szerepét, valamint HDC–/– egerek alkalmazásával tanulmányoztuk a lehetséges kapcsolatot a Gal-1 és a hisztamin között. A vad típusú állatok tüdejében az OVA szenzitizálást és légúti provokációt követően a Gal-1 mRNS expressziója és fehérje mennyisége egyaránt fokozódott a kontroll csoporthoz képest (WTcontrol). Az immunhisztokémiai elemzés során azt tapasztaltuk, hogy az alveoláris makrofágok, a limfociták és az epiteliális sejtek a Gal-1 fő forrásai a tüdőben. A gyulladás és az immunválasz Th2 irányú eltolódása alapvető az asztma patogenezisében [173]. A Gal-1-ről kimutatták, hogy apoptózist indukálhat [110-112] és gátolni képes a Th2 limfociták sejtciklusát [106,109,111,174-175], ezáltal az asztmás gyulladást indirekt módon befolyásolhatja. Leírták, hogy bizonyos gyulladásos körülmények között az aktivált makrofágok [108,176], a stimulált T [109] és B sejtek [110] nagy mennyiségben szecernálnak Gal-1-et, hogy elpusztítsák az effektor T sejteket, miután azok betöltötték küldetésüket a gyulladásos imunválasz során. Amennyiben a Gal-1 nem megfelelő mennyiségben van jelen, nem történik meg az aktivált T sejtek eltávolítása a tüdőből, és ezáltal a tüdő védtelen marad a T sejtek által termelt pro-inflammatorikus citokinek szövetroncsoló hatásával szemben. Más szerzők in vivo kimutatták, hogy a Gal-1 direkt módon csökkenti a gyulladást azáltal, hogy gyulladásos citokinek, mint az interleukin-2 (IL-2), tumor nekrózis faktor(TNF- ) és interferon- (INF- ) képződését gátolja [113,167,177]. Ezek a hatások csökkenthetik az asztmás gyulladást és módosíthatják az immunsejtek tüdőszövetbe vándorlását azáltal, hogy megakadályozzák a T sejt adhézióját az extracelluláris mátrixhoz [113] valamint a neutrofilek extravazációját [177]. A Gal-1 ugyanakkor a Th1-es típusú kísérletes autoimmun encephalomyelitist [114] és kollagén indukálta artritiszt [112] is módosítja, ugyanis megakadályozza a Th1 típusú citokinek szintézisét és/vagy szekrécióját [112-113]. Ezáltal elősegíti az immunológiai
82
egyensúly Th2 irányba való eltolódását. Csökkenti az INF szintjét és fokozza az IL-5 produkciót [112-113]. Az IL-5-ről ismert továbbá, hogy szabályozhatja az eozinofilek növekedését, differenciációját, aktivációját és túlélését [178], a Gal-1 tehát IL-5-re gyakorolt hatása révén indirekt módon súlyosbíthatja az asztmás tüneteket. Állatmodellen azt is kimutatták, hogy az IL-5 gátlása következtében az eozinofilek nem vándoroltak be a tüdőbe [179]. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a Gal-1 egyrészt enyhítheti az asztma tüneteit azáltal, hogy eliminálja a gyulladásos sejteket (kivéve az eozinofileket) és gátolja a gyulladást, másrészt viszont azzal, hogy a Th2 irányba tolja el az immunválaszt, súlyosbíthatja az asztma lefolyását. A Gal-1 asztma során betöltött pozitív és negatív hatásainak pontos tisztázásához azonban még további vizsgálatokra van szükség. A hisztamin az asztmás reakciók egyik központi mediátora [159]. Szerepet játszik szinte minden kulcsfontosságú asztmás tünet megjelenésében, így a gyulladás kialakulásában és a légúti hiperreaktivitás létrejöttében is [172]. Jelenlegi munkánk során célul tűztük ki annak vizsgálatát is, hogy kimutatható–e bárminemű összefüggés, kapcsolat a Gal-1 és a hisztamin között, ezért ennek tanulmányozására a hisztamin veleszületett hiányával jellemezhető HDC–/– állatokat vontunk be a kísérletbe [69]. A HDC–/– egerek tüdejében, a vad típusú társaikhoz hasonlóan az OVA szenzitizálás és légúti provokáció a HDC–/–ova csoportban Gal-1 mRNS expresszió fokozódásához vezetett a kontroll csoportjukhoz viszonyítva (HDC–/–control), ugyanakkor a KO állatokban lényegesen alacsonyabb Gal-1 mRNS expresszió volt kimutatható a vad típusú egerekéhez képest. A Gal-1 fehérje szintek változása a HDC–/–ova állatok tüdejében követte az mRNS expressziós változásokat a HDC–/– kontroll csoporthoz viszonyítva, azonban a szignifikáns különbség eltűnt. Továbbá a HDC–/– állatok esetében a Gal-1-et termelő sejtféleségek is megegyeztek a vad típusú állatoknál megfigyeltekkel. Az egyik legfőbb oka annak, hogy a HDC–/– állatokban a Gal-1 fehérje mennyisége a tüdőben vad típusú társaikhoz képest csak kis mértékben nőtt, az lehet, hogy ezekben a genetikailag módosított állatokban az asztmára jellemző fokozott válaszképesség csökkent. Munkacsoportunk korábbi kutatásai során leírta, hogy a HDC–/– állatok immunválaszában jelentős különbségek mutathatóak ki a vad típusú egyedekhez képest [159]. A HDC–/– állatoknak kevesebb hízósejt prekurzoruk és hízósejtjük van. Továbbá
83
hízósejtjeik granulumainak tartalma is jóval kevesebb és a degranuláció is károsodott [69]. OVA szenzitizálást és légúti provokációt követően a HDC–/– állatokban a légúti gyulladás és a légúti hiperreaktivitás kevésbé volt súlyos a vad típusú állatokéhoz képest. Erre utalt a Th1 típusú citokinek, kemokinek fokozottabb expressziója is [159]. A HDC–/– állatokban a csökkent gyulladás és a Th1 irányba polarizált immunválasz a tüdőszövetek csökkent Gal-1 termelő képességével járhat együtt. A vad típusú és HDC–/– állatok BAL sejtjeinek kapcsán végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy az alveoláris makrofágok és limfociták képesek Gal-1-et termelni és egyúttal a szövetből az alveoláris felszín felé migrálnak. Míg a WT állatok BAL-jában a Gal-1 pozitív alveoláris makrofágok és limfociták száma nem változott OVA szenzitizálást és légúti provokációt követően, a HDC–/– egerekben számuk megnőtt a HDC–/–control és a WTova csoportokéhoz képest. Ez azt bizonyítja, hogy a hisztamin hiánya előidézi a Gal-1 pozitív immunsejtek alveoláris tér felé történő vándorlását. Továbbá az OVA szenzitizált és légútilag provokált HDC–/– egerek alveoláris makrofágjai nagyobb mennyiségű intracelluláris Gal-1-et tartalmaztak, mint a HDC–/– control
és/vagy WTova egyedek makrofágjai.
Ezek az eredmények arra engednek
következtetni, hogy a HDC–/– állatok alveoláris makrofágjainak Gal-1 szintje nagyon megemelkedik az asztma során a hisztamin hiánya miatt. Meg kell említeni azonban, hogy az alveoláris makrofágok nem kizárólagos forrásai a Gal-1-nek, ami magyarázata lehet annak, hogy a tüdőben általánosan tapasztalható Gal-1 szintje kissé miért alacsonyabb a HDC–/– állatokban a vad típusú egerekhez képest. Az alveoláris makrofágok alapvető fontosságú immunsejtek a tüdőben és olyan immunfolyamatokat aktiválnak, melyek a kórokozók eliminálására irányulnak [180]. A makrofágok
megváltoztathatják
az
asztmás
tüneteket
[181].
Az
asztmás
immunválasznak már a korai fázisában a makrofágok biológiailag aktív molekulákat szintetizálhatnak - mint például Gal-1 - melyek mintegy karmesterként „vezénylik” a gyulladásos folyamatokat [173,182]. Blokkolják a hízósejtek degranulációját és a nitrogén-monoxid szintézisét [177,183], melyek gátolják a légutak simaizom elemeinek kontrakcióját [172,184]. Ezek az események kedveznek a Th1 típusú citokinválasz kialakulásának [172,185].
Gal-1 autokrin módon gátolja az alveoláris makrofágok
arachidonsav és prosztaglandin termelését [177], ezáltal is csökkentve az asztmás gyulladást.
84
A makrofágok asztma során betöltött szerepének pontosabb tanulmányozása céljából in vitro kísérletet végeztünk J774.2 alveoláris makrofág sejtvonalon. Az LPS-al stimulált sejtek nagyobb mennyiségben termeltek Gal-1-et, mint a nem stimulált populáció sejtjei. Ez az eredmény arra utal, hogy a Gal-1 termelődés kiváltásában a sejtstimulációnak fontos szerepe van. Az LPS stimulációt követően alkalmazott HDC blokkoló (FMH) szignifikáns módon tovább fokozta a Gal-1 mennyiségét a J774.2 sejtekben összehasonlítva a csak LPS stimulált (LPS) illetve az LPS-sel és hisztaminnal együttesen kezelt (LPS+H) csoportokhoz képest. Bár nem szignifikáns módon, de a hisztamin csökkentette az LPS stimulált J774.2 sejtek (LPS+H) Gal-1 mennyiségét a csak LPS-sel kezelt sejtekéhez képest. Ezek a megfigyelések és in vivo eredményeink arra engednek következtetni, hogy a hisztamin a Gal-1 negatív regulátora lehet egér alveoláris makrofágokban. Eredményeinket összevetve az irodalommal azt mondhatjuk, hogy a Gal-1 és a hisztamin egymás ellentétes hatású regulátorai [177] (43.ábra).
43. ábra. A hisztamin és Gal-1 közötti feltételezett inverz reguláció.
Gal-1 Gal-1
Hízósejt
Makrofág
Makrofág
Hízósejt Hisztamin
Hisztamin A Gal-1 és a hisztamin egymás produkcióját ellentétes módon szabályozhatják: A hízósejtek által termelt hisztamin gátolni képes az alveoláris makrofágok Gal-1 termelését, és az alveoláris makrofágok által képzett Gal-1 blokkolja a hízósejtek hisztamin produkcióját. A fehér nyilak a Gal-1 és hisztamin szecernációt mutatják, míg a szaggatott nyilak a gátlásra utalnak.
85
A hízósejtek által termelt hisztamin képes gátolni az alveoláris makrofágok Gal-1 termelését. A csökkent Gal-1 szint az alveoláris makrofágokban nem fejtheti ki gátló hatását a hisztamin termelésre, ami az asztmás tünetek kialakulása irányába billentheti el a mérleget. Ha a tüdőben alacsony a hisztamin szintje, akkor az alveoláris makrofágok nagyobb mennyiségben szecernálják a Gal-1-et, ami blokkolja a hisztamin termelést, tehát csökkentheti az asztmás tüneteket. Ebből adódóan, míg a hisztamin kulcsfontosságú szerepet tölt be az asztmás tünetek kialakításában, addig az alveoláris makrofágok által termelt Gal-1 inkább anti-asztmatikus hatással rendelkezik. Összegzésként eredményeink arra utalnak, hogy a Gal-1 fontos szerepet játszhat az asztma patogenezisében, mert az OVA szenzitizált és légútilag provokált állatok tüdejében ennek a lektinnek az expressziója lényegesen megnőtt a kontrollokhoz képest. Asztma modell rendszerünkben a hisztaminnak kettős szerepe lehet a tüdőben a Gal-1 termelés szabályozása kapcsán. Egyrészt a hisztamin növelheti a Gal-1 mennyiségét a tüdőben azáltal, hogy fokozza az asztmás gyulladást, másrészt viszont a hisztamin negatív regulátorként csökkenteni képes a Gal-1 mennyiségét bizonyos sejttípusokban, főleg az alveoláris makrofágokban. Pontosabb szerepük tisztázása azonban még a jövő feladata.
6.3. A Gal-3 molekulával kapcsolatos eredmények megbeszélése A Gal-3 szerepét több betegség – pl. atheroszklerózis, karcinómák és neoplazmák kapcsán is leírták [186-188]. A Gal-3-at vizsgálták asztma kapcsán is, itt szintje megnőtt asztmában a kontrollokhoz képest [189]. Kísérleteink során mi is azt tapasztaltuk, hogy az OVA szenzitizált és légútilag provokált WT állatokban a Gal-3 mRNS expressziója és fehérje mennyisége egyaránt fokozódott a tüdőben. Ezen túlmenően vizsgáltuk azt is, hogy mely sejtek a fő forrásai a Gal-3-nak a BAL-ban. Ahogyan azt mások is alátámasztották már, a Gal-3 egyik fő forrásai a monociták és makrofágok [190], azonban kimutattuk, hogy a BAL-ban található limfociták és újonnan bevándorolt eozinofil és neutrofil granulociták is képesek termelni ezt a lektint.
86
A Gal-3 molekuláris szerepe az asztma során meglehetősen összetett. Proinflammatorikus [191] és antiapoptotikus hatása [192-193] révén gyanítjuk, hogy fontos szerepe lehet az asztmás gyulladás kialakulásában és fenntartásában. Stimulálja a neutrofil granulociták szuperoxid termelését [194], aktiválja a NADPH oxidázt, elősegíti az asztmás gyulladásban fontos szerepet játszó monociták IL-1 termelését [105,195], monocitákra és makrofágokra nézve kemoattraktáns hatású [196]. Az előzőekben leírtuk, hogy a hisztamin kulcsfontosságú az asztma során [172]. Szerepet játszik a simaizom kontrakcióban, a mikrovaszkuláris permeabilitást növeli, fokozza a vazodilatációt és a nyáktermelést [197-198]. Másrészt a hisztamin fontos immunregulátora számos folyamatnak is [199]. A hisztamin Gal-3 termelésre kifejtett esetleges regulációs hatását hisztamin hiányos HDC–/– állatokon tanulmányoztuk OVA szenzitizálást és légúti provokációt követően. Mint azt már említettük, az immunfolyamatok tekintetében a génkiütött állatokban a vad típusú egyedekhez képest különbségek mutathatók ki [69,159]. Megfigyeléseink során azt tapasztaltuk, hogy a HDC–/– állatok esetében OVA szenzitizálást és légúti provokációt követően a légúti gyulladás és hiperreaktivitás kevésbé volt súlyos, mint a normál BALB/c genotípusú egerek esetében [159]. A Gal-3 mennyiségi vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a HDC–/– egerek BAL-jában szignifikánsan kevesebb Gal-3 pozitív alveoláris makrofág volt jelen, és azok intracelluláris Gal-3 szintje is alacsonyabb volt OVA kezelést követően a WT állatokéhoz képest. Ezek a megfigyelések arra engednek következtetni, hogy a hisztamin direkt módon hatással lehet a Gal-3 regulációjára alveoláris makrofágok esetében, vagy a HDC–/– állatoknál tapasztalt eltérő immunfolyamatok vezethetnek a Gal-3 mennyiségi csökkenéséhez. Azért, hogy megvizsgáljuk, hogy a hisztamin direkt módon hat –e az alveoláris makrofágok Gal-3 termelésére, in vitro sejtmodellt alkalmaztunk. A hisztamin és a HDC-blokkolóként használt α-fluoro-metil hisztamin (FMH) kezelés nem volt hatással a J774.2 sejtek Gal-3 termelésére, ami arra utal, hogy a hisztaminnak nincs direkt szerepe a Gal-3 szintézis szabályozásában, hanem feltehetően indirekt módon, mediátorok révén regulálja a Gal-3 produkciót. Irodalmi adatok szerint a Gal-3 fokozott expressziója révén enyhíti a Th1 típusú betegségek tüneteit, ugyanakkor súlyosbíthatja a Th2 típusúakat, így tehát az asztmát is.
87
Gal-3 deficiens egerek tanulmányozása [189] megerősíti a fenti teóriát, ugyanis ezeknek az állatoknak OVA provokációt követően kevesebb gyulladásos sejtjük volt, légúti hiperreaktivitásuk is csökkent a WT egerekéhez képest. Továbbá, ha a Gal-3 endogén szubsztrátját az N-acetilglükózaminil-transzferáz V (Mgat5) genetikai módosítása révén eltávolították, akkor ezeknek az állatoknak nőtt a késleltetett-típusú hiperszenzitivitása és fokozott hajlamot mutattak a kísérletes autoimmun enkefalomielitisz kialakulására [200], ami arra utal, hogy az immunválasz Th1 irányba tolódott el. Ha a szubsztrát az intakt Mgat5, akkor a glikoproteinek keresztkötése gátolja az agonista-függő TCR-ek csoportosulását, és ez a Th2 sejtek proliferációját idézi elő [200]. Kísérleteink alapján kapcsolatot feltételezünk az immunpolarizációs állapot és alveoláris makrofágok Gal-3 mennyisége között. Korábban kimutattuk, hogy a hisztamin hiánya a HDC–/– állatok immunrendszerét Th1 irányba polarizálta, ugyanis az IgE termelés csökkent, és a Th1 típusú citokinek és kemokinek szintje megnőtt [159]. Jelenlegi kísérleteinkben kimutattuk, hogy a HDC–/– állatok alveoláris makrofágjai, melyek a Gal-3 fő forrásai az asztma során, szignifikánsan kevesebb Gal-3-at tartalmaztak OVA szenzitizálást és légúti provokációt követően, mint WT társaik. Ezek alapján arra következtetünk, hogy az alveoláris makrofágok kevesebb Gal-3-at képesek termelni, ha az immunpolarizáció Th1-es irányba tolódott el. Gyanítjuk, hogy nem csupán a hisztamin hiánya képes befolyásolni az alveoláris makrofágok Gal-3 termelő képességét az OVA szenzitizálást és provokációt követően a HDC–/– állatokban, hanem más tényezők is, ugyanis ezeknek az állatoknak a bazofil és eozinofil granulociták valamint hízósejtek által mediált immunfolyamatai is károsodhattak [159]. A Gal-3 előidézheti a hízósejtek és bazofilek aktivációját az IgE receptorok keresztkötése által [133,190], mely a sejtek degranulációja révén különféle mediátorok kibocsátásához vezethet. Ezzel szemben a Gal-3 eozinofilekben és allergén indukálta T-sejtekben gátolja az IL-5 transzkripcióját, mely az eozinofilek növekedését, differenciációját, aktivációját és túlélését szabályozza [116]. Ebben az értelemben a Gal-3 anti-asztmatikus hatású. Eredményeinket összefoglalva arra következtetünk, hogy az alveoláris makrofágok, eozinofil és neutrofil granulociták illetve limfociták által termelt Gal-3 fontos mediátora lehet az asztmás reakcióknak. Úgy tűnik, hogy a hisztaminnak nincs közvetlen szabályozó hatása a Gal-3 produkcióra, de indirekt módon befolyásolhatja a Gal-3
88
pozitív makrofágok számát és azok intracelluláris Gal-3 mennyiségét. Feltételezzük, hogy a hisztamin hiányos HDC–/– állatokban a Gal-3 módosíthatja az asztma patogenezisét, azonban -e regulációs folyamatok tisztázásához további kutatómunkára van szükség.
6.4. A Gal-9 molekulával kapcsolatos eredmények megvitatása Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy az allergizált (GOVA) egerek Gal-9 pozitív limfocitáinak száma és ezen sejtek intracelluláris Gal-9 mennyisége megnőtt, valamint a BAL felülúszóban a Th2-es típusú citokinek, mint az IL-4, IL-5 és IL-6 szintje emelkedett a placebo kezelt GPBS és a gyulladáscsökkentő szteroidot kapott GOVA+DEX egerekéhez képest. Korábban kimutatták, hogy a Gal-9 a Th1 limfociták sejthalálát indukálja Tim-3 dependens módon. A Tim-3 egy Th1 specifikus, 1-es típusú membránfehérje, mely a naiv T sejtek és a Th2 sejtek felszínén nem expresszálódik, csak a teljesen differenciált Th1 típusú sejtek felszínén jelenik meg [141]. Eredményeink, melyek szerint a Gal-9 szintje a limfocitákban megemelkedett, arra engednek következtetni, hogy a Gal-9-nek szerepe lehet az allergiás asztmára jellemző Th2 típusú dominancia kialakulásában, és az ennek következtében kialakuló Th2 citokinek fokozott szecernálásában. Munkánk során a Gal-9 szintézisét is vizsgáltuk az allergizált egerek tüdejében. Érdekes módon, míg a Gal-9 mRNS expresszió csökkent a tüdőben, a Gal-9 fehérje mennyisége megnövekedett a GOVA állatokban a GPBS egerekéhez képest. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az OVA szenzitizáció és légúti provokáció a Gal-9 transzkripcióját és transzlációját egyaránt megváltoztathatja. A Gal-9 fehérje mennyiségében bekövetkezett emelkedés és az mRNS expresszió egyidejű csökkenése arra utal, hogy a Gal-9 szintézisében a poszttranszkripciós szabályozásnak fontos szerepe van. A másik lehetőség, hogy a csökkent mRNS expressziós szint az általunk vizsgált időponthoz képest egy későbbi szakaszban csökkent fehérje szintet fog eredményezni a GOVA állatokban. Irodalmi adatok alapján azonban azt gyanítjuk, hogy az OVA szenzitizáció és légúti provokáció a Gal-9 fehérje mennyiségének növekedéséhez vezet. Yamamoto és
munkatársai
szintén
emelkedett
Gal-9
89
fehérje
szintet
figyeltek
meg
tengerimalacokban 7 órával az utolsó légúti provokációt követően, mely egészen 24 órán keresztül kimutatható volt [145]. A DEX kezelés nem változtatta meg a Gal-9 mRNS expressziót az OVA szenzitizált és légúti provokáción átesett (GOVA+DEX) állatokban a GOVA egerekéhez képest. Ugyanakkor a Gal-9 fehérje szintje csökkent a GOVA+DEX csoportban a GOVA állatokhoz képest. Eredményeink arra utalnak, hogy a DEX kezelés megváltoztatja a Gal-9 transzlációját, azonban nincs hatással a transzkripcióra. Ezek az eredmények alátámasztják a fent említett hipotézisünket, miszerint a Gal-9 szintézise mindkét szinten, tehát transzkripcionális és transzlácionális módon is regulált. A tüdőben a Gal-9 egyik fő forrásaként a bronchiális epitél sejteket tartják számon, habár gyanítják, hogy a fibroblasztok, endotél sejtek, limfociták, eozinofil granulociták és makrofágok is termelhetnek Gal-9-et [145,201]. Habár van egy látszólagos ellentmondás az irodalomban, a Gal-9 többféle módon is részt vehet az allergiás gyulladás patomechanizmusában. Eredményeinkkel összhangban Yamamoto és munkatársai is emelkedett Gal-9 szintet találtak egy másik modell kapcsán szenzitizált tengerimalacok tüdejében, és arra a következtetésre jutottak, hogy a Gal-9 indukálhatja az eozinofil granulociták kemotaxisát és a T sejtek apoptózisát [145]. Ezzel szemben Katoh és kollégái leírták, hogy a, különböző dózisban (10, 30, 100 µg) intravénásan adott rekombináns Gal-9 gátolja az allergiás gyulladást azáltal, hogy módosítja az extracelluláris mátrix CD44függő leukocita felismerő képességét [202]. Irodalmi adatok és saját eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy a Gal-9 hatása dózisfüggő. Míg a Gal-9 fiziológiás mennyiségben indukálja az eozinofil granulociták kemotaxisát és hozzájárul az allergiás asztma patomechanizmusához [145], addig a nagyobb koncentrációkban alkalmazott, exogén módon a szervezetbe juttatott Gal-9 csökkenti ezeknek a sejteknek a számát, ezáltal enyhíti a gyulladást [201]. Összegzésként elmondhatjuk, hogy a tüdőben tapasztalt Gal-9 fehérje mennyiségének fokozódása az irodalmi adatok alapján többféle módon befolyásolhatja az asztma folyamatát és súlyosságát. Ahogyan a fentiekben utaltunk rá, a Gal-9 a Th1 sejtek halálát indukálhatja [141], mely a Th2 dominancia kialakulásához és Th2-es típusú citokinek fokozott termelődéséhez vezet. A Th2-es citokinek, mint az IL-4, IL-5 és IL-6 fontos szerepet játszanak az allergiás asztma patofiziológiájában azáltal, hogy
90
eozinofiliás gyulladást idéznek elő [10,11,203]. Ezzel szemben a GOVA+DEX egerekben tapasztalt csökkent Gal-9 szint oka lehet az AHR és az eozinofiles légúti gyulladás enyhülésének. Az eozinofil granulociták és az eozinofil-eredetű molekulák jelenléte a légutakban összefüggést mutat az allergiás asztma excerbációjával [12-13,204]. A szecernált eozinofil mediátorok epiteliális károsodást okoznak és elősegítik a gyulladás tartós fennmaradását a tüdőben [205-207]. Befolyásolják az AHR-t [29] és a légúti remodelinget [11], szabályozzák az IgE termelést és az eozinofilek légúti infiltrációját [179]. A Gal-9 eozinofil toborzásra kifejtett hatása jól ismert. Allergizált tengerimalacok tüdejében leírták, hogy a Gal-9 szerepet játszik az elnyújtott eozinofil akkumulációban [145]. Más kutatók kimutatták, hogy a Gal-9 in vitro és in vivo körülmények között kemoattraktáns hatású az eozinofil granulocitákra nézve, azonban a neutrofil granulociták, limfociták és monociták migrációjára nem volt hatással [137]. Eredményeinket összefoglalva kimutattuk, hogy a Gal-9 mennyisége megnőtt az allergizált egerek tüdejében és a BAL limfocitáiban. Továbbá a Th2 típusú citokinek szintje emelkedett a GOVA állatok BAL-jában. Mindezen adatok arra utalnak, hogy a Gal-9-nek szerepe van az allergiás asztma patogenezisében. A jelenlegi publikációkkal összevetve feltételezzük, hogy a Gal-9-nek fontos szerepe lehet a Th2 dominancia kialakulásában, másrészt pedig az eozinofil granulociták toborzásában. Azonban még további kísérletekre van szükség, hogy a Gal-9 allergiás asztmában betöltött pontos szerepét tisztázhassuk.
6.5. A VEGF molekulával kapcsolatos eredmények megvitatása Az utóbbi években a VEGF az asztmakutatások egyik célpontja lett, mint a légúti gyulladás és remodeling lehetséges meditátora [208]. A hisztamin és a VEGF többféle módon vehet részt az asztma patomechanizmusában. Mindkét molekula indukálhatja gyulladásos sejtek szövetbe áramlását [149,209], előidézhetnek simaizom kontrakciót és vazodilatációt [210-211], valamint fokozzák a mikrovaszkuláris permeabilitást [212213]és a nyák kiválasztódást [214].
91
Kísérleteinkben HDC–/– és WT egerek segítségével vizsgáltuk a hisztamin [172] illetve annak hiányának hatását a VEGF szintézisre, expresszióra asztmában. Ehhez kutatólaborunkba bevezettük az allergiás légúti gyulladás és hiperreaktivitás klasszikus kísérletes állatmodelljét. A VEGF fehérje emelkedett szintjét tapasztaltuk az egerek tüdőszövetében és a BALban található limfocitákban és alveoláris makrofágokban az OVA szenzitizált és légútilag provokált HDC–/– és vad típusú állatokban egyaránt a kontrollokhoz képest (HDC–/–control és WTcontrol). Továbbá az OVA kezelt csoport BAL-jában megjelent a VEGF
pozitivitást
mutató
eozinofil
granulociták
populációja.
Eredményeink
összhangban vannak Lee KS és munkatársai által leírtakkal, akik allergizált állatokban VEGF immunreaktivitást mutattak ki a bronchiolák körüli gyulladásos sejtekben és epitél sejtekben, valamint a BAL makrofágokban, limfocitákban és eozinofil granulocitákban [215]. Mások VEGF pozitívitást találtak az OVA-szenzitizált egerek tüdejének fibroblasztjaiban is [216] valamint humán bronchiális biopszia mintákban a simaizom kötegekben is kimutattak VEGF-et [217]. Érdekes módon, míg a VEGF fehérje mennyisége megnőtt az OVA szenzitizált és provokált WT and HDC–/– egerek tüdejében, addig mRNS szinten nem tudtunk változást kimutatni a kontrollokhoz képest (WTcontrol és HDC–/–control). Hasonló jelenséget talált munkacsoportunk és más kutatók is patkány vese vizsgálata közben [218-220]. Ez a látszólagos diszkrepancia arra utal, hogy a poszt-transzkripcionális mechanizmusoknak fontos szerepük van a VEGF szintézis szabályozásában az alllergizált tüdőben is. Korábban kimutatták, hogy ha a HuR nevű RNS-kötő fehérje a VEGF mRNS 3’ nem transzlált AU gazdag régiójához kapcsolódik, akkor a transzkript stabilizálódik [221]. Továbbá a VEGF mRNS 5’ nem transzlálódó régiójában található két internális riboszóma belépési hely (internal ribosomal entry site (IRES)) biztosítja a VEGF hatékony transzlációját akkor is, ha a transzlációs mechanizmusok gátoltak [222]. A megnövekedett VEGF szintnek szerepe lehet az asztma patomechanizmusában. Eredményeinkkel összhangban Asai és munkatársai emelkedett VEGF szintet találtak az asztmás betegekből származó köpetben [223] valamint Hoshino és munkatársai fokozott VEGF mRNS expressziót mértek az emberi bronchiális biopsziás mintákból származó makrofágokban és eozinofil granulocitákban [224].
92
A korábbi irodalmi adatok arra utalnak, hogy az újonnan szintetizált véredények száma, mérete és összfelszíne szignifikáns módon megnőtt a gyulladt asztmás tüdőben. Egyre több tény támasztja alá, hogy az angiogenezis és a krónikus gyulladás összefüggésben állnak. Az újonnan létrejött véredények hozzájárulnak a gyulladás kialakulásához, azáltal, hogy lehetővé teszik, hogy a proinflammatórikus sejtek a gyulladás helyére vándorolhassanak [225-228]. A VEGF, mint lehetséges angiogenikus faktor, szintén részt vesz a gyulladás kialakulásában és fenntartásában azáltal, hogy fokozza az allergiás szenzitizációt és a T-helper 2 (Th2) típusú immunválaszt [229]. A tartós gyulladás a légutak szerkezeti változásához vezet. Ezt a jelenséget légúti remodelingnek nevezzük, melyre jellemző a nem teljesen reverzibilis légúti obstrukció, továbbá az idő előrehaladtával kialakuló progresszív tüdőfunkció vesztés. A légutak szerkezeti változása kapcsán a következő folyamatok mennek végbe: epitél sejtek proliferációja, kehelysejt metaplázia, szubepiteliális fibrózis, a légutak simaizom kötegének és bazális membránjának megvastagodása, kóros mértékű angiogenezis és mátrixfehérje depozíció [157,230]. A VEGF, mint az angiogenezist indító, kehelysejt metapláziát indukáló, és mátrix metalloproteináz (MMP)-9-et aktiváló molekula, az asztmában kialakuló szerkezeti tüdőremodeling folyamatának fontos mediátora lehet [158]. Munkánk során az allergizált HDC–/– és WT egerek tüdejében és BAL-jában hasonló VEGF fehérje szinteket tapasztaltunk. Jelen ismereteink szerint az irodalom a hisztamin VEGF szintézis szabályozásában betöltött szabályozó funkciójával kapcsolatban meglehetősen ellentmondásos. Numata és munkatársai HDC–/– állatok segítségével kimutatták, hogy a hisztamin kulcsfontosságú a sebgyógyulás folyamatában. A HDC–/– állatokban csökkent bázikus fibroblaszt növekedési faktor (bFGF) szintet találtak, azonban jelen eredményeinkhez hasonlóan a VEGF expresszió mértéke változatlan maradt a bőrön található sebek szélén [231]. Korábbi kutatásaink során mások munkájával egybehangzóan azt tapasztaltuk, hogy mind az endogén jelenlevő, mind pedig az exogén módon adott hisztamin fokozza a VEGF szintjét a H2 receptoron keresztül
hatva
[217,232-233].
Az
irodalomban
megfigyelhető,
látszólagos
diszkrepancia oka lehet, hogy a vizsgálatok során különböző modellek (egér vagy patkány, sebgyógyulás, granulációs szövet vagy vese iszkémia modell) alkalmazásával történtek a kísérletek. Jelenlegi eredményeink alapján az endogén hisztamin nem szükséges a VEGF szintézis fokozódásához az allergiás asztma egérmodelljében, bár
93
további kísérletekre van szükség, hogy a hisztamin és a megváltozott VEGF szintézis közötti lehetséges komplex összefügést feltérképezhessük. A hisztamin központi szerepe az azonnali (I-es) típusú hiperszenzitivitási reakciókban és ezáltal az asztma allergiás mechanizmusában jól ismert. Korábbi eredményeink szerint a hisztamin fontos befolyással bír más alapvető immunológiai folyamatokra is. Munkacsoportunk korábban kimutatta, hogy az OVA szenzitizált és provokált HDC–/– állatok AHR-je, a tüdő eozinofil sejtes gyulladása, a szérum OVA-specifikus IgE szintje jelentős mértékben csökkent, megváltozott a citokin és kemokin gének expressziós mintázata az ugyanilyen kezelésben részesült WT egerekhez képest [159]. Jelenlegi eredményeink értelmében arra következtetünk, hogy létezniük kell más, a hisztamin által mediált gyulladásos utaktól független mechanizmusoknak is, melyeknek a betegség lefolyására gyakorolt hatása rendkívül fontos. Megfigyeléseink részben magyarázatul
szolgálhatnak
a
bronchiális
asztma
kezelésében
alkalmazott
antihisztaminok kapcsán tapsztalt esetleges hatástalanságra [234-235]. Eredményeinket
összefoglalva
tehát
az
allergizált
HDC–/–
és
WT
egerek
tüdőszövetében és a BAL sejtjeiben egyaránt emelkedett VEGF fehérjeszintet tapasztaltunk. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a VEGF-nek szerepe lehet az asztma patogenezisében. Azonban a két allergizált csoportban (HDC–/–ova és WTova) a VEGF szintje nem különbözött egymástól, ami arra enged következtetni, hogy a HDC–/– állatokban tapasztalható hisztamin hiány nem befolyásolja az allergén indukált VEGF szintézist. Eredményeink arra engednek következtetni, hogy azon folyamatok között, melyek végső soron asztmához vezetnek, léteznie kell egy olyan útnak is, mely független a hisztamintól. Továbbá megfigyeléseink részben magyarázatul szolgálhatnak arra a tényre is, hogy bizonyos esetekben az asztma kezelésére használt anti-hisztamin készítmények miért bizonyulhatnak hatástalannak. Éppen ezért, a VEGF, mint a tüdő remodeling egyik lehetséges mediátora, a jövőbeni kutatások egyik célpontja lehet. Fontos lenne, hogy a molekula allergiás betegségekben és asztmában betöltött pontos szerepére fény derüljön.
94
7. KÖVETKEZTETÉSEK Értekezésem legfontosabb megállapításait az alábbi pontokban foglalom össze: 1. Asztmában a fokozott Gal-1 produkcióért elsősorban az alveoláris makrofágok, limfociták és részben a bronchiális epitél sejtek felelősek. 2. A hisztamin hiánya fokozza az alveoláris makrofágok és limfociták Gal-1 termelését, míg a hisztamin csökkenti azt, így a hisztamin és a Gal-1 molekula egymás regulátorai lehetnek. 3. Kimutattuk, hogy a Gal-3 mRNS expresszió és fehérje produkció egyaránt fokozódik az asztmás állatok tüdejében, amiben az alveoláris makrofágoknak, limfocitáknak valamint az újonnan bevándorló eozinofil és neutrofil granulocitáknak kitüntetett szerepük van. In vivo a hisztamin hiánya nem okozott változást a Gal-3 mennyiségében, amit in vitro is alátámasztottunk. Ez arra utal, hogy a hisztamin direkt módon nem befolyásolja a Gal-3 produkciót. 4. Méréseink alapján megállapítottuk, hogy allergizálás hatására a Gal-9 mRNS expressziója csökken, ezzel egyidejűleg a fehérje mennyisége nő, ezért feltételezzük, hogy a Gal-9 szintézisében a poszttranszkripciós szabályozásnak fontos szerepe lehet. Habár a BAL összes immunsejtfélesége mutatott Gal-9 pozitivitást, kimutattuk, hogy az asztmában tapasztalt emelkedett Gal-9 szintért elsősorban a limfociták, eozinofil és neutrofil granulociták, valamint az immunsejtek mellett az epiteliális sejtek felelősek. 5. Elsőként mutattuk ki, hogy a szteroid DEX kezelés csökkenti a Gal-9 mennyiségét a tüdőben, és a DEX kezelt beteg állatokban a Gal-9 szöveti lokalizációja is a kontrollokéhoz
hasonló.
Mivel
a
Gal-9
eozinofil
granulocitákra
nézve
kemoattraktáns hatású, feltételezzük, hogy a DEX a Gal-9 mennyiségének csökkentése révén is mérsékelheti a gyulladást.
95
6. Kimutattuk, hogy a VEGF fehérje mennyisége nő az asztmásítás hatására, a BALban található alveoláris makrofágok, limfociták és eozinofil granulociták VEGF produkciója fokozódik. 7. Elsőként mutattuk ki, hogy a genetikailag hisztamin hiányos állatok és a vad típusú, endogén hisztamint tartalmazó asztmásított egerek VEGF mRNS expressziójában és VEGF fehérje mennyiségében nincs különbség. Ezek alapján arra következtetünk, hogy a hisztamin direkt módon nem befolyásolja az allergén indukált VEGF szintézist. Feltételezzük, hogy az asztmához vezető folyamatok között léteznie kell egy hisztamin-független útvonalnak is, ami részben magyarázatul szolgálhatna arra is, hogy bizonyos esetekben az asztma kezelésére használt anti-hisztamin készítmények miért bizonyulhatnak hatástalannak.
96
8. ÁBRÁK ÉS TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE 8.1. Ábrák jegyzéke 1. ábra. A légúti gyulladás kialakulásának folyamata 2. ábra. A hisztamin keletkezése. 3. ábra. A humán H1R primer szerkezete. 4. ábra. A hisztamin receptor vázlatos szerkezete. 5. ábra. Példa a galektinek dimerizációjára illetve multimerizációjára. 6. ábra. A galektinek csoportosítása. 7. ábra. Galektinek által mediált sejt-szubsztrát adhézió. 8. ábra. A galektin (Gal) -1, -3, és -9 által kontrollált mechanizmusok a gyulladás során. 9. ábra. A galektin-1 (Gal-1) kristályszerkezete. 10. ábra. A galektin-3 (Gal-3) kristályszerkezete. 11. ábra. A galektin-9 (Gal-9) N-terminális CRD-jének kristályszerkezete 12. ábra. A vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) molekulaszerkezete. 13. ábra. Kísérleti protokoll. 14. ábra. A Gal-1 mRNS expressziója a tüdőben 15. ábra. A Gal-1 fehérje mennyisége a tüdőben 16. ábra. Gal-1 lokalizációja a tüdőben 17. ábra. A BAL leukocita összetétele 18. ábra. A Gal-1 pozitív alveoláris makrofágok (MF) és limfociták (Ly) százalékos aránya a BAL-ban 19. ábra. A Gal-1 pozitív alveoláris makrofágok (MF) és limfociták (Ly) intracelluláris Gal-1 tartalma a BAL-ban. 20. ábra. A Gal-1 mennyisége J774.2 alveoláris makrofág sejtekben 21. ábra. A Gal-3 mRNS expressziója a tüdőben. 22. ábra. A Gal-3 fehérje mennyisége a tüdőben 23. ábra. A Gal-3 pozitív sejtek százalékos aránya a BAL-ban 24. ábra. A Gal-3 pozitív sejtek intracelluláris Gal-3 tartalma a BAL-ban. 25. ábra. A Gal-3 mennyisége J774.2 alveoláris makrofág sejtekben 26. ábra. Az ovalbumin (OVA) hatása a légúti reaktivitásra.
97
27. ábra. A tüdő szövettani képe GPBS (A), GOVA (B) és GOVA+DEX (C) csoportokban. 28. ábra. A bronchoalveoláris folyadék (BAL) sejtes összetétele. 29. ábra. Gal-9 pozitív sejtek százalékos aránya a BAL-ban. 30. ábra. A BAL sejtek intracelluláris Gal-9 tartalma. 31. ábra. Szemléltető FACS hisztogram a Gal-9 pozitív makrofágokról a BAL-ban. 32. ábra. Szemléltető FACS hisztogram a Gal-9 pozitív limfocitákról a BAL-ban. 33. ábra. Citokin koncentrációk a bronchoalveoláris folyadék (BAL) felülúszójában. 34. ábra. A Gal-9 mRNS expressziója a tüdőben. 35. ábra. A Gal-9 fehérje mennyisége a tüdőben. 36. ábra. A Gal-9 immunhisztokémiai lokalizációja a GPBS (A), GOVA (B) és GOVA+DEX (C) állatok tüdejében. 37. ábra. Asztmásított vad típusú (WT) és hisztamin hiányos (HDC–/–) egér tüdejének szövettani képe 38. ábra. A VEGF mRNS expressziója a tüdőben. 39. ábra. A VEGF fehérje mennyisége a tüdőben. 40. ábra. VEGF immunpozitivitás a BAL makrofágokban 41. ábra. VEGF immunpozitivitás a BAL limfocitákban. 42. ábra. VEGF immunpozitivitás a BAL eozinofil granulocitáiban. 43. ábra. A hisztamin és Gal-1 közötti feltételezett inverz regulációja.
8.2. Táblázatok jegyzéke 1. Táblázat. A túlérzékenységi reakciók felosztása 2.
Táblázat.
Néhány,
az
asztmás
tünetek
előidézésére
szolgáló
protokoll
összehasonlítása. 3.
Táblázat. A real time polimeráz láncreakciók (RT-PCR) során használt primerek szekvenciái, illetve a PCR reakciók körülményei.
4.
Táblázat. A Western blot során használt specifikus antitestek, azok gyártói és alkalmazott higításaik.
98
9. ÖSSZEFOGLALÁS Bevezetés: Az asztma bronchiale reverzibilis, obstruktív jellegű ventillációs zavarral, légúti gyulladással, nyálkahártya duzzanattal, és bronchiális hiperreaktivitással járó komplex krónikus tüdőbetegség, melynek molekuláris mechanizmusa még korántsem tisztázott. Az elmúlt években előtérbe kerültek a cukorkötő molekulák, többek között a galektinek (Gal), melyek szerepét az adaptív és a természetes immunválasz kapcsán egyaránt leírták, azonban allergiás asztmában betöltött funkciójukkal kapcsolatos ismereteink meglehetősen hiányosak. Célkitűzés: Munkánk során célul tűztük ki a Gal molekulacsaládba tartozó Gal-1, Gal3,
Gal-9,
valamint
az
angiogenezisben
és
újabb
eredmények
szerint
a
tüdőremodelingben is kulcsfontosságú vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) szerepének vizsgálatát az allergiás asztma állatmodelljében. Mivel az asztma egyik központi mediátorának tartott molekulája a hisztamin, vizsgálataink jelentős részét hisztamin hiányos, hisztidin-dekarboxiláz génkiütött (HDC-/-) egereken is elvégeztük. Továbbá vizsgáltuk a gyulladáscsökkentőként alkalmazott szteroid (dexametazon, DEX) kezelés hatását az eozinofil kemoattraktánsként leírt Gal-9 expressziójára. Eredmények: Asztmásítás hatására a Gal-1,-3,-9 és a VEGF fehérje mennyisége egyaránt megnőtt a tűdőben. Az immunhisztokémiai analízis alapján a fokozott Gal-1 produkcióért elsősorban az alveoláris makrofágok és limfociták felelősek, melyek Gal-1 termelése hisztamin hiányos állatokban tovább fokozódik. Alveoláris makrofág sejtvonalon végzett in vitro kísérleteink szerint a hisztamin a Gal-1 szintet csökkenti. A Gal-3-at a bronchoalveoláris folyadék (BAL) valamennyi immunsejtjében kimutattuk, az újonnan bevándorolt eozinofil és neutrofil granulocitáknak pedig mintegy 80-90%-a Gal-3 pozitív volt. A hisztamin hiányos és endogén hisztaminnal rendelkező állatok tüdejében mért Gal-3 fehérje szintjében nem volt különbség. A tüdőben tapasztalt megnövekedett Gal-9 mennyiségért elsősorban a BAL limfociták, az eozinofil és neutrofil granulociták valamint az alveoláris epitél sejtek felelősek. A DEX kezelés a Gal-9 mennyiségét csökkentette. Asztmásítást követően fokozott VEGF produkciót mutattunk ki
a BAL alveoláris makrofágjaiban,
limfocitáiban
és
eozinofil
granulocitáiban. A hisztamin hiánya azonban nem okozott változást sem a VEGF
99
mRNS expresszióban, sem a fehérje mennyiségében. Következtetések: A Gal-1,-3,-9 és VEGF fehérje mennyiségének növekedése a tüdőben arra utal, hogy valamennyien szerepet játszanak az asztma patogenezisében. Eredményeinket összevetve az irodalmi adatokkal feltételezzük, hogy a Gal-1 és a hisztamin egymás ellentétes hatású regulátorai lehetnek. Kimutattuk, hogy a hisztaminnak a Gal-3 produkcióra nincs direkt hatása. Mivel a DEX csökkenti az eozinofil kemoattraktáns hatású Gal-9 mennyiségét, feltételezzük, hogy a DEX ily módon is mérsékelheti az eozinofilek tüdőbe vándorlását, ezáltal a gyulladást. VEGFvel kapcsolatos vizsgálataink alapján feltételezzük, hogy az asztmához vezető folyamatok között léteznie kell egy hisztamin független útnak is. Ez részben magyarázatul szolgálhatna arra is, hogy bizonyos esetekben az asztma kezelésére alkalmazott anti-hisztamin készítmények miért bizonyulhatnak hatástalannak. Ezért a VEGF, mint a tüdő remodelling egyik lehetséges mediátora, a jövőbeni kutatások egyik célpontja lehet.
100
10. SUMMARY
Background: Asthma bronchiale is a complex chronic lung disease characterized by a reversible obstructive ventillatory disturbance, airway inflammation, mucosal enlargement and bronchial hyperreactivity, which molecular mechanisms are not clear. Recently sugar-binding molecules, such as galectins (Gal), came into the focus, which role were described during the adaptive and innate immune responses as well, but their function in allergic asthma is not fully understood. Aim: Using an animal model of asthma our aim was to examine the role of some members of the Gal family, namely Gal-1, Gal-3, Gal-9, and the involvement of vascular endothelial growth factor (VEGF), which is key molecule of angiogenesis and as newly described also of lung remodeling. Since histamine is known as a central mediator of asthma, we also used histidine-decarboxylase gene knock out (HDC-/-) mice during our experiments. Furthermore we analyzed the effect of a steroid (dexamethasone, DEX) – often used as anti-inflammatory drug - on Gal-9 expression, which may have eosinophil chemoattractant potential. Results: The protein level of Gal-1,-3,-9 and VEGF was elevated in the asthmatic lung. Using immunohistochemical analysis we found, that alveolar macrophages and lymphocytes are the major source of Gal-1, and their Gal-1 production is enhanced if histamine lacks. Our in vitro experiments on alveolar macrophage cell line show, that histamine can reduce the level of Gal-1. Gal-3 could be detected in all immune cells of the bronchoalveolar lavage (BAL), and 80-90% of the newly immigrated eosinophil and neutrophil granulocytes were Gal-3 positive. There were no differences in the lung Gal3 protein level of histamine deficient and endogen histamine containing animals. We found that the major sources of Gal-9 in the lung are the BAL lymphocytes, eosinophil and neutrophil granulocytes and alveolar epithelial cells. DEX treatment reduced the level of Gal-9. We found elevated VEGF production in the alveolar macrophages, lymphocytes and eosinophil granulocytes of the BAL after OVA sensitization and challenge. The lack of histamine did not alter the VEGF mRNA expression and protein level. Conclusions: Elevation of Gal-1,-3,-9 and VEGF protein level in the lung suggest that all molecules take part in the pathogenesis of asthma. Based on our results in
101
accordance with data in the literature we hypothesize that Gal-1 and histamine are regulators of each other. We found that histamine has no direct effect on Gal-3 production. Since DEX treatment reduced the amount of eosinophil chemoattractant protein Gal-9, we hypothetise, that DEX may reduce the immigration of eosinophils into the lung also in this manner and diminish the inflammation. Based on our results from VEGF experiments we suggest that there might be a histamine independent pathway which also leads to asthma. Our observations would partially explain, why in some cases anti-histamine drugs are inefficient. Therefore VEGF, as a potential mediator of lung remodeling could be a target of researches in the future.
102
11. IRODALOMJEGYZÉK
1.
Dunphy JL, Barcham GJ, Bischof RJ, Young AR, Nash A, Meeusen EN. Isolation and characterization of a novel eosinophil-specific galectin released into the lungs in response to allergen challenge. J Biol Chem 2002; 277: 14916–14924.
2.
Breuilh L, Vanhoutte F, Fontaine J, van Stijn CM, Tillie-Leblond I, Capron M, Faveeuw C, Jouault T, van Die I, Gosset P, Trottein F. Galectin-3 modulates immune and inflammatory responses during helminthic infection: impact of galectin-3 deficiency on the functions of dendritic cells. Infect Immun 2007; 75: 5148–5157.
3.
Bernardes ES, Silva NM, Ruas LP, Mineo JR, Loyola AM, Hsu DK, Liu FT, Chammas R, Roque-Barreira MC. Toxoplasma gondii infection reveals a novel regulatory role for galectin- 3 in the interface of innate and adaptive immunity. Am J Pathol 2006; 168: 1910–1920.
4.
Gergely J, Erdei A. Immunbiológia. Medicina Könyvkiadó Rt. Budapest, 1998
5.
Kay A B. Allergy and allergic disease (First of two part). N Eng J Med. 2001; 344: 30-37
6.
Busse WW, Lemanske RF Jr. Expert Panel Report 3: Moving forward to improve asthma care. J Allergy Clin Immunol. 2007; 120: 1012-4.
7.
McFadden ER Jr, Gilbert IA. Asthma. N Engl J Med. 1992; 327: 1928-37.
8.
Beasley R, Roche WR, Roberts JA, Holgate ST. Cellular events in the bronchi in mild asthma and after bronchial provocation. Am Rev Respir Dis. 1989; 139: 80617.
9.
Robinson DS, Hamid Q, Ying S, Tsicopoulos A, Barkans J, Bentley AM, Corrigan C, Durham SR, Kay AB. Predominant Th2-like bronchoalveolar T-lymphocyte population in atopic asthma. N Engl J Med 1992; 326: 298-304.
10. Robinson DS. The role of the mast cell in asthma: induction of airway hyperresponsiveness by interaction with smooth muscle? J Allergy Clin Immunol. 2004; 114: 58-65. 11. Cohn L, Elias JA, Chupp GL. Asthma: mechanisms of disease persistence and progression. Annu Rev Immunol. 2004; 22: 789-815.
103
12. Kay AB, Barata L, Meng Q, Durham SR, Ying S. Eosinophils and eosinophilassociated cytokines in allergic inflammation. Int Arch Allergy Immunol. 1997; 113: 196-9. 13. Bischof RJ, Meeusen EN. Cellular kinetics of an allergic-type response in a sheep mammary gland model of inflammation. Clin Exp Allergy. 2002; 32: 619-26. 14. Maggi E, Parronchi P, Manetti R, Simonelli C, Piccini MP, Rugiu FS, de Carli M, Romanagni S. Reciprocal regulatory effects of IFN-γ and IL-4 on the in vitro development of human Th1 and Th2 clones. J Immunol 1992; 148: 2142-2147. 15. Burney P, Chinn S, Jarvis D, Luczynska C, Lai E. Variations in the prevalence of respiratory symptoms, self-reported asthma attacks, and use of asthma medication in the European Community Respiratory Health Survey (ECRHS). Eur Respir J 1996; 9: 687-95. 16. Asher MI. Worldwide variations in the prevalence of asthma symptoms: the International Study of Asthma and Allergies in Childhood (ISAAC). Eur Respir J 1998; 12:315-35. 17. European Lung White Book, published by the European Respiratory Society (ERS) and the European Lung Foundation (ELF), 2003 18. Szalai C. Az atópiás légúti betegségek genomikai háttere. In: Herjavecz I, ed. Légúti allergológia. Budapest: Melania, 2004: 17-35. 19. Lau S, Illi S, Sommerfeld C, Niggemann B, Bergmann R, von Mutius E, Wahn U. Early exposure to house-dust mite and cat allergens and development of childhood asthma: a cohort study. Multicentre Allergy Study Group. Lancet 2000; 356: 1392-7. 20. Cullinan P, MacNeill SJ, Harris JM, Moffat S, White C, Mills P, Newman Taylor AJ. Early allergen exposure, skin prick responses, and atopic wheeze at age 5 in English children: a cohort study. Thorax 2004; 59:855-61. 21. Peden DB. The epidemiology and genetics of asthma risk associated with air pollution. J Allergy Clin Immunol 2005; 115: 213-9. 22. Ellwood P, Asher MI, Bjorksten B, Burr M, Pearce N, Robertson CF. Diet and asthma, allergic rhinoconjunctivitis and atopic eczema symptom prevalence: an ecological analysis of the International Study of Asthma and Allergies in
104
Childhood (ISAAC) data. ISAAC Phase One Study Group. Eur Respir J 2001; 17: 436-43. 23. Bjorksten B. Effects of intestinal microflora and the environment on the development of asthma and allergy. Springer Semin Immunopathol 2004; 25: 25770 24. Schaub B, Lauener R, von Mutius E. The many faces of the hygiene hypothesis. J Allergy Clin Immunol. 2006; 117(5):969-77; 25. Martinez FD, Holt PG. Role of microbial burden in aetiology of allergy and asthma, Lancet 1999; 354(2): II12–II15. 26. Björkstén B. The hygiene hypothesis: do we still believe in it? Nestle Nutr Workshop Ser Pediatr Program. 2009; 64: 11-8; discussion 18-22, 251-7 27. Schwarze E, Hamelmann KL, Bradley K, Takeda EW, Gelfand. Respiratory syncytial virus infection results in airway hyperresponsiveness and enhanced airway sensitization to allergen, J Clin Invest 1997; 100: 226–233. 28. Dunnill M S. The pathology of asthma, with special reference to changes in the bronchial mucosa. J Clin Pathol. 1960; 13: 27-33 29. Wills
-Karp
M.
Immunologic
basis
of
antigen-induced
airway
hyperresponsiveness. Annu Rev Immunol. 1999; 17: 255-81 30. Bousquet J, Jeffery PK, Busse WW, Johnson M, Vignola AM. Asthma: from bronchoconstriction to airways inflammation and remodeling. Am J Respir Crit Care Med. 2000; 161: 1720-45 31. Drazen JM, Arm JP, Austen KF. Sorting out the cytokine of asthma. J Exp Med. 1996; 183: 1-5 32. Barnes PJ. Cytokines as mediators of chronic asthma. Am J Respir Crit Care Med 1994; 150: S42-S49 33. Crimi E, Spanevello A, Neri M, Ind PW, Rossi GA, Brusasco V. Dissociation between airway inflammation and airway hyperresponsiveness in allergic asthma. Am J Respir Crit Care Med 1998; 157: 4-9. 34. Holgate ST, Davies DE, Powell RM, Howarth PH, Haitchi HM, Holloway JW. Local genetic and environmental factors in asthma disease pathogenesis: chronicity and persistence mechanisms. Eur Respir J 2007; 29: 793-803.
105
35. Bradley BL, Azzawi M, Jacobson M, Assoufi B, Collins JV, Irani AM, Schwartz LB, Durham SR, Jeffery PK, Kay AB. Eosinophils, T-lymphocytes, mast cells, neutrophils, and macrophages in bronchial biopsy specimens from atopic subjects with asthma: comparison with biopsy specimens from atopic subjects without asthma
and
normal
control
subjects
and
relationship
to
bronchial
hyperresponsiveness. J Allergy Clin Immunol. 1991; 88: 661-74 36. Broide DH, Gleich GJ, Cuomo AJ, Coburn DA, Federman EC, Schwartz LB, Wasserman S I. Evidence of ongoing mast cell and eosinophil degranulation in symptomatic asthma airway. J Allergy Clin Immunol. 1991; 88: 637-648 37. Humbert M, Menz G, Ying S, Corrigan CJ, Robinson DS, Durham SR, Kay AB. The immunopathology of extrinsic (atopic) and intrinsic (non-atopic) asthma: more similarities than differences. Immunol Today 1999; 20: 528-33. 38. Burrows B, Martinez FD, Halomen M, Barbee RA, Cline MG. Association of asthma with serum IgE levels and skin-test reactivity to allergens. N Eng J Med. 1989; 320: 271-77 39. Finotto S, Neurath MF, Glickman JN, Qin SX, Lehr HA, Green FHY, Ackerman K, Haley K, Gatte PR, Szabo SJ, Drazen JM, de Sanctis GT, Glimcher LH. Development of spontaneous airway changes consistent with human asthma in mice lacking T-bet. Science 2002; 295: 336-8. 40. Brightling CE, Bradding P, Symon FA, Holgate ST, Wardlaw AJ, Pavord ID. Mast-cell infiltration of airway smooth muscle in asthma. N Engl J Med 2002; 346: 1699-705. 41. Yang W, Kaur D, Okayama Y, Ito A, Wardlaw AJ, Brightling CE, Bradding P. Human lung mast cells adhere to human airway smooth muscle, in part, via tumor suppressor in lung cancer-1. J Immunol 2006; 176: 1238-43. 42. Bradding P, Walls AF, Holgate ST. The role of the mast cell in the pathophysiology of asthma. J Allergy Clin Immunol 2006; 117: 1277-84. 43. Geha RS. Regulation of IgE synthesis in humans. J Allergy Clin Immunol. 1992; 90: 143-50 44. Tang C, Ward C, Reid D, Bish R, O'byrne PM, Walters EH. Normally suppressing CD40 coregulatory signals delivered by airway macrophages to Th2 lymphocytes
106
are defective in patients with atopic asthma. J Allergy Clin Immunol 2001; 107: 863-70. 45. Barnes PJ. Pathophysiology of asthma. Eur Respir Mon 2003; 23: 84-113. 46. Robinson DS, Kay AB, Wardlaw AJ. Eosinophils. Clin Allergy Immunol 2002; 16: 43-75. 47. Wardlaw AJ. Molecular basis for selective eosinophil trafficking in asthma: A multistep paradigm. J Allergy Clin Immunol 1999; 104: 917-26. 48. Blease K, Lukacs NW, Hogaboam CM, Kunkel SL. Chemokines and their role in airway hyper-reactivity. Respir Res 2000; 1: 54-61. 49. Jatakanon A, Uasuf C, Maziak W, Lim S, Chung KF, Barnes PJ. Neutrophilic inflammation in severe persistent asthma. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160:1532-9. 50. Gibson PG, Simpson JL, Saltos N. Heterogeneity of airway inflammation in persistent asthma: evidence of neutrophilic inflammation and increased sputum interleukin-8. Chest 2001; 119:1 329-36. 51. Huang SK, Xiao HQ, Kleinetebbe J, Paciotti G, Marsh DG, Lichtenstein LM, Liu MC. Il-13 Expression at the Sites of Allergen Challenge in Patients with Asthma. Journal of Immunology 1995; 155: 2688-94. 52. Spiteri MA, Knight RA, Jeremy JY, Barnes PJ, Chung KF. Alveolar macrophageinduced suppression of peripheral blood mononuclear cell responsiveness is reversed by in vitro allergen exposure in bronchial asthma. Eur Respir J 1994; 7: 1431-8. 53. Yukawa T, Read RC, Kroegel C, Rutman A, Chung KF, Wilson R, Cole PJ, Barnes PJ. The effects of activated eosinophils and neutrophils on guinea pig airway epithelium in vitro. Am J Respir Cell Mol Biol 1990; 2: 341-53. 54. Wills -Karp M, Luyimbazi J, Xu X, Schofield B, Neben TY, Karp CL, Donaldson DD. Interleukin-13: central mediator of allergic asthma. Science. 1998; 282: 225861 55. Hill SJ, Ganellin CR, Timmerman H, Schwartz JC, Shankley NP, Young JM, Schunack W, Levi R, Haas HL. International Union of Pharmacology. XIII. Classification of histamine receptors. Pharmacol. Rev. 1997; 49: 253-278.
107
56. Togias A. H1-receptors: localization and role in airway physiology and in immune functions. J. Allergy Clin. Immunol. 2003; 112: S60-68. 57. Simons FE. H1-Antihistamines: more relevant than ever in the treatment of allergic disorders. J. Allergy Clin. Immunol. 2003; 112: S42-52. 58. Pattichis K, Louca LL. Histamine, histamine H2-receptor antagonists, gastric acid secretion and ulcers: an overview. Drug Metabol. Drug Interact. 1995; 12: 1-36. 59. Idzko M, la Sala A, Ferrari D, Panther E, Herouy Y, Dichmann S, Mockenhaupt M, Di Virgilio F, Girolomoni G, Norgauer J. Expression and function of histamine receptors in human monocyte-derived dendritic cells. J. Allergy Clin. Immunol. 2002; 109: 839-846. 60. Jutel M, Watanabe T, Klunker S, Akdis M, Thomet OA, Malolepszy J, ZakNejmark T, Koga R, Kobayashi T, Blaser K, Akdis CA. Histamine regulates Tcell and antibody responses by differential expression of H1 and H2 receptors. Nature. 2001; 413: 420-425. 61. Jutel M, Watanabe T, Klunker S, Akdis M, Thomet OA, Malolepszy J, ZakNejmark T, Koga R, Kobayashi T, Blaser K, Akdis CA. Histamine regulates Tcell and antibody responses by differential expression of H1 and H2 receptors. Nature. 2001; 413: 420-425. 62. Gomez-Ramirez J, Ortiz J, Blanco I. Presynaptic H3 autoreceptors modulate histamine synthesis through cAMP pathway. Mol. Pharmacol. 2002; 61: 239-245. 63. Leurs R, Blandina P, Tedford C, Timmerman H. Therapeutic potential of histamine H3 receptor agonists and antagonists. Trends Pharmacol. Sci. 1998; 19: 177-183. 64. Toyota H, Dugovic C, Koehl M, Laposky AD, Weber C, Ngo K, Wu Y, Lee DH, Yanai K, Sakurai E, Watanabe T, Liu C, Chen J, Barbier AJ, Turek FW, FungLeung WP, Lovenberg TW. Behavioral characterization of mice lacking histamine H(3) receptors. Mol. Pharmacol. 2002; 62: 389-397. 65. Coge F, Guenin SP, Rique H, Boutin JA, Galizzi JP. Structure and expression of the human histamine H4-receptor gene. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001; 284: 301-309. 66. O'Reilly M, Alpert R, Jenkinson S, Gladue RP, Foo S, Trim S, Peter B, Trevethick M, Fidock M. Identification of a histamine H4 receptor on human eosinophils--
108
role in eosinophil chemotaxis. J. Recept. Signal. Transduct. Res. 2002; 22: 431448. 67. Nissinen
MJ,
Panula
P.
Developmental
patterns
of
histamine-like
immunoreactivity in the mouse. J. Histochem. Cytochem. 1995; 43: 211-227. 68. Watanabe,T, Ohtsu,H. L-histidine decarboxylase as a probe in studies on histamine. Chem. Rec. 2002; 2: 369-376 69. Ohtsu H, Tanaka S, Terui T, Hori Y, Makabe-Kobayashi Y, Pejler G, Tchougounova E, Hellman L, Gertsenstein M, Hirasawa N, Sakurai E, Buzás E, Kovács P, Csaba G, Kittel A, Okada M, Hara M, Mar L, Numayama-Tsuruta K, Ishigaki-Suzuki S, Ohuchi K, Ichikawa A, Falus A, Watanabe T, Nagy A. Mice lacking histidine decarboxylase exhibit abnormal mast cells. FEBS Lett. 2001; 502: 53-56. 70. Zahnow CA, Yi HF, McBride OW, Joseph DR. Cloning of the cDNA encoding human histidine decarboxylase from an erythroleukemia cell line and mapping of the gene locus to chromosome 15. DNA Seq. 1991; 1: 395-400. 71. Malzac P, Mattei MG, Thibault J, Bruneau G. Chromosomal localization of the human and mouse histidine decarboxylase genes by in situ hybridization. Exclusion of the HDC gene from the Prader-Willi syndrome region. Hum. Genet. 1996; 97: 359-361. 72. Suzuki-Ishigaki S, Numayama-Tsuruta K, Kuramasu A, Sakurai E, Makabe Y, Shimura S, Shirato K, Igarashi K, Watanabe T, Ohtsu H. The mouse L-histidine decarboxylase gene: structure and transcriptional regulation by CpG methylation in the promoter region. Nucleic Acids Res. 2000; 28: 2627-2633. 73. Khai P L, David P. Understanding the pathogenesis of allergic asthma using mouse models. Ann Allergy Asthma Immunol. 2001; 87: 96-110 74. Cieslewicz G, Tomkinson A, Adler A, Duez C, Schwarze J, Takeda K, Larson K A, Lee J J, Irvin C G, Gelfand E W. The late, but not early, asthmatic response is dependent on IL-5 and correlates with eosinophil infiltration. J Clin Invest. 1999; 104: 301-08 75. Stelts D, Egan R W, Falcone A, Garlisi C G, Gleich G J, Kreutner W, Kung T T, Nahrebne D K, Chapman R W, Minnicozzi M. Eosinophils retain their granule
109
major basic protein in a murine model of allergic pulmonary inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 1998; 18: 463-70 76. Dreborg S. Mite allergens. Collection, determination, expression of results, and risk levels for sensitization and symptom induction. Allergy. 1998; 53(48): 88-91. 77. Kucharewicz I, Bodzenta-Łukaszyk A, Buczko W. Experimental asthma in rats. Pharmacol Rep. 2008; 60(6): 783-8. 78. Patric G H, Alison H R, Janet E B, Keven J T. Induction of adjuvant independent IgE responses in inbred mice: primary, secundary, and persistent IgE responses to ovalbumin and ovomucoid. Int. Archs Allergy Appl Immun. 1981; 65: 42-50 79. Bomford R. The comparative selectivity of adjuvants for humoral cell-mediated immunity. Clin Exp Immunol. 1980; 39: 426-34 80. Jonathan M S, Emiko M, Joanne P B, Thomas R M, Atul K B, Raif S G. Epicutaneous sensitization with protein antigen induces localized allergic dermatitis and hyperresponsiveness to methacholine after single exposure to aerosolized antigen in mice. J. Clin Invest. 1998; 101: 1614-22 81. Denis P S, Jean S M, Mary H P, Hong L. Production of IgE antibody and allergic sensitization of intestinal and peripheral tissues after oral immunization with protein Ag and cholera toxin. The Journal of Immunology. 1994; 153: 647-57 82. Brewer J P, Kisselgof A B, Martin T R.Genetic variability in pulmonary physiological, cellular, and antibody responses to antigen in mice. Am J Respir Crit Care Med. 1999; 160: 1150-56 83. Kung TT, Jones H, Adams GK 3rd, Umland SP, Kreutner W, Egan RW, Chapman RW, Watnick AS. Characterization of a murine model of allergic pulmonary inflammation. Int Arch Allergy Immunol. 1994; 105: 83-90 84. Tomkinson A, Cieslewicz G, Duez C, Larson K A, Lee J J, Gelfand E W. Temporal
association
between
airway
hyperresponsiveness
and
airway
eosinophilia in ovalbumin-sensitized mice. Am J Respir Crit Care Med. 2001; 163: 721-30 85. Barondes SH, Castronovo V, Cooper DN, Cummings RD, Drickamer K, Feizi T, Gitt MA, Hirabayashi J, Hughes C, Kasai K, eLeffler H, Liu F-T, Lotan R, Mercurio AM, Monsigny M, Pillai S, Poirer F, Raz A, Rigby PWJ, Rini JM,
110
Wang JL. Galectins: a family of animal beta-galactoside-binding lectins. Cell. 1994; 76(4): 597-8. 86. Houzelstein D, Gonçalves IR, Fadden AJ, Sidhu SS, Cooper DN, Drickamer K, Leffler H, Poirier F. Phylogenetic analysis of the vertebrate galectin family. Mol Biol Evol. 2004; 21(7): 1177-87. 87. Barondes SH, Cooper DN, Gitt MA, Leffler H. Galectins. Structure and function of a large family of animal lectins. J Biol Chem. 1994; 269(33):20807-10. 88. Brewer CF, Miceli MC, Baum LG. Clusters, bundles, arrays and lattices: novel mechanisms for lectin-saccharide-mediated cellular interactions. Curr Opin Struct Biol. 2002; 12(5): 616-23. 89. Ahmad N, Gabius HJ, André S, Kaltner H, Sabesan S, Roy R, Liu B, Macaluso F, Brewer CF. Galectin-3 precipitates as a pentamer with synthetic multivalent carbohydrates and forms heterogeneous cross-linked complexes. J Biol Chem. 2004; 279(12): 10841-7. 90. Liu FT. Regulatory roles of galectins in the immune response. Int Arch Allergy Immunol. 2005; 136(4):385-400. 91. Hughes RC. Galectins as modulators of cell adhesion. Biochimie. 2001; 83(7):667-76. 92. Elola MT, Chiesa ME, Alberti AF, Mordoh J, Fink NE. Galectin-1 receptors in different cell types. J. Biomed. Sci. 2005; 12: 13 – 29. 93. Nakahara S, Oka N, Raz A. On the role of galectin-3 in cancer apoptosis. Apoptosis 2005; 10: 267 – 275. 94. Yang RY, Rabinovich GA, Liu FT. Galectins: structure, function and therapeutic potential. Expert Rev Mol Med. 2008; 10: e17. 95. Hughes RC. Secretion of the galectin family of mammalian carbohydrate-binding proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1999; 1473: 172-185. 96. Nickel W. Unconventional secretory routes: direct protein export across the plasma membrane of mammalian cells. Traffic. 2005; 6: 607-614. 97. Cooper DN, Barondes SH. God must love galectins; he made so many of them. Glycobiology. 1999; 9(10): 979-84. 98. Vyakarnam A, Dagher SF, Wang JL, Patterson RJ. Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing. Mol Cell Biol. 1997; 17(8):4730-7.
111
99. Wang JL, Gray RM, Haudek KC, Patterson RJ. Nucleocytoplasmic lectins. Biochim Biophys Acta. 2004; 1673(1-2):75-93. 100. Laing, JG, Wang JL. Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex. Biochemistry 1988; 27: 5329– 5334. 101. Moutsatsos, IK, Davis JM, Wang JL. Endogenous lectins from cultured cells: subcellular localization of carbohydrate-binding protein 35 in 3T3 fibroblasts. J. Cell Biol. 1986; 102: 477–487. 102. Ho MK, Springer TA. Mac-2, a novel 32,000 Mr mouse macrophage subpopulation-specific antigen defined by monoclonal antibodies. J. Immunol. 1982; 128: 1221–1228. 103. Elola MT, Wolfenstein-Todel C, Troncoso MF, Vasta GR, Rabinovich GA. Galectins: matricellular glycan-binding proteins linking cell adhesion, migration, and survival. Cell Mol Life Sci. 2007; 64(13): 1679-700. 104. Norling LV, Perretti M, Cooper D. Endogenous galectins and the control of the host inflammatory response. J Endocrinol. 2009; 201(2):169-84.. 105. Liu FT, Patterson RJ, Wang JL. Intracellular functions of galectins. Biochim Biophys Acta. 2002; 1572(2-3):263-73. 106. Baum LG, Pang M, Perillo NL, Wu T, Delegeane A, Uittenbogaart CH, Fukuda M, Seilhamer JJ. Human thymic epithelial cells express an endogenous lectin, galectin-1, which binds to core 2 O-glycans on thymocytes and T lymphoblastoid cells. J Exp Med 1995; 181: 877-887. 107. Hynes MA, Gitt M, Barondes SH, Jessell TM, Buck LB. Selective expression of an endogenous lactose-binding lectin gene in subsets of central and peripheral neurons. J Neurosci 1990; 10: 1004-1013. 108. Rabinovich GA, Iglesias MM, Modesti NM, Castagna LF, Wolfenstein-Todel C, Riera CM, Sotomayor CE. Activated rat macrophages produce a galectin-1-like protein that induces apoptosis of T cells: biochemical and functional characterization. J Immunol 1998; 160: 4831-4840. 109. Blaser C, Kaufmann M, Muller C, Zimmermann C, Wells V, Mallucci L, Pircher H. Beta-galactoside-binding protein secreted by activated T cells inhibits antigeninduced proliferation of T cells. Eur J Immunol. 1998; 28: 2311-2319.
112
110. Zuniga E, Rabinovich GA, Iglesias MM, Gruppi A. Regulated expression of galectin-1 during B-cell activation and implications for T-cell apoptosis. J Leukoc Biol. 2001; 70: 73-79. 111. Perillo NL, Pace KE, Seilhamer JJ, Baum LG. Apoptosis of T cells mediated by galectin-1. Nature. 1995; 378: 736-739. 112. Rabinovich GA, Daly G, Dreja H, Tailor H, Riera CM, Hirabayashi J, Chernajovsky Y. Recombinant galectin-1 and its genetic delivery suppress collagen-induced arthritis via T cell apoptosis. J Exp Med. 1999; 190: 385-398. 113. Rabinovich GA, Ariel A, Hershkoviz R, Hirabayashi J, Kasai KI, Lider O. Specific inhibition of T-cell adhesion to extracellular matrix and proinflammatory cytokine secretion by human recombinant galectin-1. Immunology. 1999; 97: 100106. 114. Offner H, Celnik B, Bringman TS, Casentini-Borocz D, Nedwin GE, Vandenbark AA. Recombinant human beta-galactoside binding lectin suppresses clinical and histological
signs
of
experimental
autoimmune
encephalomyelitis.
J
Neuroimmunol. 1990; 28: 177-184. 115. Zuberi RI, Hsu DK, Kalayci O, Chen HY, Sheldon HK, Yu L, Apgar JR, Kawakami T, Lilly CM, Liu FT. Critical role for galectin-3 in airway inflammation and bronchial hyperresponsiveness in a murine model of asthma. Am J Pathol. 2004; 165(6):2045-53. 116. del Pozo V,Rojo M,Rubio ML,Cortegano I,Cardaba B,Gallardo S, Ortega M,Civantos
E,
Lopez
E,
Martin-Mosquero
C,Peces-Barba
G,Palomino
P,Gonzalez-Mangado N, Lahoz C. Gene therapy with galectin-3 inhibits bronchial obstruction and inflammation in antigen-challenged rats through interleukin-5 gene downregulation. Am J Respir Crit Care Med. 2002; 166(5):732-7. 117. Lopez E, del Pozo V, Miguel T, Sastre B, Seoane C, Civantos E, Llanes E, Baeza ML, Palomino P, Cardaba B, Gallardo S, Manzarbeitia F, Zubeldia JM, Lahoz C. Inhibition of chronic airway inflammation and remodeling by galectin-3 gene therapy in a murine model. J Immunol. 2006; 176(3):1943-50. 118. Yang, R. Y., and F. T. Liu. Galectins in cell growth and apoptosis. Cell Mol. Life Sci. 2003; 60: 267-276
113
119. Kim, H. R., H. M. Lin, H. Biliran, and A. Raz. Cell cycle arrest and inhibition of anoikis by galectin-3 in human breast epithelial cells. Cancer Res. 1999; 59(16):4148-54. 120. Hsu DK, Chen HY, Liu FT. Galectin-3 regulates T-cell functions. Immunol Rev. 2009; 230(1):114-27. 121. Yang RY, Hsu DK, Liu FT. Expression of galectin-3 modulates T cell growth and apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 6737–6742. 122. Openo, K. P., M. M. Kadrofske, R. J. Patterson, and J. L. Wang. Galectin-3 expression and subcellular localization in senescent human fibroblasts. Exp. Cell Res. 2000; 255: 278-290. 123. Galectin-3 in apoptosis, a novel therapeutic target. Nangia-Makker P, Nakahara S, Hogan V, Raz A. J Bioenerg Biomembr. 2007; 39(1):79-84. 124. Matarrese P, Fusco O, Tinari N, Natoli C, Liu FT, Semeraro ML, Malorni W, Iacobelli S. Int J Cancer. 2000; 85(4): 545–554 125. Ochieng J, Leite-Browning ML, Warfield P. Biochem Biophys Res Commun. 1998; 246(3):788–791 126. Saegusa J, Hsu DK, Chen HY, Yu L, Fermin A, Fung MA, Liu FT. Galectin-3 is critical for the development of the allergic inflammatory response in a mouse model of atopic dermatitis. Am J Pathol 2009; 174: 922–931. 127. Cortegano I, del Pozo V, Cárdaba B, de Andrés B, Gallardo S, del Amo A, Arrieta I, Jurado A, Palomino P, Liu FT, Lahoz C. Galectin-3 down-regulates IL-5 gene expression on different cell types. J Immunol 1998; 161: 385–389. 128. Cortegano I, Pozo V, Cárdaba B, Arrieta I, Gallardo S, Rojo M, Aceituno E, Takai T, Verbeek S, Palomino P, Liu FT, Lahoz C. Interaction between galectin-3 and FcgammaRII induces downregulation of IL-5 gene: implication of the promoter sequence IL-5REIII. Glycobiology 2000; 10: 237–242. 129. Dumic J, Dabelic S, Flögel M. Galectin-3: an open-ended story. Biochim Biophys Acta. 2006; 1760(4):616-35. 130. M. Kasper, R.C. Hughes, Immunocytochemical evidence for a modulation of galectin 3 (Mac-2), a carbohydrate binding protein, in pulmonary fibrosis, J. Pathol. 1996; 179 : 309–316.
114
131. Truong MJ, Gruart V, Kusnierz JP, Papin JP, Loiseau S, Capron A, Capron M. Human neutrophils express immunoglobulin E (IgE)-binding proteins (Mac2/epsilon BP) of the S-type lectin family: role in IgEdependent activation. J Exp Med. 1993; 177(1):243-8. 132. Truong MJ, Gruart V, Liu FT, Prin L, Capron A, Capron M. IgEbinding molecules (Mac 2/epsilon BP) expressed by human eosinophils. Implication in IgE-dependent eosinophil cytotoxicity, Eur J Immunol. 1993; 23(12):3230-5. 133. Craig SS, Krishnaswamy P, Irani AM, Kepley CL, Liu FT, Schwartz LB. Immunoelectron microscopic localization of galectin-3, an IgE binding protein, in human mast cells and basophils. Anat Rec. 1995; 242(2):211-9. 134. Dietz AB, Bulur PA, Knutson GJ, Matasić R, Vuk-Pavlović S. Maturation of human monocyte-derived dendritic cells studied by microarray hybridization, Biochem Biophys Res Commun. 2000; 275(3):731-8. 135. Türeci O, Schmitt H, Fadle N, Pfreundschuh M, Sahin U. Molecular definition of a novel human galectin which is immunogenic in patients with Hodgkin's disease. J Biol Chem. 1997; 272: 6416-22. 136. Wada J, Kanwar YS. Identification and characterization of galectin-9, a novel beta-galactoside-binding mammalian lectin. J Biol Chem. 1997; 272: 6078-86. 137. Matsumoto R, Matsumoto H, Seki M, Hata M, Asano Y, Kanegasaki S, Stevens RL, Hirashima M. Human ecalectin, a variant of human galectin-9, is a novel eosinophil chemoattractant produced by T lymphocytes. J Biol Chem. 1998; 273: 16976-84. 138. Lipkowitz MS, Leal-Pinto E, Rappoport JZ, Najfeld V, Abramson RG. Functional reconstitution, membrane targeting, genomic structure, and chromosomal localization of a human urate transporter. J Clin Invest. 2001; 107: 1103-15. 139. Wada J, Ota K, Kumar A, Wallner EI, Kanwar YS. Developmental regulation, expression, and apoptotic potential of galectin-9, a beta-galactoside binding lectin. J Clin Invest. 1997; 99: 2452-61. 140. Saita N, Goto E, Yamamoto T, Cho I, Tsumori K, Kohrogi H, Maruo K, Ono T, Takeya M, Kashio Y, Nakamura K, Hirashima M. Association of galectin-9 with eosinophil apoptosis. Int Arch Allergy Immunol. 2002; 128: 42-50.
115
141. Zhu C, Anderson AC, Schubart A, Xiong H, Imitola J, Khoury SJ, Zheng XX, Strom TB, Kuchroo VK. The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates T helper type 1 immunity. Nat Immunol. 2005; 6: 1245-52. 142. Seki M, Oomizu S, Sakata KM, Sakata A, Arikawa T, Watanabe K, Ito K, Takeshita K, Niki T, Saita N, Nishi N, Yamauchi A, Katoh S, Matsukawa A, Kuchroo V, Hirashima M.Galectin-9 suppresses the generation of Th17, promotes the induction of regulatory T cells, and regulates experimental autoimmune arthritis. Clin Immunol. 2008; 127(1): 78-88. 143. Seki M, Sakata KM, Oomizu S, Arikawa T, Sakata A, Ueno M, Nobumoto A, Niki T, Saita N, Ito K, Dai SY, Katoh S, Nishi N, Tsukano M, Ishikawa K, Yamauchi A, Kuchroo V, Hirashima M. Beneficial effect of galectin 9 on rheumatoid arthritis by induction of apoptosis of synovial fibroblasts. Arthritis Rheum. 2007; 56(12):3968-76. 144. Nobumoto A, Nagahara K, Oomizu S, Katoh S, Nishi N, Takeshita K, Niki T, Tominaga A, Yamauchi A, Hirashima M. Galectin-9 suppresses tumor metastasis by blocking adhesion to endothelium and extracellular matrices. Glycobiology. 2008; 18(9): 735-44. 145. Yamamoto H, Kashio Y, Shoji H, Shinonaga R, Yoshimura T, Nishi N, Nabe T, Nakamura T, Kohno S, Hirashima M. Involvement of galectin-9 in guinea pig allergic airway inflammation. Int Arch Allergy Immunol. 2007; 143: 95-105 146. Senger DR, Galli SJ, Dvorak AM, Perruzzi CA, Harvey VS, Dvorak HF. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 1983; 219(4587):983-5. 147. Laitinen M, Zachary I, Breier G, Pakkanen T, Häkkinen T, Luoma J, Abedi H, Risau W, Soma M, Laakso M, Martin JF, Ylä-Herttuala S. VEGF gene transfer reduces intimal thickening via increased production of nitric oxide in carotid arteries. Hum Gene Ther. 1997; 8(15):1737-44. 148. Gerber HP, Dixit V, Ferrara N. Vascular endothelial growth factor induces expression of the antiapoptotic proteins Bcl-2 and A1 in vascular endothelial cells. J Biol Chem. 1998; 273(21):13313-6.
116
149. Scalia R, Booth G, Lefer DJ. Vascular endothelial growth factor attenuates leukocyte-endothelium interaction during acute endothelial dysfunction: essential role of endothelium-derived nitric oxide. FASEB J. 1999; 13(9):1039-46. 150. Murohara T, Horowitz JR, Silver M, Tsurumi Y, Chen D, Sullivan A, Isner JM. Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor enhances vascular permeability via nitric oxide and prostacyclin. Circulation. 1998; 97: 99-107. 151. Waltham M, Burnand KG, Collins M, McGuinness CL, Singh I, Smith A. Vascular endothelial growth factor enhances venous thrombus recanalisation and organisation. Thromb Haemost. 2003; 89: 169-176. 152. Noiri E, Hu Y, Bahou WF, Keese CR, Giaever I, Goligorsky MS. Permissive role of nitric oxide in endothelin-induced migration of endothelial cells. J Biol Chem. 1997; 272: 1747-1752. 153. Goligorsky MS, Abedi H, Noiri E, Takhtajan A, Lense S, Romanov V, Zachary I. Nitric oxide modulation of focal adhesions in endothelial cells. Am J Physiol. 1999; 276: C1271-C1281. 154. Ferrara N. Vascular endothelial growth factor. Eur J Cancer. 1996; 32A: 24132422. 155. Shweiki D, Itin A, Soffer D, Keshet E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. 1992; 359: 843845. 156. Walters EH, Soltani A, Reid DW, Ward C. Vascular remodelling in asthma. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2008; 8(1): 39-43. 157. Munakata M. Airway remodeling and airway smooth muscle in asthma. Allergol Int. 2006; 55(3): 235-43. 158. Siddiqui S, Martin JG. Structural aspects of airway remodeling in asthma. Curr Allergy Asthma Rep. 2008; 8(6): 540-7. 159. Kozma GT, Losonczy G, Keszei M, Komlósi Z, Buzás E, Pállinger E, Appel J, Szabó T, Magyar P, Falus A, Szalai C. Histamine deficiency in gene-targeted mice strongly reduces antigen-induced airway hyper-responsiveness, eosinophilia and allergen-specific IgE. Int Immunol. 2003; 15(8): 963-73. 160. Kumagai K, Ohno I, Imai K, Nawata J, Hayashi K, Okada S, Senoo H, Hattori T, Shirato K. The involvement of matrix metalloproteinases in basement membrane
117
injury in a murine model of acute allergic airway inflammation. Clin Exp Allergy 2002; 32: 1527-34. 161. Peebles RS, Jr., Dworski R, Collins RD, Jarzecka K, Mitchell DB, Graham BS, Sheller JR. Cyclooxygenase inhibition increases interleukin 5 and interleukin 13 production and airway hyperresponsiveness in allergic mice. Am J Respir Crit Care Med 2000; 162: 676-81. 162. Miyamoto K, Iwase M, Nyui M, Arata S, Sakai Y, Gabazza EC, Kimura H, Homma I. Histamine type 1 receptor deficiency reduces airway inflammation in a murine asthma model. Int Arch Allergy Immunol. 2006; 140(3): 215-22. 163. Bernardes ES, Silva NM, Ruas LP, Mineo JR, Loyola AM, Hsu DK, Liu FT, Chammas R, Roque-Barreira MC: Toxoplasma gondii infection reveals a novel regulatory role for galectin- 3 in the interface of innate and adaptive immunity. Am J Pathol 2006; 168: 1910–1920. 164. Epstein MM. Are mouse models of allergic asthma useful for testing novel therapeutics? Exp Toxicol Pathol. 2006; 57: 41-4. 165. Hirashima M. Ecalectin/galectin-9, a novel eosinophil chemoattractant: its function and production. Int Arch Allergy Immunol. 2000; 122: 6-9. 166. Christodoulopoulos P, Cameron L, Nakamura Y, Lemière C, Muro S, Dugas M, Boulet LP, Laviolette M, Olivenstein R, Hamid Q. TH2 cytokine-associated transcription factors in atopic and nonatopic asthma: evidence for differential signal transducer and activator of transcription 6 expression. J Allergy Clin Immunol. 2001; 107: 586-91. 167. Harjacek M, Diaz-Cano S, De Miguel M, Wolfe H, Maldonado CA, Rabinovich GA. Expression of galectins-1 and -3 correlates with defective mononuclear cell apoptosis in patients with juvenile idiopathic arthritis. J Rheumatol. 2001; 28: 1914-1922. 168. Rabinovich GA, Baum LG, Tinari N, Paganelli R, Natoli C, Liu FT, Iacobelli S. Galectins and their ligands: amplifiers, silencers or tuners of the inflammatory response? Trends Immunol. 2002; 23: 313-320. 169. Bentley AM, Menz G, Storz C, Robinson DS, Bradley B, Jeffery PK, Durham SR, Kay AB. Identification of T lymphocytes, macrophages, and activated eosinophils
118
in the bronchial mucosa in intrinsic asthma. Relationship to symptoms and bronchial responsiveness. Am Rev Respir Dis. 1992; 146: 500-506. 170. Busse WW, Lemanske RF. Asthma. N Engl J Med. 2001; 344: 350–362. 171. Galli SJ. Mast cells and basophils. Curr Opin Hematol. 2000; 7: 32-39. 172. White MV, Slater JE, Kaliner MA. Histamine and asthma. Am Rev Respir Dis. 1987; 135: 1165-1176, 173. Homey B, Zlotnik A. Chemokines in allergy. Curr Opin Immunol. 1999; 11: 626634. 174. Novelli F, Allione A, Wells V, Forni G, Mallucci L. Negative cell cycle control of human T cells by beta-galactoside binding protein (beta GBP): induction of programmed cell death in leukaemic cells. J Cell Physiol. 1999; 178: 102-108. 175. Perillo NL, Uittenbogaart CH, Nguyen JT, Baum LG. Galectin-1, an endogenous lectin produced by thymic epithelial cells, induces apoptosis of human thymocytes. J Exp Med. 1997; 185: 1851-1858. 176. Rabinovich G, Castagna L, Landa C, Riera CM, Sotomayor C. Regulated expression of a 16-kd galectin-like protein in activated rat macrophages. J Leukoc Biol. 1996; 59: 363-370. 177. Rabinovich GA, Sotomayor CE, Riera CM, Bianco I, Correa SG. Evidence of a role for galectin-1 in acute inflammation. Eur J Immunol. 2000; 30: 1331-1339. 178. Mattes J, Yang M, Mahalingam S, Kuehr J, Webb DC, Simson SP, Koskinen A, McKenzie ANJ, Dent LA, Rothenberg ME, Matthaei KI, Young GI, Foster PS. Intrinsic defect in T cell production of interleukin (IL)-13 in the absence of both IL-5 and eotaxin precludes the development of eosinophilia and airway hyperreactivity in experimental asthma. J Exp Med. 2002; 195: 1433-1444. 179. Hamelmann E, Oshiba A, Loader J, Larsen GL, Gleich G, Lee J, Gelfand EW.. Antiinterleukin-5 antibody prevents airway hyperresponsiveness in a murine model of airway sensitization. Am J Respir Crit Care Med. 1997; 155: 819-825. 180. Lohmann-Matthes
ML,
Steinmuller
C,
Franke-Ullmann
G.
Pulmonary
macrophages. Eur Respir J. 1994; 7: 1678-1689. 181. Peters-Golden M. The alveolar macrophage: the forgotten cell in asthma. Am J Respir Cell Mol Biol. 2004; 31: 3-7. 182. Nathan CF. Secretory products of macrophages. J Clin Invest. 1987; 79: 319-326.
119
183. Correa SG, Sotomayor CE, Aoki MP, Maldonado CA, Rabinovich GA. Opposite effects of galectin-1 on alternative metabolic pathways of L-arginine in resident, inflammatory, and activated macrophages. Glycobiology. 2003; 13: 119-128. 184. de Boer J, Meurs H, Flendrig L, Koopal M, Zaagsma J. Role of nitric oxide and superoxide in allergen-induced airway hyperreactivity after the late asthmatic reaction in guinea-pigs. Br J Pharmacol. 2001; 133: 1235-1242. 185. Xue J, Xu Y, Zhang Z. Effects of intrinsic nitric oxide on the expression of interleukin-4 and IFN-gamma mRNA in the bronchial and lung tissues of sensitized rats. J Tongji Med Univ. 2000; 20: 29-31. 186. Califice S, Castronovo V, Van Den Brûle F. Galectin-3 and cancer. Int J Oncol. 2004; 25(4): 983-92. 187. Nachtigal M, Ghaffar A, Mayer EP.Galectin-3 gene inactivation reduces atherosclerotic lesions and adventitial inflammation in ApoE-deficient mice. Am J Pathol. 2008; 172(1): 247-55. 188. Dancer JY, Truong LD, Zhai Q, Shen SS. Expression of Galectin-3 in renal neoplasms: a diagnostic, possible prognostic marker. Arch Pathol Lab Med. 2010; 134(1):90-4. 189. Zuberi RI, Hsu DK, Kalayci O, et al. Critical role for galectin-3 in airway inflammation and bronchial hyperresponsiveness in a murine model of asthma. Am J Pathol 2004; 165: 2045–2053. 190. Liu FT, Hsu DK, Zuberi RI, Kuwabara I, Chi EY, Henderson WR Jr. Expression and function of galectin-3, a beta galactoside-binding lectin, in human monocytes and macrophages. Am. J. Pathol. 1995; 147: 1016-1029. 191. Papaspyridonos M, McNeill E, de Bono JP, Smith A, Burnand KG, Channon KM, Greaves DR. Galectin-3 is an amplifier of inflammation in atherosclerotic plaque progression through macrophage activation and monocyte chemoattraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008; 28(3): 433-40. 192. Akahani S, Nangia-Makker P, Inohara H, Kim HR, Raz A. Galectin-3: a novel antiapoptotic molecule with a functional BH1 (NWGR) domain of Bcl-2 family. Cancer Res. 1997; 57(23): 5272-6. 193. Oka N, Nakahara S, Takenaka Y, Fukumori T, Hogan V, Kanayama HO, Yanagawa T, Raz A. Galectin-3 inhibits tumor necrosis factor-related apoptosis-
120
inducing ligand-induced apoptosis by activating Akt in human bladder carcinoma cells. Cancer Res. 2005; 65(17): 7546-53. 194. Yamaoka A, Kuwabara I, Frigeri LG, Liu FT. A human lectin, galectin-3 (epsilon bp/Mac-2), stimulates superoxide production by neutrophils. J Immunol. 1995; 154(7): 3479-87. 195. Rabinovich GA, Rubinstein N, Toscano MA. Role of galectins in inflammatory and immunomodulatory processes. Biochim Biophys Acta. 2002; 1572: 274–284. 196. Sano H, Hsu DK, Yu L, Apgar JR, Kuwabara I, Yamanaka T, Hirashima M, Liu FT. Human galectin-3 is a novel chemoattractant for monocytes and macrophages. J Immunol. 2000; 165(4): 2156-64. 197. Falus A. Histamine and inflammation. CRC Press. 1994: 99-11 198. Simon R A, Stevenson D D, Arroyave C M, Tan E M. The relationship of plasma histamine to the activity of bronchial asthma. J Allergy Clin Immunol. 1977; 60: 312-16 199. Falus A, Meretey K: Histamine: an early messenger in inflammatory and immune reactions. Immunol Today. 1992, 13: 154-156 200. Demetriou M, Granovsky M, Quaggin S, Dennis JW. Negative regulation of Tcell activation and autoimmunity by Mgat5 N-glycosylation. Nature 2001; 409: 733-779. 201. Asakura H, Kashio Y, Nakamura K, Seki M, Dai S, Shirato Y, Abedin MJ, Yoshida N, Nishi N, Imaizumi T, Saita N, Toyama Y, Takashima H, Nakamura T, Ohkawa M, Hirashima M. Selective eosinophil adhesion to fibroblast via IFNgamma-induced galectin-9. J Immunol. 2002; 169: 5912-8. 202. Katoh S, Ishii N, Nobumoto A, Takeshita K, Dai SY, Shinonaga R, Niki T, Nishi N, Tominaga A, Yamauchi A, Hirashima M. Galectin-9 inhibits CD44-hyaluronan interaction and suppresses a murine model of allergic asthma. Am J Respir Crit Care Med. 2007; 176(1): 27-35. 203. Inoue H, Fukuyama S, Matsumoto K, Kubo M, Yoshimura A. Role of endogenous inhibitors of cytokine signaling in allergic asthma. Curr Med Chem. 2007; 14: 181-9. 204. Hogan SP. Recent advances in eosinophil biology. Int Arch Allergy Immunol. 2007; 143: 3-14.
121
205. Thomas LH, Warner JA. The eosinophil and its role in asthma. Gen Pharmacol. 1996; 27: 593-7. 206. Ohashi Y, Motojima S, Fukuda T, Makino S.
Airway hyperresponsiveness,
increased intracellular spaces of bronchial epithelium, and increased infiltration of eosinophils and lymphocytes in bronchial mucosa in asthma. Am Rev Respir Dis. 1992; 145: 1469-76. 207. Weller PF. The immunobiology of eosinophils. N Engl J Med. 1991; 324: 1110-8. 208. Lee CG, Link H, Baluk P, Homer RJ, Chapoval S, Bhandari V, Kang MJ, Cohn L, Kim YK, McDonald DM, Elias JA. Vascular endothelial growth factor (VEGF) induces remodeling and enhances TH2-mediated sensitization and inflammation in the lung. Nat Med. 2004; 10(10): 1095-103. 209. Jutel M, Blaser K, Akdis CA. Histamine in allergic inflammation and immune modulation. Int Arch Allergy Immunol. 2005; 137(1): 82-92. 210. Hart PH. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunol Cell Biol. 2001; 79(2): 149-53 211. Kanazawa H, Hirata K, Yoshikawa J. Involvement of vascular endothelial growth factor in exercise induced bronchoconstriction in asthmatic patients. Thorax. 2002; 57(10): 885-8. 212. Maintz L, Novak N. Histamine and histamine intolerance. Am J Clin Nutr. 2007;85(5): 1185-96. 213. Hoshino M, Takahashi M, Aoike N. Expression of vascular endothelial growth factor, basic fibroblast growth factor, and angiogenin immunoreactivity in asthmatic airways and its relationship to angiogenesis. J Allergy Clin Immunol. 2001; 107(2): 295-301. 214. Chetta A, Zanini A, Foresi A, D'Ippolito R, Tipa A, Castagnaro A, Baraldo S, Neri M, Saetta M, Olivieri D. Vascular endothelial growth factor up-regulation and bronchial wall remodelling in asthma. Clin Exp Allergy. 2005; 35(11): 1437-42. 215. Lee KS, Kim SR, Park SJ, Min KH, Lee KY, Choe YH, Park SY, Chai OH, Zhang X, Song CH, Lee YC. Mast cells can mediate vascular permeability through regulation of the PI3K-HIF-1alpha-VEGF axis. Am J Respir Crit Care Med. 2008; 178(8): 787-97.
122
216. Sugiura H, Liu X, Duan F, Kawasaki S, Togo S, Kamio K, Wang XQ, Mao L, Ahn Y, Ertl RF, Bargar TW, Berro A, Casale TB, Rennard SI. Cultured lung fibroblasts from ovalbumin-challenged "asthmatic" mice differ functionally from normal. Am J Respir Cell Mol Biol. 2007; 37(4): 424-30. 217. Burgess JK, Boustany S, Moir LM, Weckmann M, Lau JY, Grafton K, Baraket M, Hansbro PM, Hansbro NG, Foster PS, Black JL, Oliver BG. Reduction of tumstatin in asthmatic airways contributes to angiogenesis, inflammation, and hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 2010; 181(2): 106-15. 218. Kanellis J, Mudge SJ, Fraser S, Katerelos M & Power DA. Redistribution of cytoplasmic VEGF to the basolateral aspect of renal tubular cells in ischemiareperfusion injury. Kidney Int 2000; 57: 2445–2456. 219. Vannay A, Fekete A, Müller V, Strehlau J, Viklicky O, Veres T, Reusz G, Tulassay T, Szabó AJ. Effects of histamine and the h2 receptor antagonist ranitidine on ischemia-induced acute renal failure: involvement of IL-6 and vascular endothelial growth factor. Kidney Blood Press Res. 2004; 27(2): 105-13. 220. Vannay A, Fekete A, Adori C, Tóth T, Losonczy G, László L, Vásárhelyi B, Tulassay T, Szabó A. Divergence of renal vascular endothelial growth factor mRNA expression and protein level in post-ischaemic rat kidneys. Exp Physiol. 2004; 89(4): 435-44. 221. Levy NS, Chung S, Furneaux H, Levy AP. Hypoxic stabilization of vascular endothelial growth factor mRNA by the RNA-binding protein HuR. J Biol Chem. 1998; 273(11): 6417-23. 222. Stein I, Itin A, Einat P, Skaliter R, Grossman Z, Keshet E. Translation of vascular endothelial growth factor mRNA by internal ribosome entry: implications for translation under hypoxia. Mol Cell Biol. 1998; 18(6): 3112-9. 223. Asai K, Kanazawa H, Kamoi H, Shiraishi S, Hirata K, Yoshikawa J. Increased levels of vascular endothelial growth factor in induced sputum in asthmatic patients. Clin Exp Allergy. 2003; 33(5): 595-9. 224. Hoshino M, Nakamura Y, Hamid QA. Gene expression of vascular endothelial growth factor and its receptors and angiogenesis in bronchial asthma. J Allergy Clin Immunol. 2001; 107(6): 1034-8.
123
225. Goebel S, Huang M, Davis WC, Jennings M, Siahaan TJ, Alexander JS, Kevil CG. VEGF-A stimulation of leukocyte adhesion to colonic microvascular endothelium: implications for inflammatory bowel disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2006; 290(4): G648-54. 226. Lucerna M, Zernecke A, de Nooijer R, de Jager SC, Bot I, van der Lans C, Kholova I, Liehn EA, van Berkel TJ, Yla-Herttuala S, Weber C, Biessen EA.Vascular endothelial growth factor-A induces plaque expansion in ApoE knock-out mice by promoting de novo leukocyte recruitment.Blood. 2007; 109(1): 122-9. 227. Feistritzer C, Kaneider NC, Sturn DH, Mosheimer BA, Kähler CM, Wiedermann CJ. Expression and function of the vascular endothelial growth factor receptor FLT-1 in human eosinophils. Am J Respir Cell Mol Biol. 2004; 30(5): 729-35. 228. Lu M, Perez VL, Ma N, Miyamoto K, Peng HB, Liao JK, Adamis AP. VEGF increases retinal vascular ICAM-1 expression in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999; 40(8): 1808-12. 229. Lee CG, Link H, Baluk P, Homer RJ, Chapoval S, Bhandari V, Kang MJ, Cohn L, Kim YK, McDonald DM, Elias JA. Vascular endothelial growth factor (VEGF) induces remodeling and enhances TH2-mediated sensitization and inflammation in the lung. Nat Med. 2004; 10(10): 1095-103. 230. Tagaya E, Tamaoki J. Mechanisms of airway remodeling in asthma. Allergol Int. 2007; 56(4): 331-40. 231. Numata Y, Terui T, Okuyama R, Hirasawa N, Sugiura Y, Miyoshi I, Watanabe T, Kuramasu A, Tagami H, Ohtsu H. The accelerating effect of histamine on the cutaneous wound-healing process through the action of basic fibroblast growth factor. J Invest Dermatol. 2006; 126(6): 1403-9. 232. Ghosh AK, Hirasawa N, Ohtsu H, Watanabe T, Ohuchi K. Defective angiogenesis in the inflammatory granulation tissue in histidine decarboxylase-deficient mice but not in mast cell-deficient mice. J Exp Med. 2002; 195(8): 973-82. 233. Ghosh AK, Hirasawa N, Ohuchi K. Enhancement by histamine of vascular endothelial growth factor production in granulation tissue via H(2) receptors. Br J Pharmacol. 2001; 134(7): 1419-28.
124
234. Chang AB, Peake J, McElrea MS. Anti-histamines for prolonged non-specific cough in children. Cochrane Database Syst Rev. 2008; (2): CD005604. 235. Lehman JM, Blaiss MS. Selecting the optimal oral antihistamine for patients with allergic rhinitis. Drugs. 2006; 66(18): 2309-19.
125
12. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE 12.1. A doktori értekezés témájához kapcsolódó közlemények: 1) Erna Sziksz, Gergely Tibor Kozma, Éva Pállinger, Zsolt István Komlósi, Csaba Ádori, Lajos Kovács, Beáta Szebeni, Krisztina Rusai, György Losonczy, András Szabó, Ádám Vannay. Galectin-9 in allergic airway inflammation and hyperresponsiveness in mice. – Int Arch Allergy Immunol. 2010; 151(4): 308-17. (IF: 2,131) 2) Erna Sziksz, Gergely Tibor Kozma, Zsolt István Komlósi, Éva Pállinger, Magdolna Kardos, Beáta Szebeni, György Losonczy, András Falus, András Szabó, Tivadar Tulassay, Ádám Vannay. Increased synthesis of VEGF in allergic airway inflammation in histidine decarboxylase knockout (HDC–/–) mice. – Exp Lung Res, 2010, elfogadva, megjelenés alatt (IF:1,618) 3) Sziksz Erna, Kozma Gergely Tibor, Pállinger Éva, Komlósi Zsolt István, Ádori Csaba, Kovács Lajos, Szebeni Beáta, Rusai Krisztina, Losonczy György, Vannay Ádám, Tulassay Tivadar, Szabó András. Galektin-9 szerepének vizsgálata
az
allergiás
légúti
gyulladás
és
hiperreaktivitás
kísérletes
egérmodelljében. Gyermekgyógyászat 2009; 60: 1. (IF: 0,0) 12.2. A doktori értekezés témájához nem kapcsolódó közlemények: 4) Ádám Vannay, Andrea Fekete, Róbert Langer, Tibor Tóth, Erna Sziksz, Barna Vásárhelyi, Attila J. Szabó, György Losonczy, Csaba Ádori, Anikó Gál, Tivadar Tulassay, András Szabó. Dehydroepiandrosterone pretreatment alters the ischaemia/reperfusion-induced VEGF, IL-1 and IL-6 gene expression in acute renal failure. Kidney Blood Press Res. 2009; 32(3): 175-84. (IF:1,268) 5) Beáta Szebeni, Ádám Vannay, Erna Sziksz, Ágnes Prókai, Áron Cseh, Gábor Veres, Antal Dezsőfi, Hajnalka Győrffy, Ilma Rita Korponay Szabó, András
126
Arató. Increased expression of serum-and glucocorticoid-regulated kinase-1 in the duodenal mucosa of children with coeliac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2010 Feb; 50(2): 147-53. (IF: 2,132) 6) Mónika Ádori, Endre Kiss, Zsuzsanna Barad, Klaudia Barabás, Edda Kiszely, Andrea Schneider, Dorottya Kövesdi, Erna Sziksz, István M. Ábrahám, János Matkó, Gabriella Sármay. Estrogen augments the T-cell-dependent but not the T-independent immune response. – Cell Mol Life Sci. 2010 May; 67(10): 166174 (IF: 5,511) 7) Ádám Vannay, Erna Sziksz, Ágnes Prókai, Gábor Veres, Kriszta Molnár, Dorottya Nagy Szakál, Anna Ónódy, Ilma Rita Korponay-Szabó, András Szabó, Tivadar Tulassay, András Arató, Beáta Szebeni. Increased expression of hypoxia inducible factor 1alpha in coeliac disease. Pediatr Res. 2010 May 5, elfogadva, megjelenés alatti társelsőszerzős közlemény (IF: 2,604) 8) Szebeni Beáta, Sziksz Erna, Prókai Ágnes, Gál Krisztina, Vannay Ádám, Cseh Áron, Veres Gábor, Dezsőfi Antal, Korponay Szabó Ilma, Bodánszky Hedvig, Arató András. Fokozott szérum és glükokortikoid regulált kináz-1 expresszió gyermekkori cöliákiában. Gyermekgyógyászat 2009; 60: 1. Társelsőszerzős közlemény (IF: 0,0) 9) Sziksz Erna, Gál Krisztina, Vannay Ádám, Reusz György, Tulassay Tivadar, Szabó András. A hipoxia indukálta faktorok szerepe a hipoxiás vesekárosodások patológiai folyamataiban. Hypertonia és Nephrologia 2008; 12 (6): 197-201, review (IF: 0,0) 10) Himer Leonóra, Balog Attila, Szebeni Beáta, Nagy Szakál Dorottya, Sziksz Erna, Reusz György, Tulassay Tivadar, Vannay Ádám. A Th17 sejtek szerepe a reumatoid artritiszben. – Orv Hetil. 2010 Jun 20; 151(25):1003-10. (IF: 0,0)
127
12.3. Konferencia absztraktok:
1) Meeting of Pediatric Research in Central European Countries (Innsbruck, Austria), 2007 June – Erna Sziksz, Ádám Vannay, Éva Pállinger, Zsolt Komlósi, Edit Buzás, András Szabó, Tivadar Tulassay, Gergely T Kozma. Importance of Galectin-9 in the pathogenesis of asthma -- „Award for the best presentation” - díj 2) Fiatal Gyermekgyógyászok Konferenciája (Pécs), 2008 március– Erna Sziksz, Ádám Vannay, Éva Pállinger, Zsolt Komlósi, Krisztina Rusai, András Szabó, Tivadar Tulassay, Gergely T. Kozma. Galectin-9 lehetséges szerepe az asthma patomechanizmusában. 3) Magyar Tüdőgyógyász Konferencia, A Magyar Tüdőgyógyász Társaság 55. Nagygyűlése (Balatonfüred), 2008 – Sziksz Erna, Vannay Ádám, Pállinger Éva, Komlósi Zsolt, Rusai Krisztina, Szabó András, Tulassay Tivadar, Kozma Gergely. Galectin-9 lehetséges szerepe az asthma patomechanizmusában. 4) Fiatal Gyermekgyógyászok Konferenciája (Kőszeg), 2009 április – Sziksz Erna, Szebeni Beáta, Vannay Ádám, Veres Gábor, Dezsőfi Antal, Ónódy Anna, Korponay-Szabó IR, Szabó András, Tulassay Tivadar, Arató András. A hipoxia indukálta faktor 1 alfa (HIF-1α) expresszió gyermekkori cöliákiában. -- A legjobb poszter „oral presentation” előadás díja
5) 42. annual meeting of European Society for Paediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (Budapest), 2009 June – Erna Sziksz, Beáta Szebeni, Ádám Vannay, Gábor Veres, Antal Dezsőfi, Anna Ónódy, IR Korponay-Szabó, András Szabó, Tivadar Tulassay, András Arató. Hypoxia Inducible Factor 1 alpha (HIF-1α) expression in coeliac disease. (Impakt faktoros absztrakt)
6) 42. annual meeting of European Society for Paediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (Budapest), 2009 June – Beáta Szebeni, Erna Sziksz,
128
Ádám Vannay, Gábor Veres, Antal Dezsőfi, Anna Ónódy, IR Korponay-Szabó, András Szabó, Tivadar Tulassay, András Arató. Increased Heat Shock Protein 72 expression in coeliac children. (Impakt faktoros absztrakt) 7) Magyar Gasztroenterológiai Társaság 51. Nagygyűláse (Tihany), 2009 Június – Sziksz Erna, Szebeni Beáta, Vannay Ádám, Veres Gábor, Dezsőfi Antal, Ónody Anna, Korponay-Szabó Ilma, Szabó András, Tulassay Tivadar, Arató András. A Hipoxia Indukálta Faktor 1 alfa (HIF-1α) expressziója cöliákiás gyermekekben. 8) Magyar Gyermekorvosok Társasága 53. Nagygyűlése (Eger), 2009 Június – Sziksz Erna, Szebeni Beáta, Vannay Ádám, Veres Gábor, Dezsőfi Antal, Ónody Anna, Korponay-Szabó Ilma, Szabó András, Tulassay Tivadar, Arató András. A hipoxia indukálta faktor (HIF) 1 alfa expressziója cöliákiás gyermekek duodenumában. 9) Magyar Gyermekorvosok Társasága 53. Nagygyűlése (Eger), 2009 Június – Szebeni Beáta, Sziksz Erna, Vannay Ádám, Veres Gábor, Dezsőfi Antal, Ónody Anna, Korponay-Szabó Ilma, Szabó András, Tulassay Tivadar, Arató András. Emelkedett hősokk fehérje 72 (HSP72) expresszió cöliákiában. 10) Magyar Gyermeknephrológiai Egyesület (Pécs), 2009 Október - Sziksz Erna, Szebeni Beáta, Prókai Ágnes, Kis Éva, Gál Krisztina, Bánki Nóra Fanni, Cseh Áron, Szalay Balázs, Fekete Andrea, Vásárhelyi Barna, Szabó András, Szabó Attila, Reusz György, Tulassay Tivadar, Vannay Ádám: IL-17 szerepe az epitélsejtek miofibroblaszttá történő differenciációjában.
11) 11th Spring Meeting of Clinical and Basic Research in Renal Diseases (Nagycenk), 2010 Április - Sziksz Erna, Szebeni Beáta, Prókai Ágnes, Kis Éva, Gál Krisztina, Bánki Nóra Fanni, Cseh Áron, Szalay Balázs, Fekete Andrea, Vásárhelyi Barna, Szabó András, Szabó Attila, Reusz György, Tulassay Tivadar, Vannay Ádám: Role of IL-17 in renal fibrosis.
129
12) Magyar Tüdőgyógyász Konferencia, A Magyar Tüdőgyógyász Társaság 55. Nagygyűlése (Balatonfüred), 2008 – Szebeni Beáta, Sziksz Erna, Vannay Ádám, Komlósi Zsolt, Pállinger Éva, Szabó András, Kozma Gergely Tibor. Hisztamin hatása a Galectin-1, -3 rendszerre az asztma egérmodelljében. 13) XVI. Tudományos Diákköri Konferencia, (Marosvásárhely), 2009 március – Ónódy Anna, Szebeni Beáta, Vannay Ádám, Sziksz Erna, Veres Gábor, Dezsőfi Antal, Korponay-Szabó IR, Szabó András, Tulassay Tivadar, Arató András. A Hősokk Protein 72 (HSP72) expressziója cöliákiás gyermekek duodenumában. 14) Fiatal Gyermekgyógyászok Konferenciája (Kőszeg), 2009 április – Szebeni Beáta, Sziksz Erna, Vannay Ádám, Veres Gábor, Dezsőfi Antal, Ónódy Anna, Korponay-Szabó IR, Szabó András, Tulassay Tivadar, Arató András. A Hősokk Protein 72 (HSP72) expressziója cöliákiás gyermekek duodenumában. 15) Magyar Gasztroenterológiai Társaság 51. Nagygyűláse (Tihany), 2009 Június – Szebeni Beáta, Sziksz Erna, Vannay Ádám, Veres Gábor, Dezsőfi Antal, Ónody Anna, Korponay-Szabó Ilma, Szabó András, Tulassay Tivadar, Arató András. A Hősokk protein 72 (HSP72) expressziója cöliákiás gyermekekben.
16) Meeting of Pediatric Research in Central European Countries (Innsbruck, Austria), 2009 July – Krisztina Gál, Beáta Szebeni, Erna Sziksz, Ágnes Prókai; Áron Cseh, Ádám Vannay, Gábor Veres, Antal Dezsőfi, Anna Ónódy, IR Korponay-Szabó, Veronika Müller, András Szabó, Tivadar Tulassay, András Arató. Increased heat shock protein 72 (HSP72) expression in coeliac children. 17) Magyar Élettani Társaság LXXIII. Vándorgyűlése,(Budapest) 2009 augusztus – Vannay Ádám, Szebeni Beáta, Kis Éva, Sziksz Erna, Cseh Áron, Szalay Balázs, Prókai Ágnes, Gál Krisztina, Bánki Nóra Fanni, Kardos Magdolna, Szabó Attila, Vásárhelyi Barna, Szabó András, Tulassay Tivadar, Reusz György. Ureter obstructio következményeinek molekuláris pathomechanizmusa.
130
18) Magyar Nephrológiai Társaság (MANET) XXVI. Nagygyűlése, Siófok, 2009 szeptember – Szebeni Beáta, Sziksz Erna, Prókai Ágnes, Kis Éva, Gál Krisztina, Bánki Nóra Fanni, Cseh Áron, Szalay Balázs, Szabó Attila, Fekete Andrea, Vásárhelyi Barna, Szabó András, Tulassay Tivadar, Reusz György Vannay Ádám. Az uréter obstrukció patomehanizmusa. 19) Magyar Élettani Társaság 74. Vándorgyűlése és a Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság 2. közös konferenciája, Szeged, 2010 június - Szebeni Beáta, Sziksz Erna, Himer Leonóra, Nagy Szakál Dorottya, Prókai Ágnes, Kis Éva, Gál Krisztina, Bánki Nóra Fanni, Cseh Áron, Szalay Balázs, Rusai Krisztina, Fekete Andrea, Vásárhelyi Barna, Szabó András, Szabó Attila, Reusz György, Tulassay Tivadar, Vannay Ádám. IL-17 szerepe az epitélsejtek miofibroblaszttá történő differenciációjában. 20) Magyar Élettani Társaság 74. Vándorgyűlése és a Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság 2. közös konferenciája, Szeged, 2010 június - Sziksz Erna, Vannay Ádám, Szebeni Beáta, Prókai Ágnes, Veres Gábor, Molnár Kriszta, Nagy Szakál Dorottya, Ónódy Anna, Korponay-Szabó Ilma Rita, Szabó András, Tulassay Tivadar, Arató András. A hipoxia indukálta faktor (HIF) 1 szerepének vizsgálata cöliákiában. 21) Magyar Élettani Társaság 74. Vándorgyűlése és a Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság 2. közös konferenciája, Szeged, 2010 június - Nagy Szakál Dorottya, Szebeni Beáta, Sziksz Erna, Himer Leonóra, Prókai Ágnes, Kis Éva, Gál Krisztina, Bánki Nóra Fanni, Cseh Áron, Szalay Balázs, Rusai Krisztina, Vásárhelyi Barna, Szabó András, Reusz György, Szabó Attila, Tulassay Tivadar, Vannay Ádám. IL-17 hatására az MMP-12 expresszió fokozódik ERK1/2, JNK ÉS SMAD2/3 jelátviteli útvonalakon keresztül HK-2 sejtekben.
131
13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetemet szeretném kifejezni mindenek előtt Prof. Dr. Tulassay Tivadarnak, aki biztosította számomra a kutatómunka elvégzéséhez szükséges szellemi műhelyt, és aki bátorító
szavaival
oly sokszor
lendületet adott
az
előttem álló
kihívások
végrehajtásához. Kimondhatatlan hálával tartozom témavezetőimnek Prof. Dr. Szabó Andrásnak és Dr. Vannay Ádámnak, akik nélkül ez a munka nem jöhetett volna létre. Köszönöm, hogy mindenben
mellettem
álltak,
köszönöm
a
sok
észrevételt,
tanácsot,
és
a
felbecsülhetetlen segítséget a tudományos kutatói magatartás és gondolkodás elsajátításához, valamint azt is, hogy megteremtették a munkához szükséges tárgyi feltételeket is. Köszönettel tartozom Dr. Kozma Gergelynek és Dr. Komlósi Zsoltnak, akik fontos szerepet vállaltak abban, hogy ez a munka megszülethessen. Köszönöm Dr. Vásárhelyi Barnának, hogy tapasztalataival segítette pályámat és alakította tudományos szemléletmódomat. Hálás vagyok Dr. Pállinger Évának a FACS mérések kapcsán nyújtott önzetlen segítségéért és szakmai tanácsaiért. Köszönöm továbbá Prof. Dr. Arató Andrásnak, Prof. Dr. Reusz Györgynek, Dr. Szabó Attilának és Dr. Veres Gábornak, akik ugyancsak hozzájárultak ahhoz, hogy lehetőségem legyen eredményeinket szakmai konferenciákon is bemutatni. Külön szeretném megköszönni Dr. Szebeni Beátának, hogy mindenben számíthattam értékes baráti támogatására és szakmai segítségére. Köszönöm a labor többi kutatójának, Dr. Fekete Andreának, Dr. Rusai Krisztinának, Dr. Tory Kálmánnak és Himer Leonórának, hogy készségesen válaszoltak felmerülő szakmai kérdéseimre. Hálás vagyok PhD hallgató társaimnak, akik ugyancsak szerves részt vállaltak a fiatalos, jó légkör megteremtésében. Külön köszönettel tartozom Bernáth Máriának vizsgálataim során nyújtott felbecsülhetetlen technikai és emberi segítségéért, valamint az I.sz. Gyermekklinika valamennyi munkatársának, hogy segítő, baráti körülmények között végezhettem doktori munkámat. Végül, pedig kifogyhatatlan hálám szeretném kifejezni Szüleimnek, minden egyes Családtagomnak és Vőlegényemnek, akiknek féltő szeretetét semmi nem pótolhatja.
132
