A fetuin-a artériás kalcifikációt gátló hatásának vizsgálata érbetegekben

A fetuin-A artériás kalcifikációt gátló hatásának vizsgálata érbetegekben Doktori értekezés Dr. Szeberin Zoltán

Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Acsády György egyetemi tanár, az orvostudomány doktora Hivatalos bírálók: Dr. Kasza Gábor egyetemi adjunktus, PhD. Dr. Szíjártó Attila egyetemi tanársegéd, PhD. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Ondrejka Pál, egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Jámbor Gyula, egyetemi docens, Ph.D. Dr. Járai Zoltán, egyetemi docens, Ph.D.

Budapest 2010

1

TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ……………………………………………..........4 1. BEVEZETÉS………………………………………………………….........….....5 1. 1. ATHEROSCLEROSIS ……………………………………………………..........5 1. 1. 1. Az atherogenezis folyamata …………………………………………..............5 1. 1. 2. Az atherosclerotikus érbetegségek kialakulása és kockázati tényezői ........7 1. 2. ARTÉRIÁS KALCIFIKÁCIÓ ………………………………………….............9 1. 2. 1. Az artériás kalcifikáció patofiziológiája ...………………………...................9 1. 2. 2. Az artériás kalcifikáció serkentő tényezői ………………………….............11 1. 2. 3. Az artériás kalcifikáció inhibitorai ...……………………………….............13 1. 2. 4. Az artériás kalcifikáció típusai ……………………………………...............16 1. 3. A FETUIN-A JELLEMZŐI ……………………………………………...........17 1. 3. 1. A fetuin-A szerkezete és genetikája ………………………………...............17 1. 3. 2. A fetuin-A hatásai ……………………………………………………............19 1. 3. 3. A fetuin-A kapcsolata az artériás kalcifikációval és az atherosclerosissal .21

2. CÉLKITŰZÉSEK .............................................................................................28 3. MÓDSZEREK ....................................................................................................29 3. 1. VIZSGÁLT BETEGCSOPORTOK ÉS VIZSGÁLATI TERVEK ................29 3. 2. VIZSGÁLATI MÓDSZEREK ...........................................................................32 3. 2. 1. Klinikai vizsgálatok .........................................................................................32 3. 2. 2. Laboratóriumi vizsgálatok .............................................................................35 3. 3. STATISZTIKAI ANALÍZIS ..............................................................................36

4. EREDMÉNYEK ................................................................................................38 4. 1. A SZÉRUM FETUIN-A SZINT KAPCSOLATA AZ ARTÉRIÁS KALCIFIKÁCIÓVAL KRÓNIKUS ALSÓ VÉGTAGI ATHEROSCLEROTIKUS, NEM URAEMIÁS BETEGEKBEN ......................................................38 4. 2. KÜLÖNBÖZŐ ETIOLÓGIÁJÚ AORTA ANEURIZMÁVAL RENDELKEZŐ BETEGEK SZÉRUM FETUIN-A SZINTJÉNEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA .............................................................................................43

2

4. 3. A PERIFÉRIÁS ÉRBETEGEK SZÉRUM HSP 70, FETUIN-A SZINTJÉNEK ÉS AZ ARTÉRIÁS KALCIFIKÁCIÓ MÉRTÉKÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSEI ......................................................................................................48

5. MEGBESZÉLÉS ...............................................................................................54 5. 1. AZ ALACSONY FETUIN-A SZÉRUM SZINT FOKOZOTT ARTÉRIÁS KALCIFIKÁCIÓVAL JÁR EGYÜTT KRÓNIKUS ALSÓ VÉGTAGI ATHEROSCLEROTIKUS, NEM URAEMIÁS BETEGEKBEN ..........................54 5. 2. AZ ATHEROSCLEROTIKUS AORTA ANEURIZMÁVAL RENDELKEZŐ BETEGEK SZÉRUM FETUIN-A SZINTJE ALACSONYABB, MINT A MARFAN SZINDRÓMÁS ANEURIZMÁS BETEGEKÉ ......................................56 5. 3. A HSP 70 ÖSSZEFÜGG AZ ARTÉRIÁS KALCIFIKÁCIÓ SÚLYOSSÁGÁVAL PERIFÉRIÁS ÉRBETEGEKBEN ........................................58

6. KÖVETKEZTETÉSEK ..................................................................................61 7. ÖSSZEFOGLALÁS ..........................................................................................64 7. 1. ÖSSZEFOGLALÁS ............................................................................................64 7. 2. SUMMARY ..........................................................................................................65

8. IRODALOMJEGYZÉK .................................................................................66 9. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE ......................................................82 9. 1. AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK ..................82 9. 2. EGYÉB KÖZLEMÉNYEK ................................................................................82

10. KÖSZÖNETNYiLVÁNÍTÁS .................................................................... .86

3

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ABI – boka-kar Doppler index

HbA1c - haemoglobin A1c

AHSG - alfa-2 Heremans Schmid

HDL – high density lipoprotein

glikoprotein

HSP - heat-shock protein

ALP - alkalikus foszfatáz

IL - interleukin

ANK - ankyrin

IMT - intima-média vastagság

ASA - atherosclerotikus aneurizma

IQR - interkvartilis range

BMP - bone morphogenetic protein

KS - kalcifikációs score

Cbfa1 - core binding factor

LDL - low density lipoprotein

CI - konfidencia intervallum

MGP - mátrix glutamic acid protein

CRP - C-reactive protein

MMP - mátrix metalloproteináz

CT - computer tomography

OPG - oszteoprotegerin

CVC - calcifying vascular cell

OPN - oszteopontin

ECM - extracelluláris mátrix

OR - esélyhányados

EDRF - endothelial-derived relaxing

ox-LDL - oxidatívan módosult LDL PAD - perifériás érbetegség

factor eGFR

–

számított

glomerolus

PTH - parathormon

filtrációs ráta

SNP - single-nucleotide polymorphism

ELISA - enzyme linked immunosorbent

TGF-β - transforming growthfactor-β TNF-α - tumor nekrózis faktor-α

assay ENPP1 - ekto-nukleotid pirofoszfatáz-

UH - ultrahang

foszfodieszteráz -1

VEGF - vascular endothelial growth

GFR - glomerolus filtrációs ráta

factor

GGT - gamma-glutamil transzpeptidáz

VSMC - ér simaizomsejt

Az értekezésben a Magyar Tudományos Akadémia megengedő iránymutatásának megfelelően az általánosan ismertebb, vagylagos írású címszavak esetén igyekeztem a magyar helyesírás szabályai szerint használni a szakmai nyelvet.

4

1. BEVEZETÉS Magyarországon és a nyugati típusú társadalmakban a szív- és érrendszeri megbetegedések ma is a haláloki statisztikák vezető helyén állnak. A megbetegedések hátterében számos esetben atherosclerosis mutatható ki. Az atherosclerosis régóta ismert betegség, de pontos kialakulása, etiológiája, lefolyása és kezelése ma is intenzív kutatás tárgya. A legfontosabb tényezőket, melyek érelmeszesedéshez vezetnek, minden művelt ember ismeri, mindenapjaink részévé vált az érszűkület elleni küzdelem. A hagyományos rizikótényezők és szérum markerek mellett folyamatosan fedeznek fel molekulákat, melyek a klasszikus tényezők mellett, szerepet játszhatnak az érszűkület, érelmeszesedés kialakulásában. Az érsebészet a szervezet különböző helyén kialakult atherosclerosis legsúlyosabb megjelenési formáit hivatott kezelni. A cél a beteg életének megmentése, életminőségének javítása, az atherosclerosis súlyos szövődményeinek megelőzése, mérséklése. Tekintettel az atherosclerosis krónikus progresszív jellegére az érsebészeti ténykedés sokszor palliatív jellegű. Az érelmeszesedés kialakulásának pontos megértése lehetővé tenné már korábbi szakaszban kezelését. A klinikumban szerzett mindennapi tapasztalat felveti a klasszikus rizikótényezőkön kívül egyéb mechanizmusok jelenlétét. Érsebészek, angiológusok, radiológusok által jól ismert jelenség, hogy a súlyos atherosclerosisos betegek között némelyek súlyos, diffúz artériás kalcifikációban szenvednek (pl. diabéteszes, krónikus uraemiás dializált betegek), másokban alig látható mész az érfalban, bár az artériás szűkületek, és elzáródások súlyos klinikai állapothoz vezetnek. Az érfal korai, a klasszikus rizikótényezőkkel nem mindig magyarázható meszesedésének hátterében az utóbbi években új szabályozó mechanizmusok merültek fel. Az extraosszeális és intraarteriális kalcifikáció egyik szabályozója lehet a fetuin-A, mely számos egyéb szerepe mellett szerepet játszhat az érelmeszesedés kialakulásában. E mechanizmus megismerésének szükségessége vezetett a fetuin-A érbetegekben történő vizsgálatához.

1. 1. ATHEROSCLEROSIS 1. 1. 1. Az atherogenezis folyamata Az atherogenezis kezdeti lépése szövettanilag extracelluláris lipid felhalmozódással és leukocyták

bevándorlásával

jellemezhető

5

folyamat,

melynek

hátterében

az

endotheldiszfunkció áll. Endotheldiszfunkción azt a jelenséget értjük, melynek során az intima endothelrétegének integritása sérül, permeabilitása egyes molekulák felé (mint pl.a low density lipoprotein [LDL]) fokozódik, a leukociták adhéziója megindul, az antithrombotikus felszín károsodik, sejtaktiváció és proliferáció indul és csökken az artériák válaszképessége [1]. Az intimába vándorolt monocyták aktivált makrofágokká differenciálódnak, képesek az ott lévő lipidpartikulumokat felvenni, ezáltal kialakulnak az atherosclerosisra jellegzetes habos sejtek. A lipoproteinek felvételében nem a klasszikus sejtfelszíni LDL receptorok, hanem az ún. scavenger receptorok, azon belül pedig a scavenger receptor-A család tagjai játszanak fontos mediátor szerepet [2, 3]. A habos sejtek intenzív osztódásba kezdenek, létrejön a laesio legkorábban kimutatható formája a fatty streak („zsíros csík”), mely főként habos sejteket tartalmaz. A fatty streak már fiatal felnőttkorban kimutatható és egyes adatok szerint részben reverzibilis elváltozás [4]. Amennyiben a kiváltó tényező, az endotheldiszfunkció nem szűnik meg, az atheromában

folytatódik

a

sejtes

elemek

proliferációja,

további

leukocyták

bevándorlása; az intimában simaizomsejtek jelennek meg és kialakul a köztes laesio. Fontos szerepet játszanak a laesio fejlődésében és a simaizomsejtek bevándorlásában az extracelluláris mátrix lebontásáért felelős mátrix metalloproteináz (MMP) enzimek [5, 6]. A plakkban angiogenezist elősegítő faktorok (savas és bázikus fibroblast növekedési faktor, VEGF, oncostatin-M) hatására mikrovaszkularizációt kialakító plexusok jönnek létre, a fokozott sejttevékenység felborítja az érfal homeosztázisát, mely nekrózishoz, gyulladáshoz vezet. Ezt szöveti fibrosis követi, a zsíros nekrotizált szövetanyagot aktivált simaizomsejtekből álló „fibrosus sapka” borítja. A simaizomsejtek elhalásában a nekrózis mellett jelentős szerepet játszik a gyulladásos cytokinek által indukált apoptózis [7]. A plakkban gyakran kalcifikáció mutatkozik, melyet a simaizomsejtek által termelt TGF-β homológ cytokinek indukálnak. Az atheroma továbbfejlődésével tehát kialakul a komplikált laesio, mely jelentős szűkületet okozhat az adott ér lumenében. A laesio kialakulása és fejlődése évtizedeken át tartó folyamat lehet. A 60 %-t meghaladó stenosis egy adott szerv vérellátásának kritikus csökkenéséhez vezet és már klinikai tüneteket válthat ki. Plakkruptura során a fibrosus sapkára ható erők és a sapka mechanikai tűrőképessége közötti egyensúly felbomlik, kialakul a vulnerábilis plakk. A vulnerábilis plakkban megnő az aktív

6

makrofágok száma és a plakk lipid tartalma, melyek gyulladásos cytokinek, MMP-ok termelésével és az apoptózis indukciójával járnak [8-10]. A plakk superficialis eróziója sokkal kevésbé ismert folyamat, létrejöttében az endothelsejtek apoptózisa és desquamatiója játszhat fontos szerepet [11]. Mindkét folyamat a plakk in situ trombózisához vezet, ez azonban nem feltétlenül nyilvánul meg klinikai szindrómákban. 1. 1. 2. Az atherosclerotikus érbetegségek kialakulása és kockázati tényezői Az atherosclerosis tehát egy évtizedek alatt progresszívan kialakuló betegség, melyben az egyes stádiumok jól definiáltak: endotheldiszfunkció – fatty streak – köztes laesio – fibrosus plakk – komplikált laesio – vulnerábilis plakk – plakkruptura/erozió, trombózis.

Az

atherosclerosis

etiológiáját

tekintve

multifaktoriális

jellegű

megbetegedés, kialakulásában genetikai prediszpozíció mellett környezeti tényezők károsító hatása játszik kulcsszerepet. Nagy, betegpopulációs vizsgálatokban a káros környezeti tényezőket azonosították és kockázati tényezőként definiálták. A legismertebb ilyen vizsgálat a The Framingham Heart Study volt (1966, [12]), melynek jelenkori folytatása ma is értékes eredményeket ad a betegség kutatásában. A korai vizsgálatok szerint az atherosclerosis klasszikus kockázati tényezőinek tekinthető a magas életkor, a hyper- és dyslipidaemia (emelkedett LDL; csökkent high-density lipoprotein [HDL]), a dohányzás, a magasvérnyomás-betegség, a diabetes mellitus, a fizikai aktivitás hiánya, az elhízás, a mentális stressz („A” típusú személyiség) és a férfi nem. A betegség intenzív kutatása során számos új kockázati tényezőt is azonosítottak. A nagyon magas homocisztein szint (hiperhomociszteinémia) toxikus az endothelsejtekre, fokozza az LDL oxidációját, rontja az endothelial-derived relaxing factor (EDRF) működését és csökkenti az áramlás mediált artériás vasodilatatiot [13, 14]. A laesio kialakulásának kezdeti lépése az endotheldiszfunkció, míg a folyamat továbbfejlődésében azonban a krónikus gyulladásnak van jelentős szerepe: „az atherosclerosis gyulladásos betegség” [15, 16]. A laesio korai formája a fatty streak tisztán gyulladásos eredetű elváltozás; a gyulladásos jelek és folyamatok végig észlelhetők a plakk fejlődésének minden szakaszában és a plakkruptura során is [17, 18]. Így kézenfekvő volt az a feltevés, hogy a gyulladás új kockázati tényezője lehet az atherosclerosisnak, melynek mértékét jól jelzik a különböző gyulladásos markerek. A

7

legismertebb és a rizikóbecslésben mai ismereteink szerint legjobban használható ilyen marker az ultraszenzitív módszerrel meghatározott C-reaktív protein (CRP). A magas CRP szint a klasszikus kockázati tényezőktől függetlenül, additívan jelzi előre az emelkedett kardiovaszkuláris rizikót egészséges egyénekben, idősekben, stabil vagy instabil angina pectorisban szenvedőkben és korábban myocardialis infarktuson átesett betegekben egyaránt [19]. A CRP mellett számos proinflammatorikus cytokinről (IL-6, tumor necrosis factor-α [TNF-α]), adhéziós molekuláról (intercellular adhesion molecule-1)

és

komplementfehérjék)

akut-fázis ismert,

fehérjéről hogy

(serum

emelkedett

amyloid-A,

szintjük

előre

fibrinogén, jelezheti

az

atherosclerotikus érbetegségek megjelenését [20]. Vitatott kérdés azonban az, hogy az akut-fázis fehérjék mennyiben tekinthetők csak a betegség markerének és milyen részben játszhatnak direkt mediátor szerepet a folyamat kialakulásában [21]. A gyulladásos folyamat kiváltásában egyes fertőző ágensek is szerepet játszhatnak, felmerült a Chlamydia pneumoniae, a Helicobacter pylori, a Herpes simplex vírus és a cytomegalovírus kóroki szerepe. Azonban az egyes fertőzések és a betegség között direkt összefüggést egyértelműen és ellentmondás nélkül igazolni nem sikerült. Jelenleg a fertőző ágensek vonatkozásában az összesített patogénterhelés elmélete (total pathogen burden) az elfogadott, miszerint a koronáriabetegség kialakulására annál nagyobb az esély, minél több fertőzést szenved el az egyén bizonyos kórokozóktól élete során [22]. Egy másik, talán elismertebb hipotézis szerint az immunológiai folyamatot saját antigének váltják ki, tehát az autoimmunitás lehet az atherosclerosis iniciációjának egyik kulcseleme [23]. Az érfalban a saját hősokkfehérje (Hsp 60-70) képezheti az ereket károsító immunválasz fő célpontját [24]. A sérülésre adott válasz elmélet és a gyulladás patogenezisben betöltött szerepe magyarázza a betegség legtöbb lépését, és magában foglalja folyamat multifaktoriális jellegét, sokszínűségét. Az atherosclerosisra jellemző, hogy párhuzamosan egyszerre több érterületen alakul ki, ugyanakkor bizonyos érterületek nagyságrendekkel gyakrabban érintettek másoknál (ún. predilekciós helyek). Ez utóbbi megfigyelésre vonatkozóan azonban egyértelmű biológiai magyarázat még nem ismert [25]. Jelentőségét azonban kiemeli az a tény, hogy az egyes érterületek jellegzetes kockázati tényezőai között lényeges különbségek figyelhetők meg: jól ismert, hogy míg a hipertónia inkább az ischaemiás stroke, addig a

8

magas koleszterinszint az akut myocardialis infarktus kialakulására hajlamosít. Ezért mindenképpen indokolt a különböző érterületet érintő atherosclerotikus érbetegségeket egymástól elválasztani és külön vizsgálni. 1. 2. ARTÉRIÁS KALCIFIKÁCIÓ 1. 2. 1. Az artériás kalcifikáció patofiziológiája A vaszkuláris rendszerben észlelhető ektópiás kalcifikáció évtizedek óta ismert jelenség. Az utóbbi időkig ez a jelenséget passzív folyamatként az öregedés velejárójaként tartották számon. Az orvostudomány különböző területein (angiológia, érsebészet, endokrinológia, csontanyagcsere, diabetológia, alapkutatások) folyó kutatásokból származó növekvő mennyiségű bizonyíték azonban arra utal, hogy az extraosszeális mineralizáció egy szorosan és szerteágazóan szabályozott folyamat, melyet segítő és gátló faktorok tartanak egyensúlyban. A pontos szabályozó mechanizmusok azonban ma sem tisztázottak. Az oszteogenezis indukciójának megerősödése és a mineralizáció gátló faktorok csökkenése egyaránt fokozott vaszkuláris kalcifikációhoz vezethet. Az oszteogenezis indukciójának egyik elmélete szerint oszteoblaszt típusú sejtek aktiválódása eredményez aktív csontképződést az erekben [26]. E sejtek eredete nem tisztázott: felmerült, hogy az érfalban lévő simaizom sejtek (vascular smooth muscle cell: VSMC) fenotípus változásaként alakulnak ki az oszteoblasztok, mások keringő őssejtek és pericyták aktiválódását és differenciálódását tartják forrásuknak. A VSMC fenotípus reverzibilis differenciációja jellegzetes képessége e sejteknek, különböző ingerek hatására proliferatív fázisba léphetnek és extracelluláris mátrixot (ECM) termelnek [27]. Ilyen ingerek lehetnek pl. az oxidatív stressz, csont morfogenetikus fehérjék (bone morphogenetic protein: BMP), a pirofoszfát szint változásai. Ahogy az atherosclerotikus laesio fibrotikus-kalcifikált plakká fejlődik, az oszteogenetikus differenciáció markerei expresszálódni kezdenek, pl. a BMP-2, a transzkripciót szabályozó core binding factor (Cbfa1) és az osterix. Demer és mtsai bizonyították egy VSMC szubpopuláció jelenlétét az érfalban, melyet kalcifikálódó ér sejtnek (calcifying vascular cell: CVC) neveztek el; ezek a sejtek spontán nodulusokba rendeződnek és kalcifikálódnak szövettenyészetben. Ezek a nodulusok számos vonatkozásban hasonlítanak a csontra: emelkedett bennük az alkalikus foszfatáz (ALP) aktivitás, az oszteokalcin, oszteonektin és oszteopontin expresszió [28]. Ezek a sejtek rendelkeznek

9

mesenchymális differenciálódási képességgel is (pl. oszteoblasztokká alakulhatnak) és a teljes VSMC populáció mintegy 20-30%-át alkotják. Más szerzők szerint az érfalban előforduló pericyták a mesenchymális progenitorsejtek, és megmaradt a képességük, hogy oszteoblasztokká és chondrocytává fejlődjenek [29, 30]. A pericyták tímusznélküli egerekben különböző vázszövetté képesek fejlődni (pl. csont, porc) és a CVC-ekhez hasonlóan szövettenyészetben nodulusokat formálnak, melyek I. típusú kollagént, oszteopontint (OPN), mátrix G1a proteint (MGP) és oszteokalcint tartalmaznak [31, 32]. Számos bizonyíték szól továbbá amellett, hogy a neoangiogenezis szerepet játszik a szívbillentyűk és az erek elmeszesedésében. A kalcifikált laesiok környezetében gyakran fokozott neovaszkularizáció figyelhető meg. A valvuláris kalcifikáció szövettani vizsgálata során neovaszkularizációt figyeltek meg az összes meszes billentyű környékén [33]. A mechanizmus valószínűleg multifaktoriális, mindenesetre ismert, hogy cytokinek (BMP-2, BMP-4) és a VEGF serkenti az oszteoblasztok migrációját és differenciációját [34]. Más angiogenezis mediátorokat is kimutattak a fibrotikus kalcifikált plakkokban: pl. sialoprotein és OPN [35, 36]. Az ektópiás csontképződést számos mediátor szabályozza. Az egyik legfontosabb a transforming growthfactor-β (TGF-β) szupercsaládba tartozó BMP csoport, melyek közül a BMP-2 és a BMP-4 szerepet játszik a vaszkuláris kalcifikációban és a lokális gyulladás folyamatában. A BMP-7 a vaszkuláris kalcifikáció ellen hat [37]. Az atherosclerosis és veseelégtelenség kapcsolatát vizsgáló kutyakísérletben a BMP-7 adása megállította vaszkuláris kalcifikációt [38]. Ez a megfigyelés együtt járt az erek falában

lévő

atherosclerotikus

plakkokban

az

oszteokalcin

expressziójának

csökkenésével is. A BMP-2 receptor mutációja és a familiáris pulmonális hipertónia között kapcsolatot igazoltak, sőt a hisztológiai vizsgálat során a tüdő ereinek kalcifikációját észlelték, bár a pulmonális erekre nem jellemző a meszesedés [39, 40]. További érdekes megfigyelés, hogy az autoszomális recesszív öröklődésű idiopathiás infantilis artériás kalcifikáció és a perzisztáló pulmonális hipertónia kombinációja rendellenes kalcium homeosztázissal jár együtt [41]. A BMP-2 hatása oszteogén transzkripciós faktorok (Cbfa1, osterix) termelését növelő mechanizmussal érvényesül. Cbfa1-null egereknek nincs funkcionális oszteoblasztja, nem képesek hypertrophiás porc vagy mineralizált csont termelésre [42]. Emberben a Cbfa1 mutációja az oka az

10

autoszomális, domináns öröklődésmenetű cleidocraniális dysplasiának, melynek fenotipikus megjelenéséhez tartoznak a nyitott kutacsok, számfeletti fogak, hiányzó claviculák, alacsony termet [43]. Krónikus vesebetegségben szenvedő betegek szöveti mintájában a Cbfa1 expressziója fokozott volt a meszes artériákban [44]. Az osterix egy cink tartalmú transzkripciós faktor, mely szintén fontos szerepet játszik a csontszövet kialakulásában; osterix-knockout egérben hiányzik a csontképződés. Állatkísérletek alapján valószínű, hogy a Cbfa1 szabályozza az osterix expressziót, bármelyikük hiánya a kalcifikáció súlyos zavarához vezet [45]. 1. 2. 2. Az artériás kalcifikáció serkentő tényezői A krónikus vesebetegekben észlelt fokozott artériás kalcifikáció vizsgálatai során felmerült annak a lehetősége, hogy az ilyen betegekben fennálló tartósan emelkedett foszfát szérum szint szerepet játszhat az érelmeszesedésben. Az uraemiás betegekben mind a csökkent foszfát elimináció, mind a szekunder hiperparatireoid állapot felelős a magasabb foszfát szintért. Korábbi elképzelések szerint egyszerűen a magas kalciumfoszfát szérum szint vezetett volna a kicsapódáshoz, de újabb vizsgálatok azt mutatták, hogy a magas foszfát szérum szint a VSMC-k oszteoblasztokká történő differenciációját indukálja. Sejttenyészetekben az anorganikus foszfát hozzáadása indukálta a VSMC-k mineralizálódását és fokozta az OPN és az alkalikus foszfatáz (ALP) expresszióját [46, 47]. A humán szérum vizsgálatai szerint azonban önmagában az emelkedett foszfát szint nem magyarázza az uraemiás betegekben észlelhető intenzívebb kalcifikációt, ugyanis az ilyen betegek széruma a foszfát koncentrációtól függetlenül OPN, ALP [47] és Cbfa1 expressziót [44] indukált. A parathormon (PTH) alapvető szerepet játszik a kalcium homeosztázisban és tudjuk, hogy a szekunder hiperparatireózis gyakori uraemiás betegekben. Ismert, hogy a PTH az ALP aktivitás csökkentésével gátolja a VSMC kalcifikációt [48]. Ugyanakkor a csontokban a PTH oszteoblaszt és Cbfa1 expressziót indukál, bár a PTH és Cbfa1 kapcsolatát VSMC-kben kimutatni eddig nem sikerült [49]. A szekunder hiperparatireózis okozta renális oszteodisztrófia kivédése céljából az uraemiás betegek sokszor részesülnek foszfát megkötő gyógyszerek és D vitamin kezelésben, melyek viszont fokozhatják a vaszkuláris kalcifikációt. E szerek a súlyos vaszkuláris calcyphylaxis kórképhez vezethetnek.

11

A Sevelamer (kalciumot nem tartalmazó foszfátkötő szer) állatkísérletekben csökkentette a szérum foszfát és PTH szintet, mérsékelte az aorta kalcifikációt és a renális oszteodisztrófiát [50]. Klinikai vizsgálatokban hemodializált, ismerten coronariasclerosisban szenvedő betegekben a Sevelamerrel kezelt betegcsoportban a vaszkuláris kalcifikáció progressziója lelassult a kalciumot tartalmazó foszfátkötő szerekkel kezelt betegekhez képest [51]. Egy éves Sevelamer kezelés után e betegek LDL és inflammációs marker szintje is szignifikánsan csökkent és egy randomizált tanulmány szerint CT vizsgálat is igazolta a mérsékeltebb aorta és coronaria kalcifikációt a Sevelamerrel kezelt betegcsoportban [52]. A

szekunder

hiperparatireózis

kezelésében

használatos

kalcitriol

(1,25-

dihydroxyvitamin D, a D vitamin aktív formája) is disztrófiás kalcifikációt eredményezhet. Gyakran használt állatkísérleti modell a magas D vitamin bevitellel elért fokozott vaszkuláris kalcifikáció; a kalcitriol dózisfüggően fokozza a VSMC-kben a kalcifikációt és az ALP aktivitást egyaránt [53]. Uraemiás betegek kalcitriol kezelése gyakran vezet hiperkalcémiához és hiperfoszfatémiához, mely emeli az ektópiás meszesedés rizikóját. Újabb D vitamin analógok intenzív kutatás tárgyai, ezek a szerek csökkentik a PTH szintézist a szérum kalcium és foszfát szint emelése nélkül; valamint kalcium-mimetikus gyógyszerek kipróbálása folyik, melyek a mellékpajzsmirigy kalciumérzékelő receptorainak érzékenységét fokozzák. Az atherosclerotikus kardiovaszkuláris betegségekben orális antikoagulánsként gyakran használt warfarin fokozza a kalcifikációt a kalcium inhibitor MGP γ- karboxilációjának gátlása révén. Állatkísérletek szerint a warfarinnal kezelt patkányokban 5 hét után már RTG felvételen is kimutatható volt az aorta és az aortabillentyű meszesedése [54]. Tartósan warfarint szedő betegek CT vizsgálata fokozott coronariarendszer és szívbillentyű meszesedést igazolt a kontrollcsoporthoz képest [55]. A főként antiinflammatorikus hatásuk miatt használt glükokortikoidok is ektópiás kalcifikációt eredményeznek az oszteoblaszt differenciáció serkentése révén. Jól ismert, hogy a tartós glükokortikoid szedés oszteoporózissal jár együtt és az érfalban fokozott oszteokondrogenetikus differenciáció zajlik; a dexametazonnal kezelt VSMC-k oszteoblasztos átalakuláson mennek át [56]. Az érfalban lévő pericyták dexametazon kezelés hatására csökkent MGP és OPN expresszióval reagálnak, mely növeli az ALP aktivitást és a kalcium depozíciót [57].

12

A korábban már említett alkalikus foszfatáz (ALP) az oszteoblasztok fenotipikus markere, a fokozott ALP aktivitás együtt jár a vaszkuláris kalcifikációval. Az angolkór egy ritka, öröklődő formájában az ALP gén mutációját igazolták [58]. Az ALP aktivitása nélkülözhetetlen a hydroxyapatit keletkezéséhez az enchondralis csontosodás során, ez az érfalban is hasonlóan zajlik. A media kalcifikációban a VSMC-k is magasabb ALP aktivitást mutatnak és a klasszikus atherosclerotikus vaszkuláris kalcifikáció jellemzői (a BMP-2 és oxidált LDL) növelik a VSMC sejttenyészetek ALP aktivitását. Az ALP csökkenti az anorganikus pirofoszfát szintet, mely erős gátlója a vaszkuláris kalcifikációnak [59]. A vaszkuláris kalcifikáció egy másik feltételezett mechanizmusa a számos patológiás állapotban és az öregedéssel együtt járóan megfigyelhető fokozott arányú VSMC apoptózis. In vitro kísérletekkel igazolták, hogy az apoptózis gátlása csökkenti a kalcifikációt, illetve az apoptózis serkentése jelentősen növeli a kalcifikációt [60]. Az elpusztult habos macrophág sejtek és VSMC-k maradványai az élő VSMC-k mátrix veziculumaival együtt a magas kalcium és foszfát koncentráció miatt kedvező helyszínt jelentenek a kalcifikáció folyamatának megindulására [61]. Érdekes, hogy nem minden esetben vezetnek kalcifikációhoz a mátrix vezikulumok: normál élettani állapotban a jelenség nem indul meg, tartósan magas kalcium és foszfát szint szükséges a meszesedés kialakulásához. Az öregedés, a VSMC fenotípus változás és differenciáció egyaránt jelentősen elősegíti az atherosclerotikus meszesedést. A HSP-70 egy olyan akut fázis fehérje, mely a szérumban és atherosclerotikus plakkokban is kimutatható és a MGP-hez kapcsolódva gátolja annak működését, ezzel elősegíti az erek kalcifikációját. Ezenkívül a HSP-70 állatkísérletekben serkentette a BMP aktivitást, ezáltal is fokozva az artériás meszesedést [62]. 1. 2. 3. Az artériás kalcifikáció inhibitorai A vaszkuláris kalcifikáció másik alapvető szabályozási mechanizmusa a kalcifikációs folyamatok gátlása, melyeknek zavara szintén az érfal meszesedéséhez vezet. Számos szerkezeti és keringő protein létezik, mely normál körülmények között gátolja a vaszkuláris kalcifikációt. A fiziológiás szérum kalcium és foszfát szintek közel vannak a kicsapódási koncentrációhoz, ezért e gátló fehérjék megfelelő működése alapvető az ektópiás kalcifikáció megakadályozása szempontjából.

13

Az anorganikus pirofoszfát a vaszkuláris kalcifikáció potens inhibitora, az ALP szubsztrátja. A pirofoszfát direkt kémiai úton gátolja a hydroxyapatit képződést és a szöveti kalcium depozíció kialakulását. A pirofoszfát szintet szabályozó ekto-nukleotid pirofoszfatáz/foszfodieszteráz I (ENPP1) és a celluláris pirofoszfát exportáló ankyrin (ANK) hiánya a gyermekkori idiopátiás artériás kalcifikációhoz, valamint fokozott enchondrális kalcifikációhoz vezet [63, 64]. ENPP1 knockout egérben fokozott artériás kalcifikációt igazoltak [64]. E tanulmányok azt sugallják, hogy a pirofoszfát szint normalizálása az ALP gátlásával, a NPP 1 vagy ANK serkentésével elért intracelluláris pirofoszfát koncentráció emelése a vaszkuláris kalcifikáció gátlását eredményezheti. Ezt az elméletet támasztja alá, hogy korábbi vizsgálatok szerint a pirofoszfát analóg bifoszfonát etidronát csökkentette a dializált betegek vaszkuláris kalcifikációját [65]. A MPG több hatásmechanizmuson keresztül szabályozza a sejt differenciációt és kalcifikációt. A MGP gátolja a BMP-2 kötödését receptoraihoz, a MGP és a BMP-2 aránya meghatározza a kalcifikációs folyamatok lezajlásának lehetőségét (az alacsony, illetve túl magas szintek egyaránt kalcifikációhoz vezetnek) [66]. A MGP működéséhez fontos a protein γ – karboxylációja, mely K vitamint igényel. A γ – karboxylált MGP kalcium jelenlétében konformáció változáson megy át, mely a MGP – BMP-2 komplexum kialakuláshoz szükséges, ami megakadályozza a BMP-2 kötödéséét a BMP receptorhoz [67]. A γ – karboxylált MGP a plazmában a fetuin-A-hoz kötődik; a nem γ – karboxylált MGP forma mutat összefüggést a vaszkuláris kalcifikációval. Állatkísérletekben igazolták, hogy a MGP knockout egerekben atherosclerosis hiányában is intenzív artériás kalcifikáció alakul ki [68]. Humán vizsgálatokban a CTvel meghatározott coronaria kalcifikáció korrelál a szérum MGP szinttel, a MGP nincs jelen a normál érfalban, de kimutatható az artériás kalcifikáció helyszínén. Az eredmények azzal magyarázhatóak, hogy a szervezet igyekszik a kalcifikációt megakadályozni, majd ha ez folyamat nem elégséges, globálisan csökken a MGP szint, mely az atherosclerosis kialakulásához és az érfal kalcifikációjához vezet [69]. Arra utaló adatokat is publikáltak, hogy a MGP gén polimorfizmus és plakk kalcifikáció, illetve myocardiális infarktus között összefüggés van [70]. Az oszteopontin lokálisan ható adhezív molekula, mely a monocyta-makrofág rendszer működését szabályozza, illetve a makrofág és T sejtek cytokin termelését. Az OPN a mineralizáció hatékony inhibitora, proinflammatorikus tulajdonságokkal is rendelkezik

14

számos krónikus gyulladásos betegségben, pl. atherosclerosisban. A fenti két szerepét nehéz elkülöníteni, ennek tisztázása folyamatban van [71]. Az oszteoprotegerin (OPG) a TNF család tagja és része az OPG – NF-κB receptor aktivátor komplexnek. Ez a cytokin hálózat szabályozza az oszteoklaszt differenciációt és aktiválódást, ezzel súlyponti szerepet játszik a csontképződés és csontreszorpció folyamatában [72]. Az OPG a szervezet számos helyén megtalálható, pl. a csontban és az érrendszerben (főként a VSMC-kben) is. Humán vizsgálatok magasabb szérum OPG szinteket igazolták coronaria betegekben, perifériás atherosclerotikus betegekben és carotis stenosissal rendelkező betegekben. Nem egyértelmű jelenleg, hogy az OPG a vaszkuláris kalcifikáció markere vagy mediátora, de biztosan szerepet játszik a kalcifikáción kívül krónikus inflammatorikus folyamatokban és az apoptózisban is [73]. A fetuin-A, - mely a kalcifikáció szisztémásan ható fontos inhibitora -, szerepe később kerül taglalásra. A vaszkuláris kalcifikáció kialakulásához vezető folyamatok összefoglaló ábrája segíthet a fent felsorolt elméletek együttes megértésében (1. ábra). Gátló mechanizmusok hiánya

Hiperfoszfatémia

Pirofoszfát

Fetuin-A MGP OPN Pirofoszfát

Hiperkalcémia

Lipidek Citokinek

Ca x P

Csontképződés indukció

Vaszkuláris kalcifikáció

Ca és P tartalmú matrix vezikulumok

Apoptotikus testek és nekrotikus maradványok

Keringő nidusképző komplexek

Sejthalál

Csont remodeling

1. ábra: A vaszkuláris kalcifikációt magyarázó, egymást nem kizáró elméletek vázlatos illusztrációja (Giachelli után módosítva, Giachelli, CM, Vascular calcification mechanisms, J Am Soc Nephrol, 2004, 15: 2959-64) [74]

15

1. 2. 4. Az artériás kalcifikáció típusai Klinikailag a kardiovaszkuláris kalcifikáció 4 típusát különítjük el: atherosclerotikus kalcifikáció, a közepes artériák Mönckeberg-féle media sclerosisa, szívbillentyű meszesedés és a calciphylaxis. A 4 típus különálló, de egymást gyakran átfedő patológiai mechanizmus (különösen az atherosclerotikus és a mediasclerotikus formákat nehéz egymástól elkülöníteni). Az atherosclerotikus kalcifikáció az atherosclerotikus plakkokban jelentkezik, ahol sejt nekrózis, gyulladásos jelenségek, koleszterin lerakódás zajlik, ahová az ox-LDL Tsejteket és makrofágokat vonz. Az atherosclerotikus kalcifikáció az enchondrális csontosodáshoz hasonlóan zajlik: chondrogenezis előzi meg az oszteoblaszt indukciót és a lamelláris csontképződést. Ahogy a folyamat előrehalad, az oszteogenezis válik uralkodóvá, mely a műtétek során és patológiai mintákban is jól látható [75]. A közepes artériák Mönckeberg-féle sclerosisa az atherosclerotikus kalcifikációval szemben a tunica mediában jelentkezik, a folyamat a mátrix vezikulum mediálta intramembrán csontképződéshez hasonlít, ahol nincs köztes porcképződés. Ez a folyamat gyakran észlelhető cukorbetegségben, krónikus vesebetegségben, idős korban és gyakran figyelhető meg natív röntgenfelvételeken [76]. Mönckeberg-féle sclerosisban kifejezetten gyakori az emelkedett szisztolés-diasztolés nyomás különbség és a bal kamra hypertrophia, melyek az epidemiológiai adatok alapján mindketten jelentősen

fokozott

rizikót

jelentenek

coronariasclerosis,

amputáció,

további

kardiovaszkuláris megbetegedés és mortalitás szempontjából, különösen diabétesz és uraemia együttes előfordulása esetén [77]. A szívbillentyűk meszesedése egy amorfabb, kevésbé strukturált folyamat, mely mind a media sclerosis, mind az atherosclerotikus kalcifikáció egyes jellemzőivel rendelkezik. Úgy tűnik, a valvuláris kalcifikáció elsődleges ingere a billentyűkre ható mechanikai stressz és a gyulladásos folyamat kombinációja. Az endothelium sérülés hatására a billentyűkben makrofág és T-sejt infiltráció jelentkezik, majd a lymphocyta infiltráció területén a myofibroblastok és preosteoblastok BMP-2-t és BMP-4-t expresszálnak [33]. A szívbillentyűkben további oszteoblaszt differenciációt elősegítő faktorokat is kimutattak, pl. Cbfa1-t és oszteokalcint. A billentyűk meszesedésének patológiai vizsgálata szintén lamelláris csontképződést mutat. Kongenitális bikuszpidális

16

aortabillentyű estén már a beteg 30 éves korában kimutatható a billentyű meszesedése, mely a billentyűre ilyenkor ható fokozott mechanikai stressz következménye [78]. Az előző típusoktól eltérően a calciphylaxis egy kiterjedtebb folyamat, mely főként a kis artériák és arteriolák tunica médiájának kalcifikációját jelenti és szöveti nekrózist eredményező intima proliferációval jár együtt. A jelenség nagy területű szubkután lágyrész meszesedéshez vezet, mely akkor alakul ki, ha a fiziológiás kalcium-foszfát szintet meghaladó ion szintek állandósulnak. A calciphylaxis az aktív csontképződési folyamatoktól független, ritka jelenség, mely a jelentős, diffúz szöveti nekrózis miatt igen magas mortalitással jár (60-80%) [79, 80]. 1. 3. A FETUIN-A JELLEMZŐI A fetuin-A-t vagy korábbi nevén alfa-2 Heremans Schmid glikoproteint (AHSG) Heremans és Schmid 1960-ban és 1961-ben fedezte fel kérődző állatok magzatában [81]. Két különböző néven (α2-Z-globulin és Ba-α2-glikoprotein) írták le a molekulát egymástól függetlenül, majd egy évvel később Schultze mutatta ki, hogy a két fehérje elektroforetikus mobilitását és immunreaktivitását tekintve azonos, ő adta a protein mai használatos egyik nevét az első leírók kezdőbetűje alapján, ma már inkább a fetuin-A elnevezéssel találkozunk az irodalomban. A fetuin-A-t felnőttekben a májban a hepatocyták termelik, relatíve magas koncentrációban található fiziológiás körülmények között is a szérumban (500-700 μg/ml), emellett megtalálható a vizeletben, a cerebrospinális liquorban, a nyálban, az ondóban is, de legnagyobb koncentrációban a csontokban és a dentinben fordul elő. Kiválasztási mechanizmusai pontosan nem ismertek, de tudjuk, hogy lebomlása részben asialoglycoprotein receptorokon keresztül történik, illetve komplex formációt (fetuin-A+MGP+kalciumfoszfát) követően a vese választja ki. A szérumban fél életideje néhány nap. 1. 3. 1. A fetuin-A szerkezete és genetikája A humán fetuin-A két polipeptidláncból áll, (A lánc: 282, B lánc: 27 aminosav), melyeket diszulfid híd köt össze. A fetuin-A két lánca egy proproteinből hasad le, melyet egy mRNS kódol. A két lánc között egy 40 aminosavból álló összekötő szakasz helyezkedik el, melyből változó hosszúságú szakaszok hasadhatnak le [82]. Az A láncon 12 cisztein található, mely hat diszulfid hidat alkot, ezek közül egy a

17

molekula két láncát köti össze. A hurkok lineáris, tandemszerű elhelyezkedése arra utal, hogy a molekula génkettőződés útján alakult ki az evolúció során. Mindegyik homológ hurokpár egy úgynevezett cisztatin domaint képez, mely a molekula konzervált régiója. Ennek alapján a fetuin-A-t cisztatinfehérjék családjába soroljuk. Az ide tartozó cisztatinokról és kininogénekről ismert, hogy ciszteinproteáz-gátlók, a fetuin-A cisztatin domainjéről ezt eddig nem igazolták [83]. A fetuin-A-t először kérődzők foetusában írták le, de később számos fajban kimutatták. Az emberi és a többi fajból származó fetuin-A hasonlóságára vonatkozóan azt találták, hogy a bovin fetuin cDNS sorrendje 70%-ban egyezik az emberével; az egér és patkány fetuin 50-60%-os azonosságot mutat az emberi fetuinA aminosav szekvenciájával. Emberben a 3. kromoszóma q27 szakaszán található a fetuin-A-t kódoló gén, több állatfajban is azonosították a fetuin-A gént. A fetuin-A kimutatására szolgáló antitestek ma már kereskedelmi forgalomban elérhetők; ELISA és Western blot módszerekkel használják a kecskéből, csirkéből vagy egérből előállított antitesteket. Rekombináns fetuin-A-t is előállítottak, mely 100-szor aktívabb, mint a humán szérumból izolált forma. A fetuin-A gén polimorfizmusa ismert (single-nucleotide polymorphysm: SNP) Osawa munkásságából [84]. A genetikai különbözőségek befolyásolhatják a fetuin-A szintet, ezáltal alapvetően befolyásolhatják az artériás kalcifikáció létrejöttét, illetve annak súlyosságát. Egy a fetuin-A polimorfizmusát vizsgáló tanulmány dializált betegekben kimutatta, hogy az egyik SNP, a 256 Thr/Ser genotípus szignifikánsan alacsonyabb fetuin-A szérum szinttel jár együtt, ugyanez az allél magasabb mortalitással volt kapcsolatban és a korreláció a vesepótló kezelés hosszával arányosan erősödött [85]. Egy másik (egészséges egyedeket tanulmányozó) vizsgálat a szérum foszfát és fetuin-A szinttel mutatott ki szignifikáns összefüggést a fetuin-A gén SNP-ket összehasonlítva [86]. Ebben a vizsgálatban a szérum kalcium szint nem korellált sem a foszfát, sem a fetuin-A szérum szinttel, illetve a különböző SNP-kel sem igazolódott összefüggés. A fetuin-A polimorfizmus és a myocardiális infarktus ok-okozati kapcsolata mellett szól Fisher és mtsai vizsgálata, mely egy prospektív európai vizsgálat betegeiben összefüggést talált a különböző fetuin-A gén SNP-k, a fetuin-A szérum szint és a kardiovaszkuláris mortalitás között [87]. Panaszt nem okozó atherosclerosissal rendelkező cukorbetegek (2-es típusú diabetes mellitus) vizsgálata során összefüggést

18

találtak a különböző fetuin-A gén SNP-k és a CT vizsgálattal meghatározott coronaria kalcifikáció súlyossága között [88]. Ez az eredmény függetlennek bizonyult más klinikai változókat (kor, nem, dohányzási szokás, lipidcsökkentő gyógyszerek szedése) figyelembe véve is; azonban a carotis kalcifikációval és az UH-gal meghatározott IMTvel a SNP-k nem voltak kapcsolatban. 1. 3. 2. A fetuin-a hatásai A fetuin-A humán embrióban végzett vizsgálatai arra utalnak, hogy fontos szerepe van az embrionális szervek, elsősorban az agykéreg és a csontok fejlődésében. Állatkísérletek igazolták, hogy különböző fajok magzataiban számos szerv szöveteiben a fetuin szint többszöröse a kifejlett állatok fetuin szintjéhez viszonyítva, mely szintén a szervfejlődés korai szakaszában betöltött szerepét támasztja alá. A szervezet védekező mechanizmusai részét képező akut fázis válaszreakció során számos, zömében a májban termelődő fehérje szintje jelentősen megváltozik. Legtöbbjük szérum szintje emelkedik (pl. C-reaktív protein, komplement rendszer), néhányuké csökken (negatív akut fázis fehéjék: pl. fetuin-A, albumin, transzferrin). A fetuin-A szérumkoncentrációjának csökkenését számos olyan állapotban kimutatták, melyben akut fázis reakció zajlik: csonttöréssel vagy égéssel járó trauma esetében, súlyos bakteriális infekcióban, myocardiális infarktusban, protein és energia hiányban, alkoholos májcirrózisban, malignus tumorokban [89, 90]. Másodlagos fertőzés és citosztatikus kezelés tovább csökkentette a fetuin-A szérum szintjét. A krónikus és akut májbetegségek esetén a gyulladásos folyamatokban résztvevő cytokinek hatása és a máj parenchyma pusztulás egyaránt felelős az alacsony fetuinA szintért. A szintén negatív akut fázis fehérjék közé tartozó transzferrin és hisztidinben gazdag glycoprotein génjei a fetuin-A gén szomszédságában helyezkednek el a 3. kromoszómán. A stressz reakció során a csökkenő fetuin-A a lymphoblasztos proliferáció fokozódását eredményezi, mely a gyulladást kiváltó tényező hatásosabb eliminációjához vezet. Másik elképzelés szerint a fetuin-A a TGF-β természetes antagonistája, így a fetuin-A csökkenés a TGF-β szint emelése révén serkenti a szöveti regenerációt, az extracelluláris mátrix képződést. A cytokinek közül az IL-1 és a TNF-α gátolják a negatív akut fázis fehéjék, így a fetuin-A szintézisét.

19

Krónikus hatásai között az egyik legfontosabbnak a diabetes mellitusban betöltött szerepe tűnik. In vitro és állatkísérletek igazolták, hogy a fetuin-A az inzulin receptor tirozin kináz aktivitását gátolja [91]. Ezt megerősítette az az egerekben végzett kísérlet, mely során fetuin-A knockout állatokban a glükóz és inzulin tolerancia tesztek során jelentősen fokozott glükóz elimináló képességet és inzulin érzékenységet mutattak ki [92]. A posztprandiális cukorterhelés szabályozása mellett a fetuin-A a súlygyarapodás és zsírlerakódás mechanizmusában is szerepet játszik, ezáltal therápiás lehetőséget jelenthet a 2 típusú diabétesz, az elhízás és más inzulin rezisztenciával járó állapotokban is. Humán vizsgálatok során egészséges, nem cukorbeteg populációban is igazolták a magasabb fetuin-A szint és az inzulin rezisztencia összefüggését [93]. A diabétesz mellett a metabolikus szindrómával is kapcsolatot mutat a fetuin-A: magasabb szérum fetuin-A koncentrációval rendelkező csoportban szignifikánsan több volt a metabolikus szindrómás beteg egy nem diabéteszes, coronaria beteg populációban [94]. Utánkövetéses vizsgálatok is amellett szólnak, hogy a magasabb fetuin-A szint összefüggésben van a gyakoribb diabétesz kialakulással. Ix és mtsai nagy beteganyagban vizsgálták a diabétesz megjelenésének és a fetuin-A szintjének kapcsolatát: 70 éve feletti jó általános állapotú betegeket követtek és eredményeik szerint a magasabb fetuin-A szintű betegek közül lényegesen nagyobb számban jelentkezik a diabétesz, mint az alacsony fetuin-A szinttel rendelkező csoportban [95]. A fetuin-A fontos gátló szerepet játszik a MMP-k működésének szabályozásában is. Az MMP-k a fiziológiás és patológiás szöveti remodellingben játszanak szerepet, aktivitásukat számos mechanizmus szabályozza. Az MMP működés regulációjának felborulása pl. az érfal szerkezetének kóros elváltozásához vezethet. Állatkísérletek igazolták [96], hogy a fetuin-A megóvja a MMP-9-t az egyébként fiziológiás körülmények között történő autolízistől, így a MMP-k hatása tartósabb, mely pl. az aneurizma képződés egyik fontos tényezője lehet [97]. A kardiovaszkuláris betegségek és az oszteoporózis két gyakori és nehezen kezelhető betegség a fejlett társadalmakban. Két különálló betegségről van szó, de az utóbbi évtizedekben számos vizsgálat szerint van kapcsolat köztük. Mindkettő gyakoribbá és súlyosabbá válik az öregedéssel, és patomechanizmusokban is számos hasonló, illetve közös folyamatra derült fény. A menopauza, a dyslipidaemia, krónikus

20

gyulladásos állapotok, hiperhomociszteinémia, hipertónia és a diabétesz jól ismert rizikótényezői az atherosclerosisnak, de növelik a csontritkulás esélyét is. A magas LDL, az alacsony HDL szint csökkent csontsűrűsséggel jár együtt, a lipid anyagcsere zavara fokozott csont remodelling-hez vezet. A sztatinok anti-atherogenetikus hatásuk mellett a csontépülést is elősegítik. Az oszteoporózisban használt foszfátcsökkentő szerek az atherogenezist is gátolják [98]. A két mindennapjainkat megkeserítő folyamat közötti összekötő kapcsok kutatása folyamatban van, az egyik ilyen lehetőség a fetuin-A. A fetuin-A-ról tudjuk, hogy gátolja a Ca X PO4 precipitációt, a csont és ásványi anyagcserében egyaránt szerepet játszik, a magzati csontfejlődésben nélkülözhetetlen, az atherosclerotikus plakkokban kalcifikáció esetén koncentrációja emelkedett. Egy a csontritkulást és az atherosclerosist egyszerre vizsgáló tanulmány szerint az atherosclerotikus betegek csont tömege a lumbális gerinc és a femur nyak területén szignifikánsan kisebb volt az egészséges kontrollcsoporthoz képest, míg a fetuin-A szérumszintje magasabb volt a beteg csoportban [99]. Mások szerint [100] a két betegség csak véletlen egybeesés miatt fordul elő egyszerre, a közvetlen kapcsolat az oszteoporózis és az atherosclerosissal együtt járó kalcifikáció között nem bizonyítható, esetleg a tartós ösztrogén deficiencia játszhat szerepet kialakulásukban. 1. 3. 3. A fetuin-A kapcsolata az artériás kalcifikációval és az atherosclerosissal Vizsgálataink szempontjából a legérdekesebb a fetuin-A és az atherosclerosis, azon belül is az artériás kalcifikáció kapcsolata. A fetuin-A in vitro vizsgálatok szerint erősen gátolja a kalcium sók precipitációját és a hydroxyapatit képződést, mely a csontképződés alapvető folyamata [101]. Fetuin-A hiányos egérben végzett kísérletek igazolták, hogy fetuin-A hiányában súlyos ektópiás kalcifikáció alakul ki ásványi anyagban és D-vitaminban gazdag diétán tartott egerekben [102]. (1. kép)

21

Vad típustípus Vad

Fetuin-A knockout 1. kép: Vad típusú és fetuin-A hiányos egér natív RTG felvétele (Fetuin-A knockout egér kép forrása: www.iff.kfa-juelich.de, készítette: Willi Jahnen-Dechent, RWTH Aachen University, 2007) A humán vizsgálatok nagy része egy olyan populációból származik, melyben közismert a kifejezett, diffúz, előrehaladott extraosszeális kalcifikáció: a dialízist igénylő krónikus uraemiás betegek csoportja. Ebben a betegcsoportban az ektópiás kalcifikáció egyik gyakori helyszíne az artériás rendszer. A kiterjedt kalcifikáció az érrendszer rigiditásával, az atherosclerosis talaján kialakult meszes plakkok gyors progressziójával,

hipertóniával,

fokozott

kardiovaszkuláris

morbiditással

és

mortalitással jár. A dializált krónikus vesebetegekben az alacsonyabb fetuin-A szint összefüggést mutat a magasabb kardiovaszkuláris és összes halálozással [103]. A dializált betegek szérum mintáiban a fetuin-A koncentráció alacsonyabb volt a kontroll, egészséges emberekéhez képest, és ex vivo kevésbé gátolták a Ca x PO4 kicsapódást. Tisztított fetuin-A adása a szérumhoz visszaállította annak precipitáció gátló tulajdonságát. A dializált betegek CRP szintje fordított korrelációban áll a fetuin-A szinttel. Ennek oka valószínűen az, hogy mindkét protein szerepet játszik az akut fázis reakcióban, de míg a CRP szint emelkedik, a fetuin-A szint csökkent akut stressz helyzetekben. A gyulladással járó állapotok önmagukban csökkenthetik a

22

fetuin-A szintet, ezért nehéz annak eldöntése, hogy krónikus gyulladásos állapotként is értelmezhető rendszeres dialízis vezet-e a fetuin-A szérum szintjének csökkenéséhez, vagy egymástól független jelenségről van szó. A dialízis fajtája (hemodialízis vagy peritoneális dialízis) nem befolyásolta a fetuin-A és a mortalitás kapcsolatát [104]. Mindkét dialízis kezelés módozat tartósan beültetett idegen testtel jár (centrális vénás vagy hasűri kanül), illetve hetente háromszori transzkután punctióval jár; ezen eljárások mindegyike potenciálisan fertőzéssel jár, bacterémiát okozhat. A dializált vesebetegek egy részében diabéteszes nephropathia áll a veseelégtelenség hátterében; ellentmondó adatok találhatóak a fetuin-A-val kapcsolatban, ha a diabéteszt és a krónikus veseelégtelenséget külön vizsgáljuk. A vesebetegek fetuin-A szintje alacsonyabb, a diabéteszes csoport fetuin-A szintje magasabb a kontrollcsoportokénál, ennek oka a fetuin-A különböző hatásaival (kalcifikációt gátló, illetve inzulin rezisztenciát eredményező) magyarázható [105]. A vizsgálatok többsége a dializált, végstádiumú (5. stádium) vesebetegek adatain alapszik, Ix és mtsai vizsgálata szerint az enyhe és mérsékelt krónikus vesebetegségben szenvedő betegek fetuin-A szintje nem mutatott összefüggést a vesefunctiós értékekkel [106] és a 3. – 4. stádiumú krónikus vesebetegek mortalitása sem mutatott összefüggést a szérum fetuin-A szinttel [107]. A betegek artériás kalcifikációjának vizsgálati módszereinek értéke nem egyértelmű. A különböző diagnosztikai eljárások jellegükből adódóan más-más módon határozzák meg a kalcifikáció jelenlétét és annak súlyosságát. Az érfal meszesedésének vizsgálatára natív radiológiai felvétel (2. kép), az ultrahang vizsgálat (3. kép), a CT (4. kép), szövettani vizsgálat egyaránt alkalmas lehet.

23

2. kép: Natív RTG felvételen látható a kétoldali, diffúz arteria femoralis superficialis és profunda meszesedés (klinikánk anyagából)

3. kép: Duplex UH felvételen a meszes plakk jól ábrázolódik a mögöttes hangárnyékkal a carotis oszlás vizsgálatakor (klinikánk anyagából)

24

4. kép: Natív CT mutatja az infrarenalis aorta szakasz falában a körkörös meszesedést (klinikánk anyagából)

A szisztémásan jelenlévő fetuin-A általános kalcifikációt befolyásoló hatásának vizsgálatára a minél több érszakaszt vizsgáló eljárás lenne ideális. Az irodalomban a natív radiológiai vizsgálatra adat nincs, ez az eljárás a meszesedés kvantifikálására nem alkalmas. Az ultrahang vizsgálatok a kalcifikációt jól mutatják, a mennyiségi meghatározás nem lehetséges, de ha a szervezet több pontján végzünk vizsgálatot, az jól kifejezi a meszesedés szisztémás jellegét [108]. Echocardiographián alapuló kalcifikáció meghatározásként több vizsgálat alkalmazza az aorta, a mitrális billentyű meszesedésének megítélését. E vizsgálatok során az alacsony fetuin-A szint összefüggést mutatott a fokozott szívbillentyű meszesedéssel vesebetegekben és normál

vesefunkciójú

betegekben

is

[109-111].

A

pusztán

szívbillentyű

meszesedéssel becsült általános kalcifikáció mérés nem pontos, de elfogadott módszer. Az ultrahang vizsgálat további, indirekt alkalmazása a carotis oszlások intima-média vastagságának mérése, mely indirekten az atherosclerosisra jellemző falvastagság növekedés meghatározásából következtet a meszesedésre [112]. A

25

carotis stenosis duplex ultrahang vizsgálattal történő mérése mindennapos, klinikai relavanciával rendelkező gyakorlat, mely jól korrelál az atherosclerosis lokális súlyosságával, így közvetve a kalcifikációval. CT vizsgálattal (multi-slice CT) meghatározható a koszorúerek kalcifikációjának mértéke. Különböző score rendszereket dolgoztak ki (pl. Agatston score), melyek a coronariák meszesedésének mértékét (Hounsfield egységben kifejezve) és kiterjedését számszerűsítik. Előnyük, hogy relatíve hosszabb érszakasz vizsgálatán alapulnak, hátrányuk a drágaság és az ellentmondó reprodukálhatósági arány [113, 114]. A boka-kar index Doppler UH vizsgálattal történő meghatározása egyszerű vizsgálat, mely az atherosclerosis klinikai súlyosságával áll kapcsolatban, előnye egyszerűsége, széles körben történt elterjedtsége, olcsósága, azonban kalcifikáció megítélésére csak korlátozottan alkalmas. Az angiográfiás felvételek Bollinger score szerinti elemzése hosszú érszakaszon ad számszerűsített információt az atherosclerosis súlyosságáról, de a kalcifikáció szempontjából ez is indirekt metódus [115]. Nem invazív vizsgálatként említést érdemel az artériás stiffness vizsgálat, mely az artériás rendszer rigiditására jellemző értékeket ad, mely összefügghet a kalcifikáció mértékével. Ez a vizsgálati típus széles körben még nem terjedt el, validitása nem egyértelműen

igazolt,

különösen

a

vizsgálatunkban

szereplő

előrehaladott

érbetegekben kérdéses pontossága [116]. A kalcifikáció jelenléte egyértelműen az esetleges műtét során eltávolított szövetminták patológiai feldolgozásával igazolható, de ez jellegéből adódóan csak korlátozottan hozzáférhető, pusztán a lokális viszonyokat tükrözi, nehezen kvantifikálható, az irodalmi hivatkozások is ritkák [117]. A fetuin-A és az artériás kalcifikáció tanulmányozása során a különböző vizsgálatok igen heterogén populációkat elemeztek, melyek nehezen összehasonlíthatóak. A szubklinikus atherosclerosistól a súlyos érszűkületes betegig széles a skála. Tovább bonyolítja az összevetést, hogy a betegek egy része coronariasclerosisban szenved vagy myocardiális infarktuson esett át, más része peripheriás érbeteg. Ez utóbbi a carotis stenosistól az aorta kalcifikáción át az alsó végtagi obliteratív érbetegségig terjedhet. Mindegyik csoport értékelését nehezíti továbbá a vesebetegség különböző stádiuma, a diabétesz megléte vagy hiánya, az akut stressz állapotban vagy krónikus

26

státuszban végzett mintavétel. A fetuin-A szintet potenciálisan befolyásoló tényezők és a fetuin-A legfontosabb lehetséges hatásait mutatja a 2. ábra. Dialízis kezelés

Uraemia

Polimorfizmus

Gyulladás

?

Lehetséges módosító tényezők: Szteroidok ?

Gyulladásgátlók

Fetuin-A

Sztatinok Dializátum

?

? TGF –β hatás Csontképződés ?

Inzulin receptor tirozin kináz Inzulin érzékenység ?

Kardiovaszkuláris és lágyrész kalcifikáció (calcyphylaxis?)

2. ábra: A fetuin-A termelődésének és hatásainak vázlatos összegzése (Ketteler és mtsai után módosítva [118])

27

2. CÉLKITŰZÉSEK Vizsgálatainkkal azt kívántuk tanulmányozni, hogy a fetuin-A artériás kalcifikációt gátló szerepére utaló összefüggések igazolhatóak-e humán atherosclerotikus, nem uraemiás beteganyagban. 2. 1. Van-e összefüggés a szérum fetuin-A szint és az artériás kalcifikáció között krónikus alsó végtagi atherosclerotikus, nem uraemiás betegekben? Számos munkacsoport szerint a szérum fetuin-A szint alacsonyabb atherosclerotikus betegekben, mint a kontroll csoportban és kapcsolatban állhat a kardiovaszkuláris mortalitással. Az adatok nagy része uraemiás, haemodializált betegek vizsgálatán alapszik. A krónikus uraemia vagy önmagában a haemodialízis kezelés állandósult, krónikus

gyulladást

fenntartva

befolyásolhatja

a

fetuin-A

szintet.

Ennek

kiküszöbölése céljából végeztük vizsgálatunkat nem haemodializált atherosclerotikus betegeken. Arra kerestük a választ, hogy a szérum fetuin-A szint és az artériás kalcifikáció kapcsolata kimutatható-e ebben a betegcsoportban is. 2. 2. Van-e különbség az eltérő etiológiájú aorta aneurizmával rendelkező betegek szérum fetuin-A szintje között? Az aorta aneurizmák kialakulásának pontos patofiziológiája ma sem tisztázott. Az öröklött kötőszöveti rendellenességgel bíró betegek (pl. Marfan szindróma) és az aorta aneurizma kapcsolata ismert. Az aorta aneurizmával rendelkező betegek túlnyomó többsége azonban atherosclerosisban szenved, ebben a csoportban nem ismert pontosan az aorta dilatációjának mechanizmusa. Az artériás kalcifikációban szerepet játszó fetuin-A szintjét aneurizmatikus betegségekben még nem vizsgálták. Vizsgálatunkban arra voltunk kíváncsiak, hogy különbözik-e a szérum fetuin-A szintje két eltérő etiológiájú (Marfan szindróma és atherosclerosis), de hasonló morphológiai (aorta aneurizma) megjelenésű betegcsoportban. 2. 3. Van-e összefüggés a perifériás érbetegek szérum HSP 70 szintje és az artériás kalcifikáció mértéke, valamint a szérum fetuin-A szintje között?

28

A nem tradicionális atherosclerosis rizikótényezők közül a HSP 70 szintje pontosan nem tisztázott kapcsolatban áll az atherosclerosissal. Az artériás kalcifikáció mértékének mérése különböző módszerekkel történt több munkacsoportnál. Vizsgálatunkban az atherosclerosis és az artériás kalcifikáció súlyosságát több módszerrel mértük: Fontaine klasszifikáció, ABI, duplex UH vizsgálattal mért carotis IMT, UH vizsgálattal meghatározott általános kalcifikációs score. Az akut stressz állapotokban a HSP 70 szint emelkedhet, ezért vizsgálatunkban a krónikus betegekben mértük szintjét. Arra kerestük a választ, hogy a HSP 70-nek van-e kapcsolata az artériás kalcifikációval és más nem tradicionális rizikótényezőkkel (fetuin-A, homocisztein).

29

3. MÓDSZEREK 3. 1. VIZSGÁLT BETEGCSOPORTOK ÉS VIZSGÁLATI TERVEK 3. 1. 1. Krónikus alsó végtagi ischaemiában szenvedő betegek keresztmetszeti vizsgálata (1. betegcsoport) A vizsgálatba 93 beteget vontunk be a Semmelweis Egyetem Érsebészeti Klinikáján 2009. 01. 01. és 2009. 07. 31. között. A vizsgálatba történő bevonás szempontjából a klinika ambulanciáján, illetve az érsebészeti osztályon jelentkező összes beteget figyelembe vettük, akinek krónikus alsó végtagi ischaemiája volt, mely atherosclerosis talaján alakult ki és a vizsgálatba beleegyezett. Kizárási kritérium volt, ha a beteg akut ischaemia tüneteivel jelentkezett, ha klinikai jelek infectióra utaltak, ha a beteg malignus tumorral rendelkezett, ha a betegnek akut vagy krónikus májbetegsége volt, ha dialízis kezelésben részesült, ha a beteg bármilyen okból immunszupresszív kezelés alatt állt, ha 6 hónapon belül stroke-ot, myocardiális infarktust szenvedett el, bármilyen ér- vagy szívműtéten (beleértve a percutan intervenciókat is) vagy egyéb súlyos betegségen vagy műtéten esett át. Minden beteggel kitöltöttük a vizsgálat számára készített demográfiai adatokat, életmód jellemzőket

tartalmazó

kérdőívet,

felvettük

anamnézisét,

részletes

fizikális

vizsgálaton esett át. A beteg panaszai alapján klinikai stádium beosztásként a Fontaine klasszifikációt rögzítettük. Mindkét alsó végtagon megmértük a boka–kar indexet, éhomi vénás vérmintákat vettünk, duplex ultrahang vizsgálttal megmértük az artéria carotis interna eredésénél lévő esetleges szűkületet és megmértük az intimamédia vastagságot. A test hét pontján UH vizsgálattal ítéltük meg az artériás rendszer kalcifikációját. Akiknél klinikai szempontból angiográfia szükséges volt, a felvételek elemzésével megállapítottuk az alsó végtagi artériák atherosclerosisára jellemző Bollinger score-t. A vizsgálat protokollját (a következő két csoporttal együtt) a Semmelweis Egyetem Regionális Tudományos és Kutatásetikai Bizottsága engedélyezte.

30

3. 1. 2. Aorta aneurizmával rendelkező betegek keresztmetszeti vizsgálata (2. betegcsoport) A vizsgálatba 45 aorta aneurizmás beteget vontunk be, akik a Semmelweis Egyetem Érsebészeti Klinikáján 2009. 01. 01. és 2009. 07. 31. között jelentkeztek aneurizma beutaló diagnózissal vagy korábban (6 hónapon túl) aneurizma miatt műtéten estek át. Amennyiben a vizsgálatban történő részvételbe a beteg felvilágosítás után írásban beleegyezett, kitöltöttük a vizsgálat számára készített demográfiai adatokat, életmód jellemzőket

tartalmazó

kérdőívet,

felvettük

anamnézisét,

részletes

fizikális

vizsgálaton esett át. A kizárási kritériumok megegyeztek a 3.1.1. pontban szereplőkkel (ld. fenn). Mindkét alsó végtagon megmértük a boka–kar indexet, éhomi vénás vérmintákat vettünk, duplex ultrahang vizsgálttal megmértük az artéria carotis interna eredésénél lévő esetleges szűkületet és megmértük az intima-média vastagságot. A test hét pontján UH vizsgálattal ítéltük meg az artériás rendszer kalcifikációját. Kontroll csoportként 30 egészséges véradó szerepelt, akiknél arteriosclerosisra utaló panasz vagy tünet nem volt tapasztalható, illetve 30 peripheriás atherosclerosisban szenvedő beteg, akiket az előző vizsgálati csoportból random választottunk ki. 3. 1. 3. Peripheriás érbetegek keresztmetszeti vizsgálata a HSP 70, a fetuin-A és az artériás kalcifikáció szempontjából (3. betegcsoport) A vizsgálatba 180 alsó végtagi és/vagy carotis arteriosclerosissal rendelkező beteget vontunk be a Semmelweis Egyetem Érsebészeti Klinikáján 2009. 01. 01. és 2009. 07. 31. között. Amennyiben a vizsgálatban történő részvételbe a beteg felvilágosítás után írásban beleegyezett, kitöltöttük a vizsgálat számára készített demográfiai adatokat, életmód jellemzőket tartalmazó kérdőívet, felvettük anamnézisét, részletes fizikális vizsgálaton esett át. A kizárási kritériumok megegyeztek a 3.1.1. pontban szereplőkkel (ld. fenn). Mindkét alsó végtagon megmértük a boka–kar indexet, éhomi vénás vérmintákat vettünk, duplex ultrahang vizsgálttal megmértük az artéria carotis interna eredésénél lévő esetleges szűkületet és megmértük az intima-média vastagságot. A test hét pontján UH vizsgálattal ítéltük meg az artériás rendszer kalcifikációját.

31

3. 2. VIZSGÁLATI MÓDSZEREK

3. 2. 1. Klinikai vizsgálatok A betegek bevonása után a vizsgálatunk számára készített kérdőívet töltöttük ki a beteggel, mely kérdéseket tartalmaz a beteg demográfiai adatairól, életmódjáról, az atherosclerosis szempontjából szóba jövő rizikótényezőkről, korábbi és jelenlegi betegségekről, műtétekről, gyógyszerszedésről, beépített idegentestről (1. táblázat). 1. táblázat: Fetuin-A vizsgálati adatlap

Beteg adatlap – Fetuin-A

Vizsgálati azonosító:

Demográfia

Status

Név

Carotis stenosis (tünet, %, oldal, sebesség)

TAJ

Alsó végtagi panaszok

Születési idő

Dysbasiás távolság

Cím

Fontaine beosztás

Telefon

Pulzus status

Adatlap kitöltésének ideje

Doppler boka-kar index

Súly

Aneurizma (Marfan)

Magasság Haskörfogat

Anamnézis Diabétesz I-II

Májbetegség

Menopauza

Uraemia/dialízis

Dohányzás

Infekció (akut/krónikus)

Osteoporosis

Malignus betegség

Hipertónia

Immunszuppresszió

ISZB/AMI

Idegen test jelenléte

Stroke

Gyógyszerek

32

A testtömeg indexet (body mass index: BMI) a testtömeg (kg) és a testmagasság (m) négyzetének hányadosaként határoztuk meg. Hipertóniásnak a kezelt hipertónia betegséggel rendelkezőket tekintettük; kezelt diabetes mellitus esetén tartottuk a beteget diabéteszesnek. A metabolikus szindrómát Alberti és mtsai tanulmánya alapján határoztuk meg [119]: metabolikus szindróma diagnózisa akkor állítható fel, ha a beteg haskörfogata meghaladja a 94 cm-t (férfiak), ill. a 80 cm-t (nők) és bármelyik két feltétel teljesül a következőkből: kezelt hyperlipidaemia, emelkedett triglicerid szint (> 1,7 mmol/L), alacsony HDL-koleszterin (< 1,03 mmol/L – férfi és < 1,29 mmol/L - nő), kezelt hipertónia, emelkedett éhomi vércukorszint

(≥ 5,6 mmol/L) és

korábban

diagnosztizált diabetes mellitus (2-es típus). A klasszikus Fontaine beosztást alkalmaztuk a krónikus alsó végtagi atherosclerosis klinikai súlyosságának megítélése céljából (2. táblázat). 2. táblázat: A krónikus alsó végtagi atherosclerosis klinikai stádium beosztása

I.

II.a

II.b

III.

IV.

Panaszmentes

200 m fölötti

200 m alatti

Nyugalmi

Necrosis

dysbasia

dysbasia

fájdalom

A szokványos fizikális vizsgálaton túl minden betegnél megmértük a boka-kar indexet (ankle-brachial index, ABI). Az index mérését a hordozható Doppler ultrahang készülék (Dopplex II., 8 MHz, Huntleigh Diagnostics) kezelésében jártas érsebész, illetve a vizsgálat számára betanított PhD hallgató végezte. A méréskor a beteg hanyatt fekvő helyzetben volt, nyugalomban, átlagos szobahőmérsékleten. A méréseket mindkét artéria dorsalis pedis és artéria tibialis posterior felett végeztük. A Doppler indexet a következő módon számoltuk: a legalacsonyabb, bokánál mért értéket elosztottuk a két karon mért vérnyomás érték közül a magasabbal [120, 121]. Az intima-média vastagságot az artéria carotis communis oszlása előtt közvetlenül mértük a carotis communis dorsalis falán plakkmentes területen 3 helyen. A vizsgálatot ugyanaz a tapasztalt radiológus végezte egy Toshiba Aplio SSA-770 ultrahang berendezéssel, lineáris (7,5-11 MHz) és konvex (3,5-5 MHz) transducerrel. Az átlag és a maximum IMT értékeket használtuk számításaink során [122].

33

Ugyanezen duplex UH vizsgálat során megmértük az artéria carotis interna eredésénél található esetleges szűkület mértékét is, melyet a klinikumban és az irodalomban általánosan elfogadott gyakorlat szerint – 0% és 100% között adtunk meg, ahol a 0% az intakt eret, a 100% a teljes elzáródást jelentette [123]. A szisztémás artériás kalcifikáció megítélése céljából duplex UH vizsgálatot végeztünk a test hét pontján: a két carotis bifurcatióban, az infrarenalis aortán, a két artéria femoralis communisban, a mitrális és az aorta billentyűn [108, 124]. Ahol az érfalban kalcifikáció látszott, az a hely „1” értéket kapott, ahol nem volt meszesedés, ott a vizsgálati hely „0” értéket kapott. Így egy betegnél a kalcifikációs score (KS) maximum 7, minimum 0 lehet. Az erek UH vizsgálatát ugyanaz a radiológus ugyanazon a készüléken vizsgálta, melyet az IMT mérésnél részleteztem. Kalcifikációt állapított meg, ha a meszesedés típusos UH jeleit észlelte az érfalban (hangárnyékot adó, környezeténél lényegesen echodenzebb struktúra az érfalban). A szívbillentyűk meszesedésének megítélése egy tapasztalt kardiológus feladata volt, a transthoracalis echocardiographiákat Toshiba Xario és Philips IE 33 készüléken 2,5 és 4,5 MHz-es phased array vizsgálófejekkel végezte az American Society of Echocardiography ajánlása alapján. Az aortagyök régiót az aorta anulustól az aorta ascendens kezdeti szakaszáig defineáltuk, melynek részei az anulus, a billentyű tasakok, a sinus Valsalva, a sino-tubularis junctio és aorta ascendens kezdeti, néhány mm-es szakasza. A régiót 3 irányból vizualizáltuk: parasternális hossztengely, parasternalis rövid tengely és apicalis 5 üreg felől. A mitrális billentyű állományt a mitrális anulus és a mellső, valamin a hátsó vitorla komplexumaként defineáltuk a vizsgálat céljából. A régiót 3 irányból hoztuk látótérbe: parasternális hossztengely, parasternalis rövidtengely és apicalis 4 üreg felől. Kalcifikációnak tekintettük (és „1” értéket kapott), ha a vizsgálat során bármely irányból, a régió bármelyik területén hiperdenz, az epicardium reflexivitását elérő denzitású terület ábrázolódott. Lokális megvastagodást, melynek denzitása nem érte el az epicardiumét, nem tekintettünk meszesedésnek. Az erek és a szívbillentyűk UH vizsgálatát végző kollégák a betegek tudományos vizsgálattal kapcsolatos egyéb eredményeit illetően nem rendelkeztek semmilyen információval. Amikor egy betegnél a vizsgálattól függetlenül diagnosztikus vagy therápiás céljából angiográfia elvégzése vált szükségessé, a vizsgálat képanyagát egy a vizsgálattól

34

független tapasztalt radiológus vizsgálta meg az alsó végtagi atherosclerosis kiterjedtségének és súlyosságának megítélése céljából, melyet a Bollinger által leírt score rendszerrel számszerűsítettünk [125]. Az aorta infrarenális szakaszától distal felé haladva mindkét alsó végtagi artériás rendszert elemeztük a proximális cruralis artériákig. Az eredeti leírás szerint feljegyeztük a szűkületeket és elzáródásokat az aortán, az iliacalis és femoralis ereken, az artéria popliteán és a cruralis ágak kezdeti szakaszán, majd összesítettük a kapott számadatokat. A kapott pontértékek függtek a szűkület érátmérőt érintő mértékétől és hosszúságától, a szűkült érszakaszok mennyiségétől, ill. az elzáródások jelenlététől. 3. 2. 2. Laboratóriumi vizsgálatok A vérvételeket reggel 7 és 9 óra között végeztük, a betegek éjszaka éhgyomorra voltak. A vénás vért a standard laborvizsgálatok céljából a Semmelweis Egyetem Érsebészeti Klinika laboratóriumába, illetve az egyetem központi laboratóriumába szállítottuk, a vizsgálatok során a következő készülékeket használtuk: D-Cell 5D Diagon Ltd., Cobas Integra 400 - Roche, STA-Compact, Diagnostica Stago. A fetuin-A meghatározást radiális immunodiffuziós módszerrel végeztük a Semmelweis Egyetem III. Belgyógyászati Klinika kutató laboratóriumában. A betegektől

levett

vért

natív

vacutainer

csőbe

gyűjtöttük,

majd

azonnal

o

lecentrifugáltuk (4000 fordulat/perc, 15 percig 23 C-on). A vizsgálandó mintákat cryotube-ban -80 oC-on, kettős azonosítóval ellátva tároltuk, majd egyszerre végeztük el a fetuin-A meghatározást. A beteg szérumából 5 mikrolitert higítottunk 1:4 arányban, majd azt 11,5 ml Litex agaróz gélre vittük (Sigma). Szérum minták (1:4 hígításban) ismert fetuin-A koncentrációval szolgáltak standard mintaként. Az inkubáció szobahőmérsékleten történt 48 órán keresztül. Kétféle antitestet használtunk a fetuin-A-val szemben, mert a fehérje egyes láncként szintetizálódik és gyorsan dipeptid formába alakul át egy kapcsoló peptid enzimatikus aktivitása eredményeképpen. A kereskedelmi forgalomban elérhető termék (anti-fetuin-A, IgG frakció, Incstar, Cat.No.81931, 13,7 mg/ml, végleges koncentrációban 84 μl/11,5 ml gél) felismeri a dipeptid formát. A másik antitest típus az újonnan képződő egyes lánc formájú fetuin-A molekulát ismeri fel, ennek előállítása rekombináns humán

35

fehérjével immunizált nyúlból történt (végleges koncentráció 568 μl/11,5 ml gél) [90]. A szolubilis HSP 70 szintet ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) kittel mértük (R&D system, Cat No. DYC1663E, USA). A HSP 70 család meghatározására Tavaria és mtsai javaslatait követtük [126]. A mikrotitrálásra alkalmas lemezt egérből származó anti humán HSP 70 antitesttel borítottuk (100 µl, 2 µg/ml) karbonát pufferben (pH= 9,5) egy éjszakán keresztül 4 oC-on. A lemezeket háromszor mostuk át foszfát pufferelt sóoldattal, mely 0,1%-os Tween 20 oldatot tartalmazott. A nem specifikus kötő helyek gátlását 200 μl foszfát pufferelt sóoldattal végeztük (mely 0,5 % zselatint és Tween 20 oldatot tartalmazott) 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. Kimosás után 100 μl referencia preparátumot (rekombináns humán HSP 70, 0-10 ng/ml) vagy hígítatlan szérum mintákat adtunk hozzá, majd a lemezeket 2 órán át szoba hőmérsékleten inkubáltuk. A lemezeket ismét mostuk, majd a HSP 70 kötődést határoztuk meg nyúl anti-humán antitesttel (100 μl, 0,5 μg/ml) foszfát pufferelt sóoldatos zselatinban. Szobahőmérsékleten eltöltött 1,5 óra után a lemezeket ismét mostuk, majd streptavidin-horseradish peroxidase-zal inkubáltuk (1:200) foszfát pufferelt sóoldatos zselatinban 20 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. Ismételt mosás után 100 μl o-phenylén-diamint (Sigma, St. Louis, MO, USA) adtunk hozzá citrát pufferben. Az optikai denzitást λ=490 nm hullámhosszon mértük (referencia: λ=620 nm). 3. 3. STATISZTIKAI ANALÍZIS A statisztikai analízis és az adatábrázolás a Prism for Windows (GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok, 5.0.1 verzió), illetve az SPSS for Windows (SPSS Inc, Chicago, Illinois, Amerikai Egyesült Államok, 15.0.1. verzió) használatával készült. A vizsgált változók nagy része nem mutatott normál eloszlást, ezért ezekben az esetekben nonparametrikus statisztikai teszteket használtunk az analízisek során. Két független minta folytonos változói közötti összehasonlításhoz a Mann-Whitney U-tesztet, több csoport változóinak összehasonlítása esetén KruskalWallis tesztet használtunk. A változók közötti korrelációk vizsgálatára a Spearman-féle korrelációs koefficiens értékét határoztuk meg. Bináris adatok kapcsolatának vizsgálatára többszörös logisztikus regressziós analízist végeztünk. Minden statisztikai

36

tesztet kétoldalasan végeztünk, a próbák eredményét p <0,05 értékek esetén tekintettük szignifikánsnak. A szövegben megadott értékek medián (interkvartilis tartomány) értékeknek felelnek meg, ettől eltérő esetben a szövegben feltüntettem. A vizsgálat protokollját a Semmelweis Egyetem Regionális Tudományos és Kutatásetikai Bizottsága engedélyezte. Minden beteg önkéntesen és térítésmentesen vállalkozott vizsgálatainkban való részvételbe. A részvételét szóbeli és írásbeli részletes felvilágosítás után aláírásával hitelesített adatlap kitöltésével írásban erősítette meg.

37

4. EREDMÉNYEK Az eredmények a célkitűzésekben megfogalmazott pontoknak megfelelően kerülnek részletezésre. 4. 1. A SZÉRUM FETUIN-A SZINT KAPCSOLATA AZ ARTÉRIÁS KALCIFIKÁCIÓVAL

KRÓNIKUS

ALSÓ

VÉGTAGI

ATHERO-

SCLEROTIKUS, NEM URAEMIÁS BETEGEKBEN A 93 – a 3.1.1. pontban részletesen leírt feltételeknek megfelelő – beteg alapvető klinikai és laboratóriumi jellemzőit az 3. táblázatban tüntettem fel. Ismert coronariasclerosissal rendelkezik 41%, szívinfarktuson 26% esett át és 19%uk szenvedett el agyi infarktust a vizsgálatba történt bevonás előtt. A Fontaine klasszifikáció szerint a betegek 82%-a tartozott II/b-IV csoportba. E betegek a későbbiekben a klinikai tünetek súlyosságára tekintettel sebészeti vagy intervencionális radiológiai módszerrel műtétre kerültek. A lipid profil vizsgálata a laboratóriumi normál értékekhez képest mérsékelten emelkedett triglicerid, koleszterin és LDL értékeket mutatott. Az UH vizsgálattal meghatározott kalcifikációs score medián értéke 5 volt (IQR: 46), ez egyezik azzal, hogy a vizsgált populáció nagy része súlyos atherosclerotikus beteg, akiket kezelő orvosuk érsebészhez irányított.

38

3. táblázat: Klinikai és laboratóriumi jellemzők (Krónikus alsó végtagi ischaemiás betegek, 1. betegcsoport)

Betegek Esetszám

93

Kor (év)

60,3 (54,5-65,0)

Nem (férfi)

72 (78)

BMI

26,58 (24,19-29,15)

Dohányzás

88 (95)

Diabétesz

33 (35)

Hipertónia

74 (80)

Fontaine csoport I, II/a, II/b, III, IV 8, 9, 56, 9, 11 ABI

0,40 (0,18-0,58)

IMT átlag (mm)

0,82 (0,70-0,99)

IMT maximum (mm)

1,00 (0,80-1,30)

Kalcifikációs score

5 (4-6)

Bollinger score

52 (33-80)

CRP (mg/l)

3,60 (1,15-7,75)

Kreatinin (μmol/l)

82,00 (73,0-89,0)

eGFR (ml/min)

91,51 (78,23-109,68)

Triglicerid (mmol/l)

1,70 (1,20-2,50)

Koleszterin (mmol/l)

5,50 (4,50-6,50)

LDL (mmol/l)

3,39 (2,90-4,33)

HDL (mmol/l)

1,42 (1,13-1,64)

Fetuin-A (mg/l)

732 (630-768)

BMI= Body mass index, ABI= Ankle-brachial index, IMT= intima-media vastagság, CRP= C-reactive protein, eGFR= számított (estimated) glomeruláris filtrációs ráta, LDL= low-density lipoprotein, HDL= high-density lipoprotein. Az értékeket mediánban (interkvartilis range) vagy számként (%) adtam meg.

39

4. táblázat: A szérum fetuin-A és egyéb jellemző faktorok Spearman-féle rang korrelációs vizsgálata Változók

r érték

p érték

(Spearman rho) Kalcifikációs score -0,2570

0,0183

Bollinger score

-0,3474

0,0351

IMT átlag

-0,1073

0,3405

ABI

0,0792

0,4505

BMI

-0,0438

0,6765

Hemoglobin A1C

0,2194

0,0388

eGFR

-0,0074

0,9437

CRP

-0,2018

0,0579

Albumin

0,2877

0,0066

Transzferrin

0,3060

0,0032

IMT= intima-média vastagság, ABI= Ankle-brachial index, BMI= Body mass index. eGFR= számított (estimated) glomeruláris filtrációs ráta, CRP= C-reactive protein. A szignifikáns kapcsolatot dőlt betűvel jeleztem. A Spearman-féle rang korrelációs vizsgálat nem mutatott összefüggést a fetuin-A és a triglicerid, koleszterin, HDL és LDL szintek között. Ahogy a 4. táblázatban látható, a Spearman-féle rang korrelációs vizsgálat szignifikáns negatív korrelációt igazolt a szérum fetuin-A szint és a kalcifikációs score között (r= -0,257, p= 0,018) (3.A. ábra).

40

3. ábra: A szérum fetuin-A szintek és az UH vizsgálattal mért kalcifikációs score (A), valamint a Bollinger score (B) kapcsolata (Spearman-féle rang korrelációs analízis)

A Spearman rho (r) és p értékeket jelöltem az ábrákon. Hasonló kapcsolat igazolódott a szérum fetuin-A szint és az angiográfia alapján számolt Bollinger score között is (r= -0,347, p= 0,035) (3.B. ábra). Digitális szubtrakciós angiográfiát 37 esetben végeztünk, mivel ezt az invazív vizsgálatot csak akkor végeztük el, ha a beteg kezelését vagy a tervezett műtét típusát a vizsgálat

41

eredménye befolyásolta; pusztán jelen tanulmányunk céljából érfestést nem végeztünk. Szignifikáns pozitív kapcsolat áll fenn a fetuin-A szintek és a haemoglobin A1c (r= 0,219, p= 0,039), az albumin (r= 0,288, p= 0,007) és a transzferrin (r= 0,306, p= 0,003) értékek között. Nem találtunk szignifikáns összefüggést a szérum fetuin-A szintek és az átlag IMT, a boka-kar Doppler index, a BMI, a GFR, valamint a CRP között. Nem volt szignifikáns különbség a diabéteszes és nem-diabéteszes csoportok szérum fetuin-A szintje között (Mann-Whitney U teszt: p= 0,4838). A Fontaine klasszifikáció csoportjainak univariáns analízissel végzett összevetése a szérum fetuin-A szinttel nem mutatott szignifikáns kapcsolatot (Kruskal-Wallis teszt, p= 0,1801). A legalacsonyabb fetuin-A szinttel rendelkező betegcsoport (alsó tercilis) összevetése a magasabb fetuin-A szintű kétharmaddal azt mutatta, hogy az alacsony fetuin-A szint szignifikánsan magasabb kalcifikációs score-ral jár együtt (5. táblázat). 5. táblázat: A fetuin-A és az UH vizsgálattal megállapított artériás kalcifikációs score közötti kapcsolat logisztikus regressziós analízise Esélyhányados a súlyosabb

p érték

artériás kalcifikációra (CI) Nem adjusztált

2,9683 (1,2128-7,2645)

0,0172

1. modell

2,8894 (1,1215-7,4438)

0,0280

2. modell

3,2790 (1,707-9,2853)

0,0239

3. modell

3,0351 (1,0533-8,7457)

0,0398

Az esélyhányadosokat és a 95 % konfidencia intervallumokat (CI) logisztikus regressziós analízissel számítottuk 1. modell: korra, nemre, BMI-re, diabéteszre, dohányzásra adjusztálva 2. modell: 1. modell + koleszterin, triglicerid, HDL 3. modell: 2. modell + CRP Azoknak a betegeknek, akik a legalacsonyabb fetuin-A szinttel rendelkeztek, majdnem háromszoros esélyük volt, hogy magasabb értékű kalcifikációs score-ral rendelkezzenek, mint a magasabb fetuin-A szintű két tercilisnek (esélyhányados

42

/OR/= 2,9683, konfidencia intervallum /CI/: 1,21-7,26). Logisztikus regressziós analízist végeztünk a fetuin-A és a kalcifikációs score kapcsolatának egyéb tényezőktől való függőségének tisztázására. Három különböző modell hatását vizsgáltuk az esélyhányadosokra: 1. modell = kor, nem, BMI, diabétesz, dohányzás; 2. modell = 1. modell + koleszterin, triglicerid, HDL; 3. modell = 2. modell + CRP. Egyik fenti modell sem változtatta meg a szérum fetuin-A szint és a kalcifikációs score szignifikáns kapcsolatát.

4. 2. KÜLÖNBÖZŐ ETIOLÓGIÁJÚ AORTA ANEURIZMÁVAL RENDELKEZŐ

BETEGEK

SZÉRUM

FETUIN-A

SZINTJÉNEK

ÖSSZEHASONLÍTÁSA A 3.1.2. pontban részletesen leírt feltételek alkalmazása után 30 atherosclerotikus aorta aneurizmás, 15 Marfan szindrómával és aorta aneurizmával rendelkező beteg, az 1. betegcsoportból random kiválasztott 30 alsó végtagi érbeteg és 30 egészséges kontroll egyed került a 2. betegcsoportba, melynek elemzése a következő eredményeket adta. A négy csoport lényeges klinikai, UH vizsgálati és laboratóriumi jellemzőit a 6. és 7. táblázat mutatja, kiemelve (félkövér betűtípus) a vizsgálat fő lényegét jelentő különböző etiológiájú aneurizmás csoportok összehasonlítását (p1 oszlop).

43

6. táblázat: Klinikai és UH vizsgálati jellemzők (aorta aneurizmával rendelkező betegek /atherosclerotikus aneurizma és Marfan szindróma/, 2. betegcsoport)

ASA

Marfan

PAD

Kontrol

Esetszám

30

15

30

30

Kor (év)

70,8

35,2

66,7

46,2

(60,6-76,0)

(25,3-47,6)

(58,5-75,8)

(43,2-52,4)

26 (87)

8 (53)

21 (76)

12 (40)

Nem (férfi)

p1

p2

p3

p4

p5

p6

<0,01

0,57

<0,01

<0,01

0,03

<0,01

<0,01

0,37

0,48

0,02

(NS)

(NS)

<0,01

<0,01

(NS) 0,026

0,27 (NS)

BMI

Dohányzás

26,6

22,6

28,0

26,6

(24,2-29,7)

(19,6-25,2)

(24,5-31,5)

(24,1-27,8)

24 (80)

5 (33)

24 (80)

2 (6,6)

<0,01

<0,01

0,40

0,43

(NS)

(NS)

1

<0,01

0,15 (NS)

0,01

0,18

0,04

(NS) Diabétesz

Hipertónia

IMT max. (mm) IMT átlag (mm) Artériás kalcifikációs score

9 (30)

24 (80)

1 (7)

6 (40)

13 (43,3)

22 (73,3)

0 (0)

2 (6,6)

0,9

0,6

1,2

0,6

(0,8-1,2)

(0,5-0,6)

(0,9-1,4)

(0,5-0,8)

0,8

0,6

0,9

0,59

(0,7-0,9)

(0,5-0,6)

(0,7-1,1)

(0,46-0,7)

5 (3-6)

0 (0-1)

5,1 (5-6)

0 (0)

0,13

0,38

(NS)

(NS)

0,02

0,66

0,68

0,07

0,24

0,41

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

0,06

<0,01

<0,01

0,35

<0,01

<0,01

<0,01

0,05

0,11

(NS) <0,01

<0,01

(NS) <0,01

0,07

0,18

<0,01

(NS) <0,01

<0,01

<0,01

(NS)

PAD= perifériás (alsó végtagi) érbetegség, ASA= atherosclerotikus aneurizma, BMI= Body mass index, IMT= intima-média vastagság. Az értékeket mediánban (interkvartilis range) vagy számként (%) adtam meg. NS= nem szignifikáns. Összehasonlítások: p1=ASA és Marfan, p2=ASA és PAD, p3=ASA és kontroll, p4=Marfan és PAD, p5=Marfan és kontroll, p6=PAD és kontroll

44

<0,01

(NS)

(NS) <0,01

0,73

<0,01

7. táblázat: Laboratóriumi jellemzők (aorta aneurizmával rendelkező betegek /atherosclerotikus aneurizma és Marfan szindróma/, 2. betegcsoport)

ASA

Marfan

PAD

Kontrol

p1

p2

p3

p4

p5

p6

Kreatinin

106

66

100,3

78,6

<0,01

0,07

<0,01

<0,01

<0,01

<0,01

(μmol/l)

(95-125)

(56-72)

(81-123)

(67-87)

eGFR

60,1

138,1

74,0

139,03

<0,01

<0,01

0,98

<0,01

(ml/min)

(50,9-84,5)

(104,1-54,0)

(49,3-96,1)

(110,1-165,2)

CRP (mg/l)

2,5

1,6

3,1

2,1

0,44

0,37

0,66

0,09

0,71

0,11

(0,7-5,6)

(1,2-2,5)

(0,8-6,6)

(1,2-2,4)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

46,3

45,0

41,3

44,9

0,26

<0,01

0,18

0,01

0,77

0,01

(43,9-49,5)

(42,6-45,7)

(39,3-43,8)

(40,8-48,0)

(NS)

Transzferrin

2,4

2,7

2,6

2,6

0,09

0,89

0,81

0,20

0,20

0,928

(g/l)

(2,2-2,8)

(2,5-3,2)

(2,2-2,9)

(2,0-3,15)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

Koleszterin (mmol/l)

5,2

4,8

5,41

5,5

0,29

0,77

0,54

0,40

0,05

0,38

(4,3-6,4)

(3,9-5,6)

(4,3-6,5)

(4,9-6,1)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

1,6

1,1

2,1

1,6

0,08

0,93

0,10

0,08

0,63

0,10

(1,3-2,7)

(0,9-2,0)

(1,2-2,6)

(1,1-1,8)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

3,1

2,7

3,1

3,1

0,49

0,67

0,81

0,60

0,35

0,96

(2,4-4,5)

(2,1-3,5)

(2,4-3,9)

(2,7-3,7)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

HDL

1,3

1,4

1,3

1,5

0,65

0,56

0,09

0,32

0,38

0,04

(mmol/l)

(1,1-1,6)

(1,1-1,6)

(1,0-1,5)

(1,3-1,7)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

Homocisztein

17,2

12,1

18,5

11,0

<0,01

0,91

<0,01

<0,01

0,02

(μmol/l)

(13,4-21,0)

(11,4-15,0)

(13,5-21,4)

(9,6-12,0)

Albumin (g/l)

Triglicerid (mmol/l)

LDL (mmol/l)

(NS) <0,01

0,58 (NS)

(NS)

(NS)

(NS)

(NS)

PAD= perifériás (alsó végtagi) érbetegség, ASA= atherosclerotikus aneurizma, eGFR= számított (estimated) glomeruláris filtrációs ráta, CRP= C-reactive protein, LDL= lowdensity lipoprotein, HDL= high-density lipoprotein. Az értékeket mediánban (interkvartilis range) vagy számként (%) adtam meg. NS= nem szignifikáns. Összehasonlítások: p1=ASA és Marfan, p2=ASA és PAD, p3=ASA és kontroll, p4=Marfan és PAD, p5=Marfan és kontroll, p6=PAD és kontroll Az aorta aneurizmák legnagyobb átmérője 52 mm (46-60) volt az atherosclerotikus csoportban és 55 mm (50-65) a Marfan szindrómások között (medián /IQR/ értékek). Sebészeti beavatkozás (nyitott műtét Dacron graft implantációval /20 eset/ vagy stentgraft beültetés /4 eset/) 24 esetben volt szükséges az atherosclerotikus aneurizmás

45

<0,01

csoportban, a másik 6 beteg beavatkozást nem igényelt, konzervatív kezelésben és megfigyelésben részesül. Az összes Marfan szindrómás aorta aneurizmás beteg műtéten esett át: aorta ascendens Dacron interpoziciót vagy Bentall műtétet végeztünk. A fetuin-A szérum szintek mérése az alábbi eredményeket hozta: a kapott fetuin-A értékek szignifikánsan alacsonyabbak voltak a perifériás érbetegekben (PAD: 654 μg/ml /600-756/) és az atherosclerotikus aneurizmás csoportban (ASA: 708 /612-780/), mint a Marfan szindrómásokban (756 /708-816/) és az egészséges kontrol csoportban (754 /713-777/), (medián /IQR/ értékek). A vizsgálatunk lényegét tekintve szignifikáns különbséget találtunk a két különböző etiológiájú aneurizmás csoport között: p= 0,0428. (4. ábra). Hasonlóan szignifikáns volt a különbség az ASA és a kontroll csoport, illetve a Marfan szindrómás és a PAD csoportok összevetésében is. 4. ábra: A szérum fetuin-A szintek scatter plot diagrammal történő ábrázolása a különböző betegcsoportok között

PAD= perifériás (alsó végtagi) érbetegség (654μg/ml / 600-756, n=30), ASA= atherosclerotikus aneurizma (ASA) (708 / 612-780, n=30), Marfan szindróma (756 /

46

708-816, n=15) és egészséges kontroll (754 / 713-777, n=30). A számok medián értékeket jelentenek, illetve az IQR-t. (A nem ábrázolt különbségek nem voltak szignifikánsak a PAD és az ASA, illetve a Marfan és a kontroll csoportok között.) (Kruskal-Wallis és Mann-Whitney U teszt) A

különböző

csoportok

demográfiai

adatainak

összehasonlítása

során

előre

megjósolható különbségek mutatkoztak kor, nem, BMI és hipertónia szempontból (6. táblázat). Szintén várható volt a különbség az ultrahang vizsgálatok (carotis IMT és kalcifikációs

score)

eredményeit

tekintve:

az

atherosclerotikus

csoportokban

szignifikánsan nagyobb volt az artéria falvastagsága, illetve a meszesedés mértéke, mint a Marfan szindrómás betegeké. Logisztikus regressziós analízist végeztünk, annak céljából, hogy megítéljük a két csoport között lényegesen eltérő változók hatását a fetuin-A szintek között talált különbségre. Az analízis eredménye szerint a fetuin-A szint különbség nem volt független e változóktól (p értékek a változók után zárójelben): kor (0,210), nem (0,062), kreatinin szint (0,438), aneurizma méret (0,507), átlag IMT (0,146), artériás kalcifikációs score (0,197). Egyik beteg sem részesült dialízis kezelésben, nem tudtak krónikus vesebetegségről, mindazonáltal egy erősen szignifikáns különbség mutatkozott az atherosclerotikus és a Marfan szindrómás csoport között a szérum kreatinin szint és a számított GFR érték tekintetében (mindkét esetben p< 0,0001). A kreatinin és a számított GFR értékek a normál értékeken belül voltak a Marfan szindrómás csoportban és a normál érték felső határa közelében (azt részben meghaladva) az atherosclerotikus csoportban. Nem találtunk szignifikáns különbséget az atherosclerotikus és a Marfan szindrómás csoportban az akut fázis fehérjék (CRP, albumin és transzferrin) vonatkozásában. A szérum LDL mérsékelten emelkedett volt az atherosclerotikus betegekben; a koleszterin, triglicerid és HDL szintek a normál értékeken belül voltak. Sztatinokat az atherosclerotikus betegek 37%-a szedett. A diabétesz tekintetében nem volt különbség a két aneurizmás csoport között és csoporton belül sem korrelált a fetuin-A szint a diabétesszel, vércukor szinttel vagy HbA1c-vel. Szignifikánsan magasabb homocisztein szinteket találtunk az atherosclerotikus csoportban. Spearman-féle rang korrelációs analízis nem igazolt szignifikáns összefüggést a fetuin-A és homocisztein szintek között, de szignifikáns, pozitív kapcsolat mutatkozott a fetuin-A és transzferrin koncentrációk viszonyában (r= 0,4046, p< 0,05).

47

4. 3. A PERIFÉRIÁS ÉRBETEGEK SZÉRUM HSP 70, FETUIN-A SZINTJÉNEK

ÉS

AZ

ARTÉRIÁS

KALCIFIKÁCIÓ

MÉRTÉKÉNEK

ÖSSZEFÜGGÉSEI A vizsgálatba 180 alsó végtagi és/vagy carotis arteriosclerosissal rendelkező beteget vontunk be a 3.1.3. pontban részletezett kritériumok alapján (3. betegcsoport). Az átlagéletkor 64 év volt, 124 volt férfi (68,9%), 98 (54,4%) dohányzott vizsgálatunk idején, 55 (30,6%) dohányzott régebben és csak 27 beteg (15%) nem dohányzott soha. Az alapvető demográfiai, UH vizsgálati és laboratóriumi mérések eredményei a táblázatokban láthatóak ( 8. és 9. táblázat). 8. táblázat: Klinikai és UH vizsgálati jellemzők (alsó végtagi és/vagy carotis arteriosclerosissal rendelkező betegek, 3. betegcsoport) Vizsgált paraméterek

Értékek

Kor (év)

64,1 (57,0-70,7)

Nem (férfi)

124 (68,89%)

BMI

26,1 (23,88-28,99)

Dohányzás (év)

35 (25-41)

Cigaretta/nap

20 (20-30)

Hipertónia

140 (77,78%)

Diabétesz

62 (34,44%)

Iszkémiás szívbetegség

65 (36,11%)

Szignifikáns carotis stenosis

95 (52,78%)

Carotis stenosis maximum (%)

60 (0-90)

Fontaine csoport I, II/a, II/b, III, IV (n=143)

14, 21, 83, 12, 13

ABI

0,50 (0,26-0,76)

IMT átlag (mm)

0,83 (0,70-0,97)

IMT maximum (mm)

1,00 (0,80-1,30)

Kalcifikációs score

5 (4-6)

BMI= Body mass index, ABI= Ankle-brachial index, IMT= intima-média vastagság. Az értékeket mediánban (interkvartilis range) vagy számként (%) adtam meg.

48

9. táblázat: Laboratóriumi jellemzők (alsó végtagi és/vagy carotis arteriosclerosissal rendelkező betegek, 3. betegcsoport) Változók

Értékek

Nátrium (mmol/l)

141 (138-143)

Kálium (mmol/l)

4,5 (4,3-4,8)

Kalcium (mmol/l)

2,47 (2,38-2,53)

Foszfát (mmol/l)

1,11 (0,97-1,21)

Kreatinin (μmol/l)

89 (80-103)

Karbamid (mmol/l)

6,6 (5,20-7,85)

eGFR (ml/min)

75,8 (57,17-94,36)

Bilirubin (μmol/l)

9,65 (7,25-13,05)

AST (U/l)

21 (17-26)

ALT (U/l)

21 (14-28)

Gamma-GT (U/l)

33 (22-55)

Albumin (g/l)

46,5 (43,20-49,00)

CRP (mg/l)

2,7 (0,9-6,5)

Homocisztein (μmol/l)

16,1 (13,20-19,30)

Triglicerid (mmol/l)

1,7 (1,20-2,40)

Koleszterin (mmol/l)

5,2 (4,30-6,40)

LDL (mmol/l)

3,1 (2,61-4,07)

HDL (mmol/l)

1,4 (1,20-1,58)

Fetuin-A (mg/l)

732 (648-804)

Szolubilis Hsp70 (ng/ml)

0,63 (0,52-0,81)

AST= aszpartát aminotranszferáz, ALT= alanin aminotranszferáz, Gamma-GT= gamma-glutamil transzpeptidáz, CRP= C-reactive protein, eGFR= számított (estimated) glomeruláris filtrációs ráta, LDL= low-density lipoprotein, HDL= high-density lipoprotein. Az értékeket mediánban (interkvartilis range) adtam meg. Harminchét betegnek (20,6%) volt csak szignifikáns carotis stenosisa, 91 betegnek (50,6%) csak alsó végtagi atherosclerosisa, és 52 beteg (28,9%) mindkét betegségben szenvedett. A Fontaine klasszifikáció (I-IV) szerint 129-en (71,7%) tartoztak a sebészi

49

kezelést igénylő II/b-IV csoportba. A boka-kar index medián értéke 0,50 volt (IQR: 0,26-0,76), az átlag IMT és a legrosszabb IMT medián (IQR) értékei 0,83 (0,70-0,97) és 1,00 (0,80-1,30) voltak. A lipidprofil értékek a normál szintet mérsékelten meghaladó triglicerid, koleszterin és LDL szinteket mutattak. A kalcifikációs score medián értéke 5 volt (IQR: 4-6), ez is mutatja a betegcsoport súlyos szisztémás artériás kalcifikációját. A Hsp70 szérum szintek és az artériás kalcifikációs score, valamint az egyéb klinikai, UH vizsgálati és laboratóriumi paraméterek közötti kapcsolatot Spearman-féle rang korrelációs analízissel vizsgáltuk. A Hsp70 szint és a kalcifikációs score, valamint a homocisztein szignifikáns kapcsolatát

S zérum HS P 70 (ng/ml)

scatter plot diagramon ábrázoltuk (5.a. és b. ábra).

K alcifikáció score

5.a. ábra: A szérum Hsp70 szint kapcsolata a kalcifikációs score-ral perifériás érbetegekben (scatter plot diagram)

50

S zérum HS P 70 (ng/ml)

Homocis ztein ( mol/l)

5.b. ábra: A szérum Hsp70 szint kapcsolata a homocisztein szinttel perifériás érbetegekben (scatter plot diagram)

A korrelációs vizsgálat analízise során szignifikáns kapcsolatot találtunk a Hsp70 szérum szintje és a kor, a szérum bilirubin és gamma GT szint között is. Nem találtunk szignifikáns korrelációt a Hsp70 szérum koncentráció és más májkárosodásra jellemző enzim érték között (aszpartát aminotranszferáz /AST/, alanin aminotranszferáz /ALT/). Továbbá az anamnesztikus adatok közül a nem, a BMI, a hipertónia, a diabétesz, az iszkémiás szívbetegség megléte sem mutatott összefüggést a Hsp70 szinttel. A vizsgálat során műszeresen mért értékek közül az IMT és a boka-kar index is független volt a Hsp70 koncentrációtól. Különösen érdekes, hogy a CRP, triglicerid, koleszterin, kreatinin, karbamid, GFR értékek sem mutattak kapcsolatot (10. táblázat).

51

10. táblázat: A korrelációs koefficiensek és p értékek a Hsp70 és a klinikai, UH és labor vizsgálatok eredményeinek Spearman-féle rang korrelációs elemzése alapján (alsó végtagi és/vagy carotis arteriosclerosissal rendelkező betegek, 3. betegcsoport) Változó

r érték

p érték

(Spearman rho) Kor

0,1505

0,0454

BMI

0,0832

0,2707

Carotis stenosis maximum

0,0613

0,4171

Fontaine csoport I, II/a, II/b, III, IV (n=143) -0,1576

0,0627

ABI

0,0628

0,4060

IMT átlag (mm)

0,0761

0,3253

IMT maximum (mm)

-0,0316

0,6829

Kalcifikációs score

0,1689

0,0245

Kreatinin (μmol/l)

0,1114

0,1397

Karbamid (mmol/l)

0,0300

0,6914

eGFR (ml/min)

-0,0940

0,2129

Bilirubin (μmol/l)

0,2330

0,0020

AST/GOT (U/l)

0,1269

0,0940

ALT/GPT (U/l)

0,1011

0,1842

Gamma-GT (U/l)

0,1504

0,0469

Albumin (g/l)

-0,0458

0,5515

CRP (mg/l)

-0,0858

0,2626

Homocisztein (μmol/l)

0,1794

0,0178

Triglicerid (mmol/l)

-0,0263

0,7299

Koleszterin (mmol/l)

-0,0286

0,7078

LDL (mmol/l)

-0,0275

0,7288

HDL (mmol/l)

0,0204

0,7958

Fetuin-A (mg/l)

0,0033

0,9649

BMI= Body mass index, ABI= Ankle-brachial index, IMT= intima-média vastagság, AST= aszpartát aminotranszferáz, ALT= alanin aminotranszferáz, Gamma-GT= gamma-glutamil transzpeptidáz, CRP= C-reactive protein, eGFR= számított (estimated) glomeruláris filtrációs ráta, LDL= low-density lipoprotein, HDL= high-density lipoprotein. A szignifikáns kapcsolatot dőlt betűvel jeleztem.

52

A vizsgálatba történt bevonás alkalmával feljegyzett gyógyszerek egyike sem befolyásolta a Hsp70 szinteket (az adatokat külön nem mutattam - aszpirin, clopidrogel, warfarin, ACE inhibitorok, angiotenzin receptor blokkolók, β blokkolók, sztatinok, antidiabetikus tabletták, inzulin). Az atherosclerosis anatómiai helye alapján felállított csoportosítás 3 csoportja között nem találtunk szignifikáns Hsp70 szint különbséget (Kruskal-Wallis teszt, p= 0,588). A diabéteszes és nem-diabéteszes csoportok között sem volt szignifikáns különbség (Mann-Whitney U teszt, p= 0,993) Univariáns analízis során azt találtuk, hogy a Hsp70 szérum értékek felső kvartilisába (Hsp70 koncentráció >0,7296 ng/ml) tartozó betegeknek majdnem 2,2-szeres esélye van arra, hogy a legsúlyosabban kalcifikált csoportba tartozzanak (KS= 6-7). A Hsp70 szint és az artériás kalcifikáció súlyosságának kapcsolatát logisztikus regressziós analízissel vizsgáltuk. Négy modell lehetséges hatását vizsgáltuk az esélyhányadosra: 1. modell= kor, nem, eGFR, 2. modell= 1. modell + dohányzás, 3. modell= 2. modell + CRP, 4. modell= 3. modell + homocisztein. A fenti esetleg zavaró faktorokkal elvégzett korrekció után is szignifikáns maradt az összefüggés a Hsp70 és az artériás kalcifikációs score között (11. táblázat). 11. táblázat: A Hsp70 és az artériás kalcifikációs score összefüggése (alsó végtagi és/vagy carotis arteriosclerosissal rendelkező betegek, 3. betegcsoport) Esélyhányados a súlyosabb artériás

p érték

kalcifikációra (CI) Nem adjusztált

2,189 (1,156-4,144)

0,016

1. modell

2,110 (1,066-4,175)

0,032

2. modell

2,233 (1,054-4,730)

0,036

3. modell

2,403 (1,115-5,181)

0,025

4. modell

2,264 (1,021-5,020)

0,044

Az esélyhányadosokat és a 95 % konfidencia intervallumokat (CI) logisztikus regressziós analízissel számítottuk. 1. modell: korra, nemre, eGFR-re adjusztálva, 2. modell: 1. modell + dohányzás, 3. modell: 2. modell + CRP, 4. modell: 3. modell + homocisztein

53

5. MEGBESZÉLÉS Az eredmények tárgyalása a célkitűzésekben megfogalmazott pontoknak megfelelően kerül részletezésre. 5. 1. AZ ALACSONY FETUIN-A SZÉRUM SZINT FOKOZOTT ARTÉRIÁS KALCIFIKÁCIÓVAL

JÁR

EGYÜTT

KRÓNIKUS

ALSÓ

VÉGTAGI

ATHEROSCLEROTIKUS, NEM URAEMIÁS BETEGEKBEN Vizsgálatunk megerősítette azt a feltételezést, hogy szérum fetuin-A szintek és a szisztémás artériás kalcifikáció között negatív korreláció áll fenn súlyos, krónikus alsó végtagi atherosclerotikus, normál veseműködésű betegekben. Az összefüggés függetlennek bizonyult a kortól, nemtől, BMI-től, diabétesztől, dohányzástól; koleszterin, triglicerid, HDL és CRP szinttől. A talált összefüggés egybevág azzal a hipotézissel, hogy az alacsonyabb fetuin-A szérum szint felelős lehet a súlyosabb artériás kalcifikációért. Az eredmények alátámasztják azt a feltételezést, hogy a fetuin-A az artériás kalcifikációt gátló tényező lehet emberben. A szérum fetuin-A szintet számos kóros állapot befolyásolhatja. Ahogy azt a bevezetésben említettem, a fetuin-A-t vizsgáló legtöbb tanulmányban a beteganyag krónikus, dializált vesebeteg [103, 127, 128], itt a dialízis önmagában egy krónikus gyulladást tart fenn, mely a fetuin-A negatív akut fázis fehérjeként való működése révén befolyásolhatja annak szintjét. Ezért terveztük vizsgálni csak a normál vesefunkciójú, ismert vesebetegséggel nem rendelkező betegeket. Néhány tanulmány ugyan normál vesefunkciójú betegek adatait elemezte, az artériás kalcifikáció vagy atherosclerosis súlyosságát határozta meg (eltérő módon), de ezen betegek súlyos atherosclerosisa nem volt ismert [99, 129-131]. Mivel betegeinket egy érsebészeti osztály betegei közül válogattuk, ők a többi vizsgálathoz képest súlyosabb állapotban voltak. A 93 beteg közül 76 igényelt műtétet (81,72%), 56 betegnek volt életminőséget limitáló klaudikácója és 20 esetben kritikus, krónikus végtag ischaemia volt a panasz. A boka-kar index medián értéke 0,40 volt, ami szintén arra utal, hogy beteganyagunk a többi szerző által vizsgált csoportnál előrehaladottabb érbetegséggel rendelkezik [130]. Az IMT átlaga és legmagasabb értéke nem mutatott korrelációt a fetuin-A szinttel anyagunkban, míg Fiore [99] és Rittig [132] pozitív korrelációt

54

igazolt. A közölt tanulmányok IMT értékei eltérőek egymástól; eredetileg az IMT mérés a szubklinikus atherosclerosis vizsgálatára használatos módszer volt. Jelen beteganyagunkban a súlyosan atherosclerotikus erek, plakkok miatt a korrekt mérési helyszín kiválasztása nehezített volt. Az angiográfián alapuló Bollinger score-t 1980-ban alkották meg; az angiográfiás eszközök, technika és képminőség sokat fejlődött azóta, így az eljárás érzékenysége javult, több szűkületről lehet pontosabb képet kapni. Nemrégen Ziegler és mtsai pozitív korrelációt találtak a Bollinger score és az oszteoprotegerin (egy az atherosclerosis kialakulásában szerepet játszó glikoprotein) között [115]. A Bollinger score hasznos eszköz az atherosclerosis kiterjedésének megítélésére, eredetileg nem az artériális kalcifikáció mérésére fejlesztették ki, jellegénél fogva így az érfal meszesedés értékelésének közvetett módszere. Az UH vizsgálati technikák közül a szisztémás kalcifikáció megítélésére a 7 egymástól távoli anatómiai helyen végzett vizsgálat pontosabb képet ad, mint a csak a mitrális vagy aorta billentyű meszesedés mérése. Szignifikáns pozitív korrelációt találtunk a szérum fetuin-A és HbA1c szintek között, de amikor az anamnézis alapján két csoportra osztottuk a betegeket a diabétesz és a metabolikus szindróma alapján, a fetuin-A lényegesen nem különbözött a csoportok között. Ismert, hogy a diabéteszesek fetuin-A szintje magasabb a kontrollokénál [133], ezt a megfigyelést magyarázhatja a fetuin-A insulin receptor gátló hatása, bár ezt vizsgálatunkkal megerősíteni nem tudtuk. A pontos mechanizmus, mellyel a fetuin-A gátolja az ektópiás kalcifikációt ismeretlen. Vizsgálati anyagunkban a fetuin-A pozitívan korrelált a transzferrin és albumin szintekkel; mindhárom negatív akut fázis fehérje. A fetuin-A egy hordozó molekulaként viselkedhet, mely chaperonként stabilizálja a fölös mennyiségben lévő calcium-foszfátot és segíti annak felvételét a sejtek által [134]. Adataink szerint a fetuin-A nem korrelált a szérum kalcium és foszfát szinttel. Az eddigi vizsgálatok alapján nem egyértelmű, hogy a súlyos artériás kalcifikáció vezet-e az elhasználódás miatt a fetuin-A szint csökkenéséhez, vagy az alacsony fetuin-A ok-okozati összefüggésben áll-e az artériás kalcifikációval [99]. Vizsgálatunk erőssége volt, hogy a szisztémás atherosclerosis és artériás kalcifikáció kiterjedését és súlyosságát a korábbi tanulmányokhoz képest több módszerrel mértük

55

és számos a fetuin-A szintet esetleg befolyásoló tényezőt kiküszöböltünk. A vizsgálat értékét csökkenti azonban, hogy keresztmetszeti jellege miatt nem enged következtetni a fetuin-A és az artériás kalcifikáció hosszú távú összefüggéseire. A kalcifikáció megítélésére vizsgálatunkból sem derül ki, melyik a legmegfelelőbb módszer. A különböző atherosclerosist és artériás kalcifikációt mérő módszerek másmás paramétert vizsgálnak: meszesedés, szűkület, elzáródás, véráramlás. 5. 2. AZ ATHEROSCLEROTIKUS AORTA ANEURIZMÁVAL RENDELKEZŐ BETEGEK SZÉRUM FETUIN-A SZINTJE ALACSONYABB, MINT A MARFAN SZINDRÓMÁS ANEURIZMÁS BETEGEKÉ Vizsgálatunkban szignifikánsan alacsonyabb szérum fetuin-A szintet találtunk az atherosclerotikus aorta aneurizmával rendelkező betegekben, mint a Marfan szindrómás és aorta aneurizmás betegekben. Tudomásunk szerint ez az első vizsgálat, mely különböző etiológiájú aorta aneurizmás betegek fetuin-A szintjét hasonlítja össze. Az eredmények arra utalnak, hogy a fetuin-A gátló szerepet játszhat az artériás kalcifikáció kialakulásában, ezt nem vesebeteg populációban igazoltuk és a diabétesz jelenlététől függetlennek bizonyult. A periphériás érbeteg csoport fetuin-A szintje szintén szignifikánsan alacsonyabb volt a Marfan szindrómás és a kontroll csoporténál, mely megfigyelés tovább erősíti a fetuin-A szerepének lehetőségét az atherosclerosis patofiziológiájában. Azt, hogy a fetuin-A kalcifikációt gátló tényező in vitro és in vivo kísérletekben már igazolták [101, 135]. A humán kísérletek alapján nem egyértelmű, hogy az alacsonyabb fetuin-A szint genetikailag meghatározott-e, vagy más betegségek, pl. krónikus vesebetegség, diabétesz, akut vagy krónikus fertőzés, befolyásolják. A vizsgálat tervezésénél igyekeztünk kizárni az összes ismert tényezőt, mely a fetuinA szintet befolyásolhatja és olyan kontroll csoportot felállítani az egészségeseken kívül, melyet hasonló morphológiájú betegség (aorta aneurizma) jellemez, de várhatóan nem rendelkezik meszes erekkel. A hasi aorta aneurizmákat túlnyomó többségben atherosclerotikus eredetűnek tartjuk és az aorta falában gyakran található mész. A Marfan szindrómában viszont ritkaságszámba megy az aorta falának makroszkópos meszesedése. Az UH vizsgálataink (carotis, szívbillentyűk, hasi aorta,

56

artéria femoralis communisok) megerősítették az artériás kalcifikáció hiányát a Marfan szindrómás csoportban. Az 1. betegcsoporthoz hasonlóan, ebben a populációban (2. betegcsoport) sem találtunk korrelációt a fetuin-A szintek és a carotis IMT között (ennek okát ld. az 5.1. pontban). Az aneurizmák maximális átmérője a két csoportban hasonló, a tágulat legtöbb esetben az 5 cm-t meghaladta, a legtöbb beteg műtétben részesült. Az elvégzett multivariáns analízis szerint a fetuin-A szint különbségek nem függetlenek azoktól a paraméterektől, melyek szignifikánsan különböznek a két aneurizmás populációban (6. és 7. táblázat). Ennek oka lehet a csoportonként relatíve kevés beteg, illetve a vizsgált zavaró paraméterek egymással való összefüggése (pl. kor, IMT, artériás kalcifikáció, kreatinin ismerten együtt változik). A homocisztein szint a normál értéknél magasabbnak bizonyult az atherosclerotikus csoportban és szignifikánsan különbözött a Marfan szindrómás betegekétől. Jól ismert, hogy a

hiperhomociszteinémia

jelentős

szerepet

játszik

az

érbetegségekben

(atherosclerosisban, trombózisban egyaránt) [136]. Aorta aneurizmában, aorta disszekcióban, Marfan szindrómában szintén leírtak magasabb homocisztein szinteket (az utóbbit eredményeink nem erősítették meg). Általában a magasabb homocisztein szintek súlyosabb érbetegséggel járnak együtt [137]. A hiperhomociszteinémia a mátrix metalloproteinázok (MMP-2, MMP-9) fokozott aktivációjával is jár, mely az aneurizmatikus aortafal tunica mediájában az elasztikus és kollagén rostok további degradációját okozza. MMP-2 és MMP-9 hiányos egereken végzett kísérletek igazolták, hogy a MMP-k szerepet játszanak az aorta aneurizmák kialakulásában [97]. A homocisztein pontos szerepe az aneurizmaképződésben még nem tisztázott és további vizsgálatok szükségesek a fetuin-A és homocisztein aorta betegségekben esetleg fennálló kapcsolatának tisztázása céljából is. A szérum kreatinin koncentráció szignifikánsan magasabb, a GFR értékek szignifikánsan alacsonyabbak voltak az atherosclerotikus aneurizmás csoportban, de medián értékük éppen a fiziológiás limitnél volt. Az atherosclerotikus betegnek nagyobb eséllyel lehet érbetegsége más szervben is, pl. a vese artériákban. Azon tanulmányok eredményei, melyek a fetuin-A szint összefüggéseit vizsgálták enyhe vesebetegségben, ellentmondásosak [107, 138], de ezek a vizsgálatok a vaszkuláris

57

kalcifikáció különböző aspektusát vizsgálták, pl. kardiovaszkuláris mortalitás és artériás stiffness. Bár más szerzők kapcsolatot mutattak ki a szérum fetuin-A szint és a diabétesz között [139], ezt jelen vizsgálatunk csoportjaiban igazolni nem tudtuk Vizsgálatunk limitációi: Ez a vizsgálatunk is keresztmetszeti jellegű, tehát utánkövetési adat még nem elérhető, a fetuin-A szint időbeni alakulásáról információnk nincs. A Marfan szindrómás csoportba bevont betegek száma alacsony, ez a betegség ritkaságának tulajdonítható. További nehézséget jelent az ideális, kor szerint egyező kontroll csoport megtalálása, tekintettel arra, hogy a klinikai panaszokat okozó atherosclerosis a 60-70 év körül a leggyakoribb és ebben az életkorban még a panaszmentes embereknek is gyakran diagnosztizálhatunk (akár meszes plakkokkal járó) szubklinikus atherosclerosist. Más szempontból a Marfan szindrómás és műtéti kezelést igénylő aorta aneurizmával rendelkező betegek várható élettartama rövidebb, a Marfan szindrómás betegek átlagéletkora nem meglepő módon alacsonyabb. A két aneurizmás csoport (ASA és Marfan szindróma) között talált fetuin-A különbség nem független egyéb paraméterektől, de a két atherosclerotikus csoport (ASA és PAD) összevetésének eredményei a nem atherosclerotikus csoportokkal (Marfan szindróma és kontroll) támogatják a fetuin-A potenciális szerepét az atherosclerosisban. 5. 3. A HSP70 SZÉRUM SZINTJE ÖSSZEFÜGG AZ ARTÉRIÁS KALCIFIKÁCIÓ SÚLYOSSÁGÁVAL PERIFÉRIÁS ÉRBETEGEKBEN Vizsgálatunk új eredménye, hogy a Hsp70 szérum szint pozitív korrelációban áll a szisztémás artériás kalcifikációval krónikus alsó végtagi érbetegekben és súlyos carotis stenosisos betegekben. Szintén szignifikáns összefüggést találtunk a Hsp 70 és a homocisztein szintek között e betegcsoportban. A vizsgált paraméterek részletes elemzése során szignifikáns kapcsolatot találtunk a Hsp70 és a kor, illetve a szérum bilirubin koncentráció között is. A Hsp70 nem mutatott összefüggést az akut fázis fehérjékkel, a CRP és a fetuin-A szinttel. Korábbi tanulmányok valószínűsítették egy Hsp csoportba tartozó molekula kapcsolatát kardiovaszkuláris betegségekkel, de az eredmények nem egyértelműek. A különböző beteganyagban (szívbetegek, alsó végtagi érbetegek, carotis stenosisos betegek) végzett vizsgálatok, melyek a Hsp70 szintet vizsgálták, egyaránt mutattak pozitív és negatív korrelációt is [140, 141]. Az ellentmondás a különböző

58

betegcsoportokból, a mintavételi technika különbségeiből és az eltérő ELISA technikából származhat, de a Hsp70 szintet befolyásoló hatásmechanizmusok pontosan nem ismertek. Megfigyeléseink összevágnak Wright és mtsainak [142], illetve Zhang és mtsainak [140] eredményeivel abból a szempontból, hogy a magasabb Hsp70 szérum koncentráció összefügg a perifériás érbetegség súlyosságával. Beteganyagunkban a Hsp70 szintek szignifikánsan korreláltak az artériás meszesedés mértékével alsó végtagi érbetegekben, carotis betegekben és a kombinált csoportban is. Logisztikus regressziós analízissel igazoltuk, hogy ez az összefüggés független a vesefunctiós értékektől (nem uraemiás beteganyag) és a gyulladásos paraméterektől (ismert infectio nélküli populáció). Az enyhe (KS: 1-5), illetve súlyosan (KS: 6-7) meszes artériákkal rendelkező két csoport összehasonlítása során a következő paramétereket vizsgáltuk a logisztikus regressziós modellel: kor, nem, eGFR, dohányzás, CRP és homocisztein koncentráció. A felső Hsp70 koncentráció kvartilisba (>75% percentilis, 0,7296 ng/ml) tartozó betegeknek több mint kétszer nagyobb volt az esélyük, hogy a súlyosabban kalcifikált csoportba tartozzanak. Ez az összefüggés független volt a fent említett paraméterektől. Továbbá nem találtunk szignifikáns kapcsolatot a Hsp 70 és a vesefunctiós értékek (kreatinin és karbamid) között, ami azt jelzi, hogy a súlyosabb kalcifikációval járó magasabb Hsp70 szintet nem a csökkent veseműködéssel esetleg együtt járó csökkent Hsp70 ürítés okozza. Pockley és mtsai [143] prospektív vizsgálatukban igazolták, hogy a magasabb szérum Hsp70 koncentráció mérsékli a carotis IMT progresszióját hipertóniás betegekben. Ezt

vizsgálatunkkal

keresztmetszeti

alátámasztani

jellegéből

és

nem

tudtuk,

származhat

a

mely adódik

súlyosabban

a

vizsgálat

atherosclerotikus

betegcsoportból. Dulin és mtsainak [144] vizsgálata nem mutatott semmilyen szignifikáns összefüggést a keringő Hsp70 koncentrációk és az ismert atherosclerosis kockázati tényezők, mint a CRP és a homocisztein között. Vizsgálatunkban szignifikáns pozitív összefüggést találtunk a Hsp70 és a homocisztein szérum szintek között. A hiperhomociszteinémia leírt, független preditív kockázati tényező számos érbetegségben

[145]

és

apolipoprotein

E

hiányos

egérben

elősegíti

az

atherosclerotikus laesiók kialakulását a Hsp70–et is magában foglaló mechanizmuson keresztül [146]. Egy másik figyelemre méltó állatkísérlet szerint a Hsp70 a MGP

59

megkötésével serkenti a BMP-4 működését, mely BMP indukálta kalcium depozícióhoz vezet. Ezen felül a Hsp70 az IL-6 kalcifikációt erősítő hatásában is részt vesz a CVC-kel kapcsolatban [62]. A Hsp70 forrása ma sem pontosan tisztázott. Febbraio és mtsai [147] fokozott Hsp70 felszabadulást észleltek a splanchnikus szövetekből a véráramba fizikai terhelés kapcsán. Anyagunkban szignifikáns pozitív kapcsolatot találtunk a Hsp70 és a bilirubin szérum koncentrációk között. Ez felveti a lehetőségét, hogy visceralis (hepatikus) károsodás állhat az emelkedett Hsp70 szint mögött, így a Hsp70 termelődés helye a máj is, mely feltételezést korábbi (más beteganyagon végzett) vizsgálatok is alátámasztanak [148, 149]; azonban jelen vizsgálatunkban az egyéb májfunkciós értékek (ALT, AST, GGT) nem utaltak májkárosodásra. Más elmélet szerint a keringő Hsp70 molekulák az ox-LDL vagy homocisztein által indukált endothel sejtekből származnak [150]. A hiperhomociszteinémia endoplazmatikus stressz indukáló tényezőként apoptózist okoz az endothel sejtekben [151]. Továbbá a sejthalál miatt extracellulárissá váló Hsp70 aktiválhatja a komponens rendszert, cytokin termelést stimulálhat a makrofág sejtekben [152]. A Hsp70 szerepe az atherosclerosisban továbbra sem tisztázott. Nem egyértelmű, hogy a magasabb Hsp70 szérum szint vezet-e atherosclerosishoz, vagy a diffúz kalcifikáció vezet fokozott termelődéséhez és atheroprotektív szerepe lenne. A Hsp70 és különböző atherosclerotikus folyamatok között megfigyelt (olykor egymásnak ellentmondó) összefüggések okának feltárása továbbra is szükséges.

60

6. KÖVETKEZTETÉSEK A dolgozat fő megállapításai a következők: 1. A szérum fetuin-A szint és a szisztémás artériás kalcifikáció súlyossága között negatív korreláció áll fenn előrehaladott krónikus alsó végtagi atherosclerotikus, infekciómentes, normál veseműködésű betegekben. Ez újabb betegcsoportban támasztja alá a fetuin-A érfalmeszesedést gátló feltételezett hatását. Eszerint nem az 5. stádiumú krónikus vesebetegség és a hemodializált betegek krónikus infekciós állapota magyarázza az alacsony fetuin-A szint és a fokozott artériás kalcifikáció kapcsolatát. Az alacsonyabb fetuin-A szérum szintek súlyosabb artériás kalcifikációval járnak együtt az UH-gal meghatározott kalcifikációs score szerint. Az észlelt összefüggés kortól, nemtől, BMI-től, diabétesztől, dohányzástól, koleszterin szinttől, triglicerid szinttől, HDL és CRP szinttől is független volt a logisztikus regressziós analízis szerint. Az angiográfiás felvételek alapján számolt atherosclerosist leíró Bollinger score és a fetuin-A szint között is szignifikáns összefüggés állt fenn, de ez a vizsgált fenti paraméterektől nem volt független. Nem találtunk szignifikáns korrelációt a fetuin-A és a carotis IMT, ABI, illetve a Fontaine stádiumok súlyossága között. 2. A szérum fetuin-A szint szignifikánsan különbözik az eltérő etiológiájú aorta aneurizmás betegekben: az atherosclerotikus betegekben alacsonyabb, mint a Marfan szindrómásokban. Ez a megfigyelés újabb kontroll csoportban igazolja a fetuin-A lehetséges gátló szerepét az artériás kalcifikációban. Az aneurizmák képződésében a fetuin-A jelentőségének megismerése további vizsgálatokat igényel. A fetuin-A atherosclerosisban és artériás

kalcifikációban játszott szerepét

alátámasztja az a megfigyelésünk, hogy a két aneurizmás csoport (atherosclerotikus és Marfan szindrómás betegek) között tapasztalt szignifikáns fetuin-A szint különbség (p= 0,0428) mellett a perifériás érbetegek és a Marfan szindrómások között is (p= 0,0339), illetve az atherosclerotikus aneurizmások és az egészséges kontroll csoport között is szignifikáns volt a különbség (p=0,0155). Ebben a nem vesebeteg

61

populációban szignifikáns különbséget találtunk az atherosclerotikus és a Marfan szindrómás csoport között a szérum kreatinin szint és a számított GFR érték vonatkozásában (mindkét esetben p< 0,0001). Ebben az atherosclerosisban gyakoribb nagy és kis renális artériák sclerosisa játszhat szerepet. Egyéb akut fázis fehérjék vonatkozásában nem találtunk szignifikáns különbséget a két aneurizmás csoport között, mely igazolta a betegek infekciómentes állapotát, így az nem befolyásolhatta a fetuin-A szint különbséget.

Lipid profil és diabétesz

szempontjából a két csoport között különbség nem volt. Szignifikánsan magasabb homocisztein szinteket találtunk az atherosclerotikus csoportban (p= 0,0034). Az aneurizma képződésben a homocisztein szerepe, illetve a fetuin-A-val való kölcsönhatása jelenleg ismeretlen. 3. A Hsp70 szérum szint egyéb atherosclerotikus rizikótényezőktől függetlenül pozitív korrelációt mutat az atherosclerosisban észlelhető artériás kalcifikáció mértékével. A magas Hsp70 szintű betegek artériafal meszesedése vizsgálatunk szerint súlyosabb mértékű, ez előjelezheti a várható kardiovaszkuláris események bekövetkeztét. A perifériás érbetegekben (carotis stenosisos és alsó végtagi érbetegek, illetve a kettő kombinációja) a magasabb Hsp70 szérumszinthez súlyosabb szisztémás artériás kalcifikáció társul (r= 0,169, p= 0,025, Spearman korreláció). A felső Hsp70 kvartilisba tartozó betegeknek több mint kétszerese volt az esélye, hogy a legsúlyosabb érelmeszesedést mutató csoportba (KS= 6-7) kerüljenek (OR: 2,189, 95%-os CI: 1,156-4,144, p= 0,016). Logisztikus regressziós analízissel igazoltuk, hogy a Hsp70 és az artériás kalcifikáció kapcsolat független a kortól, nemtől, eGFRtól, dohányzástól, a CRP és homocisztein szinttől. Az atherosclerosis anatómiai helye alapján felállított csoportosítás 3 csoportja között nem találtunk szignifikáns Hsp70 szint különbséget. A carotis IMT, illetve az ABI és a Hsp70 között kapcsolatot nem találtunk. Az anamnesztikus adatok közül a nem, a BMI, a hipertónia, a diabétesz, az iszkémiás szívbetegség megléte sem mutatott összefüggést a Hsp70 szinttel. A korrelációs vizsgálat analízise során szignifikáns kapcsolatot találtunk a Hsp70 szérum szintje és a szérum bilirubin és gamma GT szint között is, mely a Hsp70 májban történő termelődésére utal. A Hsp70 és a homocisztein szintek között

62

szignifikáns, pozitív korrelációt találtunk (r= 0,179, p= 0,018, Spearman korreláció) melyet az endothel sejtek apoptózisa magyarázhat. A Hsp70 és a fetuin-A között korrelációt nem tapasztaltunk, a két molekula eltérő mechanizmusokon keresztül vesz részt az atherosclerotikus kalcifikáció mechanizmusában.

63

7. 1. ÖSSZEFOGLALÁS Az atherosclerosis megjelenését a genetikai determináltság mellett károsító életkörülmények befolyásolják, de ezek nem mindig magyarázzák kialakulását. Az atherosclerosis artériás meszesedéssel járhat együtt, mely összefügg az életkilátások romlásával. A fetuin-A egy számos élettani hatással bíró, szisztémásan ható szérum glikoprotein, mely az extraosszeális kalcifikáció gátlásában szerepet játszik. Ismert, hogy végstádiumú vesebetegekben alacsony szérum szintje összefügg az artériás kalcifikáció súlyosságával és a kardiovaszkuláris mortalitással. Célunk volt, hogy vizsgáljuk a fetuin-A lehetséges artériás kalcifikációt gátló szerepét nem vesebeteg, infekciómentes populációban, ismerten atherosclerotikus, krónikus perifériás érbetegekben. Keresztmetszeti vizsgálataink során carotis szűkületes, aorta aneurizmás és alsó végtagi atherosclerotikus betegekben vizsgáltuk a klasszikus rizikótényezők jelenlétét; ultrahang és angiográfiás vizsgálattal mértük az artériás kalcifikáció és az atherosclerosis súlyosságát, illetve laboratóriumi módszerrel vizsgáltuk a szérumot. Igazoltuk, hogy a szérum fetuin-A szint és a szisztémás artériás kalcifikáció súlyossága között negatív korreláció áll fenn krónikus alsó végtagi atherosclerotikus, infekciómentes, normál veseműködésű betegekben. Eszerint nem a végstádiumú krónikus vesebetegség és a dialízis magyarázza az alacsony fetuin-A szint és a fokozott artériás kalcifikáció kapcsolatát. Elsőként mutattuk ki, hogy a szérum fetuin-A szint szignifikánsan különbözik az eltérő etiológiájú aorta aneurizmás betegekben: az atherosclerotikus betegekben alacsonyabb, mint a Marfan szindrómásokban. A különbséget a perifériás érbetegekkel és az egészséges kontroll csoporttal történt összehasonlítás eredményei is alátámasztják. Igazoltuk, hogy a Hsp70 szérum szint a fetuin-A szinttől és egyéb atherosclerotikus rizikótényezőktől függetlenül pozitív korrelációt mutat az atherosclerosisban észlelhető artériás kalcifikáció mértékével. Vizsgálataink alapján kijelenthetjük, hogy a fetuin-A szint és az artériás kalcifikáció súlyossága között kapcsolat van vesebetegség hiányában is. A keresztmetszeti vizsgálatok oko-okozati összefüggés feltárására nem alkalmasak, a kardiovaszkuláris események és a mortalitás értékelésére utánkövetéses vizsgálatok indokoltak.

64

7. 2. SUMMARY Development of atherosclerosis is determined by genetic predisposition and harmful environmental factors, but these elements do not always explain the disease. Atherosclerosis may present with arterial calcification, which associates with increased cardiovascular morbidity and mortality. Fetuin-A is a systemic glycoprotein bearing several physiologic effects and plays role in the inhibition of extraosseal calcification. The low serum level of fetuin-A in end-stage renal disease patients is related to more severe arterial calcification and higher cardiovascular mortality. The aim of our study was to examine the potential role of fetuin-A in the inhibition of arterial calcification in a population with chronic, atherosclerotic peripheral disease without renal disease or infection. The presence of classic risk factors of atherosclerosis, the severity of arterial calcification and atherosclerosis assessed by ultrasound and angiography, and serum analysis was examined in a cross-sectional study of patients with carotid stenosis, aortic aneurysm and lower extremity atherosclerosis. We demonstrated that there is an inverse correlation between serum fetuin-A levels and the severity of arterial calcification in patients with chronic atherosclerotic lower extremity disease without renal disease or infection. This finding suggests, that it is not end-stage renal disease and dialysis that explains the earlier reported association of low fetuin-A level and arterial calcification. The novel finding of our study was the significantly different serum fetuin-A level in patients with aortic aneurysm of different etiology (atherosclerosis and Marfan syndrome). The observed difference was emphasized by the results of comparing the aneurysm groups of patients with peripheral occlusive disease and healthy controls. We found that heat shock protein-70 serum levels significantly correlate with the degree of arterial calcification independently of fetuin-A and other atherosclerotic risk factors. Our results suggest that there is an association between serum fetuin-A levels and the severity of arterial calcification also in patients without renal failure. Our crosssectional study design is not suitable for exploring the possible causative role of fetuin-A in developing arterial calcification or its potential role as a biomarker.

65

8. IRODALOMJEGYZÉK 1.

Lerman A, Zeiher AM: Endothelial function: cardiac events. Circulation 2005, 111(3):363-368.

2.

Hajjar DP, Haberland ME: Lipoprotein trafficking in vascular cells. Molecular Trojan horses and cellular saboteurs. J Biol Chem 1997, 272(37):22975-22978.

3.

Krieger M: The other side of scavenger receptors: pattern recognition for host defense. Curr Opin Lipidol 1997, 8(5):275-280.

4.

Libby P, Aikawa M, Kinlay S, Selwyn A, Ganz P: Lipid lowering improves endothelial functions. Int J Cardiol 2000, 74 Suppl 1:S3-S10.

5.

Dollery CM, McEwan JR, Henney AM: Matrix metalloproteinases and cardiovascular disease. Circ Res 1995, 77(5):863-868.

6.

Dollery CM, Libby P: Atherosclerosis and proteinase activation. Cardiovasc Res 2006, 69(3):625-635.

7.

Geng YJ, Wu Q, Muszynski M, Hansson GK, Libby P: Apoptosis of vascular smooth muscle cells induced by in vitro stimulation with interferon-gamma, tumor necrosis factor-alpha, and interleukin-1 beta. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1996, 16(1):19-27.

8.

Davies MJ, Richardson PD, Woolf N, Katz DR, Mann J: Risk of thrombosis in human atherosclerotic plaques: role of extracellular lipid, macrophage, and smooth muscle cell content. Br Heart J 1993, 69(5):377-381.

9.

Galis ZS, Sukhova GK, Lark MW, Libby P: Increased expression of matrix metalloproteinases and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atherosclerotic plaques. J Clin Invest 1994, 94(6):2493-2503.

10.

Galis ZS, Muszynski M, Sukhova GK, Simon-Morrissey E, Unemori EN, Lark MW, Amento E, Libby P: Cytokine-stimulated human vascular smooth muscle cells synthesize a complement of enzymes required for extracellular matrix digestion. Circ Res 1994, 75(1):181-189.

11.

Farb A, Burke AP, Tang AL, Liang TY, Mannan P, Smialek J, Virmani R: Coronary plaque erosion without rupture into a lipid core. A frequent cause of coronary thrombosis in sudden coronary death. Circulation 1996, 93(7):13541363.

66

12.

Dawber TR, Kannel WB: The Framingham study. An epidemiological approach to coronary heart disease. Circulation 1966, 34(4):553-555.

13.

Stamler JS, Osborne JA, Jaraki O, Rabbani LE, Mullins M, Singel D, Loscalzo J: Adverse vascular effects of homocysteine are modulated by endotheliumderived relaxing factor and related oxides of nitrogen. J Clin Invest 1993, 91(1):308-318.

14.

Chambers

JC,

McGregor

hyperhomocysteinaemia

and

A,

Jean-Marie

endothelial

J,

Kooner

dysfunction.

JS:

Acute

Lancet

1998,

351(9095):36-37. 15.

Ross R: Atherosclerosis--an inflammatory disease. N Engl J Med 1999, 340(2):115-126.

16.

Sitia S, Tomasoni L, Atzeni F, Ambrosio G, Cordiano C, Catapano A, Tramontana S, Perticone F, Naccarato P, Camici P et al: From endothelial dysfunction to atherosclerosis. Autoimmun Rev, 9(12):830-834.

17.

Libby P: Inflammation in atherosclerosis. Nature 2002, 420(6917):868-874.

18.

Hansson GK, Libby P: The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol 2006, 6(7):508-519.

19.

Libby P, Ridker PM: Inflammation and atherosclerosis: role of C-reactive protein in risk assessment. Am J Med 2004, 116 Suppl 6A:9S-16S.

20.

Ridker PM, Hennekens CH, Buring JE, Rifai N: C-reactive protein and other markers of inflammation in the prediction of cardiovascular disease in women. N Engl J Med 2000, 342(12):836-843.

21.

Pepys MB, Hirschfield GM: C-reactive protein: a critical update. J Clin Invest 2003, 111(12):1805-1812.

22.

Zhu J, Nieto FJ, Horne BD, Anderson JL, Muhlestein JB, Epstein SE: Prospective study of pathogen burden and risk of myocardial infarction or death. Circulation 2001, 103(1):45-51.

23.

Wick G, Knoflach M, Xu Q: Autoimmune and inflammatory mechanisms in atherosclerosis. Annu Rev Immunol 2004, 22:361-403.

24.

Wick G, Schett G, Amberger A, Kleindienst R, Xu Q: Is atherosclerosis an immunologically mediated disease? Immunol Today 1995, 16(1):27-33.

67

25.

Gimbrone MA, Jr., Resnick N, Nagel T, Khachigian LM, Collins T, Topper JN: Hemodynamics, endothelial gene expression, and atherogenesis. Ann N Y Acad Sci 1997, 811:1-10; discussion 10-11.

26.

Demer LL: A skeleton in the atherosclerosis closet. Circulation 1995, 92(8):2029-2032.

27.

Hruska KA, Mathew S, Saab G: Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res 2005, 97(2):105-114.

28.

Watson KE, Bostrom K, Ravindranath R, Lam T, Norton B, Demer LL: TGFbeta 1 and 25-hydroxycholesterol stimulate osteoblast-like vascular cells to calcify. J Clin Invest 1994, 93(5):2106-2113.

29.

Doherty MJ, Canfield AE: Gene expression during vascular pericyte differentiation. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 1999, 9(1):1-17.

30.

Farrington-Rock C, Crofts NJ, Doherty MJ, Ashton BA, Griffin-Jones C, Canfield AE: Chondrogenic and adipogenic potential of microvascular pericytes. Circulation 2004, 110(15):2226-2232.

31.

Doherty MJ, Ashton BA, Walsh S, Beresford JN, Grant ME, Canfield AE: Vascular pericytes express osteogenic potential in vitro and in vivo. J Bone Miner Res 1998, 13(5):828-838.

32.

Tintut Y, Parhami F, Bostrom K, Jackson SM, Demer LL: cAMP stimulates osteoblast-like differentiation of calcifying vascular cells. Potential signaling pathway for vascular calcification. J Biol Chem 1998, 273(13):7547-7553.

33.

Mohler ER, 3rd, Gannon F, Reynolds C, Zimmerman R, Keane MG, Kaplan FS: Bone formation and inflammation in cardiac valves. Circulation 2001, 103(11):1522-1528.

34.

Collett GD, Canfield AE: Angiogenesis and pericytes in the initiation of ectopic calcification. Circ Res 2005, 96(9):930-938.

35.

Iribarren C, Sidney S, Sternfeld B, Browner WS: Calcification of the aortic arch: risk factors and association with coronary heart disease, stroke, and peripheral vascular disease. JAMA 2000, 283(21):2810-2815.

36.

Asou Y, Rittling SR, Yoshitake H, Tsuji K, Shinomiya K, Nifuji A, Denhardt DT, Noda M: Osteopontin facilitates angiogenesis, accumulation of osteoclasts, and resorption in ectopic bone. Endocrinology 2001, 142(3):1325-1332.

68

37.

Wang EA, Rosen V, D'Alessandro JS, Bauduy M, Cordes P, Harada T, Israel DI, Hewick RM, Kerns KM, LaPan P et al: Recombinant human bone morphogenetic protein induces bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A 1990, 87(6):2220-2224.

38.

Davies MR, Lund RJ, Hruska KA: BMP-7 is an efficacious treatment of vascular calcification in a murine model of atherosclerosis and chronic renal failure. J Am Soc Nephrol 2003, 14(6):1559-1567.

39.

Newman JH, Wheeler L, Lane KB, Loyd E, Gaddipati R, Phillips JA, 3rd, Loyd JE: Mutation in the gene for bone morphogenetic protein receptor II as a cause of primary pulmonary hypertension in a large kindred. N Engl J Med 2001, 345(5):319-324.

40.

Arbustini E, Morbini P, D'Armini AM, Repetto A, Minzioni G, Piovella F, Vigano M, Tavazzi L: Plaque composition in plexogenic and thromboembolic pulmonary hypertension: the critical role of thrombotic material in pultaceous core formation. Heart 2002, 88(2):177-182.

41.

Farquhar J, Makhseed N, Sargent M, Taylor G, Osiovich H: Idiopathic infantile arterial calcification and persistent pulmonary hypertension. Am J Perinatol 2005, 22(3):121-125.

42.

Otto F, Thornell AP, Crompton T, Denzel A, Gilmour KC, Rosewell IR, Stamp GW, Beddington RS, Mundlos S, Olsen BR et al: Cbfa1, a candidate gene for cleidocranial dysplasia syndrome, is essential for osteoblast differentiation and bone development. Cell 1997, 89(5):765-771.

43.

Mundlos S, Otto F, Mundlos C, Mulliken JB, Aylsworth AS, Albright S, Lindhout D, Cole WG, Henn W, Knoll JH et al: Mutations involving the transcription factor CBFA1 cause cleidocranial dysplasia. Cell 1997, 89(5):773779.

44.

Moe SM, Duan D, Doehle BP, O'Neill KD, Chen NX: Uremia induces the osteoblast differentiation factor Cbfa1 in human blood vessels. Kidney Int 2003, 63(3):1003-1011.

45.

Nakashima K, Zhou X, Kunkel G, Zhang Z, Deng JM, Behringer RR, de Crombrugghe B: The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is

69

required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell 2002, 108(1):1729. 46.

Jono S, McKee MD, Murry CE, Shioi A, Nishizawa Y, Mori K, Morii H, Giachelli CM: Phosphate regulation of vascular smooth muscle cell calcification. Circ Res 2000, 87(7):E10-17.

47.

Chen NX, O'Neill KD, Duan D, Moe SM: Phosphorus and uremic serum upregulate osteopontin expression in vascular smooth muscle cells. Kidney Int 2002, 62(5):1724-1731.

48.

Jono S, Nishizawa Y, Shioi A, Morii H: 1,25-Dihydroxyvitamin D3 increases in vitro vascular calcification by modulating secretion of endogenous parathyroid hormone-related peptide. Circulation 1998, 98(13):1302-1306.

49.

Franceschi RT, Xiao G: Regulation of the osteoblast-specific transcription factor, Runx2: responsiveness to multiple signal transduction pathways. J Cell Biochem 2003, 88(3):446-454.

50.

Katsumata K, Kusano K, Hirata M, Tsunemi K, Nagano N, Burke SK, Fukushima N: Sevelamer hydrochloride prevents ectopic calcification and renal osteodystrophy in chronic renal failure rats. Kidney Int 2003, 64(2):441-450.

51.

Block GA, Spiegel DM, Ehrlich J, Mehta R, Lindbergh J, Dreisbach A, Raggi P: Effects of sevelamer and calcium on coronary artery calcification in patients new to hemodialysis. Kidney Int 2005, 68(4):1815-1824.

52.

Chertow GM, Burke SK, Raggi P, Treat to Goal Working G: Sevelamer attenuates the progression of coronary and aortic calcification in hemodialysis patients. Kidney Int 2002, 62(1):245-252.

53.

Norman PE, Powell JT: Vitamin D, shedding light on the development of disease in peripheral arteries. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005, 25(1):39-46.

54.

Price PA, Faus SA, Williamson MK: Warfarin causes rapid calcification of the elastic lamellae in rat arteries and heart valves. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998, 18(9):1400-1407.

55.

Koos R, Mahnken AH, Muhlenbruch G, Brandenburg V, Pflueger B, Wildberger JE, Kuhl HP: Relation of oral anticoagulation to cardiac valvular and coronary calcium assessed by multislice spiral computed tomography. Am J Cardiol 2005, 96(6):747-749.

70

56.

Mori K, Shioi A, Jono S, Nishizawa Y, Morii H: Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999, 19(9):2112-2118.

57.

Kirton JP, Wilkinson FL, Canfield AE, Alexander MY: Dexamethasone downregulates calcification-inhibitor molecules and accelerates osteogenic differentiation of vascular pericytes: implications for vascular calcification. Circ Res 2006, 98(10):1264-1272.

58.

Whyte MP: Hypophosphatasia and the role of alkaline phosphatase in skeletal mineralization. Endocr Rev 1994, 15(4):439-461.

59.

Lomashvili KA, Cobbs S, Hennigar RA, Hardcastle KI, O'Neill WC: Phosphateinduced vascular calcification: role of pyrophosphate and osteopontin. J Am Soc Nephrol 2004, 15(6):1392-1401.

60.

Proudfoot D, Skepper JN, Hegyi L, Bennett MR, Shanahan CM, Weissberg PL: Apoptosis regulates human vascular calcification in vitro: evidence for initiation of vascular calcification by apoptotic bodies. Circ Res 2000, 87(11):1055-1062.

61.

Reynolds JL, Joannides AJ, Skepper JN, McNair R, Schurgers LJ, Proudfoot D, Jahnen-Dechent W, Weissberg PL, Shanahan CM: Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. J Am Soc Nephrol 2004, 15(11):2857-2867.

62.

Yao Y, Watson AD, Ji S, Bostrom KI: Heat shock protein 70 enhances vascular bone morphogenetic protein-4 signaling by binding matrix Gla protein. Circ Res 2009, 105(6):575-584.

63.

Rutsch F, Ruf N, Vaingankar S, Toliat MR, Suk A, Hohne W, Schauer G, Lehmann M, Roscioli T, Schnabel D et al: Mutations in ENPP1 are associated with 'idiopathic' infantile arterial calcification. Nat Genet 2003, 34(4):379-381.

64.

Johnson K, Polewski M, van Etten D, Terkeltaub R: Chondrogenesis mediated by PPi depletion promotes spontaneous aortic calcification in NPP1-/- mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005, 25(4):686-691.

71

65.

Hashiba H, Aizawa S, Tamura K, Kogo H: Inhibition of the progression of aortic calcification by etidronate treatment in hemodialysis patients: long-term effects. Ther Apher Dial 2006, 10(1):59-64.

66.

Zebboudj AF, Imura M, Bostrom K: Matrix GLA protein, a regulatory protein for bone morphogenetic protein-2. J Biol Chem 2002, 277(6):4388-4394.

67.

Wallin R, Cain D, Hutson SM, Sane DC, Loeser R: Modulation of the binding of matrix Gla protein (MGP) to bone morphogenetic protein-2 (BMP-2). Thromb Haemost 2000, 84(6):1039-1044.

68.

Luo G, Ducy P, McKee MD, Pinero GJ, Loyer E, Behringer RR, Karsenty G: Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature 1997, 386(6620):78-81.

69.

Hao H, Hirota S, Ishibashi-Ueda H, Kushiro T, Kanmatsuse K, Yutani C: Expression of matrix Gla protein and osteonectin mRNA by human aortic smooth muscle cells. Cardiovasc Pathol 2004, 13(4):195-202.

70.

Herrmann SM, Whatling C, Brand E, Nicaud V, Gariepy J, Simon A, Evans A, Ruidavets JB, Arveiler D, Luc G et al: Polymorphisms of the human matrix gla protein (MGP) gene, vascular calcification, and myocardial infarction. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000, 20(11):2386-2393.

71.

Scatena M, Liaw L, Giachelli CM: Osteopontin: a multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2007, 27(11):2302-2309.

72.

Van Campenhout A, Golledge J: Osteoprotegerin, vascular calcification and atherosclerosis. Atherosclerosis 2009, 204(2):321-329.

73.

Kiechl S, Werner P, Knoflach M, Furtner M, Willeit J, Schett G: The osteoprotegerin/RANK/RANKL system: a bone key to vascular disease. Expert Rev Cardiovasc Ther 2006, 4(6):801-811.

74.

Giachelli CM: Vascular calcification mechanisms. J Am Soc Nephrol 2004, 15(12):2959-2964.

75.

Hunt JL, Fairman R, Mitchell ME, Carpenter JP, Golden M, Khalapyan T, Wolfe M, Neschis D, Milner R, Scoll B et al: Bone formation in carotid plaques: a clinicopathological study. Stroke 2002, 33(5):1214-1219.

72

76.

Davies MR, Hruska KA: Pathophysiological mechanisms of vascular calcification in end-stage renal disease. Kidney Int 2001, 60(2):472-479.

77.

London GM, Marchais SJ, Guerin AP, Metivier F: Arteriosclerosis, vascular calcifications and cardiovascular disease in uremia. Curr Opin Nephrol Hypertens 2005, 14(6):525-531.

78.

Yener N, Oktar GL, Erer D, Yardimci MM, Yener A: Bicuspid aortic valve. Ann Thorac Cardiovasc Surg 2002, 8(5):264-267.

79.

Weenig RH, Sewell LD, Davis MD, McCarthy JT, Pittelkow MR: Calciphylaxis: natural history, risk factor analysis, and outcome. J Am Acad Dermatol 2007, 56(4):569-579.

80.

Johnson RC, Leopold JA, Loscalzo J: Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res 2006, 99(10):1044-1059.

81.

Arnaud P, Kalabay L: Alpha2-HS glycoprotein: a protein in search of a function. Diabetes Metab Res Rev 2002, 18(4):311-314.

82.

Dziegielewska KM, Brown WM, Casey SJ, Christie DL, Foreman RC, Hill RM, Saunders NR: The complete cDNA and amino acid sequence of bovine fetuin. Its homology with alpha 2HS glycoprotein and relation to other members of the cystatin superfamily. J Biol Chem 1990, 265(8):4354-4357.

83.

Kellermann J, Haupt H, Auerswald EA, Muller-Ester W: The arrangement of disulfide loops in human alpha 2-HS glycoprotein. Similarity to the disulfide bridge structures of cystatins and kininogens. J Biol Chem 1989, 264(24):1412114128.

84.

Osawa M, Yuasa I, Kitano T, Henke J, Kaneko M, Udono T, Saitou N, Umetsu K: Haplotype analysis of the human alpha2-HS glycoprotein (fetuin) gene. Ann Hum Genet 2001, 65(Pt 1):27-34.

85.

Stenvinkel P, Wang K, Qureshi AR, Axelsson J, Pecoits-Filho R, Gao P, Barany P, Lindholm B, Jogestrand T, Heimburger O et al: Low fetuin-A levels are associated with cardiovascular death: Impact of variations in the gene encoding fetuin. Kidney Int 2005, 67(6):2383-2392.

86.

Osawa M, Tian W, Horiuchi H, Kaneko M, Umetsu K: Association of alpha2HS glycoprotein (AHSG, fetuin-A) polymorphism with AHSG and phosphate serum levels. Hum Genet 2005, 116(3):146-151.

73

87.

Fisher E, Stefan N, Saar K, Drogan D, Schulze MB, Fritsche A, Joost HG, Haring HU, Hubner N, Boeing H et al: Association of AHSG gene polymorphisms with fetuin-A plasma levels and cardiovascular diseases in the EPIC-Potsdam study. Circ Cardiovasc Genet 2009, 2(6):607-613.

88.

Lehtinen AB, Burdon KP, Lewis JP, Langefeld CD, Ziegler JT, Rich SS, Register TC, Carr JJ, Freedman BI, Bowden DW: Association of alpha2Heremans-Schmid glycoprotein polymorphisms with subclinical atherosclerosis. J Clin Endocrinol Metab 2007, 92(1):345-352.

89.

Kalabay L, Cseh K, Benedek S, Fekete S, Masszi T, Herjeczki K, Pozsonyi T, Jakab L: Serum alpha 2-HS glycoprotein concentration in patients with hematological malignancies. A follow-up study. Ann Hematol 1991, 63(5):264269.

90.

Kalabay L, Jakab L, Prohaszka Z, Fust G, Benko Z, Telegdy L, Lorincz Z, Zavodszky P, Arnaud P, Fekete B: Human fetuin/alpha2HS-glycoprotein level as a novel indicator of liver cell function and short-term mortality in patients with liver cirrhosis and liver cancer. Eur J Gastroenterol Hepatol 2002, 14(4):389-394.

91.

Auberger P, Falquerho L, Contreres JO, Pages G, Le Cam G, Rossi B, Le Cam A: Characterization of a natural inhibitor of the insulin receptor tyrosine kinase: cDNA cloning, purification, and anti-mitogenic activity. Cell 1989, 58(4):631640.

92.

Mathews ST, Singh GP, Ranalletta M, Cintron VJ, Qiang X, Goustin AS, Jen KL, Charron MJ, Jahnen-Dechent W, Grunberger G: Improved insulin sensitivity and resistance to weight gain in mice null for the Ahsg gene. Diabetes 2002, 51(8):2450-2458.

93.

Stefan N, Hennige AM, Staiger H, Machann J, Schick F, Krober SM, Machicao F, Fritsche A, Haring HU: Alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein/fetuin-A is associated with insulin resistance and fat accumulation in the liver in humans. Diabetes Care 2006, 29(4):853-857.

94.

Ix JH, Shlipak MG, Brandenburg VM, Ali S, Ketteler M, Whooley MA: Association between human fetuin-A and the metabolic syndrome: data from the Heart and Soul Study. Circulation 2006, 113(14):1760-1767.

74

95.

Ix JH, Wassel CL, Kanaya AM, Vittinghoff E, Johnson KC, Koster A, Cauley JA, Harris TB, Cummings SR, Shlipak MG et al: Fetuin-A and incident diabetes mellitus in older persons. JAMA 2008, 300(2):182-188.

96.

Ray S, Lukyanov P, Ochieng J: Members of the cystatin superfamily interact with MMP-9 and protect it from autolytic degradation without affecting its gelatinolytic activities. Biochim Biophys Acta 2003, 1652(2):91-102.

97.

Longo GM, Xiong W, Greiner TC, Zhao Y, Fiotti N, Baxter BT: Matrix metalloproteinases 2 and 9 work in concert to produce aortic aneurysms. J Clin Invest 2002, 110(5):625-632.

98.

McFarlane SI, Muniyappa R, Shin JJ, Bahtiyar G, Sowers JR: Osteoporosis and cardiovascular disease: brittle bones and boned arteries, is there a link? Endocrine 2004, 23(1):1-10.

99.

Fiore CE, Celotta G, Politi GG, Di Pino L, Castelli Z, Mangiafico RA, Signorelli SS, Pennisi P: Association of high alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein/fetuin concentration in serum and intima-media thickness in patients with atherosclerotic vascular disease and low bone mass. Atherosclerosis 2007, 195(1):110-115.

100.

van der Klift M, Pols HA, Hak AE, Witteman JC, Hofman A, de Laet CE: Bone mineral density and the risk of peripheral arterial disease: the Rotterdam Study. Calcif Tissue Int 2002, 70(6):443-449.

101.

Schinke T, Amendt C, Trindl A, Poschke O, Muller-Esterl W, Jahnen-Dechent W: The serum protein alpha2-HS glycoprotein/fetuin inhibits apatite formation in vitro and in mineralizing calvaria cells. A possible role in mineralization and calcium homeostasis. J Biol Chem 1996, 271(34):20789-20796.

102.

Schafer C, Heiss A, Schwarz A, Westenfeld R, Ketteler M, Floege J, MullerEsterl W, Schinke T, Jahnen-Dechent W: The serum protein alpha 2-HeremansSchmid glycoprotein/fetuin-A is a systemically acting inhibitor of ectopic calcification. J Clin Invest 2003, 112(3):357-366.

103.

Ketteler M, Bongartz P, Westenfeld R, Wildberger JE, Mahnken AH, Bohm R, Metzger T, Wanner C, Jahnen-Dechent W, Floege J: Association of low fetuinA (AHSG) concentrations in serum with cardiovascular mortality in patients on dialysis: a cross-sectional study. Lancet 2003, 361(9360):827-833.

75

104.

Hermans MM, Brandenburg V, Ketteler M, Kooman JP, van der Sande FM, Boeschoten EW, Leunissen KM, Krediet RT, Dekker FW, Netherlands cooperative study on the adequacy of D: Association of serum fetuin-A levels with mortality in dialysis patients. Kidney Int 2007, 72(2):202-207.

105.

Mehrotra R: Emerging role for fetuin-A as contributor to morbidity and mortality in chronic kidney disease. Kidney Int 2007, 72(2):137-140.

106.

Ix JH, Chertow GM, Shlipak MG, Brandenburg VM, Ketteler M, Whooley MA: Fetuin-A and kidney function in persons with coronary artery disease--data from the Heart and Soul Study. Nephrol Dial Transplant 2006, 21(8):2144-2151.

107.

Ix JH, Shlipak MG, Sarnak MJ, Beck GJ, Greene T, Wang X, Kusek JW, Collins AJ, Levey AS, Menon V: Fetuin-A is not associated with mortality in chronic kidney disease. Kidney Int 2007, 72(11):1394-1399.

108.

Cozzolino M, Galassi A, Biondi ML, Turri O, Papagni S, Mongelli N, Civita L, Gallieni M, Brancaccio D: Serum fetuin-A levels link inflammation and cardiovascular calcification in hemodialysis patients. Am J Nephrol 2006, 26(5):423-429.

109.

Kaden JJ, Reinohl JO, Blesch B, Brueckmann M, Haghi D, Borggrefe M, Schmitz F, Klomfass S, Pillich M, Ortlepp JR: Systemic and local levels of fetuin-A in calcific aortic valve stenosis. Int J Mol Med 2007, 20(2):193-197.

110.

Wang AY, Woo J, Lam CW, Wang M, Chan IH, Gao P, Lui SF, Li PK, Sanderson JE: Associations of serum fetuin-A with malnutrition, inflammation, atherosclerosis and valvular calcification syndrome and outcome in peritoneal dialysis patients. Nephrol Dial Transplant 2005, 20(8):1676-1685.

111.

Ix JH, Chertow GM, Shlipak MG, Brandenburg VM, Ketteler M, Whooley MA: Association of fetuin-A with mitral annular calcification and aortic stenosis among persons with coronary heart disease: data from the Heart and Soul Study. Circulation 2007, 115(19):2533-2539.

112.

Wang AY, Ho SS, Liu EK, Chan IH, Ho S, Sanderson JE, Lam CW: Differential associations of traditional and non-traditional risk factors with carotid intimamedia thickening and plaque in peritoneal dialysis patients. Am J Nephrol 2007, 27(5):458-465.

76

113.

Kirkpantur A, Altun B, Hazirolan T, Akata D, Arici M, Kirazli S, Turgan C: Association among serum fetuin-A level, coronary artery calcification, and bone mineral densitometry in maintenance hemodialysis patients. Artif Organs 2009, 33(10):844-854.

114.

Zheng S, de Las Fuentes L, Bierhals A, Ash-Bernal R, Spence K, Slatopolsky E, Davila-Roman VG, Delmez J: Relation of serum fetuin-A levels to coronary artery calcium in African-American patients on chronic hemodialysis. Am J Cardiol 2009, 103(1):46-49.

115.

Ziegler S, Kudlacek S, Luger A, Minar E: Osteoprotegerin plasma concentrations

correlate

with

severity

of

peripheral

artery

disease.

Atherosclerosis 2005, 182(1):175-180. 116.

Ford ML, Tomlinson LA, Smith ER, Rajkumar C, Holt SG: Fetuin-A is an independent determinant of change of aortic stiffness over 1 year in non-diabetic patients with CKD stages 3 and 4. Nephrol Dial Transplant, 25(6):1853-1858.

117.

Keeley FW, Sitarz EE: Identification and quantitation of alpha 2-HSglycoprotein in the mineralized matrix of calcified plaques of atherosclerotic human aorta. Atherosclerosis 1985, 55(1):63-69.

118.

Ketteler M, Wanner C, Metzger T, Bongartz P, Westenfeld R, Gladziwa U, Schurgers LJ, Vermeer C, Jahnen-Dechent W, Floege J: Deficiencies of calcium-regulatory proteins in dialysis patients: a novel concept of cardiovascular calcification in uremia. Kidney Int Suppl 2003(84):S84-87.

119.

Alberti KG, Zimmet P, Shaw J: The metabolic syndrome--a new worldwide definition. Lancet 2005, 366(9491):1059-1062.

120.

Fowkes FG, Murray GD, Butcher I, Heald CL, Lee RJ, Chambless LE, Folsom AR, Hirsch AT, Dramaix M, deBacker G et al: Ankle brachial index combined with Framingham Risk Score to predict cardiovascular events and mortality: a meta-analysis. JAMA 2008, 300(2):197-208.

121.

Espinola-Klein C, Rupprecht HJ, Bickel C, Lackner K, Savvidis S, Messow CM, Munzel T, Blankenberg S: Different calculations of ankle-brachial index and their impact on cardiovascular risk prediction. Circulation 2008, 118(9):961967.

77

122.

Higgins CL, Marvel SA, Morrisett JD: Quantification of calcification in atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005, 25(8):1567-1576.

123.

Grant EG, Benson CB, Moneta GL, Alexandrov AV, Baker JD, Bluth EI, Carroll BA, Eliasziw M, Gocke J, Hertzberg BS et al: Carotid artery stenosis: gray-scale and Doppler US diagnosis--Society of Radiologists in Ultrasound Consensus Conference. Radiology 2003, 229(2):340-346.

124.

Guerin AP, London GM, Marchais SJ, Metivier F: Arterial stiffening and vascular calcifications in end-stage renal disease. Nephrol Dial Transplant 2000, 15(7):1014-1021.

125.

Bollinger A, Breddin K, Hess H, Heystraten FM, Kollath J, Konttila A, Pouliadis G, Marshall M, Mey T, Mietaschk A et al: Semiquantitative assessment of lower limb atherosclerosis from routine angiographic images. Atherosclerosis 1981, 38(3-4):339-346.

126.

Tavaria M, Gabriele T, Kola I, Anderson RL: A hitchhiker's guide to the human Hsp70 family. Cell Stress Chaperones 1996, 1(1):23-28.

127.

Moe SM, Chen NX: Pathophysiology of vascular calcification in chronic kidney disease. Circ Res 2004, 95(6):560-567.

128.

Mazzaferro S, Pasquali M, Pugliese F, Barresi G, Carbone I, Francone M, Sardella D, Taggi F: Serum levels of calcification inhibition proteins and coronary artery calcium score: comparison between transplantation and dialysis. Am J Nephrol 2007, 27(1):75-83.

129.

Mehrotra R, Westenfeld R, Christenson P, Budoff M, Ipp E, Takasu J, Gupta A, Norris K, Ketteler M, Adler S: Serum fetuin-A in nondialyzed patients with diabetic nephropathy: relationship with coronary artery calcification. Kidney Int 2005, 67(3):1070-1077.

130.

Eraso LH, Ginwala N, Qasim AN, Mehta NN, Dlugash R, Kapoor S, Schwartz S, Schutta M, Iqbal N, Mohler ER, 3rd et al: Association of Lower Plasma Fetuin-A Levels with Peripheral Arterial Disease in Type-2 Diabetes. Diabetes Care 2009, 12:12.

131.

Emoto M, Mori K, Lee E, Kawano N, Yamazaki Y, Tsuchikura S, Morioka T, Koyama H, Shoji T, Inaba M et al: Fetuin-A and atherosclerotic calcified plaque in patients with type 2 diabetes mellitus. Metabolism 2009, 14:14.

78

132.

Rittig K, Thamer C, Haupt A, Machann J, Peter A, Balletshofer B, Fritsche A, Haring HU, Stefan N: High plasma fetuin-A is associated with increased carotid intima-media thickness in a middle-aged population. Atherosclerosis 2009, 207(2):341-342.

133.

Ix JH, Wassel CL, Kanaya AM, Vittinghoff E, Johnson KC, Koster A, Cauley JA, Harris TB, Cummings SR, Shlipak MG: Fetuin-A and incident diabetes mellitus in older persons. Jama 2008, 300(2):182-188.

134.

Jahnen-Dechent W, Schafer C, Ketteler M, McKee MD: Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification. J Mol Med 2008, 86(4):379-389.

135.

Westenfeld R, Schafer C, Smeets R, Brandenburg VM, Floege J, Ketteler M, Jahnen-Dechent W: Fetuin-A (AHSG) prevents extraosseous calcification induced by uraemia and phosphate challenge in mice. Nephrol Dial Transplant 2007, 22(6):1537-1546.

136.

Giusti B, Porciani MC, Brunelli T, Evangelisti L, Fedi S, Gensini GF, Abbate R, Sani G, Yacoub M, Pepe G: Phenotypic variability of cardiovascular manifestations in Marfan Syndrome. Possible role of hyperhomocysteinemia and C677T MTHFR gene polymorphism. Eur Heart J 2003, 24(22):2038-2045.

137.

Halazun KJ, Bofkin KA, Asthana S, Evans C, Henderson M, Spark JI: Hyperhomocysteinaemia is associated with the rate of abdominal aortic aneurysm expansion. Eur J Vasc Endovasc Surg 2007, 33(4):391-394; discussion 395-396.

138.

Ford ML, Tomlinson LA, Smith ER, Rajkumar C, Holt SG: Fetuin-A is an independent determinant of change of aortic stiffness over 1 year in non-diabetic patients with CKD stages 3 and 4. Nephrol Dial Transplant, 2010:14.

139.

Mori K, Emoto M, Yokoyama H, Araki T, Teramura M, Koyama H, Shoji T, Inaba M, Nishizawa Y: Association of serum fetuin-A with insulin resistance in type 2 diabetic and nondiabetic subjects. Diabetes Care 2006, 29(2):468.

140.

Zhang X, Xu Z, Zhou L, Chen Y, He M, Cheng L, Hu FB, Tanguay RM, Wu T: Plasma levels of Hsp70 and anti-Hsp70 antibody predict risk of acute coronary syndrome. Cell Stress Chaperones 2010.

79

141.

Zhu J, Quyyumi AA, Wu H, Csako G, Rott D, Zalles-Ganley A, Ogunmakinwa J, Halcox J, Epstein SE: Increased serum levels of heat shock protein 70 are associated with low risk of coronary artery disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003, 23(6):1055-1059.

142.

Wright BH, Corton JM, El-Nahas AM, Wood RF, Pockley AG: Elevated levels of circulating heat shock protein 70 (Hsp70) in peripheral and renal vascular disease. Heart Vessels 2000, 15(1):18-22.

143.

Pockley AG, Georgiades A, Thulin T, de Faire U, Frostegard J: Serum heat shock protein 70 levels predict the development of atherosclerosis in subjects with established hypertension. Hypertension 2003, 42(3):235-238.

144.

Dulin E, Garcia-Barreno P, Guisasola MC: Extracellular heat shock protein 70 (HSPA1A) and classical vascular risk factors in a general population. Cell Stress Chaperones 2010.

145.

Clarke R, Daly L, Robinson K, Naughten E, Cahalane S, Fowler B, Graham I: Hyperhomocysteinemia: an independent risk factor for vascular disease. N Engl J Med 1991, 324(17):1149-1155.

146.

Zhou J, Werstuck GH, Lhotak S, de Koning AB, Sood SK, Hossain GS, Moller J, Ritskes-Hoitinga M, Falk E, Dayal S et al: Association of multiple cellular stress pathways with accelerated atherosclerosis in hyperhomocysteinemic apolipoprotein E-deficient mice. Circulation 2004, 110(2):207-213.

147.

Febbraio MA, Ott P, Nielsen HB, Steensberg A, Keller C, Krustrup P, Secher NH, Pedersen BK: Exercise induces hepatosplanchnic release of heat shock protein 72 in humans. J Physiol 2002, 544(Pt 3):957-962.

148.

Gombos T, Forhecz Z, Pozsonyi Z, Janoskuti L, Prohaszka Z: Interaction of serum 70-kDa heat shock protein levels and HspA1B (+1267) gene polymorphism with disease severity in patients with chronic heart failure. Cell Stress Chaperones 2008, 13(2):199-206.

149.

Madach K, Molvarec A, Rigo J, Jr., Nagy B, Penzes I, Karadi I, Prohaszka Z: Elevated serum 70 kDa heat shock protein level reflects tissue damage and disease severity in the syndrome of hemolysis, elevated liver enzymes, and low platelet count. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2008, 139(2):133-138.

80

150.

Zhan R, Leng X, Liu X, Wang X, Gong J, Yan L, Wang L, Wang Y, Qian LJ: Heat shock protein 70 is secreted from endothelial cells by a non-classical pathway involving exosomes. Biochem Biophys Res Commun 2009, 387(2):229233.

151.

Kyriakakis E, Philippova M, Joshi MB, Pfaff D, Bochkov V, Afonyushkin T, Erne P, Resink TJ: T-cadherin attenuates the PERK branch of the unfolded protein response and protects vascular endothelial cells from endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis. Cell Signal 2010.

152.

Prohaszka Z, Singh M, Nagy K, Kiss E, Lakos G, Duba J, Fust G: Heat shock protein 70 is a potent activator of the human complement system. Cell Stress Chaperones 2002, 7(1):17-22.

81

9. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE 9. 1. AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK 1.

Szeberin Z, Fehérvári M, Krepuska M, Apor A, Rimely E, Sarkadi H, Bíró G,

Sótonyi P. Széplaki G. Prohászka Z, Szabolcs Z. Kalabay L. Acsády G. Fetuin-A serum levels in patients with aortic aneurysms of Marfan syndrome and atherosclerosis, Eur J Clin Invest, 2010 Oct 8. DOI: 10.1111/j.1365-2362.2010.02393.x 2.

IF: 2,643

Krepuska M, Szeberin Z, Sótonyi P, Sarkadi H, Fehérvári M, Apor A, Rimely

E, Prohászka Z, Acsády G: Serum level of soluble Hsp70 is associated with vascular calcification Cell Stress & Chaperones, 2010 Nov 3. (Epub ahead of print)

IF: 2,167

9. 2. EGYÉB KÖZLEMÉNYEK

1.

Szeberin Z., Nemes B., Nemes A.: Arteria hepatica communis aneurysma

ruptura, Magyar Sebészet, 2000, 53. 70-72

2.

Szeberin Z., Pápay J., Bíró G., Nemes A.: Alsó végtagi vénás kompressziós

tüneteket okozó éreredetű leiomyosarcoma az inguinális régióban, Magyar Sebészet, 2000, 53. 21-23

3.

Sepa Gy., Dzsinich Cs., Szabó A., Nemes A., Szeberin Z.: Térdhajlati verőér

leszorítása, Magyar Sebészet 2000, 53. 17-20

4.

Szabó G., Laczkó Á., Szeberin Z., Windisch M., Százados M., Kristóf V.,

Acsády Gy.: Anatomikus és extraanatomikus reconstructiók az arteria iliaca rendszer occlusiv betegségeiben, Magyar Sebészet, 2001, 54. Suppl. 60-62

5.

Bíró G., Szabó A., Szeberin Z., Nemes A.: Homograft beültetéssel végzett

artériás reconstructiók, Magyar Sebészet, 2001, 54. Suppl. 63-67

82

6.

Laczkó Á., Szabó G., Szeberin Z., Nemes B., Bobek I., Kristóf V., Selmeci L.,

Acsády Gy.: Érsebészeti és intervencionális radiológiai beavatkozások előkészítése trombolízis alkalmazásával, Magyar Sebészet, 2001, 54. Suppl. 69-73

7.

Acsády Gy., Laczkó Á., Szabó A., Szabó G., Szeberin Z., Gálfy I., Turbók E.,

Nemes A.: Az érsebészeti szövődmények kezelési lehetőségei, Magyar Sebészet, 2001, 54. Suppl. 75-80

8.

Szeberin Z., Bíró G., Sótonyi P., Soós P., Százados M., Árkossy O., Berta K.,

Acsády Gy.: Proximális radio-cephalikus autológ fisztulák szerepe a haemodialízis kezelés biztosításában, Magyar Sebészet, 2006, 59. 421-8

9.

Szeberin Z., Szabó A., Gősi G., Szabó G.: Kezelési határterületek heveny

artériás kórképekben, Háziorvos Továbbképző Szemle, 2006, 4. 64-9

10.

Szabó G., Szeberin Z., Bíró G.: Jósló tünetetek jelentősége a szekunder stroke

prevenciójában, Háziorvos Továbbképző Szemle, 2006, 4. 54-8

11.

Szeberin Z, Bíró G, Sótonyi P, Soós P, Százados M, Árkossy O, Berta K,

Acsády G: The role of autologous antebrachial arteriovenous fistula in the strategy of access planning for chronic uremic patients on hemodialysis. Minerva Urologica e Nefrologica, 2007, 59, 231-6

12.

Szeberin Z., Bíró G., Szabó G. V., Százados M., Nemes B., Dzsinich Cs.:

Aorto-bifemoralis graft készítése vena femoralis superficialisból, Érbetegségek, 2007, 14. 7-11

13.

Szabó Gy., Laczkó Á., Becker D., Molnár L., Fülöp G., Szilágyi Sz., Szeberin

Z., Acsády Gy, Merkely B.: Kardiogén sokkal szövődött miokardiális infarktus primer PCI-t követő intraaorticus ballonpumpa kezelése bilateralis arteria iliaca communis elzáródás miatt bal arteria axillaris felőli behelyezéssel, Cardiologia Hungarica, 2007, 4. 276-81

83

14.

Dzsinich Cs., Hüttl K., Bodor E., Nemes A., Bíró G., Szabó G., Szeberin Z.,

Bodor G., Windisch M., Gálfy I., Széphelyi K.: Hybrid megoldások az aortaív sebészetében, Magyar Sebészet, 2007, 60. 494-500

15.

Szabó G. V., Szeberin Z., Bíró G., Laczkó Á., Dzsinich Cs., Acsády Gy.:

Bilateralis carotis interna aneurysma, Magyar Sebészet, 2007, 60. 262-6

16.

Szabolcs Z., Veres G., Hüttl T., Bíró G., Tóth A., Szeberin Z., Windisch M.,

Acsády G.: Egyszerű sebészi módszer az aorta ascendensben elhelyezkedő nagy, lebegő thrombus eltávolítására, Orvosi Hetilap, 2007, 148. 363-6

17.

Tóth A, Kispál G, Ungvári E, Violka M, Szeberin Z, Pászti J, Molnár K, Gacs

M, Füzi M.: First report of heterogeneously vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) causing fatal infection in Hungary. Journal of Chemotherapy, 2008, 20. 655-6

18.

IF: 0,843 Paukovits TM, Haász J, Molnár A, Szeberin Z, Nemes B, Varga D, Hüttl K,

Bérczi V, Léránt G.: Transfemoral endovascular treatment of proximal common carotid artery lesions: a single-center experience on 153 lesions. Journal of Vascular Surgery, 2008, 48. 80-7

19.

IF: 3,770

Molnár AA, Apor A, Kristóf V, Nádasy GL, Szeberin Z, Monos E, Acsády G,

Préda I, Bérczi V.: Generalized alterations in the biomechanical properties of large veins in non-thrombotic thrombophilic young patients. International Angiology, 2008, 27. 247-52

20.

IF: 1,418

Szeberin Z., Firneisz G., Bíró G., Szabó G. V., Sótonyi P., Windisch M.,

Krepuska M., Sípos F., Mihály E., Acsády Gy.: B típusú aortadissectio sebészi kezelése kokaint használó beteg esetében, Orvosi Hetilap, 2009, 3. 129-31

21.

Szeberin Z.: Krónikus dialízis szükségessége és halálozási arány dialízist

igénylő heveny veseelégtelenség túlélői között MOTESZ Magazin, 2010, 1. 55-7

84

22.

Szeberin Z., Münch Z., Fehérvári M., Bíró G., Entz L., Acsády Gy.: Ezüst-

acetáttal bevont Dacron grafttal végzett rekonstrukciós érműtétek középtávú eredményei, Magyar Sebészet, 2010, 63. 369-73

85

10. KÖSZÖNETNYiLVÁNÍTÁS Először is köszönettel tartozom Acsády György professzor úrnak, aki témavezetőként és klinikaigazgatóként is lehetővé tette számomra, hogy a gyógyító és oktató munka mellett kutatásra is fordítsak időt és annak elvégzésére folyamatosan ösztönzött. Köszönöm első érsebész mesteremnek, Sebestény Miklósnak, aki megszerettette velem az érsebészetet, tapasztalatával és életbölcsességével irányította kezdeti lépéseimet az érsebészet területén. Köszönet illeti Nemes Attila és Entz László professzor urakat, akik az érsebészeti szakvizsga után lehetőséget adtak, hogy a Semelweis Egyetem Érsebészeti Klinikáján gyarapíthassam tudásomat. Hálával tartozom Kalabay László professzor úrnak, hogy támogatta elképzelésemet és kutatási terveimet egy eddig még kevéssé ismert szakterületen, a vizsgálatok során folyamatos tanácsokat adva bátorított és a témában szerzett korábbi tapasztalatait velem megosztotta. Köszönöm Dr. Prohászka Zoltánnak, hogy utat mutatott a tudományos munka kezdeti időszakában és a laboratóriumi mérésekre lehetőséget biztosított. Külön köszönöm annak a lelkes és fiatal csapatnak, akik nélkül ez a vizsgálat nem így folyt volna, akikkel a mindennapi örömöket és nehézségeket meg tudtam osztani, akik a betegvizsgálatokban, a mintagyűjtésben, a statisztikai feldolgozásban végig segítettek; köszönet dr. Fehérvári Mátyásnak, dr. Krepuska Miklósnak, dr. Sarkadi Hunornak, dr. Rimely Endrének, dr. Apor Astridnak és dr. Széplaki Gábornak. Köszönöm dr. Skopál Juditnak és kollégáinak kedvességét, hogy laboratóriumukba befogadtak vizsgálataink során. Tanácsaik sokat segítettek a kezdeti időszakban. A statisztikai feldolgozás közben nyújtott segítségért Vargha Péternek jár a köszönet. Külön köszönöm az érsebészeti osztályon dolgozó közvetlen kollégáimnak, hogy a mindennapi megterhelő gyógyító munka mellett a kutatásnak is tudtam időt szentelni, ez segítségük nélkül nem sikerülhetett volna; köszönet dr. Bíró Gábornak, dr. Járányi Zsuzsának, dr. Szabó Gábor Viktornak és dr. Münch Zoltánnak. Hálával tartozom az Érsebészeti Klinika összes nővérének, akik napi munkájuk mellett időt

és

energiát

szenteltek

vizsgálatunknak,

és

adminisztrátorainak, akik az adatfeldolgozásban segítettek.

86

az

érsebészeti

osztályok

Továbbá köszönöm a Városmajori Klinikák valamennyi orvosának és dolgozójának, hogy lehetőségük szerint munkámat végig támogatták. Külön köszönet dr. Szabolcs Zoltánnak, aki egy speciális betegcsoport bevonásában nyújtott nélkülözhetetlen segítséget. Köszönet illeti dr. Járányi Zsuzsannát és dr. Soós Pált a részletes és értékes házibírálatukért, munkájuk által jelentősen javult a dolgozat. Disszertációm nem jöhetett volna létre szüleim, családom türelme, szeretete és támogatása nélkül. Köszönöm Nektek!

87