A felső és alsó végtagot mozgató motoneuronok dendritikus ingerületvezetési tulajdonságainak összehasonlítása békában (Rana esculenta); számítógépes modellezés
Sümegi János
2013
Tartalomjegyzék
Rövidítések jegyzéke
2. oldal
Absztrakt
3. oldal
Bevezetés
4. oldal
Módszerek
6. oldal
Eredmények
20. oldal
Megbeszélés
31. oldal
Köszönetnyilvánítás
34. oldal
Irodalomjegyzék
35. oldal
Függelék
40. oldal
1
Rövidítések jegyzéke
AP
akciós potenciál
Cm
dendritmembrán felületegységenkénti kapacitása
CPG
központi ritmusgenerátor hálózat (Central Pattern Generator)
e.c.
extracelluláris
Em
elektromotoros erő
EPSP excitatorikus posztszinaptikus potenciál Hox
Homeobox
i.c.
intracelluláris
MN
motoneuron
PSP
posztszinaptikus potenciál
Ra
dendroplazma tengelyirányú (axiális) specifikus ellenállása
Rmd
dendritek membránjának felületegységenkénti ellenállása
Rms
sejttest membránjának felületegységenkénti ellenállása
2
1.
Absztrakt Felnőtt békában a felső és alsó végtagi izmokat beidegző motoneuronok (MN) a
cervicalis és lumbalis gerincvelői szakaszokban helyezkednek el. Az úszó és ugró mozgás során a felső és alsó végtagok mozgási sajátosságai eltérőek, azonban az egyes végtagok mindkét esetben hasonló mozgásokat végeznek. Ez felveti annak lehetőségét, hogy a végtagmozgató MN-ok fiziológiai tulajdonságai eltérnek a két gerincvelői szakaszon, de egy szakaszon belül hasonlóak. Munkánk során e hipotézist teszteltük számítógépes modelleken. Nyolc-nyolc cervicalis és lumbalis végtagmozgató MN térbeli rekonstrukciója után morfológiailag hű passzív szegmentális kábelmodelleket készítettünk. A steady-state és tranziens lokális szinaptikus aktivitást áraminjekcióval, illetve konduktancia változással modelleztük a dendriteken. A változó szinaptikus háttéraktivitást a dendritmembrán felületegységenkénti ellenállásának változtatásával szimuláltuk. A somatopetalis steady-state áram- és feszültségtranszfert, valamint a tranziens posztszinaptikus potenciálok (PSP) terjedése során az alakparaméterek (amplitúdó, félérték-szélesség, emelkedési idő) változásait vizsgáltuk a dendritfa különböző pontjai és a sejttest között. A MN-okat e tulajdonságokkal jellemeztük, majd box plotok (doboz diagramok) elemzésével és hierarchikus klaszteranalízissel a MN-ok gerincvelői szakaszok szerinti csoportképződési tendenciáit vizsgáltuk. Az így képződött csoportokban homogenitási indexek segítségével teszteltük a MN-ok szegmentumok szerinti szétválását. Vizsgálataink szerint a cervicalis és lumbalis gerincvelői szakaszok végtagmozgató MN-jai a dendritekben végbemenő steady-state feszültségtranszfer és a tranziens PSP-ok amplitúdó változásai alapján is szignifikánsan különböznek a szinaptikus háttéraktivitás bármely szintjén. A steady-state áramtranszfer azonban csak magas szinaptikus háttéraktivitás esetében különbözteti meg a két MN csoportot. Eredményeink azt sugallják, hogy a dendritikus ingerületvezetés sajátosságai fontos szerepet játszhatnak a végtagmozgató MN-ok fiziológiájában és e sajátosságok megkülönböztetik a felső és alsó végtagot beidegző MN-okat felnőtt békában.
3
2.
Bevezetés A neuronok morfológiai és elektromos tulajdonságainak kutatása a neurobiológia
tudományának kialakulásától kezdve a tudományos érdeklődés előterében állt. Nagy érdeklődés övezi az alaki és ingerületvezetési jellemzőknek az idegsejtek funkciójával való összefüggését. Az új szövettani festési eljárások megteremtették a lehetőséget, hogy a neuronok morfológiáját rendkívüli pontossággal megismerjük. A technika fejlődésének köszönhetően pedig lehetővé vált az idegsejtek elektródokkal történő ingerlése és a kialakult válasz mérése. E két módszertani vívmány felhasználásával sok sejtszinten lejátszódó folyamatot sikerült feltérképezni, azonban még napjainkban is számos olyan terület maradt, mely a kísérletek jelenlegi technikai lehetőségein kívülre esik. Ezekben az esetekben nyújt nélkülözhetetlen segítséget a neuronok számítógépes modellezése. A biológiailag realisztikus számítógépes idegsejt-modellek kísérletek során megszerzett információkon alapszanak, ezzel biztosítva, hogy az eredmények a valósághoz lehető legközelebb álljanak. A neuronok ingerületvezetését leíró modellek közül legtöbbször a Wilfrid Rall által kidolgozott kábelmodellt (Rall, 1977) alkalmazzák szerte a világon. Segítségével több kutatócsoport különböző típusú idegsejtek elektromos tulajdonságait vizsgálta (pl. Rall, 1977, Segev és mtsai., 1989), mások különböző típusú neuronok morfológiai és elektromos tulajdonságait hasonlították össze (pl. Bui és mtsai., 2003), néhányan pedig ugyanolyan típusú, de az idegrendszer más részén elhelyezkedő neuronokat hasonlítottak össze (Carnevale és mtsai., 1997: patkány hippocampalis piramissejtek összehasonlítása). Munkánk során felnőtt béka (Rana esculenta) felső és alsó végtagi izmokat beidegző alfa MN-jainak dendritikus ingerületvezetési tulajdonságait hasonlítottuk össze. A béka cervicalis és lumbalis gerincvelői szegmentumaiban elhelyezkedő MN-ok összehasonlítása azért is érdekes, mert az általuk beidegzett izmok lényegileg eltérő mozgási mintázatot hoznak létre. A felnőtt béka alapvetően kétfajta helyváltoztató mozgást végez: ugrik és úszik. A kétfajta mozgás közben a felső végtagok a törzs mellett helyezkednek el és – az alsó végtaghoz viszonyítva – lassú, finom mozgásokkal segítik az egyensúly megőrzését és a mozgás irányának megtartását. Az alsó végtagok teljesen eltérő mozgási mintázattal rendelkeznek: mind ugrás, mind úszás közben az erőkifejtésre és helyváltoztatásra alkalmas mozdulatokat végzik. Az alsó végtagok a mozgás kezdetén felhúzva, Z alakban helyezkednek el, majd hirtelen egy nagy mozdulattal kiegyenesednek (Nauwelaerts és Aerts, 2003). A mellső és a 4
hátsó végtag ugró és úszó mozgása tehát páronként igen hasonló, viszont a mellső és hátsó végtagot egymással szembe állítva nagyfokú eltéréseket tapasztalunk. Közlemények tanúsága szerint több állatfaj esetében megfigyelhető, hogy a gyors mozgást végző izmokat beidegző MN-ok dendritfája összetettebb, mint a lassú izmok MN-jaié (patkány és macska – Luscher és Clamann, 1992 ill. béka – Dityatev és mtsai., 1995). Megfigyelték továbbá, hogy a béka cervicalis MN-jainak dendritfája kevésbé összetett, mint a lumbalis MN-oké (Dityatev és mtsai., 1995). A mozgásformákkal kapcsolatos fenti megfigyelések tehát összhangban állnak a kétféle MN populáció dendritfájának felépítéséről szóló tapasztalatokkal. Székely tarajos gőte embriókon végzett kísérletei (Székely, 1963) során megfigyelte, hogy amennyiben a gerincvelő cervicalis és lumbalis szegmentumait kicserélte, a felső és alsó végtag az oda újonnan beültetett gerincvelői szakasznak megfelelő mozgási mintázatot hajtotta végre. A végtagok mozdulatait tehát az izmokat ellátó gerincvelői szegmentumok határozzák meg. E kísérletből azonban nem tudjuk megállapítani, hogy az eltérő mozgásért a gerincvelő mely része(i) felelős(ek): csak a központi ritmusgenerátor hálózatnak (CPG – Central Pattern Generator) nevezett interneuron-hálózat vagy maguk az izmokat közvetlenül beidegző MN-ok is. Számítógépes modellkísérleteink során arra a kérdésre kerestünk tehát választ, hogy a cervicalis és lumbalis MN-ok dendritikus ingerületvezetési tulajdonságai között van-e olyan különbség, mely – legalábbis részben – felelőssé tehető a felső és alsó végtag eltérő mozgási mintázatainak létrejöttében.
5
3.
Módszerek 1. Motoneuronok kiválasztása és jelölése Felnőtt béka (Rana esculenta) nyolc cervicalis és nyolc lumbalis végtagmozgató I alfa
MN-ját vizsgáltuk. A cervicalis MN-ok a gerincvelő harmadik, a lumbalisak pedig a nyolcadik, illetve a kilencedik szegmentum rostralis szakaszából származtak. Korábbi közlemények tanúsága szerint a végtagi izmokat beidegző MN-ok a gerincvelő lateralis oszlopában helyezkednek el. Az oszlopon belül a medialisabban található idegsejtek látják el a ventralis oldalon lévő izmokat, míg a lateralisabbak a dorsalis izmokat (Tosney és mtsai., 1995). Az általunk felhasznált MN-ok mind a lateralis oszlopban foglaltak helyet, de azon belül eltérő mediolateralis pozícióban. Ennek megfelelően mintánkban biztosan voltak különböző izmokat ellátó MN-ok. Így a cervicalis és lumbalis idegsejtek összehasonlításakor kapott eredmények a két MN csoportot jellemzik, nem pedig adott izmokat ellátó idegsejteket. Öt-öt idegsejtet korábban intézetünkben in vivo intracellularis kobalt-lizin jelöléssel látták el (Birinyi és mtsai., 1992), hármat-hármat pedig neurobiotin jelöléssel (Dityatev és mtsai., 2001a). Annak igazolására, hogy a jelölt gerincvelői sejtek valóban végtagi izmot beidegző MN-ok voltak, megvizsgálták, hogy a sejttest és dendritfa tulajdonságai megfelelnek-e a végtagmozgató idegsejtekre jellemző tulajdonságoknak. Ezek a következők (Székely, 1976; Birinyi 1992): (1) a sejttest a gerincvelő ventralis szarvának lateralis részén helyezkedik el és (2) ellipsoid vagy fuziform alakú, (3) a dendritfa ágai dorsomedialis, lateralis és dorsalis kisugárzásokra oszthatók, s (4) számos ág a fehérállomány lateralis funinculusába hatol, (5) a lateralis kisugárzás ágai pedig a fehérállomány subpialis részéig érnek, ahol hálózatot alkotnak. (1. ábra) Az általunk vizsgált MN-ok mindegyike rendelkezett a fenti tulajdonságokkal, azaz végtagmozgató MN volt.
6
1. ábra: Egy cervicalis (bal oldalt) és egy lumbalis (jobb oldalt) MN rekonstruált képe. A szaggatott vonal a szürke- és fehérállomány határát jelzi.
2. Motoneuronok háromdimenziós rekonstrukciója A gerincvelő jelölt MN-okat tartalmazó szegmentumaiból a gerincvelő tengelyére merőleges síkban sorozatmetszeteket készítettek. A metszeteken látható jelölt dendriteket egy mikroszkópból és a hozzá kapcsolt számítógépből álló Neurolucida (MicroBrightField Inc., USA) nevű rendszer segítségével három dimenzióban, szubmikronos pontossággal rekonstruálták. Minden egyes dendritikus pont esetében regisztrálták annak X, Y, és Z koordinátáját és a dendrit vastagságát is. (1. ábra) A MN-ok rekonstrukciója alkalmával megvizsgálták a szövettani előkészítés során létrejövő szöveti zsugorodás mértékét majd a mikroszkópos mérés során a szövet, a beágyazó közeg és a fedő üveglap törésmutatóinak eltéréséből származó optikai torzulást, melyekkel korrigálták az adatokat (Birinyi és mtsai., 1992, Dityatev és mtsai., 2001a).
7
3. A motoneuronok számítógépes modellezése A Neuron programcsomag (Hines és Carnevale, 1997, 2001) segítségével elkészítettük a MN-ok Rall-féle passzív szegmentális kábelmodelljét (Rall, 1977). A modellben a dendritfát elágazó, elektromos áramot vezető kábelként közelítettük, s azt vizsgáltuk, hogy a kábel egyes pontjai és a sejttest között hogyan terjed az ingerület. A dendritfát, azaz az elágazó kábelt kis részekre, ún. kompartmentekre bontottuk. A kompartmenteket a 2. ábrán látható módon modelleztük.
8
2. ábra: A motoneuronok Rall-féle szegmentális kábelmodellje A szegmentális kábelmodellben a dendritfát, melyet elágazó, áramot vezető kábelként fogtunk föl, meghatározott szabályrendszer (lásd később) alapján kompartmentekre bontottuk. A kompartmenteket egy ellenállás és egy telep, valamint egy kapacitás párhuzamos kapcsolásával modelleztük. Ra: dendroplazma tengelyirányú specifikus ellenállása, Rmd: dendritmembrán felületegységenkénti ellenállása, Cm: dendritmembrán felületegységenkénti kapacitása, Em: elektromotoros erő, e.c.: extracelluláris tér, i.c.: intracelluláris tér
A szegmentális kábelmodell felépítési szabályainak megfelelően új kompartment kezdődött minden elágazási pontban, minden végpontban, illetve ahol a dendrit átmérője megváltozott. A számítások pontosságának növelése érdekében a kompartmentek hosszát maximáltuk. Segev és munkatársai (1985) szegmentális kábelmodellek és analitikus számítások eredményeinek összehasonlításakor megállapították, hogy amennyiben a leghosszabb kom9
partment hossza nem haladja meg a térkonstans (λ) 20 %-át, úgy a kompartmentalizáció okozta pontatlanság elhanyagolható. A térkonstans a következő képlettel számítható ki (Rall, 1977):
λ=
( Rm d / Ra )(d / 4)
(1)
ahol Rmd a dendritmembrán felületegységenkénti ellenállása, Ra a dendroplazma tengelyirányú specifikus ellenállása, d pedig a dendrit kompartment átmérője. Az egyenlőségből látható, hogy a térkonstans a dendritikus membránellenállás és az átmérő négyzetgyökével arányos. Kiválasztottuk a 16 MN legkisebb átmérőjű dendritjét (0,3 μm) és kiszámoltuk, hogy a legmagasabb szinaptikus háttéraktivitási szint (Rmd = 5 000 Ωcm2, részletesen lásd később) mellett mennyi a térkonstans 20 %-ának értéke. Az így kapott eredmény tehát a legszigorúbb határérték, mely fiziológiailag releváns számítási hiba nélkül alkalmazható minden vastagabb kompartment és nagyobb háttéraktivitási szint esetén is. Az érték 38 μm volt. Ezt alkalmaztuk az összes dendriten a kompartmentek maximális hosszának meghatározásához. A MN-ok kompartmentjeinek száma 880 és 6209 között változott a sejtek méretétől és dendritfelépítésétől függően. A sejttestet a kábelmodellben forgási ellipszoiddal közelítettük, melynek méretét a háromdimenziós rekonstrukció adatai alapján Weast és Selby (1985) módszerével számítottuk ki. Az idegsejtek dendritjei mentén az ingerület terjedésének tulajdonságait - a morfológiai adatok mellett – a dendrit és a sejttest membránjának biofizikai tulajdonságai határozzák meg. Passzív szegmentális kábelmodellt készítettünk, azaz a dendritmembránban nem modelleztünk feszültségfüggő ioncsatornákat. Ennek az az oka, hogy bár a lipid kettősréteg bizonyosan tartalmaz feszültségvezérelt csatornákat, azok típusa, eloszlása és tulajdonságai nagyrészt ismeretlenek a felnőtt béka gerincvelői MN-jai esetében, illetve a különböző források egymásnak ellentmondóak (Larkum és mtsai., 1996, Czeh, 1976). Továbbá Larkum és munkatársai (1996) azt tapasztalták, hogy a passzív membránmodellben nyert eredményeket nagy pontossággal lehetett illeszteni a mérési eredményekhez. Ez alapján lehetségesnek tartják, hogy az ingerület a dendritfa mentén passzívan terjed. Végül számos kutatócsoport osztja azt a véleményt, hogy a passzív membránmodellekkel nyert eredmények kifejezetten szükségesek ahhoz, hogy megértsük a feszültségvezérelt csatornák szerepét az ingerület-feldolgozás során (Zador és mtsai., 1995, Carnevale és mtsai., 1997). 10
A szükséges biofizikai adatokat az irodalomból vettük. A sejttest input ellenállásának 1,4±0,7 MΩ-ot (Magherini és mtsai., 1976), a dendroplazma tengelyirányú specifikus ellenállásának pedig 110 Ω*cm-t (Rall, 1977) állítottunk be. Mivel egyes kutatócsoportok (Frank és Fuortes, 1956; Urbán és mtsai., 1987) a fentinél jelentősen nagyobb – 1,9 MΩ-tól 6 MΩ-ig terjedő – input ellenállást mértek, modellkísérleteink egy részében 5 MΩ-os input ellenállást alkalmaztunk. Számos tudományos munka bizonyítja, hogy az idegsejtek membránjának ellenállása inhomogén, vagyis különböző lehet a sejttesten és a dendriten. A cikkek tanúsága szerint számos idegsejtnél, így a MN-oknál is a dendritikus ellenállás nagyobb a sejttesténél (Iansek és Redman, 1973; Fleshman és mtsai., 1988; Rose és Vanner, 1988), ám ezek abszolút értékével illetve különbségével kapcsolatos eredmények nem egybehangzóak (Wolf és mtsai., 1992; Dityatev és mtsai., 2001b; Cushing és mtsai., 2005). Ez az egyik oka annak, hogy szimulációinkat több dendrit- és sejttest-ellenálláspárral hajtottuk végre. A másik ok az volt, hogy a dendritek membránellenállását változtatva modellezni tudtuk a dendritek által fogadott szinapszisok általános aktivitásának különböző szintjeit, azaz a szinaptikus háttéraktivitást (lásd még később). Három esetet vizsgáltunk: egy magas (Rmd = 5 000 Ωcm2), egy közepes vagy kontroll (Rmd = 20 000 Ωcm2) és egy alacsony (Rmd = 50 000 Ωcm2) szinaptikus aktivitási szintet. A sejttest felületegységenkénti ellenállása mindhárom esetben azonos volt és úgy választottuk meg, hogy a sejt teljes ellenállása a fiziológiás tartományban maradjon. A membrán kapacitása mindig 1 µFcm2 volt. A felületegységenkénti membránellenállásokat a szóma-dendrit határon egy lépésben változtattuk meg, mely a valós, folyamatos átmenet egyszerűsítése. Azonban az egyszerűsítésből származó hiba nem számottevő, amint azt Fleshman és munkatársai (1988) és Segev és munkatársai (1990) kimutatták.
4. A posztszinaptikus potenciálok keletkezése és vizsgált tulajdonságai A célból, hogy a dendritek ingerületvezetési tulajdonságait feltérképezzük, a Neuron szimulátor (Hines és Carnevale, 1997, 2001) segítségével minden MN minden egyes kompartmentjében szinapszist modelleztünk. A szinapszis működésének következtében kialakuló posztszinaptikus potenciál (PSP) terjedése közben áthalad az keletkezés pontja és a sejttest között lévő összes kompartmenten. A dendritfa ingerületvezetési tulajdonságainak elemzése-
11
kor a modell szinapszis helyén kialakult PSP tulajdonságait hasonlítottuk össze a sejttesten mérhetőkkel. A szinapszisok működését két módon modelleztük. A steady-state modellben konstans áramot injektáltunk a dendrit kompartmentek középpontjába és megmértük a feszültség- és áramtranszfer hatékonyságát. A feszültségtranszfer hatékonyságát a sejttesten és az áraminjekciót fogadó kompartmenten mérhető feszültségek hányadosával mértük. Az áramtranszfer értéke pedig a sejttestre eljutott és injektált áramerősségek aránya. (3. ábra A része) A szinaptikus aktivitás tranziens modelljében a szinapszis működését a posztszinaptikus membránban konduktancia-változással modelleztük, s az általa elindított és a sejttestre megérkező excitatorikus posztszinaptikus potenciál (EPSP) alakparamétereinek arányát vizsgáltuk. A konduktanciaváltozás paramétereit úgy választottuk meg, hogy az a monoszinaptikus reticulospinalis axon - MN kapcsolatban (Dityatev és mtsai., 2001b, Stelescu és mtsai., 2007) mérhető EPSP-t hűen modellezze (2 nS amplitúdójú, 1,5 ms emelkedési idejű, alfa függvényt követő konduktancia-változás (Rall, 1977)). Az EPSP vizsgált alakparaméterei az amplitúdó, a félérték-szélesség és a 10-90 %-os emelkedési idő voltak. (3. ábra B része)
12
3. ábra: Szinapszisok működésének szimulálása kétféle modell szerint (A ábra) A steady-state modellben konstans áramot injektáltunk a dendrit kompartmentek középpontjába és megmértük a sejttest felé történő feszültség- és áramtranszfer hatékonyságát. (B ábra) A tranziens modellben a szinaptikus aktivitást a posztszinaptikus membránban konduktanciaváltozással modelleztük, s az általa elindított és a sejttestre megérkező excitatorikus posztszinaptikus potenciál (EPSP) alakparamétereinek arányát vizsgáltuk.
Minden MN számos idegsejttel áll állandó kapcsolatban és a dendritfán elhelyezkedő több tízezer szinapszis (Birinyi és mtsai., 1992) közül minden pillanatban rengeteg működik. Az így keletkező elektromos impulzusok sejttest felé történő haladásuk során befolyásolják egy-más terjedését. Ennek megfelelően, amikor egy-egy PSP terjedési tulajdonságait vizsgáljuk, figyelembe kell vennünk a többi PSP jelenlétét is, azaz az ún. szinaptikus háttéraktivitást. A szinaptikus háttéraktivitás a MN által fogadott összes szinapszis átlagos aktivitási szintjét jelenti. Három háttéraktivitási szintet modelleztünk a dendritmembrán felületegységenkénti ellenállásának változtatásával: egy átlagosat vagy kontrollt (20 000 Ωcm2), egy alacsonyt (50 000 Ωcm2) és egy magasat (5 000 Ωcm2), mely értékek általánosan 13
elfogadottak a szak-irodalomban (Rose és Vanner, 1988). E három szint segítségével vizsgáltuk, hogy a háttéraktivitás hogyan befolyásolja a PSP-k terjedési tulajdonságait. Rendelkezésünkre állt tehát egy olyan adatbázis, mely a 16 MN mindegyikének dendritikus ingerületvezetési tulajdonságait írta le a feszültség- és áramtranszfer hatékonysága, illetve a tranziens amplitúdók, felérték-szélességek és emelkedési idők sejttesten és posztszinaptikus membránon mért aránya alapján a szinaptikus háttéraktivitás három különböző szintjén.
5. Adatfeldolgozás Antal és munkatársai (1992) leírták, hogy a Rana esculenta békafaj gerincvelői MNjainak dendritfáján a szinapszisok sűrűsége mindenütt egyforma, függetlenül a dendritág átmérőjétől és sejttesttől való távolságától. A kompartmentek felszíne tehát egyenesen arányos a rajtuk található szinapszisok számával. Az arányszám 0,2511 szinapszis / µm2. Ennek megfelelően az ingerületvezetést leíró paramétereket súlyoztuk annak a kompartmentnek a felszínével, melyben a szinapszist modelleztük. Így a nagyobb felszínű és ezért több szinapszist fogadó dendritekre vonatkozó adatok nagyobb súllyal szerepeltek az adatsorokban. Ez egyben azt is jelenti, hogy – amennyiben az ingerületvezetést leíró paramétert a PSP-t indító szinapszishoz rendeljük – akkor a szinapszisok ingerületvezetést jellemző paraméterek szerinti eloszlásfüggvényeit használtuk. Ez után a felszínnel súlyozott adatsorokat standardizáltuk, hogy az egyes idegsejtek közötti méretbeli különbségek ne zavarhassák a vizsgálatot. Így a tanulmányozott paramétereket leíró eloszlások mindegyikének várható értéke 0, szórása pedig 1 lett. A standardizálás az eloszlások alakját természetesen nem változtatta meg (Rose és Cushing, 2004). Az eloszlások alakjának összehasonlításához azok 5 kitüntetett értékét, a 10., 25., 50., 75. és 90. percentilisét választottuk. Azonban minél inkább eltér a percentilis érték a mediántól (azaz az 50. percentilistől), annál kevésbé reprezentálja az adatsort. Ezért a percentilis értékeket súlyoztuk aszerint, hogy milyen távol vannak a mediántól. Az 50. percentilis súlyfaktora minden esetben 1 volt. Kétféleképpen súlyoztunk, hogy eredményeinkben a súlyozás hatását, illetve az eredmények súlyozástól való függését vizsgálhassuk. Az első esetben a 10. és 90. percentilist 0,33-mal, a 25. és 75. percentilist 0,66-tal szoroztuk meg. A második esetben a 10. és 90. percentilis súlyfaktora 0,20, a 25. és 75. percentilisé 0,80 volt. (4. ábra) 14
4. ábra: Az adatsorok standardizálása és súlyozása A dendritikus ingerületvezetés egyes tulajdonságait (feszültség- és áramtranszfer, amplitúdók, félérték-szélességek és emelkedési idők aránya) leíró eloszlások öt percentilis értékét választottuk ki a további elemzés megkönnyítésére. A 10., 25., 50., 75. és 90. percentilist kétféleképpen súlyoztuk mediántól való távolságuknak megfelelően.
A továbbiakban tehát az egyféle súlyozás során kapott 5 percentilis érték az, mely egy eloszlást jellemez. Az eloszlás pedig egy MN egy dendritikus ingerületvezetési tulajdonságát (feszültség- és áramtranszfer hatékonyságát, illetve az amplitúdók, felérték-szélességek vagy emelkedési idők változását) írja le a szinaptikus háttéraktivitás egy szintjén. Az öt percentilis értéket box plot (doboz diagram) alakjában tüntettük fel. (5. ábra illetve 7. és 10. ábra) 90. percentilis 75. percentilis 50. percentilis 25. percentilis 10. percentilis 5. ábra: A percentilis értékek ábrázolása box plot (doboz diagram) formájában
15
6. Adatelemzés Az adatok elemzése során olyan módszert kerestünk, mely megmutatja, hogy a cervicalis és lumbalis szegmentumokból származó MN-ok mennyire térnek el egymástól dendritikus ingerületvezetési tulajdonságaik alapján. Azt vizsgáltuk tehát, hogy az egyes idegsejtek mennyire hasonlítanak azonos szegmentumbeli társaikhoz és mennyire térnek el a másik végtagot beidegző mozgató neuronoktól. Az adatok elemzését a hierarchikus klaszter analízis módszerével a Past (Hammer és mtsai., 2001) programban végeztük el. A klaszter analízis jól ismert eljárás különböző elemek, halmazok viszonyának, kapcsolatának tanulmányozására. A módszer lényege, hogy az egyes elemeket hasonlóságuk alapján rendezi csoportokba. Kiinduláskor minden elem külön áll. A módszer először a leghasonlóbb elemeket vonja össze, majd a kialakult csoportokat lépésről lépésre nagyobb halmazokba rendezi, míg végül minden elem egy nagy halmaz, azaz klaszter részévé nem válik. Minden összevonáskor az egy csoportba kerülő elemek vagy klaszterek egymáshoz való hasonlósága csökken. Az eredmény egy faágszerű diagramon, az ún. dendrogramon ábrázolható, melyen végigkövethetők a csoportosítás lépései a legkisebb ágaktól, azaz az egyes elemektől egészen a törzsig, vagyis az utolsó nagy klaszterig. (6. ábra)
16
6. ábra: Hierarchikus klaszter analízis során készült dendrogram A hierarchikus klaszter analízis a csoportosítandó elemeket, azaz a MN-okat hasonlóságuk alapján vonja össze nagyobb és nagyobb csoportokba (ún. klaszterekbe). A hasonlóságot a MN-okhoz tartozó percentilis értékek matematikai módszerekkel történő elemzésével állapítjuk meg. Az eredményt az itt látható grafikonon, az ún. dendrogramon ábrázolhatjuk. A cervicalis (C) és lumbalis (L) MN-ok arányát a klaszterképződés utolsó előtti lépéseként kialakult ún. utolsó rendű klaszterekben vizsgáltuk.
A hasonlóság vizsgálatának alapját az elemek tulajdonságai, ún. descriptorai képezik. Az elemek csoportosítása descriptoraik különböző matematikai szabályok alapján történő elemzésével jön létre. Kutatásainkban a MN-ok ún. euklideszi távolságát (különbözőségét) mértük két algoritmussal: a Ward-féle (diszperzitásnövekedés-optimalizálás) és a Paired Group (csoportátlag) módszerrel. Esetünkben az elemek a MN-ok, descriptoraik pedig a hozzájuk tartozó percentilis értékek voltak. (6. ábra) A klaszter analízis során azt a hasonlósági szintet vizsgáltuk, ahol az elemek két nagy csoportba tartoznak, azaz a klaszterek összevonásának utolsó előtti lépéseként kialakult csoportképződési tendenciákat vizsgáltuk („utolsó rendű klaszterképződés”). (6. ábra) 17
Meg kellett állapítanunk, hogy a két utolsó rendű klaszterben a felső és alsó végtagot mozgató MN-ok mennyire szegregálódtak. A MN-ok elkülönülése abban az esetben nagy, ha a klaszterek egyikében döntően cervicalis, a másikban pedig lumbalis MN-ok találhatók. Vagyis a MN-ok szegregációjának fokát vizsgálhatjuk a klasztereken belüli MN-ok szegmentumok szerinti homogenitásának mérésével. Egyes szélsőséges esetekben – amikor az egyik klaszter döntően cervicalis, a másik döntően lumbalis MN-okat foglal magába – nem okoz nehézséget, hogy megállapítsuk a MN-ok elkülönülését. A legtöbb esetben azonban a MN-ok csoportosulási tendenciáját nem tudjuk ránézésre megállapítani, így az elemzéshez matematikai képlettel definiált mérőszámokat kellett alkalmaznunk. Ezek az ún. homogenitási indexek voltak. A két általunk használt mutató az irodalomból ismert Peterson index (Bakus, 1990) és az általunk bevezetett utolsó rendű klaszter index voltak. A Peterson index kiszámítása a következő képlettel történt: 1 – 0.5 Σi | ai –bi |
(2)
ahol „ai” és „bi” a MN-ok szegmentumok szerinti aránya a két utolsó rendű, „A” és „B” klaszterben, „i” pedig cervicalis vagy lumbalis MN-okat jelent. Például, ha „A” klaszterben a lumbalis (L) és cervicalis (C) MN-ok aránya 2:5, „B” klaszterben pedig 6:3, akkor a Peterson index értéke: 1-0,5*(| 2/7 – 6/9 | + | 5/7 – 3/9|) = 0,62 Az utolsó rendű klaszter index a klaszterekben lévő cervicalis és lumbalis MN-ok arányának (≤1) a klaszter elemszámával súlyozott átlaga. Képletszerűen: [( „A” klaszter lumbalis és cervicalis MN-jainak aránya * „A” klaszter elemszáma) + („B” klaszter lumbalis és cervicalis MN-jainak aránya * „B” klaszter elemszáma )] / (a két klaszterben lévő MN-ok száma)
(3)
Az előző példában az utolsó rendű klaszter értéke: [ 2/5*7 + 3/6*9] / 16 = 0,46 Mindkét index dimenzió nélküli és értéke 0 és 1 közé esik. Minél közelebb van a mérőszám egyhez annál hasonlóbb egymáshoz a két utolsó rendű klaszter, azaz annál kisebb fokú a MN-ok szegmentum szerinti szegregációja. Minél közelebb van az index értéke nullához, annál nagyobb a klaszterek közötti szegregáció, vagyis a cervicalis és lumbalis MN-ok annál inkább különböznek.
18
A MN-ok szegregációs tendenciájának szignifikanciáját véletlenszerűen generált mintákon teszteltük. Minden dendrogram esetén megtartottuk az elágazási mintázatot és az elemeket leíró percentilis értékeket, de a cervicalis és lumbalis jelöléseket véletlenszerűen kicseréltük. Minden egyes dendrogram esetén száz véletlenszerű esetet képeztünk. Ez után kiszámítottuk az utolsó rendű klaszterek homogenitási indexeit. Utolsó lépésben egymintás tpróbával 0,05-os szignifikancia szint mellett teszteltük, hogy jelentősen eltérnek-e a véletlenszerű és a valós indexek. Amennyiben a t-teszt szignifikáns eltérést mutat, megállapítható, hogy a MN-ok gerincvelői szegmentális eredetük szerint homogén csoportokat alakítottak ki.
19
4.
Eredmények 1. Áttekintés A MN-ok dendritikus ingerületvezetési tulajdonságait geometriájuk és biofizikai paramé-
tereik határozzák meg. Korábbi tudományos munkákból ismert, hogy a béka cervicalis és lumbalis gerincvelői szegmentumaiból származó MN-ok geometriája több szempontból eltér (Birinyi és mtsai., 1992, Stelescu és mtsai., 2006, 2008 és 2009 ). Felmerül azonban a kérdés, hogy ha a két MN populáció méretbeli különbségeit kiiktatjuk, akkor a dendritikus szignáltranszfer tulajdonságai alapján megkülönböztethetjük-e egymástól a cervicalis és lumbalis MN-okat. A kérdésfelvetés releváns, hiszen az ingerületvezetést nemcsak a dendritfa metrikus adatai határozzák meg, hanem annak elágazódási mintázata is, mely a PSP-ok terjedését befolyásolja. A steady-state modellben kiszámítottuk a feszültség- és áramtranszfer hatékonyságát. A tranziens modellben pedig megmértük a PSP alakparamétereit (amplitúdó, félérték-szélesség és emelkedési idő) a sejttesten és az egyes kompartmenteken, mely értékek hányadosával jellemeztük a PSP terjedését. Azért, hogy a MN-ok méretbeli különbségei ne zavarhassák a vizsgálatokat, az ingerületvezetést leíró adatokat standardizáltuk. Az így létrejött adatsorok öt percentilis értékét jelöltük ki az adatsorok összehasonlításához. A percentiliseket súlyozás után a hierarchikus klaszter analízisben descriptorokként használva vizsgáltuk a MN-ok szegmentális eredet szerinti elkülönülését. A cervicalis és lumbalis MN-ok elkülönülését az utolsó rendű klaszterek szintjén homogenitási indexek segítségével értékeltük. Munkánk utolsó lépéseként statisztikai módszerekkel vizsgáltuk meg, hogy a MN-ok szétválása véletlenszerűen alkotott dendrogramokhoz képest szignifikáns-e. Az alábbi eredmények értékelésekor figyelembe kell vennünk, hogy – mivel a felnőtt béka MN-ok dendritmembránjában elhelyezkedő feszültségfüggő ioncsatornákra vonatkozóan nem rendelkezünk elég adattal, – passzív membránmodellt választottunk. A feszültségfüggő ioncsatornák jelenléte minden bizonnyal befolyásolja az ingerületterjedést, ám az eltérés nem jelentős (lásd bővebben a Módszerek fejezetben). Amennyiben megfelelő mennyiségű információ állna rendelkezésünkre, úgy az aktív membrán ingerületvezetési tulajdonságait Fourier-analízissel tudnánk vizsgálni.
20
2. Steady-state modell Steady-state analízis során hosszan tartó konstans áramot injektáltunk a dendrit kompartmentek középpontjába és kiszámítottuk a feszültség- és az áramtranszfer hatékonyságát. Az adatokat súlyoztuk a kompartmentek felszínével, majd standardizáltuk. Az steady-state áram- és feszültségtranszfer mérése a MN-ok vezetési tulajdonságainak vizsgálatakor helytálló, hiszen a sejttestre, illetve az annak közvetlen közelében lévő axon eredési dombra eljutó feszültség nagysága határozza meg elsősorban azt, hogy keletkezik-e akciós potenciál. Amennyiben akciós potenciál-sorozat keletezik, annak frekvenciája az axon dombot elérő áramerősséggel arányos. A feszültségtranszfer során mért percentilisek box plotját (7. ábra A része) elemezve feltűnik, hogy a két MN csoporthoz tartozó értékek általánosságban eltérőek s a lumbalis MNok értékeinek variabilitása nagyobb, mint a cervicalisaké.
7. ábra: Felülettel súlyozott és standardizált feszültség- (A) és áramtranszfer (B) értékei box plot formájában (Rmd = 20 000 Ωcm2)
21
Az áram- és feszültségtranszfert leíró eloszlásokat 5 percentilis értékükkel jellemeztük. Ezek a 10., 25., 50., 75. és 90. percentilisek voltak. C: cervicalis MN L: lumbalis MN
8. ábra: A cervicalis (C) és lumbalis (L) MN-ok elkülönülését ábrázoló dendrogramok a felülettel súlyozott és standardizált feszültség- és áramtranszfer értékei alapján 22
A klaszter analízis megmutatja a két MN populáció csoportképződési tendenciáját magas (Rmd = 5000 Ωcm2) és alacsony (Rmd = 50000 Ωcm2) szinaptikus háttéraktivitás mellett. Az itt látható dendrogramok azonos klaszterezési módszerrel azonos súlyozás mellett készültek (Ward-féle módszer; a 10. és 90. percentilis súlyfaktora 0,2, a 25. és 75. percentilisé 0,8, az 50. percentilisé 1). A feszültségtranszfer vizsgálata során a klaszteranalízis (8. ábra A és C része) a lumbalis és cervicalis MN-ok elkülönülését mutatta a két utolsó rendű klaszterben. A szegregáció a szinaptikus háttéraktivitás mindhárom szintjén megfigyelhető, s a háttéraktivitás növekedésével kifejezettebbé válik. Megvizsgáltuk, hogy 100 véletlenszerűen generált dendrogram szegregációs tendenciájához viszonyítva a valós elkülönülés szignifikáns-e. Az egymintás t-próba minden esetben szignifikánsnak találta az eltérést (p<10-18) (9. ábra – zöld görbék), tehát a MN-ok a somatopetalis feszültségtranszfer szempontjából szegmentumok szerint jól elkülönülnek.
Az áramtranszfer esetében a box plotokon (7. ábra B része) a lumbalis MN-ok mediánja nagyobb variabilitást mutat, mint a cervicalisaké, s a két csoport közti eltérés kevésbé kifejezett, mint a feszültségtranszfer esetében. A klaszter analízis eredménye szerint (8. ábra B és D része ) a két szegmentum MN-jai csak magas szinaptikus háttéraktivitás esetén váltak szét szignifikánsan (egymintás t-próba, p<0,02). Az idegsejtek elkülönülése egyre kevésbé volt kifejezett, amint a szinaptikus háttéraktivitás csökkent. (9. ábra – kék görbék)
23
9. ábra: A steady-state modell eredményei - A feszültség- és áramtranszfer alapján képződött utolsó rendű klaszterek homogenitási indexeinek alakulása a szinaptikus háttéraktivitás három különböző szintjén (Rmd = 5 000, 20 000 ill. 50 000 Ωcm2) kétféle klaszterezési módszer és kétféle súlyozás mellett A két súlyozási módszer (súly 1 és súly 2) szerint a MN-okat jellemző eloszlás öt percentilis értékét (10., 25., 50., 75., és 90.) mediántól való távolságuk függvényében súlyoztuk. A 10. és 90. percentilis súlyfaktora 0,33 ill. 0,20, a 25. és 75. percentilisé 0,67 ill. 0,80, az 50. percentilisé pedig mindkét esetben 1 volt. A MN-ok szegmentumok szerinti elkülönülését a percentilisek felhasználásával kétféle klaszter analízis módszer (Ward-féle és csoportátlag) segítségével vizsgáltuk. Az így kapott eredményeket homogenitási indexekkel (Peterson és utolsó rendű klaszter index) jellemeztük. Referencia egyenes: a 100 véletlenszerűen alkotott dendrogram esetében kiszámolt homogenitási indexek átlaga. Ha a transzfert jellemző paraméter referencia egyenes alatti értékeket vesz fel, az azt jelenti, hogy a valós MN-ok szegmentumok szerinti elkülönülése a véletlenszerűen generált csoportok szegregációs tendenciájánál szignifikánsan jobb volt.
24
Megállapíthatjuk tehát, hogy az alsó és felső végtagot beidegző mozgató idegsejteket a steady-state feszültségtranszfer a szinaptikus háttéraktivitás minden szintjén elkülöníti. Az áramtranszfer azonban ugyanerre csak magas szinaptikus háttéraktivitás esetében képes. A háttéraktivitás intenzitásának csökkenésével a szegregáció is csökken.
3. Tranziens modell A steady-state modellben a PSP-k kiváltása hosszantartó áraminjekcióval történt, azonban a szinapszisok aktiválódása sokszor pillanatszerű, így ezeket az időben változó (tranziens) modell milliszekundumos membránkonduktancia-változtatással pontosabban írja le. Az így keletkező ingerület terjedési tulajdonságai eltérnek a steady-state körülmények mellett generált PSP tulajdonságaitól. Modellkísérleteink következő lépéseként tehát az időben változó (tranziens) jel terjedését vizsgáltuk. A dendritikus kompartment középpontjában rövid konduktanciaváltoztatás eredményeképpen létre jövő EPSP alakparamétereit (amplitúdó, félérték-szélesség és emelkedési idő) mértük meg az adott kompartmentben majd a sejttesten. A két érték arányával jellemeztük az EPSP terjedés közben bekövetkezett változásait. Az adatokat az előzőekhez hasonlóan súlyoztuk a kompartment felszínével és standardizáltuk. A box plotok szerint az amplitúdók arányát tekintve a lumbalis MN-ok variábilisabbak, mint a cervicalisak (10. ábra A része). A félérték-szélességek és emelkedési idők esetében ilyen elkülönülés nem fedezhető fel (10. ábra B és C része).
25
10. ábra: Az amplitúdók (A), félérték-szélességek (B) és emelkedési idők (C) arányainak felülettel súlyozott és standardizált értékei box plot formájában (Rmd = 20 000 Ωcm2) C: cervicalis MN L: lumbalis MN
26
11. ábra: A cervicalis (C) és lumbalis (L) MN-ok elkülönülési tendenciáját ábrázoló dendrogram az amplitúdók (A ábra), félérték-szélességek (B ábra) és emelkedési idők (C ábra) sejttesten és dendriten mért értékeinek hányadosai alapján A klaszter analízis megmutatja a két MN populáció csoportképződési tendenciáját közepes vagy kontroll (Rmd = 20000 Ωcm2) szinaptikus háttéraktivitás mellett. Az itt látható dendrogramok azonos klaszterezési módszerrel azonos súlyozás mellett készültek (csoportátlag módszer; a 10. és 90. percentilis súlyfaktora 0,33, a 25. és 75. percentilisé 0,66, az 50. percentilisé 1). 27
Az utolsó rendű klaszterek homogenitási indexei az EPSP amplitúdójának vizsgálata során kifejezett elkülönülést mutattak a cervicalis és lumbalis MN-ok között (11. ábra A része). A szegregáció véletlenszerű próbákkal szemben elemezve szignifikánsnak (p<0,0005) bizonyult a szinaptikus háttéraktivitás mindhárom szintjén (12. ábra – kék görbék). Az EPSP félérték-szélessége és emelkedési ideje alapján készült klaszterek (11. ábra B és C része) homogenitási indexei a háttéraktivitás egyik szintjén sem különböztek szignifikánsan a véletlenszerűen generált klaszterek mérőszámaitól (p>0,96). Ennek megfelelően a két szegmentum MN-jai e két tulajdonság szempontjából nem különböznek (12. ábra – zöld és sárga görbék).
28
12. ábra: A tranziens modell eredményei - Az EPSP terjedésének három jellemzője (amplitúdók, emelkedési idők és félérték-szélességek a sejttesten és a posztszinaptikus membránban mért aránya) alapján képződött utolsó rendű klaszterek homogenitási indexeinek alakulása a szinaptikus háttéraktivitás három különböző szintjén (Rmd = 5 000, 20 000 ill. 50 000 Ωcm2) kétféle klaszterezési módszer és kétféle súlyozás mellett A két súlyozási módszer (súly 1 és súly 2) szerint a MN-okat jellemző eloszlás öt percentilis értékét (10., 25., 50., 75., és 90.) mediántól való távolságuk függvényében súlyoztuk. A 10. és 90. percentilis súlyfaktora 0,33 ill. 0,20, a 25. és 75. percentilisé 0,67 ill. 0,80, az 50. percentilisé pedig mindkét esetben 1 volt. A MN-ok szegmentumok szerinti elkülönülését a percentilisek felhasználásával kétféle klaszteranalízis módszer (Ward-féle és csoportátlag) segítségével vizsgáltuk. Az így kapott eredményeket homogenitási indexekkel (Peterson és utolsó rendű klaszter index) jellemeztük. Referencia egyenes: a 100 véletlenszerűen alkotott dendrogram esetében kiszámolt homogenitási indexek átlaga. Ha a transzfert jellemző paraméter referencia egyenes alatti értékeket vesz fel, az azt jelenti, hogy a MN-ok szegmentumok szerinti elkülönülése a véletlenszerűen generált csoportok szegregációs tendenciájánál szignifikánsan jobb volt.
29
Összefoglalva, az EPSP terjedése során csak az amplitúdó változásai különböztetik meg a végtagmozgató MN-ok cervicalis és lumbalis populációját. A félérték-szélességek és az emelkedési idők változásai a dendritikus ingerületvezetés során hasonlóképpen alakulnak a cervicalis és lumbalis MN-okban, vagyis e két tulajdonság alapján a két MN populáció nem különül el.
30
5.
Megbeszélés 1. Áttekintés Munkánk során felnőtt béka felső és alsó végtagi izmokat beidegző MN-jainak elektro-
mos vezetési tulajdonságait hasonlítottuk össze. Számítógépes modellkísérleteinkhez a cervicalis és lumbalis végtagmozgató MN populációk 8-8 tagját véletlenszerűen választottuk ki. Azt vizsgáltuk, hogy van-e olyan elektromos vezetési tulajdonág, mely a két MN csoportot alapvetően megkülönbözteti. Ismert, hogy a MN-ok mélyreható változásokon mennek keresztül embrionális és postnatalis fejlődésük során. Az átalakulás nem merül ki a sejttest és a dendritek méretének illetve a MN dendritelágazódási-mintázatának változásában, hanem érint olyan alapvető tulajdonságokat is, mint a nyugalmi membránpotenciál, a citoplazma tengelyirányú ellenállása, a specifikus membránellenállás és az ingerelhetőség (Cameron és Nunez-Abades, 2000). E tulajdonságok közül többről bizonyították, hogy a bekövetkező változás iránya és mértéke az adott MN-nak a gerincvelő rostrocaudalis tengelye mentén való elhelyezkedésével függ össze (Cameron és mtsai., 1989). Az utóbbi öt évben több tudományos cikk bizonyította, hogy a MN-ok jellemzői bizonyos mértékig genetikailag meghatározottak. Csirkékkel és egerekkel végzett kísérletek szerint a Hox (Homeobox) gének rostrocaudalis tengely mentén történő kifejeződése alakítja ki a gerincvelő lateralis MN oszlopát (Dasen és mtsai., 2005; Garcia és Jessell, 2008; Wu és mtsai., 2008). Szintén a Hox gének irányítják a MN-ok szegmentumok szerinti elkülönülését és a beidegzett izmokkal való kapcsolatának létrejöttét (Dasen és mtsai., 2005). A Hoxc6-ról, a békában izolált első Hox génről is bizonyították, hogy részt vesz a neurogenesisben (Bardine és mtsai., 2009). A fenti eredmények valószínűsítik, hogy a MN-ok fejlődése igen jelentős mértékben függ rostrocaudalis elhelyezkedésüktől. Munkánk során azt vizsgáltuk, hogy kimutatható-e ez az elkülönülés a MN-ok elektromos vezetési tulajdonságaiban is. 2. A végtagmozgató motoneuronok elektrotonikus tulajdonságai Stelescu és munkatársai (2008 és 2009) szerint a cervicalis és lumbalis végtagmozgató MN-ok számos metrikus tulajdonság – a sejttest alakja, a dendrit elágazódási szintek száma, az össz-dendrithossz és a dendrit kompartmentek száma – alapján szignifikánsan elkülönülnek 31
egymástól. Bizonyították továbbá, hogy a két MN populáció elektromos vezetési tulajdonságait megjelenítő morfoelektrotonikus transzformáltjai (MET – Zador és mtsai., 1995) is jelentősen különböznek egymástól. Felmerült tehát a kérdés, hogy a cervicalis és lumbalis MN-ok elektromos vezetési tulajdonságai között tapasztalható eltérésekért pusztán a méretbeli különbségek tehetők felelőssé, vagy az eltérő dendritikus elágazódási mintázat is. Kutatásaink során a MN-ok e két populációjának dendritikus ingerületvezetési tulajdonságait hasonlítottuk össze. Vizsgálataink során a terjedési tulajdonságokat leíró mérőszámokat standardizáltuk, kiküszöbölve azt, hogy a méretbeli különbségek befolyásolhassák az eredményeket. A feszültség amplitúdó terjedése alapján a cervicalis és lumbalis MN-ok elkülönültek mind a steady-state, mind a tranziens modellben. Ennek megfelelően kijelenthetjük, hogy azonos mértékű szinaptikus aktivitás esetén a depolarizációs hullám eltérően terjed a sejttest felé, s így az axon eredési dombot elérő depolarizáció mértéke eltérhet. Tunstall és Roberts (1994) gerincvelői MN-okon végzett kísérletes mérései szerint a mozgató idegsejtek küszöbpotenciáljában nincsen szignifikáns különbség a gerincvelő rostrocaudalis tengelye mentén. Ha tehát a cervicalis és lumbalis MN-ok küszöbpotenciálja egyforma nagyságú, akkor a felső és alsó végtagi MN-okon keletkező akciós potenciál (AP) kialakulásáért a sejttestet elérő depolarizáció nagysága és a dendritfa integrációs tulajdonságai felelősek. A steady-state körülmények között mért áramterjedés csak magas szinaptikus háttéraktivitás esetén különböztette meg a két MN csoportot. Vita folyik arról, hogy az AP kiváltásában egy bizonyos feszültség-küszöb elérése vagy adott áramerősség ’összegyűjtése’ a fontosabb. Ismert, hogy egyes esetekben az axon eredési dombra érkező EPSP amplitúdója kicsi, mégis keletkezik AP (Holmes és Woody, 1989). E megfigyelés alapján feltételezik, hogy – bizonyos körülmények között – az EPSP-k idő-integrálja az a tényező, mely az AP keletkezését legjobban befolyásolja (Calvin, 1975). Mivel az idő-integrál a sejttestet elérő össztöltéssel arányos, ennek nagysága bizonyos esetekben fontosabb lehet a feszültség mértékénél. Ezért vizsgáltuk az áram terjedését a dendritfa mentén. A steady-state modellben végzett mérések a MN-ok egyre kifejezettebb szegmentális elkülönülését mutatták a szinaptikus háttéraktivitás növekedésével. A különbség az áramtranszfer estében jelentősebb volt, mint a feszültségtranszfer esetében. Macska esetében különböző gerincvelői idegsejtek – köztük MN-ok – tanulmányozása során szintén megfigyelték a transzferjellemzők elkülönülésének fokozódását a háttéraktivitás növekedésével párhuzamosan (Bui és mtsai., 2003).
32
Fontos kiemelni, hogy eredményeinkben a MN-ok elkülönülése, illetve azok hasonulási tendenciái függetlenek voltak a homogenitási indexek, a súlyfaktorok, és a klaszteranalízishez használt módszerek megválasztásától. Mivel a mérettől független összehasonlítás céljából az eredeti, morfológiai adatokat több matematikai művelet segítségével átalakítottuk (részletesen lásd a Módszerek fejezetben), sajnos elveszett az a lehetőség, hogy a két MN populáció között kimutatott eltéréseket konkrét metrikus tulajdonságokra vezethessük vissza. A munkánk során nagy biztonsággal megállapított eltérések okának kiderítésére másfajta vizsgálómódszerek szükségesek. 3. Kitekintés Munkánk során megállapítottuk, hogy a felnőtt béka cervicalis és lumbalis végtagmozgató MN-jainak dendritikus ingerületvezetési tulajdonságai eltérnek. E szegmentális különbségek valószínűleg befolyást gyakorolnak a MN-ok által fogadott elektromos jelek integrálására és az idegsejtek AP képzésére. Eredményeink egy lépéssel közelebb juttathatnak ahhoz, hogy megértsük, hogyan és miért függnek a MN-ok elektromos és morfológiai tulajdonságai a gerincvelőben elfoglalt helyüktől.
33
7.
Irodalomjegyzék
Antal M, Kraftsik R, Szekely G, Vanderloos H. (1992) Synapses on Motoneuron Dendrites in the Brachial Section of the Frog Spinal-Cord - a Computer-Aided Electron-Microscopic Study of Cobalt-Filled Cells. J Neurocytol 21(1):34-49. Bakus GJ. (1990) Quantitative Ecology and Marine Biology. New Delhi: Quantitative Ecology and Marine Biology. Bardine N, Donow C, Korte B, Durston AJ, Knochel W, Wacker SA. (2009) Two Hoxc6 Transcripts Are Differentially Expressed and Regulate Primary Neurogenesis in Xenopus laevis. Developmental Dynamics 238(3):755-765. Birinyi A, Antal M, Wolf E, Szekely G. (1992) The Extent of the Dendritic Tree and the Number of Synapses in the Frog Motoneuron. Eur J Neurosci 4(11):1003-1012. Bui TV, Cushing S, Dewey D, Fyffe RE, Rose PK. (2003) Comparison of the Morphological and Electrotonic Properties of Renshaw Cells, Ia Inhibitory Interneurons, and Motoneurons in the Cat. Journal of Neurophysiology 90(5):2900-2918. Calvin WH. (1975) Generation of Spike Trains in CNS Neurons. Brain Res 84(1):1-22. Cameron WE, Nunez-Abades PA. (2000) Physiological Changes Accompanying Anatomical Remodeling of Mammalian Motoneurons During Postnatal Development. Brain Research Bulletin 53(5):523-527. Cameron WE, He F, Brozanski BS, Guthrie RD. (1989) The Postnatal-Growth of Motoneurons at 3 Levels of the Cat Neuraxis. Neuroscience Letters 104(3):274-280. Carnevale NT, Tsai KY, Claiborne BJ, Brown TH. (1997) Comparative Electrotonic Analysis of Three Classes of Rat Hippocampal Neurons. Journal of Neurophysiology 78(2):703720.
34
Cushing S, Bui T, Rose PK. (2005) Effect of Nonlinear Summation of Synaptic Currents on the Input-Output Properties of Spinal Motoneurons. Journal of Neurophysiology 94:3465-3478. Czeh G. (1976) Dendritic Responses of Frog Motoneurons Produced by Antidromic Activation. Neuroscience 1:469-475. Dasen JS, Tice BC, Brenner-Morton S, Jessell TM. (2005) A Hox Regulatory Network Establishes Motor Neuron Pool Identity and Target-Muscle Connectivity. Cell 123(3):477-491. Dityatev AE, Birinyi A, Puskar Z, Antal M, Clamann HP. (2001a) A Correlative Physiological and Morphological Analysis of Monosynaptically Connected Propriospinal Axon-Motoneuron Pairs in the Lumbar Spinal Cord of Frogs. Neuroscience 106(2):405417. Dityatev AE, Chmykhova NM, Dityateva GV, Babalian AL, Kleinle J, Clamann HP. (2001b.) Structural and Physiological Properties of Connections Between Individual Reticulospinal Axons and Lumbar Motoneurons of the Frog. J Comp Neurol 430(4):433447. Dityatev AE, Chmykhova NM, Studer L, Karamian OA, Kozhanov VM, Clamann HP. (1995) Comparison of the Topology and Growth Rules of Motoneuronal Dendrites. Journal of Comparative Neurology 363(3):505-516. Fleshman JW, Segev I, Burke RE. (1988) Electrotonic Architecture of Type-Identified AlphaMotoneurons in the Cat Spinal Cord. Journal of Neurophysiology 60(1):60-85. Frank K, Fuortes MG. (1956) Stimulation of Spinal Motoneurons with Intracellular Electrodes. J Physiol 134(2):451-470. Garcia NVDM, Jessell TM. (2008) Early Motor Neuron Pool Identity and Muscle Nerve Trajectory Defined by Postmitotic Restrictions in Nkx6.1 Activity. Neuron 57(2):217231. Hammer Ø, Harper DAT, Ryan PD. (2001) PAST. Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis. Palaentological Electronica 4(1):1-9. 35
Hines ML, Carnevale NT. (1997) The NEURON Simulation Environment. Neural Comput 9(6):1179-1209. Hines ML, Carnevale NT. (2001) NEURON: A Tool for Neuroscientists. Neuroscientist 7(2):123-135. Holmes WR, Woody CD. (1989) Effects of Uniform and Non-Uniform Synaptic ActivationDistributions on the Cable Properties of Modeled Cortical Pyramidal Neurons. Brain Research 505(1):12-22. Iansek R, Redman SJ. (1973) The Amplitude, Time Course and Charge of Unitary Excitatory Post-Synaptic Potentials Evoked in Spinal Motoneuron Dendrites. J Physiol 234:665-688. Larkum ME, Rioult MG, Luscher HR. (1996) Propagation of Action Potentials in the Dendrites of Neurons from Rat Spinal Cord Slice Cultures. J Neurophysiol 75:154-170. Luscher HR, Clamann HP. (1992) Relation between Structure and Function in InformationTransfer in Spinal Monosynaptic Reflex. Physiological Reviews 72(1):71-99. Magherini PC, Precht W, Schwindt PC. (1976) Electrical-Properties of Frog Motoneurons in Insitu Spinal-Cord. Journal of Neurophysiology 39(3):459-473. Nauwelaerts S, Aerts P. (2003) Propulsive Impulse as a Covarying Performance Measure in the Comparison of the Kinematics of Swimming and Jumping in Frogs. Journal of Experimental Biology 206(23):4341-4351. Rall, W. (1977) Handbook of Physiology, The Nervous System, Vol. 1, Cellular Biology of Neurons, Core Conductor Theory and Cable Properties of Neuron (3. fejezet), American Physiological Society, Bethesda Rose PK, Cushing S. (2004) Relationship Between Morphoelectrotonic Properties of Motoneuron Dendrites and Their Trajectory. Journal of Comparative Neurology 473(4):562-581. Rose PK, Vanner SJ (1988) Differences in Somatic and Dendritic Specific Membrane Resistivity of Spinal Motoneurons: An Electrophysiological Study of Neck and Shoulder Motoneurons in the Cat. Journal of Neurophysiology 60:149-166.
36
Segev I, Fleshman JW, Burke RE. (1989) Compartmental Models of Complex Neurons. Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks: MIT Press. Segev I, Fleshman JW, Burke RE. (1990) Computer-Simulation of Group Ia Epsps Using Morphologically Realistic Models of Cat Alpha-Motoneurons. Journal of Neurophysiology 64(2):648-660. Segev I, Fleshman JW, Miller JP, Bunow B. (1985) Modeling the Electrical Behavior of Anatomically Complex Neurons Using a Network Analysis Program - Passive Membrane. Biological Cybernetics 53(1):27-40. Stelescu A, Birinyi A, Wéber I, Wolf E. (2006) Spatial and Temporal Influence of Dendrites on Propriospinal EPSP Summation in Motoneurons of Frog. IBRO Workshop, 26-28, January, Budapest, 2006. Clinical Neuroscience / Ideggyógyászati Szemle, Budapest, 59/1: 59-60., 2006 Stelescu A, Vida E, Wéber I, Birinyi A, Wolf E. (2008) Cervical and Lumbar Motoneurons Are Morphologically and Electrotonically Different in Frog (Rana esculenta). Clinical Neuroscience / Ideggyógyászati Szemle, Debrecen, 61/1: 58., 2008 Stelescu A, Vass J, Sümegi J, Wolf E. (2009) Morphological and Electrotonic Comparison of Motoneurons and Their Dendritic Fields in the Cervical and Lumbar Segments of Frogs. Frontiers in Systems Neuroscience. Conference Abstract: 12th Meeting of The Hungarian Neuroscience Society. Doi: 10.3389/conf.neuro.01.2009.04.075, Budapest, 2009. Székely G. (1963) Functional Specificity of Spinal Cord Segments in the Control of Limb Movements. J Embryol Exp Morphol 11:431-444. Székely G. (1976) The Morphology of Motoneurons and Dorsal Root Fibers in the Frog's Spinal Cord. Brain Research 103(2):275-290. Tosney KW, Hotary KB, Lancejones C. (1995) Specifying the Target Identity of Motoneurons. Bioessays 17(5):379-382. Tunstall MJ, Roberts A. (1994) A Longitudinal Gradient of Synaptic Drive in the Spinal Cord of Xenopus Embryos and its Role in Co-Ordination of Swimming. Journal of PhysiologyLondon 474(3):393-405. 37
Urbán L, Oláh S, Birinyi A. (1987) Correlative Physiological and Morphological Investigations of Frog Motoneurons: An Intracellular Study with Cobalt-Lysine. Neuroscience Suppl 22. Weast RC, Selby SM. (1985) Handbook of Tables for Mathematics. Ohio: Cleveland : CRC Press. Wolf E, Birinyi A, Szekely G. (1992) Simulation of the Effect of Synapses – the Significance of the Dendritic Diameter in Impulse Propagation. Eur J Neurosci 4:1013-1021. Wu Y, Wang G, Scott SA, Capecchi MR. (2008) Hoxc10 and Hoxd10 Regulate Mouse Columnar, Divisional and Motor Pool Identity of Lumbar Motoneurons. Development 135(1):171-182. Zador AM, Agmonsnir H, Segev I. (1995) The Morphoelectrotonic Transform: A Graphical Approach to Dendritic Function. Journal of Neuroscience 15(3):1669-1682.
38
