A fagocitózis – A kemotaxis célreakciója
Dr. Szabó Rita ELTE-MTA Peptidkémia Kutatócsoport
Endocitózis • •
Az endocitózis formái Fagocitózis: – – – –
Professzionális fagocitasejtek Milyen részecskék Formái:opsz/nonopsz Mechanizmus • • • •
Internalizáció Receptorok IC folyamatok Szabályozás
– A fagocitózis vizsgálata – módszerek – Fagocitózis defektusai • Patogén miatt • Fagocita miatt
A kemotaxis és az endocitózis összefüggése
van Eeden, S.F. et al.rJournal of Immunological Methods 232(1999)23–43
Az endocitózis formái Pinocitózis: Az a folyamat, melynek során a sejt felveszi a környezetében található vízben oldott anyagokat („iszik”).
oldott anyag víz
plazmamembrán
http://academic.brooklyn.cuny.edu
Az endocitózis formái Makropinocitózis: 0,15-5 µm átmérőjű nagy vezikulák (makrofág, dendritikus sejt) Oldott anyag felvétele
Rupper A. et al, Mol. Biol. Cell, (2001) 12: 2813-24
Az endocitózis formái Klatrin függő (receptor mediált) endocitózis: Az a folyamat, melynek során a molekula specifikus ejtfelszíni receptorhoz kötődik, és a receptorral együtt kerül be a sejtbe. •Specifikus. •A mambránbetűrődés területén klatrinburok – hatszöges szerkezet, adapterfehérjékkel kapcsolódik a receptorhoz
plazmamembrán
LEFŰZŐDÉS: DINAMIN VEZIKULA KIALAKULÁSA
http://academic.brooklyn.cuny.edu B. M. M. Perry, 1979. J. Cell Science 39: 266. Cooper, G.M. The Cell: A Molecular Approach, 2nd ed. Alberts et al.,1994, Molecular Biology of the Cell
KLATRIN LEVÁLIK
pl.: LDL
Alberts et al.,1994, Molecular Biology of the Cell
transzferrin
Az endocitózis formái Kaveola/lipid raft közvetített endocitózis: Kaveola: 50-100 nm hosszú palack alakú membránbetűrődés Lipid raft: a mambrán koleszterinben gazdag mikrodoménjei – receptor akkumuláció (GPI-horgonyzott fehérjék, pl. kaveolin, src-kinázok, Gfehérjék, receptorok, stb.*) *Foster J. L. et al, PNAS (2003) 10: 5813-18 kontroll
MβCD
Kaveolák
D’Alessio, A. et al, Am.J. Pathol. (2005) 166:1273-1282.
Kolokalizáció: TNFR1 és kaveolin
metil-β-cilklodextrin: koleszterin kivonása a menbránból Nincs kolokalizáció
Az endocitózis formái Fagocitózis: Az a folyamat, melynek során élő sejtek más sejteket, vagy részecskéket kebeleznek be. •A fagocita lehet önálló szervezet (pl. egysejtű), vagy a test sejtjeinek egyike (pl. fehérvérsejt). •Receptror – pl. Fc-receptor, komplement receptor, táplálékreceptor
http://academic.brooklyn.cuny.edu/biology/bio4fv/page/phago.htm
A fagocitózis lépései
1. Álláb kialakulása 2. Fagoszóma kialakulása Az álláb összeolvad amembránnal és kialakul a részecskét tartalmazó fagoszóma. 3. Fago-lizoszóma kialakulása A fagoszóma a sejt belsejében összeolvad egy lizoszómával (fago-lizoszóma). 4. Enzimatikus lebontás hidrogén peroxid, reaktív oxigéngyökök, peroxidáz, lizozim, hidrolitikus enzimek 5. Exocitózis a sejt kiválasztja a törmeléket
© 1997, Duane W. Sears, http://www.whfreeman.com/immunology/CH01/phagocytosis.htm http://www-micro.msb.le.ac.uk/MBChB/bloodmap/Phagocytosis.html
Fagocitált sejtek és részecskék
baktériumok
vírusok
gombák
E. Coli
HIV, influenza
élesztő
Wikipedia
medicine.wustl.edu
www.utoronto.ca
korom
azbeszt
7starm.asu.edu/graphics
www.dnevnik.si/azbest
elpusztult sejtek, sejttörmelék www.boku.ac.at
Fagocita sejtek Egysejtűek Csillósok
Tetrahymena pyriformis www.ulb.ac.be
epitél sejtek
Amőbák
fibroblasztok
Amoeba proteus www.bioeng.auckland.ac.nz cellapplications.com
faculty.clintoncc.suny.edu
cellapplications.com
Fehérvérsejtek
„Professzionális” fagocitasejtek
makrofág
Éretlen dendritikus sejtek www.vumc.nl (dr. Y. van Kooyk)
neutrofil granulocita
Monociták, makrofágok
Granulociták
microbiology.otago.ac.nz
Wikipedia
Csillósok Tetrahymena www.zeiss.de
3.
1. 2. protist.i.hosei.ac.jp
4.
1. 2. 3. Nilsson, J. R. J. Cell Sci., (1977) 27:115-126 Grønlien, H. K. et al, J. Exp. Biol. (2002), 205:2089-97
4.
Szájmező alján kialakul a táplálékvakuólum A táplálékot a hártyák „besöprik” a vakuólumba A táplálékvakuólum leválik a a szájmezőről és megkezdi útját a sejtben A vakuólum vándorlása: citoszkeleton
Az immunsejtek fagocitózisának formái
nem opszonizált fagocitózis
szénhidrátok lipidek/lipoproteinek nukleinsavak természetes immunitás mintázatfelismerő receptorokon keresztül komplement receptoron keresztül komplementfehérje kötődik a sejt felszínéhez
opszonizált fagocitózis
természetes immunitás
ellenanyag kötődik a felszínhez adaptív immunitás Fc receptorokon keresztül
„Mintázatfelismerő receptorok”
Immunkomplexeket felismerő receptorok
Receptorok Receptor
Célsejt
Komplement receptorok CR1 (CD35) CR3 (CD11b/CD18) CR4 (CD11c/CD18)
Komplement-komponensekkel opszonizált baktériumok, gombák
Fc-receptorok FcγRII (CD32) FcγRIII (CD16)
Immunglobulinokkal opszonizált baktériumok, gombák
LPS receptor (CD14)
Gram - baktériumok
Toll-szerű receptorok (TLR)
Baktériumok, vírusok
Szénhidrát felismerő receptorok a. mannóz receptor (DEC205 - DC-n) b. galaktóz receptor
Baktériumok Gombák
Scavenger receptorok
Dectin-1
Ligandja
Szerepe az immunválaszban Opszonizált fagocitózis Effektorfunkciók beindítása
[1]
IgG Fc régió
Opszonizált fagocitózis Effektorfunkciók beindítása
[1]
LPS
Fagocitózis
[1]
Fagocitózis, intracelluláris jelátvitel – effektorfunkciók beindítása
[3] [4]
C3b, C4b, MBL iC3b, b-glükóz, ICAM1/2 iC3b, C3d, fibrinogén
Sejtfal-alkotóelemek mannóz fukóz, galaktóz
Fagocitózis (baktériumok, gombák)
Baktériumok, apoptotikus sejtek
polianionos molekulák, pl. fucoidin, Ac-LDL, Ox-LDL, telomer szekvenciák, foszfatidil-szerin
Baktériumok, apoptotikus sejtek fagocitózisa
[5]
Baktériumok
β-glükóz tartalmú poliszaharidok
Fagocitózis
[6]
[1] [2]
MBL: mannan binding lectin, mannánkötő lektin [1]: Aderem és Underhill, 1999; [2]: Basu, 1990; [3]:Kopp et al, 2003 ; [4]:Vaidyay et al, 2003; [5]:Peiser et al, 2001; [6]:The Immune Response to Infection, Science Press Ltd
Az aktin polimerizáció szabályozása a fagocitózis során Kis GTPázok szabályozzák az aktin polimerizációt a fagocitózis folyamata során. •GTP-kötő fehérjék, GTP-t hidrolizálnak GDP-vé (Rho); •GEF: guanin nucleotide exhange factor, GTPcserefaktor.
Sejtfelszíni receptor GEF
→ A LIGAND KÖTŐDIK A RECEPTORHOZ → GTP-ÁZ(OK) GEF FÜGGŐ AKTIVÁLÓDÁSA → JELÁTVITELI KASZKÁD → Arp2/3 KOMPLEX AKTIVÁLÓDÁSA → AKTIN POLIMERIZÁCIÓ
YopT YopE ExoS ExoT
Rho GTP-ázok Toxin B
Tir
Effektor fehérjék Gátló bakteriális fehérjék és toxinok
GEF: guanine nucleotide exchange factor; CNF: cytotoxic necrotizing factor 1 (aktiváló bakteriális toxin) Tir: translocated intimin receptor; Yop: Yersinia outer protein
CNF1
Arp2/3 AKTIN
Az emlős sejtek fagocitózisa során aktiválódó fő jelátviteli útvonalak I. típus
II. típus
FcγR
Apoptotikus sejt felvétele
Vav
Dock180 /Elmo
Rac FcγR: Fcγ receptor; CR3: komplement receptor 3; WASp: Wiskott-Aldrich Syndrome protein Vav: Dock180/Elmo, SopE: adapterfehérjék
CR3
SopE
+
Cdc42
Rho
WASp
Rho kináz
Arp2/3 AKTIN kitüremkedés
AKTIN kontrakció
Szabályozás : Az inracelluláris Ca2+ felszabadítása az ER-ből 0s
3s
6s
A fagocitózis receptorok (Antigen-R) által aktivált jelátviteli utak: 1. szfingozin-1-foszfát (S1P) útvonal 2. PLCγ/PLCβ – inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) útvonal IP3 receptor (IP3R), ryanodine és NAADP receptors (RYR, NAADPR), SCaMPER (putative sphingolipid Ca2+ releasemediating protein of the ER): intracelluláris Ca2+ csatornák Eurekah.com and Landes Bioscience; 2003. www.cellbioed.org
Szabályozás – aktiváció Fcγ receptoron keresztül Fehérjefoszforilációs kaszkád: → FcγR keresztkötése a ligand által → ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) foszforilációja (Src kinázok) → adapterfehérjék foszforilációja (LAT) → SH2 domént tartalmazó fehérjék megkötése + foszforilációja → jelátviteli kaszkád (Tyr-foszforiláció, Ser/Thr-foszforiláció) → az immunkomplex fagocitózisa → gyulladási citokinek termelése
Eurekah.com and Landes Bioscience; 2003.
A fagocitasejtek endocitózist követő aktivációja – makrofágok
Limfociták aktiválása antigén feldolgozás és prezentáció IL-1 termelés IL-10 → Th2 IL-12 → Th1
Gyulladás TNFα, IL-1, IL-6, prosztaglandinok, komplementfaktorok véralvadási faktorok Akut fázis reakció
Antitumor aktivitás Proteázok, argináz, toxikus faktorok, H2O2, C3a, NO, TNFα
Immunkompetens sejtek vonzása Kemotaktikus anyagok: kemokinek, C5a
Szöveti újraképződés elasztáz, kollagenáz, hialuronidáz FGF, VEGF, TGFβ,Véralvadási faktorok Antimikrobiális aktivitás Oxigénfüggő: H2O2, O2−, OH−, HOCl, NO, NO2, HNO3 (NADPH-oxidáz, iNOS, SOD) Oxigéntől független: lizozim, hidrolitikus enzimek, kationos fehérjék, peptidek. TNFα Szövetkárosítás H2O2, savas hidrolázok, C3a, TNFα A fertőzés terjedésének megakadályozása
Az endocitózis formái: összefoglalás
Endicitózis formája
Vezikula mérete
Bekebelezett anyag/részecske
Burkoló Adapterfehérjék fehér je
Klatrinfüggő
120 nm
Ligand/receptor komplex, toxinok, tápanyagok
Klatrin
Kaveola/lipid raft
50–80 nm
Albumin, vírusok, toxinok, Kaveolin 1,2,3 lgE, glikoproteinek, folsav, GPIhorgonyzott receptorok
-
Fagocitózis
300 nm– pár µm
Baktériumok, lgG, egyéb részecskék
CBL, NCK, GRB2, CRKL, CED, DOCK180
Pinocitózis
0,5–5 µm
Folyadékok, oldatok
Šamaj J. et al., Plant Physiology, (2004) 135: 1150-1161
-
AP1, AP2a, AP3, AP4, AP180a, arrestin
-
Az endocitózis molekuláris mechanizmusa: összefoglalás Endocitózis formája
Köztes molekulák (endocitózis/citoszkeleton)
Citoszkeleton fehérjék
Jelátvivő molekulák
Klatrin-függő (RME)
Dinamin, Hip1R, ankyrin, intersectin, ACK1, ACK2, epsin, Auxilin, synaptojanin, Hsc70, Eps15, synaptotagmin, amphiphysin, annexin, GGA, syndapin, endophilin, pascilin
Aktin, Arp2/3, WASp, cortaktin, cofilin, ABP1, miozin I, miozin VI, fimbrin, talin, alfa-aktinin
GAK, BIK, AAK1, PLD, P13-K, kazein kináz, PIP5K, PDK, MAPKs, PKC, ARF6, Sar1, foszfatázok
Kaveola/lipid raft
Dinamin
Aktin, Arp2/3, WASp
Src, Abl, Fyn, Ret, Lyn, Syk tirozin kináz, PKC, NO szintáz, Rac, Rho A, PLC, Ras, Raf, MAPks
Fagocitózis
Dinamin, annexin, ERM fehérjecsalád
Aktin, Arp2/3, WASp, coronin, cofilin, ABP120, alfa-aktinin, miozin I, miozin II, miozin VII
Src tirozin kináz, Syk, casein kináz, PKC, PLD, PI3-K, PIP5K I, Rho, Cdc42, ARF6, Rac, POR1, Rap1
Pinocitózis
Dinamin
Aktin, ARP2/3, WASp, cortaktin
PDK, Ras, Rho, ARF6, PI3-K, p21-aktivált kináz
Šamaj J. et al., Plant Physiology, (2004) 135: 1150-1161
Vizsgálati módszerek Fénymikroszkóp Fagicitózis index számolása pl. bekebelezett részecskék száma/200 sejt
Elektronmikroszkóp www.aldeaeducativa.com
www.agen.ufl.edu
Mechanizmus, szerkezeti infirmációk
Vizsgálati módszerek Áramlási citometria (FACS) lézer
3.
2.
fluoreszcensen jelölt részecske
1.
Mérhető paraméterek: 1. FSC (forward scatter) ∼ sejt mérete 2. SSC (side scatter) ∼ a sejt granuláltsága 3. fluoreszcencia intenzitás ∼ arányos a bekebelezett fluoreszcens részecskék mennyiségével
meds.queensu.ca www.bio.umass.edu
sejtszám
egy sejt megy át a lézer előtt
fluoreszcencia
Indirekt vizsgálati módszerek Reaktív oxigéngyökök meghatározása NBT-teszt: a fagocitáló sejtek a sárga színű nitro-blue-tetrazólium festéket felveszik, és azt a szuperoxid anion (O2-) kék színû formazánná alakítja át Enzimaktivitás mérése Mieloperoxidáz Savas foszfatáz Alkalikus foszfatáz Lizozim (Micrococcus lysodeikticus baktérium szuszpenziót hozzáadják a neutrofil szuszpenzióhoz, a baktérium lízisének eredményeként a fényszóródás csökkenését optikai denzitás alapján mérik)
A fagociták által termelt szolubilis molekulák mérése Citokinek, Leukotriének prosztaglandinok, Tromboxánok, Hisztamin Immunkémiai módszerek: ELISA, RIA, FIA Áramlási citometria Génexpressziós szinten: PCR www.medicine-pecs.hu/immbio/HungarianVersion/Gyakorlatok/10_szovettenyesztes.htm
A fagocitasejtek defektusai Hibás fehérje
Sejtszintű funkcióhiány
Tünetek
sialyl-Lewisx
Sejtadhézió zavara
Bakteriális fertőzések
Integrin β lánc (CD18)
Sejtadhézió zavara
Bakteriális fertőzések
Leukocita adhézió deficiencia (LAD)
NAPH oxidáz
A sejt nem termel szuperoxid aniont Csökkent ölőképesség
Krónikus bakteriális fertőzések, granulómák kialakulása
Krónikus granulomatózis
Mieloperoxidáz Csökkent ölőképesség
Krónikus fertőzés
Glü-6-Pdehidrogenáz
Csökkent ölőképesség
Krónikus fertőzés
Vezikulák kialakulásában szerepet játszó fehérje
Lizoszómák nem fuzionálnak a fagoszómákkal, nagy granulumok a sejtben; csökkent ölőképesség
Részleges albinizmus, fényérzékenység, nystagmus; abnormális vérlemezke funkció; súlyos immunhiányos állapot
Janeway, C. A. et al. Immunobiology, Garland Publishing, 2001
Chediak-Higashi szindróma
