A kemotaxis során megfigyelhető eltérő mozgási formák értelmezése
A baktérium ostor - 12-30nm monotrich
5
lopotrich peritrich Felépítő protein: z flagellin (53.000) z pentahelikális felépítés z gyors regeneráció (3-6 perc)
{
A baktérium ostor bazális testének szerkezete ostor „hook” rotor
22.5 nm L P S M
stator
27 nm
A baktérium ostor rotációjának iránya és a mozgás-típusok közötti összefüggés
CCW
CW tumbling
R M Berry: Torque and switching in the bacterial flagellar motor. An electrostatic model. Biophys J. 1993 April; 64(4): 961–973
Grádiens
Egyenes szakaszok hossza Tumbling szám
Grádiens
Egyenes szakaszok hossza Tumbling szám
E. COLI
E. COLI
A bakteriális kemotaxis és adaptáció A sejtek mozgására nem csupán a koncentráció-grádiens változása hat
!
Az adaptációs mechanizmusok megléte e sejtek „primitív” memóriájának létélre utal.
cukrok
dipeptidek
aminosavak
periplazmikus kötő/szállító molekulák kemotaxis receptporok
intracellulláris szignalizációs út
Bakteriális cheotaxis receptorok kimutatása osztódási gyűrű
receptor
Aszpartát receptor ligandkötő-hely
„coiled-coil” domain metilációs helyek szignáltovábbító rész
Asp receptor részei
O C O
ligandkötő hely
O metilációs hely C O 8 db
szignál továbbító rész alap-aktivitásban
Asp kemotaxis receptor metilációja
O C O
O C O
metiltranszferáz
O C O
O C O
O C O CH3
metilészteráz
O C O CH3
Repellens molekula CheW , CheB-P 200 ms
CheA
CheA-P
CheA-P + CheY Mg2+
CheY-P + CheZ Mg2+
CheY-P+ CheA CW rotáció „tumbling” CheY + Pi
Attraktáns molekula
CheA aktivitás CheY-P mennyiség H+ vándorlási iránya az ostor motor régiójában megfordul CCW rotáció „úszás”
dipeptidek
Tap
galaktóz ribóz
Trg
Leu, Ser
Ni2+, Asp
Tsr
Tar CheR
CheB-P CheB
CheA CheA-P MOTOR
CheW CheY CheY-P
CheZ
Ser Asp Maltóz
MalE
Ribóz
RbsB
D-Gal
MglB
Dipeptid DppA
MotA =MotB Tsr
-m
CheB
Tar
Trg Tap
+P
CheA CheW
+P
CheY -P
FliG FliM FliN
CheZ +m
CheR
Gázok Aer m = metiláció P = foszforiláció
Repellens molekulák
CH3
CheB-P CheB
CheA Che A-P
CheY-P CheY
CheA
Receptor
Effektor
L
Homocyst
NH3 CheD H2 O Methanol
CheR
-CH3 CheW
CheV -P
ADP
CheA -P
CheB
SAM
ATP
H2 O
CheY
P- Pi Sink
CheZ P- CheY
CheC CheX Motor app FliY
Pi
A CheY szerkezete
A ChA - ChY komplex
Baktérium legfontosabb flagelláris proteinjei z
z z z
z z
FlgK - a „hook” régió FlgD- hosszát szabályozza FlgB, C, G - összekötő „pálca” FliF M-gyűrű Mot A - Transzmembrán proton-csatorna Mot B - Kapcsoló fehérje Fli G - CheY-CheZ Fli M- kapcsolat Fli N-
Flagelláris proteinek z
Több operonon elhelyezkedő, 30-nál több gén határozza meg
z
Szintézisét, illetve expresszióját a Sigma 28 faktor szabályozza
z
„Hook asszociált protein” (HAP) : - a flagellin molekulák nukleációs helyét adja - növeli a mechanikai ellenállóképességet
z
Fő fajtái: Fli, Flg, Flh
A bakteriális kemotaxis proteinek jellemzése z
CheA - hisztidin autokináz P1 - 22 aminosav, nem gátlódó régió P2 - 25 aminosav, a CheY interakcióban vesz részt ¾ CheAL (long) - His48 autofoszforilálódik, mely része a CheY és CheB aktiválódási folyamatának ¾ CheAL működése pH-függő. Optimális pH 8.1 - 8.9 - ha a citopl. pH 7.6 alá csökken a Tar és Trg receptorok továbbítanak szignált ¾
ChAS (short) - kináz aktivitással rendelkező, de NEM autofoszforilálódó alegység - aminoterminálisan 97 as. szekvencia hiányzik
A bakteriális kemotaxis proteinek jellemzése z
CheA hyper kináz - pontmutáció a Pro337-nél, melynek következménye a foszforiláció sebességének növekedése
z
A CheA a CheV foszforilációját is irányitja
z
CheN -
Bacillis substilisban található és homológ E. coli CheA-jával
A bakteriális kemotaxis proteinek jellemzése z
CheY -
128 as.-ból áll, foszforilációját a konformáció megváltozása követi számos pozícióban lévő as. helyzete változik, pl.: 17, 21, 23, 39, 60, 63, 64, 66, 67, 68, 69, 85, 86, 87, 88, 94, 107, 109, 112, 113, 114, 121
z
A Mg2+ jelenléte a CheY aktiválódásához elengedhetetlen Mg2+ hatására a Lys109 - Asp 57 közötti sókötés felszakad, ez lehetővé teszi a molekula foszforilációját
Metil-Accepting Chemotaxis proteinek (MCP-k) jellemzése z
MCP1 - Tsr, MCP2 - Tar, MCP3 - Trg, MCP4 - Tap
zH1
- 97 kD pI 5.1; H2 - 86 kD pI 5.1; H3 - 76 kD pI 5.3
zDcrA
z
- Hem tartalmú, 668 as.-ból álló, 2 hidrofób szekvenciát tartalmazó oxigén szenzor, mely a redox-potenciál változásaira reagál (Desulfovibrio vulgaris)
Tlpc - 30% homológiát mutat az E.coli MCP-jével; defgektusa esetén elmarad a pathológiás kemotaxis
Metil-Accepting Chemotaxis proteinek (MCP-k) jellemzése
A metiláció táplálékmolekula-függő folyamat (pl. E.coli) z Éheztetés hatására egy 43kD-os, membrán-asszociált protein metilációja figyelhető meg; - táplálék molekulák jelenlétében a metiláció leáll z
A metilációs rendszer és a kemotaxis aktivációja közötti kapcsolat a kemotaxis receptorok, illetve szignalizációs folyamat alapvető evolúciós hátterére utal
Metil-Accepting Chemotaxis proteinek (MCP-k) jellemzése z
MCP-k demetilálódása -CH3
Attraktáns
CARRIERCARRIER-CH3
MCP-CH3 gyors
CARRIERCARRIER-CH3
Metanol + CARRIER lassú
A nem metilált intermedier „tumblingot” idéz elő, majd kialakul az ADAPTÁCIÓ
MCP-fluoreszcencia kimutatása eltérő fenotípusú sejtekben
Adaptáció - Tumbling
A sejtek elhelyezkedése optimális koncentrációt Jelentő gyűrűkben - adaptáció
Ser gyűrű
Asp gyűrű
Methyláció – Szénhidrát típusú ligandok hatása
Methyláció - időfüggés
Kemotaxis - Evolúció Metil-transzferázok CheR Homológia: E.coli metil-transzferáza metilálja a Bac. subst. MCP-jét Eltérés: Bac. subst. CheRB E.coli CheRE
Adaptáció repellensekhez Adaptáció attraktánsokhoz
Kemotaxis - Evolúció Metil-észterázok CheB Homológia: Bac.subst. MCP + ATTRAKTÁNS E.coli CheB
Bac.subst. CheB + ATTRAKTÁNS E.coli MCP
DEMETILÁCIÓ
DEMETILÁCIÓ
A reakciók sebességét az MCP határozza meg
Kemotaxis - Evolúció Metil-transzferázok CheR Homológia: E.coli metil-transzferáza metilálja a Bac. subst. MCP-jét Eltérés: Bac. subst. CheRB E.coli CheRE
Adaptáció repellensekhez Adaptáció attraktánsokhoz
Methanol-képződés dinamizmusa és a ligandspecifitás C. gelida
E. coli
B. subst.
Kemotaxis - Evolúció zBac.subst.
CheY E.coli CheA
zBac.subst.
CheY-P E.coli CheZ
zBac.subst. zE.coli
CheY-P CheY
pozitív kemotaxis a esetén - CheY-P
pozitív kemotaxisa esetén - Chey-P
zBac.subst.
és E. coli CheW 28.6% homológia zBac. subst. CheB és E.coli CheY 36% homológia zBac. subst. és E. coli - M gyűrű és pálca
Ca2+ hatása baktériumok kemotaxisára
z
Kimutatható egy 38kD-os Ca2+-kötő fehérje
zCa2+
csatorna gáltók (pl. verapamil, LaCl3) a kemotaxis zavarát okozzák
Che A (kb. 650 AS) P1 N
P2
P3
P4
P5
H
C
Foszforiláció RR-bdg. Dimer
Katalít.
CheW rec bdg.
Che Y (kb. 120 AS) N
DD Mg2+ bdg.
D Foszforiláció
T/S
K
Katalít.
C
Sigma faktor
Che ? Sigma28 Bas.test CheW CheY CheB A Sigma28 faktort kódoló gén egy 26 kb-os operon része z A flagellin, a „hook-asszociált protein” (HAP) és egyes motor proteinek szintézisét szabályozó régió z Hiánya: paralizált flagellum; MCP hiány z
Bakteriális chemotaxis mérése 3-csatornás rendszerben
