A DNAL1 gén identifikálása és új, genetikai alapokon nyugvó diagnosztikai eljárás kifejlesztése primer ciliáris dyskinesiában
Doktori (PhD) értekezés tézisei
Dr. Horváth Judit
Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekklinika Programvezető: Dr. Falus András egyetemi tanár
Budapest, 2006
Szigorlati bizottság: Dr. Kopper László egyetemi tanár Dr. Váradi András MTA doktora Dr. Bujdosó Györgyi PhD
Opponensek: Dr. Sasvári Mária MTA doktora Dr. Oláh Edit MTA doktora
Bevezetés
Bevezetés A primer ciliáris dyskinesia (PCD; MIM 242650) ritka megbetegedés, általában autoszómális recesszív öröklésmenetet mutat, incidenciája 1:20 000. Az alsó és a felső légutak epithelje motilis csillókkal sűrűn fedett, melyek folyamatosan szállítják az inhalált partikulumokat, a sejttörmeléket és a mikróbákat a torok felé. Az immotilis vagy dysmotilis csillók következtében hiányzik a mukociliáris clearance a PCD betegekben. Ez rekurrens légúti infekciókhoz vezet, amely maradandó tüdőkárosodást okoz, mint pl a bronchiectasia. Az embriogenezis során a nodális csillók dysfunkciója a bal/jobb oldali testi aszimmetria véletlenszerű kialakulásához vezet. Ez magyarázza, hogy a PCD betegek felében situs inversus mutatható ki. A PCD és a situs inversus asszociációját Kartagener szindrómának nevezzük (KS; MIM 244400). A motilis csilló és ostor ultrastruktúrája két centrális tubulusból valamint az ezeket körülvevő kilenc, rendezett perifériás mikrotubuluspárból (A és B tubulusok) áll (9+2 axonema). A belső (IDA) és a külsö (ODA) dynein karok a perifériás A tubulushoz vannak kihorgonyozva és a csillómozgást azáltal hozzák létre, hogy reverzibilisen kötődnek a perifériás B tubulushoz. A PCD betegek respiratórikus csillóinak elektronmikroszkópos vizsgálata során gyakran kimutatható jellemző ultrastrukturális defektus közül a leggyakoribb a dynein karok részleges vagy teljes hiánya. A külső (ODA) és a belső (IDA) dynein karok molekuláris motorokat tartalmaznak, melyek ATP-dependens reakcióval generálják a csillók mozgásához szükséges erőt. Az ODA-k nagy multiprotein komplexek, nehéz (HCs, 400-500 kDa), közepesen nehéz (Ics, 55-110 kDa) valamint könnyű (LCs, 8-45 kDa) dynein láncokból állnak. Biflagelláns zöld algát széles körben használják, mint modell organizmust a dynein karok összeépülésének és a csilló funkció vizsgálatára. Eddig már számos Chamydomonas mutánst írtak le, melyek ODA és IDA defektussal rendelkeznek. A külső dynein kart felépítő ODA gének mutációi azt eredményezik, hogy az alga lassabban úszik valamint ultrastrukturális ODA defektus is kimutatható. Kandidáns génvizsgálat és pozicionális klónozási stratégiák felhasználásával sikerült recesszív mutációkat azonosítani a humán orthológ ODA génekben, a DNAI1-ben és a DNAH5-ben PCD betegeknél. A DNAH5 a Chlamydomonas γ-HC humán orthológja. Chlamydomonasban γ-HC motor protein aktivitását az axonemalis LC1 kötése szabályozza. A Chlamydomonas LC1 génjének humán (DNAL1) és a murin (Dnal1) orthológjait identifikáltuk és karakterizáltuk.
1
Bevezetés A PCD diagnózisa a jellemző klinikai tünetek meglétére, - mely magában foglalja a rekurrens légúti infekciókat situs inversussal vagy anélkül, - a csillók specifikus ultastrukturális elváltozásának
elektonmikroszkópos
kimutatására
és/vagy
a
ciliáris
dyskinesia
fénymikroszkópos kimutatására épül. A fénymikroszkópos csilló csapás vizsgálata komplikált lehet és a szekunder ciliáris elváltozások, pl. infekciók nehezíthetik a diagnózis felállítását. A PCD betegek legnagyobb részében elektronmikroszkóppal detektáljuk a dynein kar defektusokat. A csilló morfológia elektronmikroszkópos analízise is lehet eredménytelen, amely gyakran a belső dynein karok kiértékelését érinti, ugyanis a belső dynein karok különféle összetétele és eloszlása miatt alacsony a kontrasztjuk. DNALI1 elleni antitest (mint belső dynein kar marker) valamint DNAH5 elleni antitest (mint külső dynein kar marker) felhasználásával kifejlesztettünk egy új diagnosztikus módszert PCD-ben. Vizsgálatunkban 54 PCD beteg transznazális biopsziáit dolgoztuk fel nagy feloldóképességű immunfluoreszcens mikroszkópos technika segítségével.
2
Célkitűzés
Célkitűzés A humán DNAL1 és a murin Dnal1 gének identifikálása A motilis csillók kongenitális diszfunkciója primer ciliáris dyskinesiában komplex fenotípust okoz. A PCD-ben leggyakrabban leírt ultrastrukturális defektus a könnyű (LC), a közepesen nehéz (IC), valamint a nehéz láncból (HC) álló külső dynein karok (ODA) részleges vagy teljes hiánya. Ebből a klinikai megfigyelésből kiindulva az eddigi génidentifikációs vizsgálatok a dynein karokat felépítő génekre korlátozódtak. A biflagelláns Chlamydomonas γ-ODA-HC gén humán orthológ génjének, a DNAH5-nek a recesszív mutációi PCD-t okoznak. A Chlamydomonas γ-ODA-HC motoros protein aktivitása az axonemális LC1 fehérje által szabályozott. PhD munkám célja az axonemális LC1 fehérje humán és murin orthológjának (DNAL1 és Dnal1) identifikálása az alábbi módon: •
A génstruktúra meghatározása
•
A DNAL1 fehérjeszerkezetének elemzése
•
A DNAL1 és a DNAH5 interakciójának vizsgálata
•
A DNAL1 expressziós vizsgálata
•
A DNAL1 gén mutációanalízise PCD-ben szenvedő betegekben
Új diagnosztikai eljárás kifejlesztése primer ciliáris dyskinesiában Jelenlegi ismereteink alapján nem áll rendelkezésünkre olyan nem invazív, megbízható, gyorsan elvégezhető módszer, amelynek segítségével a PCD diagnózisa teljes biztonsággal felállítható. Az eddig használt diagnosztikai eljárások felhasználásával a betegek kb. 20 %-a nem diagnosztizálható egyértelműen. Legtöbb esetben a diagnosztikus támpontot a klinikai eltérések mellett a mikroszkópos vizsgálatok adják. A PCD diagnózisa a jellegzetes klinikai tünetek jelenléte mellett az immotilis vagy dysmotilis csillók ultrastrukturális és/vagy direkt mikroszkópos kimutatásán alapszik A diagnózishoz szükséges élő epithel sejteket bronchoszkóp vagy transznazális kefebiopszia segítségével a nasopharynx területéről nyerjük. A direkt mikroszkópos vizsgálóeljárást a betegnél
fennálló
gyulladás,
az
un.
szekunder
elváltozások
nehezíthetik
meg.
Elektronmikroszkóp segítségével az esetek kb. 80%-ában lehet csak biztos diagnózist mondani
[22].
Több
vizsgálatban
kimutatták, 3
hogy
a
belső
dynein
karok
Célkitűzés elektronmikroszkópos detektálása nagyon nehéz, mert ezen sejtstruktúrák elektrodenzitása alacsony. Ez azzal jár, hogy gyakran még az egészséges egyéneknél sem lehet a belső dynein karokat láthatóvá tenni az elektronmikroszkópos felvételeken. Ezért az EM-vizsgálat álpozitív eredményekhez vezethet. Célunk egy olyan új diagnosztikus eljárás kifejlesztése volt, amely lehetővé teszi, hogy •
a leggyakrabban előforduló külső és/belső dynein kar defektusokat diagnosztizálni lehessen
•
a vizsgálati mintát a kevésbé invazív kefebiopsziával nyerjük
•
kiküszöböljük az álpozitív valamint az álnegatív vizsgálati eredményeket
•
a vizsgálóeljárás a primer ciliáris elváltozásokra legyen specifikus
•
segítségével a betegek több mint 80%-ánál biztos diagnózist lehessen mondani
•
specifikus információt adjon a további genetikai vizsgálatokra vonatkozóan
4
Módszerek
Módszerek A humán DNAL1 és a murin orthológ Dnal1 gének azonosítása In silico gén analízis. A Chlamydomonas LC1 génjének humán orthológját in silico klónozási stratégiák felhasználásával végeztük. Az NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) honlapjának BLAST programjával a humán EST adatbankban összehasonlító elemzést végeztünk
felhasználva
a
Chlamydomonas
LC1
proteinjének
aminosavsorrendjét
(AAD41040). Ezzel a módszerrel megállapítást nyert, hogy a Chlamydomonas LC1 proteinjéhez leghasonlóbb humán klón az AA975229 klón, ami a humán DNAL1 gén teljes kódoló szakaszát tartalmazza az első exon kivételével. A feltételezett 1. exont és az 5’ UTR régiót a genomikus BLAST és a TWOBLAST segítségével találtuk meg. A 14q24.3 DNAL1 genom szekvenciát az AC005225 és az AC006146 PAC klónokból nyertük és a Chlamydomonas LC1 cDNS szekvenciájával (AF112476) fedésbe hozva megkaptuk a humán DNAL1 gén feltételezett 1. exonját és 5’ UTR régióját. Meghatároztuk a DNAL1 gén 5’ végét beleértve az 5’UTR-t, az 1 exont, 5’ RACE rendszer felhasználásával identifikáltuk. Testis cDNS könyvtárat (Marathon-Ready cDNA, BD Biosciences Clontech, Heidelberg, Németország) felhasználva génspecifikus reverse primerek segítségével a DNAL1 gén 5’ végét amplifikáltuk. A kapott 250 bp hosszú PCR terméket gélextrakcióval izoláltuk és megszekvenáltuk. A DNAL1 gén így teljes cDNS szekvenciáját az AF542071 accession number alatt a GeneBankban regisztráltattuk. Az egér orthológ gén identifikálásához is a fent részletezett stratégiát alkalmaztuk. Az egér cDNS klónjának (BG916281) és a genomikus szekvenciát tartalmazó BAC klónjának (AC125071) egymásravetítésével identifikáltuk az egér Dnali1 gént. Az 5’ RACE PCR reakcióhoz egér vese cDNS könyvtárat (Clontech) használtunk templátként. Northern blot. A blot kivitelezéséhez a humán multiple tissue Northern blot rendszert (Clontech) használtuk, szondaként a humán cDNS klónból (AA975229) származó 800 bp hosszú NotI-EcoRI fragmentet alkalmaztuk. A hibridizáció 60°C-on egy éjszakán át Church pufferben (500 mM foszfát puffer pH 7,2, 7% SDS (w/v), 1 mM EDTA 100 μg/ml lazac spermiumból származó DNS hozzáadásával) történt. A DNAL1 specifikus próbát radioaktív α-32P-dCTP-vel jelöltük a Megaprime DNA labeling kit (Amersham, Freiburg, Németország) segítségével. A filtert 2x5 percig mostuk szobahőmérsékleten 2xSSC/0,1% SDS-el és 2x 10 percig 55°C-on 0,2xSSC/0,1%SDS-sel. A röntgenfilmre (X-OMAT AR, Kodak, Stuttgart, 5
Módszerek Németország) történő előhívás intensifying screen reagens (Cronex, DuPont, Bad Homburg, Németország) jelenlétében –70°C-on történt. Az RNS futtatása az előre elkészített blot gyári leírása szerint történt (Clontech). In situ hibridizáció. Az 1,39 kb hosszú, digoxigeninnel jelzett antisens ribopróbát a BG916281 egér EST klónból állítottuk elő. Egész egérembrió és a kifejlett állat metszeteit használtuk fel az in situ hibridizáció során. A színreakciót 4 napig végeztük, hogy az embrionális csomóban lévő gyenge expresszió is láthatóvá váljon. A preparátumokat 80%-os glicerinben fixáltuk és Leica M420 fotomikroszkóppal illetve Nomarski optikával felszerelt Fujix digitális kamerát (HC300Z) használó Zeiss Axioplan mikroszkóppal fényképeztük (Zeiss, Jena, Németország). In silico protein analízis. A proteinek összehasonlító elemzéséhez az European Bioinformatics Institute ClustalW programját használtuk. Az összehasonlított szekvenciák a humán DNAL1, az egér Dnali1 és a Chlamydomonas LC1 proteineken kívül más spécieszek putatív orthológ fehérjéi voltak. A Chlamydomonas LC1 publikált háromdimenziós szerkezetét alapul véve a DNAL1 szerkezetét a DALI szerver ( www.ebi.ac.uk/dali/ ) és a protein adatbank ( www.rcsb.org/pdb/ ) segítségével határoztuk meg. A képek 3 dimenziós megjelenítése a MOLMOL program segítségével történt. Koimmunoprecipitáció. A humán full length cDNS klón előállításához pEGFPc2 (Clontech) vektort használtunk, amelybe a DNAL1 teljes kódoló szekvenciáját az EGFP C-terminális végéhez klónoztuk. A vizsgálatok során kontrollként az üres pEGFPc2 vektort használtuk. HEK293T
sejteket
tranziens
módon,
kalciumfoszfát
koprecipitáció
alkalmazásával
transzfektáltunk felhasználva a pEGFPc2 és a DNAL1-pEGFPc2 plazmidokat. A sejteket a transzfektálástól számított 24 óra múlva lizáltuk NP40 lízispuffer felhasználásával. A kontroll és a vizsgált sejtcsoport proteinexpressiós szintjét Western blottal ellenőriztük. A néhézláncú dyneinproteineket sertés trachea sejtjeiből a korábban publikált módszer szerint izoláltuk. A sejtlizátumot és a protein izolátumot összekevertük és egy éjszakán át 4°C-on folyamatos rázatás mellett inkubáltuk. Az immunoprecipitációhoz a Protein G Immunprecipitation Kit-et (Sigma, Taufkirchen, Németország) és a nyúl anti-GFP antitestet (Clontech) a gyári leírást követve használtuk. A precipitált terméket 4-12%-os Bis-Tris gélen (Invitrigen, Karlsruhe, Németország) nagyság szerint elválasztottuk és PVDF membránra blottoltuk (Amersham, Freiburg, Németország). A membránt 5 órán át szobahőn 1:1000-en hígított rabbit-anti 6
Módszerek DNAH5 antitesttel inkubáltuk, majd a membrán többszöri TBS-T-ben történt mosása után 1:2500-en hígított HRP-konjugált anti-rabbit szekunder antitestet alkalmaztunk (Santa Cruz, Heidelberg, Németország). A sávok láthatóvá tételéhez ECL plus kit-et (Amersham, Freiburg, Németország) használtunk. Mutáció analízis. A DNAL1 mutáció analízisét végeztük el 86 család PCD-ben szenvedő betegeinél. A vizsgálatba összesen 110 PCD családot vettünk fel nemzetközi kooperáció (Németország, Svájc, USA, Magyarország) segítségével. 24 PCD családot kizártunk, mert DNAH5 vagy DNAI1 mutáció hordozók voltak, vagy a linkage analízis során a DNAH5 lokussal kapcsoltságot mutattak. A maradék 86 PCD családnál végeztük el a mutáció vizsgálatot. Egy családból egy érintett személyt vizsgáltunk. 48 betegnek volt situs inverusa (56%). A diagnózis felállítása az elfogadott kritériumok alapján történt. Élő, egészséges donorokat használtunk kontrollként. A betegek és a családtagok aláírt belegyező nyilatkozatainak birtokában hajtottuk végre a Freiburgi Egyetem intézeti etikai bizottsága által jóváhagyott vizsgálatokat. A genomikus DNS-t standard módszerrel vérmintából, vagy EBV-vel trnszformált perifériás lymphocytákból izoláltuk. A DNAL1 gén nyolc exonját valamint az exon-intron határt amplifikáltuk és szekvenáltuk. A PCR-t 50 μl térfogatban 50 pmol primer, 2 mM dNTP, és 1.5 U of Taq DNA polymerase (Invitrogen) jelenlétében futattuk le.Q-Solutiont (Qiagen, Hilden, Germany) az 1. exon amplifikálásához használtunk. Az amplifikálás lépései: denaturáció 94 ˚C –on 4 percig, majd ezt követte 32 ciklus denaturáció 30 másodpercig 94 ˚C-on, annealing az 1. és a 3. exon esetében és 61 ˚C –on a 2, 4, 5, 6, 7, és 8 exon esetében, elongáció 60 másodpercig. A végső elongáció 10 percig 70˚Con történt. A PCR termékeket gélextrakcióval vagy csővel tisztítottuk (Qiagen). Minden exont két irányból szekvenáltuk. A szekvenálás során nyert adatokat és a nekik megfelelő genomikus szakaszokat a TWOBLAST segítségével analizáltuk. A DNS szekvencia adatok minőségét a Chromas (www.technelysium.com) programmal bíráltuk el.
Új diagnosztikai eljárás kifejlesztése primer ciliáris dyskinesiában Betegek. A betegek és a családtagok aláírt belegyező nyilatkozatainak birtokában hajtottuk végre a Freiburgi Egyetem és a kollaboráló intézetek etikai bizottsága által jóváhagyott vizsgálatokat. 54 PCD biztos diagnózisával rendelkező betegnél végeztünk transznazális kefebiopsziát. Kontrollként 2 cisztás fibrózisban, 7 visszatérő légúti infekcióban szenvedő
7
Módszerek beteget valamint 5 egészséges önkéntest használtunk. A mintákat vakon értékeltük ki, hogy elkerüljük a vizsgáló elfogultságát. Immunfluoreszcens analízis. A légzőhám sejteket transznazális kefebiopsziával, cytobrush plus kefe (Medscand Malmö, Svédország) segítségével nyertük és RPMI 1640 egyéb adalék nélküli sejtmédiumba (Gibco, Karlsruhe, Németország) mostuk. A sejteket tárgylemezen szélesztettük ki, levegőn beszárítottuk és a felhasználásig –80 ˚C-on tároltuk. A metszeteket 15 percig 4%-os parafolmaldehid oldatával kezeltük, majd 5 percig 0,2 %-os Triton-X 100-at alkalmaztunk és végül 0,5% sovány tejpor oldattal inkubáltuk egy éjszakán át. A primer (legalább 2 óra) és a szekunder (30 perc) antitestekkel való inkubálás szobahőn történt. Minden lépés után a metszeteket PBS-sel mostuk. A DNAH5 és a DNALI1 antitestek saját készítésű poliklonális, nyúlban termeltetett antitestek voltak. Egér anti-acetilált-α-tubulin antitestek a Sigmától (Taufkirchen, Németország), a szekunder antitestek (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546) a Molecular Probes-tól (Invitrogen, Karlsruhe, Németország) származtak. A DNS-t Hoechst 33342-vel (Sigma) mutattuk ki. A konfokális képeket a Zeiss Axiovert 200 LSM 510 mikroszkóppal készítettük.
8
Eredmények
Eredmények A humán DNAL1 és a murin Dnal1 gének izolálása A génstruktúra meghatározása Az in silico klónozási stratégia felhasználásával meghatároztuk a humán (DNAL1) és a murin axonemalis könnyű lánc 1 (Dnal1) gének szerkezetét. A cDNS szekvenciát egyrészt számítógépes analízis, másrészt kísérletes módszerek felhasználásával sikerült identifikálni. A DNAL1 a 14q24.3 kromoszómán található, 49 kb nagyságú területet foglal el. A gén 8 exonból áll, minden exon-intron határ klasszikus hasítóhellyel rendelkezik az exonok 3’ és 5’ végét is beleértve. A feltételezett start kodon előtt konszenzus Kozak szekvencia található. Az mRNS szekvencia hossza a start kodontól a stop kodonig 573 bp. A DNAL1 gén által kódolt aminosav szekvencia 190 aminosav hosszúságú. A humán DNAL1 protein szekvenciája 54%-ban identikus és 69%-ban homológ a Chlamydomonas reinhardtii LC1 gén termékével. Az egér Dnal1 gén a 12 kromoszómán, 25 kb nagyságú területen található. A humán DNAL1hez hasonlóan 8 exonból áll, viszont a hosszabb 3’ UTR régió miatt a transzkriptum 1,6 kb nagyságú. Az 570 bp-ból álló ORF 190 aminosavat kódol. A Dnal1 által kódolt murin fehérje 93%-ban identikus és 97%-ban homológ az általunk izolált humán DNAL1 proteinnel. A humán, egér és Chlamydomonas fehérjék valamint más speciesek putatív orthológ fehérjéinek nagyfokú homológiája azt mutatja, hogy ezen protein funkciója a magasabb evolúcionális szinteken lévő szervezetek motilis sejtjeiben erősen konzervált.
A DNAL1 fehérjeszerkezetének elemzése Az LC1 és a DNAL1 aminosav szekvenciája néhány szakaszon eltérő. Ezek a területek a következők: N-terminális szakasz (12-33. aminosav), a protein C-terminális fele (153-170. aminosav, ahol 3 aminosav deléció is található), továbbá a C terminális régió (5 aminosav trunkáció). Ahhoz, hogy meg tudjuk állapítani, hogy ezek a szekvenciavariációk a protein sztérikus szerkezetében változást okoznak-e, megalkottuk a DNAL1 számítógépes 3 dimenziós szerkezetét. A DALI protein szerkezet analizáló program használatával a Chlamydomonas LC1 struktúrájára alapozva hoztuk létre a DNAL1 3D szerkezetét. A háromdimenziós
szerkezetvizsgálatok
eredménye
9
azt
mutatja,
hogy
a
proteinek
Eredmények evolúcionálisan nagy mértékben konzerváltak. Csak finom eltéréseket lehet megfigyelni, amelyek a fehérjék tercier struktúrájára nem hatnak ki. A 3 aminosav deléció (153-155. aminosav) a DNAL1 protein C-terminális felében található. A Chlamydomonas LC1 proteinje ezen szakaszon olyan szerkezetet ölt, amely a humán proteinben loop-ként jelenik meg. A humán könnyű lánc 1 C terminális α-hélixe rövidebb egy egységgel, ami az 5 aminosav deléciójának köszönhető. A legfontosabb tény, ami a háromdimenziós szerkezetvizsgálat alapján megállapítható, hogy a DNAL1 és az LC1 funkcionális doménje, amelyek a proteinprotein közötti kölcsönhatásokat mediálják, evolúcionálisan nagy mértékben konzerváltak. A DNAL1 tartalmaz egy hidrofób szakaszt, amely valószínűleg a DNAH5 fehérjével történő kölcsönhatásban fontos szerepet játszik. Ez a terület a Chlamydomonas LC1 fehérjéjében is megfigyelhető. Mindkét protein ezen kívül rendelkezik egy olyan doménnel, amelynek külső felszíne töltéseket/poláris gyököket tartalmaz. Ez a domén töltése miatt dinamikus változásra képes és valószínűleg az eddig még nem karakterizált 45 kDa-os protein interakcióját mediálja. Ezen tényekből kiindulva megállapítható, hogy a humán DNAL1 és a Chlamydomonas LC1 fehérje funkciói, beleértve a fizikális interakciókat is, evolúcionálisan konzerváltak.
A DNAL1 és a DNAH5 interakciója In vitro protein interakciós vizsgálatot végeztünk annak érdekében, hogy tisztázzuk, hogy a DNAL1 és DNAH5 (a Chlamydomonas γ-HC) kapcsolatban állnak-e egymással. Anti-GFP antitestet felhasználva megállapítható volt, hogy a sertés tracheából származó axonemális dynein extraktum DNAH5 proteinje és a HEK297T sejtek tranziensen expresszált EGFPDNAL1 fúziós proteinje valóban koprecipitálódik. A sertés DNAH5 nem volt detektálható a Western bloton a vizsgálat kontrolljaként használt EGFP-t tartalmazó HEK297T sejtek lizátumában. Ezen eredmények alapján megállapítható volt, hogy a DNAL1 és a DNAH5 fizikai interakciót létesít.
A DNAL1 expressziós vizsgálata Megvizsgáltuk, hogy a Chlamydomonas LC1 emlős orthológja is szerepet játszik-e a motilis csillók funkciójában. Először a DNAL1 szövet specifikus expresszióját vizsgáltuk meg Northern blottal. A specifikus transzkript kb. 0,9 kb nagyságú volt, amely megegyezik a DNAL1 cDNA-ének számított hosszával. A Northern blot kiértékelése során megállapítottuk,
10
Eredmények hogy a DNAL1-re specifikus csíkot kizárólag a testisben lehetett kimutatni. A blothoz felhasznált egyéb olyan szövetekben, amelyek nem hordoznak csillót, így a lépben, a thymusban, perifériás leukocytákban, a prostatában, az uterusban a DNAL1 expresszióját nem lehetett kimutatni. Ez az eredmény megegyezik azzal a feltételezéssel, hogy az axonemális dynein könnyű lánc 1 protein a spermiumokban és a feltételezhetően egyéb motilis csillókkal rendelkező szövetekben expresszálódik és ott meghatározó szerepet játszik. Hogy ezt a feltételezésünket egy további módszerrel is alátámasszuk, a DNAL1 expressziójának jellemzése céljából egér embrió és kifejlett egér in situ hibridizációt végeztük el. A gaszrtulációs stádiumban lévő embrióban (7,5 napos post coitum) az embrionális csomó expresszióját vizsgáltuk. Ebben a fejlődési állapotban a nodális motilis és szenzoros csillók aktivitása felelős a bal/jobb testi aszimmertia kialakításáért. Az embrionális csomó területén ebben a periódusban detektálható specifikus expresszió arra enged következtetni, hogy a DNAL1 a nodális motilis 9+0 szerkezetű csilló funkciójában nagy szerepet játszik. A kifejlett felnőtt állat hibridizációs metszetein a Dnal1 expressziót az alsó légutak légzőhámjában az aqueductus cerebri és az agykamrákat borító ependyma sejtekben tudtunk kimutatni. Mivel mindkét epitheliális szövet sűrűn borított a 9+2 szerkezetű motilis csillókkal, ez a fent említett eredmény felveti, hogy az axonemális dynein LC1 a magasabb rendű szervezetek motilis csillóinak felépítésében szerepet játszik.
Mutációanalízis A PCD genetikailag heterogén betegség, de eddig csak három PCD gént azonosítottak. A DNAH5 és a DNAI1 a külső dynein kar nehéz és közepesen nehéz láncait kódolják. A DNAL1 magas evolúcionális konzerváltsága és a motilis csillókben betöltött feltételezett szerepe alapján úgy ítéltük meg, hogy a külső dynein kar LC gén, a DNAL1 kiváló kandidáns gén a PCD-ben. 86 PCD-ben szenvedő betegnél amplifikáltuk és szekvenáltuk a DNAL1 gén nyolc kódoló exonját. Öt egészséges egyént kontrollként használtunk a vizsgálatban. Mindamellett, hogy kizárólag PCD betegek vettek részt a vizsgálatban sem mutációt, sem nukleotid polimorfizmust nem tudtunk detektálni a mutációanalízisünk során.
11
Eredmények
Új diagnosztikai eljárás kifejlesztése primer ciliáris dyskinesiában DNALI1, a belső dynein kar specifikus markere A DNALI1 egy könnyű láncú protein és a belső dynein kar komponense. Megvizsgáltuk a humán egészséges respiratórikus epithel sejtekben a DNALI1 subcelluláris lokalizációját konfokális immunfluoreszcens módszerrel. Kontrollként acetilált α-tubulin ellenes antitestet használtunk, amely a csillókat felépítő tubulinhoz specifikusan kötődik. DNALI1 protein az egészséges kontrollokból származó epithel sejtek csillóinak teljes hosszában detektálható. Az átmeneti zónában és a bazális test területén DNALI1 proteint kimutatni nem lehetett. A DNALI1 festési mintája azt mutatja, hogy a DNALI1 a belső dynein kar egyik komponense, ami a humán respiratórikus sejtek csillóinak teljes hosszában kimutatható. Ez a megfigyelés megegyezik a DNALI1 axonemális dynein funkciójával.
DNAH5, a külső dynein kar specifikus markere A leggyakoribb genetikai defektus PCD-ben a külső dynein kar komponenseit kódoló DNAH5 és a DNAI1 recesszív mutációi. A következőkben immunfluoreszcens vizsgálattal analizáltuk a DNAH5 protein eloszlását in vivo humán respiratórikus epithel sejtekben. A csillós epithel sejteket transznazális biopsziával nyertünk. Kontrollként csilló specifikus anti-acetilált α-tubulint alkalmaztunk. A DNAH5 elleni antitest felhasználása során alkalmazott immuncitokémiai festéssel megállapítható volt, hogy egészséges kontrollok transznazális biopsziával nyert epithel sejtjeiben a DNAH5 a csilló teljes hosszában és a citoplazmában a basális test területén mutatható ki. Ez azt mutatja, hogy a külső dynein karok az axonema teljes hosszában DNAH5-öt tartalmaznak. Ezen kutatási eredmények alapján feltételezhető, hogy a DNAH5 vagy a DNAI1 ellen előállított antitest felhasználható arra, hogy a PCD betegeknél nem invazív módon nyert légzőhám csillós sejtjeiben immuncitokémiai vizsgálatot végezzünk.
Izolált DNAH5 defektus Elsőként olyan izolált külső dynein kar defektussal rendelkező beteg légzőhám sejtjeit vizsgáltuk, akik a DNAH5 homozigóta mutációját hordozzák. A DNAH5 a külső dynein kart
12
Eredmények felépítő egyik nehéz lánc. A mutáció azt eredményezi, hogy a csillók külső dynein karja hiányzik és a csilló axonemájában DNAH5 festést nem lehet kimutatni. A mutáns DNAH5 protein a bazális test területén halmozódik fel. Ezen betegekben a DNALI1 protein a csilló teljes hosszában látható, megjelenése nem különbözött az egészséges kontroll sejtekben megfigyelt fehérjeeloszlástól. A DNAH5 mutáns sejtekben a külső dynein karok teljes hiánya nem befolyásolja a DNALI1 axonemális festődést. Ez az eredmény bizonyítja, hogy a DNALI1 a belső dynein kar integráns része, és a külső dynein kar felépítésében nem játszik szerepet. Az 54 PCD beteg 25,9%-ában (14/54) találtunk normál DNALI1 festést és a DNAH5 komplett axonemális hiányát. Ez arra enged következtetni, hogy ezek a betegek komplett, izolált külső dynein kar defektussal rendelkeznek. A következőkben bizonyítottuk, hogy a DNALI1 axonemális lokalizációja a distalis külső dynein kar defektustól is független. Korábban leírtuk, hogy a DNAI1 kevert (compound) heterozigóta mutációjával rendelkező betegek esetében a mutáció a külső dynein kar distális defektusát okozza a respiratórikus axonemában. Mint ahogy az egészséges és a DNAH5mutáns sejtekben is megfigyelhető volt, a DNAI1 mutációval rendelkező betegeknél a DNALI1 protein a légzőhám csillóinak teljes hosszában kimutatható volt. A distális DNAH5 deficiencia és normál DNALI1 festődés jellemző az izolált distális külső dynein kar defektura, ami a vizsgált PCD kohort 7,4 %-ában (4/54) volt kimutatható.
Izolált belső dynein kar defektus További immunfluoreszcens vizsgálatok során teszteltük, hogy a DNALI1 antitest a különböző belső dynein kar defektusokat ki tudja-e mutatni. Elektronmikroszkópos módszerrel diagnosztizált belső dynein kar defektussal, de normál külső dynein karral rendelkező PCD betegek respiratorikus epithel sejtjeit vizsgáltuk. DNAH5 elleni antitestet, mint markert használva megállapítottuk, hogy a külső dynein kar a ciliáris axonema teljes hosszában jelen van. Megállapítottuk, hogy a vizsgált belső dynein kar defektusos betegek között két csoportot lehet felállítani. Az egyik csoportban lévő betegek esetében a DNALI a citoplazmában akkumulálódott és a csillók területén DNALI1 proteint kimutatni nem lehetett. A citoplazma apikális részében a DNALI1 szignálja intenzívebb volt. Az izolált belső dynein kar defektus ezen szubtípusa a vizsgált PCD betegek 22, 2%-ában (12/54) volt kimutatható.
13
Eredmények Ezzel szemben a más IDA defektussal rendelkező betegekben a légzőhám sejtjeiben a csillók proximális felében látható volt a DNALI1 festés és megfigyelhető volt, hogy egyes esetekben a citoplazmában a DNALI1 halmozódik. Az izolált belső dynein kar defektusnak ezt a szubtípusát a betegek 16,7%-ában (9/54) találtuk
A DNAH5 és a DNALI1 kombinált belső és külső dynein kar defektus Izolált belső vagy izolált külső dynein kar defektussal rendelkező PCD betegek légzőhám sejtjeinek DNALI1-el és DNAH5-el történt vizsgálata után teljes vagy distális DNALI1 vagy DNAH5 defektust tudtunk megállapítani. Ez arra ösztönzött bennünket, hogy a DNALI1-el és a DNAH5-el kombinált vizsgálatot végezzünk. Négy különböző aberráns DNALI1 és DNAH5 lokalizációt tudtunk meghatározni, amely arra enged következtetni, hogy a PCD betegek respiratórikus sejtjeiben a dynein kar defektusoknak különböző formája fordul elő. A PCD betegek 7,4%-ában (4/54) a DNALI1 és a DNAH5 protein is hiányzott a csillók teljes hosszában. Ez a megfigyelés megegyezik ezen betegek elektronmikroszkópos analízisével, miszerint a fent említett betegek külső és belső dynein kar defektussal rendelkeznek. Az immunfluoreszcens vizsgálattal a DNALI1 teljes hiányát az axonemában további betegekben is ki tudtuk mutatni. Ezekben a sejtekben a DNAH5 a csillók distális felében hiányzott, de az axonema proximális szakasza pozitív festődést mutatott. A kombinált belső és külső dynein kar defektus ezen szubtípusa a betegek 1,9%-ában (1/54) volt jelen. A PCD betegek egy másik csoportjában a DNALI1 a csilló distális felében nem volt kimutatható, ugyanakkor a DNAH5 az axonema egész hosszában hiányzott. A kombinált külső és belső dynein kar defektus alcsoport a betegek 9,3%-át (5/54) érintette. Ezzel szemben előfordult olyan csoport is, ahol mind a DNALI1, mind a DNAH5 a respiratórikus sejtek csillóinak proximális felében volt detektálható és a distális szakaszon nem tudtuk kimutatni. A vizsgált PCD betegek 3,7 %-ában (2/54) tartozott a kombinált külső és belső dynein kar defektus ezen szubtípusába. A PCD betegek nagy kohortjában (n=54) végeztük el a respiratórikus epithel sejtek analízisét. Megvizsgáltuk a DNALI1 és/vagy a DNAH5 dyslokalizációját és megállapítottuk, hogy a PCD betegek 94,4 %-ában (51/54) aberráns festési minta fordul elő. Ezzel ellentétben az egészséges és a beteg (cisztás fibrózisban, visszatérő légúti infekcióban szenvedő betegek) kontrollokban a festési mintázat mindig normális volt. Összegzésképpen elmondható, hogy a legtöbb belső és/vagy külső dynein kar defektussal rendelkező PCD beteg diagnosztizálható ezzel a nagy feloldóképességű immunflureszcens módszerrel. Az immunfluoreszcens 14
Eredmények mikroszkópos analízis bevezetésének előnye, hogy a vizsgálati minta nasális kefebiopsziával nyerhető, ami az elektronmikroszkópos mintavételi eljáráshoz képest sokkal kevesebb megterhelést jelent a betegek számára
15
Összefoglalás
Összefoglalás A Chlamydomonasban az LC1 a külső dynein kart felépítő protein komplex része és fizikai kontaktust létesít a külső dynein kart felépítő γ−nehézlánccal . Az LC1 a leucinban gazdag fehérjék (LRR) családjának SDS22+ szubcsoportjába tartozik. A γ-HC protein motoros aktivitása az LC1 interakción keresztül szabályozott, amely a környezeti stimulusok szignáljait közvetíti. Az LC1 és a DNAL1 nagy szekvencia és strukturális hasonlósága alapján feltételeztük, hogy a humán DNAL1 és a humán DNAH5 ugyancsak egymással kapcsolódnak. A DNAH5 a Chlamydomonas γ-HC humán orthológ génje, amelynek bizonyítottan szerepe van a PCD pathogenezisében. Immunoprecipitációs vizsgálatok alkalmazásával kimutattuk, hogy a GFP-vel kötött DNAL1 a sertés légzőhámjának sejtjeiből származó natív DNAH5-höz kötődik. Demonstráltuk a DNAL1 és a DNAH5 proteinek specifikus ko-expresszióját különböző csillós sejtekben, mint a légzőhám epithelsejtjei, az epemdymasejtek és a spermiumok és az expresszió hiányát a csillóval nem rendelkező szövetekben valamint a szenzoros csillós szövetekben, mint a retina vagy a vese. Ez azt bizonyítja, hogy a DNAL1-nek a DNAH5-re kifejtett regulációs szerepe csak a motoros csillókban van jelen, így a spermiumokban, a respiratorikus epithel sejtekben és az ependyma sejtekben. A DNAL1 fent említett funkcióira alapozva megállapítottuk, hogy az általunk identifikált DNAL1 gén lehetséges kandidáns gén a PCD betegségben. A Chlamydomonas γ−ΗC génjének mutációja egy lassan úszó mutáns kialakulását eredményezi. A fent nevezett gén humán orthológjának, a DNAH5-nek a mutációja ODA defektussal járó PCD-t okoz. Ezek alapján feltételeztük, hogy a funkcióképtelen DNAL1 a szabályozó funkció károsodásának következtében ugyancsak csilló dysmotilitást okozhatja. PCD-ben szenvedő betegek nagy kohortjában végeztük el a mutációanalízist, melynek során a DNAL1 gén kódoló területén nem tudtunk szekvenciaelváltozást kimutatni. A PCD betegek nagy csoportjára való tekintettel ki lehet jelenteni, hogy a DNAL1-nek nincs jelentős szerepe a PCD etiológiájában. Az egyik lehetséges oka annak, hogy a DNAL1 gén PCD betegek esetében nem mutált, az lehet, hogy a DNAL1 ép működése elengedhetetlenül fontos szerepet játszik a csillóban a fejlődés során. A másik lehetséges magyarázat, hogy a DNAL1-nek a csillókompartmenten kívül a citoplazmában is esetleg szerepe van.
16
Összefoglalás PhD munkám során identifikáltam a humán és az egér axonemális könnyű lánc 1 proteint kódoló géneket. Meghatároztam ezen gének teljes cDNS-ét, exon-intron struktúráját és bebizonyítottam a DNAL1 és a DNAH5 között fennálló interakció létezését. A DNAL1 nagy expressziója a testisben azt indikálja, hogy ezen gén által kódolt fehérje a spermiumok felépítésében és funkciójában játszhat szerepet. A DNAL1 mutáció hiánya PCD betegekben és a gén nagy expressziós kifejeződése a testisben azt mutatja, hogy a férfi fertilitás kialakulásában a DNAL1 kiváló kandidáns gén lehet.
Új diagnosztikus módszer kifejlesztése primer ciliáris dyskinésiáben Vizsgálatunkban
54
PCD
beteg
transznasalis
kefebiopsziáját
immunfluoreszcens
mikroszkóppal analizáltuk.A PCD betegek nagy kohortjában végzett kombinált analízis során, mely a belső dynein kar könnyű láncának, a DNALI1-nek valamint a külső dynein kar nehéz láncának, a DNAH5-nek a dyslokalizációját vizsgálta, megállapítható volt, hogy nyolc különböző festési minta különíthető el. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a dynein kar defektusok nagy komplexitást mutatnak. Csak három esetben (5,6%) igazolódott a DNAH5 és a DNALI1 antitestekkel normális festési kép. Ennél a három betegnél nem rendelkeztünk elektronmikroszkópos vizsgálati eredménnyel, a diagnózis felállítása fénymikroszkóppal történt. A tipikus klinikai kép mellett a csillók abnormális csapási mintázatát találtuk. Ezek a betegek valószínűleg más ultrastrukturális defektusokkal rendelkeznek, mint pl. radiális küllő defektus vagy a tubulusok eltérései. A dynein kar defektus szubtípusok részletes karakterizálása segít, hogy megértsük a dynein karok létrejöttének komplex folyamatát, valamint új PCD-t okozó gének identifikálását teszi lehetővé. Az immunfluoreszcens mikroszkópos analízis bevezetésének előnye, hogy a vizsgálati minta nasális kefebiopsziával nyerhető, ami az elektronmikroszkópos mintavételi eljáráshoz képest sokkal kevesebb megterhelést jelent a betegek számára. A DNALI1és/vagy a DNAH5 abnormális festődési mintázatának identifikálása a PCD betegek 94,4%-ában (n=54) indikálja a módszer nagy hatékonyságát a PCD diagnosztikájában.
17
Publikációk
Publikációk Az értekezés témájában megjelent közlemények Horvath J, Fliegauf M, Olbrich H, Kispert A, King SM, Mitchison H, Zariwala MA, Knowles MR, Sudbrak R, Fekete G, Neesen J, Reinhardt R, Omran H. Identification and analysis of axonemal dynein light chain 1 in primary ciliary dyskinesia patients. Am J Respir Cell Mol Biol. 2005 Jul;33(1):41-7. IF: 4,175 Fliegauf M, Olbrich H, Horvath J, Wildhaber JH, Zariwala MA, Kennedy M, Knowles MR, Omran H. Mislocalization of DNAH5 and DNAH9 in respiratory cells from patients with primary ciliary dyskinesia. Am J Respir Crit Care Med. 2005 Jun 15;171(12):1343-9. IF:8,123 Kispert A, Petry M, Olbrich H, Volz A, Ketelsen UP, Horvath J, Melkaoui R, Omran H, Zariwala M, Noone PG, Knowles M. Genotype-phenotype correlations in PCD patients carrying DNAH5 mutations. Thorax. 2003 Jun;58(6):552-4. IF: 4,188
Nem az értekezés témájában megjelent közlemények Schermer B, Hopker K, Omran H, Ghenoiu C, Fliegauf M, Fekete A, Horvath J, Kottgen M, Hackl M, Zschiedrich S, Huber TB, Kramer-Zucker A, Zentgraf H, Blaukat A, Walz G, Benzing T. Phosphorylation by casein kinase 2 induces PACS-1 binding of nephrocystin and targeting to cilia. EMBO J. 2005 Nov 24 Tacke U, Olbrich H, Sass JO, Fekete A, Horvath J, Ziyeh S, Kleijer WJ, Rolland MO, Fisher S, Payne S, Vargiami E, Zafeiriou DI, Omran H. Possible genotype-phenotype correlations in children with mild clinical course of Canavan disease. Neuropediatrics. 2005 Aug;36(4):252-5. Horvath J, Ketelsen UP, Geibel-Zehender A, Boehm N, Olbrich H, Korinthenberg R, Omran H. Identification of a novel LAMP2 mutation responsible for X-chromosomal dominant Danon disease. Neuropediatrics. 2003 Jun;34(5):270-3.
18
Publikációk Fliegauf M, Frohlich C, Horvath J, Olbrich H, Hildebrandt F, Omran H. Identification of the human CYS1 gene and candidate gene analysis in Boichis disease. Pediatr Nephrol. 2003 Jun;18(6):498-505.
19
