A DNAL1 gén identifikálása és új, genetikai alapokon nyugvó diagnosztikai eljárás kifejlesztése primer ciliáris dyskinesiában

A DNAL1 gén identifikálása és új, genetikai alapokon nyugvó diagnosztikai eljárás kifejlesztése primer ciliáris dyskinesiában

Dr. Horváth Judit Doktori (PhD) értekezés Budapest, 2006 Témavezető: Dr. Fekete György egyetemi tanár Készült a Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola „Ritka gyermekkori betegségek molekulárgenetikai diagnosztikája“ című PhD programjának keretében

Programvezető: Dr. Falus András egyetemi tanár Szigorlati bizottság: Dr. Kopper László egyetemi tanár Dr. Váradi András MTA doktora Dr. Bujdosó Györgyi PhD

Opponensek: Dr. Sasvári Mária MTA doktora Dr. Oláh Edit MTA doktora

1 Tartalomjegyzék 1 Tartalomjegyzék ..........................................................................................................3 2 Ábrajegyzék .................................................................................................................6 3 Rövidítések jegyzéke ...................................................................................................7 4 Bevezetés ...................................................................................................................10 5 Elméleti áttekintés .....................................................................................................12 5.1 Primer ciliáris dyskinesia ......................................................................................... 12 5.2 A diagnózis felállítása .............................................................................................. 12 5.2.1 PCD betegek klinikai tünetei......................................................................... 13 5.2.2 Mikroszkópos vizsgálóeljárás ....................................................................... 17 5.2.3 Egyéb, a diagnosztikában használt eljárások................................................. 19 5.3 A PCD kezelése ........................................................................................................ 22 5.4 A csillók.................................................................................................................... 23 5.4.1 Csillós sejtek az emberi szervezetben ........................................................... 23 5.4.2 A motilis csillók anatómiája.......................................................................... 24 5.5 Chlamydomonas, a PCD modellje............................................................................ 25 5.5.2 A Chlamydomonas axonemális proteinjei..................................................... 28 5.5.3 Ismert orthológ gének.................................................................................... 29 5.6 LC1, a Chlamydomonas axonemális dynein könnyű lánca...................................... 32 5.6.1 Az LC1 szerkezeti jellemzői ......................................................................... 33 5.6.2 Az LC1 interakciói ........................................................................................ 34 6 Célkitűzés ...................................................................................................................36 6.1 A humán DNAL1 és a murin Dnal1 gének identifikálása........................................ 36 6.2 Új diagnosztikai eljárás kifejlesztése primer ciliáris dyskinesiában ........................ 36 7 Anyagok ...................................................................................................................38 7.1 Kemikáliák ............................................................................................................... 38 7.2 Enzimek, kitek, antitestek és markerek .................................................................... 39 7.3 Pufferek és oldatok ................................................................................................... 39 7.4 Laboreszközök.......................................................................................................... 40 7.5 Egyéb anyagok ......................................................................................................... 41 3

8 Módszerek ..................................................................................................................42 8.1 Betegek ..................................................................................................................... 42 8.2 Diagnosztikai módszerek.......................................................................................... 42 8.2.1 Nagy-frekvenciájú videomikroszkópos analízis............................................ 42 8.2.2 Immuncitokémiai vizsgálat ........................................................................... 43 8.3 In silico módszerek................................................................................................... 45 8.3.1 A humán DNAL1 és a murin orthológ Dnal1 gének azonosítása ................. 45 8.3.2 In silico protein analízis................................................................................. 46 8.3.3 Online adatbankok és programok.................................................................. 46 8.4 Northern blot ............................................................................................................ 47 8.5 In situ hibridizáció .................................................................................................... 47 8.6 Western blot analízis ................................................................................................ 48 8.6.1 Dynein extrakció sertés tracheából Hastie szerint [29, 83] ........................... 48 8.6.2 A Western blot kivitelezése........................................................................... 49 8.7 Koimmunoprecipitáció ............................................................................................. 50 8.8 Genomikus DNS izolálása........................................................................................ 51 8.8.1 A DNS tisztaságának és koncentrációjának meghatározása ......................... 52 8.9 PCR 52 8.9.1 A PCR elve .................................................................................................... 52 8.9.2 Primer tervezés .............................................................................................. 53 8.9.3 A PCR kivitelezése........................................................................................ 54 8.10 Agaróz gélelektroforézis ........................................................................................ 54 8.10.1 Az agaróz gélelektroforézis elve ................................................................. 54 8.10.2 Az agaróz gélelektroforézis kivitelezése ..................................................... 54 8.11 DNS szekvenálás .................................................................................................... 55 8.11.1 A PCR termékek tisztítása........................................................................... 55 8.11.2 A szekvenálás elve ...................................................................................... 55 8.11.3 A szekvenálás kivitelezése .......................................................................... 56 9 Eredmények ...............................................................................................................57 9.1 A humán DNAL1 és a murin Dnal1 gének izolálása ............................................... 57 9.1.1 A génstruktúra meghatározása ...................................................................... 57 9.1.2 A DNAL1 fehérjeszerkezetének elemzése .................................................... 59 4

9.1.3 A DNAL1 és a DNAH5 interakciója............................................................. 62 9.1.4 A DNAL1 expressziós vizsgálata.................................................................. 64 9.1.5 A DNAL1 mutációanalízise PCD-ben szenvedő betegeknél ........................ 66 9.2 Új diagnosztikai eljárás kifejlesztése primer ciliáris dyskinesiában ........................ 66 9.2.1 Külső dynein kar marker kifejlesztése és tesztelése...................................... 67 9.2.2 Belső dynein kar marker kifejlesztése és tesztelése ...................................... 69 9.2.3 A DNAH5 és a DNALI1 antitestekkel folytatott kombinált vizsgálat eredménye............................................................................................................... 72 10 Megbeszélés ..............................................................................................................74 10.1 A human DNAL1 és a murin Dnal1 izolálása........................................................ 74 10.1.1 A génstruktúra meghatározása .................................................................... 75 10.1.2 A DNAL1 szerkezete és interakciói ............................................................ 76 10.1.3 A DNAL1 expressziós vizsgálata................................................................ 77 10.1.4 A DNAL1 gén mutációanalízise PCD-ben szenvedő betegekben .............. 77 10.2 Új diagnosztikus módszer a DNAH5 és a DNALI1 elleni antitestek felhasználásával ..................................................................................................... 80 10.2.1 DNAH5 elleni antitest, mint külső dynein kar marker................................ 80 10.2.2 DNALI1 elleni antitest, mint belső dynein kar marker ............................... 83 10.2.3 DNALI1- und DNAH5 diszlokalizáció kombinált előfordulása................. 85 11 Irodalomjegyzék ......................................................................................................87 12 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS.................................................................................98 13 Saját publikációs lista..............................................................................................99 13.1 Az értekezés témájában megjelent közlemények ................................................... 99 13.2 Nem az értekezés témájában megjelent közlemények ........................................... 99 14 Összefoglalás ..........................................................................................................101 15 Summary ................................................................................................................103

5

2 Ábrajegyzék 1. ábra Diagnosztikai séma krónikus légúti betegségekben (átvett és módosított ábra Mark J. Cowan, 2001.) ........................................................................................... 14 2. ábra A respiratorikus epithelsejt csillócsapásának morfológiája................................ 17 3. ábra Csillók elektronmikroszkópos felvételei ............................................................ 19 4. ábra Csillók előfordulása az emberi szervezetben [34] .............................................. 23 5. ábra Az axonéma felépítése........................................................................................ 24 6. ábra A Chlamydomonas reinhardtii............................................................................ 26 7. ábra A Chlamydomonas külső dynein karjának modellje [11] .................................. 27 8. ábra A DNAH5 murin orthológjának (Dnah5) in situ hibridizációja [66] ................. 31 9. ábra A humán axonemális könnyű lánc gén 1 (DNAL1) genetikai szerkezete.......... 57 10. ábra Összehasonlító szekvenciavizsgálat ................................................................. 58 11. ábra A murin Dnal1 genetikai szerkezete................................................................. 59 12. ábra Az axonemális könnyű lánc protein 1 háromdimenziós szerkezete ................. 60 13. ábra Az egymásra vetített DNAL1 és LC1 térbeli struktúrája ................................. 61 14. ábra Koimmunoprecipitációs vizsgálat .................................................................... 63 15. ábra A humán DNAL1 proteinexpressziós vizsgálata.............................................. 64 16. Ábra A Dnal1 in situ hibridizációs vizsgálata .......................................................... 65 17. ábra Egészséges epithelsejtek immuncitokémiai vizsgálata anti-DNAH5 és antiacetilált tubulinnal .................................................................................................. 67 18. ábra DNAH5 homozigóta mutációját hordozó beteg epithelsejtjeinek immuncitokémiai vizsgálata................................................................................... 68 19. ábra DNAI1 mutációt hordozó beteg epithelsejtjeinek immunfluoreszcens mikroszkópos vizsgálata......................................................................................... 69 20. ábra Egészséges epithelsejtek vizsgálata DNALI1 antitesttel................................. 70 21. ábra Teljes DNALI1 defektus PCD betegek epithelsejtjeiben ................................. 71 22. ábra Partialis DNALI1 defektus PCD beteg epithel sejtjeiben................................. 72 23. ábra A külső dynein kar komplex kialakulása.......................................................... 82 24. ábra A DNALI1 és a DNAH5 elleni antitestek által mehatározott nyolc dynein kar szubtípus sematikus megjelenítése ......................................................................... 84 6

3 Rövidítések jegyzéke µl

mikroliter

AS

aminosav

bp

bázispár

cDNS

komplementer DNS

dH2O

desztillált víz

DNAH11

axonemális dynein nehéz lánc 11

DNAH5


DNAH9


DNAI1

axonemális dynein közepesen nehéz lánc 1

DNAL1

axonemális külső dynein könnyű lánc 1

DNALI1

axonemális belső dynein könnyű lánc 1

DNS

dezoxiribonukleinsav

dNTP

dezoxi-nukleozid-trifoszfát

E. coli

Escherichia coli

EBV

Epstein-Barr vírus

EDTA

etilén-diamin-tetraacetát

F

forward-szál

HC/IC/LC

nehéz/közepesen nehéz/ könnyű lánc

Ig

immunglobulin

kb

kilobázis

kDa

kilodalton

M

molaritás

Mb

megabázis

mRNS

messenger RNS

NCBI

National Center for Biotechnology Information

NO

nitrogén-monoxid

OMIM

Online Mendelian Inheritance in Man

PBS

foszfát puffer (phosphate buffer salinated)

PCD

primer ciliáris dyskinesia 7

PCR

polimeráz láncreakció

R

reverse szál

RFLP

restrikciós fragment hossz polimorfizmus

RNS

ribonukleinsav

Rpm

fordulat per perc

TBE

tris-bórsav-EDTA-puffer

U

enzimaktivitás egysége

UTR

nem transzlatált régió

V

Volt

w/v

az egész térfogatra vonatkoztatott tömeg

8

9

Bevezetés

4 Bevezetés A primer ciliáris dyskinesia (PCD) összefoglaló elnevezés minden olyan kóros állapotra vonatkozóan, amely összefügg a csillószőrök kongenitális morfológiai és funkcionális defektusával. Az első PCD-vel kapcsolatos feljegyzés 1904-ből Zivert-től származik [108], majd a klasszikus triászt (situs inversus, bronchiectasia és sinusitis) 1935-ben Kartagener írta le. A primer ciliáris dyskinesia (PCD) ritka, a legtöbb esetben autoszómális recesszíven öröklődő betegség. Genetikailag heterogén csoportot képvisel, amelyben különböző gének defektusa felelős a csillószőrök eltérő strukturális, funkcionális rendellenességeiért. A légutak epithel sejtjeinek csillói nem megfelelő működése a mukociliáris clearence elégtelenségéhez, krónikus felső és alsó légúti gyulladás kialakulásához vezet. A betegség prevalenciája 1:20 000. Ritka, népegészségügyi szempontból mégis jelentős betegségről van szó. A PCD-s betegek nagy aránya egyáltalán nem kerül felfedezésre, a prevalencia alapján kalkulált, adott populáció esetén várható esetszám alig 5-10 %-a ismert. A regisztrált PCD-s betegek egy részét is csak későn, az irreverzibilis károsodások (bronchiectasia, a krónikus felső légúti gyulladás következményeként létrejött halláskárosodás) kialakulását követően veszik gondozásba, pedig korai életkorban diagnosztizált, megfelelően kezelt betegség esetén a szövődmények kialakulása megelőzhető [13, 59]. A betegség ritka előfordulása ellenére témaválasztásom aktualitását egyrészt az adta, hogy lefolyása során csökkent életminőséggel számolhatunk, ennek megfelelő szociális, társadalmi

és

gazdasági

(morbiditás,

jövedelem

kiesés,

szociális

leépülés)

következményekkel, másrészt a molekuláris genetika nagy ütemű fejlődése új lehetőségeket nyitott a betegség patomechanizmusának megismerése és diagnosztikája terén. Munkám célja a PCD-vel kapcsolatos jelenlegi ismereteink és a rendelkezésünkre álló irodalmi adatok áttekintése során felmerülő diagnosztikus, terápiás problémák és következtetések ismertetése. Tekintettel arra, hogy az irodalomban eddig még nem közölt új gént azonosítottunk-én jobban szeretem a többes szám I. személyt, de ízlés kérdése, amely a csilló felépítésében szerepet játszik, az általános áttekintésen túl

10

Bevezetés (meghatározás, klinikai lefolyás, diagnosztika, oki tényezők) az általam izolált DNAL1 gén és az általa kódolt protein jellemzőinek részletes ismertetésére összpontosítottam. Vizsgálataim második részének céja egy olyan új, genetikai alapokon nyugvó diagnosztikai eljárás kifejlesztése volt, amely a PCD diagnózisának felállítását noninvazív módon, gyorsan, nagy specificitással teszi lehetővé.

11

Elméleti áttekintés

5 Elméleti áttekintés 5.1 Primer ciliáris dyskinesia A primer ciliáris dyskinesia (PCD) (OMIM 242650) ritka, öröklődő betegség, amely a csillók genetikai defektusa miatt alakul ki. A betegség többnyire autoszómális recesszív öröklésmenetet mutat, incidenciája kb. 1:20 000 [34]. A tünetek hátterében a különféle genetikai defektusok miatt kialakult immotilis vagy dysmotilis csillók állnak. A légutak csökkent mukociliáris clearence-e miatt, a felső és az alsó légutakban visszatérő infekciók lépnek fel. A krónikus gyulladások a betegség előrehaladtával irreverzibilis tüdőelváltozáshoz vezetnek. A légúti eltérések mellett a spermiumok és a petevezeték epithelsejtjei által hordozott csillók csökkent mozgásképessége miatt, gyakori lelet az érintett betegek csökkent fertilitása. Az esetek felében komplett situs inversus figyelhető meg. A PCD és a komplett situs inversus együttes előfordulását Kartagener szindrómának (OMIM 244400) nevezzük [4]. Elsőként Kartagener írta le a tünetegyüttest 1935-ben, és a következő triásszal definiálta: situs inversus, krónikus sinusitis,

bronchiectasia.

A

PCD-hez

a

különböző

szervek

megbetegedései

kapcsolódhatnak, amelyek a diagnózis felállítását megnehezítik. Ezen betegségek hátterében ugyancsak motilis vagy szenzoros csillódefektus áll. A leggyakrabban fellépő társult betegségek a szívfejlődési rendellenességek, hydrocephalus internus, retinitis pigmentosa, cisztás vesebetegségek és nagyothallás [34, 4, 19].

5.2 A diagnózis felállítása A primér ciliáris dyskinesia diagnózisának felállítása a következő kritériumokon alapszik: •

A légutakban fellépő recidiváló infekciók situs inversussal vagy anélkül

•

Immotilis/dyskinetikus csillók vagy spermiumok kimutatása fénymikroszkóppal

•

A betegségre jellemző axonemális ultrastrukturális változások kimutatása elektronmikroszkóp segítségével

•

Epithelsejtek immuncitokémiai vizsgálata 12


5.2.1 PCD betegek klinikai tünetei A diagnózis felállításában legfontosabbak a betegségre jellemző klinikai tünetek. Az alsó és felső légutak recidiváló infekciói következtében kialakuló tüdőgyulladás, melléküreggyulladás, középfülgyulladás miatt fordulnak a betegek orvoshoz. Az PCD-s betegek felében komplett situs inversust lehet diagnosztizálni. Ezen kívül egyéb szervek megbetegedései is társulnak a kialakult PCD kórképéhez, amely megnehezíti a diagnózis felállítását. Elsősorban olyan betegségmanifesztációkról van szó, amelyek pathogenezisében a csillók defektusának szerepe lehet. A leggyakoribbak ezek közül a hydrocephalus internus, cisztás vesebetegségek és a retinitis pigmentosa. A diagnózis felállításában a klinikai képnek és a mikroszkópos vizsgálóeljárások során kapott leletnek egyaránt jelentős szerepe van. Sok esetben a betegség diagnózisa nem egyértelmű az egyes vizsgálóeljárások alapján, ilyenkor a betegről alkotott összkép segít a diagnosztikában. A diagnosztikai út folyamata a 1. ábrán látható. A betegek leggyakoribb tünetei a recidív köhögés, sinusitis, vagy otitis media, amelyek segítségével a diagnózis felállítása átlagosan 2-3 éves korú betegeknél történik. Természetesen ettől eltérő eseteket is közöltek, ahol a PCD leírására a beteg 4 hónapos vagy akár 51 éves korában került sor. Újszülött korban a PCD-re utaló tünetek a tachypnoe, a neonatális pneumonia, situs inversus,

congenitális

szívfejlődési

rendellenességek

[24].

Időre,

congenitális

infekcióval született csecsemő esetében is gondolni kell a PCD lehetőségére. [101] Ritkábban előforduló, de ugyancsak PCD-re utaló kórképek az oesophagealis [24] vagy biliaris atresia és a hydrocephalus [27, 36]. Kisgyermekek esetében a „nem típusos” vagy kezelésre nem reagáló asztma kialakulása, krónikus köhögés és köpet produkció esetén fel kell merülnie a kezelőorvosban a PCD lehetőségének [17, 72, 63]. Idősebb betegek esetében a gastrooesophagealis reflux, rhinosinusitis, krónikus otitis media van jelen, amely felnőtt betegek esetében infertilitással kombinálódhat [3, 62].

13


Krónikus sinopulmonális betegség • Nasális elzáródás/polyposis • Sinusitis • Otitis media • Krónikus bronchitis

Situs inversus ?

igen

nem

Sterilitás ? Nagy valószínűséggel Kartagener szindróma

igen

Nem

Kizárni a CF-et • Genetikai teszt • könny

negatív

negatív

Csillómozgás vizsgálata • direkt mikroszkópia

pozitív

Elektonmikroszkópos vizsgálat

Kizárni: • CF • Immundeficiencia • Wegener granulomatosis

pozitív

Megfelelő kezelés

negatív

Alternatív diagnosztikus módszerek: • Immuncitokémia

1. ábra Diagnosztikai séma krónikus légúti betegségekben (átvett és módosított ábra Mark J. Cowan, 2001.)

14


5.2.1.1 Kartagener szindróma: PCD asszociációja situs inversussal A PCD-ben szenvedő betegek felében situs inversus diagnosztizálható. Ez a jelenség azzal magyarázható, hogy a korai embrionális fejlődés során a primitív csomó területén lévő csillók (nodális csillók) a különböző szervek rotációjáért felelősek. A primitív csomó sejtjei monocsillókat hordoznak, amelyek folyamatosan az óramutató járásával megegyezően csapkodnak [65]. A csillócsapások által keltett áramlás a csillókat körülvevő folyadékban azt eredményezi, hogy egyes szabályozó molekulák a primitív csomó bal oldalára kerülnek. Ez a „nodal” vagy „lefty” transzkripciós faktorok aszimmetrikus

génexpresszióját

okozza.

Egészséges

embriók

esetében

ennek

következtében alakul ki a jobb/baloldali testi aszimmetria. PCD-betegek esetében az immotilis nodális csillók miatt a folyadékáramlás és az általa indukált transzport elmarad. Ez véletlenszerű testi aszimmetria kialakulásához vezet. Stochasztikus okokból kiindulva fordulhat az elő, hogy a PCD betegek felénél situs inversust, a másik felénél situs solitust lehet diagnosztizálni [59].

5.2.1.2 Infertilitás: A spermiumok immotilitása/dysmotilitása gyakori lelet PCD-betegek esetében A PCD-ben szenvedő férfi betegek gyakran infertilisek, melynek oka a dysmotilis vagy immotilis spermiumok következtében. Ennek előfordulása a csillók és a spermiumok hasonló szerkezetére vezethető vissza. A légzőhám epithelsejtjeiben kialakuló genetikai defektus a hasonló ultarstrukturális felépítés miatt a spermiumokat is érinti. A férfi PCD betegek ejakulátuma normális mennyiségű, a sejtek száma a normálistól nem tér el, ezzel szemben a motilis spermiumok aránya 0-30%. Nők estében a csökkent fertilitás a petevezeték csillóinak csökkent funkciójával magyarázható. Ezen oknál fogva a tubagraviditás előfordulása gyakoribb a PCD-s betegnél.

5.2.1.3 Hydrocephalus internus: ritkán társuló kórkép A PCD különféle megbetegedésekkel társulva léphet fel. A betegek 0,5-1%-ában hydrocephalus internus alakulhat ki, amely a születéstől fogva fennáll. A liquortereket ependymasejtek borítják, amelyek motilis csillóval rendelkeznek. Ezen csillók szerepe 15

Elméleti áttekintés hosszú ideig tisztázatlan volt. Bizonyítást nyert, hogy a Mdnah5-/--egérben obligát módon hydrocephalus alakul ki. Ez az egér a PCD knock-out állatmodellje, amely segítségével kimutatható volt, hogy az ependyma sejtek csillói a liquortranszportban fontos szerepet játszanak [33]. A vad típusú egér ependymasejtjeinek ultrastrukturális és funkcionális vizsgálata azt mutatta, hogy a csillók koordinált csapása liquoráramlást okoz (ependymal flow) az aqueductus cerebrin belül. Ez az ependymalis liquoráramlás az agyi fejlődés közben az aqeductus cerebri átjárhatóságának fenntartásában esszenciális szerepet játszik. A Mdnah5-/--egérben a fent említett okok miatt az aqueductus cerebri elzáródása triventrikuláris hydrocephalus internus kialakulásához vezet. Epidemiológiai vizsgálatok azt mutatják, hogy az aqueductus elzáródással járó (aqueductus stenosis) hydrocephalus internus aránya a PCD-betegek esetében magasabb. Ez megerősíti azt a feltételezést, hogy a Mdnah5-/--egérben megfigyelhető hydrocephalus kialakulásának pathofiziológiai mechanizmusa emberben is fontos szerepet játszik [35].

5.2.1.4 Egyéb PCD-vel együtt előforduló kórképek A csillók funkciózavara miatt PCD betegekben egy sor öröklődő betegség alakulhat ki [34]. Cisztás vesebetegség esetében a renális tubulussejtek szenzoros csillóinak károsodását lehet kimutatni [31, 71]. Ritkán PCD betegek esetében is diagnosztizálható cisztás vesebetegség. A connecting csilló dysfunkciója, amely a fotoreceptor külső és belső szegmentjét köti össze, retinitis pigmentosához vezet [99, 19, 107, 32]. Egyéb társuló

elváltozások

lehetnek

pl.:

veleszületett

szívfejlődési

rendellenesség,

nagyothallás, májfibrosis. A PCD-vel együtt fellépő betegségek komplexitása arra enged következtetni, hogy ebben a kórképben nemcsak a légzőhám epithelsejtjeinek csillói érintettek, hanem mindazon sejtek, amelyek csikló-struktúrát hordoznak. Miután a PCD-ben a motoros csillók defektusa mellett szenzoros csillózavar (retinitis pigmentosa, cisztás vesebetegség) is kimutatható, ezáltal feltételezhető, hogy a motilis csilló felépítésében résztvevő fehérjék a senzoros csilló szerkezetében is szerepet játszanak.

16


5.2.2 Mikroszkópos vizsgálóeljárás PCD-ben a csillók genetikai defektusuk miatt nem vagy nem kielégítően mozgásképesek. A genetikai hiba a csillók ultrastrukturális elváltozásához vezet. A betegség

diagnózisa

vizsgálóeljárásokon

egyrészt alapszik.

a

klinikai

tüneteken,

Fénymikroszkópos

másrészt

vizsgálattal

az

mikroszkópos epithelsejtek

csillóinak/spermiumoknak a dysmotilitását vagy immotilitását keressük. Miután a normális sejtek csillócsapásának frekvenciája 12-14 Hz, ami az emberi szem feloldóképessége fölött van, a direkt mikroszkópos vizsgálat elvégzését nagyfrekvenciás videó, lézer, stroboszkóp vagy fotoelektromos rendszer felhasználásával kell kiegészíteni. [85, 88] Az adatok elemzését megkönnyíti, ha a felvétel után a videót le lehet lassítani, mert akkor a különböző csillócsapásban bekövetkezett morfológiai elváltozásokat is meg lehet ítélni. Alternatív vizsgálati módszer az ultrastrukturális defektusok elektronmikroszkópos megjelenítése [2]. Általában erre a vizsgálatra akkor kerül sor, ha a betegnek bizonyíthatóan csillómozgás zavara van, vagy a klinikai kép egyértelműen PCD-re utal, de a direkt mikroszkópos vizsgálat nem volt kivitelezhető.

2. ábra A respiratorikus epithelsejt csillócsapásának morfológiája Az effektív csillócsapás során a csilló a mozgás első fázisában kiegyenesedve mozog, ami elősegíti azt, hogy a vizes, csillóhoz közeli fázison úszó glikoprotein tartalmú nyákfilm a szájnyílás irányába továbbítódjon. Az ineffektív csillócsapás az epithelsejt apikális felszínének széli régiójában megy végbe. Eredménye, hogy a csilló a kiindulási pozíciójába kerül és egy újabb csapási ciklus kezdődik. (saját ábra) 17


5.2.2.1 Videomikroszkópia A 2. ábra a légzőhám csillóinak normális csapását illusztrálja. Egy epithelsejt kb.100200 csillót hordoz, amelyek koordinált mozgásra képesek. Fáziskontrasztmikroszkóppal ezen koordinált csillómozgás részleteiben vizsgálható. A mikroszkóp által detektált képeket nagyfrekvenciájú videokamera alkalmazásával lehet rögzíteni. A képsorozatok számítógépes elemzése lehetőséget ad a csillók mozgásának részletes vizsgálatára és dokumentálására. A légzőhám csillóinak csapási frekvenciája egészséges egyén esetében 10 Hz fölött van. A

fáziskontrasztmikroszkóppal

összekapcsolt

nagy

frekvenciájú

videokamera

másodpercenként 125 képet képes rögzíteni [15]. A fent említett rendszer egy számítógéppel van összekötve, amely lehetőséget teremt arra, hogy a mikroszkópban látott képeket egyesével a számítógépben tároljuk. Az így rögzített videófelvételt az ún. SAVA szoftver segítségével lassítva, képről-képre lejátszva elemezhetjük. Ezáltal az egyes csillók mozgásmintája felismerhető és analizálható. Ez a módszer alkalmas továbbá arra is, hogy a csillók csapási frekvenciáját standardizált körülmények között folyamatosan mérjük.

5.2.2.2 Elektronmikroszkópos (EM) vizsgálóeljárás A PCD betegek elektronmikroszkópos vizsgálata gyakran a ciliáris struktúrák defektusát mutatja [48, 20, 37]. A vizsgálathoz szövetbiopsziás mintára van szükség, amely

leggyakrabban

bronchoszkópia

során

kerül

eltávolításra.

Az

elektronmikroszkópos vizsgálat standard követelményei a PCD diagnózis felállításában a következők: a vizsgálat során 10 különböző sejt legalább 5 jól analizálható csillóját kell megtekinteni, valamint minden csillóeltérést le kell írni. 10%-nál kevesebb eltérés normális leletre utal [22, 85]. Nem mutatható ki szignifikáns eltérés a nazális illetve a bronchialis csillók ultrastruktúrájában, valamint az életkorral sem történik szerkezetbeli változás [101, 8]. A szekunder ciliáris elváltozásokat az EM vizsgálatok során nem lehet egyértelműen a primer elváltozásoktól elkülöníteni. A szekunder elváltozások többnyire a dohányzás, bakteriális vagy virális infekciók miatt alakulnak ki és a csillók ultrastrukturális szerkezetében a primer elváltozásokhoz hasonló képet hoznak létre. Ezért fontos, hogy az elektronmikroszkópos vizsgálatra a fertőzést követő 10 hét 18

Elméleti áttekintés elteltével kerüljön sor [14]. A kimutatható ultrastrukturális károsodások többnyire a külső és a belső dynein karok hiánya (70-80%) (3. ábra), ritkábban a radiális küllők, a nexin és a mikrotubulusok zavara. Az érintett betegek kis százalékában (5%) nem mutatható ki semmiféle ultrastrukturális elváltozás. Ez azt jelenti, hogy ezekben az esetekben a diagnózist nem lehet megerősíteni elektronmikroszkópos vizsgálati eredménnyel. A külső és a belső dynein karok hiányának magas előfordulási aránya miatt Afzelius már 1976-ban azt feltételezte, hogy a PCD hátterében a dyeninstruktúrák vagy más ciliáris struktúrproteinek defektusa áll [1]. Ezért azon gének, amelyek a csillót felépítő fehérjéket kódolják, kiváló kandidáns gének a primer ciliáris dyskinesia esetében.

a

b 3. ábra Csillók elektronmikroszkópos felvételei

a: Normális ultrastruktúra. A csillók keresztmetszeti képén jól felismerhetőek a perifériás tubulus párok és a két centrális tubulus. Minden tubuluspárhoz ki vannak horgonyozva a külső (fehér nyilak), és a belső (piros nyíl) dynein karok. A belső dynein karok az alacsonyabb elektrodenzitásuk miatt csak ritkábban láthatók. b: Külső és belső dyneinkar hiány PCD betegnél. A tubulus struktúrák normális képet mutatnak, viszont a dupla tubulusokhoz sem külső, sem belső dynein kar nem kapcsolódik. (saját felvételek)

5.2.3 Egyéb, a diagnosztikában használt eljárások 5.2.3.1 Kilégzett és nasalisan mért NO Talán a legszélesebb körben kutatott, fiziológiai, és patofiziológiai vonatkozásaiban leginkább ismert kilégzett gáz az NO. Az endogén NO-t az NO szintáz (NOS) állítja elő L-argininből. A NOS-nak két izoformja ismert, a konstitutív (cNOS) valamint az indukálható forma (iNOS). A konstitutív enzim a neuronokban (nNOS), valamint az 19

Elméleti áttekintés érendotélben (eNOS) található, de kimutatható a légúti epithel sejtekben is [94, 56, 51]. Az iNOS a gyulladásos sejtekben és a légúti epithel sejtekben, alveoláris makrofágokban fordul elő [56, 91]. Egészségesekben a kilégzett levegőben mért NO-t főként az alveoláris és légúti epithel sejtekben található cNOS termeli, míg patológiás állapotokban az iNOS aktiválódik [104]. A diagnosztikában a kilégzett, valamint nasalis NO mérése kemilumineszcens módszert alkalmazunk. A nemzetközi laborokban a kilégzett NO meghatározása az Amerikai Tüdőgyógyász Társaság (ATS)-, valamint az Európai Tüdőgyógyász Társaság (ERS) mérési módszerek standardizálását szolgáló ajánlásai alapján történik [5, 46]. A kilégzés során az alveoláris térből, valamint a légutakból származó NO keveredik [47, 95]. Az elmúlt években számos tanulmány látott napvilágot, amely a különböző légúti betegségek esetén mért kilégzett NO eredményeket ismerteti. Cisztás fibrózisban (CF), és PCD-s esetekben a krónikus, rekurráló légúti gyulladás mellett alacsony kilégzett NO koncentrációk mérhetőek. Markánsabb és egyéb betegségek között egyedülálló mértékű ez az NO koncentráció csökkenés a PCD-s betegek felső légutaiban [42, 25, 6]. Ennek a jelenségnek a patofiziológiai háttere még nem ismert. CF-ben kimutatták, hogy az iNOS expessziója csökkent az állati eredetű, valamint humán légutakban [44], PCD-ben azonban a NOS működésére vonatkozó egyértelmű adat nem áll rendelkezésre. A vizsgálat eredménye megerősítette azt a korábbi megfigyelést, amely szerint a kilégzett, valamint nasalisan mérhető NO PCD-s betegekben az egészségesekénél szignifikánas alacsonyabb. Az NO metabolitjainak a kilégzett levegő kondenzátumban mért egészségesekével megegyező koncentrációja alapján feltételezhető, hogy az alacsony kilégzett NO értékek hátterében a NOS működésének defektusa, valamint a fokozott NO metabolizáció egyaránt szerepet játszik. Az NO biológiai szerepét figyelembe véve nem kizárt, hogy az alacsony kilégzett, valamint felső légúti NO-nak jelentősége van a betegség patomechanizmusában. PCD-ben a kilégzett és felső légúti NO csökkenés mértéke, különösen a nasalis NO esetén olyan mértékű, amely más betegségben nem fordul elő. A kilégzett és nasalis NO meghatározása ennek megfelelően alkalmas a PCD-s eseteknek a visszatérő légúti infekciók, infertilitás miatt vizsgált betegcsoportból történő kiemelésére.

20


5.2.3.2 Szacharin teszt A normális csillócsapás irány a nasalis üregből hátrafelé a nasopharyx felé, a bronchusokból pedig fölfelé az oropharynx felé irányul. Ezt a mechanizmust használjuk ki a szacharin teszt esetében. A szacharint az inferior nasális choana anterior részébe helyezzük. A csillók megfelelő mozgása esetén a szacharin a nasopharynx után az oropharynxba kerül és az édes íz érezhetővé válik a szájüregben. Egészséges egyén esetén az édes érzet kialakulása 10-20 percig tart, míg PCD-ben szenvedő beteg esetén ez több mint 60 perc. Cisztikus fibrózisos betegnél és bronchiectasiában a nasalis clearence 30 perc [88]. A teszt egyszerűen kivitelezhető, olcsó, de mivel nem mutat magas specifcitást a PCD-re, csak irányadó diagnózisra használható.

5.2.3.3 Genetikai diagnosztika A PCD genetikailag heterogén betegség, amely többnyire autoszómális recesszív módon öröklődik [12], de leírtak dominánsan öröklődő és X kromoszómához kötött formát is. Eddig két gént sikerült izolálni a 19q13.3-qter és a 5p15-p14 kromoszóma régiókban, amelyek bizonyítottan PCD-t okoznak [66, 60]. A DNAI1 (9p13-p21) és a DNAH5 (5p15-p14) két, külső dynein kart felépítő dyenin proteint kódolnak. Ezen gének recesszív mutációi PCD-t és Kartagener szindrómát okoznak [28, 105]. A DNAI1 génben kialakult mutációk PCD-t okoznak, továbbá az ultrastrukturális vizsgálattal külső dynein kar defektus detektálható. A DNAI1 mutációt hordozó betegek között előfordul Kartagener szindrómás beteg illetve a férfi betegeknél az immotilis csillók miatt kialakult infertilitást is leírtak [74, 28]. 121 PCD-s beteg DNAI1 mutációanalízise

során

megállapítást

nyert,

hogy

a

betegek

14%-a

(n=17)

mutációhordozó. A 17 beteg közül 15-nél ugyanazt a mutációt (219+insT) [74] igazolták a vizsgálatok. Ezek az eredmények megteremtették egy reményteljes genetikai analízis alapját ebben a betegségben. A DNAH5 gén az 5p14-p15 kromoszómána területén található, izolálása egy egymással többszörös rokoni kapcsolatban álló család genetikai vizsgálatával történt [66]. A gén (DNAH5) egy olyan fehérjét kódol, amely a Chlamydomonas külső dynein karjának γnehéz láncával rendkívül nagy homológiát mutat. A DNAH5 molekulárgenetikai analízise a gén nagysága miatt munka és időigényes folyamat, ezért a napi 21

Elméleti áttekintés diagnosztikában nem használható. A gén 79 exonból áll, az első exon rendelkezik egy alternatív párral is, ezáltal a megszekvenálandó exonok száma 80 A DNAH5 molekulárgenetikai analízise a gén nagysága miatt munka és időigényes folyamat, ezért a napi diagnosztikában nem használható. Ugyan az eddig izolált mutációk alacsony aránya a DNAI1 és a DNAH5 génekben nem indokolja a molekulárgenetikai diagnosztika bevezetését a PCD-ben, azonban a további génvizsgálatok alapjául szolgál.

5.3 A PCD kezelése A PCD kezelése alapjaiban megegyezik más, krónikus, infekcióval járó légúti megbetegedés kezelésével. A PCD-s betegek infekcióiból leggyakrabban izolált kórokozó a H. influenze (59%), ezt követi a S. pneumoniae (21%), a S. aureus (19%), a P. aeruginosa (14%) és egyéb Streptococcus speciesek (1%). [7, 93, 75]. A legfontosabb pillérek a kezelésben az antibiotikumok, a fizioterápia és a különböző kórokozók, így a H. influenze, S. pneumonie és az influenza elleni vakcináció. A diagnózis korai felállításának nagyon fontos szerepe van abban, hogy a sorozatos infekciók miatt károsodott tüdőben kialakuló bronchectasiát lehetőség szerint megelőzzük. A fertőzések első tüneteinek megjelenésekor elnyújtott hatású, magas dózisú antibiotikum adását helyezzük előtérbe, valamint ha a tünetek nem enyhülnek, térjünk át az intravénás alkalmazásra. Felnőtt betegek esetében a P. aeruginosa kolinizálódása nem ritka. [73, 26] Ilyen esetekben az első választás az intravénás, hosszú távú agresszív antibiotikus kezelés III. generációs cefalosporinnal vagy ciprofloxacinnal. A napi fizioterápiás kezelés a légutak clearancejének elősegítése és az obstruktív légúti betegségek kialakulásának megakadályozása miatt elengedhetetlenül fontos. A bronchodilatátor szerek alkalmazása ugyancsak előnyös lehet, bár irodalmi adatok szerint a fizioterápiás légzőgyakorlatok alkalmazásával a légutak clearancenek javításában jobb eredményeket lehet elérni. [77] A betegség késői stádiumában a végstádiumú tüdőbetegség kialakulása esetén a sebészi terápia is szóba jön. A betegség prognózisa általánosan tekintve jó, az egészségesekhez hasonló várható élettartammal.

22


5.4 A csillók 5.4.1 Csillós sejtek az emberi szervezetben Motilis és szenzoros csillók az emberi szervezet majdnem minden szervében jelen vannak. Ezzel magyarázható, hogy a csillók dysfunkciója különböző humán megbetegedések alapját képezi. A humán megbetegedésekben szerepet játszó csillók előfordulását a szervezetben a 4. ábra mutatja.

4. ábra Csillók előfordulása az emberi szervezetben [34] A képen a különböző szervekben előforduló csillók láthatók és a különböző csillók axonemális ultrastruktúrája is jelzett. Az agyban az agykamrákat borító ependymális sejtek motilis csillói 9+2 ultrastruktúrával rendelkeznek. A retinában a fotoreceptorok un. connecting csillókat tartalmaznak, amelyek a külső és a belső szegmentumot kötik össze egymással. Ezeknek a szenzoros csillóknak 9+0 szerkezetük van. A felső és az alsó légutak epithel sejtjeit motilis csillók borítják, ami ultrastrukturálisan 9+2 szerkezetet mutat. A vesében a 9+0 struktúrájú monocsilló a glomerulusokban és a tubuláris sejtekben található. A szenzoros csillók esetében, mint a vesében és a retinában előforduló csillók, eddig elektronmikroszkópos vizsgálattal nem lehetett centrális tubulusokat kimutatni. A reprodukciós szervek csillói ezzel ellentétben 9+2 szerkezetet mutatnak, ami motoros funkciójukra vezethető vissza. 23

Elméleti áttekintés Ezen kívül egyéb szervekben, szövetekben is izoláltak csillókat, de az eddigi kutatások még nem derítettek fényt arra, hogy a csillóknak ezekben a szervekben milyen funkciója lehet.

Az

emberi

csillós

sejttípusok

http://members.global2000.net/bowser/cilialist.html

listáját internetes

megtaláljuk

a

adatbázisban.

Valószínűleg további humán kutatásokra van szükség ahhoz, hogy ezen szervek csillóinak a különböző betegségekben betöltött szerepe tisztázódjon.

5.4.2 A motilis csillók anatómiája Az emberi szervezetben motilis csillók a felső és az alsó légutakat borítják, ezen kívül a tuba uterina nyálkahártyájának hengerhámsejtjei valamint a spermiumok rendelkeznek tisztán motilisan működő csillókkal. A motilis és a szenzoros funkciót ellátó csillók kizárólag a fejlődés korai stádiumában az embrionális csomó területén találhatók. A légutak minden egyes epithel sejtjét kb. 200 csilló borítja, a csillók átlagos hossza 5-7 µm, átmérőjük 0,25-0,33 µm. A normális mukociliáris clearance egyrészt a csillók megfelelő működésén, másrészt a mucus adekvát minőségén alapszik. [16] A légutak tisztulási rátája a nasalis mucosára vonatkoztatva 4,5-7 mm/min, a nagy légutakban 8,84,7 mm/min. [98, 97] Összességében elmondható, hogy a légutakba bekerült port, baktériumokat, egyéb anyagokat az epithelsejtek csillómozgása 6-24 óra múlva távolítja el a nyálkahártyáról [69]. Az epithelsejtek csillójának keresztmetszete (5. ábra) kiválóan demonstrálja az un. axonéma jellegzetes anatómiai képét.

5. ábra Az axonéma felépítése A csilló hosszanti- és keresztmetszetének sematikus vázlata. A két centrális tubulust a kilenc tubuluspár veszi körbe. A mikrotubulusokhoz a zölddel jelölt külső és a sárgával jelölt belső dynein karok vannak kihorgonyozva. Minden tubuluspár nexinekkel van egymáskoz kötve és a centrális tubulusok irányába a radiális küllők mutatnak.

24

Elméleti áttekintés A csilló axonémája két centrális tubulusból és a szimmetrikusan ezek köré rendezett 9 perifériás mikrotubuluspárból (A- és B- tubulus) áll (9+2 szerkezet). Néhány csillótípus, mint pl. a motilis nodális csilló nem rendelkezik centrális mikrotubulussal. A perifériás A tubuluson horgonyzódnak a radiális irányban elhelyezkedő küllők, és a külső valamint a belső dynein karok [20]. Az axonemális dyneinek a csilló biológiai motorjai, amelyek a csillócsapás kialakulásában alapvető szerepet játszanak. A mozgás kialakításában a dyneinek nehéz láncának kulcsszerepe van. A dynein nehézláncok bázisa folyamatosan az A tubulushoz van kötve, miközben a feje időszakosan a szomszédos B tubulusokhoz kötődik. A 5. ábrán a csillók egyes ultrastrukturális építőelemei vannak feltűntetve. Egy ATP függő reakció a dynein nehéz láncának un. „P1-loop”-ján a dynein fej konformációváltozását hozza létre. Ez a konformácó változás azt okozza, hogy a dyneinfej a szomszédos tubuluspáron hosszanti irányban elcsúszik és ezáltal létrehozza a csillómozgást. A nehéz dyneinláncokat a közepesen nehéz és a könnyű láncok (intermediate és light chain) horgonyozzák ki a tubulushoz. Ezen láncok szerepe a csillómozgásban, a mozgás szabályozása részleteiben még nem ismert, de feltételezhető, hogy a radiális küllők és a könnyű láncú dyneinek is szerepet játszanak a mozgás kialakításában.

5.5 Chlamydomonas, a PCD modellje A Chlamydomonas reinhardtii, egy egysejtű, biflagelláris zöld alga kiváló modell a csillófunkció vizsgálatára. A PCD kutatásban leginkább használt modellorganizmus, mivel a csillót felépítő génjeinek nagy többsége már ismert. (6. ábra) Számos vizsgálat irányult a csilló működésének meghatározására, a felépítésére és az intraflagelláris transzport részleteinek feltárására. A Chlamydomonas anterior végén két csilló helyezkedik el, aminek segítségével úszásra képes a sejt. Strukturálisan ez a csilló és a humán epithelsejtek csillója nagyon hasonló egymáshoz. Biokémiai és proteomikai vizsgálatok bebizonyították, hogy az alga axonemát felépítő proteinek az evolúció során nagymértékben konzerváltak, így a nekik megfelelő humán orthológok azonosíthatók.

25


6. ábra A Chlamydomonas reinhardtii A Chlamydomonas reinardtii egysejtű zöldalga, két csillóval rendelkezik. Mivel csillófelépítő génjeinek nagy része ismert, ezért a PCD kiváló modellorganizmusa. A Chlamydomonasban ismertek az axonemális géneket érintő mutációk, amelyek a nagy axonemális struktúrák hiányához vezetnek. Ez a hiány elektronmikroszkópos felvételen detektálható és megegyezik azokkal a leletekkel, amiket PCD betegekben is diagnosztizálni lehet. Ebből kiindulva a Chlamydomonas kiváló modellorganizmus a PCD betegségben. A Chlamydomonas axonemális vizsgálataival szerzett információk konvertálhatók és a segítségükkel a humán orthológ géneket identifikálni lehet. Ezek az ismeretek alapozták meg az eddig ismert humán axonemális proteinkutatásokat [70].

5.5.1.1 A csillók evolúcionálisan konzerváltak Evolúcionális tekintetben a csillók az élőlények legősibb struktúráji közé tartoznak. A csillókról és a csillófunkcióról szerzett legtöbb ismeretünket Chlamydomonas tanulmányokból szerezzük [20]. A szerkezeti és funkcionális elemzések során kiderült, hogy az emberi csillók és a Chlamydomonas csillója nagyon hasonló. A csillókat felépítő proteinek több mint 80%ban konzervált szerkezetűek. Bizonyítást nyert, hogy a Chlamydomonas esetében a csillómozgásért a dynein molekulák felelősek. Számos axonemalis dynein molekulát izoláltak, amelyek a csilló felépítésében vesznek részt. Ismertté vált ezen molekulák genetikai szerkezeti, továbbá az általuk kódolt proteinek 3D szerkezete és funkciója is. Az egyes proteinek interakciója más, a csilló felépítésében szereplő fehérjékkel csak részben ismert. A belső és a külső dynein karok (7. ábra) nagy fehérjekomplexumok, 26

Elméleti áttekintés amelyek nehéz (400-500 kDa), közepesen nehéz (55-110 kDa) és könnyű láncból (8-45 kDa) állnak. Chlamydomonasban a dynein karokat felépítő legtöbb fehérje ismert. Ezen struktúrproteineket kódoló Chlamydomonas génekben fellépő mutációk a csillók ultrastrukturális defektusát hozzák létre és a csillómozgás kinetikája megváltozik. Ezen megfigyelések alapján feltételezhető, hogy a PCD betegekben megfigyelhető különböző axonemalis ultrastrukturális dyneindefektusok hátterében a dyneineket kódoló gének genetikai hibája áll [3].

p45

βHC

1

p45

1

αHC

γHC 3

5

LC1-Dimer

4

Thioredoxin-like

Calmodulin-like IC2

8 8

7 6 6

LC8-Dimer

2

IC1

88

LC6-Dimer

7. ábra A Chlamydomonas külső dynein karjának modellje [11] A három nehéz lánc (α,β,γ) a külső dynein kar felépítésében központi szerepet tölt be. A nehéz láncok C terminális vége alkotja a putatív mikrotubulus kötőhelyet. Az N terminális doménhez kötődnek a közepesen nehéz láncok (IC1/IC2) és a könnyű láncok (sorszámozva). A p45 axonemális protein még nem ismert, azonban valószínűleg a γ−nehéz lánc szabályozásában játszik szerepet.

27


5.5.2 A Chlamydomonas axonemális proteinjei A PCD genetikailag heterogén betegség, különböző gének defektusa vezethet a betegség kialakulásához. Eddigi ismereteink szerint két olyan gén ismert és jól karakterizált, amelyek károsodása PCD-hez vezet. További új PCD gének identifikálásához olyan információkra van szükség, amelyek a humán axonemális proteinek tulajdonágait, jellegét, funkcióit írják le.

nehéz láncok

közepesen nehéz láncok

humán gén

humán kr.

PCD mutáció

-

-

-

DNAH9

17p12

nincs

DNAH11

7p21

van

ODA defektus

DNAH5

5p15

van

oda9

ODA defektus

DNAI1

9p21-p13

van

oda6

ODA defektus

DNAI2

17p25

nincs

DNAL1

14

nincs

ODA defektus

TCTE3

6q27

nincs

LC3

ismeretlen

-

-

-

LC4

ismeretlen

-

-

-

LC5

ismeretlen

-

-

-

LC6

oda13

lassabb mozgás

-

-

-

LC7a

oda15

ODA defektus

-

-

-

ismeretlen

-

-

-

Chlamy. protein

mutáns gén

Chlamy. fenotipus part. ODA defektus

DHCα

oda11

DHCβ

oda4

ODA defektus

DHCγ

oda2

IC1 IC2 LC1 LC2

könnyű láncok

oda12

LC7b

dokkoló komplex

asszociált proteinek

LC8

fla14

ODA defektus

-

17q23.3

nincs

DC1

oda3

ODA defektus

-

-

-

DC2

oda1

ODA defektus

-

-

-

DC3

oda14

ODA+IDA defektus

-

-

-

ODA5

oda5

ODA defektus

-

-

-

ismeretlen

-

-

-

ODA5-AK

1. táblázat A Chlamydomonas külső dynein karjának proteinjei A táblázatban a Chlamydomonas proteinek, az azokat kódoló gének és a mutációjuk következtében kialakult fenotípusok vannak felsorolva. A táblázat második felében az eddig ismert humán orthológ gének, azok kromoszóma lokalizációja, valamint PCD betegekben izolált génmutációk jelennek meg. 28

Elméleti áttekintés Humán bronchiális epithelsejtek primer sejtkultúrájának axonemális proteom analízise során 200 potenciális axonemális proteint izoláltak [67]. Primer ciliáris dyskinesiában a betegségért felelős gének izolálása abból indul ki, hogy a specifikus axonemális substruktúrák hiányoznak, amit diagnosztikus módszerekkel ki lehet mutatni. Az eddig izolált gének által kódolt fehérjék mindegyike a csilló felépítésében játszik szerepet. Ismert azonban az az intraflagelláris mechanizmus alacsonyabb szervezetekben, ami a csillót felépítő fehérjéket az axonemába szállítja és a csillón belül ezeket az alkotóelemeket transzportálja. Feltételezhető, hogy ezek a proteinek is szerepet játszhatnak a PCD kialakulásában, de jelenlegi ismereteink ezekről a humán proteinekről igen felületesek. A Chlamydomonas reinhardtii külső dynein karjának felépítése, szerepe részleteiben ismert, a kódoló gének humán orthológjának nagy többsége azonban még nem azonosított. A 1. táblázatban látható összefoglalás a külső dynein kar proteinjeit mutatja [70]. Azok a gének, amelyek mutációja a Chlamydomonas külső dynein karjának ultrastrukturális elváltozásaihoz vezet, kiváló kandidáns gének a PCD-ben. Ezen humán gének identifikálása és szekvenciaanalízie a jövőben fényt deríthet a PCD genetikai hátterére. Nemcsak a külső dynein karok defektusa vezethet PCD-hez, hanem más, axonemális illetve transzport fehérjék strukturális és funkcionális hibája is. A jövőben a Chlamydomonas vizsgálatok kiterjedésével lehetőségünk lesz ezen proteinek és az azokat kódoló humán orthológ gének identifikálására. A kutatás ilyenfajta előrehaladása valószínűleg fényt derít a PCD genetikai hátterére.

5.5.3 Ismert orthológ gének A PCD genetikailag heterogén betegség, amely többnyire autoszómális recesszív módon öröklődik [12]. A PCD betegekben előforduló heterogén ultrastrukturális defektusok miatt a teljes genom haplotípus elemzése több lokus előfordulását írta le a betegséggel kapcsolatban. Ezzel az eljárással szinte minden kromoszómán ki lehetett mutatni PCD-vel kapcsolt régiót. Eddig a 19q13.3-qter lévő DNAI1-et és az 5p15-p14 kromoszómán elhelyezkedő DNAH5-öt sikerült azonosítani, amelyek bizonyítottan PCD-t okoznak [60, 66]. A DNAI1 (9p13-p21) és a DNAH5 (5p15-p14) két, külső dynein kart felépítő dyneinproteint kódolnak. Ezen gének recesszív mutációi PCD-t és 29

Elméleti áttekintés Kartagener szindrómát okoznak [28, 105]. A DNAH11 recesszív mutációja ugyancsak nagy valószínűség szerint Kartagener szindrómát okoz, de a vizsgált beteg a fent említett mutáción kívül még CF-et okozó génmutációt is hordoz. Minden kétséget kizárólag nem sikerült bebizonyítani, hogy a beteg klinikai tüneteit melyik mutáció okozza [9]. A PCD öröklődésmenete többnyire autoszómális recesszív, de megfigyeltek autoszómális domináns és X-kromoszómához kötött recesszív öröklődést is. Több kandidáns gén analízis is napvilágot látott, legfőképp olyan géneket izoláltak, amelyek különböző dyeninproteineket kódolnak, pl: TCTEX2, DNAI2, DNAH9. Ezen gének mutációanalízise PCD-ben szenvedő betegek esetén eredménytelen maradt.

5.5.3.1 A belső dynein kar humán génjei DNALI1 A DNALI1 a Chlamydomonas p28 génjének humán orthológja, amely a belső dyneinkar egyik könnyű láncát kódolja. A Chlamydomonas belső dyneinkarjának felépítése rendkívül komplex, ami azzal jár, hogy a csilló hosszában a belső dynein kar strukturális és funkcionális eltérést mutat [80, 82, 18, 55, 39]. A belső dynein karok radiális küllőkhöz viszonyított longitudinális helyzete alapján a belső dynein karokat 3 csoportba lehet osztani (I1, I2, I3) [53]. A p28 a Chlamydomonasban az I2 és az I3 belső dynein kar egyik komponense, a ciliáris axonema teljes hosszában kimutatható [82, 39, 54, 79]. A Chlamydomonas ida-4 mutánsaiban a p28 fehérje a csilló teljes hosszából hiányzik. Ez ahhoz vezet, hogy a csillómozgás megváltozik. A csilló inefficiens csapási amplitúdója miatt a zöldalga sokkal lassabban úszik, mint egészséges társa [53, 78, 41, 57]. Ez arra enged következtetni, hogy a p28 esszenciális szerepet játszik a belső dyneinkar felépítésében és funkciójában. A p28 fehérje a belső dyneinkar nehéz láncához, aktinhoz és caltractinhoz/centrinhez kötődik a csillón belül. Ezen tények is alátámasztják azt a feltételezést, hogy a p28 fehérje a csilló motilitásában fontos szerepet játszik. A DNALI1 (hp28) a Chlamydomonas p28 génjének humán homológja [43]. A gén az 1p35.1 kromoszómán helyezkedik el és 6 exonból áll, az általa kódolt fehérjét 280 aminosav építi fel. A gén egy axonemális könnyűláncot kódol, amely rendkívül nagy 30

Elméleti áttekintés homológiát mutat a Chlamydomonas p28 génjével. Northern blot analízissel kimutatható volt, hogy a DNALI1 a csillót hordozó szövetekben expresszálódik, a legnagyobb génexpresszió a testisben és a tüdőben detektálható. BLAST analízissel bebizonyítható volt, hogy a Chlamydomonas p28 fehérjéjének és a hp28 humán homológ proteinjének aminosavszekvenciája 66%-ban identikus. A 130-as és a 250-es aminosav közötti régió rendkívül konzervált a különböző élőlényekben. Ezen protein nagyfokú evolúcionális konzerváltsága arra utal, hogy a p28/hp28 fehérjének fontos funkciója van a csilló belső dynein karjának felépítésében.

5.5.3.2 A külső dynein kar humán génjei DNAH5 A DNAH5 gén az 5p14-p15 kromoszómán található, amelyet rokoni házasságból származó PCD betegek genetikai vizsgálatával sikerült izolálni [66]. A gén (DNAH5) egy olyan fehérjét kódol, amely a Chlamydomonas külső dynein karjának γ-nehéz láncával rendkívül nagy homológiát mutat. A Chlamydomonas γ-nehéz láncát kódoló génben bekövetkező mutáció a csilló dysmotilitását okozza. Elektronmikroszkópos vizsgálattal a külső dyneinkar hiányát lehet kimutatni. A humán DNAH5 expressziós vizsgálata azt mutatta (8. ábra), hogy a gén expressziója a tüdőben a legnagyobb, ami az esetleges PCD-ben betöltött szerepét alátámasztja.

8. ábra A DNAH5 murin orthológjának (Dnah5) in situ hibridizációja [66] a, A Dnah5 expressziója a légutakban (egérembrió 16,5. nap post coitum). b, A Dnah5 expressziója a primitív csomóban (egérembrió 7,5. nap post coitum). A primitív csomó erős szignálja egy nyíllal jelölt a képen. c, Az agykamrákat borító, csillót hordozó ependymasejtek expressziója. (felnőtt állat) 31

Elméleti áttekintés A DNAH5 egér orthológ génjének in situ hibridizációs vizsgálatával bizonyítást nyert, hogy a Mdnah5 a csillóval rendelkező sejtekben, úgymint a légutak epithelsejtjeiben, az embrionális csomó sejtjeiben és az agyi ependymasejtekben mutatható ki. A Chlamydomonas homológ gén funkcionális jelentősége, a DNAH5 expressziós vizsgálati eredményeit figyelembe véve az, hogy a DNAH5 a primer ciliáris dyskinesia kiváló kandidáns génje.

DNAI1 A DNAI1 gén a 9p13-p21 kromoszómán található és egy 699 aminosavból álló proteint kódol, amely a Chlamydomonas külső dynein kar IC1 láncával nagy homológiát mutat. Northern blot segítségével specifikus expressziót lehetett kimutatni a trachea és a testis sejtjeiben [74]. A DNALI1 génben kialakult mutációk PCD-t okoznak, továbbá az ultrastrukturális vizsgálattal külső dynein kar defektus detektálható. A DNAI1 mutációt hordozó betegek között előfordul Kartagener szindrómás beteg illetve a férfi betegeknél az immotilis csillók miatt kialakult infertilitást is leírtak [74, 28]. 121 PCD-s beteg DNAI1 mutációanalízise során megállapítást nyert, hogy a betegek 14%-a (n=17) mutációhordozó. A 17 beteg közül 15-nél ugyanazt a mutációt (219+insT) [105] igazolták a vizsgálatok. Ezek az eredmények megteremtették egy reményteljes genetikai analízis alapját ebben a betegségben.

5.6 LC1, a Chlamydomonas axonemális dynein könnyű lánca A Chlamydomonas LC1 proteinje a külső dynein kar egyik könnyű lánca, amely szorosan kontaktusban van a külső dynein kar γ- nehéz láncával. A külső dynein kar 8 könnyű láncát két csoportba lehet osztani az axonemális lokalizációjuk alapján. Az első csoportba tartoznak azok a láncok, amelyek a közepesen nehéz láncok bazális régiójához kapcsolódnak. A másik csoport közvetlenül a nehéz láncokkal kerül kapcsolatba. Az α- és a β−nehéz láncokhoz egy-egy könnyű lánc kapcsolódik, amik a tioredoxin szupercsalád tagjai. A harmadik, γ- nehéz lánchoz két könnyű lánc kapcsolódik, az egyik a LC1 a másik az LC4 [76]. Az LC4 a calmodulin szupercsalád új tagja, 10-5 M affinitása Ca 2+-t köt, ami azt támasztja alá, hogy ez a protein a fotoshockválaszban játszik fontos szerepet [40, 61]. A γ−nehéz lánc szorosan asszociált a 22kDa 32

Elméleti áttekintés molekulasúlyú LC1-al. A leucin repeat protein családba tartozó LC1 egy olyan strukturális motívummal rendelkezik, amely a protein-protein interakcióban játszik szerepet. Több, ebbe a családba tartozó protein a szignáltranszdukciós utak komponenseinek interakcióiban van jelen [50]. Jelenlegi ismereteink szerint az LC1 az egyetlen eddig ismert fehérje, ami egy dynein nehéz lánc globuláris doménjével lép kapcsolatba. Protein-protein interakciós vizsgálatok bebizonyították, hogy az LC1 közvetítésével egy 45 kDa-os axonemális polypeptid kapcsolódik a γ−nehéz lánc motoros doménjéhez.

5.6.1 Az LC1 szerkezeti jellemzői Az LC1 olyan protein szubcsaládba tartozik, amelyet leucinban gazdag repeatek jellemeznek. Az ebbe a csoportba tartozó proteinek konszenzus szekvenciája az LxxLxxLxLxxNxIxxIxxLxx [38], ahol általában az I izoleucint, az L leucint jelöl, de más hidrofób aminosavak (metionin, feninlalanin, valin) is betölthetik ezt a szerepet. Az LC1 szekvenciavizsgálata során kiderült, hogy ez a fehérje négy esszenciális komplett és több részleges LRR motívumot hordoz. Az LRR proteinek több mint hat különböző szubtípusát írták le, az LC1 az SDS22+ szubtípus tagja. [38] A sertés ribonukleáz inhibitor 15 LRR motívumot tartalmaz, és kiváló modellje ennek a struktúrának. E protein vizsgálata során megállapítást nyert, hogy az LRR motívumok fő formája βlemezes szerkezet és az α-hélix, amelyeket egy aszparagin híd köt össze. Az LC1 ebből a

szerkezetből

kettőt

tartalmaz.

Szekunder

strukturális

protein

vizsgálatok

bebizonyították, hogy az LC1 N-terminális végén az LRR szakasz előtt nagy valószínűséggel helikális struktúra található. A centrális LRR régió egy hengert hoz létre, amely nagy, párhuzamos β-lemezes szerkezetből áll. Ezt a szerkezetet az egyik oldalról 6 β−lánc, a szemközti oldalról négy β−lánc építi fel. A β−lánc között a kapcsolatot a 6 α-hélix biztosítja, ezen kívül mindkét terminális régió helikális szerkezetű. A hengeres szerkezet úgy alakul ki, hogy a hat β−β−α motívum egy jobb menetes spirált alkot, aminek N és C terminális végén a második β−lánc hiányzik [102]. A konzervált hidrofób láncok egy hidrofób magot alkotnak. Minden teljes LRR domén egy nagymértékben konzervált aszparagin aminosavat tartalmaz, ami a szerkezet stabilizálására szolgál. Az aszparagin nincs kihelyezve a felszínre, hanem a mag felé 33

Elméleti áttekintés mutat. Az LC1 N terminális régiója egy egyes hélixet tartalmaz, ami az LRR hengert sapkaszerűen zárja le. A C terminális végen két α-hélix helyezkedik el, amelyek önálló szubdomént alkotnak. Ez a szerkezete kilóg az LRR spirálok által alkotott henger tengelyéből. Az LC1 felszínének kis területe hidrofób, amelyet a nagy β-lemezes szerkezeten a Trp 99, Tyr 121, valamit a Leu 146 hoz létre. A proteincsalád minden tagjában ezek az aminosavak nagymértékben konzerváltak. A protein hidrofób részével szemközti oldal töltésekkel rendelkezik.

5.6.2 Az LC1 interakciói 5.6.2.1 Az LC1 a külső dynein kar γ−nehéz láncával specifikus kötést alkot Western blot vizsgálattal kimutathatták, hogy a Chlamydomonas sejtek izolátumában a specifikus LC1 elleni antitesttel egy 22 kDa molekulatömegű proteint lehet detektálni, ami az LC1 fehérjének felel meg [11]. Az LC1 nem volt detektálható a Chlamydomonas oda9 mutáns változatának vizsgálatakor, amely totális külső dynein kar hiánnyal jellemezhető. Vad típusú axonemák 0,6 M NaCl jelenlétében nyert dynein extaktumát 5-20%-os szukróz gradienssel vizsgálva megállapítható volt, hogy az LC1 a 12 S-nél a γ−nehéz lánccal együtt detektálható.

5.6.2.2 Az LC1 a γ−nehéz lánc C terminális motor doménjéhez kapcsolódik In situ vizsgálatok során bizonyítást nyert, hogy a γ-nehéz lánc, az LC1 és a feltételezhetően mikrotubulus kötő protein p45 az axonemán belül egy hármas egységet alkot. Szukróz gradiens segítségével tisztított dynein extraktumból származó γ−nehéz lánc-LC1

komplexen

végzett

fotolitikus

és

DMP

cross

linking

kísérletek

bebizonyították, hogy az LC1 γ−nehéz lánc motor doménjéhez kötődik [11]. A γ−nehéz láncnak ezen a területén található a legtöbb globuláris fej-domén, valamint a mikrotubuluskötő domén. Az LC1 γ−nehéz lánc kötés az első bizonyíték arra, hogy egy dynein asszociált komponens a dynein nehéz láncának motor doménjéhez kapcsolódik. Ez azt jelentheti, hogy az LC1 a motoros funkciók szignáltranszdukciós szabályozásában játszhat szerepet. A γ nehéz lánc és az LC1 interakciója 600 nM NaCl jelenlétében nem bomlik meg, ami arra enged következtetni, hogy a két protein közötti 34

Elméleti áttekintés kapcsolat hidrofób. Az LC1 β-lemezes szerkezetén található egy hidrofób régió, ami egyéb, ebbe a protein családba tartozó fehérjéknél protein-interakciós felületként szolgál [11].

5.6.2.3 A p45 és az LC1 kapcsolata Az LC1 a legnagyobb a külső dynein kar 8 könnyű lánca közül. EDC-vel végzett interakciós vizsgálatokkal bebizonyítható volt, hogy az LC1 és a 45 kDa molekulatömegű axonemális protein egymással direkt kapcsolatban vannak. Egy γ−nehéz lánchoz 2 LC1 kötődik, ami ugyancsak két 45 kDa proteinnel van kapcsolatban [11]. Az LC1-p45 interakció magas sókoncentráció jelenlétében felbomlik, ami arra utal, hogy a két protein között egy ionos kapcsolat áll fenn. Ezekre az eredményekre és az LC1 szerkezeti vizsgálataira alapozva megállapítható, hogy a feltételezett ionos interakciós régió a γ nehéz lánc kapcsolódási helyével átellenes oldalon található. Az LC1 kötési helye a γ nehéz láncon a motoros domén első AAA régiója. Ez lehetővé teszi azt, hogy az LC1 érzékelni tudja az ATP kötés és hidrolízis által okozott konformációváltozásokat a γ nehéz láncon. Ez a megfigyelés megerősíti azt, hogy az LC1 a motoros aktivitás regulációjában játszhat szerepet.

35

Célkitűzés

6 Célkitűzés 6.1 A humán DNAL1 és a murin Dnal1 gének identifikálása A motilis csillók kongenitális diszfunkciója primer ciliáris dyskinesiában komplex fenotípust okoz. A PCD-ben leggyakrabban leírt ultrastrukturális defektus a könnyű (LC), a közepesen nehéz (IC), valamint a nehéz láncból (HC) álló külső dynein karok (ODA) részleges vagy teljes hiánya. Ebből a klinikai megfigyelésből kiindulva az eddigi génidentifikációs vizsgálatok a dynein karokat felépítő génekre korlátozódtak. A biflagelláns Chlamydomonas γ-ODA-HC gén humán orthológ génjének, a DNAH5-nek a recesszív mutációi PCD-t okoznak. A Chlamydomonas γ-ODA-HC motoros protein aktivitása az axonemális LC1 fehérje által szabályozott. PhD munkám célja az axonemális LC1 fehérje humán és murin orthológjának (DNAL1 és Dnal1) identifikálása az alábbi módon: •

A génstruktúra meghatározása

•

A DNAL1 fehérjeszerkezetének elemzése

•

A DNAL1 és a DNAH5 interakciójának vizsgálata

•

A DNAL1 expressziós vizsgálata

•

A DNAL1 gén mutációanalízise PCD-ben szenvedő betegekben

6.2 Új diagnosztikai eljárás kifejlesztése primer ciliáris dyskinesiában Jelenlegi ismereteink alapján nem áll rendelkezésünkre olyan nem invazív, megbízható, gyorsan elvégezhető módszer, amelynek segítségével a PCD diagnózisa teljes biztonsággal felállítható. Az eddig használt diagnosztikai eljárások felhasználásával a betegek kb. 20 %-a nem diagnosztizálható egyértelműen. Legtöbb esetben a diagnosztikus támpontot a klinikai eltérések mellett a mikroszkópos vizsgálatok adják. A PCD diagnózisa a jellegzetes klinikai tünetek jelenléte mellett az immotilis vagy dysmotilis csillók ultrastrukturális és/vagy direkt mikroszkópos kimutatásán alapszik

36

Célkitűzés A diagnózishoz szükséges élő epithel sejteket bronchoszkóp vagy transznasalis kefebiopszia segítségével a nasopharynx területéről nyerjük. A direkt mikroszkópos vizsgálóeljárást a betegnél fennálló gyulladás, az un. szekunder elváltozások nehezíthetik meg. Elektronmikroszkóp segítségével az esetek kb. 80%-ában lehet csak biztos diagnózist mondani [22]. Több vizsgálatban kimutatták, hogy a belső dynein karok elektronmikroszkópos detektálása nagyon nehéz, mert ezen sejtstruktúrák elektrodenzitása alacsony. Ez azzal jár, hogy gyakran még az egészséges egyéneknél sem lehet a belső dynein karokat láthatóvá tenni az elektronmikroszkópos felvételeken. Ezért az EM-vizsgálat ál-pozitív eredményekhez vezethet. Célunk egy olyan új diagnosztikus eljárás kifejlesztése volt, amely lehetővé teszi, hogy •

a

leggyakrabban

előfordulő

külső

és/belső

dynein

kar

defektusokat

diagnosztizálni lehessen •

a vizsgálati mintát a kevésbé invazív kefebiopsziával nyerjük

•

kiküszöböljük az álpozitív valamint az álnegatív vizsgálati eredményeket

•

a vizsgálóeljárás a primer ciliáris elváltozásokra legyen specifikus

•

segítségével a betegek több mint 80%-ánál biztos diagnózist lehessen mondani

•

specifikus információt adjon a további genetikai vizsgálatokatra vonatkozóan

37

Anyagok

7 Anyagok 7.1 Kemikáliák 0,9 % NaCl, B. Braun, Melsungen Agarose peqGold Universal Agarose, peqLab, Erlangen Aqua ad inj. (steril) AMPUWA, Fresenius, Bad Homburg Bórsav Merck, Darmstadt Bromfenolkék, Sigma-Aldrich-Chemie, Deisenhofen CaCl2, Merck, Darmstadt CHAPS, Sigma-Aldrich-Chemie, Deisenhofen DTT (1,4 Dithiothreitol), Sigma-Aldrich-Chemie, Deisenhofen ECL-reagens, Amersham Pharmacia, Freiburg EDTA Serva, Heidelberg Etanol J.T.Baker, Deventer, Hollandia Ethidiumbromid 1%-os oldat H2O-ben, Merck, Darmstadt Ezüst-nitrát, Sigma-Aldrich-Chemie, Deisenhofen Glicerin Fischer GmbH, Saarbrücken Intensifying screen reagens Cronex, DuPont, Bad Homburg Kalium-acetát, Sigma-Aldrich-Chemie, Deisenhofen MgSO4, Merck, Darmstadt PFA, Sigma-Aldrich-Chemie, Deisenhofen Proteáz Inhibitor koktél, Sigma-Aldrich-Chemie, Deisenhofen Q-Solution, Taq DNA Polymerase-zal együtt szállítva, Qiagen, Hilden Sovány tejpor Tripszin inhibitor, Sigma-Aldrich-Chemie, Deisenhofen Tris bázis Trizma® Base, Sigma-Aldrich-Chemie, Steinheim Triton-X 100, Roth, Karlsruhe Tween-20, Merck, Darmstadt Xylencyanol FF, Sigma-Aldrich-Chemie, Deisenhofen

38

Anyagok

7.2 Enzimek, kitek, antitestek és markerek 4xLDS, Invitrogen, Karlsruhe DNAH5, DNALI1 anti-rabbit antitestek HiMark, unstained Protein Standard, Invitrogen, Karlsruhe Hoechst 33342 Sigma-Aldrich-Chemie, Deisenhofen HRP-konjugált anti-rabbit szekunder antitest Santa Cruz, Heidelberg MassRuler 100bp Lader, Ready to use, Fermentas Megaprime DNA labeling kit Amersham, Freiburg PCR-termék tisztító-kit Quiaquick PCR Purification Kit, Qiagen, Hilden pEGFP vektor, BD Biosciences Clontech, Heidelberg Protein G Immunprecipitation Kit, Invitrogen, Karlsruhe Proteináz K, Sigma-Aldrich-Chemie, Deisenhofen 6XPuffer QIAamp DNA Blood Maxi kit, Qiagen, Hilden Rabbit anti-GFP antitest, Clontech Seeblue Plus2 Prestained Standard, Invitrogen, Karlsruhe Sequenzier-Kit ABI PRISM / BigDye Terminator Cycle Sequencing; Ready Szekunder antitestek, Molecular Probes, Poortgebouw, Hollandia Taq DNA Polymerase Thermus, Eppendorf, Hamburg

7.3 Pufferek és oldatok 6x Loading buffer 100 µl Bromphenolblau, 300 µl Glycerol, 600 µl TBE BBS puffer: (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4 pH 6,95) Church puffer(500 mM foszfát puffer pH 7,2, 7% SDS (w/v), 1 mM EDTA 100 μg/ml lazac spermiumból származó DNS hozzáadásával) Coomassie Brillant blue, Serva, Heildelberg Előhívó folyadék (ezüst festés): 7,5 g Nátrium-karbonát, 250 ml H2O, 125 μl 37% formaldehid Extractiós puffer: 50mM NaCl, 20mM Tris-HCl pH7,5, 1mM EDTA, 7 mM β-ME (0,1% CHAPS) Festék eltávolító folyadék Fixáló folyadék (ezüst festés): 5 ml 2,3 M citromsav-oldat 39

Anyagok HMEN: 2 mM DTT, 70 mM β-ME, 0,1% Triton X-100, Protease Inhibitor Coctail Novex Tris-Glicine Transfer Buffer, Invitrogen Karlsruhe NP40: 2,5 ml 0,2 mM Hepes pH 7,5, 0,3 ml 5M NaCl, 0,5 ml 20% Igepal, 80 ml, EDTA (250 mM), 2,5 ml 40% Glycerin, 4,01 ml ddH2O, 10 ml Aprotinin, 100 ml PMSF Nukleotid-törzsoldat 100 mM dNTP Set PCR Grade, Invitrogen, Karlsruhe NuPAGE MOPS SDS Buffer kit, Invitrogen Karlsruhe PBS, Gibco, Invitrogen, Karlsruhe PFA 4%: 4g PFA, 10 mM NaOH, PBS Reed’s puffer: 30 mM HEPES pH 7,4, 5 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 625 mM NaCl Resuspendációs puffer: 50 mM KAc, 20 mM Tris-HCl pH8, 4mM MgSO4, 1mM DTT, 0,5 EDTA, 0,1 mg/ml Trypsin Inhibitor RPMI1640, Gibco, Karlsruhe TBE-puffer 108 g Tris base, 55 g Borsäure, 15 g EDTA TBS-T: 5 ml Tris (pH 8), 15 ml NaCl (5M), 250μl Tween-20 add H2O 500 ml-ben

7.4 Laboreszközök ABI-Prism Systemsequenzer 310 Perkin Elmer, Üblingen Desztiláló készülék Typ MilliQ plus Millipore, Eschborn Elektroforéziskamra GNA-100 / GNA-200, Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden Eppendorf-centrifuga Biofuge fresco, Heraeus Instruments, Kendro Laboratory Products GmbH, Hanau Fluoreszcenszmikroszkóp Axioskop Fotodokumentációs rendszer az ethidiumbromid gélekhez Fotométer, Pharmacia Biotech, Uppsala Sweden Hűthető centrifuga 5402 Eppendorf, Hamburg Hűtőszekrény Jégelőkészítő AF 10 Scotsman Mágneses keverőasztal RCD-basic IKA Labortechnik, Staufen i.Br. Mélyhűtőszekrény (-20°C) Liebherr Mélyhűtőszekrény (-80°C) VIP-Series Sanyo Mérleg L22005-D, Sartorius laboratory, Göttingen 40

Anyagok Mikrohullámú sütő Siemens Olympus IMT-2 fáziskontraszmikroszkóp PCR-gép MJ-Research PTC-200 Peltier Thermal Cycler, MJ Research Inc., Waltham PCR-gép Techne Genius, Thermo-Dux-GmbH, Wertheim pH-méter pH 538 WTW, Schott, Hofheim Sorvall RC-53 centrifuga, Kendro Termoblokk Eppendorf Thermomixer compact, Eppendorf, Hamburg Varifuge 3.2RS Heraeus, Hanau Videokamera Redlake, San Diego, USA Vortex Junke und Kunkel, IKA Labortechnik, Staufen i.Br. XCell SureLock Mini Cell und Blot Modul, Invitrogen, Karlsruhe Zeiss Axiovert 200 LSM 510 iUV laser Scanning mikroszkóp, Jena

7.5 Egyéb anyagok Biopsziás kefe, Cervixbürsten ORIBRUSH, Ystad, Svédország Blottoló szivacsok, Invitrogen, Karlsruhe Faramount medium, DakoCytomation Fedőlemez, R. Langenbrinck, Teningen Filterpapír HEK 293T sejtek Hybond N Nylonmembrán , Amersham; Freiburg Különböző pipetták, reakcióscsövek 0,5 ml, 1,5 ml Eppendorf, Hamburg NuPAGE gélek, Invitrogen, Karlsruhe Pap pen PCR-csövek ThermoTube PCR Tubes 0,2 ml, peqLab, Erlangen Petri-csészék (90 mm, 120 mm), Polystyrolgefäße, Pipettenspitzen (steril, 15 ml, 50 ml), Greiner, Frickenhausen; Röntgenfilm. Kodak Szike, Feather, Japán Tárgylemezek, R. Langenbrinck, Teningen

41

Módszerek

8 Módszerek 8.1 Betegek A vizsgálatunkban olyan családok vettek részt, ahol egy vagy több PCD-ben szenvedő beteg fordult elő. Minden megvizsgált családot felvilágosítottunk a kutatás céljáról és a beleegyezőnyilatkozat

aláírásával

igazolták,

hogy

részt

kívánnak

venni

a

vizsgálatsorozatunkban és egyetértenek a vérvétellel és a transznasalis kefebiopszia elvégzésével. Az immunfluoreszcens vizsgálatban 54 PCD beteg vett részt, 54 %-uk (n=28) situs inversusos volt. A betegek 80%-a rendelkezett EM vizsgálati eredménnyel. Ezek közül 47% (n=20) belső dynein kar defektussal, 33% (n=14) külső dynein kar defektussal és 20 % (n=9) belső és külső dynein kar defektussal rendelkezett. 86 PCD-ben szenvedő beteg DNAL1 génjében végeztünk mutációanalízist. A DNS bankunkban szereplő 110, nemzetközi kooperációból származó PCD beteg közül előzetes vizsgálatok alapján 24 beteget kizártunk a szekvenciaanalízisből. Ezen betegek vagy DNAH5 vagy DNAI1 mutációt hordoztak, vagy a genetikai vizsgálatok során a DNAH5 génnel való kapcsoltságot mutattak. A fennmaradó 86 beteg esetében végeztük el a DNAL1 gén mutációanalízisét. Minden családból csak egy beteget vizsgáltunk. A betegek 56%-ában (n=48) situs inverust diagnosztizáltunk. A szekvenálás során kontrollként 5 egészséges egyéntől származó mintát használtunk fel.

8.2 Diagnosztikai módszerek 8.2.1 Nagy-frekvenciájú videomikroszkópos analízis Betegeinknél a klinikai diagnózist a videomikroszkópos analízissel erősítettük meg. A nagy-frekvenciájú videomikroszkópos analízis lehetőséget kínál arra, hogy a csillók mozgási mintázatát és csapási frekvenciáját részleteiben vizsgáljuk. A transznasalis kefebiopsziával vett vizsgálati anyagot a SAVA rendszer segítségével analizáltuk [96]. Ehhez a biopsziával nyert epithelsejteket sejtkultúrához használt médiumba (RPMI1640 hozzáadott anyagok nélkül) tettük, majd a sejteket is tartalmazó folyadékot 42

Módszerek tárgylemezre

cseppentettük.

A

csillók

vizsgálatát

egy

Olympus

IMT-2

fáziskontrasztmikroszkóppal végeztük (40x-es objektív), amely egy „Redlake ES-310 Turbo monochrom high speed” videokamerával (Redlake, San Diegeo, USA) volt felszerelve. A kamera és a hozzá kapcsolt számítógép lehetővé teszi, hogy a mikroszkópban látott csillók mozgását rögzítsük. Szekundumonként 125 kép felvételére van lehetőség, aminek felbontása 640x480. A SAVA szoftver használatával a csillók csapási frekvenciája automatikusan meghatározható. Ahhoz, hogy a normálistól való kisebb csillómozgásbeli eltérést is megbízhatóan analizálni tudjuk, a felvett videofelvételeket lassítva játszottuk le és a diagnózist az így látott kép alapján állítottuk fel.

8.2.2 Immuncitokémiai vizsgálat 8.2.2.1 Az immuncitokémia elve Az immuncitokémia arra szolgál, hogy a különböző sejtekben lévő antigéneket specifikus antitestek segítségével felismerjük és egy festékanyaggal láthatóvá tegyük. Amíg a direkt immunfluoreszcens vizsgálatnál a specifikus primer antitest maga van festékanyaggal kapcsolva, addig az indirekt immunfluoreszcens vizsgálat esetében két antitestet használunk: a primer antitest specifikusan kötődik az antigénhez, a szekunder antitest, ami fluoreszcens festékanyaggal kötött, felismeri a primer antitestet. Mivel a szekunder antitest számos molekulája képes felismerni a primer antitestet, ezért az indirekt immuncitokémia specifikus és szenzitív reakció.

8.2.2.2 A transznasalis kefebiopszia kivitelezése A légzőhám epithelsejtjeit transznasalis kefebiopsziával nyertük, tárgylemezre vittük fel és beszárítottuk. A kefebiopsziához ORIBRUSH, cell collector with protective tip cervixkefét használtunk (product number B001, Orifice Medical AB, Aktergatan 2 SE271 53 Ystad, Svédország). Egy 15 ml nagyságú Falcon csövet megtöltöttünk sejtmédiummal (RPMI1640). A beteget megkértük, hogy fújja ki az orrát. A beteg egy széken ült úgy, hogy a fejét a falhoz támasztotta, hogy a mintavétel közben a fejét ne tudja elmozdítani. Megkértük, 43

Módszerek hogy a mintavétel közben az egyik kezével tartsa a sejtmédiummal megtöltött csövet, ami megakadályozza, hogy a kezét az arca elé emelje. A 0,9%-os NaCl oldattal megnedvesített kefét óvatosan az orrba vezettük úgy, hogy a kefe az alsó orrkagylóba jusson. A mintavétel közben a kefét ujjaink között óvatosan forgatjuk, hogy a légzőhámról minél több sejtet nyerhessünk. Az egész mintavételi folyamat néhány másodpercig tart. Az eltávolított epithelsejteket az előkésziített sejtmédiumba mossuk.

8.2.2.3 A tárgylemezek előkészítése Felületkezeléstől mentes tárgylemezeket használtunk. A kefét a mintavétel után az előkészített sejttenyésztő médiummal megtöltött Falcon csőbe helyeztük és lazán megmozgattuk benne, hogy a sejtek homogén eloszlását elősegítsük. Ezt követően a kefe segítségével a sejteket tartalmazó oldatokból 2-3 cseppet vittünk fel a tárgylemezre. Ezt a folyamatot addig ismételjük, amíg az oldat el nem fogyott. Ezzel a módszerrel egy vizsgálati anyagból kb. 20-25 tárgylemezt tudunk preparálni. A preparátumokat levegőn megszárítottuk és további felhasználásig -20C/-80C-on tároltuk.

8.2.2.4 Az immuncitokémiai vizsgálat kivitelezése A tárgylemezen lévő megszárított sejteket egy speciális viasz toll (pap pen) segítségével körberajzoljuk. Ez az eljárás megakadályozza a továbbiakban, hogy a festéshez felhasznált antitestoldat lefolyjon a tárgylemezről és ezáltal egyúttal a lehető legkevesebb antitestoldatot lehet felhasználni a festés során. A festendő sejteket 10 percig 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk, majd 3x3 percig PBS-sel mostuk. Két perces 0,2%-os Triton-X 100-al történő kezelés után a tárgylemezeket 4 °C-on 1%-os sovány tejporoldatban egy éjszakán át inkubáltuk. A következő napon a sejteket primer antitesttel (1%-os sovány tejporoldatban oldva) 5 órát szobahőmérsékleten kezeltük. Majd a háromszori PBS-ben történő mosás után 30 percig a szekunder antitesttel szobahőmérsékleten inkubáltuk. Alapos mosás után (PBS) a sejtmagokat Hoechst 33342-vel (Sigma, Németország) festettük (1:1000 oldat H2O-ban). Végül a

44

Módszerek preparátumokat fedőlemez és egy csepp Faramount Mounting Medium (Dako) segítségével lefedtük. A preparátumok vizsgálatához Zeiss Axiovert 200 LSM 510iUV lézer scanning mikroszkópot használtunk, a konfokális felvételek kielemzése az LSM szoftver segítségével történt.

8.3 In silico módszerek 8.3.1 A humán DNAL1 és a murin orthológ Dnal1 gének azonosítása A gének identifikálása in silico klónozási stratégiák felhasználásával történt. Kiindulási génként

a

Chlamydomonas

LC1

génjét

használtuk.

Az

NCBI

(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) honlapjának BLAST programjával a humán EST adatbankban összehasonlító elemzést végeztünk. A Chlamydomonas LC1 proteinjének aminosavsorrendjét (AAD41040) felhasználva a humán adatbázisból azokat a humán proteineket választottuk ki, amelyek az LC1-gyel legnagyobb hasonlóságot mutattak. Ezzel a módszerrel megállapítást nyert, hogy a Chlamydomonas LC1 proteinjéhez leghasonlóbb humán klón az AA975229 klón, ami a humán DNAL1 gén teljes kódoló szakaszát tartalmazza az első exon kivételével. A feltételezett 1. exont és az 5’ UTR régiót a genomikus BLAST és a TWOBLAST segítségével találtuk meg. Az AA975229 EST klón vizsgálata közben kiderült, hogy a DNAL1 gén a 14-es kromoszómán található. A 14-es humán kromoszóma megfelelő régióját, a Chlamydomonas LC1 cDNS szekvenciájával (AF112476) fedésbe hozva megkaptuk a humán DNAL1 gén feltételezett 1. exonját és 5’ UTR régióját. A humán kromoszómák egyes szakaszai különböző PAC klónokban találhatók (15. ábra), amelyek segítségével a humán genom projektben a teljes emberi genom feltérképezhető volt. Az általunk felhasznált PAC klónok (AC005225 és az AC006146) a 14-es kromoszóma egy szakaszát fedik le. Miután a gén lokalizációját meghatároztuk, a humán genomikus és cDNS szekvencia egymásravetítésével megállapítottuk a gén feltételezett exon-intron szerkezetét. Ezen kívül a DNAL1 gén 5’ végét beleértve az 5’UTR-t, az 1,2,3-as exonokat, 5’ RACE rendszer felhasználásával identifikáltuk. Testis cDNS könyvtárat (Marathon-Ready cDNA, BD Biosciences Clontech, Heidelberg, Németország) felhasználva génspecifikus reverse primerek segítségével a DNAL1 gén 5’ végét amplifikáltuk. A nested 45

Módszerek amplifikációt (Marathon cDNA Amplification kit, Clontech) a gyári leírásnak megfelelően a következő reverse primerekkel végeztük: GSP_h: 5’-TCT CGC AAT TAG CAA GCA TGG AAG G-3’ és a nGSP_h 5’-CAT CTT CTC TAT AGG GGG AAT CTG G-3’. A kapott 250 bp hosszú PCR terméket gélextrakcióval izoláltuk és megszekvenáltuk. A DNAL1 gén így teljes cDNS szekvenciáját az AF542071 accession number alatt a GeneBankban regisztráltattuk. Az egér orthológ gén identifikálásához is a fent részletezett stratégiát alkalmaztuk. Az egér cDNS klónjának (BG916281) és a genomikus szekvenciát tartalmazó BAC klónjának (AC125071) egymásravetítésével identifikáltuk az egér Dnali1 gént. Az 5’ RACE PCR reakcióhoz egér vese cDNS könyvtárat (Clontech) használtunk templátként. A felhasznált primer szekvenciák a következők voltak: GSP_m 5’-TCC TCA AGT TTT TTA GGC CAT TCA GGT TGG3’ és nGSP_m 5’-ACA GAG AAA GCT TCT CGC AGT TAC C-3’.

8.3.2 In silico protein analízis A proteinek összehasonlító elemzéséhez az European Bioinformatics Institute ClustalW programját használtuk. Az összehasonlított szekvenciák a humán DNAL1, az egér Dnali1 és a Chlamydomonas LC1 proteineken kívül más spécieszek putatív orthológ fehérjéi voltak. A Chlamydomonas LC1 publikált háromdimenziós szerkezetét alapul véve a DNAL1 szerkezetét a DALI szerver (www.ebi.ac.uk/dali/) és a protein adatbank (www.rcsb.org/pdb/) segítségével határoztuk meg. A képek 3 dimenziós megjelenítése a MOLMOL program segítségével történt.

8.3.3 Online adatbankok és programok BLAST

www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

Conserved Domain Dtbs

www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi

ePCR

www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/sts/epcr.cgi

Genscan

genome.dkfz-heidelberg.de/cgibin/genscan/genscan.cgi

HomoloGene

www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/

OMIM

www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim

TBLASTN

www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

TWOBLAST

www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html 46

Módszerek Unigene

www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/

NCBI-Homepage

www.ncbi.nlm.nih.gov/

Ensembl

www.ensembl.org/

Human/Mouse Hom.-Maps

www.ncbi.nlm.nih.gov/Homology/

BCM Search Launcher

dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/seq-util/sequtil.html

Chromas

www.technelysium.com.au/chromas.html

Cn3D

www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn 3d.shtml

Primer3

zeon.well.ox.ac.uk/git-bin/primer3_www.cgi

Tm Determination

alces.med.umn.edu/rawtm.html

8.4 Northern blot A blot kivitelezéséhez a humán multiple tissue Northern blot rendszert (Clontech) használtuk, szondaként a humán cDNS klónból (AA975229) származó 800 bp hosszú NotI-EcoRI fragmentet alkalmaztuk. A hibridizáció 60°C-on egy éjszakán át Church pufferben (500 mM foszfát puffer pH 7,2, 7% SDS (w/v), 1 mM EDTA 100 μg/ml lazac spermiumból származó DNS hozzáadásával) történt. A DNAL1 specifikus próbát radioaktív α-32P-dCTP-vel jelöltük a Megaprime DNA labeling kit (Amersham, Freiburg, Németország) segítségével. A filtert 2x5 percig mostuk szobahőmérsékleten 2xSSC/0,1% SDS-el és 2x 10 percig 55°C-on 0,2xSSC/0,1%SDS-sel. A röntgenfilmre (X-OMAT AR, Kodak, Stuttgart, Németország) történő előhívás intensifying screen reagens (Cronex, DuPont, Bad Homburg, Németország) jelenlétében –70°C-on történt.

8.5 In situ hibridizáció Az 1,39 kb hosszú, digoxigeninnel jelzett antisens ribopróbát a BG916281 egér EST klónból állítottuk elő. Egész egérembrió és a kifejlett állat metszeteit használtuk fel az in situ hibridizáció során. A színreakciót 4 napig végeztük, hogy az embrionális csomóban lévő gyenge expresszió is láthatóvá váljon. A preparátumokat 80%-os glicerinben fixáltuk és Leica M420 fotomikroszkóppal illetve Nomarski optikával felszerelt Fujix digitális kamerát (HC300Z) használó Zeiss Axioplan mikroszkóppal fényképeztük. 47

Módszerek

8.6 Western blot analízis A Western blot analízis a különféle proteinek specifikus kimutatására szolgál. Ezzel a módszerrel a fehérjéket, amelyeket előzőleg gélelektroforézis segítségével egymástól elválasztunk,

elektromos

feszültség

hatására

nitrocellulóz

membránra

vagy

polyvinilidendifluorid (PVDF) membránra visszük. Ezután a membránt a keresett fehérjére specifikus antitesttel inkubáljuk. Az antitestkötődés egy radioaktívan jelzett vagy enzimkapcsolt szekunder antitest felhasználásával detektálható. A használt antitestek (DNAH5, DNALI1, GFP) specificitásának kimutatásához Western blot analízist használtunk. A Western blothoz felhasznált fehérje izolátumot sertés tracheából preparáltuk.

8.6.1 Dynein extrakció sertés tracheából Hastie szerint [29, 83] A tracheáról eltávolítottuk a felesleges kötő-és zsírszövetet, majd 3-4 darabra vágjuk. A trachea darabokat 2x50 ml 0,9%-os NaCl oldattal átmostuk, hogy a véres szennyeződést eltávolítsuk, ügyelve arra, hogy a trachea belső, epithel rétegét meg ne rongáljuk. A trachea belső felszínéről egy cervicalis kefe segítségével az epithelt eltávolítottuk. Egy 50 ml-es Falcon csövet megtöltöttünk extrakcióspufferrel és a kefét ebben lemostuk. A műveletet 10-15x megismételtük. Aztán hozzáadtunk 0,4 ml 1 M CaCl2-ot és a lezárt csövet 30 másodpercig erősen ráztuk. A szuszpenziót egy 250 ml-es centrifugacsőbe átöntöttük és a már felhasznált tracheadarabokat 35 ml extrakcióspufferrel lemostuk úgy, hogy a lefolyó oldatot egy edényben gyűjtöttük. A két folyadékot összekevertük és 2000g-vel 2 percig 4° C-on centrifugáltuk. A felülúszót egy tiszta csőbe töltöttük és 5 percig 12000g-vel 4 °C-on lecentrifugáltuk. Az üledék tartalmazza a csillókat, amit 2 ml reszuszpenziós pufferben feloldottunk és 2 db 2 ml-es centifugacsőbe elosztottunk. További 2 ml pufferrel kimostuk az üledéket tartalmazó csövet és a 2 ml-es csövekbe elosztottuk. A szuszpenziót lecentrifugáltuk (12000g, 4 °C, 1,5 perc), a felülúszót leöntöttük és az üledéket reszuszpendáltuk. A következő centrifugálási lépés után (2000g, 4 °C, 1,5 perc) a felülúszót még egyszer centrifugáltuk (12000g, 4 °C, 1,5 perc). Az üledéket 2 ml reszuszpenziós pufferben feloldottuk. Az axonema membránját és a belső mátrixát Triton-X 100-al távolítottuk el. 48

Módszerek Lecentrifugáltuk (12000 g, 4 C, 3 perc) és felülúszót leöntöttük. Az üledéket 0,4 ml 0,5 % Triton-X 100-at tartalmazó reszuszpenziós pufferben feloldottuk. 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk és lecentrifugáltuk (12000g, 4 °C, 5 perc). A felülúszó tartalmazza a membránfrakciót és a mátrixot, az üledék az axonemát. Az üledéket 0,5 ml reszuszpenziós pufferben feloldottuk. Az így előkészített minta felhasználható a gélelektroforézishez és a Western blothoz.

8.6.2 A Western blot kivitelezése Az elektroforetikus proteinszeparáláshoz és a protein transzferhez a NuPAGE Bis-Tris System-et továbbá Tris-Acetat System-et

használtunk

(Invitrogen,

Karlsruhe,

Németország). Az elektroforéziskamrát a gélek (NuPAGE 4-12% Bis-Tris gél, 3-7% Tris-Acetat gél) behelyezése után 1x elektroforézispufferrel (1x MOPS) feltöltöttük és a fésűt óvatosan eltávolítottuk. A keletkezett buborékokat pipetta segítségével leszívtuk. A gélzsebekből az akrilamidmaradványokat elektroforézispufferrel kimostuk. A proteinizolátumokat 4xLDS pufferrel elegyítettük, centrifugáltuk és 10 percig 70 °C-on inkubáltuk. A próbákat a gélre való felvitel előtt újból lecentrifugáltuk és egy előszínezett molekulasúlystandarddal (Seeblue, Invitrogen, Németország) együtt felvittük a gélre és 150-200V-nál 1-2 órát futtattuk. Az elektroforetikus szeparálás után az axonemális proteinizolátumot egy PVDF memránra blottoltuk. A membránt előzőleg metanolba áztattuk és aztán a szükséges filterpapírral és blottoló szivacsokkal együtt 10 percig a transzferpufferben ekvilibráltuk. A blotrendszert az anód oldaláról nézve a következő módon állítottuk össze: blottoló szivacs, filterpapír, gél, PVDF membrán, filterpapír, blottoló szivacs. A membrán és a gél közötti buborékokat egy pipettával óvatosan eltávolítottuk. Az elektroforéziskamrát transzferpufferrel feltöltöttük, hűtés alatt 30 V-nál 5 órát blottoltuk. A transzfer után a felhasznált gélt Coomasie-oldatban 1 órán át inkubáltuk, hogy a sikeres transzferről meggyőződjünk. A blot után a PVDF membránt egy éjszakán át 4 °C-on 5%-os tejporoldatban (TBSTben oldva) és másnap 5 órán át szobahőn a primer antitesttel (5%-os tejporoldat TBSTben oldva) inkubáltuk. A membránt 2x5 majd 2x20 percig TBST-vel mostuk és ezt követően hozzáadtuk a szekunder antitestet (5%-os tejporoldat TBST-ben oldva, 1 óra, 49

Módszerek szobahő). A membrán mosása után az antitestek specificitását az ECL Plus reagens (Amersham, Freiburg, Németország) felhasználásával mutattuk ki. Az előhíváshoz XOMAT-AR (Kodak, Stuttgart, Németország) filmet 15 másodpercre, 1, 3 és 5 percre helyeztük a membránra.

8.7 Koimmunoprecipitáció A humán full length cDNS klón előállításához pEGFPc2 (Clontech) vektort használtunk, amelybe a DNAL1 teljes kódoló szekvenciáját az EGFP C terminális végéhez klónoztuk. A GFP proteint kb.10 évvel ezelőtt izolálták a mediterrán tengerben élő egyik medúza fajból. A GFP érdekessége, hogy fluoreszcens fényben zölden világít. Ezt a tulajdonságát kihasználva olyan expressziós vektorokat konstruáltak, amelyek a GFP kódoló cDNS szakaszát tartalmazzák. Ez lehetőséget ad különféle fúziós proteinek előállítására, majd a fúziós protein funkciójának, celluláris elhelyezkedésének vizsgálatára. Széles körben alkalmazzák újabban az in vivo sejtbiológiában, mert a fúziós konstruktot tartalmazó vektort élő, eukarióta sejtekbe lehet juttatni. A sejtek transzlációs apparátusát felhasználva megtörténik a fúziós protein expresszálódása. Az élő sejteket fluoreszcens mikroszkóppal vizsgálva információkhoz juthatunk a célfehérje subcelluláris lokalizációjáról, funkciójáról, vándorlásáról stb. A GFP proteinek másik nagy előnye, hogy az állatvilágban kizárólag medúzafajban fordulnak elő, szerkezetük nem tartalmaz más proteinekkel homológ doméneket. Ezáltal a GFP protein ellen előállított antitest specifikus módon kizárólag a GFP-t ismeri fel. Ezt a tulajdonságot használtuk fel a DNAL1 fúziós proteinünk kimutatásában. A vizsgálatok során kontrollként az üres pEGFPc2 vektort használtuk. HEK293T sejteket tranziens módon, kalciumfoszfát koprecipitáció alkalmazásával transzfektáltunk felhasználva a pEGFPc2 és a DNAL1-pEGFPc2 plazmidokat. A sejteket a transzfektálástól számított 24 óra múlva lizáltuk NP40 lízispuffer felhasználásával. A kontroll és a vizsgált sejtcsoport proteinexpressiós szintjét Western blottal ellenőriztük. A néhézláncú dyneinproteineket sertés trachea sejtjeiből a korábban publikált módszer szerint izoláltuk. A sejtlizátumot és a protein izolátumot összekevertük és egy éjszakán át 4°C-on folyamatos mozgatás mellett inkubáltuk. Az immunoprecipitációhoz a Protein G Immunprecipitation Kit-et (Sigma, Taufkirchen, Németország) és a nyúl anti-GFP 50

Módszerek antitestet (Clontech) a gyári leírást követve használtuk. A precipitált terméket 4-12%-os Bis-Tris gélen (Invitrigen, Karlsruhe, Németország) nagyság szerint elválasztottuk és PVDF membránra blottoltuk (Amersham, Freiburg, Németország). A membránt 5 órán át szobahőn 1:1000-en hígított rabbit-anti DNAH5 antitesttel inkubáltuk, majd a membrán többszöri TBS-T-ben történt mosása után 1:2500-en hígított HRP-konjugált anti-rabbit szekunder antitestet alkalmaztunk (Santa Cruz, Heidelberg, Németország). A sávok láthatóvá tételéhez ECL plus kit-et (Amersham, Freiburg, Németország) használtunk.

8.8 Genomikus DNS izolálása A DNS izoláláshoz 10-20 ml heparinnal kezelt vért használtunk. A DNS konzerválás érdekében a vér egy részéből származó lymphocytákat Epstein-Barr vírussal infektáltuk és tenyésztettük. A vér másik felét használtuk direkt DNS izolálásra. A DNS-extrakciót Qiagen csövek (Qiagen, Hilden, Németország) segítségével, a gyártó leírásának megfelelően végeztük. Ez a módszer lehetővé teszi, hogy a vérből 50-140 kb fragmenthosszúságú DNS szakaszokat izoláljunk. A Qiagen-Midi-Praep csövek kapacitása 1-5 ml, vagyis ekkora volumenű vér feldolgozására alkalmasak. 5 ml vért elegyítettünk 5 ml 4 °C-os C1 pufferrel és 15 ml desztillált vízzel egy 50 ml-es Falcon csőben. Az elegyet óvatosan összekevertük és 10 percig jégen inkubáltuk. Ezt követően a lizált vért 4 °C-on 15 percig 1300 g-vel lecentrifugáltuk, a felülúszót leöntöttük. Az üledéket 1ml C1 puffer és 3 ml desztillált víz elegyében reszuszpendáltuk, majd egy további centrifugálás után (4 C, 1300g, 15 perc) a felülúszót leöntöttük. A keletkezett sejtüledékethez 5 ml G2 puffert adtunk és 30 s-ig alaposan vortexeltük. 95 μl Proteináz K hozzáadása után 50 °C-os fürdőben 60 percig inkubáltuk. A további mag- és proteinmaradványokat hosszabb inkubálással vagy centrifugálással (4°C, 5000g, 10 perc) lehet eltávolítani. A Qiagen filteres csövet egy 50 ml-es Falcon csőbe helyeztük és 4 ml QBT pufferrel ekvilibráltuk. Ezt követően az előkészített próba 5 ml-ét a Qiagen csőbe pipettáztuk. A DNS a csőmátrixhoz kötődik, és további mosási lépéseket (2x7,5 ml QC puffer) követően a DNS-t 5 ml QF pufferrel eluáltuk. 3,5 ml izopropanol hozzáadásával a DNSt precipitáltuk majd 15 percig 5000g-vel 4°C-on centrifugáltuk. A felülúszót leöntve az 51

Módszerek üledéket 2 ml 70 %-os etanollal mostuk és újra centrifugáltuk (10 perc, 5000g, 4°C). A fennmaradó

üledéket

száradás

után

1-2

ml

TrisHCl-lel

(10mM,

pH

8,5)

reszuszpendáltuk.

8.8.1 A DNS tisztaságának és koncentrációjának meghatározása A DNS tisztaságát és koncentrációját fotométer (Amersham, Freiburg, Németország) segítségével határoztuk meg. A koncentrációméréshez 10 μl DNS oldatot 90 μl desztillált vízzel elegyítettünk (10-szeres hígítás). 50 μg/ml duplaszálú DNS abszorpciója OD 260-nál (optikai denzitás 260 nm hullámhosszon) 1-nek felel meg. A koncentrációszámítást a következő formula alapján számítottuk ki: DNS koncentráció (μg/ml)= mért optikai denzitás (260 nm-en) x 50 x hígítási faktorral. Az OD260/OD280 hányadosa mutatja meg a DNS tisztaságának mértékét. Tisztának nevezzük a DNS-t, ha ez az érték 1,8 és 2 közé esik. Az alacsonyabb érték fehérjével történő szennyeződésre utal.

8.9 PCR 8.9.1 A PCR elve A polimeráz láncreakció segítségével in vitro módszerrel lehetőségünk van DNS fragmentek sokszorosítására. A reakció során két egyszálú oligonukleotidot, un. primert használunk. A DNS polimeráz a mindenkori primertől 5’-3’ irányba megszintetizálja a komplementer szálat és ezáltal új duplaszálú DNS jön létre. Az újonnan szintetizált duplaszálú DNS-t denaturálás során egyszálú DNS-sé alakítjuk, ami lehetővé teszi a primerek újbóli kötődését a szálhoz és megkezdődhet a DNS szintetizálás újabb lépése. A reakcióciklus 3 lépésből áll: DNS denaturálás, primerek kötődése az egyszálú DNShez, és DNS szintézis. Ennek során a reakció kezdetén jelen lévő DNS mennyisége exponenciálisan megnövekszik. A PCR reakcióhoz olyan hőstabil enzimet használunk, amelyet egy termofil baktériumból (Thermus aqaticus) nyertek ki, ami lehetővé teszi a reakció lefolytatását anélkül, hogy a folyamat során az enzimet pótolni kellene. A reakció 3 része:

52

Módszerek Először a DNS-t 94°C-on denaturáljuk, ezáltal egyszálú DNS keletkezik. Ez azért szükséges, hogy a primerek a DNS-hez tudjanak kötődni. Ez olyan hőmérsékleten történik, ami a felhasznált primer GC tartalmától és hosszától függ. Ezt követi az elongáció 72°C-on, aminek időtartama az amplifikálandó szekvencia hosszától függ. Ezt a ciklust 25-35-ször ismételjük, ami a DNS mennyiségének exponenciális növekedéséhez vezet.

8.9.2 Primer tervezés A DNAL1 exon-intron struktúráját a gén cDNS-ének (AF542071) és a genomikus szekvenciájának (AC005225 és az AC006146) egymásravetítésével határoztuk meg. A primereket úgy terveztük meg, hogy a mindenkori exon és az exon/intron határ amplifikálható legyen. A primertervezésnél figyelembevettük, hogy a primerek hossza 19-24 bp közé essen, GC tartalmuk 50-60% legyen, továbbá az összetartozó párok annealing hőmérséklete hasonló legyen. A megtervezett primereket az SH Oligo cégnél szintetizáltattuk. A liofilizált primereket 10μM-osra H2O-val hígítottuk és felhasználásig –20 °C-on tároltuk. A PCR reakció optimális feltételeit minden egyes primerpárnál külön állítottuk be (2. táblázat).

exonok 1.exon 2.exon 3.exon 4.exon 5.exon 6.exon 7.exon 8.exon

forward primer

reverse primer

5'-TAC TCC TGT GCG GGG TTA AG-3' 5`-CCA AGG CTA ATA GTT ATT GCT TG-3` 5`-CTG GCC TCT TTT GTT TCC AC-3` 5`-ACC ATA TTG CCC TCA AGA AG-3` 5`-CCA GCA ATT TAA GAC CAT GTG-3` 5`-GAC AGG CAG GGT CTA AGT TCA C-3` 5`-CAC CCG GCC AAA ACT TAG TG-3` 5`-ATA GTA TCT CAG AGC TTC TCA GG-3`

5`-ACC CTT TTC CAC TCC CAA TC-3` 5`-TCA TGC ATC CAC CAC CAT AG-3` 5`-TGT TTG ACC TTG CCA AAG AG-3` 5`-CAA CAA GTA TGG CTA AAA CAG GTG-3` 5`-GTG GGA GTA CAG GTT GTT GC-3` 5`-TTT GCA TCT TTT CCC TCT CG-3` 5`-CTC CTC TTC ATG ATT CCA TGC-3` 5`-AGG TTG GCA TTA CCA GTT TTG-3`

2. táblázat DNAL1 exonjai, primerjei 53

amplikon nagysága

Hőm

279 bp

61°C

614 bp

60°C

322 bp

61°C

287 bp

60°C

501 bp

60°C

314 bp

60°C

271 bp

60°C

624 bp

60°C

Módszerek

8.9.3 A PCR kivitelezése A PCR reakcióhoz 50 μl végtérfogatban 1,5 Unit polimeráz enzimet (Taq Polymerase, Eppendorf, Hamburg), 30 ng DNS-t, 50 pmol-t mindkét primerből (0,3μΜ), 40 μΜ dNTP mixet, 1x PCR puffert (1,5 mM MgCl2) és steril desztillált vizet használtunk fel. Az 1. exon amplifikálásához ezen összetevőkön kívül Q-Solutiont (Qiagen, Hilden, Németország) is használtunk. A PCR reakciót az MJ Research PCR gépében futtattuk. A 4 perces 94 °C-os denaturálást követően 32 ciklust futtattunk a következő lépésekből: 94 °C 30 s, 30 s annealing (exon1, exon3: 58°C, exon 2, 4, 5, 6, 7, 8: 61°C), 72°C 1 percig. Végül a mintákat 10 percig 72 °C-on inkubáltuk, hogy a polimeráz enzim által megkezdett szintézis befejeződjön. Minden egyes PCR reakciót negatív kontrollokkal végeztünk. A reakcióelegyet DNS hozzáadása nélkül futtattuk mintáinkal együtt, ami egyben a felhasznált alkotóelemek kontamináció kontrollját is jelentette.

8.10 Agaróz gélelektroforézis 8.10.1 Az agaróz gélelektroforézis elve A DNS molekulák agaróz gélelektroforézis segítségével nagyság szerint elválaszthatók, ahol azt az elvet használjuk ki, hogy a molekulák vándorlási sebessége a molekulasúlyuk logaritmusával fordítottan arányos. Elektroforézis használható a PCR termékek nagyságának, az izolált DNS fragmentumok, az emésztett DNS szakaszok hosszának meghatározására.

8.10.2 Az agaróz gélelektroforézis kivitelezése Az PCR termékek elektroforetikus elválasztása 1% illetve 2%-os (térfogatszázalék) agaróz gélen történt. A gélek előállításához megfelelő mennyiségű agarózt 1xTBE pufferben oldottunk és mikrohullámú sütőben az agaróz teljes felolvadásáig főztük, majd lehűlés után (mg/ml) etidiumbromidot adtunk a gélhez. A gél 1xTBE-vel megtöltött elektroforézis kamrába helyeztük. A mintákat a felvitel előtt 1/6 térfogatnyi 6x loading pufferrel elegyítettük és a gél zsebeibe pipettáztuk. Az analitikus gélek esetében a felvitt mintatérfogat 5-20 μl, a preparatív gélek esetében 100-200 μl volt. 54

Módszerek Fragmentméret standardként 100 bp-os molekulasúlystandardot (Fermentas) 10 μl-jét (250 ng) használtunk. Az elektroforézist állandó feszültség mellett (110 V 20x20-as gélek esetében) 60 percig futtattuk. Az etidiumbromid a DNS-hez kötődik és UV besugárzás hatására fluoreszkál. Ezt az elvet lehet kihasználni a detektálásban. 265 nmes hullámhosszú fényben a DNS sávok láthatóvá tehetők és egy video dokumentációs rendszerrel (Vilber Lourmant, BioCapt V97) digitális kép rögzíthető.

8.11 DNS szekvenálás 8.11.1 A PCR termékek tisztítása A PCR termékek tisztítása a Qiaquick PCR Purification kittel történt. Ez a kit alkalmas arra, hogy a PCR reakció során fel nem használt alkotóelemeket (pl: primer-, nukleotid-, polimeráz maradékot) a mintából eltávolítsuk. A tisztítást szobahőmérsékleten végeztük, a centrifugálási lépésekhez asztali centrifugát használtunk. 45 μl PCR terméket 225 μl PB pufferrel elegyítünk és 1 percig szobahőn inkubáljuk. Ezt követően a mintákat a Qiagen csövekbe pipettázzuk, és 2 percig 13000 rpm-en centrifugáljuk, minek következtében a PCR termék a cső mátrixához kötődik. 750 μl PE pufferrel történő mosás után a PCR terméket 30-50 μl EB pufferrel vagy H2O-val (plazmidok esetében) eluáljuk.

8.11.2 A szekvenálás elve Az enzimatikus DNS szekvenálás lehetővé teszi, hogy rövidebb DNS szakaszok bázissorrendjét megismerjük. Ehhez az egyszálú DNS-t mintául felhasználva megfelelő mennyiségű komplementer DNS szálat szintetizálunk. A reakcióhoz adott didezoxi formában jelenlévő nukleotidok beépülése után a szintézise közben a lánc megtörik [92]. Ez a folyamat különböző hosszúságú DNS fragmentumokat eredményez. Kapilláris szekvenátor segítségével ezeket a DNS szakaszokat egymástól méret szerint elválasztjuk. A négy didezoxinukleotid ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP fluoreszcens festékanyaggal jelölt. A nagyság szerint elválasztott DNS szakaszok fluoreszcens jeleit lézersugárral detektáljuk. A fluoreszcens szignálokat a számítógép szekvencia adatokká alakítja. 55

Módszerek

8.11.3 A szekvenálás kivitelezése A szekvenálási reakcióhoz Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit-et használtunk, ami egy speciális DNA polimerázt tartalmaz (AmpliTaq DNS polimeráz). A tisztított PCR termékeket két irányból, külön az F és külön az R primerekkel megszekvenáltuk. Ez 600 bp-nál hosszabb DNS fragmentek esetében elengedhetetlen, mert a szekvenálás során egy irányból maximálisan kb. 600-700 bp olvasható megfelelő minőségben. A reakció kivitelezéséhez a következő protokollt alkalmaztuk (20 μl végtérfogatban): 4-14 μl

tisztított PCR termék

2 μl

primer (10 pmol/μl)

4 μl

BigDye mix dH2O ad 20 μl

Az így előkészített mintát a MJ Research PTC 200 PCR gépben a következő programmal futtattuk: lépés: 96°C 2 min lépés: 96°C 30 sec lépés: 50°C 15 sec

25 ciklus

lépés: 60°C 4 min A kapilláris módszerű szekvenálást követően a kapott szekvenciák nagy részét a Codoncode programmal, a problémás szekvenciákat egyesével az NCBI TWOBLAST programjával és a Chromas szoftverrel (www.technelysium.com) analizáltuk.

56

Eredmények

9 Eredmények 9.1 A humán DNAL1 és a murin Dnal1 gének izolálása 9.1.1 A génstruktúra meghatározása Az in silico klónozási stratégia felhasználásával meghatároztuk a humán (DNAL1) és a murin axonemalis könnyű lánc 1 (Dnal1) gének szerkezetét. A cDNS szekvencia meghatározását egyrészt számítógépes analízis, másrészt kísérletes módszerek felhasználásával sikerült identifikálni. A DNAL1 a 14q24.3 kromoszómán található, 49 kb nagyságú területet foglal el. A gén 8 exonból áll, minden exon-intron határ klasszikus hasítóhellyel rendelkezik az exonok 3’ és 5’ végét is beleértve (9. ábra).

9. ábra A humán axonemális könnyű lánc gén 1 (DNAL1) genetikai szerkezete A DNAL1 gén nyolc exonból áll, amelynek genomikus szekvenciája két PAC klónban (AC005225, AC006146) található. A gén a 14-es kromoszómán 49 kb nagyságú területet foglal el. Az ábrán az exonok valamint az intronok nagysága is fel van tüntetve.

A feltételezett start kodon előtt konszenzus Kozak szekvencia található. Az mRNS szekvencia hossza a start kodontól a stop kodonig 573 bp. A DNAL1 gén által kódolt aminosav szekvencia 190 aminosav hosszúságú. A humán DNAL1 protein szekvenciája 54%-ban identikus és 69%-ban homológ a Chlamydomonas LC1 gén termékével (10.ábra). 57

Eredmények

10. ábra Összehasonlító szekvenciavizsgálat Az összehasonlításhoz a humán DNAL1, a murin Dnal1 valamint az orthológ Chlamydomonas LC1 protein szekvenciákat használtuk. Más speciesek putatív szekvenciáit az NCBI BLAST programjának segítségével találtuk és az összehasonlításhoz felhasználtuk. A szürke háttérben lévő betűk az identikus vagy konzervált aminosavakat jelzik. Az LRR konszenzus szekvencia minden panel legalsó sorában látható. Az orthológ proteinek legnagyobb része nagymértékben konzervált. A Chlamydomonasban izolált γ-HC (DNAH5 orthológ) kötőhelyet nyilak, a p45 axonemális protein kötőhelyét jelzik. A felhasznált proteinek azonosító számai: Homo sapiens AF542071, Mus musculus BAB24259, Chlamydomonas reinhardtii AAD41040, Xenopus laevis AAH82218, Danio rerio NP_001003442, Drosophila melanogaster NP_610483 (saját eredmény).

58

Eredmények Az egér Dnal1 gén a 12 kromoszómán, 25 kb nagyságú területen található. A humán DNAL1-hez hasonlóan 8 exonból áll, viszont a hosszabb 3’ UTR régió miatt a transzkriptum 1,6 kb nagyságú (11. ábra). Az 570 bp-ból álló ORF 190 aminosavat kódol. A Dnal1 által kódolt murin fehérje 93%-ban identikus és 97%-ban homológ az általunk izolált humán DNAL1 proteinnel. A humán, egér és Chlamydomonas fehérjék valamint más speciesek putatív orthológ fehérjéinek nagyfokú homológiája azt mutatja, hogy ezen protein funkciója a magasabb evolúcionális szinteken lévő szervezetek motilis sejtjeiben erősen konzervált.

11. ábra A murin Dnal1 genetikai szerkezete A Dnal1 nyolc exonból áll, a genomikus szekvencia a AC 125071 azonosítószámú PAC klónban található. A gén az egér genom 12-es kromoszómáján található, 25 kb nagyságú területet foglalta el. A humán DNAL1 és a murin Dnal1 97%-os homológiát mutat, ami megmagyarázza, hogy a két gén exonjainak nagysága megegyezik.

9.1.2 A DNAL1 fehérjeszerkezetének elemzése Ahogy a 10. ábrán megfigyelhető, az LC1 és a DNAL1 aminosav szekvenciája néhány szakaszon eltérő. Ezek a területek a következők: N-terminális szakasz (12-33. aminosav), a protein C-terminális fele (153-170. aminosav, ahol 3 aminosav deléció is található), továbbá a C terminális régió (5 aminosav trunkáció). Ahhoz, hogy meg tudjuk állapítani, hogy ezek a szekvenciavariációk a protein sztérikus szerkezetében változást okoznak-e, megalkottuk a DNAL1 számítógépes 3 dimenziós szerkezetét 59

Eredmények (12.a ábra). A DNALI protein szerkezet analizáló program használatával a Chlamydomonas LC1 struktúrájára (12.b ábra) alapozva hoztuk létre a 12.b ábrán látható szerkezetet.

a

b

12. ábra Az axonemális könnyű lánc protein 1 háromdimenziós szerkezete Az a. ábrán a humán DNAL1 protein számítógéppel modellezett térbeli szerkezete, a b. ábrán a Chlamydomonas LC1 proteinjének krisztallográfiás adatokra alapozott térbeli szerkezete látható.

60

Eredmények

13. ábra Az egymásra vetített DNAL1 és LC1 térbeli struktúrája A sárgával jelzett DNAL1 és a kék LC1 egymásravetítésével bebizonyítható, hogy a két protein nagymértékben konzervált. Kis eltérések láthatók, amit a humán protein 7-es αhélixe és rövidebb C terminális régiója okoz.

A háromdimenziós szerkezetvizsgálatok eredménye azt mutatja, hogy a proteinek evolúcionálisan nagy mértékben konzerváltak (13. ábra). Csak finom eltéréseket lehet megfigyelni, amelyek a fehérjék tercier struktúrájára nem hatnak ki. A 3 aminosav deléció (153-155. aminosav) a DNAL1 protein C terminális felében található. A Chlamydomonas LC1 proteinje ezen szakaszon olyan szerkezetet ölt, amely a humán proteinben loop-ként jelenik meg. A humán könnyű lánc 1 C terminális α-hélixe rövidebb egy egységgel, ami az 5 aminosav deléciójának köszönhető. A legfontosabb tény, ami a háromdimenziós szerkezetvizsgálat alapján megállapítható, hogy a DNAL1 és az LC1 funkcionális doménje, amelyek a protein-protein közötti kölcsönhatásokat mediálják, evolúcionálisan nagy mértékben konzerváltak. A DNAL1 tartalmaz egy hidrofób szakaszt, amely valószínűleg a DNAH5 fehérjével történő kölcsönhatásban fontos szerepet játszik. Ez a terület a Chlamydomonas LC1 fehérjéjében is megfigyelhető. Mindkét protein ezen kívül rendelkezik egy olyan doménnel, amelynek külső felszíne töltéseket/poláris gyököket tartalmaz. Ez a domén töltése miatt dinamikus 61

Eredmények változásra képes és valószínűleg az eddig még nem karakterizált 45 kDa-os protein interakcióját mediálja [103]. Ezen tényekből kiindulva megállapítható, hogy a humán DNAL1 és a Chlamydomonas LC1 fehérje funkciói, beleértve a fizikális interakciókat is, evolúcionálisan konzerváltak.

9.1.3 A DNAL1 és a DNAH5 interakciója A humán DNAH5 a Chlamydomonas külső dyneinkarja γ-nehéz láncának humán homológja. Chlamydomonas-szal folytatott vizsgálatok leírták, hogy a γ-nehéz lánc és az LC1 könnyű lánc egymás interakciós partnerei. Vizsgálatunk során in vitro módszerekkel bebizonyítottuk, hogy a DNAL1 és a DNAH5 fehérjék ugyancsak egymáshoz kötődnek. A külön forrásból származó proteinek immunoprecipitációs vizsgálatát végeztük el. A klasszikus immunoprecipitációs módszer alkalmazásához szükséges, a két különböző fehérjét felismerő antitest előállítására nem volt módunk. Ez azzal magyarázható egyrészt, hogy az DNAL1 egy könnyű láncú fehérje, 190 aminosavból áll. Ilyen esetekben az állatok immunizálására az egész proteint fel kell használni. A DNAL1 esetében ez nem lehetséges, mert a fehérje a leucinban gazdag proteinek családjába tartozik és a családon belül lévő fehérjékkel nagy homológiát mutat. Ez a nagy homológia oda vezetne, hogy a DNAL1 ellen esetlegesen előállított antitest nem adna specifikus képet a fehérje celluláris lokalizációjáról, funkciójáról, mert az antitest a sejtben lévő más, leucinban gazdag fehérjékhez is kötődne. Ennek kiküszöbölésére egy DNAL1 fúziós proteint hoztunk létre. Ennek előnye, hogy a DNAL1-hez egy általánosan használt biológiai eredetű proteint, a GFP proteint kötöttük. A folyamat lényege, hogy a GFP proteint kódoló szekvenciát tartalmazó un. pEGFPc2 expressziós vektorba a DNAL1 teljes, azaz ATG-től stop kodonig tartó kódoló szekvenciáját klónoztuk. Ez azt eredményezte, hogy a transzláció során a GFP protein C terminális végén lévő DNAL1 fehérje együtt a GFP fehérjével íródott át. Ezáltal egy olyan fúziós protein jött létre, amelynek C terminalis végén a DNAL1, majd közvetlenül ehhez kapcsolódva a GFP protein található. A fúziós protein előállításához a DNAL1 cDNS teljes kódoló szekvenciáját a pEGFPc2 expressziós vektorba klónoztuk. Ezzel a plazmiddal HEK297T sejteket tranziens módon transzfektáltunk.

62

Eredmények

14. ábra Koimmunoprecipitációs vizsgálat A DNAL1 és a DNAH5 közötti kapcsolatot koimmunoprecipitációs vizsgálattal bizonyítottuk be. Az EGFP-DNAL1 fúziós proteint expresszáló HEK 293T sejtek lizátumát sertés trachea axonemális extraktumával kevertük, majd a DNAH5-DNAL1 protein komplexet anti-GFP antitesttel precipitáltuk. A detektálásra anti-DNAH5 antitestet használtunk. Az ábra felső felében a precipitátum ezüstfestése látható.

A vizsgálat kontrolljaként a HEK297T sejteket az üres pEGFPc2 vektorral is transzfektáltuk. Így a kontroll vizsgálatban a transzfektált sejtek számát 100%-ra véve meg tudtuk ítélni a transzfekció effekivitását a konstrukt esetében. Mindkét csoportba tartozó sejteket lizáltuk és protein elektroforézist futtattunk, hogy megállapítsuk a fehérjék mennyiségét. A DNAH5 proteint sertés trachea epithel sejtjeinek dynein izolátumából nyertük. Ezen eredmények alapján arra lehet következtetni, hogy a DNAL1 és a DNAH5 egymással fizikai interakcióban vannak. (14. ábra)

63

Eredmények

9.1.4 A DNAL1 expressziós vizsgálata Kísérleteink következő lépésében a Chlamydomonas LC1 humán orthológjának expresszióját vizsgáltuk. Ehhez olyan humán Nortern blottot használtunk, amely nyolcféle humán szövetet tartalmazott. Hibridizációs próbaként a DNAL1 cDNA-ének 546 bp hosszú szakaszát adtuk a különféle szöveteket tartalmazó blottjához. A specifikus transzkript kb. 0,9 kb nagyságú volt, amely megegyezik a DNAL1 cDNAének számított hosszával. A Northern blot kiértékelése során megállapítható volt, hogy a DNAL1-re specifikus csíkot kizálólag a testisben lehetett kimutatni (15. ábra). A blothoz felhasznált egyéb olyan szövetekben, amelyek nem hordoznak csillót, így a lépben, a thymusban, perifériás leukocytákban, a prostatában, az uterusban a DNAL1 expresszióját nem lehetett kimutatni Ez az eredmény megegyezik azzal a feltételezéssel, hogy az axonemális dynein könnyű lánc 1 protein a spermiumokban és a feltételezhetően egyéb motilis csillókkal rendelkező szövetekben expresszálódik és ott meghatározó szerepet játszik.

15. ábra A humán DNAL1 proteinexpressziós vizsgálata A humán DNAL1 Northern blot analízise mutatja, hogy a specifikus DNAL1 szignál a testisben detektálható, ami megfelel a spermium DNAL1 expressziójának. A DNAL1 nem detektálható a csillót nem hordozó sejtekben.

64

Eredmények

a

b

c

d 16. Ábra A Dnal1 in situ hibridizációs vizsgálata

In situ hibridizációs analízis segítségével demonstrálni tudtuk, hogy a Dnal1 specifikus expressziót mutat az aqueductus Sylvii ependymalis sejtjeiben (a), a légutak csillós epithelsejtjeiben (b,c). A korai gastrulációs fázisban lévő embrió vizsgálata mutatja, hogy a Dnal1 az emrionális csomó sejteiben is expresszálódik (d, nyíl)

Ez az eredmény megegyezik azzal a feltételezéssel, hogy az axonemális dynein könnyű lánc 1 protein a spermiumokban és a feltételezhetően egyéb motilis csillókkal rendelkező szövetekben expresszálódik és ott meghatározó szerepet játszik. Hogy ezt a feltételezésünket egy további módszerrel is alátámasszuk, egér embrió és kifejlett egér in situ hibridizációs vizsgálatát végeztük el. A vizsgálathoz gastrulációs állapotban lévő egér embriót (7,5 napos post coitum) és kifejlett felnőtt állat metszeteit Dnal1 szondával hibridizáltuk. A hibridizációs vizsgálat során megállapítást nyert, hogy az egér embrióban a legmagasabb expressziós szint a primitív csomó területén figyelhető meg (16. ábra).

65

Eredmények

9.1.5 A DNAL1 mutációanalízise PCD-ben szenvedő betegeknél A DNAL1 fentebb felsorolt szerkezeti és funkcionális szerepéből kiindulva úgy ítéltük meg, hogy a DNAL1 kiváló kandidáns gén a PCD-ben. A humán DNAH5 gén mutációi immotilis vagy dysmotilis csillóelváltozásokat okoznak PCD betegeknél. A mutáció következtében a fehérjében létrejött változások miatt az elektronmikroszkópos felvételeken külső dynein kar hiányt lehet diagnosztizálni. Feltételeztük, hogy a nem funkcióképes DNAL1 ugyancsak a csillók immotilitását vagy dysmotilitását hozza létre, azáltal, hogy a DNAH5-re gyakorolt szabályozó funkció károsodik. 86 PCD-ben szenvedő beteg DNAL1 mutácóanalízisét végeztük el. A gén 8 exonját, beleértve az exon-intron határokat is - amplifikáltuk klasszikus PCR felhasználásával. A próbák tisztítása után a termékeket megszekvenáltuk. Kontrollként 5 egészséges egyén DNS-ét használtuk a vizsgálatok során. A szekvenciaelemzés után megállapítást nyert, hogy a 86 beteg és az 5 egészséges kontroll a DNAL1 gén területén nem tartalmaz a normálistól eltérő szekvenciaváltozatot. Sem mutációt, sem nukleotid polimorfizmust nem tudtunk detektálni a mutációanalízisünk során.

9.2 Új diagnosztikai eljárás kifejlesztése primer ciliáris dyskinesiában PCD-ben a leggyakrabban diagnosztizált ultrastrukturális elváltozás a külső és/vagy a belső dynein karok hiánya. A differenciáldiagnosztikában a legnagyob problémát a szekunder ciliáris elváltozások elkülönítése jelenti. Célunk egy olyan új, genetikai alapokon nyugvó diagnosztikus eljárás kifejlesztése volt, amely lehetővé teszi a PCD gyors, nem invazív, biztos diagnózisát. Vizsgálatainkhoz

a

mintákat

transznasalis

kefebiopsziával

nyertük,

melynek

invazivitása alacsonyabb, mint a bronchoszkópos mintavételé. A külső dyenin kar elváltozások detektálásához a DNAH5 ellen előállított saját készítésű poliklonális antitestet használtuk. A DNALI1 elleni poliklonális antitestet Dr. Jürgen Neesen bocsátotta rendelkezésünkre, ami a belső dynein kar defektusok kimutatására szolgált.

66

Eredmények

9.2.1 Külső dynein kar marker kifejlesztése és tesztelése A külső dynein karok nagy multiprotein komplexek, amelyek felépítésében nehézláncok, közepesen nehéz láncok és könnyű láncok vesznek részt. Az irodalmi adatok azt mutatták, hogy az eddig ismert PCD gének közül a DNAH5 és a DNAI1 génekben sikerült PCD betegekben mutációt leírni. A DNAH5 és a DNAI1 mutációk azt okozzák, hogy az általuk kódolt fehérjék aminosav sorrendje korábban megszakad vagy az olvasókeret eltolódik és ennek következtében funkcióképtelen proteinek keletkeznek. Ez a folyamat vezet valószínűleg oda, hogy a DNAH5 mutációt hordozó betegek ultrastrukturális felvételein teljes külső dynein kar hiányt, a DNAI1 mutációt hordozó betegek esetében pedig részleges dynein kar hiányt lehet diagnosztizálni [66, 74, 28]. Ez a tény azzal magyarázható, hogy a DNAH5 és a DNAI1 gének termékei a külső dynein kart építik fel és a protein komplexben közvetlenül egymáshoz kapcsolódnak. Valószínűleg a DNAI1 mutációnak olyan hatása van, hogy az általa kódolt fehérje nem képes funkcióját ellátni és a külső dynein kar protein komplexének kialakításában nem tud részt venni. Ennek következtében a külső dynein kar szerkezete nem lesz teljes, amit az elektronmikroszkópos felvételen a külső dynein kar részleges hiányaként lehet látni.

ac. Tubulin

DNAH5

Merge

overlay

17. ábra Egészséges epithelsejtek immuncitokémiai vizsgálata anti-DNAH5 és antiacetilált tubulinnal A specifikus anti-DNAH5 festési minta (piros) a csillók teljes hosszában és a bazális test területén detektálható. A kettős festés során kontrollként felhasznált anti-acetilált tubulin antitest specifikusan kötődik az axonemát felépítő tubulusokhoz. A két antitest kolokalizációja bizonyítja, hogy a DNAH5 ugyancsak a csillót felépítő egyik struktúra. A mag festése Hoechst 33342-vel történt. Merge: az acetilált tubulinról és a DNAH5-ről készült felvétel egymásravetítése. Segítségével megállapítható, hogy a két protein kolokalizált-e. Overlay: A merge felvétel a fénymikroszkópos felvételre rávetítve. Esetünkben a tájékozódást segíti. 67

Eredmények Ezen kutatási eredmények alapján feltételezhető, hogy a DNAH5 vagy a DNAI1 ellen előállított antitest felhasználható arra, hogy a PCD betegeknél nem invazív módon nyert légzőhám csillós sejtjeiben immuncitokémiai vizsgálatot végezzünk. A DNAH5 elleni antitest felhasználása során alkalmazott immuncitokémiai festéssel megállapítható volt, hogy egészséges kontollok transznasalis biopsziával nyert epithel sejtjeiben a DNAH5 a csilló teljes hosszában és a citoplazmában a basális test területén mutatható ki. (17. ábra). A csillók kimutatásához anti-acetilált α-tubulint alkalmaztunk, azt kihasználva, hogy ez az antitest az axonemális tubulusokat felépítő tubulinhoz specifikusan kötődik. A kettős festéssel

jelzett

proteinek

subcelluláris

eloszlási

mintázatát

konfokális

immunfloreszcens mikroszkóppal határoztuk meg. Az antitest festési tulajdonságainak megállapításához egészséges egyének epithelsejtjeit használtuk. A vizsgálat során minden esetben transznasalis biopsziával csillós epithelsejteket nyertünk. A DNAH5 homozigóta mutációját hordozó betegek [48, 66] immuncitokémiai vizsgálatával kimutatható volt, hogy a DNAH5 protein a bazális test területén felhalmozódik továbbá a csillókban egyáltalán nem detektálható [21]. A fent említett mutáció a külső dynein kart felépítő nehéz lánc defektusához vezet, ami az elektronmikroszkópos képen izolált külső dynein kar hiányként látható. (18. ábra)

ac. Tubulin

DNAH5

Merge

overlay

18. ábra DNAH5 homozigóta mutációját hordozó beteg epithelsejtjeinek immuncitokémiai vizsgálata A kettős festés során kontrollként alkalmazott anti-acetilált α-tubulin (zöld) specifikusan festi a csillókat. A DNAH5 protein a bazális test területén halmozódott fel, azonban az axonemában DNAH5 fehérje jelenléte nem mutatható ki (piros). A két festési kép egymásravetítése során megállapítható, hogy a két protein a DNAH5 mutációt hordozó beteg epithelsejtjeiben nem kolokalizált. A mag megjelenítése Hoechst 33342- vet történt (kék). 68

Eredmények Bizonyított tény, hogy a DNAI1 kevert (compound) heterozigóta mutációjával rendelkező betegek elektronmikroszkópos eltérése ugyancsak külső dynein kar hiányként jelentkezik [74, 28]. A DNAI1 egy, a külső dynein kart felépítő közepesen nehéz láncot kódolja. A DNAH5 immuncitokémiai elemzése azt mutatta, hogy a DNAI1 mutációt hordozó betegek respiratórikus epithelsejtjeiben a DNAH5 protein a csillók distális felében detektálható, valamint a citoplasma bazális testjeinek területén felhalmozódott. (19. ábra)

9.2.2 Belső dynein kar marker kifejlesztése és tesztelése Bár a belső dynein kar defekusok nagyon gyakoriak PCD-ben szenvedő betegeknél, a belső dyenin kar felépítésére, transzportjára vonatkozó ismereteink kizárólag a Chlamydomonas vizsgálatokon alapulnak. A Chlamydomonas p28 génje a belső dynein kar egyik könnyű láncát kódolja. A p28 génben mesterségesen létrehozott splice site mutáció az egyed dyskinetikus csillómozgásához vezet. Videomikroszkópos vizsgálatok alátámasztották, hogy az EM által leírt, igazoltan belső dynein kar defektussal rendelkező betegek csillócsapásának mintázata is ehhez, a Chlamydomonas p28 mutánsban megfigyelhető fenotípushoz hasonló.

ac. Tubulin

DNAH5

Merge

overlay

19. ábra DNAI1 mutációt hordozó beteg epithelsejtjeinek immunfluoreszcens mikroszkópos vizsgálata A DNAH5 protein (piros) a csillók distális felében detektálható, valamint a citoplazmában a protein felhalmozódása figyelhető meg. A kontrollként alkalmazott anti-acetilált α-tubulin (zöld) a csillók teljes hosszában kötődik a tubulusok felépítésében szereplő tubulinhoz. A kolokalizációs képen megfigyelhető, hogy a sárgával jelzett régióban, a csillók distális felében a DNAH5 és az acetilált α-tubulin kolokalizált. A mag megjelenítése Hoechst 33342- vet történt (kék).

69

Eredmények A DNALI1 a belső dynein kart felépítő egyik könnyű lánc, a Chlamydomonas p28 fehérjéjének humán orthológja . A DNAH5 antitesttel végzett vizsgálatokból kiindulva feltételezhető volt, hogy a DNALI1 fehérje ellen előállított antitest ugyancsak alkalmazható immuncitokémiai diagnosztikára. A vizsgálatok kimutatták, hogy a DNALI1 protein az egészséges kontrollokból származó epithel sejtek csillóinak teljes hosszában detektálható (20. ábra). Az átmeneti zónában és a bazális test területén DNALI1 proteint kimutatni nem lehetett. Kontrollként acetilált tubulin ellens ellenanyagot használtunk, amely a csillókat felépítő tubulinhoz specifikusan kötődik. A DNALI1 festési mintája azt mutatja, hogy a DNALI1 a belső dynein kar egyik komponense, ami a humán respiratórikus sejtek csillóinak teljes hosszában kimutatható. Mivel a respirartórikus epithelsejtek citoplasmájában a DNALI1 protein nem volt detektálható, ez arra enged következtetni, hogy a DNALI1 nem része a citoplasmatikus motor-protein-komplexnek. A DNALI1 antitest specificitását a DNAH5 és a DNAI1 mutációt hordozó, izolált külső dynein kar defektussal rendelkező betegek respiratórikus epithel sejtjeiben teszteltük. Ezen betegekben a DNALI1 protein megjelenése nem különbözött az egészséges kontroll sejtekben megfigyelt fehérjeeloszlástól. A DNAH5 komplett illetve proximális hiánya a mutáns sejtekben nincs hatással a respratórikus epithel sejtekben a DNALI1 fehérje subcelluláris lokalizációjára. Ez az eredmény bizonyítja, hogy a DNALI1 a belső dynein kar integráns része, ami a külső dynein kar felépítésében nem játszik szerepet.

ac. Tubulin

DNALI1

Merge

overlay

20. ábra Egészséges epithelsejtek vizsgálata DNALI1 antitesttel A DNALI1 a belső dynein kar könnyű lánca. Anti-DNALI1 antitest (piros) felhasználása során megállapítható, hogy a DNALI1 protein egészséges sejtekben az axonema teljes hosszában kimutatható. A kontollként alkalmazott, a csillók teljes hosszában jelen levő anti-acetilált α-tubulin 100%-osan kolokalizált a DNALI1 proteinnel. A mag megjelenítése Hoechst 33342- vel történt (kék). 70

Eredmények

ac. Tubulin

DNALI1

Merge

overlay

21. ábra Teljes DNALI1 defektus PCD betegek epithelsejtjeiben A DNALI1 protein (piros) felhalmozódott a citoplazmában, de a csillók területén egyáltalán nem jelenik meg. Megfigyelhető a két kép egymásravetítése során, hogy az axonema teljes hosszában jelen lévő anti-acetilált α-tubulin (zöld) nem kolokalizált a DNALI1 proteinnel. A mag megjelenítése Hoechst 33342- vel történt (kék).

Ez arra utal, hogy a DNALI1 antitest valószínűleg a különböző belső dynein kar defektusokat detektálni képes. A belső dynein kar könnyű láncának axonemális transzportja független a külső dynein kart felépítő fehérjék ciliáris transzportjától. Továbbá a teljes és a részleges külső dyneinkar hiányát okozó molekuláris defektusok nem

befolyásolják

a

DNALI1

protein

sejten

belüli

eloszlását.

További

immunfluoreszcens vizsgálatok során teszteltük, hogy a DNALI1 antitest a különböző belső dyneinkar defektusokat ki tudja-e mutatni. Elektronmikroszkópos módszerrel diagnosztizált belső dynein kar defektussal rendelkező PCD betegek respitatorikus epithel sejtjeit vizsgáltuk: Megállapítottuk, hogy a vizsgált belső dynein kar defektusos betegek között két csoportot lehet felállítani. Az egyik csoportban lévő betegek esetében a DNALI a citoplazmában akkumulálódott és a csillók területén DNALI1 proteint kimutatni nem lehetett (21. ábra). A másik csoportban a légzőhám sejtjeiben a csillók proximális felében látható volt a DNALI1 festés és megfigyelhető volt, hogy egyes esetekben a citoplazmában a DNALI1 halmozódik. (22.ábra)

71

Eredmények

ac. Tubulin

DNALI1

Merge

overlay

22. ábra Partialis DNALI1 defektus PCD beteg epithel sejtjeiben A kontrollként használt anti-acetilált α-tubulin (zöld) az axonema teljes hosszában kötődik a csillót felépítő tubulinhoz. A DNALI1 protein a csillók distális felében mutatható ki. A két protein kolokalizációja sárga színként jelenik meg és azt mutatja, hogy a DNALI1 valóban a csillók distális régiójában található. A mag megjelenítése Hoechst 33342- vel történt (kék).

9.2.3 A DNAH5 és a DNALI1 antitestekkel folytatott kombinált vizsgálat eredménye A DNAH5 és a DNALI1 antitestekkel folytatott kombinált immuncitokémiai analízise alapján megállapítható volt, hogy a vizsgálatban résztvevő 54 beteg diagnózisa ezzel a sejtbiológiai módszerrel felállítható. A vizsgálat során bebizonyosodott, hogy a DNAH5 és a DNALI1 proteinek subcelluláris eloszlása alapján 5 nagy csoportot lehet elkülöníteni: izolált teljes DNAH5 defektus, izolált proximális DNAH5 defektus, izolált teljes DNALI1 defektus, izolált proximális DNALI1 defektus, valamint kevert forma. Izolált totál DNAH5 defektus esetén a DNAH5 protein a csilló teljes hosszában hiányzik, viszont a bazális test területén nagy mennyiségben akkumulálódik. Ezen betegek respiratórikus epithelsejtjeiben a DNALI1 fehérje a csilló teljes hosszában detektálható, az egészséges sejtekhez hasonlóan. Ez a festési mintázat a vizsgált betegek 26%-ában volt megfigyelhető. Az analizált PCD betegcsoport 7,4%-ában izolált proximális DNAH5 defektust írtunk le. A DNAH5 a csillók distális felében volt kimutatható, valamint a DNALI1 nem mutatott eltérést a vad típusban detektálható festési mintától. Izolált totális DNALI1 hiányt a betegek 22%-ában lehetett kimutatni. Ezekben az esetekben a DNALI1 protein a citoplazmában megrekedve intenzív citoplazmatikus festődést hozott létre. Ez a megfigyelés alátámasztja azt a feltételezést, miszerint a 72

Eredmények DNALI1 fehérje szintézise, a csillóbázishoz irányuló transzportja nem károsodott. A csillók bazális régiójában épülnek össze az axonemális szubstruktúrák, ahonnan a már kész dynein karok a csillóba szállítódnak az intraflagelláris transzportmechanizmus segítségével. A DNALI1 teljes axonemális hiánya azt mutatja, hogy a DNALI1-ból álló belső dynein karok nem képesek összeépülni, vagy a csillón belüli transzportra alkalmatlanok. A betegek 17%-ában proximális DNALI1 defektus volt kimutatható, miszerint a DNALI1 a csillók distális felében és a citoplazmában lokalizálódott. A DNAH5 protein axonemális elhelyezkedése a vad típusú sejtekkel egyezett meg. Miután ezekben az esetekben a DNALI1 a csillók bazális regiójában akkumulálódott, arra lehet következtetni, hogy a DNALI1 expressziója és a csilló bazális részébe történő szállítása nem szenved zavart. Az összeépült belső dynein kar axonemális transzferje sem érintett, mert a DNALI1 a csillók distális felében detektálható. Ebben az esetben lehetséges, hogy a DNALI1-et tartalmazó belső dynein kar komplex axonemális transzportja károsodott. Ez a két különböző DNALI1 defektus azt feltételezi, hogy a csillók felépítésében valószínűleg 2 különböző DNALI1-ot tartalmazó belső dynein kar vesz részt. Összefoglalásképpen elmondható, hogy a DNAH5 és a DNALI1 antitestet alkalmazó immuncitokémiai eljárással a PCD betegek 95 %-a diagnosztizálható. A diagnosztikus eljárás specifikus, mert az antitestek kipróbálása során kontrollként nemcsak egészséges egyéneket, hanem cisztikus fibrózisban, krónikus légúti infekciókban és asthmában szenvedő betegek respiratórikus epithelsejtjeit is teszteltük. A tesztelés során bebizonyosodott, hogy a nem PCD-ben szenvedő betegek DNALI1 festési mintázata nem tér el az egészségestől. Ez azzal magyarázható, hogy ezekben a betegségekben a DNAH5 és a DNALI1 vagyis a külső és a belső dynein karok defektusa a kórkép kialakításában nem vesz részt.

73

Megbeszélés

10 Megbeszélés 10.1 A human DNAL1 és a murin Dnal1 izolálása PCD betegek respiratorikus csillójának elektronmikroszkópos vizsgálata gyakran ultrastrukturális defektust mutat. A leggyakrabban diagnosztizált defektus a külső és/vagy a belső dynein karok részleges vagy teljes hiánya. A külső és a belső dyneinkarok nagy proteinkomplexek, amelyek felépítésében un. molekuláris motorok is szerepet játszanak. Ezek a molekulák a csillómozgáshoz szükséges energiát ATP függő reakciók útján termelik. A külső és a belső dyneinkarok nehéz (400-500 kDa), közepesen nehéz (55-110 kDa) és könnyű (8-45 kDa) láncokból állnak. A Chlamydomonas reinhardtii, egy biflagellás zöldalga, széles körben alkalmazott modellorganizmus a csillós axonema funkcionális és strukturális vizsgálatára. Egy sor külső és belső dyneinkar defektussal rendelkező mutáns formát írtak le. Pl.: a külső dyneinkar komponenseket kódoló IC1 és γ-HC génekben kialakuló mutációk azt okozzák, hogy a mutáns Chlamydomonas lassabban úszik, mint a vad típus. Kutatócsoportunk a humán DNAL1 és a murin Dnal1 géneket identifikálta és karakterizálta, amelyek a Chlamydomonas külső dyneinkarjának LC1 génjével orthológok. A DNAL1 genomikus szekvenciája 49 kb, míg murin párja, a Dnal1 25 kb nagyságú és mindkét gént 8 exon építi fel. A DNAL1 transzkriptum 573 bp, ami 190 aminosavat tartalmazó proteint kódol. Bebizonyítottuk, hogy a DNAL1/Dnal1 specifikusan expresszálódik a motilis csillókat hordozó szövetekben. Elemeztük a DNAL1 számítógéppel modellezett 3D proteinstruktúráját. Ennek alapján megállapítást nyert, hogy a Chlamydomonas LC1 proteinjének γ−HC kötő motívuma a humán DNAL1-ban is konzervált. Továbbá koimmunoprecipitációval demonstráltuk a DNAH5 és a DNAL1 közötti interakciót. A DNAL1 gén mutációanalízise során 86 európai és amerikai PCD beteget vizsgáltunk meg, betegséget okozó mutációt nem találtunk. Eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy a DNAL1 génnek az embrionális fejlődés során olyan fontos szerepe van, hogy a génben bekövetkezett mutáció az embrió korai elhalását okozza.

74

Megbeszélés

10.1.1 A génstruktúra meghatározása PhD munkám során egy új humán gént, a DNAL1 gént és az azzal orthológ egér Dnal1 gént identifikáltam, amelyek az axonemális könnyű lánc 1-et kódolják. Kutatásaink során különböző molekulárgenetikai módszerek felhasználásával izoláltuk a DNAL1 és a Dnal1 géneket és vizsgáltuk szerepüket a biológiai rendszerekben. A DNALI1 egy humán gén, a csilló külső dynein karjának könnyű lánca. A külső dynein kar felépítésében nyolc különféle könnyű lánc vesz részt, amelyek szerkezete eltér egymástól. Vannak közöttük a Ca2+-kötő proteinek családjába, a tioredoxin családba tartozó fehérjék. A könnyű láncok mindegyike egy nehéz vagy egy közepesen nehéz lánchoz kapcsolódik. Ebből is arra lehet következtetni, hogy a könnyű láncoknak valószínűleg szabályozó funkciójuk lehet. Arról, hogy a könnyű láncok pontosan milyen szerepet töltenek be a szabályozásában, pontos ismereteink nincsenek. A Chlamydomonas vizsgálatok kimutatták, hogy a könnyű láncok egy részének mutációja (LC2, LC7, LC8) a külső dynein kar hiányát okozza. Ezek a gének kiváló kandidánsnak tűntek a PCD esetében. Mivel a betegek legnagyobb részénél ugyancsak külső dynein kar hiány volt diagnosztizálható, ezért logikus feltételezés volt, hogy az ezen gének humán orthológ génjeiben kialakult mutáció PCD-hez vezet. Eddig ezek közül a Chlamydomonas LC2 génjének megfelelő humán gént, a TCTE3-at és az LC8nak megfelelő humán DLC2-t izolálták. A gének PCD betegekben történt mutációanalízise mindkét esetben negatív eredményt hozott. A Chlamydomonas LC1 mutánsa nem ismert, így azt sem tudjuk, hogy az LC1 génben bekövetkezett esetleges mutáció milyen ultrastrukturális elváltozáshoz vezet. Ennek ellenére úgy gondoltuk, hogy a Chlamydomonas LC1 génjének humán orthológja kiváló kandidáns gén a PCD-ben. Chlamydomonas vizsgálatokból tudjuk, hogy az LC1 a külső dynein kar γ-HC-jéhez kötődik. Az interakció pontos helye a γ-HC motoros doménje. Bizonyított továbbá, hogy az LC1 ezáltal a kötés által szabályozza a γ-HC motoros működését Chlamydomonasban. Mivel a γ-HC humán orthológ génje a DNAH5 a PCD pathogenezisében fontos szerepet játszik, ezért feltételezhető volt, hogy a DNAH5-öt szabályzó LC1 orthológ humán protein defektusa is pathognomikus. A gének izolációja során a Chlamydomonas reinhardtii biflagelláns zöldalgát használtuk modellorganizmusként. Ezen egysejtű zöldalga mutánsai kiválóan modellezik a 75

Megbeszélés különböző csillómozgászavarokat. A Chlamydomonas legtöbb csillót fölépítő génje ismert és az internetes adatbázisokban hozzáférhető. Vizsgálatunk alapját az képezte, hogy a csillót felépítő gének az evolúció során kis mértékben változtak. Ez azt jelenti, hogy a Chlamydomonas és a gerincesek csillóproteinjeinek szerkezete, felépítése, és funkciója 70-90%-os egyezést mutat. In silico kutatásaink során megállapítást nyert a DNAL1 és a Dnal1 genetikai szerkezete. Mindkét gén nyolc exonnal rendelkezik, a DNAL1 a 14-es humán kromoszómán, a Dnal1 a 12-es egér kromoszómán található. A humán és az egér gének termékei 97%-os homológiát mutatnak egymással, ami a géneket felépítő exonok nagyságában is megjelenik (9., 11. ábra). Ezt alátámasztja a 3D protein analízis során kapott eredmény is, miszerint a humán és a Chlamydomonas fehérjéjének 3 dimenziós szerkezetében csak csekély eltérés írható le. (13. ábra)

10.1.2 A DNAL1 szerkezete és interakciói A Chlamydomonasban az LC1 a külső dynein kart felépítő protein komplex része és fizikai kontaktust létesít a külső dynein kart felépítő γ−nehézlánccal [11]. Az LC1 a leucinban gazdag fehérjék (LRR) családjának SDS22+ szubcsoportjába tartozik. Szerkezeti vizsgálatok bebizonyították, hogy az LRR régió egy jobb menetes spirális szerkezetet alkot. Ez a struktúra hat β−β−α motívummal rendelkezik, amelyek két β−lemezes és egy α-hélix szerkezetet formálnak [103, 102, 90]. Az első β−lemezes szerkezet területén egy egyszerű hidrofób régió található, amely elősegíti a γ-HC kötődését a LC1-hez. Ez a kötési régió a γ-HC motor doménjének ATP hidrolizáló helyének közvetlen szomszédjában foglal helyet. Sztöchiometriai vizsgálatok mutatják, hogy egy γ-HC-hez két LC1 molekula kapcsolódik. Továbbá az is bizonyítást nyert, hogy ez a hármas komplex (két LC1 molekula és egy γ-HC) az LC1 molekulákon keresztül egy eddig még nem identifikált 45 kDa molekulatömegű fehérjével kapcsolódik [11]. Ezáltal feltételezhető az, hogy a γ-HC protein motoros aktivitása az LC1 interakción keresztül szabályozott, amely a környezeti stimulusok szignáljait közvetíti. Az LC1 és a DNAL1 nagy szekvencia és strukturális hasonlósága alapján feltételeztük, hogy a humán DNAL1 és a humán DNAH5 ugyancsak egymással kapcsolódnak. A DNAH5 a Chlamydomonas γ-HC humán orthológ génje, amelynek bizonyítottan szerepe van a PCD pathogenezisében [66]. Immunoprecipitációs 76

Megbeszélés vizsgálatok alkalmazásával kimutattuk, hogy a GFP-vel kötött DNAL1 a sertés légzőhámjának sejtjeiből származó natív DNAH5-höz kötődik.

10.1.3 A DNAL1 expressziós vizsgálata Demonstráltuk a DNAL1 és a DNAH5 proteinek specifikus ko-expresszióját különböző csillós sejtekben, mint a légzőhám epithelsejtjei, az epemdymasejtek és a spermiumok. In situ hibridizációs vizsgálattal bizonyítottuk, hogy a Dnal1 specifikus expressziót mutat a primitív csomó sejtjeiben a gastruláció fázisában. A primitív csomó sejtjei monociliummal rendelkeznek, amelyek a fejlődés során a bal/jobb oldali testi aszimmetria kialakulásában vesznek részt [59]. Az általuk keltett folyamatos folyadékáramlás oda vezet, hogy a szervek kialakulásában szereplő transzkripciós faktorok aszimmetrikusan expresszálódnak. Ez azt eredményezi, hogy egyes szervek a bal, míg más szervek a test jobb oldalára vándorolnak. Ezért a Dnal1 expressziója a nodális sejtekben azt mutatja, hogy a Dnal1 közreműködik a primitív csomó területén található motilis 9+0 szerkezetű csilló funkciójában. A kifejlett felnőtt egér hibridizációs vizsgálatai azt mutatták, hogy a Dnal1 specifikusan expresszálódik az alsó légutak epitheljében és az aqueductus Silviit borító epemdymasejtekben. Ezen sejtek csillói un. 9+2 szerkezetből állnak, ez egy újabb bizonyíték arra, hogy az axonemalis dynein könnyű lánc 1 a motilis csillók közül a 9+2 szerkezetű csillók felépítésében is fontos szerepet játszik. A szenzoros csillóval rendelkező szövetekben, pl. a retinában és a vesében, valamint a csillóval nem rendelkező szövetekben expressziót kimutatni nem tudtunk. Ez azt bizonyítja, hogy a DNAL1-nek a DNAH5-re kifejtett regulációs szerepe csak a motoros csillókban van jelen, így a spermiumokban, a respiratorikus epithel sejtekben és az ependyma sejtekben.

10.1.4 A DNAL1 gén mutációanalízise PCD-ben szenvedő betegekben A PCD genetikailag heterogén betegség. Eddigi kutatások viszont csak két olyan gént tudtak izolálni, amelyek bizonyíthatóan a PCD kialakulásában szerepet játszanak. Ezen gének a külső dynein kar felépítésében vesznek részt. A DNAH5 a külső dynein kar 77

Megbeszélés egyik nehéz lánca, a csillómozgás kulcsmolekulája. A DNAH5 gén mutációanalízise során kiderült, hogy a PCD betegek 30 %-ában kimutatható a gén defektusa. A mutációk többsége a protein korai megtöréséhez vezet stop mutáció útján. A mutációk másik nagy csoportja a splice site mutációk és a legkisebb részt a pontmutációk teszik ki. A DNAI1 a külső dynein kar intermedier lánca, amelyben PCD-ben szenvedő betegek esetén ugyancsak mutációt írtak le. 121 beteget vizsgáltak meg, akiknek 12 százalékában ugyanazt a mutációt lehetett kimutatni. A harmadik PCD kialakításában felelős gén a DNAH11. PCD betegek vizsgálata kimutatta, hogy a vizsgált populációból egyetlen beteg DNAH11 génjében lehetett kimutatni a normálistól eltérő elváltozást. A klinikai vizsgálatok során kiderült, hogy a beteg klinikai képét a cisztás fibrózis is befolyásolja. Ennek bizonyítására a CF génjében is mutációanalízist végeztek. A vizsgálatok eredményeképpen megállapítást nyert, hogy a beteg CF mutációval is rendelkezik. A további vizsgálatok nem tudták egyértelműen bizonyítani, hogy a beteg klinikai képének kialakításában melyik mutációnak van szerepe. Ezzel együtt a DNAH11 gént úgy tartják számon, mint PCD kialakításában szereplő faktort. A PCD betegeknél leggyakrabban diagnosztizált ultrastruktúrális elváltozás a külső dyneinkar teljes vagy részleges hiánya. Az eddigi genetikai vizsgálatok ugyancsak alátámasztják, hogy ennek a klinikai leletnek a genetikai háttere megalapozott. Az ez idáig leírt mutációk a külső dynein kar nehéz láncait kódoló génekben (DNAH5, DNAH11) és a külső dyneinkar intermedier láncát kódoló génben (DNAI1) vannak. Az általunk identifikált DNAL1 gén ugyancsak a külső dynein kar felépítésében játszik szerepet. Közvetlen interakciós partnere a DNAH5 protein. A DNAL1 csillókban betöltött fontos szerepére utal továbbá, hogy szerkezete az evolúció során nagymértékben konzervált módon maradt fenn és a konzerváltságot a különböző organizmusokban ugyancsak ki lehet mutatni. Továbbá expressziós vizsgálatokkal sikerült kimutatnunk, hogy a DNAL1 és a Dnal1 a csillókat hordozó szövetekben van jelen. Bizonyítható volt, hogy a légzőrendszer epitheliális sejtjeiben, az agy aqueductusainak ependymasejtjeiben és a spermiumokban a DNAL1 és a Dnali1 erősen expresszálódik. Ez a specifikus szöveti expressziós mintázat megegyezik a PCD-ben érintett szervekkel. A PCD-ben leírt klinikai tünetekért a fenti szervek megbetegedése a 78

Megbeszélés felelős. A diagnosztika alapja a légutakat érintő visszatérő fertőzések és az ezek következtében kialakuló állandó légúti gyulladás. Ez az immotilis vagy dysmotilis csillók csökkent funkciójára vezethető vissza, minek következtében a mukociliáris clearance károsodott. Az érintett férfiak körében gyakori a csökkent fertilitási képesség, ami a spermiumok motilitási zavarával magyarázható. Egy ritka, PCD-vel asszociált kórkép a hydrocephalus internus. Korábbi vizsgálatok során bebizonyítható volt, hogy az aqueductusokat borító ependymális sejtek csillóinak mozgása az ependymális folyadékáramlás kialakításában és fenntartásában nagy szerepet tölt be. A csillók nem megfelelő mozgása azt eredményezi, hogy az ependymális folyadékáramlás zavart szenved. A folyadékáramlás nem képes fenntartani az aqueductusok intaktságát és ez aqueductus stenosishoz vezet. Az elzáródás miatt alakul ki a PCD betegek estében is a ritkán leírt társult kórkép. Ezek a tények arra engednek következtetni, hogy az általunk identifikált DNAL1 gén lehetséges kandidáns gén a PCD betegségben. 86 PCD-ben szenvedő beteg mutációanalízisét végeztük el, melynek során a DNAL1 gén kódoló területén nem tudtunk szekvenciaelváltozást kimutatni. A PCD betegek nagy csoportját való tekintettel ki lehet jelenteni, hogy a DNAL1-nek nincs jelentős szerepe a PCD etiológiájában. Az egyik lehetséges oka annak, hogy a DNAL1 gén PCD betegek esetében nem mutált, az lehet, hogy a DNAL1 ép működése elengedhetetlenül fontos szerepet játszik a csillóban a fejlődés során. A másik lehetséges magyarázat, hogy a DNAL1-nek a csillókompartmenten kívül a citoplazmában is esetleg szerepe van [84]. PhD munkám során identifikáltam a humán és az egér axonemális könnyű lánc 1 proteint kódoló géneket. Meghatároztam ezen gének teljes cDNS-ét, exon-intron struktúráját és bebizonyítottam a DNAL1 és a DNAH5 között fennálló interakció létezését. A DNAL1 nagy expressziója a testisben azt indikálja, hogy ezen gén által kódolt fehérje a spermiumok felépítésében és funkciójában játszhat szerepet. A DNAL1 mutáció hiánya PCD betegekben és a gén nagy expressziós kifejeződése a testisben azt mutatja, hogy a férfi fertilitás kialakulásában a DNAL1 kiváló kandidáns gén lehet.

79

Megbeszélés

10.2 Új diagnosztikus módszer a DNAH5 és a DNALI1 elleni antitestek felhasználásával Immunfloureszcens vizsgálataink során a DNAH5 és a DNALI1 szubcelluláris lokalizációját

határoztuk

meg

egészséges

és

PCD-ben

szenvedő

betegek

epithelsejtjeiben konfokális lézer scanning mikroszkóp segítségével. A vizsgálati anyagot transznasalis kefebiopsziával nyertük

10.2.1 DNAH5 elleni antitest, mint külső dynein kar marker A DNAH5 a külső dynein kar egyik nehéz lánca. Recesszív mutációk kialakulása a DNAH5 génben funkcióképtelen DNAH5 protein képződéséhez vezet [66]. A mutációt hordozó

betegek

immotilis

respiratorikus

csillókkal

rendelkeznek,

amelyek

ultrastrukturális felvételeken külső dynein kar hiányt mutatnak. A DNAI1 gén mutációja - amely a külső dynein kar közepesen nehéz láncát kódolja – ugyancsak külső dynein kar defektust okoz PCD-ban szenvedő betegeknél. Célunk többek között az volt, hogy választ kapjunk arra a kérdésre, hogy a DNAH5 és a DNAI1 mutációk milyen mechanizmussal okozzák a csillók immotilitását. Ehhez immunfluoreszcens vizsgálatot végeztünk DNAH5 elleni antitesttel. Megállapítható volt, hogy a DNAH5 az egészséges epithelsejtek csillóiban az axonema teljes hosszában kimutatható. Az izolált külső dynein kar defektusokat két csoportba lehet osztani: megkülönböztetünk disztális és teljes DNAH5 defektust. Ezekben az esetkben a DNAH5 külső dynein kart felépítő fehérje vagy az axonema teljes, vagy disztális szakaszáról hiányzik. A DNAH5 teljes hiánya a DNAH5 génben mutációt hordozó egyének epithelsejtjeire volt jellemző. Ezekben a sejtekben a DNAH5 fehérje a citoplazmában, a basal body régióban akkumuláldott. A disztális DNAH5 defektus a DNAI1 mutációhordozók csillós sejtjeit jellemezte. Itt is megfigyelhető a DNAH5 citoplazmatikus halmozódása hasonlóan a teljes DNAH5 defektushoz. Ezek alapján feltételeztük, hogy a humán sejtekben a dynein karok összeépülése és transzportja a Chlamydomonashoz hasonló mechanizmussal jön létre. Eszerint a külső dynein kar prekurzorai a citoplazmában szintetizálódnak, majd a csilló bázisára, a basal body területére szállítódnak. A dynein kar alkotóelemei ezen a területen épülnek össze

80

Megbeszélés és az intraflagelláris transzportmechanizmus segítségével jutnak el rendeltetési helyükre [84]. Ahhoz tehát, hogy a dynein kar komplexek kialakuljanak és megfelelő helyükre kerüljenek, több folyamat kifogástalan működése szükséges (23. ábra). A külső és/vagy belső dynein kar proteinek diszlokalizációját okozhatja az, hogy a dynein karok nem képesek összeépülni a basal body területén, mert az egyes proteinek 3D szerkezete megváltozott. Ezt a változást okozhatja pl. egy mutáció. Így a DNAI1 mutációja az általa kódolt fehérjében olyan konformációváltozást okoz, amely következtében a DNAH5 és a DNAI1 proteinek nem tudnak összeépülni. Ez vezet ahhoz, hogy a DNAI1 mutációja a DNAH5 ciliáris diszlokalizációját okozza. Másrészt a teljes defektussal bíró sejtekben az intraflagelláris transzport is lehet károsodott. A disztális defektussal rendelkező betegeknél ez nem valószínű, mert a csillók proximális szakaszán detektálhatóak a DNAH5 és/vagy a DNALI1 proteinek. Az izolált külső és/vagy belső dynein kar proteinek diszlokalizációja alátámasztja azt a feltételezést, miszerint a dynein karok összetétele az axonema hosszában regionális eltérést mutat és mutáció hatására az egyik vagy másik dynein kar szubtípus nem képes összeépülni. Ez oda vezet, hogy a betegeknél pl. a teljes DNAH5 defektus estében az a külső dynein kar szubtípus hiányzik a csillók teljes hosszában, amelynek fő alapköve a DNAH5. A DNAI1 mutáció DNAH5 disztális defektust okoz. A DNAI1 normál esetben valószínűleg csak a csilló disztális szakaszain jelen lévő külső dynein kar szubtípus felépítésében szerepel. A DNAI1 gén mutációja kapcsán olyan protein jön létre, amely nem képes a DNAH5 proteinhez kapcsolódni, és a disztális dynein kar komplex nem alakul ki. (19. ábra)

81

Megbeszélés

23. ábra A külső dynein kar komplex kialakulása A dynein kar komponenseinek transzportja a csillóbázisra (I.). A dynein kar komplex összeépülése a csilló bázisán (basal body régió) és a komplex kapcsolódása az intraflagelláris transzportrendszer résztvevőihez (II.). A dyenin karok intraaxonemális transzportja (III.). A dynein kar komplexek kihorgonyzódása a tubulusrendszerhez. 82

Megbeszélés

10.2.2 DNALI1 elleni antitest, mint belső dynein kar marker A DNALI1-festés a kontroll sejtekben a respiratórikus sejtek csillóinak teljes hosszában kimutatható volt (20 és 24I ábra). Ez azt mutatja, hogy a DNALI1-ből felépülő belső dynein kar a respiratórikus csilló teljes hosszában egyenletesen oszlik meg. A negatív citoplazmatikus festés az egészségesekben és a pozitív csillófestődés az izolált külső dynein kar hiányos betegekben (24 A, B ábra) arra enged következtetni, hogy a DNALI1 a belső dynein kar komplexben fontos szerepet játszik, viszont a külső dyenin kar valamint a citoplazmatikus dynein felépítésében nem szerepel. Ezt a feltételezést megerősíti továbbá, hogy belső dyenin kar rendellenességben szenvedő PCD betegek epithelsejtjeiben a DNALI1 diszlokalizációját tudtuk kimutatni. Két különböző abnormális

DNALI1

festési

mintázatot

identifikáltunk,

mindkét

esetben

a

citoplazmában a DNALI1 fehérje akkumulációját detektáltuk. Ez a proteinakkumuláció egy grádienst mutat, miszerint a DNALI1 fehérje felhalmozódása a citopazma apikális régiójában fokozottabb. A DNALI1-deficiencia vagy a csilló teljes hosszában, vagy a disztális szakaszán figyelhető meg. Ezt támasztja alá az a tény, hogy a Chlamydomonas DNALI1-el orthológ fehérjéje a p28 két különféle belső dynein kar szubtípus felépítésében játszik szerepet [80, 54]. Továbbá a Chlamydomonas esetében a belső dyeninkar szubtípusok egyike kizárólag az axonema proximális részére lokalizálódik. A DNALI1 deficiencia a csillók teljes hosszában (21 ábra és 24 C ábra) azzal magyarázható, hogy mindkét dynein kar szubtípus, amelyek felépítésében a DNALI1 szerepet játszik, hiányzik a csillók egész hosszában. Egyes betegeknél viszont csak a csilló disztális szakaszára korlátozódik a DNALI1 hiány (22. ábra és 24 D ábra), ami azt jelenti, hogy a proximális DNALI1-et tartalmazó dynein karok intaktak. Ez arra enged következtetni, hogy ezekben az esetekben legalább egy dynein kar szubtípus hiányzik ami egészséges egyénekben a disztális csillószakaszon vagy a csilló egész hosszában helyezkedik el.

83

Megbeszélés

24. ábra A DNALI1 és a DNAH5 elleni antitestek által mehatározott nyolc dynein kar szubtípus sematikus megjelenítése Izolált külső dynein kar defektus esetén a DNAH5 teljes mértékben (A), vagy csak a csillók disztális felében nem detektálható (B). Mindkét esetben a DNAH5 a basal body területén akkumulálódik. Izolált belső dynein kar defektus esetén a DNALI1 vagy a csilló teljes hosszában (C), vagy a disztális szakaszról hiányzik (D). A DNAH5 és a DNALI1 felhasználásával különböző kombinálit defektusokat is tudtunk izolálni: a DNAH5 és a DNALI1 komplett hiánya (E), a DNALI1 komplett és a DNAH5 disztális hiánya (F), a DNALI1 disztális és a DNAH5 komplett hiánya (G), mindkét fehérje disztális hiánya (H). A DNALI1 és a DNAH5 előfordulása egészséges respiratórikus epithel sejtekben (I). 84

Megbeszélés

10.2.3 DNALI1- und DNAH5 diszlokalizáció kombinált előfordulása Elektronmikroszkópos vizsgálatokból ismert, hogy a PCD betegek nagy részénél külső és belső dynein kar hiány diagnosztizálható [37]. Megvizsgáltuk, hogy ez a csoport homogén fenotípusos tulajdonságokkal rendelkezik-e. A belső dynein kar komponens DNALI1 és a külső dynein kar komponens DNAH5 lokalizációját állapítottuk meg 54 PCD betegnél. A külső és a belső dynein kar defektussal rendelkező betegeknél összesen nyolc különböző DNAH5/DNALI1 festési mintát identifikáltunk. Ez arra enged következtetni, hogy különböző molekulárpathológiai folyamatok játszanak szerepet ezen fehérjék diszlokalizációjában. Megállapítottuk, hogy a kombinált dynein kar defektussal rendelkező betegcsoport nagyon komplex. Két antitest segítségével (a DNAH5, mint külső dynein kar marker, a DNALI1, mint belső dynein kar marker ) négy különböző kombinált dynein kar defektust identifikáltunk (24 D, E, F, G ábra). Mivel ezek a szubtípusok érinik mint a külső-, mind a belső dynein kart, ezért feltételezhető, hogy a háttérben egy speciális transzport károsodás áll, ami a belső és a külső dynein karokra is hatással van. Továbbá figyelemre méltó az is, hogy a nyolc különféle dynein kar defektust két specifikus antitest segítségével definiáltuk. A nyolc szubtípus karakterizálását a dynein kar axonemális hosszanti irányú eloszlásának regionális különbségeire alapoztuk. A jövőben további vizsgálatok valószínűleg sokkal nagyobb komplexitást fognak feltárni ezen a területen. A dynein karok nagy heterogenitása magyarázhatja a PCD-vel kapcsolatos, számos eredménytelen betegséget okozó génizolálási kísérletet [12]. Ezen kívül a dynein kar defektusok sokfélesége arra enged következtetni, hogy a gének, amelyek nem dynein kar alkotóelemeket kódolnak, ugyancsak a primer ciliáris dyskinesia pathogenezisében fontos szerepet játszhatnak. A csilló defektusok pontosabb karakterizálása megkönnyítheti új PCD-t okozó gének identifikálását. Jelenleg a PCD dignózisa a recidiváló infekciókon, a respiratórikus csillók specifikus ultrastrukturális

defektusainak

kimutatásán

valamint

a

csilló

dyskinesiának

fénymikroszkópos kimutatásán alapul [4]. A csillócsapás fénymikroszkópos vizsgálata nehezített lehet azáltal, hogy a betegeknél a folyamatos infekciók következtében szekunder ciliáris elváltozások lehetnek jelen. Ezen kedvezőtlen körülmények gyakran ismételt vizsgálathoz vezetnek. De ennek ellenére néhány betegnél ez az egyetlen mód arra,

hogy

a

diagnózist

fel

lehessen 85

állítani

különösen

akkor,

ha

nincs

Megbeszélés elektronmikroszkóppal detektálható ultrastrukturális elváltozás. A PCD esetek nagy részében a diagnózisa elektromnmikroszkópos technikával állítható fel [37]. Viszont a belső dynein karok morfológiájának EM analízise gyakran nem egyértelmű eredményt hoz. A belső dynein karok a komplex struktúrájuk és eloszlásuk miatt alacsonyabb kontrasztot mutatnak az EM felvételeken, mint a külső dynein karok [22]. Miközben a külső dynein karok 24 nm-es imtervallumokban jelennek meg az axonem a hosszában, addig a belső karok 96 nm-enként ismétlődnek [81, 78]. A csillók hosszában a regionális különbségek meghatározása valamint a disztális külső és/vagy belső dynein kar deficiencia elektronmikroszkóppal nem lehetséges, mert az ultravékony metszetek miatt a csillók teljes hossza nem vizsgálható. A külső és a belső dynein karok felépítésének longitudinális különbsége magyarázhatja, hogy a konvencionális elektronmikroszkóppal az ultrastrukturális fenopíus kiértékelése nehéz [22]. Vizsgálatunkban 54 PCD beteg transznasalis kefebiopsziáját immunfluoreszcens mikroszkóppal analizáltuk. Csak három esetben (5,6%) igazolódott a DNAH5 és a DNALI1 antitestekkel normális festési kép. Ennél a három betegnél nem rendelkeztünk elektronmikroszkópos

vizsgálati

eredménnyel,

a

diagnózis

felállítása

fénymikroszkóppal történt. A tipikus klinikai kép mellett a csillók abnormális csapási mintázatát találtuk. Ezek a betegek valószínűleg más ultrastrukturális defektusokkal rendelkeznek, mint pl. radiális küllő defektus vagy a tubulusok eltérései [4, 37]. Az immunfluoreszcens mikroszkópos analízis bevezetésének előnye, hogy a vizsgálati minta nasális kefebiopsziával nyerhető, ami az elektronmikroszkópos mintavételi eljáráshoz képest sokkal kevesebb megterhelést jelent a betegek számára. Az antitest kimutatásán alapuló diagnosztikai módszer specificitása az elektronmikroszkópiánál jobb, ugyanis az elektronmikroszkópos módszer alkalmazásával a vizsgált betegek csak 86%-ában [20], míg a fent említett eljárással 95%-ában lehet biztos diagnózist felállítani. A módszer hátránya, hogy az alkalmazott antitestek a kereskedelmi forgalomban még nem hozzáférhetőek, továbbá a preparátumok elemzésére alkalmas konfokális scanning mikroszkóp széles körben nem áll rendelkezésre. Azonban a technika és a tudomány rohamos fejlődésével belátható időn belül ez a diagnosztikai módszer széles körben felhasználhatóvá válhat.

86

11 Irodalomjegyzék 1.

Afzelius BA, Eliasson R: Male and female infertility problems in the immotile cilia syndrome. Eur J Respir Dis 127:144-147. (1983)

2.

Afzelius BA, Mossberg B, Berström SE: Immotile Cilia Syndrome (Primary ciliary dyskinesis), including Kartagener Syndrome. In Scriver, C.S., Beaudet, A.L., Valle, D., Sly, W.S., Childs, B., Kinzler, K.W. and Vogelstein, B. (eds). The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 8th ed. McGrawHill, New York, Vol. 3, pp. 3369-5238. (2001)

3.

Afzelius BA, Mossberg B: Immotile Cilia Syndrome (Primary Ciliary Dyskinesia) including Kartagener syndrome. The Metabolic and molecular bases of inherited disease (eds. Scriver, C.R., Beaudet, A.L. & Sly, W.S.) 3943-3954. (1995)

4.

Afzelius BA: A human syndrome caused by immotile cilia. Science 193:317319. (1976)

5.

Anonymous: Recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide in adults and children. Am J Respir Crit Care Med 160: 2104-2117. (1999)

6.

Balfour-Lynn IM, Laverty A, Dinwiddie R: Reduced upper airway nitric oxide in cystic fibrosis. Arch Dis Child 75: 319-322. (1996)

7.

Barlocco EG, Valletta EA, Canciani M, Lungarella G, Gardi C, De Santi MM, Mastella G: Ultrastructural ciliary defects in children with recurrent infections of the lower respiratory tract. Pediatr Pulmonol 10:11-17. (1991)

8.

Barlow J, Wilkonson M, O’Callaghan C: Neonatal cilia: ultrastructure. Arch Dis Child 65:708-710. (1990)

87

9.

Bartoloni L, Blouin JL, Pan Y, Gehrig C, Maiti AK, Scamuffa N, Rossier C, Jorissen M, Armengot M, Meeks M, Mitchison HM, Chung EM, DelozierBlanchet CD, Craigen WJ, Antonarakis SE.: Mutations in the DNAH11 (axonemal heavy chain dynein type 11) gene cause one form of situs inversus totalis and most likely primary ciliary dyskinesia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:10282-10286. (2002)

10.

Baruch GR, Gottfried E, Pery M, Sahin A, Etzioni A: Immotile cilia syndrome including polysplenia, situs inversus and extrahepatic biliary atresia. Am J Med Genet 33:390-393. (1989)

11.

Benashski SE, Patel-King RS, King SM: Light chain 1 from the Chlamydomonas outer dynein arm is a leucine-rich repeat protein associated with the motor domain of the gamma heavy chain. Biochemistry 38:7253-64 (1999)

12.

Blouin JL, Meeks M, Radhakrishna U, Sainsbury A, Gehring C, Sail GD, Bartoloni L, Dombi V, O'Rawe A, Walne A, Chung E, Afzelius BA, Armengot M, Jorissen M, Schidlow DV, van Maldergem L, Walt H, Gardiner RM, Probst D, Guerne PA, Delozier-Blanchet CD, Antonarakis SE.: Primary ciliary dyskinesia: a genome-wide linkage analysis reveals extensive locus heterogeneity. Eur. J. Hum. Genet 8: 109-118. (2000)

13.

Bush A, Cole P, Hariri M, Mackay I, Phillips G, O.Callaghan C, Wilson R,Warner JO: Primary ciliary dyskinesia: diagnosis and standard of care. Eur Respir J 12: 982-988. (1998)

14.

Carson JL, Collier AM, HuSCS: Acquired ciliary defects in nasal epithelium of children with acute viral upper respiratory infections. N Engl J Med 312:463-468. (1985)

15.

Chilvers MA, O'Callaghan C: Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax 55:314-317. (2000)

16.

Clarke SW: Rationale of airway clearance. Eur Respir J 2:599-604. (1989)

17.

de Boode WP, Collins JM, Veerman AJ, van der Baan S: Primary ciliary dyskinesia: a questionnaire study of the clinical aspects. Nederlands Tijdschr Geneeskd 133:2338-2341. (1989) 88

18.

DiBella L, King SM: Dynein motors of the Chlamydomonas flagellum. Int. Rev. Cytol 210: 227-268. (2001)

19.

Dry KL, Manson FD, Lennon A, Bergen AA, Van Dorp DB, Wright AF: Identification of a 5' splice site mutation in the RPGR gene in a family with Xlinked retinitis pigmentosa (RP3). Hum Mutat 13:141-5. (1999)

20.

El Zein L, Omran H, Bouvagnet P: Lateralization defects and ciliary dyskinesia: lessons from algae. Trends Genet 19:162-167. (2003)

21.

Engesaeth VG, Warner JO, Bush A: New associations of primary ciliary dyskinesia syndrome. Pediatr Pulmonol 16:9-12. (1993)

22.

Escudier E, Couprie M, Duriez B, Roudot-Thoraval F, Millepied MC, Pruliere-Escabasse V, Labatte L, Coste A: Computer-assisted analysis helps detect inner dynein arm abnormalities. Am J Respir Crit Care Med. 166: 125762. (2002)

23.

Fliegauf M, Olbrich H, Horvath J, Wildhaber JH, Zariwala MA, Kennedy M, Knowles MR Omran H: Mis-localization of DNAH5 and DNAH9 in Respiratory Cells From Primary Ciliary Dyskinesia Patients. Am. J. Respir. Crit. Care Med 171: 1343-9. (2005)

24.

Fox B, Bull TB Oliver TN: The distribution and assessment of electron mikroscopic abnormalities of human cilia. Eur J Resp Dis Suppl. 127:11-18. (1983)

25.

Grasemann H, Michler E, Wallot M, Ratjen F: Decreased concentration of exhaled nitric oxide (NO) in patients with cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol 24: 173-177. (1997)

26.

Greenstone M, Rutman A, Dewar A, Mackay I, Cole PJ: Primary ciliary dyskinesia: cytological and clinical features. Q J Med 67:405-423. (1988)

27.

Greenstone MA, Jones RWA, Dewar A, Neville BGR, Cole PJ: Hydrocephalus and primary ciliary dyskinesia. Ach Dis Child 59:481-482. (1984)

28.

Guichard C, Harricane MC, Lafitte JJ, Godard P, Zaegel M, Tack V, Lalau G, Bouvagnet P: Axonemal dynein intermediate-chain gene (DNAI1) mutations result in situs inversus and primary ciliary dyskinesia (Kartagener syndrome). Am J Hum Genet 68:1030-5. (2001) 89

29.

Hastie AT: Isolation of respiratory cilia. Methods Cell Biol 47: 93-98. (1995)

30.

Holzbaur EL, Vallee RB: DYNEINS: molecular structure and cellular function. Annu. Rev Cell Biol 10:339-372. (1994)

31.

Hou X, Mrug M, Yoder BK, Lefkowitz EJ, Kremmidiotis G, D'Eustachio P, Beier DR, Guay-Woodford LM: Cystin, a novel cilia-associated protein, is disrupted in the cpk mouse model of polycystic kidney disease. J Clin Invest 109:533-40. (2002)

32.

Iannaccone A, Breuer DK, Wang XF, Kuo SF, Normando EM, Filippova E, Baldi A, Hiriyanna S, MacDonald CB, Baldi F, Cosgrove D, Morton CC, Swaroop A, Jablonski MM: Clinical and immunohistochemical evidence for an X linked retinitis pigmentosa syndrome with recurrent infections and hearing loss in association with an RPGR mutation. J Med Genet 40:118. (2003)

33.

Ibanez-Tallon I, Gorokhova S, Heintz N: Loss of function of axonemal dynein Mdnah5 causes primary ciliary dyskinesia and hydrocephalus. Hum Mol Genet 11:715-21. (2002)

34.

Ibanez-Tallon I, Heintz N, Omran H: To beat or not to beat: roles of cilia in development and disease. Hum. Mol. Genet 12: 27-35. (2003)

35.

Ibanez-Tallon I, Pagenstecher A, Fliegauf M, Olbrich H, Kispert A, Ketelsen UP, North A, Heintz N, Omran H: Dysfunction of axonemal dynein heavy chain Mdnah5 inhibits ependymal flow and reveals a novel mechanism for hydrocephalus formation. Hum Mol Genet 13:2133-41. (2004)

36.

Jabourian Z, Lublin DF, Adler A, Gonzales C, Nortrup B, Zwillenberg D: Hydrocephalus in Kartagener’s syndrme. Ear Nose Throat J 65:468-472. (1986)

37.

Jorissen M, Willems T, Van der Schueren B, Verbeken E, De Boeck K: Ultrastructural expression of primary ciliary dyskinesia after ciliogenesis in culture. Acta Otorhinolaryngol Belg 54: 343-356. (2000)

38.

Kajava AV: Structural diversity of leucine-rich repeat proteins. J Mol Biol 277:519-527. (1998)

90

39.

Kamiya R, Kurimoto E, Muto E: Two types of Chlamy domonas flagellar mutants missing different components of inner-arm dynein. J. Cell Biol 112:441-447. (1991)

40.

Kamiya R, Okamoto M: A mutant of Chlamydomonas reinhardtii that lacks the flagellar outer dynein arm but can swim. J Cell Sci 74:181-191. (1985)

41.

Kamiya R: Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants. Int Rev Cytol 219: 115-155. (2002)

42.

Karadag B, James AJ, Gultekin E, Wilson NM, Bush A: Nasal and lower airway levels of nitric oxide in children with primary ciliary dyskinesia. Eur Respir J 13: 1402-1405. (1999)

43.

Kastury K, Taylor WE, Shen R, Arver S, Gutierrez M, Fisher CE, Coucke PJ, Van Hauwe P. Van Camp G Bhasin S: Complementary deoxyribonucleic acid cloning and characterization of a putative human axonemal dynein light chain gene. J Clin Endocrinol Metab 82:3047-3053. (1997)

44.

Kawamoto H, Takumida M, Takeno S, Watanabe H, Fukushima N, Yajin K: Localization of nitric oxide synthase in human nasal mucosa with nasal allergy. Acta Otolaryngol Suppl (Stockh) 539:65-70. (1998)

45.

Kelley TJ, Drumm ML: Inducible nitric oxide synthase expression is reduced in cystic fibrosis murine and human airway epithelial cells. J Clin Invest 102: 1200-1207. (1998)

46.

Kharitonov SA, Alving K, Barnes PJ: Exhaled and nasal nitric oxide measurements: recommendations. Eur Respir J 10: 1683-1693. (1997)

47.

Kharitonov SA, Chung FK, Evans DJ, O’Connor BJ, Barnes PJ: Increased exhaled nitric oxide in asthma is mainly derived from the lower respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med 153: 1773-1780. (1996)

48.

Kispert A, Petry M, Olbrich H, Volz A, Ketelsen UP, Horvath J, Melkaoui R, Omran H, Zariwala M, Noone PG, Knowles M.: Genotype-phenotype correlations in PCD patients carrying DNAH5 mutations. Thorax 58: 552-554. (2003)

49.

Knecht, A. K., P. J. Good, I. B. Dawid, and R. M. Harland: Dorsal-ventral patterning and differentiation of noggin-induced neural tissue in the absence of mesoderm. Development 121:1927-1935. (1995) 91

50.

Kobe B, Deisenhofer J: The leucine-rich repeat: a versatile binding motif. Trends Biochem Sci 19:415-421. (1994)

51.

Kobzik L, Bredt DS, Lowenstein CJ, Drazen J, Gaston B, Sugarbaker D, Stamler

JS:

Nitric

Oxide

Synthase

in

Human

and

Rat

Lung:

Immunocytochemical and Histochemical Localization. Am J Respir Cell Mol Biol 9: 371-377. (1993) 52.

Koradi R, Billeter M, Wüthrich K: MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures. J. Mol. Graphics 14:51-55. (1996)

53.

LeDizet M, Piperno G: ida4-1, ida4-2, and ida4-3 are intron splicing mutations affecting the locus encoding p28, a light chain of Chlamydomonas axonemal inner dynein arms. Mol. Biol. Cell 6:713-723. (1995)

54.

LeDizet M, Piperno G: The light chain p28 associates with a subset of inner dynein arm heavy chains in Chlamydomonas axonemes. Mol. Biol. Cell 6: 697-711. (1995)

55.

Maiti AK, Mattei MG, Jorissen M, Volz A, Zeigler A Bouvagnet P: Identification, tissue specific expression, and chromosomal localisation of several human dynein heavy chain genes. Eur. J. Hum. Genet 8: 923-932. (2000)

56.

Mannick JB, Asano K, Izumi K, Kieff E, Stamler JS: Nitric oxide produced by human B lymphocytes inhibits apoptosis and Epstein-Barr virus reactivation. Cell 79: 1137-1146. (1994)

57.

Mastronarde DN, O'Toole ET, McDonald KL, McIntosh JR Porter ME: Arrangement of inner dynein arms in wild-type and mutant flagella of Chlamydomonas. J. Cell Biol 118:1145-1162. (1992)

58.

McGrath J, Somlo S, Makova S, Tian X, Brueckner M: Two populations of node monocilia initiate left-right asymmetry in the mouse. Cell 114:61-73. (2003)

59.

Meeks M, Bush A: Primary ciliary dyskinesia. Pediatr Pulmonol 29: 307-316. (2000)

92

60.

Meeks M, Walne A, Spiden S, Simpson H, Mussaffi-Georgy H, Hamam HD, Fehaid EL, Cheehab M, Al-Dabbagh M, Polak-Charcon S, Blau H, O'Rawe A, Mitchison HM, Gardiner RM, Chung E: A locus for primary ciliary dyskinesia maps to chromosome 19q. J Med Genet 37: 241-244. (2000)

61.

Mitchell DR, Rosenbaum JL. A motile Chlamydomonas flagellar mutant that lacks outer dynein arms. J Cell Biol 100:1228-1234. (1985)

62.

Munro Nc, Currie DC, Lindsay KS, Ryder TA, Rutman A, Dewar A, Greenstone MA, Hendry WF, Cole PJ.: Fertility in male with primary ciliary dyskinesia presenting with respiratory infection. Thorax 49:684-687. (1994)

63.

Mygind N, Pedersen M: Nose-sinus and ear-symptoms in 27 patients with primary ciliary dyskinesia. Eur J Resp Dis 127: 96-101. (1983)

64.

Neesen, J., J. D. Drenckhahn, S. Tiede, P. Burfeind, M. Grzmil, J. Konietzko, C. Dixkens, J. Kreutzberger, F. Laccone, and H. Omran: Identification of the human ortholog of the t-complex-encoded protein TCTE3 and evaluation as a candidate gene for primary ciliary dyskinesia. Cytogenet Genome Res. 98:3844. (2002)

65.

Nonaka S, Tanaka Y, Okada Y, Takeda S, Harada A, Kanai Y, Kido M, Hirokawa N: Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell 95:829-37. (1998)

66.

Olbrich H, Haffner K, Kispert A, Volkel A, Volz A, Sasmaz G, Reinhardt R, Hennig S, Lehrach H, Konietzko N: Mutations in DNAH5 cause primary ciliary dyskinesia and randomization of left-right asymmetry. Nat. Genet 30: 143-144. (2002)

67.

Ostrowski, LE, Blackburn K, Radde KM, Moyer MB, Schlatzer DM, Moseley A, Boucher RC: A proteomic analysis of human cilia: identification of novel components. Mol cell Proteomics 1:451-456. (2002)

68.

Parr BA, Shea MJ, Vassileva G, McMahon AP: Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds. Development 119:247-261. (1993)

69.

Pavia D, Bateman JRM, Clarke SW: Deposition and clearance of inhaled particles. Bull Eur Physiopathol Respir 16:335-366. (1980) 93

70.

Pazour GJ, Agrin N, Walker BL, Wittman GB: Identification of predicted human outer dynein arm genes-candidates for primary ciliary dyskinesia genes. J Med Genet online published 3 jun 2005

71.

Pazour GJ, Dickert BL, Vucica Y, Seeley ES, Rosenbaum JL, Witman GB, Cole DG: Chlamydomonas IFT88 and its mouse homologue, polycystic kidney disease gene tg737, are required for assembly of cilia and flagella. J Cell Biol 151:709-718. (2000)

72.

Pedersen M, Mygind N: Rhinitis, sinusitis and otitis media in Kartagener’s syndrome (primary ciliary dyskinesia). Clin Otolaryngol 7: 373-380. (1982)

73.

Pedersen M, Stafanger G: Bronchopulmonary symptoms in primary ciliary dyskinesia. A clinical study of 27 patients. Eur J Respir Dis; 127: 118-128. (1983)

74.

Pennarun G, Escudier E, Chapelin C, Bridoux AM, Cacheux V, Roger G, Clement A, Goossens M, Amselem S, Duriez B: Loss-of-function mutations in a human gene related to Chlamydomonas reinhardtii dynein IC78 result in primary ciliary dyskinesia. Am J Hum Genet 65: 1508-1519. (1999)

75.

Perraudeau M: Lat presentation of Kartagener’s syndrome. Consequences of ciliary dysfunction. Br Med J 308: 519-521. (1994)

76.

Pfister KK, Fay RB, Witman GB: Purification and polypeptide composition of dynein ATPases from Chlamydomonas flagella. Cell motil 2:525-547. (1982)

77.

Phillips GE, Thomas S, Heather S, Bush A: Airway response of children with primary ciliary dyskinesia to exercise and beta2-agonist challenge. Eur Respir J 11: 1389-1391. (1998)

78.

Piperno G, Huang B, Luck DJ: Two-dimensional analysis of flagellar proteins from wild-type and paralyzed mutants of Chlamydomonas reinhardtii. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:1600-1604. (1977)

79.

Piperno G, Mead K, Henderson S: Inner dynein arms but not outer dynein arms require the activity of kinesin homologue protein KHP1 (FLA10) to reach the distal part of flagella in Chlamydomonas. J Cell Biol 133: 371-379. (1996)

94

80.

Piperno G, Ramanis Z, Smith EF, Sale WS: Three distinct inner dynein arms in Chlamydomonas flagella: molecular composition and location in the axoneme. J Cell Biol 110: 379-389. (1990)

81.

Piperno G, Ramanis Z: The proximal portion of Chlamydomonas flagella contains a distinct set of inner dynein arms. J Cell Biol 112: 701-709. (1991)

82.

Porter ME Sale WS: The 9 + 2 axoneme anchors multiple inner arm dyneins and a network of kinases and phosphatases that control motility. J Cell Biol 151: 37-42. (2000)

83.

Reed W, Carson JL, Moats-Staats BM, Lucier T, Hu P, Brighton L, Gambling TM, Huang CH, Leigh MW Collier AM: Characterization of an axonemal dynein heavy chain expressed early in airway epithelial ciliogenesis. Am J Respir Cell Mol Biol 23: 734-741. (2000)

84.

Rosenbaum JL, Witman GB: Intraflagellar transport. Nat Rev Mol Cell Biol 3:813-825. (2002)

85.

Rossman CM, Lee RMKW, Forrest JB, Newhouse MT: Nasal cilia in normal man, primary ciliary dyskinesia and other related respiratory diseases. Analysis of motility and ultrastructure. Eur J Respir Dis 127: 64-70. (1983)

86.

Rossman CM, Newhouse MT: Primary ciliary dyskinesia: evaluation and management. Pediatr Pulmonol 5:36-50. (1988)

87.

Rott HD: Kartagener’s syndrome and the syndrome of immotile cilia. Hum Genet 46: 249-261. (1979)

88.

Rutland J, Cole PJ: Nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency in cystic fibrosis compared with sinusitis and bronchiectasis. Thorax 36:654-658. (1981)

89.

Rutland J, Cole PJ: Non-invasive sampling of nasal cilia for measurement of beat frequency and study of ultrastructure. Lancet 2:564-565. (1980)

90.

Sakato M, King SM: Design and regulation of the AAA+ microtubule motor dynein. J. Struct. Biol. 146:58-71. (2004)

91.

Saleh D, Ernst P, Lim S, Barnes PJ, Giaid A: Increased formation of the potent oxidant peroxynitrite in the airways of asthmatic patients is associated with induction of nitric oxide synthase: effect of inhaled glucocorticoid. Faseb J 12: 929-937. (1998) 95

92.

Sanger F, Nicklen S, Coulson AR: DNA Sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Nat Acad Sci USA 74:5463-5467. (1977)

93.

Schidlow DW: Primary ciliary dyskinesia (the immotile cilia syndrome). Ann Allergy 73:457-468. (1994)

94.

Shaul PW, North AJ, Wu LC, Wells LB, Brannon TS, Lau KS, Michel T, Margraf LR, Star RA: Endothelial nitric oxide synthase is expressed in cultured human bronchiolar epithelium. J Clin Invest 94: 2231-2236. (1994)

95.

Silkoff PE, McClean PA, Slutsky AS, Furlott HG, Hoffstein E, Wakita S, Chapman KR, Szalai JP, Zamel N: Marked flow-dependence of exhaled nitric oxide using a new technique to exclude nasal nitric oxide. Am J Respir Crit Care Med 155: 260-267. (1997)

96.

Sisson JH, Stoner JA, Ammons BA, Wyatt TA: All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J Microsc 211:103-111. (2003)

97.

Sturgess J, Chao J, Wong J: Cilia with defective radial spokes. N Engl J Med 300:53-56. (1979)

98.

van der Baan S, Veerman AJ, Wulffraat N, Bezemer PD, Feenstra L: Primary ciliary dyskinesia: ciliary activity. Acta Otolaryngol 102:274-281. (1986)

99.

van Dorp DB, Wright AF, Carothers AD, Bleeker-Wagemakers EM: A family with RP3 type of X-linked retinitis pigmentosa: an association with ciliary abnormalities. Hum Genet 88:331-334. (1992)

100. Verra F, Fleury –Feith J, Boucherat M, Pinchon MC, Bignon J, Escudier E: Do nasal changes reflect bronchial changes? An ultrastructural study. Am Rev Respir Dis 147:908-913. (1993) 101. Withelaw A, Evans A, Corrin B. Immotile cilia syndrome: a new cause of neonatal respiratory distress. Arch Dis Child 56:432-435. (1981) 102. Wu H, Maciejewski MW, Marintchev A, Benashski SE, Mullen GP, King SM: Solution structure of a dynein motor domain associated light chain. Nat Struct Biol 7:575-579. (2000) 103. Wu, H., M. Blackledge, M. W. Maciejewski, G. P. Mullen, and S. M. King: Relaxation-based structure refinement and backbone molecular dynamics of the dynein motor domain-associated light chain. Biochemistry 42:57-71. (2003) 96

104. Yates DH, Kharitonov SA, Robbins RA, Thomas PS, Barnes PJ. Effect of a nitric oxide synthase inhibitor and a glucocorticosteroid on exhaled nitric oxide. Am J Respir Crit Care Med 152: 892-896. (1995) 105. Zariwala M, Noone PG, Sannuti A, Minnix S, Zhou Z, Leigh MW, Hazucha M, Carson JL, Knowles MR: Germline mutations in an intermediate chain dynein cause primary ciliary dyskinesia. Am J Respir Cell Mol Biol 25:577583. (2001) 106. Zhang YJ, O'Neal WK, Randell SH, Blackburn K, Moyer MB, Boucher RC Ostrowski LE: Identification of dynein heavy chain 7 as an inner arm component of human cilia that is synthesized but not assembled in a case of primary ciliary dyskinesia. J Biol Chem 277:17906-17915. (2002) 107. Zito I, Downes SM, Patel RJ, Cheetham ME, Ebenezer ND, Jenkins SA, Bhattacharya SS, Webster AR, Holder GE, Bird AC, Bamiou DE, Hardcastle AJ: RPGR mutation associated with retinitis pigmentosa, impaired hearing, and sinorespiratory infections. J Med Genet 40:609-615. (2003) 108. Zivert AK: Über einen Fall von Bronchiectasie bei einem Patienten mit situs inversus viscerum. Berliner klinische Wochenschrift, 1904, 41: 139-141.

97

12 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Mindenekelőtt köszönetemet fejezem ki Falus András professzor úrnak, hogy az általa vezetett PhD program résztvevője lehettem a II.sz. Gyermekklinika molekuláris genetikai kutatólaboratóriumában. Köszönöm témavezetőmnek Prof. Fekete Györgynek, hogy szakértelmével, kritikus észrevételeivel munkám során támogatott. Hálás vagyok, hogy munkámat a kezdetektől fogva tanácsaival és odafigyelésével segítette. Köszönettel tartozom németországi mentoromnak Prof. Heymut Omrannak, hogy freiburgi tanulmányutam során bekapcsolódhattam kutatócsoportjának munkájába és rengeteg technikai és elméleti tudással gazdagodhattam a legmodernebb genetikai kutatások területén. Köszönöm Dr. Manfred Fliegaufnak a kísérletek megtervezésében és kivitelezésében nyújtott nélkülözhetetlen segítségét, töretlen kitartását és optimizmusát. Hálás vagyok, hogy önzetlen szakmai és emberi segítségével a felmerülő nehézségek megoldásában, valamint a tudományos közlemények megírásában mindenkor készséggel segítségemre volt. Köszönöm Dr. Baktai György főorvos úrnak, hogy a magyar PCD betegek vizsgálati anyagát az általam végzett meolekulárgenetikai analízishez rendelkezésemre bocsátotta. Köszönettel tartozom Dr. Péterffy Erzsébetnek, aki nagy klinikai tapasztalatával valamint

szakértelmével

kísérleteimhez

elengedhetetlenül

szükséges

klinikai

háttérinformációkkal segítette munkámat. Végül köszönettel tartozom az II.sz. Gyermekklinika és a molekuláris genetikai kutatólaboratórium valamennyi munkatársának, hogy segítő, baráti légkörben végezhettem doktori munkámat.

Hálásan

köszönöm

családom

kitartó

98

biztatását

és

támogatását.

13 Saját publikációs lista 13.1 Az értekezés témájában megjelent közlemények Horvath J, Fliegauf M, Olbrich H, Kispert A, King SM, Mitchison H, Zariwala MA, Knowles MR, Sudbrak R, Fekete G, Neesen J, Reinhardt R, Omran H. Identification and analysis of axonemal dynein light chain 1 in primary ciliary dyskinesia patients. Am J Respir Cell Mol Biol. 2005 Jul;33(1):41-7. IF: 4,175 Fliegauf M, Olbrich H, Horvath J, Wildhaber JH, Zariwala MA, Kennedy M, Knowles MR, Omran H. Mislocalization of DNAH5 and DNAH9 in respiratory cells from patients with primary ciliary dyskinesia. Am J Respir Crit Care Med. 2005 Jun 15;171(12):1343-9. IF:8,123 Kispert A, Petry M, Olbrich H, Volz A, Ketelsen UP, Horvath J, Melkaoui R, Omran H, Zariwala M, Noone PG, Knowles M. Genotype-phenotype correlations in PCD patients carrying DNAH5 mutations. Thorax. 2003 Jun;58(6):552-4. IF: 4,188

13.2 Nem az értekezés témájában megjelent közlemények Schermer B, Hopker K, Omran H, Ghenoiu C, Fliegauf M, Fekete A, Horvath J, Kottgen M, Hackl M, Zschiedrich S, Huber TB, Kramer-Zucker A, Zentgraf H, Blaukat A, Walz G, Benzing T. Phosphorylation by casein kinase 2 induces PACS-1 binding of nephrocystin and targeting to cilia. EMBO J. 2005 Nov 24 Tacke U, Olbrich H, Sass JO, Fekete A, Horvath J, Ziyeh S, Kleijer WJ, Rolland MO, Fisher S, Payne S, Vargiami E, Zafeiriou DI, Omran H. Possible genotype-phenotype correlations in children with mild clinical course of Canavan disease. Neuropediatrics. 2005 Aug;36(4):252-5.

99

Horvath J, Ketelsen UP, Geibel-Zehender A, Boehm N, Olbrich H, Korinthenberg R, Omran H. Identification of a novel LAMP2 mutation responsible for Xchromosomal dominant Danon disease. Neuropediatrics. 2003 Jun;34(5):270-3. Fliegauf M, Frohlich C, Horvath J, Olbrich H, Hildebrandt F, Omran H. Identification of the human CYS1 gene and candidate gene analysis in Boichis disease. Pediatr Nephrol. 2003 Jun;18(6):498-505.

100

14 Összefoglalás Előzmények: A primer ciliáris dyskinesia (PCD) egy genetikailag heterogén betegség, amelyre az alsó és a felső légutak krónikus infekciói, a csökkent fertilitás valamint a betegek felében situs inversus előfordulása jellemző. A PCD hátterében a motilis csillók mozgászavara áll, ami immotilitásban vagy dysmotilitásban nyilvánul meg. A diagnózis általában elektronmikroszkópos vizsgálattal állítható föl, ami technikailag bonyolult és gyakran az eredményeket interpretálása nehéz. A PCD-ben leggyakrabban leírt ultrastrukturális defektus a könnyű (LC), a közepesen nehéz (IC), valamint a nehéz láncból (HC) álló külső dynein karok (ODA) részleges vagy teljes hiánya. A biflagelláns Chlamydomonas ODA humán orthológ génjének, a DNAH5-nek a recesszív mutációi PCD-t okoznak. A Chlamydomonas γ-ODA-HC motoros protein aktivitása az axonemális LC1 fehérje által szabályozott. Célktűzés: 1. A Chlamydomonas LC1 génjének humán (DNAL1) és murin (Dnal1) orthológ génjét azonosítása és ezen gének valamint az ezeket kódoló proteinek tulajdonságainak karakterizálása 2. Célunk volt továbbá olyan molekuláris alapokon nyugvó, új diagnosztikai eljárás kifejlesztése, amelynek segítségével a PCD diagnózisa non-invazív módon nagy biztonsággal megállapítható. Eredmények: 1. Az újonnan izolált humán DNAL1 és az azzal 97%-ban homológ murin Dnal1 gének a DNAH5-höz hasonlóan specifikusan expresszálódnak a testisben, az embrionális

csomóban,

a

respiratorikus

epitheliumban

valamint

az

ependymasejtekben. A Chlamydomonas LC1/γ-HC kötőhely a humán DNAL1 proteinben teljes mértékben konzervált. Koimmunoprecipitációs vizsgálattal elsőként szemléltetettem, hogy a humán DNAL1 és a DNAH5 proteinek egymással interakciót mutatnak. Ezen eredményekre alapozva megállapítottam, hogy a DNAL1 a PCD kiváló kandidáns génje. 86 PCD-ben szenvedő beteg DNAL1 génjét szekvenálása negatív eredményt hozott.

101

2. A DNAH5, a külső és a DNALI1 a belső dynein kar egy-egy proteinje ellen termelt antitesttel immunfloureszcens vizsgálatot végeztünk egészséges és 54 PCD-ben szenvedő egyén epithelsejtjein. Kontroll személyek epithelsejtjeiben a DNAH5 és a DNALI1 proteinek a csilló egész hosszában detektálhatók; PCD betegeknél ezen proteinek teljes vagy disztális hiánya figyelhető meg. A betegeknél összesen nyolc különböző DNAH5/DNALI1 festési mintát identifikáltunk: két-két izolált belső vagy külső dynein kar defektust és négy kombinált, belső és külső dynein kar károsodást. Következtetés: 1. Ugyan a negatív mutációanalízis kizárja a DNAL1 szerepét a PCD pathogenezisében, viszont a spermiumokban detektált nagymértékű DNAL1 expresszió arra enged következtetni, hogy a DNAL1 egy kiváló kandidáns gén a spermiumok immotilitásával járó infertilitás esetén. 2. A DNAH5 és a DNALI1 elleni antitestekkel történő immunfluoreszceins vizsgálat a jövőben új diagnosztikai eszköz lehet, mert non-invazív és nagy specificitással rendelkezik.

102

15 Summary

Identification of the DNAL1 gene and development of a novel genetic based diagnostic method in primary ciliary dyskinesia Background: Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a genetically heterogeneous disorder characterized by chronic infections of the upper and lower airways, situs inversus (50%) and reduced fertility. The phenotype of PCD results from dysfunction of motile cilia, which manifests in immotility and dysmotility. Diagnosis of PCD usually relies on electron microscopy, which is technically demanding and sometimes difficult to interpret. The frequent ultrastructural defects involve the absence of the outer dynein arms (ODAs), which are normally composed of several light (LCs), intermediate and heavy (HCs) dynein chains. Recessive mutations of DNAH5, the human ortholog of the biflagellate Chlamydomonas ODA γ-HC, cause PCD. In Chlamydomonas, motor protein activity of the γ-ODA-HC is regulated by binding of the axonemal LC1. Aim: 1. Identification of the human (DNAL1) and murine (Dnal1) orthologs of Chlamydomonas LC1 and characterization of the encoding proteins. 2. Establishment of a novel, genetic based diagnostic method, which helps a noninvasive, clear (obvious) diagnosis of PCD. Results: 1. The novel human DNAL1 is 97 % homologous to the murin protein Dnal1. We demonstrated that both of these proteins, similarly to DNAH5 have tissue specific expression in testis, in embrionic node, in respiratory, and in ependymal cells. The LC1/ g-HC binding motif in human DNAL1 is completely conserved. We were the first to show the interaction of human DNAH5 and human DNAL1 with co-immunoprecipitation method. Based on these findings, we considered DNAL1 a candidate for PCD. We also sequenced all exons of DNAL1 in 86 patients, the results of mutational analysis were negative. 103

2. Immunofluorescence staining of the inner dynein arm component of DNALI1 and the outer dynein arm component of DNAH5 in respiratory cells of 54 PCD patients and healthy controls were performed. In respiratory epithelial cells from a healthy probands, specific DNALI1 and DNAH5 staining were observed along the entire length of the axonemes, respectively. These proteins were either completely or only distally absent from the respiratory ciliary axoneme in patients with PCD. We observed eight distinct aberrant DNALI1/DNAH5 staining patterns: two isolated inner and outer dynein arm defect and four combined outer and inner dynein arm defects. Conclusion: 1. The strong expression in testis suggests that DNAL1 might play a particular role in sperm flagella, and raises the possibility that DNAL1 mutations are involved in male sterility, however the negative mutational analysis exclude the role of DNAL1 in the pathogenesis of PCD. 2. Immunofluorescence staining with anti-DNAH5 and anti-DNALI1 antibody might be novel diagnostic tool in the future, because it is non-invasive and high specific method.

104

A DNAL1 gén identifikálása és új, genetikai alapokon nyugvó diagnosztikai eljárás kifejlesztése primer ciliáris dyskinesiában

Recommend Documents