A csontritkulás és a műtéti csontpótlás molekuláris biológiai megközelítése

A csontritkulás és a műtéti csontpótlás molekuláris biológiai megközelítése Doktori értekezés

Dr. Lazáry Áron Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető:

Dr. Takács István, egyetemi docens, Ph.D.

Hivatalos bírálók:

Dr. Szekanecz Zoltán, egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Lacza Zsombor, egyetemi tanársegéd, Ph.D.

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Szendrői Miklós, egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr.Donáth Judit, adjunktus, Ph.D. Dr. Szűcs Nikolett, egyetemi tanársegéd, Ph.D.

Budapest 2009

Tartalomjegyzék 1.

Rövidítések jegyzéke

4

2.

Bevezetés

5

2.1.

Az oszteoporózis és szövődményeinek népegészségügyi

5

jelentősége 2.2. 2.2.1.

A csontanyagcsere molekuláris biológiája

8

A csontsejtek közötti molekuláris együttműködés a remodeling

9

során 2.2.2.

A remodeling endokrín szabályozása

13

2.3.

A csontritkulásban szerepet játszó génpolimorfizmusok

17

2.4.

Új kandidáns gének azonosítása – a szarvas-modell

18

2.5.

A kompressziós csigolyatörések minimál invazív sebészi

21

kezelésének lehetőségei 2.6. 2.6.1.

A sebészi csontpótlás aktuális kérdései

24

A gipsz szerepe a csontpótlásban

27

3.

Célkitűzések

28

4.

Módszerek

29

4.1.

A vizsgálati alanyok szűrése és beválogatása

29

4.2.

Gének és SNP-k kiválasztása

29

4.3.

DNS izolálás és genotipizálás az SNPstream rendszerrel

32

4.4.

Nucleus pulposus sejtek izolálása, tenyésztése és kezelése

33

4.5.

MC3T3 sejtek tenyésztése különböző tenyésztő-felszíneken

33

4.6.

Sejtszám-meghatározás

34

4.7.

Alkalikus

foszfatáz

aktivitás

és

Ca2+-koncentráció

35

meghatározása 4.8.

Génexpressziós vizsgálatok

35

4.9.

Statisztikai analízis

36

4.9.1.

Leíró statisztikai módszerek

36

4.9.2.

Elemző statisztikai módszerek

37

4.9.3.

Szekvencia analízis

38

2

5.

Eredmények

40

5.1.

Új génpolimorfizmusok kapcsolata a csontritkulással

40

5.1.1.

A vizsgálat egyes paramétereit leíró statisztikai analízisek

40

eredményei 5.1.2.

Asszociációs vizsgálatok

40

5.1.3.

Gén-gén interakciók elemzése

44

5.2.

A

szintetikus

csontpótló

graftok

alkalmazásának

46

A szintetikus graftok hatása a nucleus pulposus (NP) sejtek

46

molekuláris biológiai aspektusai 5.2.1.

életképességére 5.2.2.

Génexpressziós változások a csontpótló anyagok hatására

48

izolált nucleus pulposus sejtekben 5.2.3.

Az MC3T3 preoszteoblasztok alakja, osztódása és médium

49

alkalikus fosztfatáz aktivitása különböző tenyésztő felületeken 5.2.4.

A gipsz felület és a magas Ca2+ koncentráció hatása a

51

preoszteoblasztok génexpressziós profiljára

6. 6.1.

Megbeszélés Új kandidáns gének összefüggése a csontdenzitással és a

55 55

törési rizikóval 6.2.

A kompressziós csigolyatörés minimál invazív kezelésében

58

alkalmazott csontcementek hatása a nucleus pulposusra 6.3.

A szintetikus csontpótló graftként felhasználható gipsz

61

hatása preoszteoblaszt sejtekre

7.

Következtetések

64

8.

Összefoglalás

69

9.

Irodalomjegyzék

71

10.

Saját publikációk jegyzéke

95

11.

Köszönetnyilvánítás

97

3

1. Rövidítések jegyzéke AGC1 – aggrekán ALOX12 – arahidonsav-12 lipoxigenáz ALP /ALPL/ – alkalikus foszfatáz AND – androgén ANOVA – varianciaanalízis BGLAP – oszteokalcin gén BGN – biglikán BMD – csontsűrűség BMI – testtömeg index BMP – csont morfogenetikus fehérje BMU – többsejtes elemi egység BSP – csont szialoprotein CASR – kalcium-szenzor CATK – katenin COL1 – I. típusú kollagén C.I. – konfidencia intervallum CT – kalcitonin D3 – D-vitamin DBM – demineralizált csontmátrix DCN – dekorin DEXA – kettős energiájú röntgen abszorpciometria E3 – ösztrogén ECM – extracelluláris mátrix ESR1 – ösztrogén receptor-1 FABP3 – zsírsav kötő protein-3 FGF – fibroblaszt növekedési faktor FGFR1 – fibroblaszt növekedési faktor receptor-1 FN1 – fibronektin-1 GAPDH – glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz GH – növekedési hormon GLM – generalizált lineáris modell G x G – gén-gén interakció HA – hidroxi-apatit HSC – hemopoetikus őssejt IGF1 – inzulin-szerű növekedési faktor-1 IL – interleukin KCST – kompressziós csigolyatörés KORT – glükokortikoidok KP – kyphoplasztika LRP5 – lipoprotein receptor-kapcsolt fehérje-5

LRT

–

log-likelihood ratio teszt (valószínűséghányados próba) MAF – ritkább allél frekvenciája M-CSF – monocita-coloning stimuláló faktor MSC – mesenchymális őssejt MMP – mátrix metalloproteináz NFκB – nukleáris faktor kappa B NO – nitrogén-monoxid NP – nucleus pulposus OB – oszteoblaszt OC – oszteokalcin OCY – oszteocita OK – oszteoklaszt ON – oszteonektin OP – oszteoporózis OPG – oszteoprotegenin OPN – oszteopontin O.R. – esélyhányados PBS – foszfát pufferelt sóoldat PG – prosztaglandin PMMA – polimetil-metakrilát PPARγ – peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor gamma PTH – parathormon RANK – nukleáris faktor kappa B receptor aktivátor RANKL – nukleáris faktor kappa B receptor aktivátor ligand SD – szórás SIBLING – kis integrin kötő N-glikolizált protein SNP – egypontos nukleotid polimorfizmus T3/4 – pajzsmirigy hormon TCP – trikalcium-foszfát TGFβ – transzformáló növekedési faktor béta TIMP2 –metalloproteináz szöveti inhibítor-2 TNFα – tumor nekrózis faktor alfa TP – tenyésztő plate TRAP – tartarát rezisztens savi foszfatáz TSH – pajzsmirigy stimuláló hormon VDR – D-vitamin receptor VP – vertebroplasztika

4

2.

Bevezetés

2.1.

Az oszteoporózis és szövődményeinek népegészségügyi jelentősége Az oszteoporózis (OP) a csont mennyiségi és minőségi jellemzőinek progresszív

hanyatlásával jellemezhető népbetegség, mely a megváltozott szöveti és biomechanikai jellemzők miatt kis traumára bekövetkező, ismétlődő törésekhez vezet, magas morbiditási és mortalitási következményekkel. Az idősödő, indusztriális társadalmakra jellemző kórképben szenvedők száma az utóbbi évtizedekben megtöbbszöröződött, a második évezred elején világszerte több mint 200 millió ember él csontritkulással, és a betegek száma a jövőben nőni fog [1-3]. Az USÁ-ban 10 millió felett van az OP-ban szenvedők aránya, és az oszteoporotikus törések száma meghaladja az évi 1,5 milliót, több mint 17,9 milliárd dollár egészségügyi kiadást okozva [4]. Hazánkban 900 ezer főre tehető a csontritkulásban szenvedők száma, a betegek 2/3-a nő, 1/3-a férfi [5]. A porotikus

töréseket

tekintve

évi

30-40

ezer

kompressziós

csigolyatöréssel

számolhatunk, amelyek nagy része felderítetlen, kezeletlen eset. A csuklótörések száma 25 ezerre, a csípőtáji töréseké 15 ezerre tehető, és jelentős (évi 8-10 ezer) a csontritkulással összefüggő proximális humerus törések száma is [5, 6]. Az oszteoporózis és a csonttörések incidenciája drámaian megnő 50 éves kor felett; addig amíg 50 éves korban bármely törés elszenvedésére 2% az esély, ez 85 éves korra 28%ra nő [7]. Ennek oka egyrészt, hogy az idősödő szervezetben eleve könnyebben alakul ki az oszteoporózis, az életkorral járó biológiai, táplálkozási és életmódi változások miatt, másrészt a nőknél a menopauza hormonális következményei drasztikus hatással vannak a csontszövet biológiájára. A menopauzát követő öt-tíz évben bekövetkező csontvesztést írhatjuk a hormonális változások számlájára (posztmenopauzás OP), az idősebb életkorban kialakuló csontritkulás szorosabb összefüggést mutat a szeniumban bekövetkező élettani változásokkal (szenilis OP). Az incidencia adatok is jelzik a nők fokozott rizikóját. Egy 50 éves nőnek 40% esélye van, hogy hátralévő életében oszteoporotikus törést szenvedjen el, míg férfiaknál ez a rizikó kevesebb, mint 15% [8]. A korábban elszenvedett törések drámaian emelik a következő oszteoporotikus törések kockázatát. Egy csigolya kompressziós összeroppanását követő egy éven belül, a betegek 20%-a újabb törést szenved el. Csuklótörést követően duplájára nő a kockázata

a csípőtáji törés bekövetkezésének [7]. A törések növelik a mortalitást is; a csípőtáji törést követő egy éven belül a női betegek 17%-a halálozik el, a férfiaknál ez az arány 31% [9]. Kompressziós-csigolyatörés esetén a nők körében a halálozási kockázat több mint 60%-kal emelkedik és a fájdalommal járó törések esetében az egy éven belüli mortalitás 25-30% [10]. A halálozási mutatók alakításában jelentős szerepe van a törésekkel járó komorbid állapotoknak. A csípőtáji törést bekövetkezte után fél évvel a betegek 90%-a képtelen 800 métert egyedül gyalogolni, vagy félemeletnyit lépcsőn felmenni. A járóképesség még öt éves betegségtörténet után is nagymértékben beszűkült, a betegek 60%-a használ valamilyen segédeszközt és csak a betegek 20%-a fájdalommentes [11]. A hosszú immobilis állapot következtében kialakuló kórállapotok mellett (pneumónia, mélyvénás trombózis stb.), számolni kell azzal is, hogy a betegeknél – mozgásképességük beszűkülése következtében – drámaian tovább romlik a csontrendszer állapota. Az első – gyakran még traumára bekövetkező – törés után, az újabb oszteoporotikus törés olyan kismértékű erőbehatásra is bekövetkezhet, mint az ülő helyzetből történő felállás, vagy az ágyban történő megfordulás. Az OP diagnosztikájában elengedhetetlen lépés a csont ásványi anyag tartalmának, a csontsűrűségnek (bone mineral density, BMD) a mérése. A kettős energiájú röntgen abszorpciometriás technikával (DEXA) g/cm2-ben mérhető csontdenzitás jól jellemzi az adott régió csont-egészségét és a csökkent BMD fokozott törési rizikóval jár. A három standard mérési hely (combnyak, lumbális gerinc, disztális radius) BMD-jének 1 szórás-értéknyivel (SD) való csökkenése bármely oszteoporotikus törés elszenvedésének rizikóját 1,5-szeresére növeli. A combnyak esetében a BMD 1 SD-vel való csökkenése 2,6-szoros combnyak-törési rizikót von maga után [12]. A vizsgálat során oszteoporózisra utal a BMD-ből származtatott T-score alacsony értéke. A T-score az adott egyén csontdenzitásának eltérését jelzi a fiatal felnőttpopuláció csontdenzitás-átlagától, SD-ben megadva. Az európai gyakorlattól eltérően (ahol Tscore < -2,5 alatt tekintjük kezelendő mértékűnek a csontritkulást), az USÁ-ban a terápiás ajánlások „szigorúbbak”. Ott a csonttörések megelőzése érdekében, egyéb rizikófaktor hiányában T-score < -2,0 a kezelés határa, és T-score < -1,5 az ajánlás abban az esetben, ha más rizikó faktor is jelen van [13]. Az OP kialakulására és az oszteoporotikus törésekre hajlamosító rizikó faktorokat az 1. táblázatban foglaltuk össze. Számos független vagy egymást

6

befolyásoló tényező vezethet a fokozott törési rizikóval járó kórállapot kialakulásához. A „környezeti” rizikó faktorok közül több tényező befolyásolható (kalciumbevitel, alkoholfogyasztás, mozgáshiány stb.), míg számos tényező nem befolyásolható (életkor, nem stb.). 1. Táblázat ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ

Az oszteoporotikus törések kockázatát növelő faktorok [12]

Női nem Életkor Alacsony BMD Családban előforduló csípőtáji törés Szteroid-használat BMI < 20 kg/m2 Korábbi porotikus törés Dohányzás Alkoholfogyasztás > 2 egység/nap Fokozott csont-turnover Korai menopauza

ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ

Primer vagy szekunder amenorrhoea Primer vagy szekunder hypogonadizmus Elégtelen Ca-bevitel D-vitamin-hiány Ázsiai vagy kaukázusi rassz Immobilizáció Csökkent fizikai aktivitás Neuromuszkuláris betegség Látáscsökkenés

A BMD kialakításában az életmódi faktorok mellett örökletes, genetikai tényezők is szerepet játszanak. A genetikai faktorok jelentőségére irányították a figyelmet azok a kutatások, amelyek leírták a kóros csontsűrűség családon belüli halmozódását és a betegség prevalenciájának etnikai különbségeit. Régóta bizonyított, hogy a csúcscsonttömeg 60-80%-ban genetikailag determinált [9, 14-16], de a folyamatra ható gének pontos szerepét – csakúgy, mint a remodeling és a csontvesztés genetikai hátterét – az 1980-as évektől folyó intenzív kutatások ellenére – még nem ismerjük. Azon belül, hogy az OP multifaktoriális eredetű betegség, a genetikai háttér kialakításában számos gén együttes hatása érvényesül, tehát a kórkép poligénes öröklődésű [17, 18]. Nem sikerült olyan gént találni, amelynek mutációja egyértelműen felelős a csontritkulás kialakulásáért, sőt napjainkig több mint 200 gént azonosítottak, amelyek szerepe a csontanyagcserében illetve az OP patogenezisében valószínűsíthető, és számos gén variánsairól bizonyították, hogy ha kis mértékben is, de szignifikánsan befolyásolják a BMD-t és/vagy a törési rizikót [19, 20]. A 20. század végi kutatások fókuszában az egyes gének, adott génvariánsok szerepének leírása szerepelt, azonban

7

ezek eredményei – részben metodikai okokra visszavezethetően – ellentmondásosak. A legmodernebb

molekuláris

biológiai

eszközök

és

adatfeldolgozási

módszerek

lehetőséget teremtettek arra, hogy – egyszerre több gént/génvariánst vizsgálva – a komplex, poligénes betegség molekuláris patogenezisének megértéséhez közelebb kerüljünk, és a nem túl távoli jövőben ezekre a genetikai, molekuláris biológiai kutatásokra alapozva új diagnosztikai eszközöket és hatékony terápiás módszereket fejlesszünk.

2.2.

A csontanyagcsere molekuláris biológiája A csontszövet speciális felépítésű szövet, mivel a szerves alkotóelemek mellett

szervetlen – döntően hidroxi-apatitból [Ca10(OH)2(PO4)6] álló – állományt is tartalmaz. A hidroxi-apatit (HA) kristályokban fizikai erőbehatásra piezoelektromos jelenség lép fel, amely a kristály egyes felületeinek oldhatósági változásához vezet és a kristályszerkezet átépülését eredményezi. A szöveti változásokat tehát leképezik az apatit kristályok, ezért lehet a HA a dinamikusan rigid vázrendszer optimális szervetlen alkotóeleme [21]. A fejlődő vázrendszer kezdetben kötőszövetes-porcos elemekből áll, majd a késői embrionális korban kezdődik a mineralizáció folyamata, és a 2. dekádig folytatódik a csontok hosszirányú növekedése. A csontok életének ebben a szakaszában – növekedés és modeling – a csontképződés dominál, és az újcsontképzés nem igényel előzetes csontlebontást. Ez a folyamat a 2. dekádban a növekedési porcok elcsontosodásával véget ér, a csontok elérik végleges dimenzióikat. A mineralizáció még pár évig intenzíven folyik, ezért tehető a csúcscsonttömeg elérése a 2. dekád végére. A felnőttkori csontélettanra a remodeling folyamata jellemző, amely a felnőtt, érett csont folyamatos átépülését jelenti. A remodeling során a csontformáció és reszorpció térben és időben szorosan kapcsoltan zajlik és egészséges szervezetben a két folyamat intenzitása megegyezik [22]. A felnőtt szervezet tehát – ideális esetben – tartani tudja csúcscsonttömegét, miközben a folyamatos remodeling következtében a teljes vázrendszer 10 évente megújul [8]. Míg a növekedés és a modeling jobban érinti a hosszú csöves csontokat, a remodeling folyamata a trabeculáris csontállományban (köbös és lapos csontok, csöves csontok epifízise) intenzívebben zajlik. A remodeling

8

soksejtű, elemi egységekben (BMU - basic multicell unit) zajlik a csontok perioszteális és endokortikális felszínén. A szerves és szervetlen állomány – időben és térben megfelelő mértékű – képzése több szinten szabályozott folyamat. A csontállomány termelése és bontása végeredményben a csontsejtek, az oszteoblasztok, az oszteoklasztok és az oszteociták jól összehangolt együttműködésének köszönhető.

2.2.1. A csontsejtek közötti molekuláris együttműködés a remodeling során A csontszövetben található sejtek közül kiemelt jelentősége van az oszteoblasztoknak (OB), mivel elsődlegesen csontképző sejtekként funkcionálnak és a remodeling elsődleges szabályozásáért felelnek (1. Ábra). Az oszteoblasztok a csontvelő stromában elhelyezkedő mesenchymális őssejtekből (MSC) keletkeznek. Az MSC csontsejt irányú differenciálódásban fontos szerepe van a csont morfogenetikus proteineknek (BMP-k), a Runx és a SMAD transzkripciós faktor családoknak és kiemelt jelentőségű a Wnt szignál-útvonal [23-27]. Az MSC-ből más faktorok hatására differenciálódhat porcsejt (chondroblaszt), izomsejt (mioblaszt), fibroblaszt és adipocita is [26, 28]. A chondrogenezis fontos szignálja a SOX9, míg az MSC zsírsejt irányú differenciálódásában

kiemelt

szerepe

van

a

PPARγ

transzkripciós

faktor

expressziójának [29, 30]. Az érett oszteoblasztokra az extracelluláris (EC) mátrixot alkotó fehérjék intenzív termelése jellemző. A csontszövet szerves állományának 90%-át kollagén és nem kollagén típusú mátrix fehérjék alkotják. A csontra jellemző kollagén típus a glicinben és prolinban gazdag I. típusú kollagén, melynek kétféle láncmolekulája (α1 és α2) két génről íródik át (COL1A1 és CO1A2). Az ún. minor kollagének (III., V., X. típusok) a COL1-rostok „összeszerelésében” és a kollagén-hálózat integritásában játszanak szerepet. A nem kollagén típusú mátrix elemek közé tartoznak a proteoglikán, a glikoprotein-, a gamma-karboxilált- és az ún. SIBLING- (small integrin binding Nglikolizált protein) fehérjecsaládok tagjai. Általánosságban az ide tartozó kis mátrixmolekulák a kollagénfibrillumok közti keresztkötések és a sejt-mátrix kapcsolat kialakításáért, fenntartásáért felelősek. A biglikán (BGN) a fejlődő-, növekedő-, a

9

dekorin (DCN) az érett csontra jellemző két fontos proteoglikán [31, 32]. Mindkét molekulának szerepe lehet a transzformáló növekedési faktor (TGFβ) transzkripciós faktor család tagjainak megkötésében, és így a csontsejtek proliferációjának és differenciálódásának szabályozásában is [32-35]. A csontszövetben expresszálódó nem szövetspecifikus alkalikus foszfatáz (ALP) felelős a foszfátvegyületek hidrolítikus hasításáért, így a HA képződéséhez szükséges foszátionok szöveti koncentrációjának növeléséért. Az ALP – EC Ca2+-kötő fehérjeként – a mineralizáció folyamatát is precipitálja [22]. Az oszteonektin (ON) az oszteoblasztok érésében, proliferációjában és a mineralizációban játszik szerepet [36, 37]. A SIBLING fehérjecsaládba tartozik – egyebek mellett – a csontszövetre specifikus csont szialoprotein (BSP), az oszteopontin (OPN) és a fibronektin-1 (FN1), amelyek a Ca2+-ionok kötéséért és az egyes mátrixelemek összekapcsolásáért illetve a – remodeling folyamatában obligát – sejtmátrix kapcsolatok fenntartásáért felelősek [38-40]. Az oszteokalcin (OC) olyan gamma-karboxilált fehérje amely csak a csontszövetben termelődik és a csont bontás szabályozásában van szerepe. Ca2+-kötő tulajdonsága – a protein-S-hez hasonlóan – Kvitamin dependens poszttranszlációs módosulásoktól függ [41, 42]. Az oszteoblasztok – az intenzív termelés következtében – körbe veszik magukat az oszteoid állománnyal, és a csontfelszínről a mélyebb rétegekbe kerülve oszteocitává (OCY) alakulnak. A korábbi elképzelésekkel ellentétben ma már tudjuk, hogy az oszteociták nem passzív, nyugvó sejtek, hanem aktívan részt vesznek a szöveti metabolizmusban és a remodelingben is. Ezek a sejtek mechanoreceptorként működnek, a csontot ért erőbehatások, mechanikai ingerek molekuláris változásokat indukálnak az oszteocitákban [43-45]. Mivel az oszteociták nyúlványaik segítségével kapcsolatban állnak egymással, ezért valószínűsíthető, hogy a fizikai ingerek következtében kialakuló biológiai változások egész sejt-hálózatokat érintenek, így a csontszövet nagyobb kiterjedésű területén indukálódik a remodeling folyamata [46]. Az oszteociták az EC mátrix metabolizmusában is szerepet játszanak, oszteokalcin és más mátrix-elemek termelésével. A mechanikai ingerre a sejtek inzulin-szerű növekedési faktor-1 (IGF1), nitrogén-monoxid (NO), RUNX2 és prosztglandin (PG) szintézissel válaszolnak [47, 48]. Az előbbi három faktor elsődlegesen az oszteoblaszt érést illetve az oszteoblasztok mátrixtermelését serkenti, míg a PG a csontbontó oszteoklasztokra hat [45].

10

TNFα adipocyta PPARγ

IL4

HSC

MSC

SOX9

chondroblast

IL6

M-CSF RANKL/RANK C-FOS NFkB

IL1 BMP2,4 SMAD3 Wnt

IGF1

IL11 RANK

FGF

RANKL

PDGF

OK OPG

OB H+

CATK TRAP

BMP DCN

BSP

COL1A1 FN

OPN

BGN

ON

AGC ALP

MMP

TGFB

OC

HA

OCY RUNX2 IGF1

NO

PG mechanikai inger

serkentés

gátlás

differenciálódás

1. Ábra A remodeling folyamatában szerepet játszó molekuláris rendszer Az oszteoklasztok (OK) a hemopoetikus őssejtből (HSC) keletkeznek és a monocitákkal mutatnak rokonságot [49]. A több sejt fúziójából létrejövő, sokmagvú óriássejtek érésében a monocita-coloning stimuláló faktornak (M-CSF), a c-FOS-nak, az NFkB-nak és a RANKL-RANK rendszernek tulajdonítanak jelentőséget [50-52]. Az érett oszteoklasztok nem-specifikus észterázok (pl. tartarát rezisztens savi foszfatáz TRAP), kollagenázok, mátrix metalloproteinázok (MMP), kateninek (CATK) termelésével a szerves alkotóelemek lebontását végzik [43, 53]. A csont felőli hullámos sejtfelszín bővelkedik protonpumpákban és transzmebrán klorid-csatornákban; a HA lebomlásához szükséges savas kémhatású környezetet is ezek a sejtek tartják fent. A remodeling során az oszteoklasztok kis mélyedéseket vájnak ki maguk alatt a csontban, majd elhagyják az üreget, ahová aztán oszteoblasztok kúsznak be és elkezdik termelni az új csontállományt.

11

A remodeling fontos eleme az oszteoblaszt-oszteoklaszt kapcsolat, amely a folyamat fő parakrín szabályozási csomópontja [54-56]. Az aktív oszteoblasztok számos olyan molekulát expresszálnak, amelyek a csontsejtek érését, működését közvetlenül befolyásolják. Elsősorban autokrín módon ható faktorok az IGF1 és a fibroblaszt növekedési faktor (FGF), amelyeket az oszteoblasztok termelnek és saját érésüket, működésüket serkentik velük. Az oszteoid állományba az oszteoblasztok BMP-ket és TGFβ-t építenek. Az oszteoklasztok működésének következtében, az oszteoid állomány degradálódásával ezek a faktorok felszabadulnak a mátrixból és a csontbontó oszteoklasztokra illetve a csontbontó enzimekre közvetlenül gátló hatást fejtenek ki, míg a csontépítő oszteoblasztok érését és mátrix-termelését serkentik [55]. Ez a folyamat gyakorlatilag egy időben – akár hónapokra, évekre – elnyújtott parakrín szabályozási elem. Az oszteoblasztok számos olyan faktort/citokint termelnek, amelyekkel a gyulladásos reakció kapcsán, az immunrendszer működésének leírása során találkozhatunk.

A

csontmetabolizmus

és

az

immunrendszer

kapcsolatának

feltérképezése az oszteoimmunológia tárgykörébe tartozik, de számos kísérleti oszteoporózis gyógyszer a fenti kapcsolatok molekuláris hálózatának modulálásán keresztül hat [57, 58]. Az oszteoklasztok felszínén expresszálódik az NF-κB receptor aktivátor molekula (RANK), melynek ligandja, a RANKL az eddig megismert legerősebb oszteoklaszt aktiváló faktor [59-61]. A RANKL-t az oszteoblasztok termelik és a RANK-RANKL kapcsolódás hatására több oszteoklaszt keletkezik és az érett oszteoklasztok intenzív csontbontásba kezdenek. Az oszteoblaszt azonban termel egy oszteoprotegeninnek (OPG) nevezett fehérjét, amely szolubilis RANKL receptorként a RANKL-hoz kötődve megakadályozza a RANKL-RANK kapcsolódást (decoy receptor) és így az oszteoklaszt aktivációt [62, 63]. A fenti folyamat következménye, hogy a remodeling során kiemelt jelentősége van a szöveti RANKL/OPG hányadosnak. Amennyiben az OPG expresszió csökken, vagy a RANKL expresszió megnő (és itt a ligand és a receptor funkcionális változásait is ide kell érteni) a csontbontás fokozódik, a remodelinget szimbolizáló mérleg nyelve a reszorpció irányába billen. Ellentétes hatású a blasztok OPG termelésének megnövekedése, vagy a klasztok RANK expressziójának csökkenése [64-66].

12

A RANK/RANKL/OPG rendszer mellett, számos egyéb citokin vesz részt a remodeling szabályozásában [57, 58, 67]. Az oszteoblasztok által termelt interleukin-1 (IL1)

kettős

hatású

molekula

[68].

Egyfelől

serkenti

az

oszteoblasztok

kollagéntermelését, másfelől részben közvetlenül, részben a reszorpciót fokozó interleukin-6 (IL6) expressziójának és hatásának erősítésével az oszteoklasztokat aktiválja [69]. Az IL6 nagyon erős reszorpciós hatású molekula, és ezt jól példázza, hogy IL6 illetve IL1 hiányos egerekben még ovariektómia hatására sem fejlődik ki oszteoporózis [70-72]. Az interleukin-11 (IL11) szintén a blasztok által termelt citokin, amely a klasztok működését serkenti [73]. A T-limfociták által termelt citokinek az oszteoblasztokra gátló, míg az oszteoklasztokra serkentő hatású interleukin-4 (IL4) és a mindkét sejtre serkentő hatású, tehát a teljes remodeling folyamatát fokozó tumor nekrózis faktor alpha (TNFα) [74]. Az előbbiek szerepe kiemelt a különböző autimmun kórképekhez

(pl.

rheumatoid

arthritis)

kapcsolódó

fokozott

periartikuláris

csontritkulásban [75], de a primer oszteoporózisban és a fizilógiás remodelingben is jelentős funkcióval bíró molekuláris tényezők [76].

2.2.2. A remodeling endokrín szabályozása A csontanyagcsere szabályozásában számos endokrín faktor vesz részt. A három direkt kalcitrop hormon – parathormon (PTH), D-vitamin (D3), kalcitonin (CT) – mellett számos hormon és citokin a véráram útján jut a csontsejtekhez, amelyekre közvetlen vagy közvetett hatást gyakorolva befolyásolják a remodeling folyamatát (2. Ábra). Az endokrín szabályozás kapcsán is kiemelendő a fent részletezett – csontsejtek közti – molekuláris kommunikációs hálózat, mivel számos hormon hatása ennek a hálózatnak a befolyásolása útján valósul meg [54]. A PTH-t a mellékpajzsmirigy fősejtjei termelik, a peptidhormon elválasztását stimuláló inger a szérum kalcium szint csökkenése. A PTH közvetlenül fokozza a vesében a Ca2+-reabszorpciót, és a D3-hatás fokozásán keresztül növeli a bélben a Ca2+felszívódást. A csontban PTH-receptort csak az oszteoblasztok felszínén találunk, a PTH direkt csonthatásai az oszteoblasztok közvetítésével valósulnak meg. A PTH a csontbontás fő fiziológiás aktivátora. Hatására az oszteoblasztok citokin-termelése megváltozik, az oszteoklasztokat aktiváló IL1, IL6, IL11, és RANKL termelés

13

növekszik, míg az OPG-szint csökken, így az oszteoklasztok érése és aktivitása megnő, a csontból intenzív Ca2+-mobilizálás kezdődik. A PTH hatására az oszteociták csontbontó sejtekké alakulhatnak (oszteocitás oszteolízis). Ezek tükrében érthető, hogy a

látens,

vagy

manifeszt

hiperparatireózis

miért

jár

súlyos

csontrendszeri

következményekkel. A PTH kapcsán meg kell említeni, hogy 1932-ben Selye János leírta a klasszikus csontreszorpciós PTH-hatás mellett, az intermittáló PTH-kezelés csonttömeg növelő következményét. Ma már bizonyított, hogy az intermittáló PTHkezelés hatására az OPG termelés fokozódik, miközben a RANKL-szintézis csökken az oszteoblasztokban, és a csökkenő RANKL/OPG arány a csontépítés irányába dönti a remodeling mérlegét. A fenti hatást kihasználva alkalmazhatunk – főleg súlyos esetekben – subcután teriparatid (rekomibnáns PTH) injekciót oszteoporózis kezelésére jó eredménnyel. [21, 77-79]

intesztinális Ca2+ abszorpció

renális Ca2+ reabszorpció

D3 PTH

E3

CT T3/4

AND

KORT

GH

OC prekurzor TNFα IL1

IL6 CTR

IL11

IGF1

RANKL OPG

ERα,β

TGFβ VDR

PTHR

ERα,β

osteocytás osteolízis ERα,β

serkentő hatás

gátló hatás

közvetett hatások

2. Ábra Humorális faktorok a remodeling szabályozásában

14

A D-vitamin (D3) – vagy helyesebben D-hormon – az utóbbi években az egyik legtöbbet vizsgált hormonná vált. A D3-ra irányuló fokozott figyelem annak köszönhető, hogy a régen ismert klasszikus hatások (fokozott intesztinális Ca2+felszívódás, intenzívebb csont-remodeling) mellett az utóbbi évtizedben számos új szkeletális, illetve extraszkeletális D3-hatást írtak le (ún. nem-klasszikus D3-hatások). Felsorolás jelleggel említve, a D3 pozitív hatását erősítették meg autoimmun, fertőzéses és különböző tumoros megbetegedések kapcsán, de a csontritkulás szövődményei szempontjából fontos tény, hogy D3 hiányában az izomzat állapota és az egyensúlyérzék is romlik, fokozva ezzel az elesések és így a törések előfordulási gyakoriságát. A D3 a sejtmagi receptorokon (VDR) keresztül fejti ki hatásainak javarészét, a receptor aktivációja gének transzkripcióját módosítja. A VDR az oszteoblasztokban és az oszteoklaszt-prekurzorokban is megtalálható, a D3 jelenléte szükséges a csontsejtek megfelelő éréséhez és működéséhez. Hatására nő az oszteoblasztok IL11, IL1, IL6 és RANKL-termelése, amelyek a klasztok működését serkentik, de a D3 ugyanakkor fokozza az IGF1 hatását és a blasztok TGFβ-termelését, így a mátrix-termelést és mineralizációt is. A D3 tehát a remodeling teljes folyamatát serkenti, elengedhetetlen hormon a csontállomány folyamatos megújulásához. A D3 pótlása szükséges minden olyan esetben, ahol a D3-hiány – az elégtelen bevitel (táplálkozási okok), csökkent endogén képződés (napfény hiánya, időskor) vagy a fokozott szükséglet (pl. terhesség) – miatt bizonyított vagy feltételezhető. Az antiporotikus terápiának majd minden esetben része kell, hogy legyen a D3 szubsztitúció. [77, 80, 81] A kalcitonin (CT) a csontbontás legerősebb inhibitora [82]. Az oszteoklasztok felszínén található receptoraik aktivációja hatására a klasztok „megbénulnak”, összegömbölyödnek és abbahagyják reszorpciós tevékenységüket. A pajzsmirigy parafollikuláris C-sejtjeit aktiváló inger a szérum Ca2+-szint emelkedése. Humán OP terápiára elsősorban injekciós vagy orrspray formában bejutattot lazac-kalcitonin használható, és alkalmazásával az oszteoporotikus törésekkel összefüggő fájdalmak is csökkenthetők [83]. A női és a férfi nemi hormonok egyaránt hatással vannak a remodeling folyamatára [84]. Az ösztrogének (E3) receptorai megtalálhatók minden csontsejten és gátolják a csontbontást részben a CT aktivitásának serkentésével, részben a PTH aktivitásának gátlásával. Ezenkívül az IGF1 expressziót növelve a blasztok kollagén és

15

TGFβ-termelését növelik, míg számos reszorptív citokin (TNFα, IL1, IL6) szintjét csökkentik [85]. Az ösztrogének csontvédő hatását jól szemlélteti a menopauza idején bekövetkező fokozott csontvesztés, amiért a menopauza időszakában bekövetkező drasztikus ösztrogén szint csökkenés felelős [86]. Az androgének (AND) kiemelt szerepe a növekedő csontban az epifízis fúgák „lezárása”, így a csont hosszirányú növekedésének leállítása és a mineralizáció serkentése. Felnőttben az androgének gátolják a csontbontást és növelik a csontképzést és ezt a hatásukat részben közvetetten érvényesítik, mivel az androgén hormonokból a szöveti aromatáz enzimek hatására ösztrogének keletkeznek [87]. A növekedési hormon (GH) és a pajzsmirigy hormon (T3/4) elengedhetetlen a csontok normális éréshez, a növekedés folyamatához. A GH szöveti mediátorain (csontban főleg az IGF1) keresztül fejti ki anabolikus hatását [88]. A pajzsmirigy hormonok (T3/4) csontrendszeri jelentőségét jól tükrözi a csökkent pajzsmirigy-hormon képzéssel

járó

csecsemőkori

jódhiány

illetve

a

veleszületett

enzimzavarok

következményei. Az ilyen betegek csontrendszere fejletlen, a növekedésben elmaradnak, csontjaik görbék, gyakrabban törnek. A T3/4 növeli az IGF1 termelést, így az oszteoblasztok aktivitását, másrészt – az IL6 és a TNFα expressziójának serkentésével – növeli az oszteoklasztok számát és aktivitását, így a remodeling teljes folyamatára hat [89]. A glükokortikoidok (KORT) csontrendszeri hatásaival szintén gyakran találkozhatunk betegség képében, a tartós szteroid kezelést követően kialakuló szekunder oszteoporózis formájában [90]. Csökkentik a bélből a Ca2+-felszívódást, részben közvetlenül, részben a D3 aktiváció gátlásával és fokozzák a vesén keresztüli kalcium-vesztést. Az oszteoblasztok érésére és aktivitására negatív hatással vannak, így gátolva a csontépítést, míg az RANKL/OPG arányt kedvezőtlenül befolyásolva a reszorpciót serkentik [91]. Összefoglalva tehát a glükokortikoidok hatására csontvesztés következik be. A fenti – hangsúlyozottan rövid és a legfontosabb molekuláris tényezőkre fókuszáló – összefoglalásból látható, hogy a csontok élettanában, egészséges működésükben számos molekuláris tényezőnek (hormonok, enzimek, jelmolekulák és receptoraik valamint mindezek génjei stb.) kiemelkedő szerepe van. Azt sem állíthatjuk, hogy egy faktornak vagy faktorcsoportnak kulcsszerepe van a remodeling

16

folyamatában, mivel maga a folyamat is többszinten értelmezhető. Sokkal inkább jól összehangolt molekuláris hálózatok, egymással interakcióban, kapcsolatban lévő molekulák, gének együttes működése határozza meg a folyamat végső kimenetelét, amely a lokális (és generális) csontépítés / csontbontás arányaként definiálható.

2.3.

A csontritkulásban szerepet játszó génpolimorfizmusok A kalcium metabolizmus és a csontsejtek szabályozásában részt vevő gének

tanulmányozása során több mint kétszáz olyan gént azonosítottak már, amelyeknek az oszteoporózis kialakulásában szerepe van [19, 20, 92]. A betegség genetikai hátterében fontos tényezők a kandidáns gének allelikus variánsai és kiemelten az egypontos nukleotid polimorfizmusok (single nucleotide polymorphism, SNP). Számos ilyen genetikai variáns összefüggését írták le a csontdenzitással és/vagy a törési rizikóval, illetve más csontritkulásban vizsgált fenotípussal. Az SNP-k esetében az asszociációs vizsgálatok egy része ún. funkcionális SNP-ket tanulmányozott, azaz, olyan polimorfizmust, ahol a báziscsere – feltételezhetően vagy bizonyítottan – a gén funkciójának (transzkripció, splicing stb.) megváltozását eredményezi és a kódolt mRNS / fehérje mennyiségében vagy minőségében kerül végül a genetikai hatás kifejeződésre. A vizsgálatok másik típusánál az SNP-k segítségével feltérképezték az adott gént, vagy egyes kromoszóma-szakaszokat, a betegséggel asszociált variánsokat genetikai markerként felhasználva. A kapcsoltsági viszonyok alapján a szignifikáns SNP-k kijelölik azokat a génszakaszokat, amelyeken beül – valószínűleg – található az alteráló gén-funkcióhoz vezető variáns. A kandidáns gének és SNP-k egy részénél az eredményeket a további vizsgálatok megerősítették, míg más SNP-k esetében a hasonló vizsgálatok eltérő vagy egymásnak ellentmondó következtetésre jutottak. Néhány kandidáns gén esetében a csontritkulásra gyakorolt hatás bizonyítottnak tekinthető, a témában született nagyszámú asszociációs vizsgálat és az adott polimorfizmusok hatásának in vitro tesztelése során kapott eredmények alapján. Ezeket a kandidáns géneket a 2. Táblázatban foglaltuk össze.

17

2. Táblázat Kandidáns gének az oszteoporózis patomechanizmusában Gén szimbóluma

Kódolt fehérje neve

Sejtélettani szerep

Csontélettani szerepe

Kapcsolat a csontritkulással

liporpotein receptorkapcsolt fehérje 5

A kanonikus Wnt szignálútvonal koreceptorai, aktivációja eredményeként a b-katenin IC szintje emelkedik és a b-katenin regulált gének transzkripciója megnő.

Serkenti az oszteoblaszt proliferációt, érést és működést.

1330Val és a 667Met allélok csökkent BMD-vel járnak és növelik a törési rizikót [92-98]

COL1A1

I. típusú kollagén

Major kollagénként a szövetek EC mátrixának felépítésében vesz részt.

A csont EC mátrix fő szerves alkotóeleme.

Az Sp1 „s” allélja szignifikánsan növeli a vertebrális törési rizikót és csökkent csontdenzitást eredményez. [99-102]

TGFβ

transzformáló növekedési faktor béta

Kritikus intracelluláris folyamatok szabályozása az embrionális fejlődés és a posztnatális élet során.

Az oszteoblasztok és az oszteoklasztok érésének és működésének szabályozása.

Számos polimorfizmusát írták le az oszteoporózissal összefüggésben. [99, 103, 104]

BMPs

csont morfogenetikus proteinek

Csontfejlődést serkentő molekulák.

Az oszteoblasztok érését és működését serkentik.

A BMP2 Ser37Ala polimorfizmusa és a BMP4 Ala152Val variánsa szignifikánsan befolyásolják a csontdenzitást.[92, 105-108]

VDR

D-vitamin receptor

A D3 intracelluláris receptoraként gének transzkripcióját szabályozza.

Az egészséges csontturnovert serkenti, az oszteoblasztok és az oszteoklasztok működésének szabályozásával.

Régóta vizsgált polimorfzmusai (BsmI, ApaI, TaqI) különböző mértékben befolyásolják a csontdenzitást és a törési rizikót. [107, 108]

TNFS11 / TNFRSF11B

NF-κB receptor aktivátor ligand (RANKL) / osteoprotegenin (OPG)

Az OPG a RANKL szolubilis receptoraként gátolja a citokin kapcsolódását a sejtfelszíni receptorához (RANK).

A RANKL az oszteoklasztok aktiválásán keresztül csontreszorpciót indukál.

A RANKL promóterhaplotípusát illetve az OPG polimorfizmusait írták le a csontdenzitással összefüggésben. [18, 70, 92, 109-111]

Az ösztrogén intracelluláris receptora.

Aktivációja csontvédő hatású az oszteoblasztok serkentése és a reszorpciós citokinek termelésének gátlása révén.

XbaI, PvuII SNP-ek és a promóter régióban található TA repeat polimorfizmusnak szerepét írták le számos vizsgálatban. [18, 99, 112, 113]

LRP5

ESR1

2.4.

ösztrogén recetor alpha

Új kandidáns gének azonosítása – a szarvas-modell Az oszteoporózis humán betegség, nem fordul elő más gerinces fajokban.

Azonban a csontritkulás, mint jelenség megfigyelhető a különböző agancsos állatoknál, az agancsnövesztés ciklusos folyamatában. A gímszarvas (Cervus elaphus) képes az állatvilágban a legrobosztusabb csontépítő tevékenységre az éves ciklusokban zajló agancsképzés során [114, 115]. Az agancs növekedésének üteme meghaladhatja a

18

100g/napot is a május-júliusi időszakban, nem ritkán hatalmas, 14-17 kg-os kifejlett agancsot

eredményezve.

Az

agancs

növekedése

egy

módosult

enchondrális

csontképzési folyamat [116]. Ezt az intenzív csontépítést az állat 100-120 nap alatt végzi. Ilyenkor a szarvas kalciumban gazdag táplálékot fogyaszt, azonban a masszív ásványi anyag szükségletet nem tudja mind külső forrásból fedezni. Az agancsképzéshez szükséges ásványi anyagot saját csontvázából vonja ki, melynek következtében az állatban időszakos, fiziológiás oszteoporózis alakul ki [117]. A legjelentősebb csontreszorpció a bordákban tapasztalható, ahol a csont ásványi állományának 20-25%-a „eltűnik” az agancsképzés során. Az ún. dőreség júliustól augusztus végéig eső időszakában – az agancs kifejlődése után – történik a csontvázba az „elvesztett” kalcium-tartalom visszapótlása. Ilyenkor az állat kalciumgazdag táplálékokat fogyaszt és pihen, elfekszik, kerüli a fizikai igénybevételt. Az agancs – már nem csontos – érésének befejeztével a csont-visszapótlás folyamata is teljessé válik, a hím szarvas szép, új agancsával és megújult, egészséges csontrendszerével készen áll a csatározásokkal járó őszi párzási időszakra (3. Ábra). A fenti folyamat – az ásványianyag-tartalom porotikus csontokba való visszapótlása – egyedülálló az élővilágban, pontos mechanizmusát nem ismerjük. Munkacsoportunk

kollaborációja

a

gödöllői

Mezőgazdasági

Biotechnológiai

Kutatóközpontjának Genetika Intézetével, illetve az ELTE Genetikai Tanszékével azt a célt tűzte ki, hogy a szarvas agancsfejlődési ciklusa genetikai hátterének feltérképezése után olyan humán génortológokat azonosítunk, amelyek szerepe a csontritkulásvisszapótlás folyamatában kiemelten fontos lehet, és a humán oszteoporózis molekuláris hátterének megértéséhez és biológiai terápiák fejlesztéséhez közelebb vihetnek. A kutatás rendkívül szerteágazó folyamata során a gödöllői munkacsoport – expressziós array-ek segítségével – „meggyanúsított” olyan géneket, amelyek humán ortológját in silico azonosították [117]. Ezután munkacsoportunk egészséges és oszteoporotikus humán csontszövetben mérte a már korábban leírt kandidánsok, és az új gyanúsított gének – összesen 120 gén – expressziós szintjét, real-time PCR technikával [118, 119]. Az első vizsgálatok eredményeként megneveztünk öt olyan gént, amelyek csontbiológiai szerepét már leírták vagy valószínűsítették, de a humán oszteoporózisban ezeket a géneket eddig nem vizsgálták, és saját vizsgálatainkban szignifikáns vagy trendszerű expressziós különbségeket mértünk az egészséges és a porotikus

19

csontszövetet összehasonlítva. Ezek a gének a következők voltak; alkalikus foszfatáz (ALPL), zsírsav kötő protein-3 (FABP3), fibroblaszt növekedési faktor receptor-1 (FGFR1), mátrix metalloproteináz-2 (MMP2), metalloproteináz szöveti inhibítor-2 (TIMP2). A további – a disszertáció szorosabb tárgykörébe tartozó – vizsgálatokban ezen új kandidáns gének allelikus variánsainak és a csontritkulásnak kapcsolatát vizsgáltuk.

3. Ábra A gímszarvas agancs-képző ciklusa A kora tavaszi időszakban kezdődik az új agancs növesztése, amely a vázrendszer oszteoporozisának fokozatos kialakulásával jár együtt (A). A késő nyári hónapok során kalciumdús táplálék fogyasztásával a szarvas megkezdi a a csontrendszer visszapótlását (B), hogy az őszi párzási időszakra mind az agancs, mind a fizikai erőnlét szempontjából felkészült legyen (C).

20

2.5.

A kompressziós csigolyatörések minimál invazív sebészi kezelésének

lehetőségei Világszerte több mint évi 1 millió kompressziós csigolyatörés (KCST) következik be, főleg oszteoporotikus betegekben, és a KCST-ek száma évről évre növekvő tendenciát mutat [1-3, 120]. A csigolyakompressziót elszenvedők kilátásai, mind a morbiditást, mind a mortalitást tekintve romlanak. Az összeroppant csigolyatest csontcementtel való kitöltése egy olyan minimál invazív sebészi technika, amely segítségével jelentős mértékű fájdalomcsillapítás és kyphosis-korrekció érhető el az adott szegmentum belső stabilizálásával. A vertebroplasztika (VP) technikáját Galibert és munkatársai publikálták 1987-ben [121]. E technika során egy apró bőrmetszést követően, az intrapediculárisan az összeroppant csigolyatestbe vezetett trokáron keresztül, csontcementet injektálunk a csigolyatestbe (4. Ábra). 4.

Ábra

A

vertebroplasztika

folyamata Az

összeroppant

csigolyatestbe

a

pediculusokon keresztül vezetjük a trokárt (A),

amelyen

keresztül

beinjektáljuk

csontcementet (B).

A másik augmentációs technika, a kyphoplasztika (KP) – ahol a csontcementet egy felfújható ballonnal preformált üregbe töltjük – 1998-ben került először bemutatásra [122] (5. Ábra). A kyphosis korrekciót az első esetben a beavatkozást megelőző

21

a

pozícionálással / fektetéssel, míg a második esetben a ballon felfújásával, a zömült csigolya volumenének „méretre duzzasztásával” érjük el (a beavatkozás során a beroppant véglemezek is kiegyengethetők, amely tovább csökkenti a fájdalmat és a degeneratív patológiák kialakulásának rizikóját). Mindkét technika elterjedőben van a gerincsebészeti gyakorlatban, és az utóbbi időszakban jelentek meg olyan közlemények, amelyek szisztematikusan elemzik a beavatkozások rövid és hosszú távú hatásait, azonban a két technikát összehasonlító, kettős-vak randomizált prospektív vizsgálat még nem jelent meg a témakörben.

5. Ábra A kyphoplasztika technikája A beroppant csigolyatestbe először a ballont vezetjük, melynek felfújásával megemeljük a csigolyát és üreget formázunk. A csontcement ebbe az üregbe kerül az utolsó lépésben.

A csigolya-augmentációs technikák terápiás előnyeként az azonnali és szignifikáns fájdalom-csökkenést emelhetjük ki elsőként. Ez mindkét eljárás alkalmazásával elérhető és a sikeres beavatkozások esetében tartósnak bizonyult, sőt sokszor jobb eredményt kapunk a friss, adott esetben mozgáskorlátozottságot is okozó, nagyfokú fájdalommal járó KCST-k esetében [122, 123]. A kyphosis-korrekciót nem minden esetben érhetünk el, de a KP technikájának előnye a VP-vel szemben, hogy a – szigorúbb indikációk betartása mellett – a csigolyatest beroppanását a ballon felfújásával közvetlenül korrigálhatjuk [123]. Mint minden beavatkozás, a minimál invazív augmentációs technikák is járhatnak szövődményekkel. A leggyakoribb komplikáció a csontcement-csorgás, amely a repedezett csigolyatestből történik és a posztoperatív röntgen képeken jól detektálható

22

[123, 124]. Ritkán fordul elő, de súlyos-életveszélyes következményekkel jár a vénás elvezetésbe történő cement-csorgás. A vénákba kerülő cement akár pulmonális embóliához is vezethet [125]. A foraminális vagy epidurális terekbe kerülő csontcement neurológiai tüneteket okoz és sürgős reoperáció indikációját képezi [126, 127]. Gyakrabban kerül csontcement a környező lágyrészek, izmok felszínére, és a leggyakoribb, mégis kevéssé vizsgált típusa a csontcement-csorgásnak az, amikor az intervertebrális résbe, nevezetesen a porckorong nucleus pulposusába kerül a csigolyaaugmentációra szánt csontcement (6. Ábra). A közlemények a vertebroplasztikák esetében 5-25%-ra teszik az intradiscális cement-csorgás előfordulását – és ezek a makroszkópos, tehát röntgennel detektált esetek [128, 129]. A szövődmény biológiai és klinikai következményei nem ismertek.

6. Ábra Cement-csorgás a csigolyaközti porckorong állományába A műtét során az L4, L1 és Th12 csigolytestek vertebroplasztikájára került sor. A posztoperatív röntgenképen jól látszik az L1-2 és L3-4 közti résekben

elhelyezkedő

porckorongok

nucleus

pulposusába került radiodenz csontcement (piros nyilak).

A klinikai gyakorlatban a csigolya-augmentációra polimetil-metakrilát (PMMA) típusú csontcementet alkalmaznak. Kísérletesen – állat és kadaver vizsgálatokban – kalcium-foszfát (HA) és kalcium-szulfát (gipsz) alapú szintetikus csontpótló graftokat is sikerrel alkalmaztak a csigolya-plasztikás eljárások során [130-132]. Togawa és

23

munkatársai közölték, hogy az augmentált PMMA körül a csigolyatestben nekrotikus sejtek, idegen-test típusú gyulladásra jellemző óriássejtek és makrofágok találhatók [133], és számos korábbi vizsgálatban bizonyították a PMMA csontsejtekre gyakorolt káros termikus és biológiai hatását [134-137]. A vizsgálatok egyik következtetése az volt, hogy cementezett totál endoprotézisek beültetése után tapasztalt periprotetikus oszteolízis és csontreszorpció részben vagy egészben a PMMA cement káros biológiai hatásainak következménye lehet. A PMMA-val szemben a HA és a gipsz felszívódó, bioaktív anyagok, oszteokonduktív és oszteoinduktív tulajdonsággal [138, 139], és ez alapján alkalmasak lehetnek a biológiailag optimális csigolyatest-augmentáció kivitelezésére. Azt korábban nem vizsgálták, hogy a különböző vertebroplasztikás szintetikus anyagoknak milyen biológiai-élettani hatása lehet a porckorongra.

2.6.

A sebészi csontpótlás aktuális kérdései A csont a második leggyakrabban transzplantált szövet a vér után. Évi 2,2 millió

csontpótlást igénylő beavatkozás történik világszerte [140, 141], ezért ideális csontpótló technikára, optimális beültetendő graftra nagy szükség van a modern egészségügyi ellátásban. A ma is arany-standardnak számító autológ csont graft felhasználásán kívül, az utóbbi évtizedekben számos egyéb csontpótló eljárás, graft-típus vált széles körben hozzáférhetővé (3. Táblázat). Az autológ csont beültetése elterjedten alkalmazott eljárás, melynek előnye a tökéletes biológiai megfelelőség (bár az oszteogén tulajdonság gyakran „sérül” az autológ csont megőrlésével járó előkészítési procedúra alatt) [142]. Az autograft alkalmazásának hátránya, hogy helyileg limitált mennyiség nyerhető, a mennyiség növelésének céljából elvégzett párhuzamos „csontnyerő” operáció pedig fokozott műtéti megterhelést és a szövődmények kockázatának növekedését eredményezi [143]. A fenti problémákat [144] allograft beültetésével hidalhatjuk át. A csontbankból illetve kadaverből nyerhető – számos alakban, formában elérhető [142] – allogén csontszövet beültetése azonban nem mindig hozza meg a kívánt eredményt. A beültetett idegen csont sokszor nem degradálódik a megfelelő ütemben [145] és a „friss”, előkezeletlen allograft alkalmazása nagy kockázatot jelent a fertőző betegségek átvitele illetve

24

immunológiai szempontból is [146]. Ez mérsékelhető (de nem megszüntethető) a graft előkezelésével, ami azonban biológiai potenciáljának csökkenéséhez vezet [142]. 3. Táblázat Modern csontpótló graft-típusok Csontgraft

Szintetikus graft PMMA

Bioaktív Autograft

Allograft

DBM

Kollagén

HA/TCP

CaSO4

Kompozit kerámia

+ / ++

+

0

0

+

++

+ / +++

++

++

OG,OI,OK

OI,OK

OI

OK

OK

OK,OI(?)

OK / 0

OG,OI,OK

-

Applikáció

+

++

+++

+++

++

++

+ / +++

++

+++

Költség

++

++

+/++

+/++

+/++

++

+

+

+++

biokompatibil is, számos formula elérhető

optimális degradálódás, gyors újcsontképződ és

fogászati alkalmazás (PMMA alternatíváj a lehet)

porosus osteokondu ktív anyagok + osteoindukt ív faktorok

optimális applikáció, termikus és toxikus sejtkárosítás

Biomechanika Biológia

Megjegyzés

elégtelen optimális revaszkularizá csont-graft csont-graft biológiai ció, extenderké extenderké tulajdonság immunológiai nt nt ok, limitált infektológai használható használható mennyiség veszély

Jelmagyarázat: +: legkevésbé előnyös, +++: nagyon előnyös, 0: nincs, vagy nem értelmezhető, -: hátrányos, OG: oszteogén, OI: oszteoinduktív, OK: oszteokonduktív, DBM: demineralizált csontmátrix, HA: hidroxiapatit, TCP: trikalcium-foszfát, CaSO4: kalcium-szulfát-dihidrát (gipsz), PMMA: polimetil-metakrilát csontcement

A szintetikus graftok piacán számos csontpótló termék érhető el, azonban minden szempontból optimális csontpótló anyagot ez idáig nem sikerült kifejleszteni. A modern csontpótló eljárások folyamán négy alapvető tényezőt kell figyelembe vennünk a graft-típus megválasztásánál. Az egészséges csonthoz hasonló biomechanikai paraméterek (szakítószilárdság, rugalmasság, torziós tűrés stb.) elérése fontos kritérium a csontpótlásban. A biomechanikai konstelláció kialakulhat azonnal, a beültetést követően, illetve a rövid és a középtávú posztoperatív szakban. Ez utóbbi esetben a kívánt eredmény eléréséig külső vagy belső rögzítéssel kell biztosítani a fiziológiáshoz közeli mechanikai viszonyokat. A biomechanikai tényezők mellett az adott graftot jellemzi a biológiai viselkedése. A csontpótlásban megkülönböztetünk oszteogén (általában oszteogén őssejtet tartalmazó), oszteoinduktív (mesenhymális őssejtet oszteogén differenciálódásra „bíró”) és oszteokonduktív (az újcsontképződést fizikailag támogató) tulajdonságokat. A biológiai jellemzők közé tartozik az adott graft biodegradálódási „képessége”, illetve toxicitása. A csontpótló graft megválasztásánál

25

figyelembe kell venni az adott anyag applikációs, műtéttechnikai tulajdonságait, valamint az alkalmazás költségvonzatát. Az applikációs kérdéskörbe beletartozik a graft nyerésének, a graft előkészítésének, a graft behelyezésének, és a graft posztoperatív „viselkedésének” folyamata, és ez szoros kapcsolatban állhat a költség-tényezővel, amelyet a graft-típus kereskedelmi ára mellett meghatároznak az applikációval járó financiális következmények is (pl. hosszabb műtéti idő, külső-, belső kiegészítő rögzítés, hosszabb posztoperatív periódus). A demineralizált csontmátrix (DBM) és a különböző kollagén alapú készítmények közös jellemzője az előnyös applikálhatóság (formálható, illetve gél-szerű készítmények). Ennek ellenére biomechanikai hiányosságaik miatt inkább más - főleg auto- és allograftot felhasználó - csontpótló technikák kiegészítésére alkalmazhatók legjobb eredménnyel [147]. A kalcium foszfát vegyületeinek (hidroxi-apatit /HA/, trikalcium-foszfát /TCP/) alkalmazása kézenfekvő, hiszen a csontszövet szervetlen állományának kémiai összetételéhez ezek az anyagok állnak legközelebb (magas biokompatibilitás). Az alkalmazást azonban behatárolják a nem túl jó biomechanikai jellemzők (a porózus kiképzés biológiai előnyökkel, de a szilárdság csökkenésével jár), a gyakran előforduló lassú degradálódás és az applikációs megkötések [148]. A bioaktív kerámia (szilikát és üvegszerű ionomer anyagok) illetve a kompozit (az egyes típusok előnyeit egyesítő) graftok lehetnek a jövő ideális csontpótló anyagai. Anyagi minőségtől függő jellemzőkkel bíró (sok esetben még kísérleti stádiumban lévő), drága graft-típusok, melyek főként a kisebb mennyiséget igénylő fogászati, szájsebészeti beavatkozásoknál vannak napjainkban használatban [149, 150]. A polimetil-metakrilát (PMMA) csontcementek nem tartoznak a csontpótló graftok közé, annak ellenére, hogy sokszor – előnyös árfekvésük és applikációs tulajdonságaik – alapján csontpótlást igénylő esetekben kerülnek implantációra. A közelmúlt kutatási eredményei azonban egyre több biológiai hátrányt (termikus sejtkárosítás, direkt toxicitás ) tárnak fel a PMMA-val kapcsolatban [136], várhatóan jelenlegi formájukban – a modern biokompatibilis graftok tökéletesedésével és térhódításával – a csontcementek a jövőben egyre inkább ki fog szorulni a klinikai gyakorlatból.

26

2.6.1. A gipsz szerepe a csontpótlásban A gipsz (kalcium-szulfát-dihidrát, CaSO4 * 2H2O) jó degradálódási és biokompatibilitási jellemzőkkel bíró csontpótló graft, elterjedésének gátat szabnak az applikációval járó nehézségek, a viszonylag magas ár, és az eddig ismeretlen oszteológiai háttér (a kalcium-szulfát hatásmechanizmusáról nagyon kevés információ áll rendelkezésre). A múlt század második felében, Peltier és munkatársai [151] gyűjtöttek a csontpótlásra alkalmazott gipsz hatékonyságát és biztonságát alátámasztó széleskörű adatokat. A hazai tapasztalatokról – a gipsz ortopédiai alkalmazásával kapcsolatban –

Dr. Riskó Tibor professzor tájékoztatta munkacsoportunkat. A II.

világháborút követő időszakban, a csont-tuberkulózisban szenvedő betegek esetében sokszor a kitisztított tbc-s csontkavernát még képlékeny állapotú gipszmasszával töltötte fel. Évekkel később készült röntgen felvételeken a feltöltött üregek helyét szabályos csont foglalta el. 2001-ben, Kelly és munkatársai [152] multicentrikus vizsgálatban alkalmaztak Osteoset®-et (sebészi minőségű kalcium-szulfát, Wright Medical Technology,

Arlington

TN)

benignus

tumor,

trauma,

ciszta

által

okozott

csontdefektusok pótlására, összesen 109 esetben. Konklúzióként megállapították, hogy a kalcium-szulfát megbízható, kényelmesen és biztonsággal alkalmazható csontpótló graft. Az utóbbi években új indikációkban is alkalmazták a gipszet; Borelli és munkatársai [153] sikeresen kezelt 26 – súlyos, traumás csonttörést szenvedett – beteget autológ iliaca csontdarálmány és Osteoset® keverékével. 2005-ben közölték Chen és munkatársai [154] azt a tanulmányt, amely a kalcium-szulfát gerincsebészeti felhasználásának első leírása. Sikeresen kombinálták a lokálisan nyert autológ csontot Osteoset®-tel poszterolaterális fúziós eljárásnál, jó fúziós arányt elérve. Az eredményes klinikai alkalmazás ellenére keveset tudunk a gipsz csontpótló anyagként történő alkalmazásának biológiai, élettani oldaláról. Kevéssé feltérképezettek azok a sejtélettani változások, amelyek együtt járnak a szintetikus graftok alkalmazásával, és nem teljesen ismertek azok a tulajdonságok, faktorok, amelyek az adott graftot az optimális csontpótlásra alkalmassá teszik.

27

3.

Célkitűzések Kutatómunkánk során megvizsgáltuk, hogy a szarvas-modellben azonosított, a

csontritkulás patomechanizmusában potenciális szereppel bíró gének allelikus variánsainak van-e hatása a csontdenzitásra és a törési rizikóra. Tanulmányoztuk, hogy a kompressziós csigolyatörések modern minimál invazív sebészi kezelésének gyakori, de kevéssé vizsgált szövődményeként jelentkező intradiszkális cementcsorgásnak van-e hatása a porckorong biológiájára. Vizsgáltuk továbbá, hogy a csontpótlásban alkalmazott szintetikus graftok – és kiemelten a gipsz, mint számos előnnyel bíró, de kevéssé elterjedt csontpótló graft – milyen biológiai hatást gyakorolnak a csontsejtekre. Az alábbi kérdésekre kerestünk a választ kutatásunkban: 1. Van-e szignifikáns kapcsolat az ALPL, a FABP3, az FGFR1, az MMP2 és a TIMP2 gének egyedi polimorfizusai és a lumbális gerincen, a teljes femuron illetve a disztális radiuson mért csontdenzitás értékei között? 2. Befolyásolják-e az ALPL, a FABP3, az FGFR1, az MMP2 és a TIMP2 gének egyedi polimorfizusai a non-vertebrális törési rizikót? 3. Van-e kapcsolat az ALPL, a FABP3, az FGFR1, az MMP2 és a TIMP2 gének polimorfizmusaiból konstruált haplotípusok és a csontritkulást jellemző fenotípusok között? 4. Van-e olyan gén-gén interakció a fenti gének között, amely szignifikánsan befolyásolja a csontdenzitást, illetve a törési rizikót? 5. Befolyásolják-e a különböző anyagi minőségű vertebroplasztikás cementek a nucleus pulposus sejtek életképességét és osztódását? 6. Hatással vannak-e a vertebroplasztikás csontcementek a nucleus pulposus sejtek génexpressziós profiljára? 7. Képesek-e megtapadni és osztódni a gipszen – mint szintetikus csontpótló grafton – az MC3T3 preoszteoblaszt sejtek? 8. Hogyan

befolyásolják

a

preoszteoblasztok

osztódási

képességét

és

génexpressziós profilját a különböző csontcementek és a magas kalciumkoncentráció?

28

4.

Módszerek

4.1.

A vizsgálati alanyok szűrése és beválogatása Háromszáz-hatvan posztmenopauzás nőt vontunk be a vizsgálatunkba, klinikánk

oszteoporózis rendelésén keresztül. A vizsgálati alanyok első denzitometriás szűrésükre érkeztek a rendelésre. A fizikális vizsgálatot követően részletes kérdőívet töltött ki minden alany a családi anamnézis, korábbi betegségek és életmódi szokások felmérése érdekében. A vizsgálatból kizártunk minden olyan személyt, akinek anamnézisében csontrendszeri-, metabolikus- vagy anyagcsere betegség, bármilyen krónikus betegség, hormonpótlás, szteroidkezelés, bármely csontmetabolizmust befolyásoló gyógyszer szedése, rendszeres alkoholfogyasztás (több mint két egység naponta) vagy 40 éves kornál előbb bekövetkezett menopauza szerepelt. Kóros vérkémiai paraméterekkel (ALP, TSH, PTH, D3) rendelkező személyeket nem vontunk be a vizsgálatba. A BMD értékeket a lumbális gerinc (L2-L4) és a teljes femur vonatkozásában Lunar Prodigy DXA készülékkel (GE Medical Systems, Diegem, Belgium), a radiust tekintve Norland pDEXA® denzitométerrel (CooperSurgical Inc, Trumbull, CT, USA) határoztuk meg. A csontritkulás (OP) diagnózisát a WHO kritériumnak megfelelően állapítottuk meg (Tscore < -2,5 bármely mért helyen). A vizsgálati alanyoktól részletes törési anamnézist vettünk fel, és a non-vertebrális oszteoporotikus töréseket 45 éves kor után, kis traumára bekövetkező törésként definiáltunk a vizsgálatban (a koponya, ujjak és gerinc törését kizárva). Vertebrális kompressziós frakturák prevalenciáját nem mértük fel a vizsgálati populációnkban. A tudományos vizsgálatot az illetékes etikai bizottság engedélyezte (SE RKEB 6392–1/2004-1018EKU). A vizsgálati alanyok részletes tájékoztatását kaptak a vizsgálatról és beleegyező nyilatkozatot írtak alá. A vizsgálati populáció jellemzőit a 4. Táblázat foglalja össze. 4.2.

Gének és SNP-k kiválasztása Polimorfizmus-vizsgálatunkhoz öt – korábban az oszteoporózis kapcsán nem,

vagy kevéssé vizsgált – gént választottunk ki az előzőleg elvégzett szarvas és humán in vivo génexpressziós vizsgálatok eredménye alapján [117, 118].

29

4. Táblázat A vizsgálati populációt leíró adatok összesítése (N=353) Változó (mértékegység) Életkor (évek) Menopauzális kor (évek)

mean±SD (tartomány) 61,6±7,9# 13,5 (1-42)

Magasság (cm)

158,1 (139-176)

Testtömeg (kg)

68,9±12,1#

Body Mass Index (kg/m2)

27,6±4,5#

Dohányos (%)

45 (12,5%)

Rendszeres alkoholfogyasztó (%)*

16 (4,5%)

Kalcium bevitel (mg/nap)

642 (350-2000)

Lumbális BMD (g/cm2)

0,887±0,176#

Femur BMD (g/cm2)

0,785±0,168#

Radius BMD (g/cm2)

0,689±0,161#

Oszteoporózis diagnózisa (%)

198 (56%)

Non-vertebrális oszteoporotikus törése volt (%)

76 (21,5%)

*

Az aktuális alkoholfogyasztás több, mint hetente 2 egység, de kevesebb, mint naponta 2 egység. #Az adott változó eloszlása nem különbözik szignifikánsan a normál eloszlástól (p>0,05 a Kolmogorov-Smirnov tesztben).

A vizsgált gének az alkalikus foszfatáz (ALPL), mátrix metalloproteináz-2 (MMP2), metalloproteináz szöveti inhibitor-2 (TIMP2), fibroblaszt növekedési faktor receptor-1 (FGFR1) és zsírsav-kötő protein-3 (FABP3) génjei voltak. Irodalmi adatok alátámasztották a gének csontmetabolizmusban játszott szerepét. A NCBI dbSNP és a HapMap adatbázisok használatával választottunk összesen 24 egypontos nukleotid polimorfizmust (SNP) a genotipizálásra az öt génben. Mivel az adott gének polimorfizmusainak hatásáról a csontritkulással kapcsolatban nem állt rendelkezésünkre adat, ezért a SNP-k kiválasztásánál több szempontot is figyelembe kellett vennünk: 1.) a GC arányt az adott SNP környezetében (40-60% közötti arány optimális a genotipizálás

30

szempontjából); 2.) a multiplex genotipizálási technika miatt C/T vagy A/G allélcserével járó polimorfizmusokat tudtunk egy rendszerben vizsgálni; olyan SNP-ket választottunk, amelyek 3.) a kaukázusi populációban validáltak; 4.) a ritkább allél közölt frekvenciája (MAF) meghaladta az 5%-ot és 5.) próbáltunk a gének funkcionális szakaszaiban (promóter, exonok, 3’-vég) fekvő SNP-ket választani. A legtöbb általunk választott SNP, a HapMap adatok alapján haplotípus-taggelő, vagy azzal szorosan kapcsolt polimorfizmus volt, de a gének teljes lefedését (taggelését) a 24 genotipizált SNP-pel nem tudtuk megoldani. Az „in silico” kapcsoltsági adatok alapján a genotipizált SNP-k 29%, 80%, 64%, 41% illetve 55%-os mértékben reprezentálják az ALPL, FABP3, FGFR1, MMP2 és TIMP2 gének (és upstream illetve downstream nem kódoló régióik) összes allelikus variánsát r2>0,8 valószínűséggel. A kiválasztott polimorfizmusok géneken belüli elhelyezkedését, kapcsoltsági viszonyait és populációs adatait mutatja az 7. Ábra és a 6. Táblázat.

rs243843

rs243866

rs8066116

rs4789939

rs4796812

rs9900972

rs9894295

5’ rs931227

3’ rs1384364

rs12677355

rs7825208

rs6996321

5’ rs2280846

3’

rs3925

3’

TIMP2

FGFR1

rs13317

5’ rs1030868

5’

rs10914367

rs951545

rs11578034

3’

rs3738099

rs1256341

3’ rs871132

5’

MMP2

rs243847

FABP3

rs11542001

ALPL

7. Ábra A genotipizált SNP-k elhelyezkedése az új kandidáns génekben és a polimorfizmusok közti kapcsoltsági viszony

31

4.3.

DNS izolálás és genotipizálás az SNPstream rendszerrel A vizsgálati alanyoktól rutin vérvétel során nyert vénás vérből High Pure PCR

Template Purification kittel (Roche, Indianapolis, IN, USA) extraháltunk nagy tisztaságú genomiális DNS-t. A nukleinsav minőségi és mennyiségi kontrollját NanoDrop

B-1000

(NanoDrop

Technologies,

Wilmington,

DE,

USA)

spektrofotméterrel végeztük, majd minden mintát 10 ng/ml-es koncentrációra higítottunk. A robosztus genotipizálás a Semmelweis Egyetem SNP Core Facility-jének keretein belül a nagy áteresztőképességű GenomeLab SNPstream® Genotyping System (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) rendszerben történt. Az automatizált genotipizáló rendszer multiplex polimeráz láncreakcióval (PCR) kapcsolt fluoreszcens jelölésen alapuló, array-rendszerű egybázisos primer extenzió elvén működik [155]. Előnye, hogy rendkívül kis reagens mennyiségekkel, 384 lyukú plateken dolgozik, és egymással párhuzamosan határozza meg 12, illetve 48 SNP genotípusát minden mintában. Így nagyfokú idő- és költséghatékonyság valósítható meg a rendszerben, hozzátéve, hogy a kiemelkedően magas találati arány (succes rate) elérése csak gondos tervezést követően érhető el. Minden, a multiplex genotipizáláshoz szükséges PCR primer-t és extenziós primer-t – tehát gyakorlatilag a későbbi molekuláris biológiai folyamatot – a Beckman Coulter web-alapú primer tervező alkalmazásával (Autoprimer.com, http://www.autoprimer.com) terveztünk és „in silico” teszteltünk a reagensek megrendelése előtt. A genotipizálás lépései: 1.) Multiplex PCR a kiválasztott SNP-régiók amplifikálására. 2.) Tisztítás (a feleslegben maradt primerek, dNTP-k, és egyszálú PCR termékek emésztése exonukleáz I és shrimp alkalikus foszfatáz speciális keverékével). 3.) Allél-specifikus, fluoreszcens egybázisú primer extenzió. 4.) Az extenziós primerek SNP-specifikus 5’-ragadós végének segítségével a termékeket hibridizáltuk az ún. SNPware® Tag Array plate-hez. 5.) Az array leolvasása két színű fluoreszcens detektálással, a SNPstream® Imager szoftverrel. 6.) Adatelemzés és genotípus meghatározás a SNPstream® szoftverrel. A munkafolyamatot Biomek FX Dual Arm system (Beckman Coulter) pipettázó robotokkal tudtuk teljesen automatizálni. Tíz random mintát mértünk három párhuzamos futtatásban a technikai hibák tesztelése érdekében.

32

4.4.

Nucleus pulposus sejtek izolálása, tenyésztése és kezelése Négy, a csigolyaközti porckorong protrúziójával operált fiatal férfibeteget

(átlagéletkor±SD:

29±3,7

év)

vontunk

be

a

vizsgálatba

(ETT

TUKEB

ad.506/KO/2005.). A részletes tájékoztatást és az írásos belegyezést követően a betegség gyógyítását célzó műtét során eltávolításra került porckorong szövetdarabot PBS-ben (phosphate buffered saline) megmostuk, majd steril tenyésztő médiumban haladéktalanul a laboratóriumba szállítottuk. Az annulus fibrosus és a nucleus pulposus (NP) szöveteit makroszkóposan szeparáltuk, majd az NP-t apró darabokra vágtuk. Az NP szövetdarabokat 1 órán át 0,2%-os pronáz-, majd további 2 órán át 1 mg/ml kollagenáz-diszpáz oldatban (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany) emésztettük 37°C-os rázófürdőben. Az izolált NP sejteket mikropórusú szűrőn átszűrtük, majd PBS-ben mostuk háromszor. A sejteket 10% borjúsavót, 25 μg/ml aszkorbinsavat és antibiotikumot tartalmazó DMEM/F12 sejttenyésztő médiumban (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA Inc., St. Louis, MO, USA) tenyésztettük 37°C-on, 5% CO2-koncentráció és 85% páratartalom mellett, normál légköri nyomáson. A monolayer kultúrák első passzálását követően végeztük a kísérletes kezeléseket, méréseket a sejteken. A szintetikus graftok hatásainak vizsgálata érdekében a sejteket olyan anyagokkal kezeltük, amelyek az adott szintetikus graft végleges in vivo kémiai formáinak megfelelő anyagminőségű. A PMMA-partikulumokat (Polysciences, Warrington, PA), a hidroxi-apatit (HA) és a kristályos kalcium-szulfát-dihidrát (gipsz) port (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA Inc., St. Louis, MO, USA) 70%-os etanolban sterilizáltuk, majd PBS-ben mostuk át, végül 10%-os szuszpenziókat készítve.

4.5.

MC3T3 sejtek tenyésztése különböző tenyésztő-felszíneken Az MC3T3 preoszteoblaszt sejteket négyféle felszínen tenyésztettük előzőleg

preparált 6-lyukú műanyag sejttenyésztő plateken (TP). Minden plate esetén 1 kamra aljába polimetil-metakrilát (PMMA) korongot formáltunk extra alacsony viszkozitású

33

csontcementből (Cemex® XL – Tecres S.p.A., Verona, Italy), 1 kamra aljába gipszkorongot öntöttünk CaSO4*1/2 H2O (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) és desztillált víz 50%-os szuszpenziójából, illetve 1 kamra aljába előzőleg sterilizált ásványi gipszlapot helyeztünk (ELTE Ásványtani Tanszék). A sejtek tenyésztéséhez 10% borjúsavót és antibiotikumot tartalmazó α-MEM médiumot alkalmaztunk. A médium standard Ca2+ és aszkorbinsav koncentrációja 1,8 mM és 25 μg/ml volt. Mivel előkészítő méréseink során megállapítottuk, hogy a sejtmentes gipszkorongok és az ásványi gipszlapok felett a médiumban – a kis mértékű disszociáció következményeként – 25,48±0,83 mM-os Ca2+-koncentráció alakul ki, ezért a műanyag plate-re szélesztett kultúrák harmadánál a 3 ml médiumot 150 μl, 0,5 M-os CaCl2 oldattal szupplementáltuk, a végső Ca2+ koncentrációt 25,5 mM-ra beállítva (TP25). A tenyészeteket 37°C-on, 5%-os CO2 koncentráció és 85%-os páratartalom mellett tartottuk fenn.

4.6.

Sejtszám-meghatározás A szintetikus graftok NP sejtek életképességére gyakorolt hatását dózis- és

kezelési idő függvényében vizsgáltuk. 5000 sejt/cm2 kiinduló sűrűségben tenyésztettük a NP sejteket 24 lyukú platen, majd a 4. napon graft-partikulákat (PMMA, HA és gipsz) adtunk a tenyészetekhez 0,05; 0,1; 0,2; 0,4 és 0,8 v/v % végkoncentrációban. A sejtszámot a kezelés 4. napján határoztuk meg. A tenyészetek másik részét 0,1 v/v % graft-partikulával kezeltük a sejttenyésztés 1., 2., 3., 4. illetve 5. napján, a sejtszámot a 5. napon meghatározva. Mindig meghatároztuk párhuzamos, kezeletlen kontroll kultúrák életképességét is. Az MC3T3 preoszteoblasztok osztódási képességét a különböző tenyésztési felszíneken 24 órás tenyésztési periódus két végpontjában határoztuk meg. A sejtszámolást minden esetben a CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega Co., Madison, WI, USA) segítségével végeztük. A tenyészetek óvatos PBS-es mosása után, a reagens és a tenyésztő médium 1:1 arányú elegyével rázatva inkubáltuk a plateket 10 percig, majd a felülúszó lumineszcenciáját, amely az ATP mennyiséggel és így az élő sejtek számával arányos, fluorométerrel határoztuk meg.

34

4.7.

Alkalikus foszfatáz aktivitás és Ca2+-koncentráció meghatározás Az MC3T3-tenyészeteket 10 mM β-glicerol-foszfát és 25 μg/ml aszkorbinsav

tartalmú oszteogén médiumban inkubáltuk 15 napig, majd a felülúszóból p-nitrofenilfoszfatát

reakción

alapuló

ALP-meghatározást

végeztünk

Olympus

AU2700

analizátorral (Olympus Life and Material Science Europa GmbH, Hamburg, Germany). Az ALP aktivitást az előzőleg CellLyticTM reagenssel (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA Inc., St. Louis, MO, USA) emésztett tenyészetekből NanoDrop® ND-1000 spektrofotométerrel (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA), 280 nm-en meghatározott protein-koncentrációra normalizáltuk. A médium Ca2+-koncentrációját a tenyészetek 3., 6., 10., 14. és 21. napján mértük

meg

o-krezolftalein-reakción

alapuló

módszerrel

Olympus

AU2700

analizátorral.

4.8.

Génexpressziós vizsgálatok A génexpressziós vizsgálatok elvégzéséhez az NP sejteket 10000 sejt/cm2

sűrűségben tenyésztettük 6 lyukú sejttenyésztő plateken (Sigma), DMEM sejttenyésztő médiumban, standard körülmények között. A tenyésztés harmadik napján, a médium cserét követően a tenyészetek egy részét 0,1 v/v % koncentrációjú graft-partikulummal (gipsz, HA, PMMA) kezeltük, majd további 4 napig tenyésztettük a kolóniákat. Az MC3T3 preoszteoblaszt sejteket előzőleg preparált 6 lyukú műanyag platekre szélesztettük, 5000 sejt/cm2 sűrűségben. Minden plate tartalmazott 1 sejtmentes, 2 kontroll, 1 kalcium-szupplementált, 1 gipszkorongos és 1 PMMA-korongos tenyésztő kamrát. A sejteket 15 napig tenyésztettük standard körülmények között. Az NP sejttenyészetekből totál RNS-t izoláltunk QIAgen RNeasy Lipid Tissue (QIAGEN Sciences, Maryland 20874, USA) kittel. Az MC3T3-sejtekből az RNS izolálás High Pure RNA Isolation (Roche Diagnostics GmbH, Manheim, Germany)

35

kittel történt. Mindkét gyári RNS-izoláló kit nagy hatásfokú, nagy tisztaságú RNS izolálást tesz lehetővé, szilika-membrános oszlopos módszer segítségével. Az RNS integritást agaróz gélen, a mennyiséget és tisztaságot NanoDrop® ND-1000 spektrofotométerrel ellenőriztük. Tíz μl 25-50 ng/μl koncentrációjú totál RNS-t inkubáltunk 600 ng random hexamerrel 8 percig 65°C-on. A reverz transzkripcióhoz 200 U M-MLV reverz transzkriptázt, 100 nmol dNTP-t, 20 U Rnazin-t és 4 μl m-MLV 5x puffert (minden reagens Promega Co., Madison, WI, USA) adtunk a reakcióelegyhez, majd a 20 μl össztérfogatú elegyet 1 órán át 37°C-on inkubáltuk. A porckorong, illetve a csontszövet metabolizmusában jelentős szerepet játszó gének (5. Táblázat) mRNS koncentrációját génspecifikus valós-idejű PCR technikával, az Applied Biosystem TaqMan® Gene Expression Assays rendszerével vizsgáltuk. A 20 μl-es végső reakcióelegy 1 μl cDNS-t, 10 μl TaqMan® 2x Universal PCR Master Mix NoAmpErase UNG-t, 1 μl előretervezett és validált génspecifikus TaqMan® Gene Expression Assay 20x-t és 8 μl desztillált vizet tartalmazott. Az amplifikációra ABI Prism 7500 real-time PCR rendszert (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) használtunk. A kiválasztott géneket minden sejtizolátumból három párhuzamos futtatásban vizsgálatuk 96 lyukú optikai platen a következő protokoll szerint: 10 perc denaturálás 95°C-on, majd 15 másodperc 95°C-os denaturáció és 1 perc 60 °C-os annelációextenzió ciklus 50-szer ismételve. A „háztartási” GAPDH gént használtuk endogén kontrollnak minden esetben. A relatív kvantifikációs adatokat a 7500 System SDS szoftver 1.3 verziójának segítségével gyűjtöttük. A génexpressziós vizsgálatokat az izolált NP sejtekből még az in vitro tenyésztést megelőzően is elvégeztük, hogy az in vitro körülmények hatását is meg tujduk vizsgálni a sebészileg eltávolított szövetminták esetén.

4.9.

Statisztikai módszerek

4.9.1. Leíró statisztikai módszerek

36

A polimorfizmus vizsgálatok esetében kizártuk a további adatfeldolgozásból azokat a személyeket, akik 20-nál kevesebb sikeresen genotipizált lókusszal rendelkeztek (azaza sikerességi ráta 85% alatt volt). Az adatbázisban a hiányzó genotípusokat a „10-legközlebbi szomszéd módszer” (10-nearest neighbor method) [156] segítségével determináltuk a genotipizálási hibákból eredő fals eredmények elkerülése érdekben. A „Haploview 3.0” [157] szoftver segítségével végeztük a genotipizálás leíró elemzését (6. Táblázat). Az 5%-nál kisebb MAF-fal rendelkező és a Hardy-Weinberg disequilibriumban (Khi-négyzet próba p-értéke < 0,05) lévő SNP-ket kizártuk a további elemző statisztikából. Az SNP-k közti kapcsoltsági viszonyt (LD) szintén a „Haploview” szoftverrel határoztuk meg. A vizsgálati populációt az anamnesztikus és a denzitometriás adatok alapján jellemeztük (4. Táblázat). A csontdenzitás (BMD) értékre és a csonttörése szignifikáns kovariánsokat regressziós analízis segítségével szűrtük ki. A stepwise módszerrel kiszámított – a kovariánsokkal normalizált fenotípusokat leíró – regressziós reziduálisokat alkalmaztuk a további elemző statisztikák során [158].

4.9.2. Elemző statisztikai módszerek A humán genetikai asszociációs vizsgálatokat a „PedGenie” szoftver felhasználásával végeztük [159]. A statisztikai szoftver ANOVÁ-val ekvivalens elemzést végez három genetikai modellben (additív, domináns, recesszív). Az alkalmazás „Quantitativ” és „OddsRatio” opcióját alkalmaztuk vizsgálatunkban és az eredmények megbízhatóságának megőrzése érdekében empirikus p-értéket generáltunk 10000 Monte-Carlo permutációs próba futtatásával. Statisztikailag szignifikánsnak a permutált p-érték 0,05-nél kisebb értékét tekintettük. Az individuális SNP-analízis statisztikai erejét (power of the study) a Quanto szoftver 1.1 verziójával számoltuk ki [160]. A genetikai eredményekből haplotípus analízist is végeztünk az R-statisztikai környezetbe épülő „haplo.stats” szoftver felhasználásával (http://cran.r-project.org). Csúszó-ablak analízis segítségével konsturáltuk a 2, 3 és 4 SNP-ből álló haplotípusokat az egyes géneken belül, majd score-statisztika alkalmazásával határoztuk meg az egyes haplotípusok és a fenotípusok kapcsolatát [161]. A score-statisztika permuált p-értéket

37

számít a globális összefüggés és az egyes haplotípusok szerepének jellemzésére. A haplotípusok egyedi hatását regressziós modellben a szoftverbe épített „haplo.glm” funkcióval határoztuk meg. Végül vizsgálatunkban feltérképeztük a gén-gén interakciók (G x G) szerepét a csontritkulást jellemző fenotípusokkal összefüggésben. A G x G interakciókat a genetikai vizsgálatokra fejlesztett „SNPassoc” szoftverrel [162], loglikelihood ratio (LRT) teszt alkalmazásával térképeztük fel. A szoftver grafikusan jeleníti meg az egyes SNP-kombinációk közti, az adott fenotípusra vonatkozó interakciós kapcsolat p-értékét. A fals pozitív eredmények elkerülése érdekében, csak az erősen valószínű, 0,001-nél kisebb p-értékkel jellemzett interakciókat választottuk ki, majd a SNP-kombinációkat regressziós modellbe illesztve validáltuk a G x G interakciót. A validálás során p<0,01 értékkel rendelkező interakciókat tekintettük szignifikánsnak. A regressziós analíziseket az „SPSS 15.0 for Windows” (SPSS Inc., Chicago, USA) statisztikai szoftverkörnyezetben végeztük. Az in vitro mérések adatait szintén az „SPSS” szoftverrel elemeztük. A mérési eredmények minden esetben legalább négy független sejtkultúra adatait tükrözik és a két

mintás

összehasonlításokra

non-parametrikus

Mann-Whitney

U-tesztet

alkalmaztunk, 10000 Monte-Carlo permutációval kapcsoltan. Szignifikáns értéknek a 0,05-nél kisebb permutált p-értéket tekintettük. A génexpressziós analízisek során a 2szeresnél nagyobb expressziós különbségeket tekintettük pozitív eredménynek.

4.9.3. Szekvencia analízis A genotipizált SNP-k környezetének genomiális szekvenciáit az NCBI dbSNP adatbázisból nyertük (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP). A két különböző allélt tartalmazó DNS szekvenciákat „in silico” elemzésnek vetettük alá a lehetséges transzkripciós faktor kötőhelyek feltérképezése érdekében. Az analízisre a TRANSFAC adatbázist

használó

„PROMO”

web-alapú

alkalmazást

használtuk

(http://alggen.lsi.upc.es) [163].

38

5. Táblázat A génexpressziós vizsgálatok során alkalmazott TaqMan® Assay-k Assay ID*

GÉN

Protein

Funkció

Hs00202971_m1

AGC1

aggrekán

Extracelluláris mátrix glikoprotein

Mm01741771_g1

BGLAP

bone gamma-carboxyglutamate protein (osteokalcin)

Kalcium-kötő fehérje

BGN

biglikán

Extracelluláris mátrix struktúr-fehérje

Hs00154192_m1

BMP2

csont morfogenetikus protein-2

Szignál-molekula / TGFβ-család

Mm00432087_m1

BMP4

csont morfogenetikus protein-4

Szignál-molekula / TGFβ-család

Mm00432109_m1

BMP8a

csont morfogenetikus protein-8a

Szignál-molekula / TGFβ-család

Mm00492555_m1

BSP

csont szialoprotein

Extracelluláris mátrix struktúr-fehérje

Mm00443375_m1

CASR

Kalcium-szenzor

G-protein kapcsolt receptor

COL1A1

I. típusú kollagén, alpha 1 lánc

Extracelluláris mátrix struktúr-fehérje

COL1A2

I. típusú kollagén, alpha 2 lánc

Extracelluláris mátrix struktúr-fehérje

COL2A1

II. típusú kollagén, alpha 1 lánc

Extracelluláris mátrix struktúr-fehérje

DCN

dekorin

Extracelluláris mátrix struktúr-fehérje

FN1

fibronektin-1

Extracelluláris mátrix kötő-fehérje

GAPDH

glicerinaldehid-3-foszfátdehidrogenáz

dehidrogenáz, endogén kontroll

IL1a

interleukin-1, alpha

Szignál-molekula / Interleukin

MMP2

mátrix metalloproteáz-2 (zselatináz)

Metalloproteáz

Hs00233992_m1

MMP13

mátrix metalloproteáz-13 (kollagenáz)

Metalloproteáz

Mm00489637_m1

SMAD3

MAD homolog-3 (Drosophila)

Transzkripciós faktor / TGFβ család

Mm00484738_m1

SMAD6

MAD homolog-6 (Drosophila)

Transzkripciós faktor / TGFβ család

Hs00165814_m1

SOX9

SRY-box-9

Transzkripciós faktor

Hs00234278_m1

TIMP2

metalloproteáz szöveti inhibítor-2

Metalloproteáz inhibítor

Mm00455918_m1 Hs00156076_m1

Mm00801666_g1 Hs00164004_m1 Mm00483888_m1 Mm00491889_m1 Hs00156568_m1 Mm00514535_m1 Hs00266491_m1 Mm01256734_m1 Hs00277509_m1 Mm99999915_g1 Hs99999905_m1 Hs00174092_m1 Mm00439498_m1 Hs00234422_m1

*A “Hs” (Homo sapiens) kezdetű kódok a human, míg az “Mm” (Mus musculus) kezdetű kódok az egér génexpressziós assay-ket jelölik. A kódok alapján rendelhető reagens-szettek tartalmazzák a PCR reakcióhoz szükséges génspecifikus primereket és fluoreszcens jelzésű próbákat, melyek pontos szekvenciáját a gyártó nem hozza nyilvánosságra.

39

5.

Eredmények

5.1.

Új génpolimorfizmusok kapcsolata a csontritkulással

5.1.1. A vizsgálat egyes paramétereit leíró statisztikai analízisek eredményei A SNPstream® genotipizálási módszer technikai pontossága 100%-os volt vizsgálatunkban, azaz a párhuzamosan genotipizált minták eredményeiben nem volt eltérés. Hét személyt zártunk ki a vizsgálati populációból, mivel az ő sikerességi rátájuk 85% alatti volt. A ritkább allél gyakorisága az MMP2-ben található rs11542001 esetén 5%-nál kisebb volt, illetve két SNP (rs11578034 a FABP3-ban és rs243843 az MMP2ben)

Hardy-Weinberg

disequilibriumban

volt

(6.

Táblázat),

ezért

ezeket

a

polimorfizmusokat kizártuk a további adatelemzésből. A végső adatbázisunk tehát 21 SNP és 353 személy adatait tartalmazta. Ebben az adatbázisban összesen 54 genotípus hiányzott, amelyeket statisztikai módszerrel pótoltunk. Az életkor, a menopauzális kor és a body mass index (BMI) bizonyultak a csontdenzitásra szignifikáns „környezeti” faktornak. A non-vertebrális törési rizikót az életkor, a BMI és a BMD-k befolyásolták szignifikánsan. 5.1.2. Asszociációs vizsgálatok Jelen vizsgálatunkban csak azokat a statisztikailag szignifikáns összefüggéseket fogadtuk el és értelmeztük, ahol a vizsgálat statisztikai ereje 80%-ot meghaladónak bizonyult. A lumbális BMD-re (mean±SD = 0,887±0,176 g/cm2) vonatkoztatva, 0,055 g/cm2-es domináns genetikai hatás a 353 fős mintában 83%-os erősséggel detektálható, MAF = 0,322 esetén. A femur BMD-t (mean±SD = 0.785±0.168) tekintve, 82%-os erősséggel tudtunk 0,157 g/cm2-es recesszív genetikai hatást kimutatni MAF = 0,166 esetén. A törési rizikó esetén, a vizsgálati populáció mérete (76 eset – 277 kontroll) 86%-os statisztikai erőt biztosított 2,06-os esélyhányados (O.R.) kimutatására, MAF = 0,184 esetén, domináns modellben.

40

6. Táblázat A genotipizálás leíró statisztikáinak összesítése GÉN

ALPL alkalikus foszfatáz

FABP3 zsírsavkötő protein-3

FGFR1 fibroblaszt növekedési factor receptor-1

MMP2 mátrix metalloproteáz-2

TIMP2 metalloproteáz szöveti inhibítor-2

Allélok

SNP pozíciója

SNP típusa

Sikerességi ráta

HW p-érték

MAF

rs871132

G/A

chr1:21607931

intron

97,4%

0,509

0,116

rs1256341

G/A

chr1:21612135

intron

100%

0,822

0,305

rs3738099

G/A

chr1:21640041

exon(263Y/H)

100%

0,086

0,113

rs11578034

C/T

chr1:31511246

intron

99,7%

0,003

0,055

rs951545

C/T

chr1:31513758

intron

99,1%

1,0

0,119

rs10914367

G/A

chr1:31515299

promóter

100%

0,716

0,166

rs13317

C/T

chr8:38388671

3’ UTR

99,1%

0,646

0,212

rs3925

G/A

chr8:38400815

intron

97,4%

0,942

0,204

rs2280846

G/A

chr8:38401451

intron

100%

1,0

0,082

rs6996321

G/A

chr8:38441503

intron

98%

0,506

0,322

rs7825208

G/A

chr8:38446444

promóter

99,1%

0,362

0,137

rs12677355

C/T

chr8:38449100

promóter

100%

0,921

0,350

rs243866

G/A

chr16:54069038

promóter

100%

0,701

0,262

rs1030868

C/T

chr16:54074268

intron

97,7%

0,747

0,390

rs11542001

C/T

chr16:54077073

exon(239F/L)

99,4%

1,0

0,000

rs243847

C/T

chr16:54081499

intron

99,7%

0,919

0,317

rs243843

G/A

chr16:54084799

intron

100%

0,004

0,156

rs1384364

C/T

chr17:74364423

intron

99,7%

1,0

0,195

rs931227

G/A

chr17:74370134

intron

98,8%

0,697

0,173

rs9894295

G/A

chr17:74373700

intron

100%

0,063

0,122

rs9900972

G/A

chr17:74380209

intron

99,7%

0,720

0,184

rs4796812

C/T

chr17:74386781

intron

99,7%

0,656

0,058

rs4789939

G/A

chr17:74393298

intron

100%

1,0

0,133

rs8066116

C/T

chr17:74441474

promóter

98,8%

0,064

0,119

SNP jelölése

A sikerességi ráta az egyértelműen megállapított genotípusok százalékát jelöli. A HW p-érték jelöli a Hardy-Weinberg equilibrium megállapítására alkalmazott Khi2-teszt szignifikancia-szintjét. A MAF a ritkább allél előfordulási gyakoriságát jelzi.

41

Az FGFR1-ben található rs6996321 SNP szignifikáns kapcsolatot mutatott a lumbális BMD-vel (a mean BMD±SE 0,858±0,013; 0,912±0,015 és 0,916±0,029 a G/G, A/G és A/A genotípusok esetén).

A korrigált BMD értékek szignifikáns

különbséget mutattak a domináns genetikai modellben (a korrigált BMD átlagértékek 0,031±0,011 és 0,031±0,011 g/cm2 voltak a G/G és a A/G+A/A csoportok esetén, p=0,002) (8. Ábra). A FABP3-ban található rs10914367 polimorfizmus homozigóta recesszív genotípusa szignifikánsan magasabb BMD-t eredményezett a teljes femur tekintetében (a mean BMD±SE 0,783±0,009; 0,776±0,028 és 0,945±0,029 volt a G/G, A/G és A/A genotípusokban, míg a korrigált BMD különbségek a recesszív modellben 0,004±0,008 és 0,143±0,037 voltak a G/G+A/G és az A/A csoportokban, p=0,028) (8. Ábra). 8. Ábra Egyedi SNP-k összefüggése a csontdenzitással (mean±SE)

7. Táblázat Az rs9900972 TIMP2 polimorfizmus összefüggése a törési rizikóval Genotípus

Nkontroll

Neset

O.R. (95% C.I.)

G/G

196

41

1,00

A/G + A/A

81

35

2,06 (1,12 - 3,58)

p-érték

0,018 A kontrollok és esetek száma az oszteoporotikus törést szenvedő és nem szenvedők számát jelöli. Az esélyhányados (O.R.) és a 95%-os konfidencia intervallum mellett a permutált pértéket tüntettük fel.

42

A non-vertebrális törési rizikó és az rs9900912 TIMP2 polimorfizmus szignifikáns kapcsolatát mutatja a 7. Táblázat. A recesszív allélt („A”) hordozók esetében a törési rizikó kétszerese volt a homozigóta domináns csoporttal szemben (p=0,018). A „haplo.stats” program segítségével azonosítottunk egy 4 lókuszból (rs13317, rs3925, rs2280846 és rs6996321) felépülő haplotípust az FGFR1 génben, amely szignifikánsan összefüggött a lumbális BMD-vel (a globális összefüggés permutált pértéke 0,007 volt) A gyakori TCGG haplotípus a szignifikánsan alacsonyabb, míg egy ritkább (CTGA) haplotípus a szignifikánsan magasabb BMD prediktorának bizonyult (8. Táblázat). 8. Táblázat Az FGFR1 haplotípus összefüggése a lumbális csontdenzitással Score teszt

GLM modell

p-érték*

Koeficiens±SE

p-érték#

- 2,934

0,003

- 0,032±0,016

0,042

0,206

1,062

0,309

0,023±0,017

0,167

CTGA

0,107

2,595

0,012

0,069±0,022

0,002

Ht4

CTGG

0,083

- 1,121

0,269

- 0,016±0,028

0,568

Ht5

TCAG

0,078

0,964

0,346

0,034±0,026

0,189

Haplotípusok

Szekvenciák

Frekvenciák

Ht1

TCGG

0,506

Ht2

TCGA

Ht3

Hap-Score

Az 5%-nál gyakoribb haplotípusok és a korrigált lumbális BMD-re gyakorolt egyedi hatásuk láthatók a táblázatban. A globális összefüggést jellemző permutált p-érték 0,007 volt. *A score teszt p-értékeit 10000 permutációs próba eredményezte. #A GLM-modelben szereplő p-értékek a regressziós változókra vonatkozó t-statisztika szignifikanciáját jelölik. A haplotípusok egyedi hatását a regressziós koeficiensek demonstrálják.

Mivel a haplotípust felépítő egyik SNP (rs6996321) önállóan is szignifikáns kapcsolatot mutatptt a lumbális csontdenzitással, ezért további elemzéseket végeztünk az

összefüggés

mélyebb

rétegeinek

feltárása

érdekében.

Log-likelihood

(valószínűséghányados) analízissel az rs6996321 hatása konstansnak bizonyult az egyes haplotípusokban. Az rs6996321 hatása nem különbözött szignifikáns mértékben a TCG(Ht1-Ht2) és a CTG- (Ht4-Ht3) sturktúrákat összehasonlítva (Khi2=2,38, df=2, p>0,25). Szintén összehasonlítottuk a két különböző rs6996321 allél (aláhúzva) hatását az átfedő haplotípusokban, amelyek nem mutattak szignifikáns különbséget a Ht1 (TCGG) és a Ht2 (TCGA) (Khi2=1,48, df=2, p>0,25) illetve a Ht4 (CTGG) és Ht3 (CTGA)

43

(Khi2=5,6, df=2, p>0,05) összevetésekben. A fenti tesztek segítségével bizonyítottuk, hogy az elemzett FGFR1 haplotípus a lumbális BMD önálló genetikai prediktora és a szignifikáns összefüggés nem az rs6996321 egyedi hatását tükrözi.

5.1.3. Gén-gén interakciók elemzése Azonosítottunk vizsgálatunkban olyan gén-gén interakciókat, amelyek az LRT analízis során szingifikáns összefüggést mutattak a csontdenzitással vagy a törési rizikóval (p1<0,001). Az LRT analízisek eredményét demonstrálja a „SNPassoc” szoftver grafikai output-ja (9. Ábra). A fals pozitív eredmények elkerülése érdekében, a regressziós analízissel végzett validálási eljárást követően csak azokat az interakciókat tekintettük szignifikáns összefüggéseknek, ahol a regresszióban kapott interakciós pérték szintén alacsony volt (p2<0,01). A 9. Táblázat mutatja azokat a SNP-SNP kombinációkat, ahol az interakció szignifikánsnak bizonyult vizsgálatunkban. Szignifikáns G x G interakciót találtunk a FABP3 és az MMP2 (rs10914367 és rs1030868) között a lumbális BMD-t tekintve. Az ALPL és a TIMP2 közötti interakció szignifikánsnak bizonyult a femur (rs3738099 és rs9894295) és a radius (rs871132 és rs9894295) denzitás esetében. Az MMP2 és a TIMP2 (rs243847 és rs931227) között szignifikáns interakciót azonosítottunk a non-vertebrális törési rizikót figyelembe véve.

9. Ábra Az LRT analízis eredménye a lumbális csontdenzitásra A „SNPassoc” szoftver által generált reprezentatív ábra a SNP-SNP interakciókra vonatkozó likelihood ratio tesztek (LRT) p-értékeit mutatja. A sötétebb szín magasabb szignifikancia-szintet jelöl. Az átlóban elhelyezkedő négyszögek jelölik az egyedi SNP-k hatásának szignifikancia-szintjeit. A mátrix felül elhelyezkedő háromszögében találhatók az interakciók (episztázis) szignifikancia-szintjei, míg az alsó háromszög a SNP-SNP interakciókat a legjobb egyedi SNP hatással összehasonlító LRT p-értékeit reprezentálja.

44

9. Táblázat A. Csontdenzitásra szignifikáns, validált gén-gén interakciók Lumbális BMD

FABP3

p1=0,0006

rs10914367

p2=0,003

mean±SE (n) G/G MMP2 rs1030868

A/G

A/A

C/C

0,922±0,020 (86)

0,871±0,026 (41)

0,812±0,104 (3)

C/T

0,869±0,014 (120)

0,902±0,028 (44)

1,021±0,089 (8)

T/T

0,831±0,028 (41)

1,031±0,087 (10)

(0)

Femur BMD

ALPL

p1=0,0008

rs3738099

p2=0,003

mean±SE (n) A/A-G/G

A/G

TIMP2

C/C

0,801±0,011 (242)

0,746±0,022 (70)

rs4796812

C/T

0,727±0,019 (30)

0,829±0,052 (11)

Radius BMD

ALPL

p1=0,0008

rs871132

p2=0,008

mean±SE (n) G/G

A/G

A/A

TIMP2

A/A

0,695±0,012 (203)

0,671±0,023 (63)

0,483±0,000 (1)

rs9894295

A/G

0,668±0,022 (70)

0,768±0,057 (15)

1,210±0,000 (1)

B. Non-vertebrális törési rizikóra szignifikáns, validált gén-gén interakció

Törési rizikó

MMP2

p1=0,0006

rs243847

p2=0,004

O.R. (95% C.I.) T/T TIMP2 rs931227

C/T

C/C

G/G

1,00

0,79 (0,39-1,60)

0,43 (0,13-1,38)

A/G

0,06 (0,01-0,47)

1,91 (0,79-4,61)

0,91(0,27-3,10)

A/A

0,00 (0,00)

0,66 (0,04-11,7)

0,47(0,04-5,65)

Azokat a gén-gén interakciókat tekintettük szignifikánsnak, ahol az LRT analízis során a p-érték 0,001-nél kisebbnek (p1) bizonyult és a validálási eljárás során a szintén magas szignifikanciaértéket kaptunk (p2).

45

5.2.

A szintetikus csontpótló graftok alkalmazásának molekuláris biológiai

aspektusai 5.2.1. A szintetikus graftok hatása a nucleus pulposus (NP) sejtek életképességére A növekvő dózisú graft-partikulum kezelés hatását mutatja a 10/A. ábra. A PMMA alapú csontcement szignifikánsan csökkentette az életképes NP sejtek számát a tenyészetekben, az alkalmazott 0,05 – 0,1 – 0,2 – 0,4 – 0,8%-os kezelésnek megfelelően, 24,6 – 49,6 – 49,6 – 51,2 – 50,3%-kal. Sejtszám-csökkentő hatást mértünk a HA alapú graft esetén is, a kezelés koncentrációjától függően a sejtszám 55,3 – 64,4 – 64,9 – 71,8 – 68,7%-kal redukálódott. A gipsz alapú csontpótló graft experimentálisan kizárólag az alkalmazott legmagasabb (0,8%-os) koncentrációban befolyásolta negatívan az élő sejtek számát a tenyészetekben, és a 0,05%-os kezelés esetén a sejtszám szignifikáns növekedését detektáltuk a kezeletlen tenyészetekhez képest. Az azonos dózisú kezelések eredménye szignifikáns különbséget mutatott a különböző graft-típusok alkalmazásától függően. A PMMA hatása szignifikánsan különbözött a HA és a gipsz hatásától a 0,05 – 0,1 – 0,2%-os, illetve a 0,05 – 0,1 – 0,2 – 0,4%-os kezelések esetében. A HA és a gipsz kezelés minden koncentrációban szignifikánsan különböző sejtszámot eredményezett. A szintetikus töltőanyagok sejtszámra gyakorolt hatását a kezelési idő függvényében is vizsgáltuk. A 0,1%-os PMMA-koncentráció 75,2 – 79 – 78,2 – 68,4 – 72%-os sejtszám-redukciót eredményezett a NP-sejttenyészetekben az 1 – 2 – 3 – 4 – 5 napos kezelést követően (10/B. Ábra). A 0,1%-os HA-kezelés szintén szignifikánsan csökkentette a sejtszámot, a 2 – 3 – 4 – 5 napos tenyészetekben, 40,2 – 46,5 – 51,5 – 53,5%-os mértékben. A 0,1%-os gipsz kezelés nem befolyásolta szignifikáns mértékben az életképes NP-sejtek számát. A PMMA és a gipsz kezelés, illetve a PMMA és a HA kezelés hatása minden esetben szignifikánsan különbözött. A gipsz és a HA hatása a 3 – 4 – 5 napos tenyészetekben volt eltérő.

46

10. Ábra A sejtszám változása az alkalmazott dózis (A) és a kezelési idő (B) függvényében (mean±SD)

A.

140

Relatív sejtszám (%)

120

100 PMMA GIPSZ

80

HA

60

40

20 0

0,05

0,1

0,2

0,4

0,8

Koncentráció a médiumban (v/v %)

B.

140

Relatív sejtszám (%)

120 100 PMMA

80

GIPSZ HA

60 40 20 0 0

1

2

3

4

5

Kezelés ideje (nap)

A kitöltött szimbólummal jelölt mérési értékek szignifikáns különbséget jelölnek a kezeletlen kontroll sejttenyészethez képest.

47

5.2.2. Génexpressziós változások a csontpótló anyagok hatására izolált nucleus pulposus sejtekben 12 gén kifejeződésének változását vizsgáltuk az izolált NP sejtekben különböző csontpótló graftokkal való 0,1%-os, 4 napos kezelést követően (11. ábra). Az aggrekán (AGC1) expressziója mindhárom kezelést követően csökkent, 2,5 – 6,6 – 6,4-szeres csökkenést detektáltunk a PMMA – HA – gipsz kezelés eredményeként. A PMMA hatása az AGC1 expresszióra szignifikánsan különbözött a HA és a gipsz kezelés hatásától. Az I. típusú kollagén (COL1A1) expresziója csökkent a PMMA (2-szeres) és a gipsz (4,7-szeres) tenyészetekben, míg a HA nem befolyásolta szignifikánsan a gén expresszióját. A II. típusú kollagén (COL2A1) expresszióját nem tudtuk mérni az in vitro tenyészetekben. A biglikán (BGN) expressziójára negatív hatással volt a HA és a gipsz kezelés (8,7-szeres és 5,4-szeres redukció) és az expressziós különbségek szignifikánsak voltak a PMMA-kezelés hatásával összehasonlítva. A dekorin (DCN) specifikus mRNS csökkent mennyiségét mértük a HA és a gipsz kezelést követően (2,5-szeres csökkenés mindkét esetben), míg a fibronektin-1 (FN1) expresszióját a graft-anyagok nem befolyásolták számottevő mértékben. A zselatináz (MMP2) legalacsonyabb mértékben a HA-kezelt kultúrákban expresszálódott, és ez a különbség szignifikánsnak mutatkozott a PMMA-val kezelt kultúrákban mért expressziós szinthez viszonyítva. A kollagenáz (MMP13) nem expresszálódott a HA-vel kezelt sejtekben. Nem mértünk szignifikáns eltéréseket a metalloproteáz szöveti inhibítor-2 (TIMP2) expresszióban. A

csont

morfogenetikus

protein-2

(BMP2)

kifejeződésének

szintjét

magasabbnak találtuk a gipsz- és a HA-kezelt tenyészetekben (4,1-szeres, illetve 9,3szoros növekedés a kezeletlen sejtekhez képest és 2,6-szoros illetve 6,6-szoros túlexpresszió a PMMA-kezeléshez képest). Az interleukin-1-alpha (IL-1A) nem expresszálódott a gipsz-szel kezelt tenyészetekben és szignifikánsan magasabb expresszióját mértük a HA—kezelt NP sejtekben (5,3-szoros növekedés). A SOX9 gén átíródását a PMMA-kezelés szignifikánsan gátolta (3,3-szoros csökkenés), míg a HAkezelés stimulálta (5,8-szoros növekedés). A gipsz nem befolyásolta a SOX9

48

expresszióját a kezeletlen sejtekhez viszonyítva, de szignifikáns különbség mutatkozott a HA/gipsz- és a PMMA-kezelés hatása között (19,1-szeres illetve 2,3-szoros expressziós csökkenés a PMMA-kezelt tenyészetekben). 11. Ábra A génexpressziós változások az alkalmazott vertebroplasztikás töltőanyag

10

lg(NP-hez viszonyított génexpresszió)

lg(NP-hez viszonyított génexpresszió)

anyagi minőségétől függően (mean±SD)

*

1

* #

#

*

* *

§

0,1

AGC1 AGC1

COL1A1 COL1A1

10

#

1 #

*

#

* * #

*

0,1

COL2A1 COL2A1

BGN BGN

DCN DCN

FN1 FN1

10

lg(NP-hez viszonyított génexpresszió)

lg(NP-hez viszonyított génexpresszió)

#

#

1

§

0,1 MMP2 MMP2

MMP13 MMP13

PMMA

*

*

#

*

#

1

* §

0,1 BMP2 BMP2

TIMP2 TIMP2

NP

#

*

10

GIPSZ

IL-1A IL-1A

SOX9 SOX9

HA

Minden gén expressziója az adott sejttenyészetben mért GAPDH expresszióra volt normalizálva, és a kezeletlen tenyészetekben (NP) mért expresszióhoz viszonyítottuk. *: szignifikáns eltérés a kezeletlen (NP) sejtekhez képest, #: szignifikáns különbség a PMMA-val kezelt sejtekhez képest, §: az adott gén expressziója nem volt mérhető a tenyészetben

5.2.3. Az MC3T3 preoszteoblasztok alakja, osztódása és a médium alkalikus foszfatáz aktivitása különböző tenyésztő felületeken A gipszkorongon tenyésztve a preoszteoblasztok életképesek maradtak és proliferáltak, hasonló mértékben, mint a Ca2+-szupplementált műanyag tenyésztő platek esetében (12. Ábra). A 24 órás inkubációs periódus alatt a proliferációs arány a gipsz-en (1,89±0,091) szigifikánsan magasabb volt, mint a PMMA-n (p<0,01), ahol a

49

sejtosztódás gátlását tapasztaltuk (0,914±0,052). A Ca2+-szupplementált tenyésztőplaten (TP25) a gipszhez hasonló proliferációt mértünk (2,07±0,06).

12. Ábra Az MC3T3 sejtek számának

A sejtszám változása különböző felületeken

változása 24 órás inkuációs periódus A sejtszám változása 24 óra alatt

alatt (mean±SD, **: p<0,01)

250%

** 200%

150%

100%

50%

0%

GIPSZ

TP25

PMMA

13. Ábra Az MC3T3 sejtek morfológiája gipszen (A-B), ásványi gipszlapon (C), PMMA-n (D) és tenyésztő platen – 25,5 mM (E) és 1,8 mM (F) Ca2+-koncentráció melett (3 napos tenyészetek, hematoxylin festés)

100 μm

A

100 μm

D

25 μm

100 μm

B

E

250 μm

100 μm

50

C

F

Az MC3T3-sejtek jól tenyészthetőnek bizonyultak tenyésztő platen magas Ca2+koncentráció mellett és gipszkorongon. A sejtek alakja standard körülmények között kuboidális, míg a gipszkorongokon inkább hosszúkás, elnyújtott volt. Hasonló morfológiát tapasztaltunk a Ca2+-szupplementált, műanyag plates tenyészetekben. Az ásványi gipszlapon nem tudtak a preoszteoblasztok kitapadni és osztódni, míg a PMMA korongon sejtdegeneráció és nekrózis jeleit láttuk (13. Ábra). Az alkalikus foszfatáz mérések során megnövekedett aktivitást találtunk a gipszkorongok és a Ca2+-szupplementált médiumokban, a PMMA-felszínnel és a standard médiummal összehasonlítva (14/A Ábra). Az ALP-aktivitást 23,14±4,55 U/gnak mértük a gipsz-en, ami szignifikánsan magasabbnak bizonyult a tenyésztő platen mért értéktől (TP: 4,44±0,52 U/g), de nem különbözött a Ca2+-szupplementált médiuban mért ALP aktivitást (TP25: 30,07±3,04 U/g). Szignifikáns, mintegy 6-szoros különbséget mértünk a gipsz-en és a PMMA-n tenyésztett sejtek ALP-aktivitása között (PMMA: 4,08±0,62 U/g). A 15 napos tenyészetekben a SMAD3 gén expressziója hasonló arányban változott (14/B Ábra). A SMAD3 expressziót a gipsz felületen 2,2-szer nagyobbnak mértük, mint a PMMA- és 2,6-szor magasabbnak, mint a tenyésztő platen (p<0,01). A 25 mM-os Ca2+-szupplementáció esetében szintén magas SMAD3 expresziót detektáltunk.

5.2.4. A gipsz felület és a magas Ca2+ koncentráció hatása a preoszteoblasztok génexpressziós profiljára A 15 napos sejtkultúrákban az egyes gének kifejeződésének mértékét az adott tenyészet GAPDH expressziójához hasonlítottuk, így a gének expressziójának relatív értékét vethettük össze az egyes tenyésztési felszíneken. Csak azokat a géneket ábrázoltuk a 23. Ábrán, ahol szignifikáns különbségeket mértünk és a változás mértéke meghaladta a 2-szeres különbséget. A gipsz felszínen tenyésztett sejtek génexpressziós profilja eltért a tenyésztő plate-n tenyésztett preoszteoblasztok génexpressziójától. A II. típusú kollagén (COL2A1) expressziója 130-szor magasabb volt (p<0,001) a gipszkorongon. A

51

fibronektin 1 (FN1), a SMAD3 és a SMAD6 szintén nagyobb mértékben expresszálódott a gipszen. A tenyésztő platen, standard Ca2+-szint mellett növekvő sejtekben

12-szeres

növekedést

mértünk

az

I.

típusú

kollagén

(COL1A1)

expressziójában. A dekorin (DCN) és a csont morfogenetikus protein-4 (BMP4) specifikus mRNS-ek szintjében csökkenést detektáltunk a gipszfelszínen. A csont szialoprotein (BSP), az oszteokalcin (BGLAP) és a kalcium-szenzor (CASR) nem expresszálódott mérhető mértékben a gipszkorongokon. 14. Ábra Az alkalikus foszfatáz aktivitás (A) és a SMAD3 expresszió (B) 15 napos tenyészetekben (mean±SD, *: p<0,05, **: p<0,01) A. ALP aktivitás a médiumban (U/g protein)

ALP aktivitás a 15 napos sejttenyészetekben

**

40

* *

35 30 25 20 15 10 5 0 TP

A gén GAPDH-hoz viszonyított relatív expressziója

B.

TP25

GIPSZ

PMMA

SMAD3 expresszió 15 napos tenyészetekben

** *

*

0,008 0,007 0,006 0,005 0,004 0,003 0,002 0,001 0

TP

TP25

GIPSZ

PMMA

52

A standard tenyésztő médium Ca2+-szupplementációját követően, magas Ca2+koncentráció mellett, a COL2A1 expressziójának 80-szoros növekedését és a COL1A1 20-szoros csökkenését mértük a tenyésztő plateken nevelt sejtkultúrákban. A SMAD6 és a SMAD3 szintén szignifikánsan jobban expresszálódott a Ca2+-szupplementált tenyészetekben, a gipszkorongokhoz hasonlóan. A DCN, a BMP4 és a BSP mRNSátíródása csökkent a magas Ca2+-szint mellett. A standard, 1,8 mM Ca2+-t tartalmazó médiumban nevelt sejteknél a tenyésztő platen expresszálódott a CASR és a BGLAP, míg magas, 25,5 mM-os Ca2+-koncentrációnál a gének átíródása nem volt mérhető. A magas Ca2+-koncentrációjú médium mellett a tenyésztő plateken mérhető expressziós profil a gipszkorongon tenyésztett sejtekéhez volt hasonló. Az MC3T3-E1 sejtek COL2A1 expressziója jelentősen magasabb volt gipszen, mint a PMMA-korongokon (51-szeres különbség, p<0,001), míg a COL1A1 7-szer magasabb szinten expresszálódott a PMMA-n. Az FN1, a SMAD6 és a SMAD3 szintén a gipszen expresszálódott jobban, míg a BMP4 és a DCN a PMMA-n fejeződött ki nagyobb mértékben. A CASR, a BGLAP és a BSP expressziója nem volt mérhető gipszen, míg PMMA-n a gének szignifikáns expresszióját detektáltuk. A PMMA korongokon tenyésztett sejtek expressziós profilja a standard tenyésztő platen nevelt sejtkultúrák génexpressziójához volt hasonló.

53

54

0

1

2

3

4

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0

0,1

0,2

0,3

0,4

CP TP

CP TP

CP TP

**

*

**

BSP

CP25 TP25

CP25 TP25

**

DCN

GYPS GIPSZ

†

GYPS GIPSZ

GYPS GIPSZ

COL1A1

**

CP25 TP25

**

*

**

PMMA PMMA

PMMA PMMA

PMMA PMMA

0

0,00003

0,00006

0,00009

0,00012

0

0,0025

0,005

0,0075

0,01

0

0,06

0,12

0,18

0,24

TP CP

CP TP

CP TP

*

*

TP25 CP25 †

†

GIPSZ GYPS†

†

GYPS GIPSZ

GYPS GIPSZ

BGLAP

CP25 TP25

*

BMP4

CP25 TP25

**

COL2A1

**

**

PMMA PMMA

PMMA PMMA

PMMA PMMA

0

0,0000015

0,000003

0,0000045

0,000006

0

0,0025

0,005

0,0075

0,01

0

1,7

3,4

5,1

6,8

CP TP

CP TP

CP TP

*

**

CP25 TP25

†

CASR

CP25 TP25

GYPS GIPSZ

GYPS GIPSZ

†

GYPS GIPSZ

SMAD6

**

FN1

**

CP25 TP25

*

**

**

PMMA PMMA

PMMA PMMA

PMMA PMMA

15. Ábra A génexpresszió relatív mértéke az egyes tenyésztő felületeken 15 napos tenyészetekben (mean±SD, *: p<0,05, **: p<0,01)

Relatív génexpresszió

Relatív génexpresszió

Relatív génexpresszió

Relatív génexpresszió Relatív génexpresszió Relatív génexpresszió

Relatív génexpresszió Relatív génexpresszió Relatív génexpresszió

6.

Megbeszélés

6.1.

Új kandidáns gének összefüggése a csontdenzitással és a törési rizikóval A csontritkulás kialakulásában a genetikai faktoroknak kiemelt szerepe van. A

csúcscsonttömeg – a mérési helytől és a vizsgált populációtól függően – 60-80%-ban genetikailag determinált [9, 14-16] és a család- és ikervizsgálatok eredményei a törési rizikót befolyásoló egyéb csont-paraméterek – csontminőség, combnyak geometria [164], izomerő [165], csontturnover [166], BMI [167], menopauzális életkor [168] – genetikai meghatározottságát igazolták. Számos olyan monogénes eltérésről tudunk, amely ritka, csontrendszeri eltérésekkel járó öröklődő betegséghez vezet, de az oszteoporotikus csontvesztés patogenezisének pontos genetikai hátterét nem ismerjük, az irodalmi közlemények pedig gyakran ellentmondásosak, melynek oka részben a metodikai eltérésekben és az etnikai különbségekben keresendő. A csonttörések rizikóját tekintve a genetikai faktorok erejét 25-50%-nak mérték a csuklótörések [169], [170] és 60-70%-nak a csípőtáji törések [171] kapcsán, azzal a fontos konklúzióval, hogy a 65 éves kor előtt bekövetkezett töréseknél ilyen magas a genetikai faktor hatása, amely hatás az életkor előrehaladtával gyengül. Az alacsony csontdenzitás fokozott törési rizikót jelent, de a két oszteoporotikus fenotípus (alacsony BMD és fokozott törési rizikó) részben eltérő genetikai háttérrel rendelkezhet [172]. Kutatásunkban öt új, potenciálisan kandidáns gén 24 polimorfizmusának összefüggését vizsgáltuk a posztmenopauzás csontritkulással. Az öt kiválasztott gén közül négy gén polimorfizmusainak szerepét nem közölték korábban a nemzetközi irodalomban. Három olyan individuális SNP-t találtunk, amelyek szignifikáns összefüggést mutattak a csontritkulással. Az FGFR1 a tirozin-kináz receptor családba tartozó transzmembrán molekula, amely oszteoblasztokon és oszteoklasztokon is megtalálható és a mesenchymális őssejt oszteogén differenciálódásában játszik szerepet [173-175]. Az FGFR molekulacsalád jelentőségét mutatja, hogy másik tagja, az FGFR3 mutációja okozza a domináns öröklődésű achondropláziát. Az FGFR1 mutációit kapcsolatba hozták a szkeletális deformitásokkal járó Pfeiffer és Kallmann szindrómákkal, a fog-agenezissel [176] és a gén haplotípusait a koponya normál variációival találták összefüggőnek [177]. Korábbi vizsgálatunkban az FGFR1-

55

specifikus mRNS csökkent expresszióját találtuk oszteoporotikus csontszövetben. Jelen vizsgálatunkban az FGFR1 génben található rs6996321 polimorfizmus szignifikánsan befolyásolta a lumbális BMD-t. Az 1. intronban található SNP egy tag-polimorfizmus, a gén első szakaszában (promóter, 1. exon, 1. intron) található SNP-kel r2>0,8 valószínűséggel van kapcsoltsági viszonyban. Valószínűleg az intronikus SNP így inkább genomikus markerként szerepelhet, mint a gén működését közvetlenül befolyásoló variáns. Az SNP erős kapcsoltságban van az rs2568231 SNP-vel, amely a gén egy splice site-jában helyezkedik el, 7 bp-nyira az 1. exontól és elképzelhető, hogy a poszttranszkripciós splicing mechanizmus befolyásolásán keresztül hatással lehet a gén funkcióra. A génben található 4 SNP-ből konstruált FGFR1 haplotípus önálló befolyással bírt a lumbális csontdenzitásra, alátámasztva a feltételezést, hogy az FGFR1 génnek szoros kapcsolata lehet a csont-metabolizmussal és variánsai befolyással bírnak a csontritkulás kialakulására. A FABP3 gén promóterében található rs10914367 SNP homozigóta recesszív genotípusa szignifkánsan korrelált a magasabb femur BMD-vel. Az SNP a gén promóter régióját, 1. exonját és 1. intronját taggeli és a szekvencia analízis során transzkripciós faktor (TF) kötő helyeket azonosítottunk a lókuszt tartalmazó génszakaszon. Az ’A’ allél esetén a következő négy TF képes a génszakaszhoz kötődni, több mint 90%-os homológiát feltételezve (az rs10914367 allél aláhúzásával); FOXP3 – forehead boksz protein P3 (GCCAAC), C/EBPbeta – CCAAT enhancer binding protein beta (CCAA), PR-A and PR-B – progeszteron receptor A és B izoforma (AACACCA). A ’G’ allél esetében ezek a TF kötő helyek „eltűnnek”, amely alapján feltételezhető, hogy a polimorfizmusnak transzkripció-regulátor szerepe lehet. A FABP3 a zsírsavmetabolizmusban játszik szerepet, a sejtek zsírsavfelvételét és a zsírsavak intracelluláris transzportját regulálja [178] és korábban összefüggésbe hozták a diabetes mellitus és az elhízás patogenezisével [178, 179]. A molekula expresszálódik a csontvelő eredetű mesenchymális őssejteken [180], és a gén expresszióját a PPARγ is befolyásolja, amely transzkripciós faktor összefüggését leírták a csontvesztés folyamatával. A PPARγ a mesenchymális őssejtek adipogén differenciálódását serkenti, valamint gátolja az oszteogén fejlődési utat [29, 30]. Ezt a rendszert befolyásolja a közelmúlt oszteológiai kutatásainak másik kandidánsai, az ALOX12, ALOX15 molekulák [181, 182]. Fenti eredményeink alátámasztják a korábban feltételezett kapcsolatot a csont és a lipid

56

metabolizmus között [183-185], kihangsúlyozva, hogy a FABP3 és allelikus variánsainak pontos szerepének tisztázására további vizsgálatok szükségesek. Munkánkban azonosítottunk egy SNP-t a TIMP2 génben (rs9900972), amely a non-vertebrális törési rizikóval mutatott szignifikáns kapcsolatot. A polimorfizmus ’A’ allélét hordozókban 2-szeres törési rizikót mutattunk ki az ’A’ allélt nem hordozókhoz képest. Ez az SNP intronban helyezkedik el és a gén középső régiójával van magas genetikai kapcsoltsági viszonyban. Így a törési rizikó markereként és nem a génfunkciót direkt befolyásoló variánsként értelmezhetjük. A TIMP2 a – normális [186] és patológiás [187, 188] csontmetabolizmusban kiemelt szerepet játszó – mátrix metalloproteinázok (MMP) nem specifikus inhibítora. Az oszteoblasztok által termelt ECM mennyisége és minősége közvetlenül determinálja a csontszövet mennyiségi és minőségi jellemzőit és így a törésre való hajlamot. Az MMP kaszkádrendszer egyes tagjainak

génpolimorfizmusait

korábban

már

leírták

a

csontmetabolizmussal

összefüggésben. Az MMP1 és az MMP9 allelikus variánsait szignifikánsan összefüggőnek találták a csontdenzitással [189, 190]. Az MMP2 polimorfizmusait a multiplex oszteolízis és arthritis szindróma prediktoraként azonosították [188]. Az enzim fontos szerepét bizonyították malignus betegségek [191] és az egészséges csontgyógyulás [192] folyamatában. Vizsgálatunkban az MMP2 variánsait önmagukban nem találtuk szignifikánsan összefüggőnek a csontritkulás fenotípusaival, de találtunk olyan szignifikáns gén-gén interakciót, amelyben részt vett a gén. A TIMP2-vel olyan interakciót

azonosítottunk,

amely

a

törési

rizikót

befolyásolta

a

vizsgálati

populációnkban. A TIMP2 allelikus variánsai befolyásolhatják az MMP-kra kifejtett gátló hatást, míg az MMP2 polimorfizmusai az enzim mátrixdegradáló aktivitását módosíthatják. A csökkent gátlás és/vagy a megnövekedett aktivitás felgyorsult ECM lebontáshoz vezet, amely a csont törékenységet fokozhatja. A TIMP2 szintén feltűnt az ALPL-lel alkotott szignifkáns, femur BMD-t befolyásoló gén-gén interakcióban. Az ALPL az oszteoid mátrix mineralizációjának folyamatában nélkülözhetetlen enzim, szérumszintje korrelál a csont-turnover mértékével. Állat és humán vizsgálatok igazolták, hogy ALPL expresszió csökkent mértékű az alacsony csontmennyiséggel rendelkezőkben [118, 193]. A gén polimorfizmusait a hypophospatasia különböző formáival [194] és a csontdenzitással szintén összefüggésbe hozták [195]. Eredményeink alátámasztják a korábbi

57

feltételezéseket,

miszerint

az

ALPL

génpolimorfizmusai

hatással

vannak

a

posztmenopauzális oszteoporózis patogenezisére, de további vizsgálatokat látunk szükségesnek a fentiek tisztázására. Humángenetikai vizsgálatunkban külön figyelmet fordítottunk a polimorfizmusvizsgálatok kapcsán felmerülő statisztikai problémák kezelésére. Vizsgálatunk közepes nagyságú, jól dokumentált populáción végzett többszörös asszociációs vizsgálatnak minősült, ahol szigorú kritériumok mellett alkalmaztuk a robosztus statisztikai próbákat a fals eredmények elkerülése érdekében. Az egyedi SNP analízis során 21 marker egyedi hatásait vizsgáltuk, négy fenotípuson, és permutációs próbát alkalmazva határoztuk meg a statisztikai próbákhoz tartozó empirikus p-értékeket. A szignifikiáns eredményeket csak azokban az eseteben diszkutáltuk, ahol a vizsgálat statisztikai ereje (power of the study) 80%-nál magasabb volt. A haplotípus vizsgálatok során a score tesztek esetében szintén empirikus p-értékeket nyertünk a permutációs próbák alkalmazásával, és a szignifikáns összefüggéseket egy másik statisztikai módszerrel – generalizált lineáris modellben – validáltuk. A gén-gén interakciókat abban az esetben fogadtuk el szignifikánsnak, ahol az LRT analízis során nyert magas szignifikancia szintet (p1<0,001) követően, regressziós analízisben is erősen szignifikáns (p2<0,01), validált interakciót találtunk. Minden vizsgálati alanytól nagy mennyiségű klinikai és életmódi adatot gyűjtöttünk, adatbázisunkban így hatékonyan tudtuk érvényesíteni a kizárási és a korrekciós módszereket.

6.2.

A kompressziós csigolyatörés minimál invazív kezelésében alkalmazott

csontcementek hatása a nucleus pulposusra Hazánkban évi 35-40000 csigolyatest roppan össze az oszteoporózis következményeként és a kompressziós csigolyatörés elszenvedése után drámain nőnek a morbiditási és mortalitási kilátások, főleg kezeletlen eseteknél [5, 9, 10]. A kompressziós csigolyatörések minimál invazív sebészi terápiája az utóbbi évtizedben rutin

eljárássá

vált.

Az

összeroppant

csigolyatest

cement-augmentációját

oszteoporotikus törések esetében is jó klinikai eredménnyel alkalmazhatjuk, azonban a

58

hosszútávú eredmények, és a különböző technikákat illetve a szövődményeket összehasonlító vizsgálatok irodalma közel sem teljes. In vitro mérésekkel és számítógépes modellezéssel bizonyították, hogy a csigolyatest cement-augmentációja megnöveli a mozgásszegmentum szilárdsági és merevségi paramétereit [131, 196-200], valamint a beavatkozás megnöveli a szomszédos porckorongok nucleus pulposusában mérhető nyomást [196, 197, 200]. A megváltozott terhelési viszonyok a szegmentum posterior alkotórészein és a csigolyaközti porckorongon keresztül áttevődnek a szomszédos csigolyákra [196-198, 200] és a fenti biomechanikai változások a szomszédos csigolyák összeroppanásának rizikóját megnövelhetik, különösen a korai- és középtávú posztoperatív periódusban [196, 198, 200]. A csigolya-augmentációs eljárások kapcsán, az eljárást követő új csigolyatest törések bekövetkezése – leggyakrabban a kapcsolódó szegmentumokban – gyakori posztoperatív „szövődmény”, melynek pontos mechanizmusa és a új törés rizikóját befolyásoló faktorok még nem ismertek [201-204]. A csigolya-augmentációk során a csigolyaközti porckorong állományába történő cement csorgás a leggyakoribb – általában tünetmentes – komplikáció. Kutatásunkban az alkalmazott csontcementek hatását vizsgáltuk izolált, humán nucleus pulposus sejteken, in vitro körülmények között. Az elterjedten alkalmazott PMMA csontcement – dózis és kezelési idő függvényében – szingifikánsan csökkentette az NP sejtek számát a tenyészetekben. A kezelési időt figyelembe véve, a PMMA esetében toxikus hatást mértünk, míg a HA gátolta a sejtek proliferációját, a gipsz pedig nem befolyásolta az NP sejtek életképeségét az alkalmazott dózisban. A fentiek alapján feltételezhető, hogy a különböző minőségű vertebroplasztikás csontcementek eltérő élettani hatással rendelkeznek (nem csak az NP sejtekre, hanem feltehetően a csigolyatest csontsejtjeire is). Az NP sejtek génexpressziós profilját szintén szignifikánsan befolyásolták az alkalmazott

vertebroplasztikás

töltőanyagok.

A

csigolyaközti

porckorong

biomechanikai paramétereit alapvetően meghatározó major (COL1A1, AGC) és minor (BGN, DCN) extracelluláris mátrix (ECM) komponensek génexpressziója csökkent, a különböző csontcementek hatására eltérő mértékben. Szignifikáns változásokat mértünk a transzripciós faktorok (BMP2, SOX9) esetében is. A BMP2 expressziójának növekedése a HA és gipsz kezelt tenyészetekben valószínűleg az NP sejtek limitált

59

repair mechanizmusát jelzi [205-207], amit a PMMA-s kultúrákban nem tapasztaltunk. Az általunk mért sejtszám- és génexpressziós változások a csigolyaközti porckorong degenerációját kísérő hisztológiai és molekuláris jeleknek megfelelők [208]. Az ECM-t tekintve, a kollagén hálózat (dominánsan 2. típusú és 1. típusú kollagén) biztosítja a porckorong jó szakítószilárdságát, míg a kollagén-hálózatot körbevevő proteoglikán (aggrekán, biglikán, dekorin) hidrogél felelős a discus rugalmasságáért, kompressziós rezisztenciájáért és viszkoelaszticitásáért [209]. CsSzabo és munkatársai korábban leírták, hogy a proteoglikánok termelése csökken a degenerált nucleus pulposusban [210] és a degeneráció mértéke korrelál a discus proteoglikán tartalmával [211]. Kísérletes terheléses vizsgálatokban, a terhelés növelésével párhuzamosan – a magas nyomástartományokat leszámítva – a kollagén termelés emelkedését mérték [206, 212]. Magas hidrosztatikai nyomás azonban az NP sejtek kollagén termelésének csökkenését eredményezi, és ezt találjuk in vivo, degenerált discusok esetében is [213, 214]. Más molekuláris komponensek – metalloproteázok (MMP) és inhibitoraik (TIMP), transzkripciós faktorok (SOX9 és BMP) – szintén módosítják a nucleus pulposus biomechanikai tulajdonságait és fontos szerepük van a porckorong degeneráció folyamatában [205-208]. A megváltozott mátrix biológia megváltozott biomechanikai tulajdonságokat eredményez [215], a discus csökkent rugalmassága és szakítószilárdsága felelős – részben – az olyan degeneratív gerincbetegségek kialakulásáért, mint a gerincsérv vagy a spondylosis [209]. A porckorong állományába történő cementcsorgásról korábban leírták, hogy növeli a vertebroplasztikás eljárások után bekövetező új csigolyakompressziók rizikóját [216, 217]. A szövődmény bekövetkezése valószínűleg összefüggésben van a csigolyaközti porckorong megváltozott biomechanikai karakterisztikájával, illetve degenerációjának fokával [218]. Vizsgálatunkban kimutattuk, hogy a csigolyaplasztikás csontcementek – és főleg a klinikai gyakorlatban használatban lévő PMMA cement – csökkenti az NP sejtek proliferációját és

az

anabolikus

mátrix

proteinek

génexpresszióját. Eredményeink egybevágnak azokkal a korábbi vizsgálatokkal, amelyek a PMMA káros, toxikus hatását írták le csontsejteken [134, 137], valamint chondrocitákon [219]. Kutatásunk alapján feltételezhető, hogy a csigolyaközti porckorong állományába kerülő csontcement negatívan befolyásolja az NP szöveti integritását, amely gyorsult degenerációhoz, és így a porckorong biomechanikai

60

jellemzőinek hanyatlásához vezethet. A sokszor tapasztalt intradiscális cementcsorgás tehát közvetlen összefüggésben állhat a vertebroplasztikás eljárások után gyakran bekövetkező – korai, illetve középtávú posztoperatív szakban realizálódó – szomszédos csigolyák összeroppanásával. 6.3.

A

szintetikus

csontpótló

graftként

felhasználható

gipsz

hatása

preoszteoblaszt sejtekre A csontpótlás kérdéskörének jelentőségét mutatja, hogy világszerte, évente több mint 2 millió esetben kerül sor csontpótló beavatkozásra, és a növekvő igények kielégítése érdekében intenzív fejlesztések folynak az ideális szintetikus csontpótló graft kifejlesztése érdekében. A kristályos kalcium-szulfát (gipsz) csonthiány-kitöltő anyagként való alkalmazásáról régóta jelennek meg klinikai beszámolók, de a szintetikus graft biológiai viselkedéséről nem sokat tudunk. A természetben fellelhető gipszkristály (CaSO4 * 2H2O) tökéletes kristályszerkezetű anyag, ellentétben a modellgipszből (CaSO4 * ½ H2O) „házilag” készített gipsszel, ahol sok kis apró gipszkristály növekszik egymás mellett, kialakítva egy térhálós makroszerkezetet. A gipsz vizes közegben gyengén disszociál Ca2+ és SO42- ionokra, vizsgálatunkban a sejttenyésztő médiumban így kialakuló Ca2+-koncentrációt 25,5 mM-nak mértük. A csont remodeling helyein (BMUk) az extracelluláris Ca2+-koncentráció akár 40 mM is lehet [220] és az emelkedett Ca2+szint az oszteoblasztok számára kemotaktikus és proliferációs szignálként szerepel és serkenti a pre-oszteoblasztok differenciálódását [221-223]. Saját – a gipsznek a csontsejtekre gyakorolt hatásainak feltárását célzó – vizsgálatunkban azt találtuk, hogy az oszteoblasztok szignifikánsan magasabb rátával képesek osztódni a gipszfelületen, mint a PMMA csontcementen. Ezen felül, a gipsz fizikai szerkezete is fontosnak tűnik a csontsejtek megfelelő kitapadásában. A sejtek nem tudnak letapadni az ásványi gipszlapon, amelynek tökéletes kristályrács szerkezete nem „hozzáférhető” az oszteoblasztok számára. Abban az esetben azonban, ha a gipszkorongot modellgipszből (CaSO4-hemihidrát) készítjük víz hozzáadásával, az MC3T3-E1 sejtek jól megtapadnak a korong felszínén. A gipsz ezen formájában számos

61

apró kristály található egymás mellett, nagy molekuláris felszínt biztosítva a sejtek osztódásához és mátrix termeléséhez. Az ALP aktivitás az oszteoblaszt tevékenység, a fokozott csont-turnover, csontremodeling markere. Emelkedett szérum-szintje mérhető a törés utáni csontgyógyulás során [224, 225]. A gipszfelszínhez tapadt csontsejtek ALP pozitívan festhetők [226]. Winn és munkatársai [227] úgy találták, hogy a kalcium-szulfát pelleteken tenyésztett oszteoblasztok osztódási aránya és ALP aktivitása csökken, azonban ez erősen függ a tenyésztési körülményektől. Az ALP aktivitás és az MC3T3-E1 sejtek mineralizációs aktivitása az extracelluláris Ca2+-koncentráció befolyása alatt áll [221, 223], és valószínűleg összefügg a SMAD3 gén expressziójával (amely gén a TGFβ szignálútvonal kritikus komponense) [228]. Kutatásunkban azt találtuk, hogy megemelkedett ALP aktivitás mérhető azokban a tenyészetekben, ahol magas Ca2+-szint jellemezte a médiumot. A gipszen tenyésztett sejtekben és a platen nevelt, Ca2+szupplementált kultúrákban a SMAD3 expresszió szintén magasabb volt a standard Ca2+-koncentrációjú

és

a

PMMA-n

tenyészettet

sejtekkel

összehasonlítva.

Eredményeink abba az irányba mutatnak, hogy a magas extracelluláris Ca2+ ALP aktivitásra kifejtett stimuláló hatása – legalábbis részben – a csontképzésben és csontgyógyulásban ismert jelentőségű transzkripciós faktor [229], a SMAD3 expresszió serkentésén keresztül valósul meg. A magas SMAD3 expresszió eseteiben, az oszteogén differenciáció késői markereinek (BGLAP, BSP) transzkripciója csökkent volt, vagy nem volt mérhető. Ezek a mérések alátámasztják Sowa és mtsai [228] eredményét, akik azt találták, hogy a SMAD3 serkenti az ALP aktivitást és a mineralizációt, de gátolja az oszteokalcin expressziót az MC3T3-E1 sejtekben. Szintén leírták, hogy a TGFβ kezelés, vagy a SMAD3 transzfekció befolyásolja a sejtek alakját [230]. Ahogyan jelen kutatásban magunk is találtuk; a magas SMAD3 expresszióval jellemezhető sejtek inkább orsó alakúak. Az in vitro nyert eredményeink azt mutatják, hogy az MC3T3-E1 preoszteoblaszt sejtek eltérő irányban differenciálódnak a vizsgálatainkban alkalmazott kísérleti körülmények között. Az extracelluláris mátrix összetevők génexpressziója markánsan változott az adott tenyésztő felülettől függően. A gipszkorongon nyert expressziós profil jellege a csontgyógyulás folyamatának irányába mutat. A különböző

62

kollagének és más kis mátrix molekulák expressziójában mért változások valószínűleg a magas extracelluláris Ca2+-szint következményei, mivel nagyrészt ezeket a változásokat detektáltuk a sejttenyésztő platen, magas Ca2+-tartalmú médiumban nevelt kultúrák esetében is. Korábbi tanulmányok leírták, hogy a csontgyógyulás folyamata során a COL2A1 és az FN1 megnövekedett expressziója mérhető a gyógyuló defektus területén [231, 232], és az újonnan képződő csont jól karakterizálható az aktív oszteoblasztokban – és nem a chondrocitákban – szintetizálódó COL2A1 megjelenésével [233]. Az FN1 a törött csont hegmentes gyógyulásában játszhat szerepet [232]. A DCN – mint más proteoglikán a csontban – a kollagén-hálózat „összeszerelésében” és funkciójának kiegészítésében is fontos [31]. A gipszen mért génexpressziós mintázat a fentiekhez hasonlónak bizonyult kísérleteinkben.

63

7. Következtetések Az oszteoporózist jellemző fenotípusokat (csökkent csontsűrűség, emelkedett törési rizikó) befolyásoló genetikai faktorok és a genetikai tényezők egymással való kapcsolata teljes egészében nem ismert. Az egyes gének, génváltozatok egyedi hatása csekélynek bizonyult a korábbi vizsgálatokban (pl. a csontdenzitásra még a legszignifikánsabb polimorfizmusoknak is önmagukban 0,5-2%-os befolyásoló hatásuk van [17-20, 92]). A multifaktoriális kórkép hátterében poligénes öröklésmenet és az egyes gének egymással való interakciója valószínűsíthető. A multigénes modell alátámasztása érdekében végeztünk – egy hangsúlyozottan demonstratív célú – analízist a következő metodika szerint. A lumbális BMD esetében a korábban diszkutált rs6996321 FGFR1 SNP mellett, találtunk két másik SNP-t, amelyek szignifikáns befolyással bírtak a csontdenzitásra. Munkánkban szigorú kritériumokat alkalmaztunk az individuális SNP-analízisek eredményeire vonatkozólag. A két másik (rs3738099 – ALPL, és rs10914367 – FABP3) SNP-vel talált összefüggés nem teljesítette a study power-re vonatkozó kritériumunkat (power > 80%). A továbbiakban kiszámítottuk, hogy a lumbális denzitást befolyásoló 3 új polimorfizmus a teljes populációs varianciára milyen mértékű hatással bír. Ehhez a számításhoz generalizált lineáris modell-be (GLM) illesztettük az adott modellnek (additív, domináns, recesszív) megfelelően kódolt SNP-ket és függő változóként az adjusztált lumbális BMD-t. A statisztikai számítás eredményében, ez alkalommal a megmagyarázott hányadot jellemző R2 illetve adjusztált R2 értékeket elemeztük. Az SNP-k egyedi beillesztésénél a következő adjusztált R2 értékeket kaptuk; 0,03 (rs6996321), 0,005

(rs3738099) és 0,005

(rs10914367), ami az SNP-k 3%, 0,5% és 0,5%-os egyedi hatását jelenti a lumbális gerinc csontdenzitás varianciájára vonatkoztatva. Kiemelendő, hogy az individuális analízis során alkalmazott szigorú „rostánkon” fennmaradt rs6996321 FGFR1 polimorfizmus egyedi hatása kiemelkedően magas, ami aláhúzza az újonnan leírt polimorfizmus jelentőségét. A következő lépésben a modellbe mindhárom SNP-t beillesztettük. Így a teljes modell adjusztált R2 értéke 0,048-nak, azaz majdnem 5%-nak adódott, jelezve a egyrészt multigénes modell, és a multiplex genetikai analízis létjogosultságát, másrészt az egyes genomikai faktorok hatásának non-additív jellegét. A végső lépésben a modellünkbe beillesztettük a lumbális csontdenzitásra

64

szignifikánsnak talált gén-gén interakciót, amelyet az rs10914367 (FABP3) és az rs1030868 (MMP2) között írtunk le. A gén-gén interakció egyedi hatását 1,8%-nak mértük (adjusztált R2=0,18), azonban a három SNP mellé illesztve a teljes megmagyarázott hányadot „csak” további, mintegy 0,5%-kal emelte (ebben az esetben a teljes modell adjusztált R2 0,053 volt). A csontdenzitás multiplex genetikai hátterének vizsgálata és értelmezése során tehát figyelembe kell venni azt a tényt, hogy az egyedi SNP-k hatása és a gén-gén interakciók hatása nem egyszerűen összeadódik, szummálódik, ezért a jövőbeni vizsgálatok során törekedni kell, hogy egyidőben minél több kandidáns génpolimorfizmust vizsgáljunk, a valóságos biológiai konstelláció minél tökéletesebb leírására. Vizsgálatunkban nem találtunk olyan egyedi génpolimorfizmust, vagy SNP-SNP interakciót, amely mind a csontdenzitást, mind a törési rizikót szignifikánsan befolyásolta volna, bár két gén is (TIMP2 és MMP2) szerepelt mind a csontdenzitást és mind a törési rizikót befolyásoló gén-gén interakciókban. Eredményeink alátámasztják azokat az elméleteket, miszerint a csontmetabolizmus változását számos eltérő genetikai mintázat eredményezheti. A különböző gén-gén interakciók, SNP-kombinációk eredőjeként hasonló fenotípus jöhet létre. Ilyen értelemben a csontritkulás genetikai háttere diverz – a hasonló fenotípusos megjelenés ellenére. A csontdenzitást és a törési rizikót negatívan és pozitívan befolyásoló környezeti faktorok mellett a genetikai háttérben is az adott egyénben érvényesülő károsító és protektív genetikai faktorok eredője befolyásolja érdemben a betegség manifesztációját. A komplex genetikai háttér megértéséhez, és így a betegség patogenezisének megértéséhez, azaz a diagnosztika és a kezelés fejlesztéséhez tehát olyan típusú vizsgálatokra van szükség, amelyet munkánkban is demonstráltunk. Minél nagyobb esetszámú populáción, több gén / génpolimorfizmus egyidejű analízise segíthet feltárni azokat a molekuláris szinten érvényesülő génvariánsokat és gén-interakciókat, amelyek a tényleges genetikai háttér elemeit jelentik. Kutatómunkánk során öt gén – ALPL, FABP3, FGFR1, MMP2, TIMP2 – polimorfizmusainak összefüggését bizonyítottuk a humán oszteoporózissal. A négy utóbbi gén szerepét eddig nem vizsgálták a csontritkulás kapcsán. Az öt gén új kandidánsként szerepelhet a további humán vizsgálatokban, mivel az ortológ-modell, a szarvas-agancsképzés

kapcsán

kerültek

először

látóterünkbe,

génexpressziós

65

változásaikat humán csontszövetben írtuk le korábban, jelen munkánkban pedig egyes génvariánsaikat a betegséggel összefüggőnek találtuk. A csontritkulás kapcsán azonban a szövődmények, csonttörések kezelése jelenti az egyik legnagyobb egészségügyi és gazdasági problémát a modern társadalmakban. A csigolyatörések okozta morbiditás redukciójában jelentős előrelépést jelentett a perkután csigolya-augmentációs eljárások kifejlesztése, amely sebészi terápiák közel 20 éve állnak rendelkezésre a modern gerincsebészeti centrumokban a kompressziós csigolyatörést elszenvedett betegek kezelésére. A minimál invazív eljárások szövődményeiről, illetve a felhasznált szintetikus csontpótló graftok biológiai viselkedéséről kevés adat áll rendelkezésünkre. A vertebroplasztikás eljárások biomechanikai következményei nagyban függnek az alkalmazott töltőanyag minőségi jellemzőitől [131, 132, 139, 218]. Saját vizsgálatunkban az egyes csontcementek biológiai hatásaiban is jelentős különbségeket tapasztaltunk. A mindennapi klinikai gyakorlatban használt PMMA csontcement negatívan befolyásolta a nucleus pulposus sejtek életképességét és génexpresszióját. Figyelembe véve, hogy a porckorongba került csontcement degeneratív folyamatokat indukálhat a szegmentum rugalmasságáért leginkább felelős alkotóelemben, a nucleus pulposusban, eredményeink alapján valószínűsíthető, hogy ez a gyakran tapasztalt szövődménytípus hozzájárulhat a csigolya-augmentációkat követő új kompressziós törések bekövetkezéséhez. A fentiekre alapozva kijelenthető, hogy a csigolya-augmentációs eljárások szövődmény rátájának csökkentése érdekében, biomechanikailag és biológiailag optimális – az NP sejtek életképességét és génexpresszióját kevésbé befolyásoló – töltőanyag alkalmazása volna szükséges. Mindeddig az intenzív kutatások ellenére sem sikerült az optimális csontpótló graftot kifejleszteni. A szintetikus graft-típusok elterjedésével nagyobb szerep juthat a gipszként ismert kalcium-szulfát-dihidrátnak is. Számos szerző úgy írta le a gipszet, mint biztonságos, felszívódó, csonthiány kitöltő anyagot [234, 235]; melynek lassú abszorpciója lehetőséget teremt a fibrovaszkuláris szövet benövésére és az érújdonképződésre [236], majd újcsont képződésre a defektusban [237]. Walsh és munkatársai [238] feltételezték először a kalcium-szulfát oszteoinduktív hatását, amit a

66

kalcium-szulfát pelletekkel kitöltött csonthiányban kimutatható magas TGFβ-szinttel támasztottak alá. Ezt a hatást a pelletek oldódása miatt kialakuló lokálisan savas kémhatással kapcsolták össze. A klinikumban megfigyelt előnyös tulajdonságait molekuláris biológiai eszközökkel vizsgálva azt találtuk, hogy a gipszen a csontsejtek jobban osztódnak, és nagyobb arányban expresszálják az újcsont képzésben fontos szerepet játszó géneket a – csonthiány kitöltésre elterjedten alkalmazott – PMMA-n tenyésztett sejtekkel összehasonlítva. A gipsz hatékonyabb környezetet biztosít a csont gyógyulás folyamatának. Eredményeink alátámasztják a korábbi feltételezést, miszerint a gipsz nem egyszerűen egy „passzív” oszteokonduktív anyag, hanem speciális kristályszerkezetének és magas kalcium-tartalmának köszönhetően oszteoinduktív potenciállal bír. A szintetikus graftok alkalmazásának egyéb kérdéseire – applikáció, biomechanika – adott sikeres válaszok esetén, a gipsz egy jó ár/érték aránnyal bíró, biológiailag optimális csontpótló graftként szerepelhet a mindennapi klinikai gyakorlatban.

Összegezve, kutatómunkánk során az alábbi összefüggéseket tártuk fel, amelyekre korábbi adatot nem találtunk a nemzetközi szakirodalomban: 1. A szarvasmodellben azonosított – új – kandidáns géneket tanulmányozva, szignifikáns kapcsolatot találtunk az FGFR1 gén allelikus variánsa (rs6996321) és a lumbális csontdenzitás, illetve a FABP3 egyik SNP-je (rs10914367) és a femur BMD között. 2. Vizsgálatunkban találtunk egy olyan polimorfizmust a TIMP2 génben (rs9900972), amely a non-vertebrális törési rizikót szignifikánsan befolyásolta. 3. A haplotípus elemzések során kimutattuk, hogy az FGFR1 négy SNP-ből konstruált haplotípusa szignifikánsan befolyásolja a lumbális csontdenzitást. 4. Először írtunk le olyan gén-gén interakciókat az öt új kandidáns gén polimorfizmusai között, amelyek szignifikánsan befolyásolták a csontdenzitást illetve a non-vertebrális törési rizikót. 5. Kutatómunkánkban

igazoltuk,

hogy

a

különböző

anyagi

minőségű

vertebroplasztikás töltőanyagok eltérő mértékben befolyásolják a nucleus pulposus

67

sejtek életképességét és osztódását, kiemelve, hogy a mindennapi klinikai gyakorlatban használt PMMA csontcement toxikus hatásával ellentétben a gipsz-alapú csontcement előnyösebbnek bizonyult méréseinkben. 6. A vertebroplasztikás csontcementek az izolált nucleus pulposus sejtek génexpressziós profilját is befolyásolták. Molekuláris biológiai eszközökkel végzett vizsgálataink vezettek ahhoz a klinikai szempontból jelentős megállapításhoz, miszerint a csigolya-augmentációs eljárást követő új kompressziós törések bekövetkeztének rizikóját fokozhatja az intervertebrális diszkuszba kerülő csontcement. 7. Megállapítottuk továbbá, hogy a gipsz alapú csontpótló grafton az egér preoszteoblaszt sejtek képesek megtapadni, osztódni és mátrixot termelni. 8. Először írtuk le, hogy a gipszen tenyésztett oszteoblasztok differenciálódása a csontgyógyulás irányába mutat, ami molekuláris biológiai bizonyítékot szolgáltat a gipsz alapú szintetikus csontpótló graftok klinikai alkalmazásának indikációjához. Az előnyös biológiai változások kapcsolatban vannak a gipsz speciális kristályszerkezetével és magas felületi Ca2+- koncentrációjával.

68

8. Össszefoglalás Az oszteoporózis népbetegség, melynek kialakulásában az életmódi faktorok mellett örökletes, genetikai tényezők is szerepet játszanak. Régóta bizonyított tény, hogy a csúcscsonttömeg 60-80%-ban genetikailag determinált de a folyamatra ható gének pontos szerepét – az 1980-as évektől folyó intenzív kutatások ellenére – még nem ismerjük. Kutatómunkánk során megvizsgáltuk, hogy egy ortológ (gímszarvas) modellben korábban azonosított öt új kandidáns gén – az alkalikus foszfatáz (ALPL), a zsírsav kötő protein-3 (FABP3), a fibroblaszt növekedési faktor receptor-1 (FGFR1), a mátrix metalloproteináz-2 (MMP2), és a metalloproteináz szöveti inhibítor-2 (TIMP2) – allelikus variánsainak van-e hatása a csontdenzitásra és a törési rizikóra. Vizsgálatuk továbbá, hogy a csontritkulás leggyakoribb törési szövődményének – a kompressziós csigolyatöréseknek – minimál invazív kezelésekor gyakran észlelt szövődmény, az intradiszkális cementcsorgás, milyen következményekkel járhat a porckorong biológiájára nézve. Kutatómunkánkban a gipsz szintetikus csontpótló graftként történő alkalmazásának molekuláris biológiai oldalát is körbejártuk. Háromszázhatvan posztmenopauzás nőt vontunk be genomikai vizsgálatunkba és az öt új kandidáns gén 24 egypontos nukleotid polimorfizmusának (SNP) hatását vizsgálatuk a BMD-re és a törési rizikóra. Robosztus statisztikai módszereket alkalmazva haplotípuselemzéseket és gén-gén interakciós analíziseket is végeztünk. Az in vitro vizsgálatokhoz izolált humán nucleus pulposus sejteket és egér preoszteoblaszt kultúrákat használtunk, amelyeket a különböző szintetikus csontpótló anyagokkal kezelve mértük a sejtek életképességét és génexpressziós profilját. Az új kandidáns génben vizsgált egyedi SNP-k közül az FGFR1-ben található rs6996321 szignifikánsan befolyásolta a lumbális BMD-t, a FABP3 promóter régiójában

fekvő

rs10914367

polimorfizmus

a

femur

csontdenzitással

volt

összefüggésben, míg a az rs9900912 TIMP2 polimorfizmus a non-vertebrális törési rizikót befolyásolta vizsgálatunkban. Szignifikáns összefüggést találtunk az FGFR1 haplotípusa és a lumbális csontdenzitás között, és négy, a fenotípusokat befolyásoló gén-gén interakciót azonosítottunk mintánkban. Leírtuk, hogy a porckorongsejtekre a mindennapi gyakorlatban használt polimetil-metakrilát csontcement káros sejtélettani hatással bír, míg a kísérleti stádiumban lévő hidroxi-apatit és gipsz alapú cementek

69

biológiailag

megfelelőbbnek

bizonyultak.

A

gipsz

előnyösen

befolyásolta

vizsgálatunkban a csontsejtek osztódási és differenciálódási jellemzőit, míg a polimetilmetakrilát toxikusnak bizonyult a csontsejtekre nézve. Kutatómunkánk

során

új,

a

csontritkulás

folyamatában

szignifikáns

jelentőséggel bíró kandidáns géneket illetve polimorfizmusokat azonosítottunk. Kimutattuk továbbá, hogy a csigolya-augmentációs eljárások során gyakran előforduló intradiszkális

cementcsorgás

növelheti

a

beavatkozás

után

előforduló

új

csigolyakompressziók kockázatát, ezért a cementcsorgás elkerülését célzó műtéti technikák, illetve biológiailag előnyösebb cementek kifejlesztése és alkalmazása volna szükséges. Bebizonyítottuk, hogy a gipsz csontpótló graftként való alkalmazása élettani szempontból megalapozott, mivel a gipsz esetén a csontsejtek az újcsontképződés irányába differenciálódnak, ami valószínűleg a gipsz magas kalciumtartalmával és speciális kristályszerkezetével magyarázható.

70

9. Irodalomjegyzék 1.

Dennison E, Cole Z, Cooper C (2005) Diagnosis and epidemiology of osteoporosis. Curr Opin Rheumatol 17: 456-461.

2.

Dennison E, Mohamed MA, Cooper C (2006) Epidemiology of osteoporosis. Rheum Dis Clin North Am 32: 617-629.

3.

Lane NE (2006) Epidemiology, etiology, and diagnosis of osteoporosis. Am J Obstet Gynecol 194: S3-11.

4.

Lau EM (2001) Epidemiology of osteoporosis. Best Pract Res Clin Rheumatol 15: 335-344.

5.

Poor G, Kiss C, Szilagyi M, Mituszova M, O'Neill TW, Felsenberg D, Silman AJ (1997) [Prevalence of vertebral deformity in Hungary: the European Vertebral Osteoporosis Study]. Orv Hetil 138: 2647-2652.

6.

Szepesi A, Salamon A, Kazar G (1991) [Incidence of fractures of the proximal femur and the distal end of the forearm (results of a Vas County survey compared to international data)]. Magy Traumatol Orthop Helyreallito Seb 34: 201-207.

7.

Somogyi P, Bossányi A, Kricsfalusy M, Schreiterhofer L, Rápolthy I, Udvardy Cs, Horváth Cs (2000) Az osteoporosis eredetű csonttörések számának becslése Magyarországon. Ca és Csont 3: 111-117.

8.

Somogyi P (2006) Az osteoporosis epidemiológiája. In: Lakatos P, Takács I (szerk.) Metabolikus csontbetegségek. Medintel Könyvkiadó, Budapest, 2006: 147-153.

9.

Kado DM, Browner WS, Palermo L, Nevitt MC, Genant HK, Cummings SR (1999) Vertebral fractures and mortality in older women: a prospective study. Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch Intern Med 159: 12151220.

10.

Johnell O, Kanis JA, Oden A, Sernbo I, Redlund-Johnell I, Petterson C, De Laet C, Jonsson B (2004) Mortality after osteoporotic fractures. Osteoporos Int 15: 38-42.

71

11.

Kazar G, Cserhati P, Melly A, Manninger J, Kadas I (1997) [Five-year follow up of patients with femoral neck fractures]. Orv Hetil 138: 3173-3177.

12.

Kanis JA, Borgstrom F, De Laet C, Johansson H, Johnell O, Jonsson B, Oden A, Zethraeus N, Pfleger B, Khaltaev N (2005) Assessment of fracture risk. Osteoporos Int 16: 581-589.

13.

National Osteoporosis Fundation (1998) Analysis of the effectiveness and cost of screening and treatment strategies for osteoporosis: a basis for development of practice guidelines. Osteoporos Int 8: 1-88.

14.

Sigurdsson G, Halldorsson BV, Styrkarsdottir U, Kristjansson K, Stefansson K (2008) Impact of genetics on low bone mass in adults. J Bone Miner Res 23: 1584-1590.

15.

Tse KY, Macias BR, Meyer RS, Hargens AR (2009) Heritability of bone density: regional and gender differences in monozygotic twins. J Orthop Res 27: 150-154.

16.

Videman T, Levalahti E, Battie MC, Simonen R, Vanninen E, Kaprio J (2007) Heritability of BMD of femoral neck and lumbar spine: a multivariate twin study of Finnish men. J Bone Miner Res 22: 1455-1462.

17.

Deng HW, Mahaney MC, Williams JT, Li J, Conway T, Davies KM, Li JL, Deng H, Recker RR (2002) Relevance of the genes for bone mass variation to susceptibility to osteoporotic fractures and its implications to gene search for complex human diseases. Genet Epidemiol 22: 12.

18.

Styrkarsdottir U, Halldorsson BV, Gretarsdottir S, Gudbjartsson DF, Walters GB, Ingvarsson T, Jonsdottir T, Saemundsdottir J, Center JR, Nguyen TV, Bagger Y, Gulcher JR, Eisman JA, Christiansen C, Sigurdsson G, Kong A, Thorsteinsdottir U, Stefansson K (2008) Multiple genetic loci for bone mineral density and fractures. N Engl J Med 358: 2355-2365.

19.

Huang QY, Recker RR, Deng HW (2003) Searching for osteoporosis genes in the post-genome era: progress and challenges. Osteoporos Int 14: 701.

20.

Liu YJ, Shen H, Xiao P, Xiong DH, Li LH, Recker RR, Deng HW (2006) Molecular genetic studies of gene identification for osteoporosis: a 2004 update. J Bone MinerRes 21: 1511.

72

21.

Favus MJ Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism American Society for bone and Mineral Research, Washington, 2006.

22.

Eriksen EF (1986) Normal and pathological remodeling of human trabecular bone: three dimensional reconstruction of the remodeling sequence in normals and in metabolic bone disease. Endocr Rev 7: 379-408.

23.

Caetano-Lopes J, Canhao H, Fonseca JE (2007) Osteoblasts and bone formation. Acta Reumatol Port 32: 103-110.

24.

Canalis E, Economides AN, Gazzerro E (2003) Bone morphogenetic proteins, their antagonists, and the skeleton. Endocr Rev 24: 218-235.

25.

Zamurovic N, Cappellen D, Rohner D, Susa M (2004) Coordinated activation of notch, Wnt, and transforming growth factor-beta signaling pathways in bone morphogenic protein 2-induced osteogenesis. Notch target gene Hey1 inhibits mineralization and Runx2 transcriptional activity. J Biol Chem 279: 3770437715.

26.

Zou L, Zou X, Li H, Mygind T, Zeng Y, Lu N, Bunger C (2006) Molecular mechanism of osteochondroprogenitor fate determination during bone formation. Advances Adv Exp Med Biol 585: 431-441.

27.

Day TF, Yang Y (2008) Wnt and hedgehog signaling pathways in bone development. J Bone Joint Surg 90 Suppl 1: 19-24.

28.

Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR (1999) Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284: 143-147.

29.

Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, Schwartz RE, Keene CD, OrtizGonzalez XR, Reyes M, Lenvik T, Lund T, Blackstad M, Du J, Aldrich S, Lisberg A, Low WC, Largaespada DA, Verfaillie CM (2002) Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 418: 41-49.

30.

Moerman EJ, Teng K, Lipschitz DA, Lecka-Czernik B (2004) Aging activates adipogenic and suppresses osteogenic programs in mesenchymal marrow stroma/stem cells: the role of PPAR-gamma2 transcription factor and TGFbeta/BMP signaling pathways. Aging Cell 3: 379.

73

31.

Corsi A, Xu T, Chen XD, Boyde A, Liang J, Mankani M, Sommer B, Iozzo RV, Eichstetter I, Robey PG, Bianco P, Young MF (2002) Phenotypic effects of biglycan deficiency are linked to collagen fibril abnormalities, are synergized by decorin deficiency, and mimic Ehlers-Danlos-like changes in bone and other connective tissues. J Bone Miner Res 17: 1180.

32.

Young MF, Bi Y, Ameye L, Chen XD (2002) Biglycan knockout mice: new models for musculoskeletal diseases. Glycoconj J 19: 257-262.

33.

Mochida Y, Parisuthiman D, Pornprasertsuk-Damrongsri S, Atsawasuwan P, Sricholpech M, Boskey AL, Yamauchi M (2009) Decorin modulates collagen matrix assembly and mineralization. Matrix Biol 28: 44-52.

34.

Yamada T, Kamiya N, Harada D, Takagi M (1999) Effects of transforming growth factor-beta1 on the gene expression of decorin, biglycan, and alkaline phosphatase in osteoblast precursor cells and more differentiated osteoblast cells. Histochemical J 31: 687-694.

35.

Takeuchi Y, Kodama Y, Matsumoto T (1994) Bone matrix decorin binds transforming growth factor-beta and enhances its bioactivity. J Biol Chem 269: 32634-32638.

36.

Sommer B, Bickel M, Hofstetter W, Wetterwald A (1996) Expression of matrix proteins during the development of mineralized tissues. Bone 19: 371-380.

37.

Kelm RJ, Jr., Swords NA, Orfeo T, Mann KG (1994) Osteonectin in matrix remodeling. A plasminogen-osteonectin-collagen complex. J Biol Chem 269: 30147-30153.

38.

Heinegard D, Andersson G, Reinholt FP (1995) Roles of osteopontin in bone remodeling. Ann N Y Acad Sci 760: 213-222.

39.

Sivakumar P, Czirok A, Rongish BJ, Divakara VP, Wang YP, Dallas SL (2006) New insights into extracellular matrix assembly and reorganization from dynamic imaging of extracellular matrix proteins in living osteoblasts. J Cell Sci 119: 1350-1360.

40.

de Oliveira PT, Zalzal SF, Irie K, Nanci A (2003) Early expression of bone matrix proteins in osteogenic cell cultures. J Histochem Cytochem 51: 633-641.

74

41.

Rammelt S, Neumann M, Hanisch U, Reinstorf A, Pompe W, Zwipp H, Biewener

A

(2005)

Osteocalcin

enhances

bone

remodeling

around

hydroxyapatite/collagen composites. J Biomed Mater Res A 73: 284-294. 42.

Chenu C, Colucci S, Grano M, Zigrino P, Barattolo R, Zambonin G, Baldini N, Vergnaud P, Delmas PD, Zallone AZ (1994) Osteocalcin induces chemotaxis, secretion of matrix proteins, and calcium-mediated intracellular signaling in human osteoclast-like cells. J Cell Biol 127: 1149-1158.

43.

Hadjidakis DJ, Androulakis, II (2006) Bone remodeling. Ann N Y Acad Sci 1092: 385-396.

44.

Bonewald LF (2002) Osteocytes: a proposed multifunctional bone cell. J Musculoskelet Neuronal Interact 2: 239-241.

45.

Bonewald LF (2007) Osteocytes as dynamic multifunctional cells. Ann N Y Acad Sci 1116: 281-290.

46.

Ehrlich PJ, Lanyon LE (2002) Mechanical strain and bone cell function: a review. Osteoporos Int 13: 688-700.

47.

Nomura S, Takano-Yamamoto T (2000) Molecular events caused by mechanical stress in bone. Matrix Biol 19: 91-96.

48.

Pitsillides AA, Rawlinson SC, Suswillo RF, Bourrin S, Zaman G, Lanyon LE (1995) Mechanical strain-induced NO production by bone cells: a possible role in adaptive bone (re)modeling? Faseb J 9: 1614-1622.

49.

Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL (2003) Osteoclast differentiation and activation. Nature 423: 337-342.

50.

Dougall WC, Glaccum M, Charrier K, Rohrbach K, Brasel K, De Smedt T, Daro E, Smith J, Tometsko ME, Maliszewski CR, Armstrong A, Shen V, Bain S, Cosman D, Anderson D, Morrissey PJ, Peschon JJ, Schuh J (1999) RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes Dev 13: 24122424.

51.

Grigoriadis AE, Wang ZQ, Cecchini MG, Hofstetter W, Felix R, Fleisch HA, Wagner EF (1994) c-Fos: a key regulator of osteoclast-macrophage lineage determination and bone remodeling. Science 266: 443-448.

52.

Yamashita T, Yao Z, Li F, Zhang Q, Badell IR, Schwarz EM, Takeshita S, Wagner EF, Noda M, Matsuo K, Xing L, Boyce BF (2007) NF-kappaB p50 and

75

p52 regulate receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL) and tumor necrosis factor-induced osteoclast precursor differentiation by activating c-Fos and NFATc1. J Biol Chem 282: 18245-18253. 53.

Bord S, Horner A, Hembry RM, Reynolds JJ, Compston JE (1996) Production of collagenase by human osteoblasts and osteoclasts in vivo. Bone 19: 35-40.

54.

Sims NA, Gooi JH (2008) Bone remodeling: Multiple cellular interactions required for coupling of bone formation and resorption. 19: 444-451.

55.

Matsuo K, Irie N (2008) Osteoclast-osteoblast communication. Arch Biochem Biophys 473: 201-209.

56.

Stains JP, Civitelli R (2005) Cell-to-cell interactions in bone. Biochem Biophys Res Commun 328: 721-727.

57.

Rauner M, Sipos W, Pietschmann P (2007) Osteoimmunology. Int Arch Allergy Immunol 143: 31-48.

58.

Lorenzo J, Horowitz M, Choi Y (2008) Osteoimmunology: interactions of the bone and immune system. Endocr Rev 29: 403-440.

59.

Yasuda H, Shima N, Nakagawa N, Yamaguchi K, Kinosaki M, Mochizuki S, Tomoyasu A, Yano K, Goto M, Murakami A, Tsuda E, Morinaga T, Higashio K, Udagawa N, Takahashi N, Suda T (1998) Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 3597-3602.

60.

Yasuda H, Shima N, Nakagawa N, Yamaguchi K, Kinosaki M, Goto M, Mochizuki SI, Tsuda E, Morinaga T, Udagawa N, Takahashi N, Suda T, Higashio K (1999) A novel molecular mechanism modulating osteoclast differentiation and function. Bone 25: 109-113.

61.

Nakagawa N, Kinosaki M, Yamaguchi K, Shima N, Yasuda H, Yano K, Morinaga T, Higashio K (1998) RANK is the essential signaling receptor for osteoclast differentiation factor in osteoclastogenesis. Biochem Biophys Res Commun 253: 395-400.

62.

Simonet WS, Lacey DL, Dunstan CR, Kelley M, Chang MS, Luthy R, Nguyen HQ, Wooden S, Bennett L, Boone T, Shimamoto G, DeRose M, Elliott R, Colombero A, Tan HL, Trail G, Sullivan J, Davy E, Bucay N, Renshaw-Gegg L, Hughes TM, Hill D, Pattison W, Campbell P, Sander S, Van G, Tarpley J, Derby

76

P, Lee R, Boyle WJ (1997) Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density. Cell 89: 309-319. 63.

Burgess TL, Qian Y, Kaufman S, Ring BD, Van G, Capparelli C, Kelley M, Hsu H, Boyle WJ, Dunstan CR, Hu S, Lacey DL (1999) The ligand for osteoprotegerin (OPGL) directly activates mature osteoclasts. J Cell Biol 145: 527-538.

64.

Hofbauer LC, Khosla S, Dunstan CR, Lacey DL, Boyle WJ, Riggs BL (2000) The roles of osteoprotegerin and osteoprotegerin ligand in the paracrine regulation of bone resorption. J Bone Miner Res 15: 2-12.

65.

Aubin JE, Bonnelye E (2000) Osteoprotegerin and its ligand: a new paradigm for regulation of osteoclastogenesis and bone resorption. Osteoporos Int 11: 905913.

66.

Grimaud E, Soubigou L, Couillaud S, Coipeau P, Moreau A, Passuti N, Gouin F, Redini F, Heymann D (2003) Receptor activator of nuclear factor kappaB ligand (RANKL)/osteoprotegerin (OPG) ratio is increased in severe osteolysis. Am J Pathol 163: 2021-2031.

67.

Martin TJ, Romas E, Gillespie MT (1998) Interleukins in the control of osteoclast differentiation. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 8: 107-123.

68.

Manolagas SC (1995) Role of cytokines in bone resorption. Bone 17: 63S-67S.

69.

Rozen N, Ish-Shalom S, Rachmiel A, Stein H, Lewinson D (2000) Interleukin-6 modulates trabecular and endochondral bone turnover in the nude mouse by stimulating osteoclast differentiation. Bone 26: 469-474.

70.

Kwan Tat S, Padrines M, Theoleyre S, Heymann D, Fortun Y (2004) IL-6, RANKL, TNF-alpha/IL-1: interrelations in bone resorption pathophysiology. Cytokine Growth Factor Rev 15: 49-60.

71.

Romas E, Martin TJ (1997) Cytokines in the pathogenesis of osteoporosis. Osteoporos Int 7 Suppl 3: S47-53.

72.

Kimble RB, Vannice JL, Bloedow DC, Thompson RC, Hopfer W, Kung VT, Brownfield C, Pacifici R (1994) Interleukin-1 receptor antagonist decreases bone loss and bone resorption in ovariectomized rats. J Clin Invest 93: 19591967.

77

73.

Sims NA, Jenkins BJ, Nakamura A, Quinn JM, Li R, Gillespie MT, Ernst M, Robb L, Martin TJ (2005) Interleukin-11 receptor signaling is required for normal bone remodeling. J Bone Miner Res 20: 1093-1102.

74.

Feng X (2005) Regulatory roles and molecular signaling of TNF family members in osteoclasts. Gene 350: 1-13.

75.

Hirayama T, Danks L, Sabokbar A, Athanasou NA (2002) Osteoclast formation and activity in the pathogenesis of osteoporosis in rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford) 41: 1232-1239.

76.

Weitzmann MN, Pacifici R (2005) The role of T lymphocytes in bone metabolism. Immunol Rev 208: 154-168.

77.

Szulc P, Munoz F, Marchand F, Chapuy MC, Delmas PD (2003) Role of vitamin D and parathyroid hormone in the regulation of bone turnover and bone mass in men: the MINOS study. Calcif Tissue Int 73: 520-530.

78.

Masiukiewicz US, Insogna KL (1998) The role of parathyroid hormone in the pathogenesis, prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Aging (Milano) 10: 232-239.

79.

Ahmad AM, Hopkins MT, Fraser WD, Ooi CG, Durham BH, Vora JP (2003) Parathyroid hormone secretory pattern, circulating activity, and effect on bone turnover in adult growth hormone deficiency. Bone 32: 170-179.

80.

Baldock PA, Thomas GP, Hodge JM, Baker SU, Dressel U, O'Loughlin PD, Nicholson GC, Briffa KH, Eisman JA, Gardiner EM (2006) Vitamin D action and regulation of bone remodeling: suppression of osteoclastogenesis by the mature osteoblast. J Bone Miner Res 21: 1618-1626.

81.

Ikeda K, Ogata E (2000) Modulation of bone remodeling by active vitamin D: its role in the treatment of osteoporosis. Mech Aging Dev 116: 103-111.

82.

Inzerillo AM, Zaidi M, Huang CL (2002) Calcitonin: the other thyroid hormone. Thyroid 12: 791-798.

83.

Pun KK, Chan LW (1989) Analgesic effect of intranasal salmon calcitonin in the treatment of osteoporotic vertebral fractures. Clin Ther 11: 205-209.

84.

Seeman E (2002) Pathogenesis of bone fragility in women and men. Lancet 359: 1841-1850.

78

85.

de Vernejoul MC (1996) Dynamics of bone remodelling: biochemical and pathophysiological basis. Eur J Clin Chem Clin Biochem 34: 729-734.

86.

Bjarnason NH, Hassager C, Christiansen C (1998) Postmenopausal bone remodelling and hormone replacement. Climacteric 1: 72-79.

87.

Balasch J (2003) Sex steroids and bone: current perspectives. Hum Reprod Update 9: 207-222.

88.

Monson JP, Drake WM, Carroll PV, Weaver JU, Rodriguez-Arnao J, Savage MO (2002) Influence of growth hormone on accretion of bone mass. Horm Res 58 Suppl 1: 52-56.

89.

Bassett JH, Williams GR (2003) The molecular actions of thyroid hormone in bone. Trends Endocrinol Metab 14: 356-364.

90.

Rackoff PJ, Rosen CJ (1998) Pathogenesis and treatment of glucocorticoidinduced osteoporosis. Drugs Aging 12: 477-484.

91.

Swanson C, Lorentzon M, Conaway HH, Lerner UH (2006) Glucocorticoid regulation of osteoclast differentiation and expression of receptor activator of nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) ligand, osteoprotegerin, and receptor activator of NF-kappaB in mouse calvarial bones. Endocrinology 147: 36133622.

92.

Xiong DH, Shen H, Zhao LJ, Xiao P, Yang TL, Guo Y, Wang W, Guo YF, Liu YJ, Recker RR, Deng HW (2006) Robust and comprehensive analysis of 20 osteoporosis

candidate

genes

by

very

high-density

single-nucleotide

polymorphism screen among 405 white nuclear families identified significant association and gene-gene interaction. J Bone Miner Res 21: 1678. 93.

Ezura Y, Nakajima T, Urano T, Sudo Y, Kajita M, Yoshida H, Suzuki T, Hosoi T, Inoue S, Shiraki M, Emi M (2007) Association of a single-nucleotide variation (A1330V) in the low-density lipoprotein receptor-related protein 5 gene (LRP5) with bone mineral density in adult Japanese women. Bone 40: 997.

94.

Lau HH, Ng MY, Cheung WM, Paterson AD, Sham PC, Luk KD, Chan V, Kung AW (2006) Assessment of linkage and association of 13 genetic loci with bone mineral density. J Bone Miner Metab 24: 226.

95.

Xiong DH, Lei SF, Yang F, Wang L, Peng YM, Wang W, Recker RR, Deng HW (2007) Low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (LRP5) gene

79

polymorphisms are associated with bone mass in both Chinese and whites. J Bone Miner Res 22: 385. 96.

Lee YH, Woo JH, Choi SJ, Ji JD, Song GG (2009) Association between the A1330V polymorphism of the low-density lipoprotein receptor-related protein 5 gene and bone mineral density: a meta-analysis. Rheumatol Int 29: 539-44.

97.

Tran BN, Nguyen ND, Eisman JA, Nguyen TV (2008) Association between LRP5 polymorphism and bone mineral density: a Bayesian meta-analysis. BMC Med Genet 9: 55.

98.

Grundberg E, Lau EM, Lorentzson M, Karlsson M, Holmberg A, Groop L, Mellstrom D, Orwoll E, Mallmin H, Ohlsson C, Ljunggren O, Akesson K (2008) Large-scale association study between two coding LRP5 gene polymorphisms and bone phenotypes and fractures in men. Osteoporos Int 19: 829-837.

99.

Bustamante M, Nogues X, Enjuanes A, Elosua R, Garcia-Giralt N, Perez-Edo L, Caceres E, Carreras R, Mellibovsky L, Balcells S, Diez-Perez A, Grinberg D (2007) COL1A1, ESR1, VDR and TGFB1 polymorphisms and haplotypes in relation to BMD in Spanish postmenopausal women. Osteoporos Int 18: 235.

100.

Yang TL, Shen H, Xiong DH, Xiao P, Guo Y, Guo YF, Liu YZ, Recker RR, Deng HW (2007) Epistatic interactions between genomic regions containing the COL1A1 gene and genes regulating osteoclast differentiation may influence femoral neck bone mineral density. Ann Hum Genet 71: 152-159.

101.

Mann V, Ralston SH (2003) Meta-analysis of COL1A1 Sp1 polymorphism in relation to bone mineral density and osteoporotic fracture. Bone 32: 711-717.

102.

Ralston SH, Uitterlinden AG, Brandi ML, Balcells S, Langdahl BL, Lips P, Lorenc R, Obermayer-Pietsch B, Scollen S, Bustamante M, Husted LB, Carey AH, Diez-Perez A, Dunning AM, Falchetti A, Karczmarewicz E, Kruk M, van Leeuwen JP, van Meurs JB, Mangion J, McGuigan FE, Mellibovsky L, del Monte F, Pols HA, Reeve J, Reid DM, Renner W, Rivadeneira F, van Schoor NM, Sherlock RE, Ioannidis JP (2006) Large-scale evidence for the effect of the COLIA1 Sp1 polymorphism on osteoporosis outcomes: the GENOMOS study. PLoS Med 3: e90.

80

103.

Lau HH, Ho AY, Luk KD, Kung AW (2004) Transforming growth factor-beta1 gene polymorphisms and bone turnover, bone mineral density and fracture risk in southern Chinese women. Calcif Tissue Int 74: 516-521.

104.

Langdahl BL, Carstens M, Stenkjaer L, Eriksen EF (2003) Polymorphisms in the transforming growth factor beta 1 gene and osteoporosis. Bone 32:297-310

105.

Medici M, van Meurs JB, Rivadeneira F, Zhao H, Arp PP, Hofman A, Pols HA, Uitterlinden AG (2006) BMP-2 gene polymorphisms and osteoporosis: the Rotterdam Study. J Bone Miner Res 21: 845-854.

106.

Semprini S, Mango R, Brancati F, Dallapiccola B, Becherini L, Novelli G, De Lorenzo A, Brandi ML, Gennari L (2000) Absence of correlation between BMP4 polymorphism and postmenopausal osteoporosis in Italian women. Calcif Tissue Int 67: 93-94.

107.

Fang Y, Rivadeneira F, van Meurs JB, Pols HA, Ioannidis JP, Uitterlinden AG (2006) Vitamin D receptor gene BsmI and TaqI polymorphisms and fracture risk: a meta-analysis. Bone 39: 938-945.

108.

Thakkinstian A, D'Este C, Eisman J, Nguyen T, Attia J (2004) Meta-analysis of molecular association studies: vitamin D receptor gene polymorphisms and BMD as a case study. J Bone Miner Res 19: 419-428.

109.

Hsu YH, Niu T, Terwedow HA, Xu X, Feng Y, Li Z, Brain JD, Rosen CJ, Laird N, Xu X (2006) Variation in genes involved in the RANKL/RANK/OPG bone remodeling pathway are associated with bone mineral density at different skeletal sites in men. Hum Genet 118: 568.

110.

Mencej S, Albagha OM, Prezelj J, Kocjan T, Marc J (2008) Tumour necrosis factor superfamily member 11 gene promoter polymorphisms modulate promoter activity and influence bone mineral density in postmenopausal women with osteoporosis. J Mol Endocrinol 40: 273-279.

111.

Kim JG, Kim JH, Kim JY, Ku SY, Jee BC, Suh CS, Kim SH, Choi YM (2007) Association between osteoprotegerin (OPG), receptor activator of nuclear factorkappaB (RANK), and RANK ligand (RANKL) gene polymorphisms and circulating OPG, soluble RANKL levels, and bone mineral density in Korean postmenopausal women. Menopause 14: 913-918.

81

112.

Dvornyk V, Liu XH, Shen H, Lei SF, Zhao LJ, Huang QR, Qin YJ, Jiang DK, Long JR, Zhang YY, Gong G, Recker RR, Deng HW (2003) Differentiation of Caucasians and Chinese at bone mass candidate genes: implication for ethnic difference of bone mass. Ann Hum Genet 67: 216.

113.

Ioannidis JP, Ralston SH, Bennett ST, Brandi ML, Grinberg D, Karassa FB, Langdahl B, van Meurs JB, Mosekilde L, Scollen S, Albagha OM, Bustamante M, Carey AH, Dunning AM, Enjuanes A, van Leeuwen JP, Mavilia C, Masi L, McGuigan FE, Nogues X, Pols HA, Reid DM, Schuit SC, Sherlock RE, Uitterlinden

AG

(2004)

Differential

genetic

effects

of

ESR1

gene

polymorphisms on osteoporosis outcomes. Jama 292: 2105-2114. 114.

L K (1990) Horns, Pronghorns, and Antlers. Evolution, Morphology, Physiology, and Social Significance. George A. Bubenik and Anthony B. Bubenik, Eds. Springer-Verlag, New York, 1990. xii, 562 pp., illus. $89. Science 250: 1458.

115.

Goss RJ (1995) Future directions in antler research. Anat Rec 241: 291-302.

116.

Rucklidge GJ, Milne G, Bos KJ, Farquharson C, Robins SP (1997) Deer antler does not represent a typical endochondral growth system: immunoidentification of collagen type X but little collagen type II in growing antler tissue. Comp Biochem Physiol 118: 303-308.

117.

Borsy A, Podani J, Steger V, Balla B, Horvath A, Kosa JP, Gyurjan I, Jr., Molnar A, Szabolcsi Z, Szabo L, Jako E, Zomborszky Z, Nagy J, Semsey S, Vellai T, Lakatos P, Orosz L (2009) Identifying novel genes involved in both deer physiological and human pathological osteoporosis. Mol Genet Genomics 281: 301-313.

118.

Balla B, Kosa JP, Kiss J, Borsy A, Podani J, Takacs I, Lazary A, Nagy Z, Bacsi K, Speer G, Orosz L, Lakatos P (2008) Different gene expression patterns in the bone tissue of aging postmenopausal osteoporotic and non-osteoporotic women. Calcif Tissue Int 82: 12-26.

119.

Kosa JP, Balla B, Kiss J, Borsy A, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Speer G, Orosz L, Lakatos P (2009) Effect of menopause on gene expression pattern in bone tissue of non-osteoporotic women. Menopause 16: 367-377.

82

120.

(2002) Incidence of vertebral fracture in europe: results from the European Prospective Osteoporosis Study (EPOS). J Bone Miner Res 17: 716.

121.

Galibert P, Deramond H, Rosat P, Le Gars D (1987) Preliminary note on the treatment of vertebral angioma by percutaneous acrylic vertebroplasty. NeuroChirurgie 33: 166.

122.

Phillips FM (2003) Minimally invasive treatments of osteoporotic vertebral compression fractures. Spine 28: S45.

123.

Lewis G (2007) Percutaneous vertebroplasty and kyphoplasty for the standalone augmentation of osteoporosis-induced vertebral compression fractures: Present status and future directions. J Biomed Mater Res B 81: 371-386.

124.

Phillips FM, Todd Wetzel F, Lieberman I, Campbell-Hupp M (2002) An in vivo comparison of the potential for extravertebral cement leak after vertebroplasty and kyphoplasty. Spine 27: 2173.

125.

Padovani B, Kasriel O, Brunner P, Peretti-Viton P (1999) Pulmonary embolism caused by acrylic cement: a rare complication of percutaneous vertebroplasty. Am J Neuroradiol 20: 375.

126.

Ratliff J, Nguyen T, Heiss J (2001) Root and spinal cord compression from methylmethacrylate vertebroplasty. Spine 26: E300.

127.

Harrington

KD

(2001)

Major

neurological

complications

following

percutaneous vertebroplasty with polymethylmethacrylate : a case report. J Bone Joint Surg Am 83-A: 1070. 128.

Hulme PA, Krebs J, Ferguson SJ, Berlemann U (2006) Vertebroplasty and kyphoplasty: a systematic review of 69 clinical studies. Spine 31: 1983.

129.

Mirovsky Y, Anekstein Y, Shalmon E, Blankstein A, Peer A (2006) Intradiscal cement leak following percutaneous vertebroplasty. Spine 31: 1120.

130.

Ikeuchi M, Yamamoto H, Shibata T, Otani M (2001) Mechanical augmentation of the vertebral body by calcium phosphate cement injection. J Orthop Sci 6: 39.

131.

Perry A, Mahar A, Massie J, Arrieta N, Garfin S, Kim C (2005) Biomechanical evaluation of kyphoplasty with calcium sulfate cement in a cadaveric osteoporotic vertebral compression fracture model. Spine J 5: 489.

132.

Wilke HJ, Mehnert U, Claes LE, Bierschneider MM, Jaksche H, Boszczyk BM (2006) Biomechanical evaluation of vertebroplasty and kyphoplasty with

83

polymethyl methacrylate or calcium phosphate cement under cyclic loading. Spine 31: 2934. 133.

Togawa D, Kovacic JJ, Bauer TW, Reinhardt MK, Brodke DS, Lieberman IH (2006) Radiographic and histologic findings of vertebral augmentation using polymethylmethacrylate in the primate spine: percutaneous vertebroplasty versus kyphoplasty. Spine 31: E4.

134.

Zambonin G, Colucci S, Cantatore F, Grano M (1998) Response of human osteoblasts to polymethylmetacrylate In vitro. Calcif Tissue Int 62: 362.

135.

Deramond H, Wright NT, Belkoff SM (1999) Temperature elevation caused by bone cement polymerization during vertebroplasty. Bone 25: 17S.

136.

Chiu R, Ma T, Smith RL, Goodman SB (2006) Polymethylmethacrylate particles inhibit osteoblastic differentiation of bone marrow osteoprogenitor cells. J Biomed Mater Res A 77: 850-856.

137.

Chiu

R,

Ma

T,

Smith

polymethylmethacrylate

RL,

Goodman

particle-induced

SB

(2007)

inhibition

of

Kinetics

of

osteoprogenitor

differentiation and proliferation. J Orthop Res 25: 450-457. 138.

Lazary A, Balla B, Kosa JP, Bacsi K, Nagy Z, Takacs I, Varga PP, Speer G, Lakatos P (2007) Effect of gypsum on proliferation and differentiation of MC3T3-E1 mouse osteoblastic cells. Biomaterials 28: 393.

139.

Lieberman IH, Togawa D, Kayanja MM (2005) Vertebroplasty and kyphoplasty: filler materials. Spine J 5: 305S.

140.

Giannoudis PV, Dinopoulos H, Tsiridis E (2005) Bone substitutes: an update. Injury 36 Suppl 3: S20-27.

141.

Van Heest A, Swiontkowski M (1999) Bone-graft substitutes. Lancet 353 Suppl 1: SI28-29.

142.

Sandhu HS, Grewal HS, Parvataneni H (1999) Bone grafting for spinal fusion. Orthop Clin North Am 30: 685-698.

143.

Arrington ED, Smith WJ, Chambers HG, Bucknell AL, Davino NA (1996) Complications of iliac crest bone graft harvesting. Clin Orthop Relat Res 329: 300-309

144.

Boyce T, Edwards J, Scarborough N (1999) Allograft bone. The influence of processing on safety and performance. Orthop Clin North Am 30: 571-581.

84

145.

Ehrler DM, Vaccaro AR (2000) The use of allograft bone in lumbar spine surgery. Clin Orthop Relat Res 371: 38-45.

146.

Tomford WW (1995) Transmission of disease through transplantation of musculoskeletal allografts. J Bone Joint Surg 77: 1742-1754.

147.

Khan SN, Tomin E, Lane JM (2000) Clinical applications of bone graft substitutes. Orthop Clin North Am 31: 389-398.

148.

Gazdag AR, Lane JM, Glaser D, Forster RA (1995) Alternatives to Autogenous Bone Graft: Efficacy and Indications. J Am Acad Orthop Surg 3: 1-8.

149.

Kinnunen I, Aitasalo K, Pollonen M, Varpula M (2000) Reconstruction of orbital floor fractures using bioactive glass. J Craniomaxillofac Surg 28: 229234.

150.

Peltola M, Suonpaa J, Aitasalo K, Maattanen H, Andersson O, Yli-Urpo A, Laippala P (2000) Experimental follow-up model for clinical frontal sinus obliteration with bioactive glass (S53P4). Acta Otolaryngol Suppl 543: 167-169.

151.

Peltier LF (1961) The use of plaster of Paris to fill defects in bone. Clin Orthop 21: 1.

152.

Kelly CM, Wilkins RM, Gitelis S, Hartjen C, Watson JT, Kim PT (2001) The use of a surgical grade calcium sulfate as a bone graft substitute: results of a multicenter trial. Clin Orthop Relat Res 382: 42-50.

153.

Borrelli J, Jr., Prickett WD, Ricci WM (2003) Treatment of nonunions and osseous defects with bone graft and calcium sulfate. Clin Orthop Relat Res 411: 245-254.

154.

Chen WJ, Tsai TT, Chen LH, Niu CC, Lai PL, Fu TS, McCarthy K (2005) The fusion rate of calcium sulfate with local autograft bone compared with autologous iliac bone graft for instrumented short-segment spinal fusion. Spine 30: 2293.

155.

Bell PA, Chaturvedi S, Gelfand CA, Huang CY, Kochersperger M, Kopla R, Modica F, Pohl M, Varde S, Zhao R, Zhao X, Boyce-Jacino MT, Yassen A (2002)

SNPstream

UHT:

ultra-high

throughput

SNP

genotyping

for

pharmacogenomics and drug discovery. Bio Techniques Suppl: 70-72, 74, 7677.

85

156.

Xie Q, Ratnasinghe LD, Hong H, Perkins R, Tang ZZ, Hu N, Taylor PR, Tong W (2005) Decision forest analysis of 61 single nucleotide polymorphisms in a case-control study of esophageal cancer; a novel method. BMC Bioinformatics 6 Suppl 2: S4.

157.

Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ (2005) Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics 21: 263.

158.

Foroud T, Ichikawa S, Koller D, Lai D, Curry L, Xuei X, Edenberg HJ, Hui S, Peacock M, Econs MJ (2008) Association studies of ALOX5 and bone mineral density in healthy adults. Osteoporos Int 19: 637-643.

159.

Curtin K, Wong J, Allen-Brady K, Camp NJ (2007) PedGenie: meta genetic association testing in mixed family and case-control designs. BMC Bioinformatics 8: 448.

160.

Gauderman WJ & Morrison JM. QUANTO 1.1: a computer program for power and

sample

size

calculations

for

geneticepidemiology

studies.

http://hydra.usc.edu/gxe, 2006. 161.

Schaid DJ, Rowland CM, Tines DE, Jacobson RM, Poland GA (2002) Score tests for association between traits and haplotypes when linkage phase is ambiguous. Am J Hum Genet 70: 425-434.

162.

Gonzalez JR, Armengol L, Sole X, Guino E, Mercader JM, Estivill X, Moreno V (2007) SNPassoc: an R package to perform whole genome association studies. Bioinformatics 23: 644.

163.

Messeguer X, Escudero R, Farre D, Nunez O, Martinez J, Alba MM (2002) PROMO: detection of known transcription regulatory elements using speciestailored searches. Bioinformatics 18: 333-334.

164.

Arden NK, Baker J, Hogg C, Baan K, Spector TD (1996) The heritability of bone mineral density, ultrasound of the calcaneus and hip axis length: a study of postmenopausal twins. J Bone Miner Res 11: 530-534.

165.

Arden NK, Spector TD (1997) Genetic influences on muscle strength, lean body mass, and bone mineral density: a twin study. J Bone Miner Res 12: 2076-2081.

166.

Hunter D, De Lange M, Snieder H, MacGregor AJ, Swaminathan R, Thakker RV, Spector TD (2001) Genetic contribution to bone metabolism, calcium

86

excretion, and vitamin D and parathyroid hormone regulation. J Bone Miner Res 16: 371-378. 167.

Kaprio J, Rimpela A, Winter T, Viken RJ, Rimpela M, Rose RJ (1995) Common genetic influences on BMI and age at menarche. Human biology; an international record of research 67: 739-753.

168.

Snieder H, MacGregor AJ, Spector TD (1998) Genes control the cessation of a woman's reproductive life: a twin study of hysterectomy and age at menopause. J Clin Endocrinol Metab 83: 1875-1880.

169.

Deng HW, Chen WM, Recker S, Stegman MR, Li JL, Davies KM, Zhou Y, Deng H, Heaney R, Recker RR (2000) Genetic determination of Colles' fracture and differential bone mass in women with and without Colles' fracture. J Bone Miner Res 15: 1243-1252.

170.

Andrew T, Antioniades L, Scurrah KJ, Macgregor AJ, Spector TD (2005) Risk of wrist fracture in women is heritable and is influenced by genes that are largely independent of those influencing BMD. J Bone Miner Res 20: 67-74.

171.

Michaelsson K, Melhus H, Ferm H, Ahlbom A, Pedersen NL (2005) Genetic liability to fractures in the elderly. Arch Intern Med 165: 1825-1830.

172.

Lei SF, Jiang H, Deng FY, Deng HW (2007) Searching for genes underlying susceptibility to osteoporotic fracture: current progress and future prospect. Osteoporos Int 18: 1157-1175.

173.

Aguirre JI, Leal ME, Rivera MF, Vanegas SM, Jorgensen M, Wronski TJ (2007) Effects of basic fibroblast growth factor and a prostaglandin E2 receptor subtype 4 agonist on osteoblastogenesis and adipogenesis in aged ovariectomized rats. J Bone Miner Res 22: 877.

174.

Kawaguchi H, Katagiri M, Chikazu D (2004) Osteoclastic bone resorption through receptor tyrosine kinase and extracellular signal-regulated kinase signaling in mature osteoclasts. Mod Rheumatol 14: 1.

175.

Woei Ng K, Speicher T, Dombrowski C, Helledie T, Haupt LM, Nurcombe V, Cool SM (2007) Osteogenic differentiation of murine embryonic stem cells is mediated by fibroblast growth factor receptors. Stem Cells Dev 16: 305.

87

176.

Vieira AR, Modesto A, Meira R, Barbosa AR, Lidral AC, Murray JC (2007) Interferon regulatory factor 6 (IRF6) and fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) contribute to human tooth agenesis. Am J Med Genet A 143: 538-545.

177.

Coussens AK, van Daal A (2005) Linkage disequilibrium analysis identifies an FGFR1 haplotype-tag SNP associated with normal variation in craniofacial shape. Genomics 85: 563.

178.

Chmurzynska A (2006) The multigene family of fatty acid-binding proteins (FABPs): function, structure and polymorphism. J Appl Genet 47: 39.

179.

Shin HD, Kim LH, Park BL, Jung HS, Cho YM, Moon MK, Lee HK, Park KS (2003) Polymorphisms in fatty acid-binding protein-3 (FABP3) - putative association with type 2 diabetes mellitus. Hum Mutat 22: 180.

180.

Xu Y, Mirmalek-Sani SH, Yang X, Zhang J, Oreffo RO (2006) The use of small interfering RNAs to inhibit adipocyte differentiation in human preadipocytes and fetal-femur-derived mesenchymal cells. Exp Cell Res 312: 1856-1864.

181.

Ichikawa S, Koller DL, Johnson ML, Lai D, Xuei X, Edenberg HJ, Klein RF, Orwoll ES, Hui SL, Foroud TM, Peacock M, Econs MJ (2006) Human ALOX12, but not ALOX15, is associated with BMD in white men and women. J Bone Miner Res 21: 556-564.

182.

Mullin BH, Spector TD, Curtis CC, Ong GN, Hart DJ, Hakim AJ, Worthy T, Wilson SG (2007) Polymorphisms in ALOX12, but not ALOX15, are significantly associated with BMD in postmenopausal women. Calcif Tissue Int 81: 10-17.

183.

Jadhav SB, Jain GK (2006) Statins and osteoporosis: new role for old drugs. The J Pharm Pharmacol 58: 3-18.

184.

Nelson-Dooley C, Della-Fera MA, Hamrick M, Baile CA (2005) Novel treatments for obesity and osteoporosis: targeting apoptotic pathways in adipocytes. Curr Med Chem 12: 2215.

185.

Nuttall

ME,

Gimble

osteoblastogenesis

and

JM

(2004)

adipogenesis

Controlling and

the

the

balance

consequent

between

therapeutic

implications. Curr Opin Pharmacol 4: 290-294. 186.

Page-McCaw A, Ewald AJ, Werb Z (2007) Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol 8: 221.

88

187.

Guo LJ, Luo XH, Wu XP, Shan PF, Zhang H, Cao XZ, Xie H, Liao EY (2006) Serum concentrations of MMP-1, MMP-2, and TIMP-1 in Chinese women: agerelated changes, and the relationships with bone biochemical markers, bone mineral density. Clin Chim Acta 371: 137.

188.

Martignetti JA, Aqeel AA, Sewairi WA, Boumah CE, Kambouris M, Mayouf SA, Sheth KV, Eid WA, Dowling O, Harris J, Glucksman MJ, Bahabri S, Meyer BF, Desnick RJ (2001) Mutation of the matrix metalloproteinase 2 gene (MMP2) causes a multicentric osteolysis and arthritis syndrome. Nat Genet 28: 261.

189.

Yamada Y, Ando F, Niino N, Shimokata H (2002) Association of a polymorphism of the matrix metalloproteinase-1 gene with bone mineral density. Matrix Biol 21: 389.

190.

Yamada Y, Ando F, Niino N, Shimokata H (2004) Association of a polymorphism of the matrix metalloproteinase-9 gene with bone mineral density in Japanese men. Metabolism 53: 135.

191.

Mendes O, Kim HT, Lungu G, Stoica G (2007) MMP2 role in breast cancer brain metastasis development and its regulation by TIMP2 and ERK1/2. Clin Exp Metastasis 24: 341-351.

192.

Wang K, Vishwanath P, Eichler GS, Al-Sebaei MO, Edgar CM, Einhorn TA, Smith TF, Gerstenfeld LC (2006) Analysis of fracture healing by large-scale transcriptional

profile

identified

temporal

relationships

between

metalloproteinase and ADAMTS mRNA expression. Matrix Biol 25: 271. 193.

Cao J, Venton L, Sakata T, Halloran BP (2003) Expression of RANKL and OPG correlates with age-related bone loss in male C57BL/6 mice. J Bone Miner Res 18: 270.

194.

Taillandier A, Lia-Baldini AS, Mouchard M, Robin B, Muller F, Simon-Bouy B, Serre JL, Bera-Louville A, Bonduelle M, Eckhardt J, Gaillard D, Myhre AG, Kortge-Jung S, Larget-Piet L, Malou E, Sillence D, Temple IK, Viot G, Mornet E (2001) Twelve novel mutations in the tissue-nonspecific alkaline phosphatase gene (ALPL) in patients with various forms of hypophosphatasia. Hum Mutat 18: 83.

89

195.

Goseki-Sone M, Sogabe N, Fukushi-Irie M, Mizoi L, Orimo H, Suzuki T, Nakamura H, Orimo H, Hosoi T (2005) Functional analysis of the single nucleotide

polymorphism (787T>C)

in

the

tissue-nonspecific

alkaline

phosphatase gene associated with BMD. J Bone Miner Res 20: 773-782. 196.

Baroud G, Vant C, Wilcox R (2006) Long-term effects of vertebroplasty: adjacent vertebral fractures. J Long Term Eff Med Implants 16: 265.

197.

Polikeit A, Nolte LP, Ferguson SJ (2003) The effect of cement augmentation on the load transfer in an osteoporotic functional spinal unit: finite-element analysis. Spine 28: 991.

198.

Rohlmann A, Zander T, Bergmann G (2006) Spinal loads after osteoporotic vertebral fractures treated by vertebroplasty or kyphoplasty. Eur Spine J 15: 1255-1264.

199.

Kayanja MM, Togawa D, Lieberman IH (2005) Biomechanical changes after the augmentation of experimental osteoporotic vertebral compression fractures in the cadaveric thoracic spine. Spine J 5: 55-63.

200.

Baroud G, Nemes J, Heini P, Steffen T (2003) Load shift of the intervertebral disc after a vertebroplasty: a finite-element study. Eur Spine J 12: 421-426.

201.

Chang CY, Teng MM, Wei CJ, Luo CB, Chang FC (2006) Percutaneous vertebroplasty for patients with osteoporosis: a one-year follow-up. Acta Radiol 47: 568.

202.

Grohs JG, Matzner M, Trieb K, Krepler P (2005) Minimal invasive stabilization of osteoporotic vertebral fractures: a prospective nonrandomized comparison of vertebroplasty and balloon kyphoplasty. J Spinal Disord Tech 18: 238.

203.

Trout AT, Kallmes DF (2006) Does vertebroplasty cause incident vertebral fractures? A review of available data. Am J Neuroradiol 27: 1397.

204.

Trout AT, Kallmes DF, Kaufmann TJ (2006) New fractures after vertebroplasty: adjacent fractures occur significantly sooner. Am J Neuroradiol 27: 217.

205.

Murakami H, Yoon ST, Attallah-Wasif ES, Tsai KJ, Fei Q, Hutton WC (2006) The expression of anabolic cytokines in intervertebral discs in age-related degeneration. Spine 31: 1770.

206.

Omlor GW, Lorenz H, Engelleiter K, Richter W, Carstens C, Kroeber MW, Guehring T (2006) Changes in gene expression and protein distribution at

90

different stages of mechanically induced disc degeneration--an in vivo study on the New Zealand white rabbit. J Orthop Res 24: 385. 207.

Zhang Y, An HS, Thonar EJ, Chubinskaya S, He TC, Phillips FM (2006) Comparative effects of bone morphogenetic proteins and sox9 overexpression on extracellular matrix metabolism of bovine nucleus pulposus cells. Spine 31: 2173.

208.

Anderson DG, Tannoury C (2005) Molecular pathogenic factors in symptomatic disc degeneration. Spine J 5: 260S.

209.

Urban JP, Roberts S (2003) Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Res Ther 5: 120.

210.

Cs-Szabo G, Ragasa-San Juan D, Turumella V, Masuda K, Thonar EJ, An HS (2002) Changes in mRNA and protein levels of proteoglycans of the anulus fibrosus and nucleus pulposus during intervertebral disc degeneration. Spine 27: 2212.

211.

Benneker LM, Heini PF, Anderson SE, Alini M, Ito K (2005) Correlation of radiographic and MRI parameters to morphological and biochemical assessment of intervertebral disc degeneration. Eur Spine J 14: 27.

212.

Maclean JJ, Lee CR, Alini M, Iatridis JC (2004) Anabolic and catabolic mRNA levels of the intervertebral disc vary with the magnitude and frequency of in vivo dynamic compression. J Orthop Res 22: 1193.

213.

Antoniou J, Steffen T, Nelson F, Winterbottom N, Hollander AP, Poole RA, Aebi M, Alini M (1996) The human lumbar intervertebral disc: evidence for changes in the biosynthesis and denaturation of the extracellular matrix with growth, maturation, ageing, and degeneration. J Clin Invest 98: 996.

214.

Neidlinger-Wilke C, Wurtz K, Urban JP, Borm W, Arand M, Ignatius A, Wilke HJ, Claes LE (2006) Regulation of gene expression in intervertebral disc cells by low and high hydrostatic pressure. Eur Spine J 15 Suppl 3: 372.

215.

Natarajan RN, Williams JR, Andersson GB (2006) Modeling changes in intervertebral disc mechanics with degeneration. J Bone Joint Surg Am 88 Suppl 2: 36.

91

216.

Lin EP, Ekholm S, Hiwatashi A, Westesson PL (2004) Vertebroplasty: cement leakage into the disc increases the risk of new fracture of adjacent vertebral body. Am J Neuroradiol 25: 175.

217.

Syed MI, Patel NA, Jan S, Harron MS, Morar K, Shaikh A (2005) Intradiskal extravasation with low-volume cement filling in percutaneous vertebroplasty. Am J Neuroradiol 26: 2397.

218.

Luo J, Skrzypiec DM, Pollintine P, Adams MA, Annesley-Williams DJ, Dolan P (2007) Mechanical efficacy of vertebroplasty: Influence of cement type, BMD, fracture severity, and disc degeneration. Bone 40: 1110-1119.

219.

Boyd AD, Jr., Goldberg VM, Miller LM, Malemud CJ (1984) Effects of polymethylmethacrylate on rabbit articular chondrocytes in monolayer culture. Clin Orthop 189: 279.

220.

Silver IA, Murrills RJ, Etherington DJ (1988) Microelectrode studies on the acid microenvironment beneath adherent macrophages and osteoclasts. Exp Cell Res 175: 266.

221.

Nakade O, Takahashi K, Takuma T, Aoki T, Kaku T (2001) Effect of extracellular calcium on the gene expression of bone morphogenetic protein-2 and -4 of normal human bone cells. J Bone Miner Metab 19: 13.

222.

Yamaguchi T, Chattopadhyay N, Kifor O, Butters RR, Jr., Sugimoto T, Brown EM (1998) Mouse osteoblastic cell line (MC3T3-E1) expresses extracellular calcium (Ca2+o)-sensing receptor and its agonists stimulate chemotaxis and proliferation of MC3T3-E1 cells. J Bone Miner Res 13: 1530.

223.

Yamauchi M, Yamaguchi T, Kaji H, Sugimoto T, Chihara K (2005) Involvement of calcium-sensing receptor in osteoblastic differentiation of mouse MC3T3-E1 cells. Am J Physiol Endocrinol Metab 288: E608.

224.

Obrant KJ, Ivaska KK, Gerdhem P, Alatalo SL, Pettersson K, Vaananen HK (2005) Biochemical markers of bone turnover are influenced by recently sustained fracture. Bone 36: 786.

225.

Veitch SW, Findlay SC, Hamer AJ, Blumsohn A, Eastell R, Ingle BM (2006) Changes in bone mass and bone turnover following tibial shaft fracture. Osteoporos Int 17: 364.

92

226.

Sidqui M, Collin P, Vitte C, Forest N (1995) Osteoblast adherence and resorption activity of isolated osteoclasts on calcium sulphate hemihydrate. Biomaterials 16: 1327.

227.

Winn SR, Hollinger JO (2000) An osteogenic cell culture system to evaluate the cytocompatibility of Osteoset, a calcium sulfate bone void filler. Biomaterials 21: 2413.

228.

Sowa H, Kaji H, Yamaguchi T, Sugimoto T, Chihara K (2002) Smad3 promotes alkaline phosphatase activity and mineralization of osteoblastic MC3T3-E1 cells. J Bone Miner Res 17: 1190.

229.

Balooch G, Balooch M, Nalla RK, Schilling S, Filvaroff EH, Marshall GW, Marshall SJ, Ritchie RO, Derynck R, Alliston T (2005) TGF-beta regulates the mechanical properties and composition of bone matrix. Proc Natl Acad Sci USA 102: 18813.

230.

Sugama R, Koike T, Imai Y, Nomura-Furuwatari C, Takaoka K (2006) Bone morphogenetic protein activities are enhanced by 3',5'-cyclic adenosine monophosphate through suppression of Smad6 expression in osteoprogenitor cells. Bone 38: 206.

231.

Heiner DE, Meyer MH, Frick SL, Kellam JF, Fiechtl J, Meyer RA, Jr. (2006) Gene expression during fracture healing in rats comparing intramedullary fixation to plate fixation by DNA microarray. J Orthop Trauma 20: 27.

232.

Rundle CH, Wang H, Yu H, Chadwick RB, Davis EI, Wergedal JE, Lau KH, Mohan S, Ryaby JT, Baylink DJ (2006) Microarray analysis of gene expression during the inflammation and endochondral bone formation stages of rat femur fracture repair. Bone 38: 521.

233.

Chiba S, Okada K, Lee K, Segre GV, Neer RM (2001) Molecular analysis of defect healing in rat diaphyseal bone. J Vet Med Sci 63: 603.

234.

Bucholz RW (2002) Nonallograft osteoconductive bone graft substitutes. Clin Orthop Relat Res 395: 44.

235.

Coetzee AS (1980) Regeneration of bone in the presence of calcium sulfate. Arch Otolaryngol 106: 405.

93

236.

Tay BK, Patel VV, Bradford DS (1999) Calcium sulfate- and calcium phosphate-based bone substitutes. Mimicry of the mineral phase of bone. Orthop Clin North Am 30: 615.

237.

Hadjipavlou AG, Simmons JW, Yang J, Nicodemus CL, Esch O, Simmons DJ (2000) Plaster of Paris as an osteoconductive material for interbody vertebral fusion in mature sheep. Spine 25:10

238.

Walsh WR, Morberg P, Yu Y, Yang JL, Haggard W, Sheath PC, Svehla M, Bruce WJ (2003) Response of a calcium sulfate bone graft substitute in a confined cancellous defect. Clin Orthop Relat Res 406: 228.

94

10. Saját publikációk jegyzéke A disszertáció témájához kapcsolódó publikációk: Lazáry Á, Kósa JP, Tóbiás B, Balla B, Bácsi B, , Nagy Zs, Takács I, Mező T, Speer G, Lakatos P (2008) Single nucleotide polymorphisms in new candidate genes are associated with bone mineral density and fracture risk, Eur J Endocrinol 159: 18796. (IF: 3,239) Lazáry Á, Speer G, Varga PP, Balla B, Bácsi B, Kósa JP, Nagy Zs, Takács I, Lakatos P (2008) The effect of vertebroplasty filler materials on viability and gene expression of human nucleus pulposus cells, J Orthop Res 26: 601-7. (IF: 2,437) Lazáry Á, Balla B, Kósa JP, Bácsi K, Nagy Zs, Takács I, Varga PP, Speer G, Lakatos P (2007) Effect of gypsum on proliferation and differentiation of MC3T3-E1 mouse osteoblastic cells, Biomaterials 28: 393-9. (IF: 6,262) Lazáry Á, Balla B, Bácsi K, Kósa JP, Nagy Zs, Takács I, Speer G, Varga PP, Lakatos P (2007) A szintetikus csontpótló graftok alkalmazásának összefoglalása. A gipsz szerepe

a

csontpótlásban:

molekuláris

biológiai

megközelítéssel,

saját

eredményeink alapján, Orv Hetil 148: 2427-2433. Balla B, Kósa JP, Kiss J, Borsy A, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Speer G, Orosz L, Lakatos P (2008) Different Gene Expression Patterns in the Bone Tissue of Aging Postmenopausal Osteoporotic and Non-osteoporotic Women, Calcif Tissue Int 82: 12-26. (IF: 2,435) Kosa JP, Balla B, Kiss J, Borsy A, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Speer G, Orosz L, Lakatos P (2009) Effect of menopause on gene expression pattern in bone tissue of non-osteoporotic women, Menopause 16: 367-377. (IF: 3,672)

95

A disszertáció témájához nem kapcsolódó publikációk: Varga PP, Bors IB, Lazary Á (2009) Sacral tumors and Management, Orthop Clin North Am 40: 105-123. (IF: 1,692) Lazary J, Lazary A, Gonda X, Benkő A, Molnár E, Juhász G, Bagdy G (2008): New evidence for the association of the serotonin transporter gene (SLC6A4) haplotypes, threatening life events and depressive phenotype, Biol Psychiatry 64: 498-504. (IF: 8,456) Bácsi K, Kósa JP, Lazáry A, Balla B, Horváth H, Kis A, Nagy Z, Takács I, Lakatos P, Speer G (2008) LCT 13910 C/T polymorphism, serum calcium, and bone mineral density in postmenopausal women. Osteoporos Int 20: 639-645. (IF: 3,893) Bacsi K, Hitre E, Kosa JP, Horvath H, Lazary A, Lakatos PL, Balla B, Budai B, Lakatos P, Speer G (2008) Effects of the lactase 13910 C/T and calcium-sensor receptor A986S G/T gene polymorphisms on the incidence and recurrence of colorectal cancer in Hungarian population, BMC Cancer 8:317 (IF: 2,71) Bácsi K, Borgulya G, Kósa JP, Lazáry Á, Balla B, Nagy Zs, Takács I, Speer G, Lakatos P (2007) CYP3A7*1 polymorphism, serum dehydroepiandosterone sulphate level and bone mineral density in postmenopausal women, Calcif Tissue Int 80:154159. (IF:2,435) Balla B, Kósa JP, Kiss J, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Speer G, Lakatos P: Transcriptional profiling of immune system-related genes in postmenopausal osteoporotic versus non-osteoporotic human bone tissue. Clin Immunol 131: 354-359 (IF:3,551) Bácsi K, Kósa JP, Lazáry Á, Horváth H, Balla B, Lakatos P, Speer G (2007) A dehidroepiandroszteron és dehidroepiandroszteron szulfát jelentősége a különböző kórállapotokban. Saját eredmények és irodalmi adatok összefoglalása, Orv Hetil 148: 651-7. Bácsi K, Kósa JP, Lazáry Á, Horváth H, Balla B, Lakatos P, Speer G (2007) A CYP3A7*1C-polimorfizmus

hatása

a

csont

ásványanyag-tartalmára

posztmenopauzás nőkben, Orv Hetil 148: 1273-80.

96

11. Köszönetnyilvánítás A Doktori értekezésemet nem tudtam volna elkészíteni, ha nem dolgozhatok egy olyan csapatban, amely mind szakmailag, mind munkakörülményeket tekintve, mind emberileg a legmagasabb színvonalat képviseli. A munkacsoportunk vezetéséért, a kutatáshoz elengedhetetlen feltételek megteremtéséért köszönet illeti Prof. Dr. Lakatos Pétert, akitől rengeteget tanultam a közös munka során. Szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Takács Istvánnak, hogy a PhDképzés és a fokozatszerzés során egyengette utamat, irányította kutatómunkámat és elismerte eredményeimet. Köszönetet szeretnék mondani Dr. Varga Péter Pálnak, az Országos Gerincgyógyászati Központ főigazgatójának, aki bizalmával kezdetek óta kitüntetve, mind tudományos partnerként, mind emberileg nagyon sokban segítette fejlődésemet. Mentoraim közé tartozik Dr. Speer Gábor és Kósa János is, akiknek tudományalapozó tevékenysége és folyamatosan inspiráló személyisége meghatározó volt sikeres kutatómunkámban. PhD hallgató kollegáimmal, Balla Bernadett-tel és Dr. Bácsi Krisztiánnal sikerült olyan csapatot alkotnunk, amiben egymás munkájának támogatása, kiegészítése dominált. Segítségüket köszönöm. Köszönettel tartozom a SE I. Belgyógyászati Klinikájának, és kiemelten a Klinikai Kutató és Izotópdiagnosztikai Laboratórium minden munkatársának, hogy befogadtak, és jó hangulatban, támogató közegben dolgozhattam. Családom mindenben kiállt mellettem a PhD-képzésem alatt, és folyamatos motivációt jelenttettek számomra szüleim és négy testvérem személye. Végül, de kiemelten szeretném megköszönni feleségemnek, Dr. Lazáry Juditnak azt, hogy velem volt és velem van. Nemcsak türelemmel viseltetett irányomban, de az elképzelhető legaktívabb figyelemmel és hévvel vívtuk meg tudományos csatáinkat, amelyek eredményét a közös közlemények is jelzik.

97