A BAKTÉRIUMOK AZONOSÍTÁSA: BIOKÉMIAI REAKCIÓK. Krizsán Gergely dr

A BAKTÉRIUMOK AZONOSÍTÁSA: BIOKÉMIAI REAKCIÓK

Krizsán Gergely dr.

A nitrogén-anyagcserén alapuló tesztek

Krizsán Gergely dr., 2011.

UREÁZ-REAKCIÓ    

  

Az urea (karbamid) lebontását katalizálja NH3-ra és CO2-ra A keletkező NH3 megnöveli a pH-t, ezzel a fenolvörös indikátor narancsvörös (semleges) színét lilára változtatja (lúgos kémhatás) Ureáz-negatív baktériumok esetén a narancsvörös szín sárgára változik a savtermelés következtében SH-enzim, ezért gátolható DTNB-vel, PCMB-vel és egyéb higanytartalmú vegyületekkel Fontos szerepe van a nitrogén-anyagcserében Gyengén pozitív Klebsiella spp. esetén Erősen pozitív Proteus fajoknál 

struvitkövek (MgNH4PO4) keletkezése!

+

-

U


Ureáz-reakciók A Helicobacter pylori is ureáz-pozitív

Negatív: E. coli

Gyengén pozitív: Klebsiella pneumoniae

Erősen pozitív: Proteus vulgaris


INDOL-REAKCIÓ 

A triptofanáz enzim kimutatására szolgál



Két részreakcióból áll: hidrolízis és dezaminálás



Sósav (HCl) jelenlétében az indol lila terméket képez a p-dimetil-amino-benzaldehiddel történő reakció során (Kovács-reagens/Ehrlich-reagens)



Pozitív reakció: a felső fázis lila gyűrűként jelenik meg



Negatív reakció: a felső fázis sárga marad


Néhány képlet…

Triptofán

Indol

Piruvát Triptofán

Indol NH3 (g) + HCl (g) → NH4Cl (s)

A Proteus fajok indol-reakciója során fehér füst keletkezik. Krizsán Gergely dr., 2011.

Indol-reakciók (kémcsőben és szűrőpapíron)

Negatív: Klebsiella pneumoniae

Pozitív: E. coli Krizsán Gergely dr., 2011.

A légzési enzimek aktivitásán alapuló tesztek


KATALÁZ-REAKCIÓ 

A hemet tartalmazó kataláz enzim által katalizált reakción alapul



Az enzimnek igen jelentős szerepe van az oxidatív stressz elleni védelemben a H2O2 eliminálása révén



A kataláz és a hasonló protektív enzimek tipikusan aerob baktériumokban találhatók meg



A katalizált reakció: 2 H2O2 (aq) → 2 H2O (l) + O2 (g)



Gázbuborékok keletkezése jelzi a pozitív reakciót



Legfontosabb alkalmazás: Staphylococcus spp. (+) és Streptococcus spp. (-) elkülönítése


K1: Miért nem szabad ezt a tesztet véres agaron végrehajtani? V1: Mivel maga a táptalaj is rendelkezhet kataláz-aktivitással! (álpozitív reakció) K2: Miért nem szabad ezt a tesztet fémkaccsal kivitelezni? V2: Mivel bizonyos fémek hasonló reakciót adhatnak! (álpozitív reakció) Krizsán Gergely dr., 2011.

OXIDÁZ-TESZT 

Az oxidatív metabolizmus kulcsenzime, a citokróm-oxidáz kimutatására szolgál. Obligát anaerob baktériumokban nincs jelen.



A kimutatás p-fenilén-diamin reagenssel történő redoxreakción alapul: a reagens irreverzibilisen sötétkék/lila termékké alakul.



A reakció az alábbi baktériumokra pozitív:     

  

Pseudomonas spp. Neisseria spp. Haemophilus spp. (NB.: lassú reakció: >30 sec) Vibrio spp. Aeromonas spp. Plesiomonas spp. Campylobacter spp. Alcaligenes spp.


Kéntartalmú vegyületek anyagcseréjén alapuló tesztek


A H2S-TERMELÉS KIMUTATÁSA 

Bizonyos baktériumok különféle kéntartalmú molekulákból ill. ionokból (pl. szulfátok (SO42-), szulfitok (SO32-), tioszulfátok (S2O32-) vagy bizonyos aminosavak (pl. Cys, Met)) kénhidrogént (H2S) termelnek, amely záptojásszagú mérgező gáz.



A H2S általában sötétszínű csapadékokat képez fémionokkal, mint a Fe3+ (ferri) és az Pb2+ (plumbo), mindkét csapadék fekete (Fe2S3, PbS) FeCl3 ill. Fe2(SO4)3 tartalmú táptalajokat használunk a H2S-termelés detektálására





A fenti kémiai reakciókat a Módosított Russel-táptalaj, a TSI-politrop táptalaj és a bizmut-szulfit agar esetén alkalmazzuk.


A LEGFONTOSABB H2S-TERMELŐ BAKTÉRIUMOK 



Proteus spp.  Pr. vulgaris, Pr. mirabilis, Salmonella spp.

TSI = Triple Sugar Iron táptalaj Tartalmaz: + brillantcukor (laktóz, dextróz, szacharóz) + fenolvörös (sav-bázis indikátor) + vas(III)-só (pl. Fe2(SO4)3)

Nincs laktózfermentáció

H2Stermelés Glükózfermentáció


Szénhidrátok és szerves savak anyagcseréjén alapuló tesztek


LAKTÓZ-FERMENTÁCIÓ 

Az Enterobacteriaceae család felosztható laktóz-fermentáló (+) és lactózt nem fermentáló (-) baktériumokra.



A legfontosabb laktóz-pozitív baktériumok:    



E. coli Klebsiella spp. Enterobacter spp. Citrobacter spp.

A legfontosabb laktóz-negatív baktériumok:  

  

Salmonella spp. Shigella spp. Serratia spp. Proteus spp. Yersinia spp. Krizsán Gergely dr., 2011.

ONPG (β-galaktozidáz)-teszt I.   

 





ONPG = o-nitrofenil-β-D-galaktopiranozid Mikroorganizmusok laktóz fermentáló képességének detektálására használatos Igen hasznos az Enterobacteriaceae családba tartozó baktériumok osztályozásában Az ONPG a laktózhoz hasonló molekula A laktóz-fermentáló (+) baktériumokban megtalálható mind a β-galaktozidáz mind a laktóz-permeáz A késői laktóz-fermentáló (+) baktériumokban csak a β-galaktozidáz van jelen A laktózt nem fermentáló (-) baktériumokban egyik molekula sem található meg


ONPG (β-galaktozidáz)-teszt II.


EOZIN-METILÉNKÉK (EMK) AGAR 

A laktóz mellett két festéket tartalmaz: eozint és metilénkéket



A festékek gátolják a legtöbb Gram-pozitív baktérium növekedését (szelektivitás)



A baktériumok a laktóz-fermentálás alapján különíthetők el (differenciálás)



A laktóz-pozitív baktériumok sötétkék/lila telepeket képeznek 

A telepekben savtermelés következtében csökken a pH, ezért az eozin kicsapódik és a felszínén megköti a metilénkéket



A laktóz-negatív baktériumok színtelen vagy rózsaszín telepeket képeznek



Tartalmaz rajzásgátló detergenseket Krizsán Gergely dr., 2011.

Escherichia coli EMK-táptalajon


OXIDÁCIÓ-FERMENTÁCIÓ (OF)-TESZT 

A teszt annak eldöntésére szolgál, hogy a szerves molekulák lebontása oxidatív (aerob) vagy fermentatív (anaerob) metabolikus úton történik-e.



A táptalaj 1 % glükózt (vagy dextrózt) tartalmazó magas agar, amelyben jelen van brómtimolkék, egy sav-bázis indikátor, amely semleges pH-n fűzöld, savas pH-n sárga, míg lúgos közegben kék.



A steril OF-agar fűzöld (a semleges kémhatásnak megfelelően), savtermelés esetén a színe sárgára változik.


OF-próbák OF +/+: az egész táptalaj sárga (pl. E. coli) OF +/-: csak a táptalaj felső része sárga (nem fermentálók, pl. Pseudomonas spp.) OF -/-: az egész táptalaj fűzöld (biokémiai inaktivitás, pl. Acinetobacter spp.)

OF +/+

OF +/-

OF -/-

Ha a táptalaj felső része kék: alkalizáló mikroorganizmus van jelen (pl. Alcaligenes spp.)

Steril OF-agar Krizsán Gergely dr., 2011.

CITRÁT-FELHASZNÁLÁS 

Ammónium-sókat (pl. (NH4)2SO4) + nátrium-citrátot + brómtimolkék indikátort tartalmazó magas agar



Citrát-felhasználás esetén a savfogyasztás következtében megnő a pH



Az indikátor zöld színe kékre változik.



Néhány citrát-pozitív baktérium: 

KESC-csoport:    

Klebsiella spp. Enterobacter spp. Serratia spp. Citrobacter spp.

TCBS-táptalaj Vibrio spp. tenyésztésére C = citrát brómtimolkéket tartalmaz


Kölcsönhatások a baktériumok és a vér különféle komponensei között


A HEMOLÍZIS TÍPUSAI 

α: A haemoglobin részleges lebontása biliverdinné (zöld pigment), a haem-oxigenáz révén. Egyéb elnevezés: zöldítő hemolízis. 



β: A haemoglobin teljes lebontása színtelen termékké 



Nem a vörösvértestek részleges lebontását jelenti!

Definíciószerűen nem a vörösvértest teljes lebontását jelenti, bár ebben az esetben maga a vörösvértest is lebontásra kerül.

γ: Nincs hemolízis



CAMP-TESZT STREPTOCOCCUS AGALACTIAE AZONOSÍTÁSÁRA

CAMP Streptococcus agalactiae― Staphylococcus aureus|

CAMP = Christie, Atkins, Munch-Petersen Krizsán Gergely dr., 2011.

KOAGULÁZ-TESZTEK I.  

 

  

 



A koaguláz enzimeknek két típusa létezik: az exokoaguláz (szabad) és az endokoaguláz (kötött) Funkciójuk a baktériumsejt védelme a szervezet baktericid mechanizmusaitól fibrinburok kialakítása révén (“molekuláris mimikri”) Az exokoaguláz szekretált enzim, amely a fibrinogént fibrinné alakítja, ezzel lokálisan véralvadást idéz elő. Az endokoaguláz a S. aureus felszínén található, megköti a fibrinogént, ezzel befedi a baktériumot. Igen fontos teszt a Staphylococcus spp. elkülönítésében A Staphylococcus aureus pozitív Egyéb Staphylococcus spp. negatívok, ezért koaguláz-negatív Staphylococcus-oknak nevezzük őket (KNS/CNS) A leggyakoribb KNS-ok: S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus Néhány egyéb faj szintén adhat pozitív reakciót, pl. S. lugdunensis (clump-szerű faktor), S. intermedius, S. hyicus Ezek közül a S. lugdunensis a S. aureus-hoz hasonlóan súlyos endocarditist okozhat. Krizsán Gergely dr., 2011.

KOAGULÁZ-TESZTEK II.

+ -

Csőkoaguláz-teszt szekretált enzim (exo-koaguláz) fibrinogén→fibrin átalakulás

+

Clump-teszt S. aureus sejtek agglutinációja fibrinogénhez kapcsolással nem szekretált enzim (endo-koaguláz) NINCS fibrinogén→fibrin átalakulás

Fn

-

Fn

Latex particle

Gyorsteszt Latex-agglutináció fibrinogén + anti-protein A-antitest latex partikulumok felszínéhez rögzítve

SA Fn


A lipidek anyagcseréjén alapuló tesztek


LECITINÁZ- ÉS LIPÁZ-REAKCIÓ 

Lecitináz-reakció: a lecitinázt termelő baktériumok lebontják a lecitovitellin nevű lipoproteint, ennek következtében lipidek csapódnak ki a telepek körül a táptalajban



A teszt specifikus változata: Nagler-reakció (a Clostridium perfringens lecitináz-termelése specifikus antitoxinnal gátolható)



Lipáz-reakció: olajos, gyöngyházfényű telepek


API = AUTOMATED PROFILE IDENTIFICATION

Azonosítás plate-eken biokémiai reakciók révén, számítógép felhasználásával


A BAKTÉRIUMOK AZONOSÍTÁSA: BIOKÉMIAI REAKCIÓK. Krizsán Gergely dr

Recommend Documents