16
3 METODE
3.1
Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari hingga April 2012, dan
bertempat di Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler, Laboratorium Biorekayasa Lingkungan, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong, Bogor dan Laboratorium Analisis Kimia, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi, PUSPIPTEK Serpong, Tangerang.
3.2
Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan untuk ekspresi dan pemurnian enzim RNA
helikase meliputi bakteri Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS yang membawa gen NS3 RNA helikase virus hepatitis C dalam plasmid pET 21b (koleksi Andi Utama, Puslit Bioteknologi LIPI), media Luria Bertani (LB), akuades, ampisilin, isopropil β-D-thiogalaktopiranosidase (IPTG) 0,3 M; bufer B (Tris HCl 10 mM pH 8,5; NaCl 100 mM, dan Tween 20 0,25%), resin TALON, dan bufer elusi (400 mM imidazola dalam bufer B). Bahan-bahan yang digunakan untuk menganalisis bobot molekul protein RNA helikase meliputi akuabides; Tris-HCl 1,5 M pH 8,8; akrilamid 30%, sodium dedosil sulfat (SDS) 10%, TEMED, amonium persulfat (APS) 10%, comassie blue, dan loading dye. Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi dan pemurnian polisakarida dari mikroalga BTM 11 adalah isolat BTM 11 (koleksi Dwi Susilaningsih, Laboratorium Biorekayasa Lingkungan, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI), trichloroacetic acid (TCA), etanol, metanol, tris HCl 10 mM pH 8, glukosa 1 mg/mL, fenol, asam sulfat, sepharose 4B, media IMK-Seawater; adenosin trifosfat (ATP) 0,1 mM; 4-asam morfolinopropana sulfonat (MOPS) 0,1 mM; MgCl2 1 mM, larutan hijau malakit, polivinil alkohol 2,3%; amonium molibdat, natrium sitrat, dan akuades. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah ultrasentrifus Sorvall RC-26 plus, sonikator, waterbath, tabung sentrifus, erlenmeyer, inkubator, rotator, microtiter plate, microplate reader (Multiscan EX Thermo), pipet mikro, oven,
19
kolom kromatografi, SDS-PAGE, tabung vial, hot plate magnetic stirer, dan timbangan digital.
3.3
Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap. Tahap satu yaitu preparasi
RNA helikase HCV yang meliputi (1) ekspresi RNA helikase dengan cara menumbuhkan bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS yang membawa gen NS3 RNA helikase HCV dalam plasmid pET 21b (Utama et al. 2000), (2) pemurnian RNA helikase yang telah terekspresi pada sel bakteri menggunakan kromatografi afinitas (Utama et al. 2000). Tahap dua meliputi (1) kultivasi mikroalga BTM 11 dalam media IMK-Sea Water pada suhu ruang dengan pencahayaan 4800 lux, (2) ekstraksi polisakarida dari biomassa mikroalga BTM 11 (Wang et al. 2004). Tahap tiga meliputi (1) pemurnian ekstrak polisakarida menggunakan teknik kromatografi gel filtrasi dan kromatografi ion-exchange, (2) penentuan profil senyawa polisakarida inhibitor yang paling aktif menggunakan kromatografi lapis tipis dan kromatografi cair kinerja tinggi. Diagram alir prosedur kerja penelitian dapat dilihat pada Gambar 11. 3.3.1 Ekspresi dan purifikasi RNA helikase HCV (Utama et al. 2000) Ekspresi RNA helikase protein NS3 HCV dilakukan berdasarkan metode Utama et al. (2000). Ekspresi dilakukan pada skala 400 mL. Sebanyak 10 µL stok gliserol bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS yang membawa vektor ekspresi pET21b/HCV NS3 helikase diinokulasi ke dalam 10 mL medium LB cair yang mengandung 1 µg/mL ampisilin, kemudian dikultur selama satu malam dalam inkubator goyang (shaker incubator) pada suhu 37 °C dengan kecepatan 150 rpm. Hasil kultur diinokulasikan ke dalam 400 mL medium LB yang mengandung ampisilin, selanjutnya dikultur dalam inkubator berpenggoyang pada suhu 37 °C dengan kecepatan 150 rpm, selama 30 menit sampai dengan 1 jam hingga OD600 mencapai ±0,3. Apabila OD600 telah mencapai ±0,3 maka ditambahkan 0,3 M isopropil β-D-thiogalaktopiranosidase (IPTG). Kultur E. coli BL21 (DE3) pLysS kemudian diinkubasi selama 3 jam dalam inkubator goyang pada suhu 37 °C dengan kecepatan 150 rpm selama 3 jam atau hingga OD 600 mencapai ±1.
20
Mikroalga BTM 11
E.coli BL 21(DE3) pLysS pembawa gen helikase
Kultivasi mikroalga BTM 11
Ekspresi dan purifikasi enzim helikase
Biomassa Mikroalga BTM 11
RNA helikase terpurifikasi
SDS PAGE
Ekstraksi polisakarida
Ekstrak polisakarida
Uji ATPase
Pemurnian polisakarida (kromatografi gel filtrasi)
Uji ATPase
Pemurnian polisakarida (kromatografi ion-exchange)
Analisis total gula
Analisis total gula
Uji ATPase
Fraksi paling aktif polisakarida terpurifikasi
Analisis kemurnian (kromatografi lapis tipis)
Analisis kemurnian (kromatografi cair kinerja tinggi)
Gambar 11 Diagram alir prosedur kerja penelitian.
Uji ATPase
21
Hasil kultur disentrifugasi pada suhu 4 °C dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Pelet diresuspensi dengan sisa medium LB cair, kemudian disentrifugasi kembali. Pelet yang diperoleh disimpan pada suhu -20 °C. Pelet E. coli BL21 (DE3) pLysS dipecah dengan metode freeze & thaw sebanyak 3 kali ulangan yaitu dengan membekukan pelet pada suhu -20 °C selama 30 menit, lalu dicairkan pada suhu ruang selama 30 menit. Pelet kemudiian diresuspensi dengan 20 mL larutan bufer B (Tris HCl 10 mM pH 8,5; NaCl 100 mM, Tween 20 0,25%). Tahap kedua pemecahan sel dilakukan dengan metode sonikasi (Amplitudo 40; siklus 0,5; waktu 3x15 detik; interval waktu 1 menit). Suspensi sel disentrifugasi pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil untuk tahapan selanjutnya, sedangkan pelet disimpan untuk analisis SDS-PAGE. Enzim RNA helikase yang diduga berada dalam supernatan dipurifikasi menggunakan metode kromatografi afinitas. Supernatan ditambahkan dengan 300 µL resin TALON, kemudian dilakukan tahap pengikatan (binding) menggunakan rotator selama 3 jam dalam ruang pendingin (4 °C). Sampel selanjutnya disentrifugasi pada suhu 4 °C dengan kecepatan 3.500 rpm selama 7 menit. Supernatan (inner volume) disimpan pada suhu 4 °C untuk analisis SDS-PAGE. Pelet (resin binding) diresuspensi dengan 10 mL larutan bufer B dan disentrifugasi pada suhu 4 °C dengan kecepatan 3.500 rpm selama 5 menit. Tahapan ini dilakukan sebanyak 2 kali sehingga diperoleh 2 larutan supernatan (washing 1 & washing 2) yang disimpan pada suhu 4 °C dan digunakan untuk analisis SDS-PAGE. Resin binding dari hasil washing 2 kemudian dielusi untuk melepaskan enzim yang terikat pada resin. Elusi dilakukan dengan menambahkan 150 µL larutan bufer elusi (imidazol 400 mM dalam bufer B), kemudian diinkubasi menggunakan rotator dalam ruangan pendingin (4 °C) selama satu malam. Sampel disentrifugasi pada suhu 4 °C dengan kecepatan 3.000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang mengandung enzim dipindahkan dalam eppendorf yang baru (E1), sedangkan pelet ditambahkan 75 µL larutan bufer elusi, kemudian diinkubasi dengan menggunakan rotator selama 1 jam. Sampel kembali
22
disentrifugasi sehingga diperoleh supernatan (E2). Supernatan (E1 dan E2) disimpan pada suhu 4 °C dan digunakan untuk analisis ATPase dan SDS-PAGE. 3.3.2 Kultivasi dan pemanenan mikroalga BTM 11 Kultivasi BTM 11 dilakukan dengan media IMK-SW. Namun sebelum dikultivasi, inokulum disegarkan terlebih dahulu dengan media IMK. Media IMK-SW digunakan untuk membuat suatu kondisi yang sama dengan media awal pertumbuhan mikroalga tersebut. Penyegaran stok mikroalga dilakukan dalam keadaan aseptik pada erlenmeyer 500 mL dengan penyinaran lampu 4800 lux, dan diberi aerasi. Mikroalga dikultur selama 14 hari sebelum dipindahkan ke kultur dengan skala yang lebih besar. Komposisi media IMK-SW dapat dilihat pada Lampiran 1. Pemanenan dilakukan dengan teknik filtrasi, yaitu hasil kultur disaring menggunakan kain filtrasi sehingga didapatkan biomassa basah. Biomassa basah tersebut dikeringkan menggunakan oven pada suhu 60 °C selama 2 hari. Biomassa kering yang didapatkan kemudian dilakukan pengecilan ukuran menjadi bentuk serbuk dengan menggunakan mortar. 3.3.3 Ekstraksi polisakarida BTM 11 (modifikasi Wang et al.2004) Serbuk mikroalga BTM 11 sebanyak 5 g dilarutkan dalam 100 mL etanol absolut. Sampel dimaserasi selama 6 jam, kemudian disaring untuk didapatkan peletnya. Pelet tersebut dilarutkan dalam 100 mL aseton dan dimaserasi kembali selama 6 jam. Hasil maserasi tersebut disaring dan diambil peletnya untuk kemudian dilarutkan dalam NaCl 0,9%. Maserasi sampel dilakukan selama satu malam, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 4.500 rpm selama 15 menit. Supernatan hasil sentrifugasi diambil 15 µL untuk analisis ATPase. Supernatan yang telah didapatkan kemudian dilakukan presipitasi dengan trichloroacetic acid (TCA) 10%. Hasil pengendapan disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 7.500 rpm. Supernatan hasil sentrifugasi diambil 15 µL untuk analisis ATPase. Supernatan dipekatkan dengan freeze dryer untuk mendapatkan ekstrak kasar polisakarida. Ekstrak kasar polisakarida diresuspensi dengan Tris HCl dan diambil 15 µL untuk analisis ATPase.
23
3.3.4 Pemurnian polisakarida dari mikroalga BTM 11 1) Kromatografi gel filtrasi (Amersham 1999) Matriks gel Sepharose 4B dimasukkan secara perlahan ke dalam kolom kromatografi. Ekstrak kasar polisakarida BTM 11 dilarukan dalam buffer (Tris HCl 10mM pH 8) dan sebanyak 5% dari volume kolom dimasukkan ke kolom gel filtrasi. Sampel dielusi dengan eluen etanol 30%, dengan laju alir 1 mL/menit tiap fraksi. Masing-masing fraksi hasil pemurnian diuji aktivitas penghambatannya terhadap RNA helikase virus hepatitis C dengan uji ATPase. 2) Kromatografi ion-exchange(modifikasi Baumgartner dan Chrispeels 1976) Kolom kromatografi dibilas dengan menggunakan kation-anion exchange. Setelah itu, sebanyak 1 mL sampel polisakarida inhibitor diinjeksikan ke dalam kolom kromatografi. Eluen yang digunakan adalah NaCl 0,1-1 M. Hasil elusi ditampung dalam tabung vial dengan volume masing-masing 1 mL. Masingmasing fraksi diuji aktivitas inhibisinya dengan uji ATPase. 3.3.5 Profil kemurnian fraksi aktif polisakarida inhibitor RNA helikase Fraksi yang memiliki aktivitas paling tinggi dari masing-masing teknik pemurnian dibandingkan dan dipilih fraksi paling aktif untuk dilihat profil kemurniannya menggunakan kromatografi lapis tipis, dan diperjelas kembali menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi. 1) Kromatografi lapis tipis (modifikasi Putri 2011) Plat silika F254 disiapkan dan diatur jarak antara garis penotolan dengan garis akhir. Bejana (chamber) KLT diisi dengan eluen asetonitril : etanol dengan perbandingan 3:7 dan diinkubasi selama beberapa menit hingga jenuh. Plat yang telah ditotol dengan sampel hasil pemurnian yang memiliki aktivitas inhibisi tertinggi dikembangkan dalam bejana sampai eluen mencapai garis akhir. Hasil KLT kemudian divisualisasi menggunakan sinar UV dengan panjang gelombang 254 nm, setelah itu disemprot dengan penampak bercak serium sulfat dan dipanaskan hingga terlihat spot hasil kromatografi. 2) Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) / HPLC Sampel atau fraksi paling aktif diambil sebanyak 20 µL untuk diinjeksikan ke dalam HPLC. Kondisi HPLC yang digunakan adalah sebagai berikut :
24
3.4
a. Fase Gerak
: H2SO4 0,008 N
b. Kolom
: Aminex® HPX-87H, 300 mm x 7.8 mm
c. Detektor
: Refractive Index
d. Flow rate
: 1 mL/min
e. Suhu kolom
: 35 ºC
f. Back Pressure
: 1553 psi
Prosedur Analisis Analisis yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi (1) penentuan bobot
molekul RNA helikase murni menggunakan SDS-PAGE, (2) uji aktivitas penghambatan RNA helikase HCV terhadap ekstrak polisakarida dan fraksi polisakarida termurnikan, (3) penentuan kandungan gula pada fraksi polisakarida murni yang memiliki aktivitas penghambatan yang tinggi terhadap RNA helikase HCV. 3.4.1 Analisis enzim RNA helikase dengan SDS-PAGE (Speicher 1997) Analisis menggunakan alat SDS-PAGE. Glass plate sandwich (short plate & spacer plate) dibersihkan dengan etanol. Short plate ditempatkan di depan kaca spacer plate. Kedua kaca kemudian dimasukkan ke dalam casting frame dengan posisi bagian bawah kedua kaca sama rata lalu dikunci dengan menekan cams. Casting frame dipasang pada casting stand. Setelah peralatan siap, larutan gel separating dibuat sesuai dengan prosedur (Lampiran 2a). Larutan tersebut dimasukkan di antara celah short plate & spacer plate sampai duapertiga bagian lalu ditambah akuades sampai dengan batas atas kaca, ditunggu ±20 menit sampai terbentuk gel. Selama menunggu 20 menit, larutan gel stacking dibuat sesuai dengan prosedur (Lampiran 2b). Sebelum larutan gel stacking dimasukkan, air yang ada pada gel separating dibuang. Larutan gel stacking dituang sampai batas atas kaca, comb dimasukan, ditunggu ±20 menit sampai gel terbentuk. Gel dipindahkan dari casting frame dengan cara menekan cams pada casting frame.Gel cassette sandwich ditempatkan pada electrode assembly dengan posisi short plate menghadap dalam, lalu ditempatkan ke dalam clamping frame, kemudian ditutup kedua camp levers pada clamping frame. Lower inner chamber
25
dimasukan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan working solution (Buffer Elektroforesis SDS 1X pH 8,3). Masing-masing sampel diambil 4 µL lalu dicampur dengan 2 µL loading dye (Lampiran 2c). Campuran didenaturasi pada suhu 95 °C selama 15 menit. Marker protein (BIORAD®) sebanyak 4 µL/gel dimasukkan ke dalam well. Masing-masing sampel yang sudah dicampur dengan loading dye, dimasukkan ke dalam well sebanyak 5 µL/well.Gel dielektroforesis selama 90 menit dengan arus 40 mA. Gel diangkat lalu direndam dalam Commasie Blue G-250 staining solution (Lampiran 2d) selama 1 jam sambil digoyang-goyang di atas rocker. Gel dibilas dengan Commasie Blue G-250 destaining solution (Lampiran 2e) ±20 menit, dilakukan dua kali. Gel dibilas dengan H2O sampai bau asamnya hilang dan disimpan pada suhu 4 °C. Gel menunjukkan elektroforegram dari RNA helikase HCV berupa pita protein dengan bobot molekul 54 kDa. Perhitungan bobot molekul (BM) dilakukan terlebih dahulu dengan menghitung retardation factor (Rf) dari masingmasing pita protein marker dan pita protein target menggunakan rumus :
Rf =
Jarak dari titik awal elektroforesis ke pita protein Jarak dari titik awal ke titik akhir elektroforesis
Nilai Rf pada pita-pita protein marker digunakan untuk memperoleh kurva standar terhadap log standar BM dari marker. Bobot molekul dihitung melalui persamaan regresi linier kurva standar yang diperoleh, yaitu y = ax + b. Nilai “x” yang dimasukkan merupakan nilai Rf dari pita protein target, sedangkan nilai “y” merupakan nilai log BM dari pita protein target. Nilai bobot molekul diperoleh dari antilog BM pita protein target. 3.4.2 Uji aktivitas ATPase RNA helikase HCV (Utama et al. 2000) Pengujian aktivitas inhibisi enzim helikase virus hepatitis C dengan sampel hasil pemurnian polisakarida BTM 11 menggunakan uji ATPase kolorimetri (Utama et al. 2000), yaitu dengan mengukur jumlah fosfat yang dilepaskan dari hidrolisis senyawa ATP menjadi ADP dan fosfat anorganik (Pi). Konsentrasi akhir reaksi adalah sebesar 175 µL/sumur.Sistem reaksi enzim selengkapnya untuk satu sampel dengan volume total 175 µL dapat dilihat pada Tabel 2.
26
Tabel 2 Sistem reaksi enzim untuk satu sampel dengan volume total 175 µL Blanko (µL) Enzim (µL) Kontrol (-) (µL) Sampel (µL) 5 5 43,5 38,5 33,5 33,5 5 5 5 5 0,5 0,5 0,5 0,5 1 1 1 1 5 5 5 Inkubasi pada suhu ruang selama 45 menit Dye solution* 100 100 100 100 Inkubasi pada suhu ruang selama 5 menit Na-sitrat 25 25 25 25 Pembacaan pada λ 620 nm dengan referensi 405 nm (Abs. 620 nm – 405 nm) Sampel Pelarut H2O Buffer (MOPS) Kofaktor (MgCl2) Substrat (ATP) RNA helikase
*H2O : hijau malakit : polivinil alkohol : amonium molibdat (2 : 2 : 1 : 1) Persentase aktivitas penghambatan senyawa inhibitor terhadap RNA helikase ditentukan dengan rumus: % Inhibisi =
A−I × 100 % A
Keterangan : A = Absorbansi RNA helikase tanpa senyawa inhibitor I = Absorbansi RNA helikase dengan adanya senyawa inhibitor 3.4.3 Analisis kandungan gula fraksi polisakarida BTM 11 (Dubois et al. 1956) Analisis ini bertujuan untuk memastikan bahwa fraksi aktif dari kromatografi gel filtrasi dan ion-exchange terdapat kandungan polisakarida dengan cara mendeteksi komponen gula penyusunnya menggunakan metode fenol-asam sulfat. Langkah awal yaitu membuat kurva standar dengan glukosa (1 mg/mL) sebagai standar dari konsentrasi tertinggi hingga terendah. Sebanyak 0; 0,1; 0,3; 0,5; 0,8; dan 1 mg/mL glukosa dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan akuades hingga mencapai volume 100 µL. Sebanyak 0,5 mL larutan fenol 5%; 2,5 mL H2SO4 pekat dicampurkan ke dalam tabung tersebut dan dicampur rata. Standar glukosa diganti dengan akuades untuk blanko, sedangkan untuk analisis sampel, standar diganti dengan (polisakarida 1%). Setelah itu campuran diinkubasi selama 15 menit di ruang asam. Lalu tabung berisi campuran diinkubasi dalam waterbath (40 °C) selama 15-30 menit, dan diamati perubahan warna yang terjadi. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 490 nm. Kandungan gula dihitung melalui persamaan regresi linier kurva standar yang
27
diperoleh, yaitu y = ax + b. Nilai “y” yang dimasukkan merupakan absorbansi yang terbaca dari sampel, sedangkan nilai “x” merupakan kandungan gula dalam sampel.
