3. Buňka nástroj farmaceutického biotechnologa

Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa

3. Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa Buňka je základní stavební jednotka všech živých organismů. Je ohraničena cytoplazmatickou membránou a jsou naplněny koncentrovaným vodným roztokem různých chemických látek a biochemických sloučenin. Buňky jsou vysoce organizované a mají unikátní schopnost vytvářet kopie sebe sama procesem růstu, který je následován rozdělením původní tzv. mateřské buňky, na dvě nové, tzv. dceřiné. Buňka představuje pro farmaceutického biotechnologa základní pracovní nástroj, a to zejména ze dvou důvodů 1) Buňka slouží jako zdroj výchozích surovin, protože jen buňka je schopna tvořit nové sloučeniny, které jsou použitelné jako léčivo. Z buněk je možné izolovat jak produkty primárního metabolismu, tedy proteiny, sacharidy, tuky a nukleové kyseliny, tak i produkty sekundárního metabolismu, pro farmaceuta snad ještě zajímavější. Buňka je kromě toho zdrojem genetické informace, podle které se stejně všechny ostatní sloučeniny prostřednictvím enzymů tvoří. 2) Buňka je až na zcela výjimečné situace, kdy používáme jen některých jejích částí pro tzv. translaci in vitro, onou továrnou, kde všechny biotechnologické procesy probíhají. Všechno, co v buňkách, jak bylo výše uvedeno, vzniká, vzniká právě díky tomu, že je buňka k biochemickým procesům přizpůsobena. Biotechnolog této skutečnosti umí využít, pokud procesům, v buňce probíhajícím, dobře rozumí. Znalost struktury a funkce buňky (a specifických vlastností různých typů buněk, především ve smyslu buňka bakteriální, buňka hub, buňka rostlinná a živočišná), je tedy pro biotechnologa alfou a omegou ať už proto, že jednotlivé typy buněk mu slouží jako zdroj výchozího materiálu, tak z důvodu využití buňky jako produkčního systému pro přípravu biotechnologických produktů. Ačkoli je struktura buňky dobře popsána v nesčetném počtu učebnic a výukových materiálů, stojí zato v krátkosti některé pro biotechnologa důležité skutečnosti zopakovat.

3.1. Organizace buňky V každé buňce probíhají všechny funkce, které charakterizují živé soustavy, protože bez buňky není života. K základním vlastnostem buňky řadíme zejména následující: 1)

Buňka je relativně stabilní soustava, která se vymezuje vůči svému okolí tím, že existuje (i když omezeně) v čase a existuje i tehdy, když se okolí v určitém rozmezí změní.

2)

Buňka je systémem s cílovým chováním, je to soustava velmi dynamická, ve které probíhá neustále velké množství dílčích procesů, spojených s chemickými přeměnami, s transformací energie a informace. Cílem dynamiky všech těchto buněčných procesů je právě zajistit stabilitu soustavy.

3) Buňka je autonomní systém, který dosahuje stability pouze tehdy, jsou-li všechny dílčí procesy v buňce řízeny tak, aby směřovaly k zajištění stability a integrity soustavy. K tomu potřebné informace jsou obsaženy v buňce samotné.

Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa 4) Buňka je systém s autoregulací, ve kterém jsou všechny dílčí procesy regulovány na principu zpětných vazeb, takže regulace probíhají automaticky. 5) Buňka je otevřený systém; pro udržení stacionárního stavu si musí buňka s okolím neustále vyměňovat látky, energii a informaci. 6) Buňka je systém s autoreprodukcí, tzn., že informace potřebná pro zdvojení soustavy (reprodukci) je obsažena v buňce samotné a buňka je schopna syntetizovat z látek přijatých z okolí všechny potřebné stavební komponenty. 7) Buňka je systém s učením, který mění svou vnitřní strukturu a chování v závislosti na krátkodobých (adaptace) a dlouhodobých změnách v okolí (evoluce).

Každá buňka je z hlediska struktury složitý hierarchický systém. Hlavními stavebními prvky jsou tři typy makromolekul - proteiny, nukleové kyseliny a polysacharidy - a dále molekuly lipidů. Jejich prostorovou organizací vznikají složitější útvary - buněčné organely, které samy mají různě složitou víceúrovňovou organizaci. Základní dělení buněčných struktur, které použijeme v následujícím popisu, vede k rozlišení struktur na  membránové  fibrilární

3.1.1. Membránové struktury Jejich strukturním základem je biologická membrána neboli biomembrána. Základní funkce biomembrány jsou regulovaný transport molekul v důsledku semipermeability, zajištění metabolismu enzymatickými procesy a přenos signálů receptory. Co se složení biomembrány týče, jedná se o lipidovou dvojvrstvu se začleněnými proteiny. Biologické membrány obsahují proteiny připojené na matrix lipidové dojvrstvy lipidů. Na proteiny i lipidy se napojují sacharidy. Poměr proteinů k lipidům je variabilní (např. erytrocyty mají poměr proteinů k lipidům 49% k 43%, u myelinové pochvy je tento poměr 18% k 79%). Mezi membránové lipidy patří fosfolipidy a glykolipidy, které slouží k udržení hydrofility dané části membrány a stabilizaci konformace membránových proteinů. Další složkou jsou steroly (např. cholesterol, který zvyšuje pevnost membrán) tvořící mechanickou ochranu buňky. Jejich molekuly mají amfipatický charakter, tj. mají jak hydrofobní, tak i hydrofilní konec. Molekuly lipidů tvoří ve vodném prostředí dvojvrstvu s laterální difúzí, tj. mohou se dvojvrstvou pohybovat z jedné strany na druhou nebo vykonávat translační pohyb a ohyb. Rozložení fosfolipidů v cytoplazmatické membráně je asymetrické. Cholinové fosfolipidy se nacházejí hlavně na vnější straně dvojvrstvy, aminofosfolipidy na vnitřní, cytoplazmatické vrstvě. Glykolipidy se nalézají na vnější straně biomembrány, jejich cukerná složka vyčnívá na povrch buňky. Mezi lipidy obsažené v biomembránách patří fosfatidylethanolamin, fosfatidylinositol, fosfatidylserin, kardiolipin, sfingomyelin, aj.

fosfatidylglycerol,

Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa Membránové proteiny Membránové proteiny uskutečňují řadu specifických pochodů, které jsou typické pouze pro membrány. Mnoho buněčných proteinů je proto přítomno pouze v membránových strukturách. Z příkladů membránových proteinů zmíníme transportéry iontů Na+ nebo K+ nebo ATPázové pumpy, integriny, receptory, enzymy (např. adenylátcykláza), povrchové antigeny atd. Lze je rozdělit na dvě velké skupiny, přičemž většina biologických membrán obsahuje oba druhy:  integrální proteiny je nesnadné oddělit od vlastní biomembrány, je třeba použít detergentů. Tyto proteiny mají jeden nebo více strukturních segmentů, které významně interagují s konci lipidů a napínají tak lipidovou dvojvrstvu. Pokud integrální protein membránu překlenuje, jedná se o tzv. transmembránový protein; jeden konec takového proteinu vyčnívá na povrch buňky, druhý konec je vnořen do cytoplasmy.  periferní proteiny jsou na povrchu buňky napojeny elektrostatickými silami nebo vodíkovými vazbami k integrálním proteinům nebo k polárně nabitým lipidům. K odpojení periferních proteinů od lipidové dvojvrstvy lze použít solné roztoky, EDTA nebo močovinu. Periferní proteiny obsahují aminokyseliny s neutrálními nebo hydrofilními postranními skupinami. Příkladem periferních proteinů je enzym proteinkináza C.

Vlastnosti biologických membrán Plazmatická membrána, stejně tak jako membrány buněčných organel vykazují tyto společné vlastnosti: 1. Jsou nepropustné pro polární molekuly a ionty. Biomembrány umožňují průnik těchto látek, pokud obsahují proteinové transportéry nebo pokud se jedná o specializované membrány, např. membrány jádra nebo vnější membránu mitochondrií. 2. Nejsou to útvary rigidní, flexibilně se adaptují na změny v objemu a tvaru buněk nebo buněčných organel. 3. Jsou v dostatečné míře odolné proti poškození, dokáží obnovit svou celistvost po vnějším zásahu 4. Mají jednotný vzhled, v elektronovém mikroskopu vypadají jako dvě vnější tmavé linie, mezi které je vmezeřena třetí, světlejší linie střední. Tloušťka biomembrány je 3 až 4 nm.

Typy biomembrán, organely s biomembránou  plazmatická membrána tvoří vnější obal každé buňky; její hlavní funkcí je tvorba semipermeabilní povrchové bariéry a regulovaný tok látek mezi buňkou, metabolická funkce a signální funkce (jsou zde přítomny receptory, rozpoznávací proteiny, antigeny, atd.). Zachycený signál změní strukturu receptoru a původní signál se transformuje na jiný signál, které je rozpoznán dalšími strukturami na cytoplazmatické straně membrány, např. enzymy či změnou konformace cytoskeletu. Po předání informace dojde opět k regeneraci struktury receptoru. Signály jsou zpravidla chemické nebo fyzikální povahy. K chemickým signálům patří hormony, feromony nebo chemické tkáňové mediátory jako jsou oligopeptidy, nebo cytokininy, tedy látky fungující jako atraktanty nebo repelenty, případně antigenní determinanty. Z fyzikálních signálů se obvykle jedná o fotony zachycované membránovými receptory.

Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa  jaderná membrána je vnější obal jádra, nejnápadnější buněčné organely eukaryotických buněk. Obsahuje početné póry široké cca 9 nm, které regulují tok látek mezi jádrem a cytoplazmou. Velikost pórů je taková, aby jimi neprošly chromozómy a ribozómy.  membrána endoplazmatického retikula je nejrozsáhlejší membrána v eukaryotické buňce, objevená v roce 1945 Keithem Porterem. Obklopuje labyrintovou organelu – endoplazmatické retikulum. Endoplazmatické retikulum je organela s mnohostrannými funkcemi. Má centrální roli v syntéze lipidů, proteinů a steroidů. Jsou v něm oddělovány nově vytvořené molekuly proteinů. Většina proteinů podléhá v endoplazmatickém retikulu chemickým modifikacím. Oxidací cysteinových párů postranních řetězců se zde vytvářejí disulfidické můstky. Endoplazmatické retikulum má určitý význam při regulaci osmotického tlaku v buňce, svou soustavou spojených kanálků tvoří důležitý transportní systém, může převádět látky z vnějšího prostředí až k jádru buňky a naopak, aniž by došlo ke styku s cytoplazmou. Syntetizované produkty jsou shromažďovány uvnitř kanálků a odtud jsou rozváděny dále do buňky. Mnoho produktů syntetizovaných v endoplazmatickém retikulu je transportováno a dále upravováno v Golgiho aparátu. Existují dva typy endoplazmatického retikula (ER): (a) Drsné endoplazmatické retikulum, které je posázené ribozómy a je místem translace. Termín drsné je odvozen vzhledu na něm umístěných ribozómů. (b) Hladké endoplazmatické retikulum, které je tvořené váčky nesoucími nové molekuly proteinů a lipidů pro vnitrobuněčný transport. Hladké ER tvoří síť tenkých kanálků přímo navazujících na drsné ER. Na membrány ER se váží enzymy katalyzující přeměnu lipidů nebo steroidních hormonů (jen ve specializovaných buňkách). Endoplazmatické retikulum hepatocytů obsahuje enzymy, které se podílejí na biotransformaci léků, produktů metabolismu nebo exogenních toxinů (CYP 450).  membrána Golgiho aparátu. Tato organela byla popsána r. 1898 Camillem Golgim. Je tvořena souborem plochých membránových váčků. Centrální oblast se nazývá dictyozom a je tvořen systémem plochých až piškotovitých útvarů tzv. cisteren, kterých je u jednoho útvaru 4 - 20. Okrajové části cisteren přecházejí v hustou nepravidelnou síť trubiček a váčků. Konce trubiček tvoří tzv. Golgiho váčky, které se postupně odpoutávají od celého komplexu. Protože není membrána Golgiho aparátu uzavřená, mohou se jednotlivé odškrcované váčky včleňovat do cytoplazmy. U žláznatých živočišných buněk je vylučovaný sekret, je-li proteinového charakteru, transportován z ribozómů do drsného endoplazmatického retikula a odtud dosud neobjasněným způsobem do cisteren Golgiho aparátu. Zde sekret kondenzuje a pomocí odškrcujících se váčků obalených membránou je transportován z buňky ven. Významnou činnost Golgiho aparátu lze vysledovat u buněk rostlinných, které produkují slizy, jako jsou např. buňky kořenových čepiček, buňky žláznatých trichomů a podobně. Ve váčcích proniká sliz plazmolemou a buněčnou stěnou mimo buňku.  membrána mitochondrií – membrána je místem buněčné respirace u téměř všech eukaryot. Probíhá zde syntéza ATP prostřednictvím tzv. oxidativní fosforylace. Typická eukaryotní buňka obsahuje okolo 2 000 mitochondrií a ty zde zaujímají přibližně pětinu jejího celkového objemu. Mitochondrie mají membrány dvě: hladkou vnější membránu a vysoce zprohýbanou vnitřní membránu, jejíž invaginace se nazývají kristy. Díky dvěma membránám má každá mitochondrie

Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa dva vnitřní prostory: mezimembránový prostor a vnitřní prostor tzv. matrix. Enzymy katalyzující reakce spojené s tvorbou ATP jsou většinou integrovány do vnitřní mitochondriální membrány. Mitochondrie svým tvarem a velikostí velmi připomínají bakterie (mají rozměr 1 x 2 μm) a v matrix mají specifickou DNA, RNA a ribozómy, které se účastní syntézy různých mitochondriálních komponent. Mitochondrie se reprodukují příčným dělením a jejich respirační procesy nápadně připomínají současné aerobní bakterie. Tato pozorování vedla k hypotéze, že mitochondrie vznikly z původně samostatně žijících aerobních bakterií, které začaly žít symbioticky s původně anaerobními eukaryoty. Poznámka: spermie nemá mitochondrie, všechny mitochondrie v oplozeném vajíčku pochází od matky.  membrána chloroplastů. Chloroplasty jsou specializované organely rostlinných buněk. Představují místo fotosyntézy. Jsou to organely mnohonásobně větší než mitochondrie, ale vnitřní strukturou se jim podobají. Podobně jako mitochondrie, mají i chloroplasty dvě membrány: vnitřní a vnější. Prostor ohraničený vnitřní membránou se u chloroplastů nazývá stroma, obsahuje velké množství rozpustných enzymů. Vnitřní membrána zralých chloroplastů není zprohýbaná a netvoří kristy. Naproti tomu ale stroma obklopuje třetí membránový systém, tvořící navzájem spojené sady diskovitých váčků, zvaných thylakoidy, které obsahují fotosyntetický pigment chlorofyl. Chlorofylem zachycenou světelnou energii používají thylakoidy k tvorbě ATP, který je dále využíván při biosyntetických pochodech. Stejně jako mitochondrie obsahují i chloroplasty vlastní DNA, RNA a ribozómy a reprodukují se příčným dělením. Zřejmě se i chloroplasty vyvinuly z některých prekambrických sinic, které se umístily jako symbionti v původně nefotosyntetizujícím eukaryotu. Takové buňky, žijící v symbióze se současnými sinicemi, dosud existují. Podobnou strukturu jako chloroplasty mají chromoplasty a leukoplasty. Chromoplasty jsou plastidy, které obsahují místo chlorofylu jiná barviva, nejčastěji karotenoidy, obvykle se vyskytují v květech a plodech. Leukoplasty žádné pigmenty neobsahují, jsou silně světlolomivé a vyskytují se v buňkách podpokožkovitých, v dělivých pletivech, v semenech a podzemních orgánech. V zásobních orgánech se v nich shromažďuje škrob (amyloplasty), proteiny (proteinoplasty) nebo krůpěje tuků (elaioplasty). V olejnatých rostlinách se však olej neváže na plastidy, ale tvoří krůpěje v plazmě nebo je v ní jemně rozptýlen. Mezi jednotlivými plastidy není ostrých hranic, mohou se během vývoje nebo vlivem změny podmínek měnit jedny v druhé.  lysozómy (u živočišných buněk, též označované jako endozómy) a sférozómy (u rostlinných buněk) jsou samostatnou membránou obklopené organely různé velikosti a morfologie, jejichž průměr se pohybuje od 0,1 do 0,8 μm. Jedná se o tzv. „sebevražedné váčky“ obsahující nejrůznější hydrolytické enzymy. Pokud dojde k porušení membrány lysozómu a obsah se vylije do cytosolu, zničí celou buňku, případně zánět. Funkcí těchto organel je trávit materiály získané endocytózou a recyklovat buněčné komponenty. Cytologická pozorování ukázala, že lysozómy vznikají pučením Golgiho aparátu.  exozómy jsou vezikuly secernované savčími buňkami, vznikají fúzí lysozómů s cytoplazmatickou membránou. Jejich obsah odpovídá obsahu lysozómů ze kterých se vytvořily. Obsahují také proteiny a ribonukleové kyseliny, především RNA a miRNA.

Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa Role exozómů v mezibuněčné komunikaci. Exozómy byly objeveny před asi 30 lety. Předpokládalo se, že se jedná o vezikuly, které pomáhají odstraňovat zplodiny buněčného metabolismu. V roce 1996 bylo zjištěno, že buňky imunitního systému, konkrétně B lymfocyty, taky secernují exozómy, které nesou v membráně vázané molekuly jako složku nezbytnou k adaptivní imunitní odpovědi. O dva roky později byly exozómy nalezeny u dendritických buněk myší. Tyto exozómy obsahují imunitní komponenty, které mohou indukovat protinádorovou odpověď. Tak vznikla hypotéza, že exozómy mohou hrát aktivní roli v mezibuněčné komunikaci, což zvýšilo zájem o tyto organely z hlediska klinických aplikací. Dnes víme, že exozómy jsou zachycovány jinými buňkami a tímto způsobem dochází k přenosu informací nesených v daných exozómech. Prostřednictvím exozómů např. antigen prezentující buňky sdílejí patogeny, které jsou v exozómech zachyceny, což vede k zesílení imunitní odpovědi proti těmto patogenům. Na exozómy vázané molekuly se mohou podílet na indukci inaktivace nebo dokonce usmrcení cílových buněk. Některé exozómy např. na svém povrchu vystavují Fas ligand, který po vazbě ba Fas receptor (známý také jako „receptor smrti“), iniciuje apoptózu. V roce 2007 byla uvnitř exozómu nalezena také mRNA a miRNA. V experimentech in vitro bylo prokázáno, že mRNA přenášená exozómem může být v cílové buňce přeložena do polypeptidu. Jedná se vlastně o genetický přenos exozómem! Exozómy tedy skutečně mohou představovat nový způsob mezibuněčné komunikace. Kromě toho možná fungují podobně jako viry v tom smyslu, že přenášejí genetický materiál, který v „infikované buňce“ vytváří proteiny. Protože jsou exozómy komplexní částice, možná svým obsahem ovlivňují větší množství fyziologických parametrů než jednotlivé molekuly lipidů, hormonů nebo cytokinů. Změny vyvolané exozómy po interakci s recipientními buňkami mohou být rozsáhlé a závisí na typu a fyziologickém stavu secernující buňky; mohou buďto odvrátit onemocnění nebo ji naopak v některých případech vybudit. Např. maturované dendritické buňky secernují exozómy, které nesou antigeny nebo obsahují MHCpeptidové komplexy zabudované v lipidové dvouvrstvě. Takové exozómy mohou indukovat specifickou imunitní odpověď k neseným antigenům. Na druhé straně exozómy secernované myšími dendritickými buňkami, které byly „opracovány“ imunosupresivy mohou navodit imunologickou toleranci. Podobně je tomu v případě makrofágů infikovaných nepatogenními mykobakteriemi, které secernují exozómy s bakteriálními antigeny. Takové exozómy jsou rozpoznány jinými antigen prezentujícími buňkami a vyvolat imunitní odpověď. Naproti tomu exozómy uvoněné makrofágy, které byly infikovány patogenními druhy mykobakterií, inhibují aktivaci makrofágů a sekreci cytokinů, čímž dochází k utlumení imunitní odpovědi, která by jinak byla mykobakteriálními antigeny aktivována. Na úrovni exozómů tak vlastně patogen manipuluje s imunitním systémem hostitele! Exozómy secernované nádorovými buňkami nesou antigeny nádoru a mohou tak být rozpoznány dendritickými buňkami a využity k prezentaci nádorových antigenů, čímž dojde k aktivaci buněk imunitního systému proti příslušnému nádoru. Tyto exozómy také obsahují různé imunosupresivní molekuly, které mohou inaktivovat T lymfocyty nebo přirozené zabíječské buňky, případně vyvolat diferenciaci regulačních T lymfocytů nebo myeloidních buněk, které imunitní odpověď reprimují. Jaký je výsledný efekt těchto procesů na nádor, není úplně jasné. I jiné tkáně secernují exozómy nesoucí imunosupresívní molekuly. Vesikuly uvolňované placentou nesou inhibiční ligandy přirozených zabíječů a dalších složek imunitního systému, což pravděpodobně chrání fetus před útokem imunitního systému matky. Exozómy a další vezikuly uvolňované do bracheoalveolární tekutiny mohou přeášet rezistenci vůči alergenu na další živočichy – toto bylo experimentálně vyzkoušeno na myších. Na druhou stranu mohou exozómy v bronchoalveolární tekutina také zvýšit prozánětlivou odpověď, což bylo potvrzeno u exozómů pacientů s astmatem. Eukaryotičtí parazité nebo patogeny secernují exozómy, což může vést k rozvoji tolerance vůči útočníkovi nebo k patologické zánětlivé reakci na jejich přítomnost. Kromě imunitního systému ovlivňují exozómy zřejmě i další fyziologické funkce. Exozómy jsou secernovány neurony, svalovými a kmenovými buňkami a buňkami epitelu. Mohou se tedy podílet na reparaci tkání, komunikaci buněk nervového systému a tvorbě a přenosu patogenních proteinů – prionů a depozit amyloidu. Například neurony secernují exozómy nesoucí receptory neurotransmiterů, které se tak mohou podílet na eliminaci neurotransmiteru v extracelulárním prostoru a zastavit tak signalizaci nebo mohou tyto receptory přenášet k dalším buňkám, které se tak stávají citlivé k neurotransmiterům. Dá se očekávat, že další systémy a funkce ovlivňované exozómy budou popsány v nejbližších letech. Více se můžete dočíst zde: Théry, C. (2011): F1000 Biol Reports2011, 3:15 http://the-scientist.com/2011/07/01/exosome-explosion/

Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa  peroxizómy jsou organely, které se nachází zejména ve tkáních s aktivním metabolismem lipidů (např. játra, tuková tkáň). Jsou, co se týče struktury, podobné lysozómům i mitochondriím. V peroxizómech probíhají anabolické i katabolické procesy. Syntetizují plazmalogeny (to jsou mastné kyseliny, které obsahují vinylethery), žlučové kyseliny a cholesterol. Jsou centrem glukoneogeneze z aminokyselin a tvoří se v nich kyselina oxalová. Z katabolických reakcí je to především β-oxidace mastných kyselin a degradace peroxidu vodíku na vodu a kyslík účinkem katalázy (nejvíc zastoupený enzym v peroxizómech). Peroxizómy vznikají pučením endoplazmatického retikula. Peroxizómy jsou, co se týče struktury, podobné mitochondriím a lysozómům. Na rozdíl od mitochondrií, které mají dvojitou membránu, peroxizómy jsou ohraničeny jednoduchou membránou, relativně dobře propustnou pro hydrofilní molekuly. Enzymové substráty o molekulové hmotnosti menší než 800 prostupují přes membránu přes póry za asistence dvou proteinů o molekulové hmotnosti 22 000 a 28 000. Zatímco pro lysozómy je charakteristickým enzymem kyselá fosfatáza, pro peroxizómy je charakteristickým enzymem kataláza. Kromě již výše uvedených metabolických pochodů probíhá v peroxizómech oxidace etanolu, polyaminů, degradace purinů, hydroxylace kyseliny fytanové a degradace kyseliny pipekolové. V peroxizómech jsou různé antioxidační enzymy (kataláza, glutathion-peroxidáza, superoxid-dismutáza), oxidázy nasycených i nenasycených mastných kyselin i oxidázy mastných kyselin s velmi dlouhými řetězci. Oxidace mastných kyselin probíhá analogicky jako v mitochondriích, ale zatímco v peroxizómech se štěpí pouze asi 10% kyseliny palmitové, v mitochondriích probíhá oxidace převážného množství, tedy 90%. Naproti tomu jsou mastné kyseliny o delších a velmi dlouhých řetězcích, jsou štěpeny výhradně v peroxizómech. Konečnými produkty β-oxidace jsou fragmenty o délce 6 až 12 uhlíků, ty jsou pak přeneseny do mitochondrií, kde je oxidace dokončena. V peroxizómech probíhá takéα-oxidace mastných kyselin, kterou se štěpí např. kyselina fytanová, produkt oxidace fytolu (součást chlorofylu). Kyselina fytanová nemůže být štěpena β-oxidací, protože na β uhlíku obsahuje metylovou skupinu, která β-oxidaci inhibuje. Peroxizóm však oxiduje též D-aminokyseliny i L-dihydroxykyseliny. Peroxizómy obsahují aminotransferázy, acyltransferázy, enzymy pro syntézu cholesterolu či transportního alkoholu dolicholu, který buňka využívá při syntéze proteoglykanů a glykoproteinů). Kyslík je v peroxizómech přeměněn převážně na peroxid vodíku, v mitochondriích vzniká z 90% kyslíku voda, zbytek tvoří superoxid. Tyto reaktivní formy kyslíku jsou v obou organelách odstraňovány CuZn- či Mn-superoxiddismutázami, katalázou a glutathion-peroxidázou, aby nedošlo k poškození buňky.

 glyoxizómy jsou specializované typy peroxizómů, nachází se v buňkách některých rostlin. Jsou místem sledu reakcí nazývaných glyoxylátová dráha.  vakuoly se vyskytují v rostlinných i živočišných buňkách, v rostlinných jsou však mnohem významnější (zaujímají až 90 % obsahu buňky). U jednobuněčných živočichů považovány za organely a mají zde trávicí funkce, u ostatních organismů považovány spíše za buněčné inkluze. Funkcí vakuol je uskladňování zásob živin, odpadů a specifických látek, např. barviv - nejčastěji anthokyany, proteinů, cukrů (sacharóza cukrovky), tříslovin, pryskyřičných látek, pektinu, alkaloidů (např. morfin u makovic), glykosidů (Digitalis sp.) aj.; plynné vakuoly obsahují nejčastěji CO2 a jejich funkcí je vyrovnání specifické hmotnosti organismu umožňující jeho volné splývání ve vodném prostředí. V embryonálních buňkách rostlin jsou ve formě četných velmi malých vakuolek, které mají tvar protáhlých váčků a v cytoplazmě tvoří hustou síť obklopující převážně jádro; při dalším vývoji vakuolky splývají ve větší, až u starých buněk tvoří jednu velkou vakuolu vyplňující téměř celou buňku. Vakuola je ohraničena od cytoplazmy tenkou semipermeabilní membránou - tonoplastem. Další důležitou vlastností je také udržování turgoru (uvnitř vakuoly je roztok s vysokým obsahem solí, který umožňuje osmotické nasávání vody).

Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa

3.1.2. Fibrilární struktury Jejich substruktury tvoří lineárně uspořádané molekuly biopolymerů, což je základ cytoskeletu komplexu uspořádaných vláken situovaných v cytosolu. Cytoskelet dává buňce tvar a schopnost pohybu, řídí vnitřní uspořádání buňky a pohyb jejích organel. Mikrotubuly jsou nejnápadnější cytoskeletální elementy, jedná se o trubičky o průměru asi 25 nm tvořené proteinem tubulinem. Mikrotubuly jsou složeny ze 13 souběžných protofilament, která jsou tvořena řetězcem pravidelně se střídajících podjednotek tubulinu α a β. Polymerizací podjednotek dochází k tvorbě tubulinu, opačný jev se nazývá depolymerizace. Oba jevy jsou v rovnováze. Mikrotubuly tvoří podpůrnou kostru, která zabezpečuje tvar buňky a pohyby organel uvnitř buňky. V buňce jsou obvykle orientovány tak, že jeden konec mikrotubulu je orientován do centrozómu a z něho se jednotlivá vlákna rozbíhají k povrchu buňky. Alkaloid kolchicin z Colchicum autumnale působí jako tzv. mitotický jed - inhibuje buněčné pochody, jichž se účastní mikrotubuly, inhibuje polymeraci tubulinových protomerů; zabraňuje tedy vzniku mitotického vřeténka a tím zastavuje mitózu rostlinných i živočišných buněk v metafázi, mimo to zastavuje i buněčné pohyby. Kolchicin se používá k léčení akutních záchvatů dny, kdy se v lysozómech bílých krvinek hromadí zvýšené množství kyseliny močové, která zde krystaluje, a jehličkovité krystalky mohou propíchnout vnější obal lysozómu a způsobit tak lýzi buněk, což vyvolá zánětlivou reakci. Předpokládá se, že kolchicin zpomaluje ameboidní pohyby bílých krvinek tím, že inhibuje funkci soustavy mikrotubulů. Podobně působí i alkaloidy Vinca rosea - vinblastin a vinkristin, protože se vážou na tubulin a brání jeho polymeraci na mikrotubuly. Taxany z Taxus brefifolia naopak urychlují tvorbu tubulů, stabilizují je a brání depolymerizaci, mitóza pak trvá až 15 hodin, namísto 30 minut.

Mikrofilamenta jsou vlákna o průměru cca 9 nm, tvořená proteinem aktinem. Stejně jako mikrotubuly mají mechanicky podpůrnou funkci. Navíc ještě s proteinem myosinem tvoří kontraktilní aparát zodpovědný za mnoho typů intracelulárních pohybů, jako je proudění cytoplazmy a tvorba buněčných výběžků a invaginací. Na vyšší úrovni organizace jsou aktin a myozin hlavními složkami svalových buněk. Střední filamenta - proteinová vlákna o průměru 10 - 15 nm. Jejich přítomnost v místech, kde je buňka vystavena mechanickému tlaku napovídá, že jejich funkcí je tomuto tlaku odolávat. Na rozdíl od mikrotubulů a mikrofilament se proteiny tvořící střední filamenta velmi liší velikostí a složením jak mezi různými typy buněk, tak mezi odpovídajícími typy buněk v různých organismech. Intermediární filamenta můžeme rozlišit do pěti hlavních tříd, a to podle toho, jakou základní proteinovou složku obsahují: 1. Vismetin je protein, který se nalézá ve fibroblastech a v epitelových buňkách, např. v cévách 2. Desmin převažující ve svalových buňkách 3. Neurofilamenta, která jsou obsažena v axonech neuronů 4. Gliové fibrilární kyselé proteiny nalézané v buňkách gliových 5. Cytokeratiny, kam patří skupina asi 30 podtypů. Tyto proteiny se nacházejí v buňkách různých epitelů, a to v charakteristických kombinacích

Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa Centrozóm neboli dělící (mitotické) tělísko je organela živočišných buněk a buněk nižších rostlin, u vyšších rostlin doposud nenalezen nebyl. Při dělení buněk vyšších rostlin také vznikají vlákénka, ale bez objevení se centrozómu. Vyskytuje se v blízkosti jádra, které je v jeho okolí mírně prohloubeno. Jedná se o seskupení mikrotubulů a asociovaných proteinů, které se účastní separace chromozómů při dělení jádra - podmiňuje orientaci chromozómů a pohyb jejich rozdělených částí k pólům dělícího se jádra. Skládá se z centrioly, centrosféry a astrosféry. Centriola je středové tělísko, centrosféry vytváří hustou bezstrukturní zónu kolem centrioly, astrosféra jsou radiálně uspořádaná řídká vlákna gelové cytoplazmy vybíhající z centrosféry. Při zrání živočišné vaječné buňky (před oplozením) centrozóm zaniká, do zygoty je vnášen spermií. U jednobuněčných živočichů se dále účastní tvorby pohybových orgánů - bičíků a fimbrií. Mikrotubuly jsou také hlavní složkou vláskovitých výběžků vystupující z mnohých buněk a nazývaných řasinky neboli cilia; vyskytují se na povrchu mnoha živočišných buněk i buněk nižších rostlin. Mají vlasovitý tvar, jsou dlouhé 5-10 mikrometrů. Způsobují pohyb kapaliny kolem povrchu buněk nebo umožňují jednotlivým buňkám v kapalině plout. Lidský dýchací trakt je pokryt epitelem, jehož každá buňka má okolo 200 řasinek. Ty svým synchronním pohybem posunují cizí tělíska zachycená v hlenu směrem k hrtanu a tak je odstraní. Syndrom nepohyblivosti řasinek je dědičná recesivní nemoc a osoby jí postižené trpí chronickými dýchacími potížemi. Eukaryotický bičík. Velmi dlouhé řasinky, např. u spermií a některých prvoků, se nazývají bičíky neboli flagela; pohání buňku vlnivým pohybem, každá buňka obsahuje pouze jeden nebo několik málo bičíků. Muži, kteří trpí syndromem nepohyblivosti řasinek, bývají také sterilní, neboť jejich spermie jsou nepohyblivé. Eukaryotický bičík je mikrotubulární struktura s typickým uspořádáním devíti dvojic okrajových mikrotubulů + 2 centrální mikrotubuly. Mikrotubuly jsou tvořeny proteinem tubulinem. Okrajové mikrotubuly jsou připojeny k buněčné membráně prostřednictvím ramének, která jsou tvořena proteinem dyneinem. Bakteriální bičíky jsou značně odlišné od bičíků eukaryotických buněk. Mají charakter tuhého šroubovicového vlákna, u některých druhů jsou levotočivé, u jiných pravotočivé. Jsou mnohem tenčí než bičík eukaryot a jsou složeny z proteinu flagelinu. Také pohyb je zcela jiného charakteru - zatímco bičíky eukaryot se vlní a smršťují, bičíky bakterií rotují kolem osy a pohyb tak spíš připomíná lodní šroub. Struktury podílející se na pohybu bakteriálních buněk jsou popsány v práci Bardy, S.L. (2003): Prokaryotic motility structures. Microbiology 149: 295-304. Přehledným článkem o bakteriálních bičících je např. práce Macnab, R. M. (2003): How bacteria assemble flagella. Annu. Rev. Microbiol. 57: 77-100.

3.1.3. Genofory Genofory představují strukturální základ nesoucí genetickou informaci. Jádro - je místem, kde je uložen a replikován genetický materiál a kde vzniká RNA. Tato organela se skládá z DNA a chromozomálních proteinů. Je obalena dvojitou membránou (karyolemou); mezi oběma membránami se nachází perinukleární prostor. Propojení nukleoplazmy a cytoplazmy umožňují jaderné póry. Každý jaderný pór je ohraničen osmi multiproteinovými granulemi, které označujeme jako komplex jaderného póru. Jaderný obal je struktura dynamická, která se může rychle zvětšit či smrštit, a to podle stádia buněčného cyklu nebo aktuální aktivity jádra.

Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa Nukleoplazmatickou stranu vnitřní jaderné membrány tvoří tzv. nukleární lamina, fibrózní síť složená z proteinů zvaných lamininy. Při mitóze je tato síť fosforylována; fosforylace vede k rozpadu jaderného obalu. V jádru většiny eukaryotních buněk se nachází nejméně jedno tmavě se barvící tělísko zvané nukleolus neboli jadérko, které je místem, kde se shromažďují ribozómy. Obsahuje chromozómální segmenty nesoucí mnohočetné kopie genů pro ribozómovou RNA. Nukleoid je organela vyskytující se u prokaryot. Jedná se o tělísko tvořené jediným chromozómem buňky. Nukleoid obsahuje kromě dsDNA, také histonům podobné proteiny (HLA proteiny) a proteiny účastnící se procesu replikace a transkripce. V rychle rostoucí buňce může být přítomno i několik kopií nukleoidu. Další genofory jsou tvořeny plasmidovou DNA a genomem mitochondrií, u rostlin pak ještě genomem chloroplastů.

3.1.4. Základní cytoplazma Cytoplazma bez buněčných organel se nazývá cytosol. Jedná se o vysoce organizovaný gel, jehož složení se výrazně mění v různých částech buňky. Je to koloidní roztok mnoha enzymů, které katalyzují metabolické procesy v buňce. Mají vysoký obsah proteinů, které tvoří 20 až 30 % objemu cytosolu. Celkem 25 až 50% všech buněčných proteinů je v cytosolu. Jeho vnitřní proměnlivost většinou určuje cytoskelet, na který jsou proteiny cytosolu ve specifických oblastech napojeny. Vedle organel je v cytoplazmě i množství zrníček rezervních látek, především volutinu (polymetanfosfát) a polysacharidu glykogenu. Adipocyty obsahují kapénky triacylglycerolů, hepatocyty a myocyty granula glykogenu. U prokaryot obsahuje cytoplazma také mnoho druhů RNA, kolísavý počet rozpustných enzymů a mnoho tisíc ribozómů, dále zde u některých druhů bakterií mohou být obsažena různá barviva, nejčastěji karotenoidní.

3.1.5. Ribozómy Jsou kulovité částice o průměru cca 25 nm, vyskytují se volně v základní cytoplazmě nebo jsou přichyceny k vnější membráně endoplazmatického retikula. Volný výskyt v cytoplazmě je dvojího druhu: buď izolovaný (monozómy) nebo většinou tvoří shluky v podobě ribozómových agregátů zvaných polyribozómy nebo zkráceně polyzómy. Jednotlivé ribozómy jsou přichyceny na „nitce“ tvořené jednou molekulou mRNA. Ribozómy byly zjištěny nejen v cytoplazmě a na endoplazmatickém retikulu, ale také v jadérku, mitochondriích a chloroplastech, vytváří se pravděpodobně v jadérku. Každý ribozóm se skládá z velké a malé podjednotky, které jsou zbudovány z RNA a proteinů. Na ribozómech probíhá syntéza proteinů.

Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa 3.1.6. Buněčné inkluze Životní činností buňky se v cytoplazmě hromadí různé, víceméně inertní látky, jako jsou látky rezervní, odpadní, exkreční nebo sekrety žláznatých buněk. Tyto útvary neobsahují protoplazmu. Patří sem vakuoly, škrobová zrna, proteinové krystaloidy, tukové krůpěje, glykogenové granule, barviva, specifické sekrety (terpeny, pryskyřice, krystalky šťavelanu vápenatého, aj.). Pro farmaceutického biotechnologa představují právě tyto buněčné inkluze často zdroj farmaceuticky významných látek.

Tabulka 3.1: přehled základních buněčných kompartmentů a v nich probíhajících dějů Buněčná struktura

Metabolický děj

jádro

biosyntéza DNA, biosyntéza a modifikace RNA

cytoplazma

glykolýza, pentózový cyklus, biosyntéza sacharidů a mastných kyselin

mitochondrie

dýchací řetězec a oxidativní fosforylace, citrátový cyklus, odbourávání mastných kyselin, metabolismus aminokyselin

ribozómy

biosyntéza proteinů

endoplazmatické retikulum

syntéza, modifikace a transport některých proteinů, cholesterolu, fosfolipidů a triacylglycerolů, detoxikace

Golgiho komplex

modifikace, třídění, transport a vylučování některých proteinů

lysozómy

odbourávání opotřebených biomakromolekul a cizorodých struktur

peroxizómy

oxidace za vzniku peroxidu vodíku, fotorespirace

chloroplasty

fotosyntéza, syntéza mastných kyselin

glyoxizómy

gloxylátový cyklus

syntéza

Přestože principy základních funkcí jsou stejné u všech buněk bez výjimky, je možno buňky rozdělit na dva základní typy - buňky prokaryotické a eukaryotické.

Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa

3.2. Prokaryotická buňka (pro-před, karyon-jádro) Prokaryota jsou nejpočetnější a nejrozšířenější organismy na světě. Je to tím, že jejich proměnlivý a vysoce přizpůsobivý metabolismus jim umožňuje žít téměř všude. Kromě toho, že obývají mírné aerobní prostředí, určité typy bakterií mohou snášet nebo dokonce vyžadovat podmínky, které jsou pro eukaryota zcela nepřijatelné, jako je nepřítomnost kyslíku, vysoké teploty a neobvyklé chemické prostředí. Mimo to také vysoká schopnost reprodukce umožňuje prokaryotům využít přechodně výhodných podmínek a naopak, schopnost mnoha bakterií tvořit resistentní spory jim dovoluje přežít podmínky nepříznivé. Prokaryotický typ buňky mají Archae, bakterie, sinice a nejjednodušší mykoplazmata. Struktura prokaryotických buněk je poměrně jednoduchá. Rozmnožují se dělením, mají aerobní nebo anaerobní metabolismus, respirační enzymy jsou umístěny v cytoplazmatické membráně, nedochází u nich k endocytóze ani exocytóze, kolem cytoplazmatické membrány se vyskytuje pevný obal (buněčná stěna) a mezi cytoplazmatickou membránou a buněčnou stěnou se nachází periplazmatický prostor. Velikost prokaryotických buněk se pohybuje v průměru od 1 do 10 μm. Mykoplazmata jsou tvořena pouze plazmatickou membránou, chromozómem prokaryotického typu, ribozómy a základní cytoplazmou; postrádají pevnou buněčnou stěnu ostatních prokaryot. Jsou to nejmenší živé buňky (cca 0,12 μm v průměru) a obsahují jen asi 20 % DNA ve srovnání s bakteriální buňkou Escherichia coli. Tato genetická informace se blíží minimálnímu množství nezbytnému k zajištění základního metabolického vybavení pro život buňky. U bakterií a sinic jsou membránové struktury poněkud četnější. Ačkoliv prokaryotické buňky postrádají membránové buněčné organely typické pro eukaryota, jejich plazmatická membrána může tvořit i vícevrstvé vchlípeniny zvané mesozómy, jejichž funkce není dosud zcela jasná. Soudí se, že snad slouží jako místo replikace DNA a dalším specializovaným enzymovým reakcím. U fotosyntetizujících bakterií a sinic (cyanobakterií) je v cytoplazmě i membránová soustava thylakoidů, realizujících fotosyntézu. Genofor je tvořen jedním chromozómem a u některých druhů plasmidy. Bakterie jsou ve svém přirozeném prostředí obaleny rosolovitým polysacharidovým pouzdrem. Mnohé bakteriální buňky nesou jeden nebo dva bičíky či pili. Buňky většiny prokaryot jsou obaleny pevnou polysacharidovou 3 - 25 nm silnou buněčnou stěnou, která slouží především k ochraně buňky před mechanickým poškozením a zabraňuje jejímu prasknutí v prostředí, které je osmoticky mnohem řidší než její obsah. Významná je také z lékařského hlediska, neboť je zodpovědná za bakteriální virulenci (schopnost vyvolávat onemocnění). Příznaky mnoha bakteriálních onemocnění lze skutečně u pokusných zvířat vyvolat parenterálním podáním samotných buněčných stěn. Navíc jsou složkami buněčných stěn také charakteristické antigeny bakterií, takže parenterální podání preparátů z buněčných stěn často u pokusných zvířat vyvolá imunitu proti těmto bakteriím. Podle složení buněčné stěny se bakterie rozdělují na Gram-pozitivní a Gram-negativní v závislosti na tom, zdali se barví při Gramově barvení. Gram-negativní se odbarví, Gram-pozitivní zůstanou zabarvené. Základem bakteriální buněčné stěny (až na drobné výjimky - metanogenní bakterie) jsou peptidoglykany (murein). Peptidoglykan je tvořen řetězci tvořenými N-acetylmuramovou kyselinou a N-acetylglukosaminem. Na každou muramovou kyselinu je navázán krátký oligopeptidový řetězec, tvořený aminokyselinami. Tyto krátké řetězce jsou příčně spojeny pentapeptidy, čímž vzniká obrovská molekula peptidoglykanu (buněčná stěna je tvořena jedinou peptidoglykanovou sítí). Stěna Grampozitivních bakterií je poměrně silná (cca 25 nm) a je tvořena několika vrstvami (až 20) peptidoglykanů,

Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa do které jsou zapojeny další chemické látky jako teichoová (teikoová) kyselina a lipoteichoová kyselina (tvoří až 20 % sušiny buněčné stěny, jedná se o nedefinovaný polymer glycerolu nebo ribitolu, které jsou vázány fosfodiesterovými můstky, OH skupiny tohoto cukerně-fosfátového řetězce jsou substituovány D-Ala zbytky a cukry - glukózou a N-acetylglukozaminem). Gram-negativní bakterie mají stěnu tenčí (cca 3 nm), ale podstatně složitější. Vně od peptidoglykanové vrstvy je další vrstva tvořená lipidy a lipoproteiny. Její molekulární struktura připomíná biomembránu a bývá proto nazývána vnější membránou. Ještě nad ní je vrstva lipopolysacharidů.

3.2.1. Základní strukturní rysy Archae Ačkoli mají Archae prokaryotický typ buňky, řadou vlastností se podobají eukaryotickým buňkám. Velikost buněk Archae se pohybuje mezi 0,1 μm až 15 μm. Buňky mají různý tvar, nejčastěji se jedná o koky, tyčinky, spirální struktury nebo destičky. Někteří zástupci kmene Crenarchaeota ale mají velmi zvláštní a neobvyklý tvar – např. rod Sulfolobus tvoří nepravidelné lalokovité buňky, rod Thermofilum má buňky ve tvaru nudlí, kdežto rody Thermoproteus a Pyrobaculum vytvářejí dokonale pravoúhlé tyčinky. Takové struktury jsou pravděpodobně udržovány jak specifickými strukturami v buněčné stěně, tak i prostřednictvím cytoskeletu. Podobně jako u bakterií toho však o cytoskeletu Archae mnoho nevíme. Naproti tomu rody Thermoplasma a Ferroplasma nemají buněčnou stěnu, jejich buňky mají nepravidelný tvar a mohou připomínat améby. Některé druhy vytvářejí agregáty nebo vláknité buňky dlouhé až 200 μm. Takové organismy se vyskytují v biofilmech. Buňky druhu Thermococcus coalescens fúzují a vytvářejí velké buňky. Rod Pyrodictium žije v mnohobuněčných koloniích. Existují i kolonie tvořené více zástupci Archae nebo kolonie, kde se současně vyskytují Archae a bakterie. Z hlediska habitu mají Archae podobnou strukturu jako bakterie, ale složení některých buněčných struktur a jejich uspořádání je odlišné. Podobně jako bakterie nemají Archae vnitřní biomembrány ohraničující jednotlivé organely. Cytoplazmatická membrána je, podobně jako u bakterií, obklopena buněčnou stěnou. Archae se pohybují pomocí jednoho nebo více bičíků. Strukturálně jsou Archae nejvíce podobné gram-pozitivním bakteriím, mají jednoduchou cytoplazmatickou membránu, buněčnou stěnu a nemají periplazmatický prostor. Výjimkou je rod Ignicoccus, který má velký periplazmatický prostor obsahující membránově vázané vezikuly a je obklopený vnější membránou.

Membrána Archae Membrána Archae je tvořena fosfolipidy, které se velmi liší od fosfolipidů, které tvoří membrány jiných živých forem: 1) Membrány Archae na rozdíl od bakterií a eukaryot tvoří glycerol-éterové lipidy. Éterová vazba je chemicky více rezistentní než vazba esterová. Tato stabilita zřejmě umožňuje Archaeím přežívat v extrémně vysokých teplotách a v prostředích, která jsou vysoce kyselá nebo naopak alkalická. 2) Stereochemie glycerolové části je opačná než u jiných organismů. K syntéze fosfolipidů tedy Archae využívají jiné enzymy než ostatní buňky. 3) Lipidická část je rovněž velmi odlišná. Lipidy zástupců Archae mají postranní řetězce na bázi izoprenoidů, jsou dlouhé a mnohonásobně větvené, někdy obsahují cyklopropanové nebo cyklohexanové kruhy. Bakterie a eukaryota mají lipidické části složené z nevětvených

Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa mastných kyselin. Větvení zřejmě zvyšuje stabilitu membrán v prostředí s vysokými teplotami. 4) U některých Archae je lipidická dvojvrstva nahrazena monovrstvou. Tehdy dochází ke spojení dvou molekul fosfolipidu nepolárními částmi a takový fosfolipid má dvě polární „hlavičky“. Toto opět vede k zvýšení rigidity membrány.

Buněčná stěna a bičík Archae Většina Archae (kromě rodů Thermoplasma a Ferroplasma) má buněčnou stěnu. U většiny Archae je buněčná stěna poskládána z povrchové vrstvy proteinů, které vytvářejí tzv. S-vrstvu. S-vrstva tvoří chemickou i fyzikální ochranu buňky. Archae nemají peptidoglykan, ale pseudopeptidoglykan (pseudomurein), který má sice podobnou morfologii, funkci a fyzikální strukturu jako peptidoglykan bakterií, ale má odlišnou chemickou strukturu. Bičík Archae funguje stejně jako bičík bakterií a je poháněn protonovým gradientem. Má ale jiné složení a evoluční původ. Vyvinul se z bakteriálních pilů typu IV (bakteriální bičík vznikl ze sekrečního systému typu III). Rovněž růst bičíku v průběhu individuálního vývoje buňky je u Archae odlišný od bakterií. Shrnutí základních vlastností Archae a jejich porovnání s vlastnostmi bakterií a eukaryot je uvedeno v Tabulce 3.2.

Tabulka 3.2: Charakteristické rysy Archae Specifické

Společné s eukaryoty

Společné s bakteriemi

Buněčná stěna obsahuje pseudomurein

Nemají peptidoglykan

Nemají jádro ani membránou obalené organely

Cytoplazmatická membrána obsahuje lipidy s éterovou vazbou

Obsahují histony vázané k DNA

Kružnicový genom

Struktury tvořené proteinem flagelinem

Translace začíná metioninem

Mají operony

Struktura ribozomů nese rysy eukaryotické i bakteriální

Podobná RNA polymeráza, promotory a další rysy transkripce

Polycistronická mRNA

Sekvence tRNA a metabolismus

Podobný mechanismus replikace Velikost buněk (více než 100 x DNA a reparace, introny a menší než eukaryota) mechanismus sestřihu

Nemají enzymy pro syntézu mastných kyselin

Podobné ATPázy (typ V)

Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa

3.3. Eukaryotická buňka (eu-opravdu, karyon-jádro) Průměr eukaryotické buňky je 10-100 µm, její objem je tedy 1 000x až 1 000 000x větší než objem průměrné buňky prokaryotické. Není to však její velikost, nýbrž hojnost membránou obalených organel, každá se specializovanou funkcí, co nejlépe charakterizuje eukaryotní buňku. Vedle již zmiňovaných buněčných struktur obsahují buňky rostlin a hub typickou buněčnou stěnu, u rostlin je tvořen zejména celulózou. U živočišných buněk může být na povrchu buňky glykokalyx (vrstvička několik desítek až set nm silnou, která je tvořena různými typy sacharidů a glykoproteinů (mucin, hyaluronová kyselina,…), funkce známa pouze částečně, pravděpodobně tvoří určité mikrookolí buňky - ovlivňuje koncentraci iontů, kyselost v okolí buňky, určuje povrchový náboj buňky a může tedy působit jako určitý filtr přílivu látek do buňky a naopak; chrání cytoplazmatickou membránu před působením extracelulárních enzymů. Uvažuje se i o tom, že glykokalyx gamet hraje důležitou roli při oplození a při morfogenních procesech při embryogenezii; polysacharidy glykokalyxu mají i antigenní strukturu). Základní charakteristika struktur eukaryotické buňky, kterou minimálně potřebuje znát farmaceutický biotechnolog, byla popsána v předchozích částech učebního textu. V ostatních rysech eukaryotické buňky odkazujeme na základní učebnice cytologie.

3.4. Shrnutí kapitoly Buňka je základní jednotkou života, která je pro biotechnologa jednak přirozeným zdrojem surovin, tedy nukleových kyselin, enzymů, strukturních proteinů nebo sekundárních metabolitů, jednak nástrojem, pomocí kterého biotechnolog tyto suroviny, ať už v přirozeném nebo umělou cestou změněném stavu, produkuje. Každá buňka je složitý hierarchicky uspořádaný systém, jehož hlavními stavebními složkami jsou makromolekuly (nukleové kyseliny, proteiny, polysacharidy) a lipidy. Jejich prostorovou organizací vznikají různé buněčné struktury – nadmolekulární komplexy a organely. Buněčné struktury dělíme na membránové a fibrilární. Základní jednotkou membránových struktur je (bio)membrána, ohraničující buněčné organely. K jejím základním funkcím patří regulovaný transport molekul, zajištění metabolismu enzymatickými procesy a přenos signálů receptory. Membrána sestává z lipidové dvojvrstvy a do ní začleněných proteinů. Membrány ohraničují cytoplasmu (ve které probíhají základní metabolické procesy), jádro (probíhá zde biosyntéza DNA, biosyntéza a modifikace RNA), endoplazmatické retikulum (místo syntézy, modifikace a transportu některých proteinů, syntézy cholesterolu, fosfolipidů a triacylglycerolů), Golgiho aparát (organela určená k modifikaci, třídění, transportu a vylučování některých proteinů), mitochondrie (sídlo dýchacího řetězce a oxidativní fosforylace), chloroplasty (zde probíhá fotosyntéza), lysozómy (slouží k odbourávání opotřebených biomakromolekul a cizorodých struktur), exozómy (organely určené k odstraňování odpoadních produktů), peroxizómy (probíhá zde oxidace za vzniku peroxidu vodíku a fotorespirace), glyoxizómy (místo pro gloxylátový cyklus) a vakuoly (slouží k uskladňování zásob živin, odpadů a specifických látek).

Buňka – nástroj farmaceutického biotechnologa Opornou strukturu buňky tvoří fibrilární útvary formované do cytoskeletu složeného z mikrotubulů, středních filament a mikrofilament. Významnou složkou cytoskeletárních struktur je centrozóm. K cytoskeletu patří i eukaryotický a bakteriální bičík. Genetická informace buňky je nesena genofory, které u eukaryotické buňky tvoří jádro, mitochondriální DNA a u rostlin i chloroplastová DNA, v případě eukaryotických mikroorganismů pak ještě plasmidy. U bakterií a Archae patří ke genoforům nukleoid a plasmidy. Proteosyntéza probíhá u všech typů buněk v cytoplasmě ve specializovaných organelách – ribozomech. Životní činností buňky se v cytoplazmě hromadí inertní látky (látky rezervní, odpadní, exkreční nebo sekrety žláznatých buněk) ve formě inkluzí. Tyto útvary neobsahují protoplasmu. Prokaryotický typ buňky mají Archae, bakterie, sinice a mykoplazmata. Prokaryota jsou nejpočetnější a nejrozšířenější organismy na světě. Je to tím, že jejich proměnlivý a vysoce přizpůsobivý metabolismus jim umožňuje žít téměř všude. Samotná struktura prokaryotické buňky je ale oproti buňce eukaryotické poměrně jednoduchá, prokaryota především neobsahují vnitřní membrány a organely. Zvláštní skupinu organismů tvoří Archae, které mají z hlediska habitu podobnou strukturu jako bakterie, ale složení některých buněčných struktur a jejich uspořádání je odlišné. Strukturálně jsou Archae nejvíce podobné gram-pozitivním bakteriím, mají jednoduchou cytoplazmatickou membránu, buněčnou stěnu a nemají periplasmatický prostor. Membrána Archae je tvořena fosfolipidy, které se velmi liší od fosfolipidů, které tvoří membrány jiných živých forem. Řadou vlastností se Archae podobají eukaryotickým buňkám, především, co se týče genetického aparátu.

3.5. Příklady a úlohy k zamyšlení 1) Považujme typickou eukaryotickou buňku za kvádr o stranách 30, 40 a 60 μm a bakteriální buňku za kouli o průměru 1 μm. Vypočtěte velikost modelu bakterie, jestliže modelem eukaryotické buňky bude místnost dlouhá 6m, široká 4m a vysoká 3m. 2) Za teoreticky nejdelší buňku můžeme považovat neuron vymřelého dinosaura Amphicoelius fragillimus, který měřil od hlavy k ocasu možná až 60 metrů. Jestliže je nejvyšší změřená rychlost vedení vzruchu až asi 120 metrů za sekundu (432 km/h), jak dlouho by trval přenos vzruchu u takového neuronu? 3) Je možné lysozymem rozložit buněčnou stěnu Archae? 4) Porovnejte velikosti genomů u různých organismů, doplňte následující tabulku Organismus

Velikost DNA (bp)

Zea mays

3,9 x 109

Homo sapiens

3,0 x 109

Drosophila melanogaster

1,2 x 108

Saccharomyces cerevisiae

1,6 x 107

Escherichia coli

4,0 x 106

Bakteriofág 

48 514

Molární hmotnost

Hmotnost 1 molekuly

Počet molekul v 1g

5) Která(é) část(i) ribozómu (pokud vůbec) může(mohou) projít póry jaderné membrány?