2004

NKFP 4 program Azonosító szám: 4 / 042 / 2004

A korai embrionális és magzati veszteségek állategészségA projekt címe

ügyi prevenciójának lehetőségei szarvasmarha állományokban

A projekt nyilvántartási száma:

NKFP4/042/2004

A szerződés száma:

4/042/2004

Munkaszakasz számát

3

A

2006. 12. 01. – 2007. 12. 31.

beszámolási

időszak

tényleges kezdési és befejezési idejét Szent István Egyetem Állatorvos-tudományi Kar Szent István Egyetem, Mezőgazdaság és Környezettudományi A támogatott szervezetek

Kar

neve

Állattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet MTA Állatorvos-tudományi Kutatóintézete V.M.D. Állatgyógyászati Kft

A projektvezető neve

Dr. Szenci Ottó

1


Tartalomjegyzék

Oldal

1. Szakmai tudományos háttér

3

2. A projekt fő célkitűzései; az eredmények hasznosíthatósága

4

3. A projekt keretében vállalt feladatok. Projektstruktúra

5

4. A projekt keretében végzett munka részletes ismertetése

6

4.1. Elővizsgálatok

6

4.2. Diagnosztikai célú vizsgálatok

14

4.3. Az embrionális, illetve a korai magzati veszteségek csökkentése gyógyszeres kezelésekkel

24

4.3. Az embrionális, illetve a korai magzati veszteségek csökkentése két kísérleti takarmány adalékanyag segítségével

27

A projekt gyakorlatnak átadható fontosabb tapasztalatainak összegzése

48

A projekt eredményeit ismertető publikációk

49

Mellékletek

2


1. Szakmai tudományos háttér Amint pályázatunkban1, ill. korábbi más munkáinkban részletesen ismertettük, tejhasznú tehénben az első termékenyítések nyomán tapasztalható alacsony vemhesülési arány jelentős részben az embrió korai elhalásával (EM) magyarázható. Az embrió elpusztulhat a fogamzást követő legkorábbi időszakban (rendszerint a blastocysta kialakulásának stádiumában; kb. 6-7. nap): ez esetben a jelenség a jelenleg rendelkezésre álló klinikai és endokrinológiai vizsgálómódszerek számára teljes mértékben rejtve marad. Gyakori lehet azonban EM a vemhesség anyai szervezet részéről történő felismerésének az idején (kb. 12-16. nap), vagy az ezt követő kb. 10-14 napos periódusban is. Ez esetben a ciklus sárgatest (CL) fázisa meghosszabbodik, a viszszaivarzás késlekedik, ill. – ha az embrió a kb. 22-26. napon még életben van – egyes, a vemhesülés megtörténtét bizonyító proteinek (pl. vemhességspecifikus protein B, PSPB) jelennek meg a vérben. Amennyiben az ellés után kb. 60. nap után termékenyített állat vérében az inszeminálás után >26-28 nappal PSPB mutatható ki, a tehén viszont ennek ellenére is a későbbiekben üresnek bizonyul, bizonyítottnak tekinthető az EM ténye. A vemhesség anyai szervezet részéről történő felismerésének idején, vagy röviddel azt követően bekövetkező EM rendszerint összefügg a luteinizáció elégtelen voltával, ami a posztovulációs időszakban naponként mért progeszteron (P4) szintemelkedés mértékével jellemezhető. Nagyszámú korábbi vizsgálat – köztük saját munkáink is – tanúsítják, hogy a petefészekműködés ellés utáni ciklikussá válásának késlekedése, ill. az első ovuláció megtörténte után a luteinizáció zavara tejhasznú tehénben leggyakrabban az ellés utáni negatív energetikai egyensúly (negative energy balance, NEB) metabolikus és endokrinológiai következményeivel áll öszszefüggésben. Utóbbiak sorában (az LH-alapszekréció pulzusfrekvenciájának a kívánatostól való elmaradása mellett) az adipo-insuláris tengely hormonjainak (leptin-inzulin), és a pajzsmirigy hormonjainak (T4, T3) az alacsony vérszintje, továbbá – a növekedési hormon (STH) által indukált intrahepatikus inzulin-szerű növekedési faktor-I (IGF-I) produkció csökkenése nyomán – az IGF-I szint alacsony volta számít meghatározó jelentőségűnek. Az ovariális funkciók regulációja szempontjából a felsorolt metabolikus hormonok közül az inzulin és az IGF-I plazmaszintjének a csökkenése tűnik elsősorban kritikusnak. Emellett az IGF-I valószínűleg közvetlenül is befolyásolja az embrió életben maradása szempontjából meghatározó jelentőségű endometriális mirigyszekréciót, és közvetlen hatása lehet az embrió fejlődési erélyére is. A NEB dekompenzációjának (hyperketonaemia) az immunszupressziv hatása széles körben bizonyított, napjainkban sem ismert ugyanakkor, hogy egyes gyakran előforduló vírusfertőzések [pl. bovin herpeszvírusok, azaz fertőző rhinotracheitis (IBR) vírus, BoHV-1 és Movár herpeszvírus, BoHV-4] kórfejlődésében, illetve – direkt vagy indirekt módon – az ellés utáni első inszeminálást követő EM kialakulásában érvényesül-e valamilyen interakció. Úgyszintén inkább feltételezéseken, anekdotikus közléseken, mintsem konkrét vizsgálati eredményeken alapul az EM gyakoriságának a fokozódása az egyes hiányállapotokban, a nyomelemek közül elsősorban a mangán (Mn) és talán a szelén (Se) hiánya esetében. Mind az inzulin, mind pedig az IGF-I szintje fordított arányban áll az állat energetikai egyensúly-állapotával, emellett további takarmányozási és farmakológiai módszerekkel is befolyásolható. Az utóbbiak közül bSTH adásával (emellett pedig talán pótlólagos fényexpozícióval is) növelhető az IGF-I szintje, a módszer alkalmazása azonban csak Észak-Amerikában engedélyezett, az EU-ban szigorúan tiltott. A pótlólagos fénykiegészítéssel szerzett tapasztalatok biztatóak ugyan, nem mentesek azonban az ellentmondásoktól, emellett alkalmazásuk energiaigényes és jelentős kiegészítő beruházásokat is feltételez. Ezért a módszer hazai alkalmazásra ajánlása előtt még további jelentős vizsgálatok lennének indokoltak, ill. a gyakorlati alkalmazás a jelen 1

A célok szakmai megalapozottságának megítélése, illetve a jelentés tartalmi vonatkozásainak a követése csak a pályázati anyagnak is részét képező irodalmi áttekintés ismeretében lehetséges.

3


körülményeink között nem tűnik gyors sikert eredményezőnek. Az inzulin vérszintje bizonyos lassú felszívódású készítmények gyógykezelés-szerű alkalmazásával növelhető, de a nem kívánt mellékhatások megelőzése indokolja a dózis adott körülmények közötti optimalizálását, ami jelentős szakmai ismeretet és laboratóriumi hátteret feltételez, és emellett jelentős költségekkel is jár. Emellett az inzulin – és indirekt módon talán az IGF-I – produkciós rátája, és vérszintje is növelhető egyes glukoneogenetikus hatású takarmány-adalékanyagokkal (pl. propilénglikol, glicerin), illetve bizonyos, többszörösen telítetlen zsírsav-komponensekben (PUFA) gazdag, a bendőbeli átalakulásoktól (biohidrogenáció, lebomlás), védett zsírforrások biztosításával. Utóbbiak, az eikozainoidok kiindulási vegyületeként (pl. linolsav) közvetlenül befolyásolhatják a vemhesség anyai szervezet részéről történő felismerésében kulcsszerepet betöltő prosztaglandinok endometriális produkcióját is. Munkánk során e módszerek egyes lehetőségeivel kívántunk hazai tartási-takarmányozási körülményeken alapuló tapasztalatokat szerezni, propilénglikol- ill. PUFA-forrásként egy-egy, a konzorciumi partnerek egyike (V.M.D. Állatgyógyászati Kft) által kifejlesztett és üzemi méretekben is gyártani tervezett takarmány adalékanyagot felhasználva.

2. A projekt fő célkitűzései; az eredmények hasznosíthatósága A projekt keretében – a modern molekuláris biológia, virológia, endokrinológia, szaporodásbiológia, klinikai biokémia és takarmányozástan eszköztárának felhasználásával – célunk volt annak meghatározása, hogy üzemi körülmények között tejhasznú szarvasmarhában (1) mely vizsgálómódszerek alkalmazhatóak az inszeminálás után kb. >25-30 nappal bekövetkező (késői embrionális, illetve a korai magzati) veszteségek biztonságos felismeréséhez; (2) üszőkorban, illetve az ellés utáni (post partum) időszakban vizsgálva mekkora lehet e veszteségek előfordulási aránya; (3) az embrionális, illetve a korai magzati veszteségek előfordulása összefüggésbe hozható-e (a) az energia-, és a mikroelem /vitamin-ellátottság gyakran előforduló zavaraival, (b) az elléstől az első tüszőrepedésig eltelt idő tartamával, illetve (c) egyes gyakran előforduló vírusfertőzésekkel [pl. bovin herpeszvírusok, azaz fertőző rhinotracheitis (IBR) vírus, BoHV-1 és Movár herpeszvírus, BoHV-4]; (4) továbbá e veszteségek mértéke csökkenthető-e egyes, (a) a szaporodásbiológiai gondozás üzemi rendjébe könnyen beilleszthető gyógyszeres kezelésekkel, azaz (i) kb. 20-24 órás hatású, u.n. lente inzulin készítménynek az alkalmazásával, és/vagy (ii) az ellés utáni első inszeminálás időzítésére hazánkban is széles körben alkalmazott, a 63-77. napon megkezdett GnRH - PGF2 - GnRH (Ovsynch) szinkronizálási protokoll során a második GnRH kezelés humán chorion gonadotropinra (hCG) történő cseréjével, illetve (b) a kísérleti fejlesztés tárgyát képező két, a takarmány-fejadag energia koncentrációját növelő takarmány adalékanyaggal, azaz (i) egy, a májbeli glikoneogenezist is fokozni képes, szilárd halmazállapotú propilénglikol készítménnyel, valamint (ii) egy lenmag alapú, többszörösen telítetlen zsírsavakat (PUFA; elsősorban linol- és linolénsavat) nagy mennyiségben tartalmazó, ezért potenciálisan az endometriális prosztanoid szintézist is specifikusan befolyásolni képes adalék anyaggal2.

2

A lenmag alapú takarmányadaléknak e projekt keretében történő kifejlesztése és tesztelése mellett azután döntöttünk, miután a kísérleti munka során korán bebizonyosodott a lente inzulin kezeléseknek a feltételezettektől jelentősen elmaradó hatékonysága.

4


Munkánk során adatokkal kívántunk szolgálni annak megítéléséhez, hogy lehetséges-e, és igen válasz esetén milyen specifikus módszerekkel, kezelésekkel és célirányos termékekkel ezen embrionális, illetve a korai magzati veszteségek kártételének a csökkentése. A pályázat részét képező fejlesztések során – ismert általános előfordulásuk és feltételezett jelentőségük alapján – az energia-háztartás és a mikroelem/vitamin-ellátottság zavarainak, valamint az oxidatív stresszállapotnak a korrekciójára alkalmas módszereket helyeztük előtérbe. A projekt eredményei új ismereteket jelentenek a tejtermelő tehenészetek takarmányozási technológiájának, valamint állategészségügyi és szaporodásbiológiai gondozásának a hagyományosan alkalmazottnál hatékonyabb megszervezéséhez. Alkalmazásuk révén javítható a hazai tejtermelő tehenészetek versenyképessége, amely hozzájárulhat a mezőgazdasági vállalkozások megerősödéséhez, az elmaradott térségekben is elősegítve azok munkahely-teremtő, illetve -megtartó képességét.

3. A projekt keretében vállalt feladatok. Projektstruktúra A konzorcium tagjai – minden részletében összehangolt munka keretében – a projekt teljes futamideje alatt az alábbi (jelentős laboratóriumi módszerfejlesztéseket, illetve két kísérleti takarmány adalékanyag kialakítását és formulázását is magában foglaló) kutatási és fejlesztési feladatokat végezték el: (1) Elővizsgálatok (a Támogatási Szerződésben alkalmazott jelölés: ELŐ): a posztovulációs progeszteron (P4) szintemelkedés (luteinizáció) intenzitásának, illetve a termékenyítés eredményességének, az embrionális - korai magzati veszteségek előfordulásának az összevetése, előzetesen szinkronizált ciklusú tenyészüszőkben (1. kísérlet), valamint a (63-77. napon megkezdett Ovsynch kezelés előtt már ciklikussá vált, vagy még acikliás petefészekműködésű) post partum tehenekben (2. kísérlet). (2) Diagnosztikai célú kísérletek (a Támogatási Szerződésben alkalmazott jelölés: DG-1 és DG-2): A késői embrionális - korai magzati veszteségek gyakoriságának, feltételezett metabolikus, a mikroelem/vitamin-ellátottsággal összefüggő, valamint virológiai hátterének a vizsgálata; az energiaháztartás zavarának hatása a bovin típusú herpeszvírusok (BoHV-1, BoHV-4) aktiválódására, és az EM előfordulására post partum tehenekben (továbbiakban ld. 3., 4. és 5. kísérlet). (3) Az embrionális, illetve a korai magzati veszteségek csökkentése gyógyszeres módszerekkel (a Támogatási Szerződésben alkalmazott jelölés: TR1): Az ellés utáni negatív energiaegyensúllyal (negative energy balance, NEB) összefüggő ovarialis funkciózavaroknak (azaz az ellés utáni első tüszőrepedés késlekedésének, továbbá az első termékenyítést megelőző tüszőérés, illetve az azt követő luteinizáció zavarainak) a megelőzése, kezelése (hoszszú, kb. 20-24 órás hatású, ú.n. lente) inzulin készítmény segítségével (továbbiakban ld. 6. kísérlet); továbbá az ellés utáni első inszeminálást (AI) követő luteinizáció üteme befolyásolható-e az AI időzítésére alkalmazott, a 63-77. napon megkezdett GnRH - PGF2 - GnRH (Ovsynch) szinkronizálási protokollban a második GnRH kezelés hCG-re történő cseréjével (a feladat megoldására a 2. kísérlet keretében került sor). (4) A program további részeinek (a támogatási szerződésben alkalmazott jelölés: TR2 TR3 és KF1 kísérlet; a továbbiakban ld. 7. 8. és 9. kísérlet) a sikeres kivitelezéséhez szükséges kísérleti takarmány adalékanyagok, azaz egy-egy, a gyakorlatban könnyebben alkalmazható, a takarmány-fejadag energiakoncentrációját növelő, szükség esetén mikroelem és/vagy vitamin-kiegészítést is biztosító, (a) emellett glukoneogenetikus hatású szilárd halmazállapotú propilénglikol készítmény, valamint

5


(b) PUFA-ban (elsősorban linol- és linolénsavban) gazdag, ezért potenciálisan az endometriális prosztanoid szintézist is specifikusan befolyásolni képes) lenmag alapú takarmányadalék kialakítása és formulázása, az állatkísérletek lefolytatásához szükséges mennyiségű kísérleti takarmányadalék-mennyiség gyári előállítása (olyan formában, hogy azok alkalmasak legyenek az esetleges, telepspecifikus módon összeállított mikroelem és vitamin-kiegészítésre is). (5) Az előbbiekben részletezetteknek megfelelően kialakított kísérleti takarmány adalékanyagokkal végzett vizsgálatok, azaz annak a meghatározása, hogy alkalmazásuk nyomán miként alakul az állatok tejtermelése, ellés utáni metabolikus státusza és reprodukciós képessége, különös tekintettel a petefészek-működés ellés utáni ciklikussá válására, illetve a késői embrionális - korai magzati veszteségek előfordulásának az alakulására (a támogatási szerződésben alkalmazott jelölés: TR2 TR3 és KF1 kísérlet; a továbbiakban ld. 7. 8. és 9. kísérlet).

4. A projekt keretében végzett munka részletes ismertetése 4.1. Elővizsgálatok3 Az elővizsgálatok keretében két kísérletet végeztünk, első alkalommal termékenyítésre kerülő tenyészüszőkben (1. kísérlet), illetve a laktáció korai időszakában levő, első inszeminálású tehenekben (2. kísérlet). 1. kísérlet A kísérletben azt vizsgáltuk, hogy tejhasznosítású üszőkben az első inszeminálást követően (i) kb. 35 napon belül milyen gyakorisággal fordulnak elő embrionális / korai magzati veszteségek, továbbá e veszteségek összefüggnek-e (ii) a progeszteron koncentrációjának a posztovulációs időszakban megfigyelhető emelkedésével, valamint (iii) az állat energetikai egyensúlyával és/vagy tápláltsági állapotával, illetve az ezekről tájékoztató egyes metabolikus és endokrinológiai mutatóknak a termékenyítés időpontjában mért szintjével. Anyag és módszer A vizsgálatokat a nyári időszakban, a b-i tehenészet növendéküsző-telepén, Holstein fríz fajtájú, 14-15 hónapos korú és 365-470 kg testtömegű, közepes, vagy annál jobb tápláltsági állapotú (kondíció-pontszám, BCS: 3,0), korábban már legalább egyszer ivarzott tenyészüszőkön (n=60) végeztük. Az állatok tartása, takarmányozása és szaporodásbiológiai gondozása, valamint az ivarzók kiválogatásának a rendje az átlagos hazai üzemi viszonyokat tükrözte. Az üszők ivarszerveit a kísérletbe vonáskor klinikai módszerekkel (rektális tapintás, vaginoszkópia) megvizsgáltuk. Ivarszervi elváltozások esetén az állat nem került bevonásra. A kísérletbe állításkor mértük az állatok testtömegét, és Skidmore és mtsai (1997) módszerével egy öt fokozatú skálán 0,25 pont pontossággal pontoztuk a tápláltsági állapotukat (body condition score, BCS). A ciklust előzetesen szinkronizáltuk4, majd az állatokat a gesztagén implantátum eltávolítása után 56 órával inszemináltuk (fix idejű inszeminálás, fix AI)5. A vemhességet, illetve az EM előfordulását a (i) 36. napon végzett ultrahang-echográfiás (UH) vizsgálat, (ii) az egyidejű3 4

5

A Támogatási Szerződésben alkalmazott jelölés: ELŐ Szintetikus gesztagén (norgesztomet) hatóanyag-tartalmú Crestar (Intervet) készítménnyel végzett 9 napos kezelés, az implantátum eltávolítása előtt két nappal luteolitikus dózisban alkalmazott PGF2 (Prosolvin, Intervet) injekcióval, a gesztagén forrás eltávolításával egyidejűleg pedig 400 NE eCG-vel kiegészítve (a gyári előírások szerinti, standard kezelés). Valamennyi esetben standard (egyetlen, ismerten jó tenyészértékű és fertilitású bika azonos ejakulátumából származó) mélyhűtött spermával.

6


leg gyűjtött vérplazma-mintából történő vemhességspecifikus protein-B (PSPB) meghatározás (Biopryn® ELISA teszt, BioTracking LLC, Moscow, ID, US), ill. (iii) a termékenyítés után 4560 nappal végzett rektális tapintás (RP) módszerével vizsgáltuk. A metabolikus (energetikai) státusz minősítésére egy alkalommal, a fix AI idején került sor, egyes metabolikus hormonok [tiroxin (T4), trijód-tironin (T3), inzulin, inzulin-szerű növekedési faktor-1 (IGF-1) és leptin], illetve metabolitok [nem eszterifikált zsírsav (NEFA) és OHbutirát (BHB)] perifériás vérben mért szintjének a meghatározásával. A gesztagénforrás eltávolításától kezdődően hét napon át naponként kétszer (azaz 12 óránként), a 8-14. napon 24 óránként, majd ezt követően a 16., 19, 21, 23. és 36. napon egy-egy alkalommal vérmintát gyűjtöttünk. A mintákból meghatároztuk a progeszteron (P4) koncentrációját (a sárgatest kialakulásának, a luteinizáció intenzitásának a nyomon követése, posztovulációs P4 profil), továbbá – csak a hét napon át naponként kétszer gyűjtött mintákból – a domináns / preovulációs tüsző jelenlétét és hormontermelő képességét minősítő 17β-ösztradiol (E2) szintjét (E2 profil). Sárgatest (CL) / működő luteinszövet jelenlétére utaló jeleként értékeltük a kb. 3.2 nmol/l fölötti P4 szintet. A vemhesülés lehetőségére utalt, ha az állat vizsgált inszeminálására (fix AI) a ciklus tüszőfázisára jellemző alacsony (<3.2 nmol) P4 szint mellett került sor, ezt követően azonban 2-6 napon belül már emelkedett (3.2 nmol/l) P4 koncentrációt mértünk. A vemhesülés, ill. az embrionális / korai magzati elhalás diagnosztikai kritériumait az 1.1. táblázatban foglaltuk össze. 1.1. táblázat: A vemhesülés, illetve az embrionális / korai magzati elhalás (továbbiakban: EM) 1. kísérletben alkalmazott diagnosztikai kritériumai. A gesztagén-megvonást követő 16-23. nap 36. nap P4 P4 (nmol/l) (nmol/l) PSPB UH ech. 1-14. nap: a P4 szintje a vemhesülés lehetőségére utaló Nem vemhesült Min. 1 min--Negatív Negatív / tában: < 3.2 ivarzás Vemhesült + +  3.2 Mindvégig: Embrióelhalás (EM),  3.2 bizonyított36-45. nap + +  3.2 bizonyított23-35. nap + Negatív --feltételezett23-35. nap Negatív Negatív ---

45-60. nap RP Negatív / ivarzás + Negatív Negatív Negatív

Eredmények és megbeszélés A P4 profil alapján biztonsággal felismerhető volt az az összesen 8 egyed (13 %), amely – a ciklus-szinkronizációra adott szabálytalan ovariális válasz (n=6), emelkedett P4-szint mellett végzett (azaz túl késői) inszeminálás (n=1), ill. az ovuláció és sárgatest-képződés elmaradása (n=1) miatt – a vizsgált termékenyítésből biztosan nem vemhesülhetett (ezek adatait a továbbiakban a terjedelmi korlátok miatt nem elemezzük). A további állatokban (n=52=87 %) a P4 profilnak a gesztagén-megvonást követő első 14 napon megfigyelt alakulása lehetővé tette a vemhesülést. Az E2 profil alakulása jól szinkronizált tüszőfejlődésről, illetve időben bekövetkezett ovulációról tanúskodott. Közülük később valóban vemhesnek bizonyult 28, nem vemhesült 21. A 16-23. napon mért emelkedett P4 szintek, valamint a 36. napi PSPB határozás és UH vizsgálat eredményei mindössze 3 esetben (5 %) vetették föl (EM feltételezett23-35. nap; n=2) vagy bizonyították (EM bizonyított23-35. nap; n=1) a 23-35. napon bekövetkezett embrióelhalás lehetőségét. A 36. napon végzett vemhességi tesztek (PSPB,

7


UH) eredménye teljes mértékben egyezett a 45-60. napi rektális vizsgálatokéval, azaz a 3645/60. nap között magzatvesztés egyetlen esetben sem fordult elő. A vemhesek BCS-e és leptin szintje alacsonyabbnak bizonyult, mint a nem vemhesülteké (BCS: 3,10,2 ill. 3,30,3 P=0,014; plazma leptin: 7,311,37 ill. 8,031,03 ng/ml, P=0,043). Az egyéb hormonok és metabolitok plazmaszintjében ugyanakkor nem tapasztaltunk lényeges különbségeket. Valamennyi mutató a növendéküszőkre jellemző élettani határértéken belülinek bizonyult: közülük kiemelendő a leptinnek (5,28 - 10,39 ng/ml), az inzulinnak (>10,0 IU/l) és különösképpen az IGF-1-nek (154,1 – 436,6 ng/ml) az e korcsoportra jellemző, viszonylag magas szintje. A inszeminálás utáni kb. 60. órától (azaz a fix AI-t követő 2. nap estéjétől) kezdődően az azt követő kb. 7. napig a vemhes egyedekben szignifikánsan vagy tendenciózusan magasabb P4 szinteket mértünk, mint a nem vemhesült egyedekben (P=0,001 és 0,098 között). A termékenyítés utáni 8. naptól a luteolízisig (16-17. nap) terjedő időszakban e különbségek kiegyenlítődtek (1.1. ábra). 1.1. ábra: A posztovulációs progeszteronszintemelkedés üteme (xSEM) a vemhesült (n=28) és a nem vemhesült (n=21) üszőkben.

A közepes kondíciójú üszőket alacsonyabb, de még a testzsír-depók jelentős mértékű triglicerid-telítettségére utaló leptin szint, és magasabb vemhesülési arány jellemezte, mint a közepesnél jobb tápláltsági állapotú társaikat (plazma leptin, BCS3,0: 7,311,32 ng/ml, BCS3,5: 8,120,97 ng/ml, P=0,016; vemhesülési arány, BCS3,0: 23/35=66 %, BCS3,5: 5/17=29 %, P<0,05). Adataink arra utalnak, hogy tenyészüszőkben az embrionális elhalások döntő hányada nagy valószínűséggel már a fogamzás utáni első néhány napon megtörténik, ezek azonban az alkalmazott módszereinkkel nem detektálhatóak. A kb. 23-36. nap közötti veszteségek aránya ugyanakkor elmarad a laktáció 2-3. hónapjában első alkalommal termékenyített tehenekben megfigyelhetőtől (részleteiben ld. később). A tehenekben tapasztalthoz (Mann és mtsai, 2005; Robinson és mtsai, 2005, 2008) hasonlóan a luteinizáció / posztovulációs P4-emelkedés mértéke üszőkben is összefügg a vemhesülés valószínűségével. A P4-emelkedés üteme már az ideálisnak tekintett értéknél kissé jobb tápláltsági állapotú (BCS3,5) egyedekben is vontatottabbnak bizonyult, mint a közepes kondíciójúakban (BCS3,0), ami egyben magasabb leptin és inzulin szintekkel is párosult. A post-AI 3. napi P4 koncentráció negatív korrelációban állt a plazma leptin szintjével, míg nem mutatott összefüggést az egyéb metabolikus és hormonális paraméterekkel. Spicer és Francisco (1997, 1998) in vitro granulosa és theca interna sejtkultúrákon szerzett tapasztalatainak ismeretében mindezek in vivo körülmények között is megerősítik azt a feltételezést (Smith és mtsai, 2002), hogy az energetikai egyensúly fennállta esetén elsősorban a testzsír-depók lipidtelítettségének a fokát tükröző (Dalevaud és mtsai, 2001; Chilliard és mtsai, 2005), viszonylag magas (szuprafiziológiás?) leptin szinteknek, illetve a jóltáplált egyedekre jellemző magas inzulin szintnek (inzulin rezisztencia?) a főemlősökben tapasztalhatóhoz hasonlóan esetenként kérődzőkben is negatív hatása lehet az ovarialis

8


steroid produkcióra. Ovariális rendellenességek (policisztás ovarium szindróma) háttereként ehhez hasonló, hyper-leptinaemiával és az egész test inzulin érzékenységének a csökkenésével magyarázott elváltozásokról a korábbiakban pre-menopausalis korú nőbetegekben számoltak be. Háziemlősökben szerzett hasonló megfigyelésekről nincs tudomásunk. A posztovulációs P4szintemelkedés kondíció-függő különbségeinek a kialakulásához emellett természetesen hozzájárulhat a progeszteronnak a jobb tápláltsági állapot / magasabb energiaszintű takarmányozás esetén sokak által feltételezett (Hruska és mtsai, 1991; Wiltbank és mtsai, 2006), gyorsabb és/vagy nagyobb mértékű metabolizációja, inaktiválódása is. Feltételezésünk szerint a jelenség kiváltásában ezen túlmenően szerepe lehetett a szokottnál melegebb nyári időszaknak, amelynek hatása a jobb tápláltsági állapotú üszőkben (ezen állatok kisebb hőleadó képessége révén) fokozottan érvényesülhetett. 2. kísérlet A kísérlet során azt vizsgáltuk, hogy nagy tejtermelésű tehenekben az ellés utáni első inszeminálást követően (i) milyen gyakorisággal figyelhetők meg a 20-35. napi embrióelhalásra / korai magzatvesztésre utaló P4 profilok, továbbá e veszteségek összefüggnek-e (ii) a P4 koncentrációjának a posztovulációs időszakban megfigyelhető emelkedésével, (iii) hurutos-gennyes / gennyes endometritis előfordulásával, valamint (iv) az állat tápláltsági állapotával, illetve az energetikai státuszáról tájékoztató egyes metabolikus és endokrinológiai mutatókkal. A termékenyítést megelőzően az állatok ciklusát az un. Ov-synch protokoll két változatának valamelyikével (azaz: GnRH inj.- 7 nap – PGF2 inj. – 48 óra – GnRH vagy hCG inj.; továbbiakban: GPG ill. GPH kezelés), vagy 14 napos időközzel végzett kétszeri PGF2 kezeléssel (kontroll; továbbiakban: PP kezelés) indukáltuk / szinkronizáltuk, ami lehetőséget teremtett annak vizsgálatára is, hogy (v) a második GnRH kezelés hCG-vel történő helyettesítése befolyásolja-e a posztovulációs P4-szintemelkedés ütemét. Anyag és módszer A vizsgálatokra két nagyobb tehenészetben (továbbiakban K üzem ill. P üzem), Holstein fríz fajtájú, az 1-7. ellésük után levő, a ciklusindukció/szinkronizáció kezdetén anyagforgalmi vagy egyéb szervi megbetegedések kórjelző klinikai tüneteit nem mutató teheneken került sor (a vizsgálatokba bevont teljes állatlétszám: K üzem: n=180; P üzem: n=90; klinikai endometritis és/vagy mastitis előfordulását nem tekintettük kizáró tényezőnek). Az állatok tartásának, takarmányozásának és szaporodásbiológiai gondozásának technológiai színvonala, valamint az ivarzók kiválogatásának a rendje az átlagos hazai viszonyokat tükrözte (P üzem), vagy azt lényegesen meghaladta (K üzem). Az állományok átlagos laktációs tejtermelése a K üzemben lényegesen több volt, mint a P üzemben. Az involúció ellenőrzésére mindkét üzemben azonos módon (rektális tapintás és vaginoszkópia), állatonként legalább kétszer, az ellés utáni 6-10. és 28-35. napon sor került. Az involúció bakteriális szövődményei – puerperalis metritis (<14. nap) illetve klinikai endometritis (>14. nap) (diagnosztikai kritériumok: Földi és mtsai, 2006; Pécsi és mtsai, 2006) – esetén az állatok intrauterine antimikrobiális (puerperalis metritis: 2-4 g oxitetraciklin6; klinikai endometritis: 0,5 g cefapirin7) kezelésben részesültek, amelyet a szükség szerint a tünetmentesség eléréséig többször megismételtünk. Az üzemekben rendelkezésre álló, egy kb. 10 hetes perióduson belül megellett teheneket a komplikációktól mentes ellés után 4-6 nappal randomizálva három, azonos létszámú (üzemenként 3 x 15 állat, vagy ennek többszöröse), kb. üzemenként megegyező korösszetételű és előző laktációs tejtermelésű csoportot alakítottunk ki. A csoportokban az állatok ciklusát – az ellés utáni 45-59. 6 7

Tetera-Bol méhpálca (CP-Pharma, Németország) Metricur susp. (Intervet, Angers, Franciaország)

9


(PGP, GPH), illetve 39-53. napon kezdve a kezeléseket– az alábbiak szerint indukáltuk / szinkronizáltuk: GPG kezelés: Ov-Synch protokoll (GnRH inj.8 – 7 nap múlva: PGF2 inj.9 – 48 óra múlva: GnRH inj.8); GPH kezelés: módosított Ov-Synch protokoll (GnRH inj.8 – 7 nap múlva: PGF2 inj.9 – 48 óra múlva: 3000 NE humán chorion gonadotropin (hCG10) Chorulon inj., INTERVET). PP kezelés (kontroll): 14 napos időközzel alkalmazott két PGF29 kezelés. Az állatok mesterséges termékenyítésére (AI) a GPG ill. GPH csoportban az ivarzási tünetek jelentkezésétől függetlenül, a PGF2 beadása utáni 56-72. órában (fix idejű inszeminálás, fix AI); a kontroll (PP) csoportban pedig a második PGF2 injekció beadásától számított 5 napon belül megfigyelt ivarzás idején (továbbiakban együttesen: vizsgált AI). A kezelések időzítéséből következett, hogy a vizsgált AI-ra az ellés utáni 55-70. napon került sor. Az állatok kondícióját az 1. kísérletben is alkalmazott módon az ellés után 1-3 és 28-35 nappal becsültük és pontoztuk. Az energetikai státusz minősítésére egyes metabolikus hormonok (T4, T3, inzulin, IGF-1 és leptin), illetve metabolitok (NEFA, BHB és összkoleszterin [TCh]) perifériás vérben mérhető szintjének a meghatározásával, egy alkalommal, a vizsgált AI-t követő 5. napon került sor. Az ellés utáni első ovulációnak / a petefészek ciklikussá válásának, ill. petefészek-működés kezelések előtti acikliás vagy ciklikus jellegének a vizsgálata a kb. 7. naptól kezdődően hetenként háromszor gyűjtött tejminták progeszteron (P4) koncentrációjának a meghatározásán alapuló egyedi post partum P4 profil segítségével történt. A P4 meghatározására szolgáló rendszeres tejmintagyűjtést a ciklusindukció / szinkronizáció idején hetenként háromszor, az utolsó (GnRH / hCG / PGF2) kezelés időpontjában, ezt követően 12 napon át naponként, majd a fix AI utáni 36. napig ismét hetenként háromszor megismételtük (post-AI P4 profil). Az eredmények elemzése lehetőséget teremtett a luteinizáció intenzitását tükröző posztovulációs P4-szintemelkedés mértékének a becslésére, ill. az esetleges embrionális / korai magzati veszteségekre utaló P4 profiloknak az azonosítására. 2.1. táblázat: A vemhesülés, illetve az embrionális / korai magzati elhalás (továbbiakban: embrióelhalás, EM) 2. kísérletben alkalmazott diagnosztikai kritériumait. A ciklusindukció/szinkronizációt követő 16-23. nap 24-36. nap 36. nap 45-60. nap P4 (nmol/l) P4 (nmol/l) PSPB UH ech. RP 1-14. nap: a (zsírtalanított tejmintából meghatározott) P4 szintje a vemhesülés lehetőségére utaló Nem vemhesült Min. 1 mintáNegatív / Negatív /   ban: < 1,5 ivarzás ivarzás Vemhesült + +  1,5  Embrióelhalás (EM), bizonyított36-45. nap

Mindvégig  1,5

feltételezett23-35. nap Jelölések:

8 9 10

 nem jellemző

Mindvégig  1,5 Luteolysis  min. 1 min. . tában: < 1,5

 a módszer nem állt rendelkezésre

Receptal inj. (Intervet, Angers, Franciaország) ProsolvinTM inj. (Intervet, Angers, Franciaország) Chorulon inj. (Intervet, Angers, Franciaország)

10



+

Negatív



Negatív

Negatív

+ pozitív;


A vizsgált inszeminálások eredményességét (i) a post-AI P4 profil, (ii) az AI utáni 36. napon végzett transzrektális ultrahang-echográfiás (UH) vizsgálat, valamint (iii) a termékenyítés után 45-60 nappal végzett rektális tapintás módszerével végzett vemhességvizsgálat alapján ítéltük meg. Sárgatest (CL) / működő luteinszövet jelenlétére utaló jeleként értékeltük a (zsírtalanított) tejmintákban mért kb. 1,5 nmol/l fölötti P4 szinteket. A vemhesülés lehetőségére utalt, ha az állat vizsgált inszeminálására a ciklus tüszőfázisára jellemző alacsony (<1,5 nmol) P4 szint mellett került sor, ezt követően azonban 2-6 napon belül már emelkedett (1,5 nmol/l) a P4 koncentrációja. A vemhesülés, ill. az embrionális / korai magzati elhalás diagnosztikai kritériumait a 2.1. táblázatban foglaltuk össze. Eredmények és megbeszélés A kísérlet céljára az ellést követő napokban kiválasztott összesen 270 állatból 236 (87 % megoszlás: GPG: n=79 GPH: n=81 PP: n=76) bizonyult értékelhetőnek. A K üzemben a tehenek tejtermelése a laktáció korai szakaszában korábban érte el a maximum értéket,, petefészekműködésük később vált ciklikussá, illetve a ciklusindukciós/szinkronizációs kezelés kezdetén közülük több volt a még acikliás egyed, mint a P üzemben, ahol a laktációs tejtermelési csúcs csak később jelentkezett. Mivel azonban a három kezelési csoport állatai üzemenként arányosan oszlottak meg, csaknem azonos volt a három állatcsoport korösszetétele, előző laktációs tejtermelése, és tápláltsági állapota (BCS), illetve annak ellés utáni változása. A laktáció első hónapjaiban kb. megegyezett az átlagos tejtermelésük is (adatok nem részletezve). Hasonló volt továbbá a 28-35. napon, vagy ezt követően megállapított hurutos-gennyes / gennyes endometritisek11 száma és aránya (31/79=39 %, 33/81=41 % ill. 32/76=42 %) is. Ezen elváltozás előfordulása magasabb volt ugyan az általában megfigyelhetőnél, az arányos megoszlás azonban lehetővé tette a három állatcsoport reprodukciós adatainak reális összevetését. A vizsgált termékenyítésekből bekövetkező vemhesülést ez esetben is csak szabályos postAI P4 profil (ld. 1. kísérlet) mellett figyeltünk meg. A szabályos posztovulációs P4 profilú állatok előfordulási aránya a GPH, ill. a GPG kezelések után valamennyivel magasabb volt, mint a kétszeri PGF2 kezelést kapók között (2.2. táblázat). E különbség nagyrészt abból származott, hogy a kísérleti kezelés kezdetéig még acikliás állatok a kétszeri PGF2 kezelés után értelemszerűen továbbra is acikliás maradtak, ezzel szemben a GPG és a GPH csoportban ezek jelentős hányada is ovulálhatott (adatok nem részletezve). Az egyéb rendellenes posztovulációs P4 profilok előfordulásában viszont nem tapasztaltunk a kezelésekkel kapcsolatba hozható lényegesebb különbségeket (az adatokat nem részletezzük). Hasonlóan az 1. kísérletben tapasztalthoz a vizsgált AI-ból vemhesült állatokat ez esetben is intenzívebb luteinizációról tanúskodó, gyorsabb ütemű posztovulációs P4-szintemelkedés jellemezte (ld. később is). A szabályos P4 profilú állatok P4 szintjének a vizsgált AI-t követő emelkedési ütemében ugyanakkor – várakozásainkkal ellentétben – nem figyeltünk meg az egyes kezelésekkel összefüggésbe hozható lényegesebb eltéréseket (az adatokat nem részletezzük). A vizsgált AI-ból újravemhesült állatok aránya GPH csoportban volt a legmagasabb, a kétszeri PGF2 kezelés után pedig a legalacsonyabb, a különbség azonban nem volt szignifikáns (2.2. táblázat). A 23-35. napon bekövetkezett embrióelhalásra/ korai magzatvesztésre utaló P4 profilokat (az 1-14. napon szabályos P4 profilú) állatok 7-9 %-ában figyeltünk meg, elsősorban a korábbiakban hurutos-gennyes / gennyes endometritis tüneteit mutató egyedekben. A 36. napon UH vizsgálattal igazolt vemhesülések közül a 45-60. napig azonban mindössze egyetlent veszítettünk el (2.2. táblázat). Embrióelhalásra/ korai magzatvesztésre utaló P4 profilokat elsősorban a kezelések előtt

11

Hurutos-gennyes / gennyes (endo)metritis: az ellés utáni 28. napon a hüvelyen át ürülő váladékban a gennytartalom becsült aránya 50 % (Földi és mtsai, 2006; Pécsi és mtsai, 2006).

11


még acikliás petefészek-működésű állatokban figyeltünk meg, az esetek kis száma azonban e szempontból nem teszi lehetővé a reális értékelést (az adatokat nem részletezzük). Az ellést követő 28-35. nap között, vagy azt követően a hurutos-gennyes / gennyes endometritis klinikai tüneteit mutató tehenek vizsgált AI-ból származó (16/96 = 17 % ill. 81/150 = 54 % P0,001), illetve 150 napon belüli (42/96 = 44 % ill. 135/150 = 90 % P0,001) vemhesülési adatai egyaránt messze elmaradtak az e megbetegedés tüneteit nem mutató egyedekéitől (2.2. táblázat). Ez a tendencia a ciklusindukció / szinkronizáció módjától függetlenül valamennyi csoport állatait jellemezte, bizonyítva hogy a jelen kísérlet körülményei között az újravemhesülés valószínűsége jelentős mértékben az uterinális tényezőktől – az állatok klinikai állapotának, illetve korábbi tapasztalatainknak (Dohmen és mtsai, 1995, Huszenicza és mtsai, 1999) az ismeretében elsősorban a méh Archanobacterium pyogenes (A. pyogenes korábbi néven: Actinomyces pyogenes) fertőzöttségétől – függött. A mindhárom kezelési séma részeként alkalmazott PGF2 befecskendezés nyilván elősegítette a méh öngyógyulását, hatása viszont nem volt elegendő a – klinikai tünetek alapján feltételezhetően hosszasan fennálló – intrauterinális A. pyogenes fertőzés következményeinek teljes eliminálására. 2.2. táblázat: Újravemhesülés, embrióelhalás / korai magzatvesztés lehetőségére utaló P4 profilok (a 2. kísérlet teheneinek az adatai alapján) GPG kezelés (n=82) P4 profil a ciklusindukciót / szinkronizációt követő első 14 napon: 14 = 17 % Az ovuláció  luteinizáció hiányára utaló (P0,05) 55 = 67 % A vemhesülést megengedő, szabályos (P0,10) Az utóbbiak közül: 1) A vizsgált AI-ból vemhesült 32 A teljes állatlétszám arányában 39 % A szabályos P4 profilú állatok arányában 58 % Ebből: a 28. napon: endometritis1 előfordult 5/31 = 16 % nem fordult elő 27/51 = 53 % P0,001 2) A vizsgált AI-t követően: embrióelhalás (EM), bizonyított36-45. nap --feltételezett23-35. nap 4 (7 %) Ebből: a 28. napon: endometritis1 3 előfordult 1 nem fordult elő 150 napon belül: újravemhesült összesen 58 A teljes állatlétszám arányában 71 % Ebből: a 28. napon: endometritis1 előfordult 12/31 = 39 % nem fordult elő 46/51 = 90 % P0,001 Az elléstől az újravemhesülésig eltelt idő 91,6 a (nap, x  SD) LSD5%: 10,2 nap ( P0,05) 24,1 A 150 napon belüli újravemhesüléshez szükséges insze1,75 minálások száma (x  SD) ns 0,74 1

GPH kezelés (n=81)

PP kezelés (n=83)

9 = 11 % 58 = 72 %

23 = 28 % 46 = 55 %

37 46 % 64 %

28 34 % 61 %

6/33 = 18 % 5/32 = 16 % 31/48 = 65 % 23/51 = 45 % P0,001 P0,001 --5 (9 %)

1 (2 %) 3 (7 %)

3 2 59 73 %

2 2 60 72 %

16/33 = 48 % 14/32 = 44 % 43/48 = 90 % 46/51 = 90 % P0,001 P0,001 88,1a 98,4a 25,3 27,4 1,70 1,91 0,71 0,66

Hurutos-gennyes / gennyes (endo)metritis: az ellés utáni 28. napon a hüvelyen át ürülő váladékban a gennytartalom becsült aránya 50 %.

12


Az állatok kondíció-pontszámában (BCS), valamint az egyes metabolikus hormonok és metabolitok plazmaszintjében megmutatkozó tendenciák a laktáció csúcsán álló, az ellés utáni NEB mélypontján már túljutott, klinikailag tünetmentes egyedekre jellemző viszonyokat tükrözték. Az állatok mindegyikét viszonylag alacsony BCS (3,25), illetve leptin (<4,00 ng/ml), inzulin (<10,0 IU/l) és IGF-1 (<100,0 ng/ml) szint jellemezte (e hormonok koncentrációja szinte minden egyedben – a laktáció csúcsán álló tehenekre jellemző módon – az 1. kísérlet tenyészüszőiben mértnek mindössze csak kevesebb, mint kb. fele-harmada volt). A NEFA és a BHB plazmában mért aktuális szintje a mintavétel időpontjában már túljutott a laktáció korábbi időszakára jellemzőnek tartott csúcsértékein. A kezelésekre adott ovariális válaszreakciók metabolikus hátterét vizsgálva semmiféle világos összefüggés nem mutatkozott a szabálytalan P4 profillal jellemezhető, a korai ovuláció / késedelmes AI, illetve a késlekedő vagy hiányos luteolysis jeleit mutató állatok adataiban. A vizsgált termékenyítéskor a kezelésekre szabályos P4 profillal reagáló állatok jobb – de legfeljebb csak közepes (BCS: 3,25) – tápláltsági állapotúak voltak, illetve viszonylag magasabb leptin, T3, IGF-I, inzulin és TCh, valamint alacsonyabb NEFA és BHB szintek jellemezték azokat, mint a kezelések nyomán nem ovuláló (anovulációs) egyedeket (az adatokat a terjedelmi korlátok miatt nem részletezzük). A kezelésre szabályos ovariális választ adó egyedek közül kizárólag azoknak volt esélyük a vemhesülésre, amelyek már a fix AI utáni 3. napon a CL működés markáns jeleit mutatták (P4:  1,50 nmol/l). Utóbbi egyedek tendenciózusan magasabb (abszolút értelemben, a tenyészüszők adataihoz viszonyítva azonban még mindig alacsony, <4,00 ng/ml) leptin, és szignifikánsan magasabb IGF-I szinteket mutattak, mint az ovuláció utáni 3. napon CL működés jeleit (P4:  1,50 nmol/l) még nem mutató egyedek. A post-AI 3. napi P4 koncentráció pozitívan korrelációban állt a plazma IGF-I, T3 és TCh szintjével, negatív összefüggést mutatott a BHB koncentrációval, és nem korrelált a plazma leptin szinttel. Ezek az összefüggések azonban csak az esetben voltak nyilvánvalóak, ha a szabályos ovariális válaszú, az anovuláció és a késlekedő luteinizáció jeleit mutató állatok adatait együttesen elemeztük (az adatokat nem részletezzük). Eredményeink összegzéseként megállapítható, hogy a 23-35. napi embrióelhalás a laktáció csúcsán álló, az ellés után első alkalommal inszeminált tehenekben feltételezhetően sokkal gyakoribb, mint növendék üszőkben. A (feltehetően tartósan fennálló, esetenként azonban tünetszegény, mindössze szubklinikai stádiumú) endometritis / méhűri A. pyogenes fertőzöttség (részleteiben: Huszenicza és mtsai, 1999; Gilbert és mtsai, 2005; Sandholm és mtsai, 2005; Földi és mtsai, 2006) mellett a posztovulációs P4-szintemelkedés üteme részét képezi azon tényezőknek, amelyek a laktáció első heteiben lényegesen befolyásolják az újravemhesülés valószínűségét, illetve az embrióelhalás / korai magzatvesztés gyakoriságát. Az ellés utáni első inszeminálást követően a P4szintemelkedés üteme összefüggést mutat a negatív energiaegyensúly mértékét jelző bizonyos endokrinológiai jellemzőkkel (pl. a plazma IGF-1 szintjével), nincs azonban korrelációban a plazma leptin koncentrációjával. Mindezek arra utalnak, hogy más-más (kór)élettani mechanizmusok magyarázhatják e jelenség üszőkben, ill. tehenekben történő előfordulását: utóbbiakban talán nem a P4 produkció csökkenésének, hanem inkább e hormon fokozott metabolizációjának (Hruska és mtsai, 1991; Wiltbank és mtsai, 2006) lehet meghatározó jelentősége. Közvetlen gyakorlati jelentőséggel bír az a megállapításunk, hogy a ciklusindukció/szinkronizáció ismert módszereinek a megválasztásával (pl. GPG protokoll, és/vagy e kezelési sémában a második GnRH hCG-vel történő helyettesítése) a posztovulációs P4-emelkedés üteme sajnálatos módon nem befolyásolható.

4.2. Diagnosztikai célú vizsgálatok12 12

3-5. kísérlet; a Támogatási Szerződésben alkalmazott jelölés: DG-1 és DG-2.

13


A projekt diagnosztikai részében három irányban tájékozódtunk. Két – a laktáció csúcsán álló, az ellés után első alkalommal termékenyített tehenekben, nagyrészt egyező protokoll alapján végzett – kísérletben arról tájékozódtunk, hogy az embrionális, illetve a korai magzati veszteségek előfordulása (i) összefüggésbe hozható-e az ellés után előforduló negatív energiaegyensúly egyes klinikai kémiai és endokrinológiai jellemzőivel, (ii) bizonyos vírusfertőzésekkel, illetve (iii) az energia- és a mikroelem-ellátottság, és az azzal feltételezetten elválaszthatatlanul összefüggő lipidperoxidációs státusz gyakran előforduló zavaraival (3. és 4. kísérlet). Egy felmérő vizsgálatban (5. kísérlet) összesen 14 állomány mikroelem-ellátottságáról, ill. az esetleges hiányállapotok okozta szaporodási zavarok előfordulásáról kívántunk tájékozódni. 3. kísérlet Anyag és módszer A feltételezett komplex – vírusos és metabolikus – eredet összefüggéseinek a vizsgálatára különböző bovin herpeszvírusokkal (azaz fertőző rhinotracheitis vírussal: IBR BoHV-1, valamint Movár herpeszvírussal, BoHV-4) terhelt három állományban került sor. A vizsgálatokra két közepes ill. egy nagyobb méretű tehenészetben (továbbiakban N és O üzem ill. S üzem), Holstein fríz fajtájú, a 2. kísérletnél leírtaknak megfelelő szempontok szerint kiválogatott tehenek fölhasználásával került sor. Az állatok tartásának, takarmányozásának és szaporodásbiológiai gondozásának technológiai színvonala, valamint az ivarzók kiválogatásának a rendje az átlagos hazai viszonyokat tükrözte (S üzem), vagy azt lényegesen meghaladta (N és O üzem). A kondíció becslése, az involúció lefolyásának ellenőrzése és a szövődmények kezelése a 2. kísérletben ismertetett módszerekkel történt. Az üzemekben rendelkezésre álló, a tél végi - koratavaszi időszakban megellett teheneket a komplikációktól mentes ellés után 4-6 nappal vontuk be a kísérletbe. Az O és S üzemben az ellés utáni 63-77. napon kezdve a kezelést az állatok petefészek-működését az Ov-Synch (GPG) protokoll (GnRH inj. – 7 nap múlva: PGF2 inj. – 48 óra múlva: GnRH inj.; ld. 2 kísérlet) szerint indukáltuk / szinkronizáltuk. Az N üzem tehenein ezt megelőzően kétszeri PGF2 kezelést is alkalmaztunk (Prov-synch módszer: az ellést utáni 31-38. napon kezdve 14 napos időközzel végzett kétszeri PGF2α kezelés, amelyet 14 nappal később egy, az előbbiekben részletezett Ovsynch protokoll szerint elvégzett GnRH – PGF2 –GnRH kezeléssorozat követett). Elképzeléseink szerint a kezelések nyomán az állatok első termékenyítésére az ivarzási tünetek jelentkezésétől függetlenül, az Ov-Synch protokoll szerint elvégzett PGF2 kezelés utáni 56-72. órában [azaz az ellés utáni 67-74. (N üzem), ill. 68-88. (O és S üzem) napon)] került volna sor (fix idejű inszeminálás, fix AI). Az N és S üzemben az állatokat a kísérleti tervnek megfelelően inszeminálták. Az O üzem személyzete azonban egy sajnálatos félreértés nyomán a kezelési periódus bármely időpontjában ivarzó állatokat termékenyítette, ill. ha a tehén a PGF2 kezelés utáni 56-72. órában nem mutatott ivarzási tüneteket, azt nem inszeminálták. Mindezekre csupán a kísérlet befejeződése és a minták feldolgozása után, az eredmények feldolgozásakor derült fény. Ezen állatainak egységes szempontok szerinti értékelése nem lehetséges, adataikat e jelentés keretében ezért a továbbiakban nem részletezzük. Az energetikai és lipidperoxidációs státusz minősítésére az ellés utáni 1., 2., 3. és 5. héten, valamint a fix AI előtti PGF2 kezelés időpontjában, továbbá a fix AI-t követő 5. napon került sor. A perifériás vérből meghatározott paraméterek: Energetikai státusz: NEFA, BHB; Lipidperoxidációs státusz: malondialdehid (MDA), redukált glutation (GSH), glutationdiszulfid (GSSG), glutation-peroxidáz (GSH-Px). A petefészek-működés ciklikussá válásának, a fix AI-t követően luteinizáció intenzitásának (posztovulációs progeszteron-szint emelkedés), és az esetleges embrionális / korai magzati veszteségekre utaló post-AI P4 profilok nyomon követése a 2. kísérletben ismertetett módszerekkel tör14


tént. E célból az ellés utáni kb. 7. naptól kezdődő, a ciklusindukció / szinkronizáció idejére is kiterjedő időszakban hetenként háromszor, az utolsó kezelés időpontjában, ezt követően (az ovuláció és a posztovulációs luteinizáció idején) 12 napon át naponként, majd a fix AI utáni 36. napig ismét hetenként háromszor gyűjtöttünk tejmintákat, amelyekből maghatároztuk a progeszteron (P4) koncentrációját13. A vírushordozó (BoHV-1, BoHV-4) lymphocyták számának a meghatározása az alábbiak szerint történt: Vérminták gyűjtése: az ellés utáni 1. és 5. héten, valamint a fix AI előtti PGF2 kezelés időpontjában; Laboratóriumi feldolgozás: Az Na-EDTA-val alvadásában gátolt vérmintákból (i) a fehérvérsejtek kitisztítása (Ficoll-pacque módszer), (ii) a sejtek számolása és DNS-tartalmuk kivonása, majd (iii) annak kettős (nested) PCR módszerrel történő, a BoHV-1 és BoHV-4 jelenlétének igazolására irányuló vizsgálata. A vemhesség megállapítása ill. az esetleges embrionális / korai magzati elhalás diagnosztizálása a tehenek (i) kétszeri (a post-AI 33-4214. és 65-70 napon végzett) transzrektális UH vizsgálatával (3.1. - 3.5. kép), valamint (ii) a vérszérum PSPB koncentrációjának a sorozatos (a post-AI 25., 32., 39., 46., 53., 60. és 66. napon15) végzett meghatározásával (Biopryn® ELISA teszt, BioTracking LLC, Moscow, ID, US) történt.

3.1. kép: 42 napos vehem UH képe

13

3.2. kép: Vemhességi sárgatest (42.nap)

Azaz a post partum P4 profil, a luteinizáció intenzitását tükröző posztovulációs P4-szintemelkedés, illetve az esetleges embrionális / korai magzati veszteségekre utaló post-AI P4 profil meghatározása.

14

Az első UH vizsgálat alkalmával üresnek talált teheneket a méh és petefészek állapota alapján szükség szerint kezeltük. 15 Megjegyzés: A 39. nap után PSPB határozás céljából vérmintákat már csak az első UH vizsgálat során vemhesnek talált állatokból vettünk.

15


3.3. kép: 70 napos vehem ultrahangos képe

3.4. kép: Placenta, karunkulák (70.nap)

3.5. kép: Folyadékot és szöveti maradványokat tartalmazó méh (embrionális veszteség) Az értékelés során az embrionális / korai magzati veszteségeket bekövetkezésük ideje szerint két csoportra osztottuk: (1) korábbi, a sikeres AI-tól a vemhesség 42. napjáig bekövetkező, ill. (2) későbbi, a vemhesség 70. napjáig bekövetkező veszteségek. E vizsgálatok értékelésekor a korábbi formát a két vemhességvizsgálati eljárás, a termékenyítés utáni 25. és 32. napon meghatározott PSPB koncentráció alapján felállított diagnózis és a 33-42. napon végzett ultrahangvizsgálat eredménye közötti eltérés jelentette. A termékenyítés 33-42. napján az ultrahangvizsgálattal vemhesnek talált állatok vemhességének meglétét a 65-70. nap között ismételten megvizsgáltuk, így a később bekövetkező magzati veszteségeket is nyomon tudtuk követni. Szerencsés esetben UH vizsgálattal közvetlen formában is föl lehetett ismerni a vehem degenerálódását majd pusztulását (3.5. kép). Az 1. és 2. kísérletben szerzett tapasztalatok alapján abban az esetben tekintettük a vehem elvesztését valósnak, ha a tejmintákból meghatározott P4 koncentrációk alakulása alapján a vemhesülés egyébként lehetségesnek látszott. Eredmények és megbeszélés Az N üzemben 4 ill. 16, az S üzemben pedig 26 ill. 35 első alkalommal ellett ill. idősebb tehén adatai bizonyultak értékelhetőnek. a) Vemhesülés. Az embrió- és magzatelhalás különböző formái.. Metabolikus stressz Az N üzemben 11 állat vemhesült (55 %). A vemhesség 42. napjáig bekövetkezett embrióelhalást / korai magzatvesztést összesen két esetben (egy első laktációs ill. egy idősebb tehénben, azaz a vemhességek 18 %-ában) figyeltünk meg. Az ellés utáni 1. és 5. héten mért BHB és NEFA koncentrációja között szoros pozitív korrelációt (r=0,634 ill. 0,614) tapasztaltunk, azonban nem találtunk semmiféle statisztikailag igazolható összefüggést a vemhesülés, az embrionális veszteség mértéke és a vérplazma BHB és NEFA koncentrációja között. Az S üzemben a vemhesülés mértéke 38 % (n=23) volt. A vemhesültek között az embrionális elhalás 35 % (n=8), a magzati veszteség mértéke 9 %-ot (n=2) ért el. Az első ellésű, fiatal tehenekben a vemhesülési arány mindössze 31 % (n=8) volt, az embrionális és magzati veszteség együttes mértéke pedig elérte az 50 %-ot (n=4). Az idősebb tehenekben a vemhesültek aránya magasabbnak (n=15=43 %), a veszteség mértéke, pedig alacsonyabbnak (n=6=40 %) bizonyult. Az ellés utáni 2. ill. 5. héten mért BHB és NEFA koncentrációja között ez esetben is közepes pozitív korrelációt (r=0,59 ill. 0,58) tapasztaltunk. Statisztikailag igazolható összefüggést a vemhesülés, az embrionális veszteség mértéke és a vérplazma BHB koncentrációja között nem találtunk. Az ellés utáni 1. és 5. heti NEFA koncentráció szignifikánsan különbözött a vemhes és az üresen maradt üszők esetében. Ugyanezt az összefüggést a tehenek csoportjában nem tudtuk igazolni.

16


b) A vírushordozó (BoHV-1, BoHV-4) lymphocyták számának meghatározása16 Az N üzem 20, és az S üzem 58 állatának mintái kerültek feldolgozásra. Megállapítható volt, hogy az N üzem alacsonyabb termelési szinten ugyan, stresszhatásoktól kevéssé terhelt környezetben termel, míg az S üzem magasabb termelési szinten erős stresszhatások (főleg anyagcsere stressz) között dolgozik. A vírus aktiválódások és a szaporodásbiológiai adatok egyaránt alátámasztották a fentieket. IBR BoHV-1. A fertőző rhinotracheitis vírusának kimutatására irányuló vizsgálataink nem hoztak értékelhető eredményt, aminek több oka lehet. Az egyik ok a PCR módszer viszonylagos érzéketlensége. Az IBR vírusának DNS-e az élővilágban páratlan 71%-os guanin/citozin aránnyal rendelkezik, ami a G/C közötti 3 hidrogénkötés miatt nagyon nehézkessé teszi a DNS molekula két szálának elválasztását, ami a PCR reakció alapja. A szükséges denaturáció eléréséhez dimetil-szulfoxidot kell 10%-ban a reakcióelegyhez adni, vagy a denaturáció hőmérsékletét 95-96°C-ra emelni. Mindkettő csökkenti az enzim hatékonyságát, illetve működési idejét. A szerzők szerint (Ros és mtsai, 2001) ez az (az irodalomban a legjobb) IBR PCR rendszer is „csak” 60-70 virion kimutatására alkalmas. Az IBR PCR csökkent hatékonyságú működése okozta gondokat tovább növelte N üzemben a vírusaktiválódások viszonylagos hiánya és gyengesége, az S üzemben pedig a már megkezdett vakcinázás. Az is a vizsgálatok során lett nyilvánvaló, hogy a kísérleti terveink szerinti IBR vizsgálatokat már mentesítő telepeken nem érdemes elvégezni, a vakcinázás által kiváltott vírussemlegesítő ellenanyagok vírusaktiválódást gátló hatása miatt.

vírus/fvs.

S üzem, BHV-4 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0

35

vemhes

70 kisérleti napok

embrió vesztés

105

150

üres

Movár herpeszvírus BoHV-4: Ezzel a vírussal kapcsolatban érdekes eredményeket kaptunk, és az IBR-el ellentétben semmi sem zavarta a tervezett vizsgálatokat. Ez a vírus minden hazai nagyüzemi szarvasmarhatelepen jelen van, sehol sem vakcináznak ellene, nem is lehet, vírus semlegesítő ellenanyagok nem képződnek. A kettős PCR rendszer hatékonyan, specifikusan működő módszer 1-2 viriont biztosan mutat ki (Egyed és mtsai, 1996). Eredményeinket részletesebben a két ábra és két táblázat foglalja össze. Elmondható, hogy határozott, egyértelmű, statisztikailag megalapozott (S üzem: 35 üres, 13 vemhes, 10 embrióvesztett, N üzem: 7-9 üres és vemhes állat) kapcsolatot találtunk a vírusaktiválódások száma, nagysága (a vírus által fertőzött fehérvérsejtek száma) valamint az állatokat érő stressz, és a következményes szaporodási zavarok között. A vemhesült, és vemhüket megtartó tehenekben alig tudtuk a vírust kimutatni, míg a szintén alacsony BoHV-4 szintű embrióvesztéses csoportban pont a 70 nap (inszeminálás) körül találtuk vírusaktiválódások jeleit. Az üresen maradt tehenekben 35/29 esetben aktiválódott a vírus sokszor nagyon magas fertőzött fehérvérsejt számot eredményezve. Valószínűleg egy eddig ismeretlen jelenséget tudtunk kimutatni, azaz a BoHV-4 vírus az állatokat érő stressz (és a következményes szaporodási zavarok) markereként használható, sőt a stresszhatás akár szám16

A jelentésnek ez a fejezete a Dr. Egyed László vezetésével az MTA Állatorvos-tudományi Kutatóintézetében dolgozó munkacsoport munkája

17


szerűsíthető is (kimutatott vírusok, vagy fertőzött fehérvérsejtek száma, kimutatott vírus DNS menynyisége). A vírusaktiváció stressz-szel való szoros kapcsolatát az is jelzi, hogy a 0. napi (ellés után vett) minta minden állatban az ellés, mint általános erős stressz jeleként, aktív BoHV-4 fertőzés jeleit mutatta, függetlenül az állat későbbi szaporodásbiológiai státuszától. Bár mindkét telepen a vírusaktiválódás elléskor (a kísérlet 0. napja) a később üresen maradt vállatokban is jelentősen magasabb volt, mint a vemhesülteknél.

vírus/1000 fehérvérsejt

N üzem 150 100 50 0 0

35

70

105

150

kísérleti napok vemhes

üres

3.4. táblázat (S üzem): 100 ezer fehérvérsejtben kimutatott BoHV-4 virionok száma (átlag) Kísérleti napok

0.

35.

70

105.

150

Vemhes

93.33

1.54

6.15

6.66

2.05

Embrióvesztés (9)

83.33

2.66

74.66

2.66

2.66

Üres

229

120

874.4

276

465

(13)

(35)

3.5. táblázat (N üzem): 100 ezer fehérvérsejtben kimutatott BoHV-4 virionok száma (átlag) Kísérleti napok

0.

35.

70

105

150

Vemhes

(9)

31.84

1.48

8.14

8.14

1.48

Üres

(7)

118

9.52

10.47

9.52

10.47

Vizsgálataink során az S üzemben azt találtuk, hogyha egy tehénben ezer fehérvérsejtben a BoHV-4 száma a 2-3-t eléri, vagy meghaladja, az állat biztosan nem vemhesül. Így ez a PCR módszer akár diagnosztikai módszernek is minősülhet. Előre meg lehet mondani, hogy 1-2 héten belül egy adott állat biztosan nem alkalmas a vemhesítésre, de az, hogy biztosan melyik fog vemhesülni, nem mondható meg. Bár ez a BoHV-4 valószínűleg nem oka a vemhességi problémáknak, erőteljes, tartós aktiválódása során a szaporodási szervrendszer szöveteinek hámsejtjeiben és a fehérvérsejtekben való replikálódása miatt akár másodlagos kórokozónak is tekinthető, ami a meglévő szaporodási zavarokat, immunszupressziót tovább súlyosbíthatja.

18


További vizsgálatok fogják eldönteni, hogy ez a víruskimutatás milyen körülmények, feltételek között, és milyen hatékonyan alkalmazható a gyakorlatban markerként a tehénre ható metabolikus stressz jelzésére, számszerűsítésére, adott esetben pedig a szaporodásbiológiai állapot pontos előrejelzésére. c) Lipidperoxidációs státusz17 A vizsgálatok során megállapítást nyert, hogy a szaporodásbiológiai állapot, kiemelten a korai embrióvesztés és vizsgált lipidperoxidációs és antioxidáns paraméterek között sem statisztikailag értékelhető, sem tendenciaszerű összefüggés nem áll fenn. A két vizsgált állomány között emellett jelentős tendenciaszerű összefüggések mutathatók ki, amelynek hátterében a jelen vizsgálat során nem mért az eltérő antioxidáns ellátottság állhat. A korai embrióvesztés egyik lehetséges kóroki tényezője, a BoHV-4 fertőzöttség hatását a fehérvérsejtek fent jelzett paramétereinek mérésével rögzítettük a két vizsgált állományban. Megállapítottuk, hogy a szaporodásbiológiai állapot függvényében az egyik konzorciumi tag (MTA Állatorvostudományi Kutatóintézete) által részünkre preparált fehérvérsejtek MDA tartalma a korai post partum időszakban (29-33 nap) rendkívül alacsony, míg az embrióvesztés szempontjából különösen kritikus – a termékenyítést követő 30-40 nap – időszakban az ebbe a csoportba sorolt állatoknál rendkívül magas volt. A fehérvérsejtek GSH tartalma és különösen GSHPx aktivitása viszont a későbbiekben feltehetően embrióvesztett állatokban a korai post partum időszakban viszont kiemelkedően magas volt. A fenti eredmények hátterében az állhat, hogy úgy a korai post partum, mind az embrióvesztés szempontjából kritikus, a termékenyítést követő 30-40 napos időszakokban a BHV fertőzöttség függvényében (különösen az 1 és 2 fertőzöttségi csoportba sorolt) magas MDA és GSH tartalmat, továbbá kiemelten az 1 fertőzöttségi csoportba sorolt állatoknál a korai post partum időszakban rendkívül magas GSHPx aktivitást mértünk. Az eredmények alapján levonható az a következtetés, hogy az embrióvesztés korai, a termékenyítést megelőző, jelzésére – a rendkívül nagy egyedi variancia miatt csak nagyszámú kontrollméréseket követően – alkalmas lehet feltehető BHV fertőzöttség mellett a fehérvérsejtek lipidperoxidációs és antioxidáns státuszának felmérése is.

4. kísérlet Az embrionális, illetve a korai magzati veszteségek előfordulásának az ellés után előforduló negatív energiaegyensúly egyes klinikai kémiai és endokrinológiai jellemzőivel, ovarialis következményeivel mutatott közvetlen összefüggését vizsgáltuk. Anyag és módszer A vizsgálatokat négy közepes méretű, az átlagos vagy annál kedvezőbb hazai viszonyokat tükröző üzemben, a 2. kísérletben leírtak szerint kiválogatott, többször ellett Holstein fríz tehenekben folytattuk le. A kondíció becslése, az involúció lefolyásának ellenőrzése és a szövődmények kezelése a 2. kísérletben ismertetett módszerekkel történt. A tél végi - tavaszi időszakban megellett teheneket a komplikációktól mentes ellés után 4-6 nappal vontuk be a kísérletbe. Az ellés utáni 63-77. napon kezdve a kezelést az állatok petefészek-működését az Ov-Synch (GPG) protokoll (GnRH inj. – 7 nap múlva: PGF2 inj. – 48 óra múlva: GnRH inj.; ld. 3 kísérlet) szerint indukáltuk / szinkronizáltuk. Az állatok első termékenyítésére az ivarzási tünetek jelentkezésétől függetlenül, az Ov-Synch protokoll részét képező PGF2 kezelés utáni 56-72. órában került sor (fix idejű inszeminálás, fix AI). 17

A jelentésnek ez a fejezete a Dr. Mézes Miklós vezetésével a SzIE Mezőgazdasági és Környezettudományi Karának Takarmányozástani Tanszékén dolgozó munkacsoport munkája

19


Az energetikai státusz minősítésére az ellés utáni 1., 2. és 5. héten, valamint a fix AI előtti PGF2 kezelés időpontjában, továbbá a fix AI-t követő 5. napon vérmintákat gyűjtöttünk, amelyből az alábbi metabolikus mutatókat határoztuk meg: NEFA, BHB, karbamid-N. A petefészek-működés ciklikussá válásának, a fix AI-t követően luteinizáció intenzitásának (posztovulációs progeszteron-szint emelkedés), és az esetleges embrionális / korai magzati veszteségekre utaló post-AI P4 profiloknak a nyomon követése a 2. és 3. kísérletben18, a vemhesség megállapítása ill. az esetleges embrionális / korai magzati elhalás diagnosztizálása pedig a 3., ill. 7., 8. és 9. kísérletben19 ismertetett módszerekkel történt. Eredmények a) A petefészek-működés ciklikussá válása Összesen 155 állat post partum P4 profilja bizonyult értékelhetőnek. A telepek között nem volt lényeges különbség az első 35. napon ovuláló egyedek arányában (Chi2 próba, p= 0,29), ezért az adatokat együttesen is értékeltük. Az állatok mintegy fele (80 állat, 52%) ovulált az ellés utáni 35. napig, amely megegyezik korábbi hazai üzemi vizsgálatok eredményeivel (Huszenicza és mtsai., 1988). A kísérlet során minden esetben alkalmazott ciklusindukció/szinkronizáció nem tette lehetővé az ellés utáni időszakban esetleg előforduló egyéb ovariális funkciózavarok (pl. a CL működésének zavarai, anovulációs ciszták kialakulása, stb.) előfordulásának a vizsgálatát. Mivel csak 2. ellésű vagy idősebb állatokat vizsgáltunk, nem tapasztaltunk összefüggést az ellésszám és az első ovuláció időpontja között. A petefészekműködés ciklikussá válásának az ideje nem függött össze az előző laktációs tejtermeléssel sem. A post partum időszakban az állatok korlátozott energia-ellátottsága befolyásolhatja az ellés utáni acklia hosszát. Anyagunkban ennek ellenére sem találtunk határozott metabolikus különbségeket a már a 35. nap előtt, ill. a csak ezt követően ciklikus petefészek-működésűvé váló állatok között (az adatokat a terjedelmi korlátok miatt nem részletezzük). b) A vizsgált (fix idejű) termékenyítésből történő vemhesülés A termékenyítés körüli P4 eredmények alapján a szinkronizációs protokollra nem megfelelően reagáló állatok termékenyítési eredményeit nem értékeltük. Így összesen 133 állat eredményeit vettük figyelembe. Összesen 32 tehén vemhesült (24%). Embrió mortalitást összesen 13 állatnál (10%) diagnosztizáltunk, ebből 7 esetben feltételezett, 6 esetben pedig bizonyított EM állt a háttérben. Az EM eloszlása telepenként némileg különbözött (A1 üzem: n=1; D1 üzem: n=5; M1 üzem n=4; N1 üzem: n=3; Chi2 próba p=0.154). Az vizsgált fix idejű (első) termékenyítésre vemhesülő állatok ellés utáni BHB és NEFA szintje kissé alacsonyabb volt azoknál az állatokénál, amelyek később üresnek bizonyultak. Megjegyzendő azonban, hogy e paraméterek a legtöbb esetben az élettani határértéken belül maradtak. Az állatok 78%-a a vizsgálat egész idején normál (<1.00 mmol/l) BHB szinttel rendelkezett, 17%-a volt átmenetileg hiperketonémiás és csupán 5 % volt tartósan hiperketonémiás (a vizsgált valamennyi mintában: BHB > 1.00 momol/l). A laktáció kezdetén tartósan vagy átmenetileg hiperketonémiás állatok alacsonyabb arányban vemhesültek, mint a normál ketonémiás csoportban, azonban ez az arány nem volt szignifikáns (Fisher próba, P<0.05) (4.1. táblázat). A vérplazma karbamid-N szintje néhány esettől eltekintve a szaporodásbiológiai szempontból kri-

Azaz: tejminták gyűjtése a P4 koncentrációjának a meghatározására az ellés utáni kb. 7. naptól kezdődődően, a ciklusindukció / szinkronizáció idejére is kiterjedően hetenként háromszor, az utolsó kezelés időpontjában, ezt követően (az ovuláció és a posztovulációs luteinizáció idején) 12 napon át naponként, majd a fix AI utáni 36. napig ismét hetenként háromszor. 19 Azaz: a tehenek (i) kétszeri (a post-AI 33-42. és 65-70 napon végzett) transzrektális UH vizsgálatával, valamint (ii) a vérszérum PSPB koncentrációjának a sorozatos (a post-AI 25., 32., 39., 46., 53., 60. és 66. napon) végzett meghatározásával (Biopryn® ELISA teszt, BioTracking LLC, Moscow, ID, US). Az értékelés részletes leírását ld. a 7., 8. és 9. kísérletnél. 18

20


tikusnak tekinthető 7,00 mmol/l alatt volt, és ennek megfelelően nem is mutatott összefüggést a fogamzási eredményekkel. 4.1. táblázat: A vizsgált fix AI eredményessége a normoketonémiás (valamennyi mintában: BHB <1.00 mmol/l), valamint a tartósan hiperketonémiás (valamennyi mintában: BHB >1.00 mmol/l), illetve csak átmenetileg hiperketonémiás állatokban. Normoketonémia Üres Vemhes EM összesen

65 (62.5%) 27 (26%) 12 (11.5%) 104 (78%)

Átmeneti hiperketonémia 17 (77.3%) 4 (18.2%) 1 (4.5%) 22 (17%)

Tartós hiperketonémia 6 (85.7%) 1 (14.3%) 7 (5%)

Adatainkat összegezve tehát a vizsgált üzemekben ez ellés utáni első ovuláció az állatok mintegy felében a kb. 35 nap előtt bekövetkezett. A korábban ovuláló állatok az ellés utáni 1., 2. és 5. héten alacsonyabb BHB, NEFA szintekkel rendelkeztek, azonban ezek a különbségek nem voltak szignifikánsak. Az ovuláció-szinkronizációt követő vemhesülés esélye magasabb volt azokban a tehenekben, amelyekben az ellés utáni hetekben alacsony BHB és NEFA szinteket mértünk. Az EM-nek a módszereinkkel kimutatható formáját tartósan hiperketonémiás tehenekben nem figyeltük meg, és átmenetileg hiperketonémiás egyedekben is csak szórványosan. Mindezek alapján arra következtetünk, hogy az energetikai státusz, az energiaegyensúly hiánya az embrióelhalásnak elsősorban a korai, a vemhességnek az anyai szervezet részéről történő felismerését (kb. 16. nap) megelőzően lejátszódó formáját idézi elő. E forma előfordulásának az egyértelmű bizonyítása azonban a jelenleg rendelkezésre álló módszerekkel nem lehetséges.

5. kísérlet20 A projekt keretében végzett diagnosztikai munka során adatokat gyűjtöttünk továbbá 14 hazai szarvasmarha állományból az etetett TMR minták és a pigmentált fedőszőr mikroelem (szelén, vas, réz, cink, mangán) tartalmára vonatkozóan. Tekintetbe véve a pigmentált fedőszőrre vonatkozó nemzetközileg elfogadott normálérték tartományokat (Anke és Risch, 1979), valamint a hazai (Magyar Takarmánykódex, 2004) és a nemzetközileg elfogadott (NRC, 1990; DNG, 2002) szükségleti értékeket (5.1. táblázat), jelentős eltérést, hiányt, mindkét esetben csak a szelén és a cink esetében észleltünk. A szelén esetében utalni kell arra is, hogy az ellátottsági szintek a hazai szükségleti értéknek megfeleltek, az NRC által nagy tejtermelésű teheneknek javasolt szinttől viszont általában elmaradtak. A fedőszőr esetében számos esetben észlelt alacsony értékek (5.2. táblázat) feltehető oka egyrészt az alkalmazott készítmények rossz biológiai hatékonysága, míg a cink esetében a tejelő tehenek szervezetében fennálló, számos esetben nem diagnosztizált, krónikus gyulladásos folyamatok állhattak. Ennek alapján javaslatot dolgoztunk ki a jelen projekt keretében kifejlesztésre kerülő propilénglikol- illetve védett zsírkészítmény (részleteiben. ld. 6. és 7. kísérlet) mikroelem, kiemelten szelén, kiegészítésére vonatkozóan. Tekintettel azonban arra a tényre, hogy a nagy biológiai hatékonyságú szerves szelénkészítmények, szeleno-metionin, alkalmazását a gazdasági állatok takarmányozásában az Európai Unió csak a közelmúltban engedélyezte (1750/2006/EK) a szerves szelén kiegészítőt tartalmazó készítmény kialakítása, illetve engedélyeztetése jelenleg még folyamatban van.

20

A jelentésnek ez a fejezete a Dr. Mézes Miklós vezetésével a SzIE Mezőgazdasági és Környezettudományi Karának Takarmányozástani Tanszékén dolgozó munkacsoport munkája

21


5.1. táblázat: Tejelő tehenek mikroelem szükséglete és az ellátottsági érték egyes hazai üzemek (n=14) TMR értékei alapján Mikroelem (mg/kg sz.a.) Vas Réz Mangán Cink Szelén

Előkészítő Szükséglet DNG NRC 70 n.a. 20 n.a. 60 n.a. 60 n.a. 0,3 n.a.

MT n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.

Fogadó Szükséglet NRC DNG 50 n.a. 10 n.a. 40 n.a. 40 n.a. 0,3 n.a.

MT 50 5 60 60 0,1

25-30 liter Szükséglet NRC MT 50 50 10 8 40 50 40 50 0,3 0,1

Nemzetközi Takarmánykódex: NRC, DNG Magyar Takarmánykódex: MT n.a.: nem adja meg

22

30-35 liter Szükséglet NRC MT 50 50 9 8 50 60 50 60 0,3 0,1

Előkészítő Mért érték átlag  SD 78  26 11  4 55  14 67  2 0,08  0,02

Fogadó Mért érték átlag  SD 72  14 11  3 50  6 71  8 0,11  0,04

25-30 liter Mért érték átlag  SD 68  23 12  6 48  9 66  9 0,20  0,04

31-35 liter Mért érték átlag  SD 66  12 12  7 56  4 68  7 0,24  0,04


5.3. táblázat: Tejelő tehenek pigmentált fedőszőrének mikroelem tartalma 14 hazai üzemben Üzem Állatszám Termelés Vas Réz Mangán Cink Szelén liter/nap mg/kg szőr Javasolt normálérték: 5-6 115-120 0,25-0,30  50 6 1. 9 28 55  12 5,8  6,2  1,6 96  8,4 0,12  1,8 0,04 2. 12 26 58  10 6,4  6,4  2,6 107  9,6 0,21  1,6 0,06 3. 15 24 65  8 7,4  0,7 103  5,5 0,10  6,5  2,2 0,02 4. 10 31 68  2 5,2  0,4 103  3,8 6,1  0,20  0,6 0,09 5. 11 27 51  4 8,2  2,2 7,8  110  0,22  0,3 18,1 0,01 6. 8 31 71  26 4,5  6,6  0,3 84  18,8 0,18  2,1 0,03 7. 18 25 75  20 4,8  7,2  2,6 106  0,10  0,8 14,3 0,02 8. 10 29 75  23 4,9  5,1  0,4 102  3,7 0,20  2,2 0,08 9. 11 30 49  3 6,4  0,2 85  9,6 6,1  0,10  0,3 0,01 10. 8 35 75  2 5,1  0,6 89  3,6 4,8  0,20  2,5 0,03 11. 15 24 66  3 5,8  1,9 84  2,3 4,9  0,16  0,8 0,05 12. 10 25 50  2 6,9  2,1 90  3,4 5,6  0,14  0,3 0,03 13. 8 29 55  6 5,2  0,6 86  9,6 5,3  0,18  1,8 0,06 14. 10 33 72  14 5,1  6,6  1,9 106  9,7 0,21  0,7 0,09

4.3. Az embrionális, illetve a korai magzati veszteségek csökkentése gyógyszeres kezelésekkel21 6. kísérlet Számos szerző – köztük Hayirli és mtsai (2002), ill. Selvaraju és mtsai (2002) – előzetes tapasztalatai alapján a NEB metabolikus és ovariális következményeinek lassú felszívódású (slow release, ún. lente) inzulin kezelés segítségével történő megelőzhetőségét, valamint kezelhetőségét, mint a szaporodásbiológiai gondozás lehetőségét vizsgáltuk munkánkban. Első lépésként egy igen részletes mintavételi protokoll segítségével a módszer hatékonyságát és ártalmatlanságát kívántuk bizonyítani (előkísérlet). Pozitív tapasztalatok szerzése esetén ezt követően szélesebb körű további vizsgálatokat terveztünk, kevésbé intenzív mintagyűjtéssel, de nagyobb számú állat bevonásával.

21

A Támogatási Szerződésben alkalmazott jelölés: TR1.

23


Anyag és módszer Kísérleti körülmények. Kísérleti állatok: A vizsgálatokat a kb. 1800 tehenet tartó K tehenészetben, Holstein fríz fajtájú, januárban ellett, 3-4. laktációját kezdő, az előző 305 napos laktáció során >7500 kg tejet termelő tehenein (n=24) végeztük. Az állatok tartása, takarmányozása és szaporodásbiológiai gondozása, valamint az ivarzók kiválogatásának a rendje az átlagos hazai üzemi viszonyokat tükrözte. Az állatok ivarszerveit a kísérletbe vonáskor, továbbá a puerperális metritis előfordulásának (7-11. nap) időpontjában, majd pedig a 28-35. napon klinikai módszerekkel (rektális tapintás, vaginoszkópia) megvizsgáltuk. Lényegesebb klinikai elváltozások (pl. puerperális metritis, általános tünetekben is megnyilvánuló mastitis, klinikai endometritis) esetén az állat nem került bevonásra (1-3. nap), vagy adatait kihagytuk az értékelésből (n=9). Ciklus/ovuláció-szinkronizáció; első inszeminálás: az ellés utáni 50. nap körüli időpontban kezdve a kezelést, az állatok ovulációját a kereskedelmi forgalomban kapható készítményekkel22 végzett Pre-Synch protokoll (PGF2 inj. – 12 nap múlva: GnRH inj. – 7 nap múlva: PGF2 inj. – 48 óra múlva: GnRH inj.) szerint szinkronizáltuk, majd 17-24 óra múlva fix idejű inszeminálást (fix AI) végeztünk, valamennyi esetben standard (egyetlen, ismerten jó tenyészértékű és fertilitású bika azonos ejakulátumából származó) mélyhűtött spermával. Kísérleti inzulin kezelés: (1) Készítmény: Lassú felszívódású (slow release, ún. lente) inzulin (továbbiakban: SRI) kezelésként amerikai szerzők (Hayirli és mtsai, 2002) kedvező tapasztalatai nyomán egy eredetileg humángyógyászati célra kifejlesztett készítményt23 alkalmaztunk, intramuszkuláris injekció formájában, 0,15 NE/kg dózisban. (2) Elrendezés: A rendelkezésünkre álló állatok közül:  Az SRI-kezeltek (i) az ellés utáni első tüszőnövekedési hullámból származó domináns tüsző megjelenését követően, de még ovuláció feltételezett időpontját megelőzően (azaz az ellés utáni 10-13. napon), továbbá ismét (ii) a Pre-Synch protokoll szerinti második PGF2 kezelés időpontjában SRI kezelést kapott (értékelhető létszám: n=7).  A további (kontroll) tehenek egyik alkalommal sem részesült SRI kezelésben (értékelhető létszám: n=8). Kondícióbecslés / pontozás: Az ellés utáni 1-3. napon, 28-35. napon és 63-70. napon, az 1. kísérletben ismertetett módszerrel. Az állatok metabolikus (energetikai) státuszának a minősítése: Egyes metabolikus hormonok [tiroxin (T4), trijód-tironin (T3), inzulin, IGF-1 és leptin], illetve metabolitok [vércukor, nem eszterifikált zsírsav (NEFA) és OH-butirát (BHB)] perifériás vérben mért szintjének a meghatározásával: az ellés utáni (i) 1-3., (ii) 10-13. és (iii) 28-35. napon, valamint (iv) a fix AI idején gyűjtött vérmintákból. A petefészek-működés nyomonkövetése: (1) Az ellés utáni első ovuláció időpontjának a meghatározása / ciklikus petefészekműködés monitorozása: a kb. 7-10. naptól kezdődően, a fix AI utáni kb. 35. napig

Receptal ill. ProsolvinTM inj., Intervet AG, Angers, Franciaország 23 Humulin Ultralente Human Insulin 100 IU/ml, Eli Lilly Co, Indianapolis, IN, USA 22

24


hetenként 3 alkalommal gyűjtött tejminta progeszteron (P4) tartalmának a meghatározásán alapuló P4 profil segítségével. (2) A szinkronizált tüszőnövekedési hullámból származó domináns tüsző ösztrogéntermelő képességének a becslése / preovulációs LH-csúcs meghatározása: A második PGF2 kezelés időpontjában, majd ezt követően 36 órán át 8 óránként, majd további 32 órán át 4 óránként gyűjtött vérminták 17-ösztradiol (E2) tartalmának a meghatározásával (E2 profil). A második GnRH kezelés körüli időpontokban 4 óránként gyűjtött minták LH tartalmát is meghatároztuk (preovulációs LHcsúcs)24. (3) A posztovulációs progeszteron-szintemelkedésnek ill. a sárgatest (CL) működésének a nyomon követése: A második PGF2 kezelés időpontjában, majd ezt követően 10 napon egy-egy alkalommal vérmintát is gyűjtöttünk, amelyből meghatároztuk a progeszteron (P4) koncentrációját (posztovulációs P4-szintemelkedés). Vemhességvizsgálat: A (i) 36. napon végzett ultrahang-echográfiás (UH) vizsgálat, ill. (ii) a fix AI után 45-60 nappal végzett rektális tapintás (RP) segítségével. Értékelés: Sárgatest (CL) / működő luteinszövet jelenlétére utaló jeleként értékeltük a vérplazma kb. 3.2 nmol/l fölötti, ill. a tej 1,60 mmol/l fölötti P4 szintjét. A vemhesülés lehetőségére utalt, ha az állat vizsgált inszeminálására (fix AI) a ciklus tüszőfázisára jellemző alacsony (<3.2 nmol) P4 szint mellett került sor, ezt követően azonban 2-6 napon belül már emelkedett (3.2 nmol/l) P4 koncentrációt mértünk. Eredmények és megbeszélés A vércukor szintje, valamint a vérplazma NEFA és BHB koncentrációja, ill. inzulin, leptin, IGF-I, T4 és T3 tartalma valamennyi állatban az ellés utáni NEB-re utaló állapotot tükrözte. A SRI-kezelt ill. a kontroll tehenek adatai minden mintavételi időpontban teljes mértékben megegyeztek25. A P4 profil alapján a 13-18. napon – azaz az első tüszőnövekedési hullámból – ovulált 3 SRI-kezelt, ill. 4 kontroll tehén, és nem volt különbség az első ovulációk időpontjának az átlagában sem. Az alkalmazott Pre-Synch kezelés nyomán valamennyi – SRI-kezelt és kontroll – tehénben a második PGF2 kezelést követően jól kifejezett E2 termelést produkáló domináns tüsző, a második GnRH kezelés nyomán pedig erőteljes LH-szintemelkedés (preovulációs LH-csúcs) alakult ki. A második GnRH kezelést követő mintákban már jelentősen alacsonyabb E2 szintek voltak mérhetők. A plazma leptin szintjében ugyanakkor semmiféle diurnális jellegű, és/vagy az egyszeri SRI kezeléssel kapcsolatba hozható ingadozást nem tapasztaltunk, valamint (egységesen alacsony, 0,200-0,330 nmol/l közötti tartományban ingadozva) megegyeztek a preovulációs LH-csúcsot megelőzően, ill. az azt követően mért leptin koncentrációk is. A fix AI nyomán mindössze 2/7 (28 %) SRI-kezelt és 3/8 (37%) kontroll tehén vemhesült. A vemhesség anyai szervezet részéről történő felismerésének idején, vagy azt követően fellépő embrióelhalás gyanúját a P4 profilok egyetlen állatban sem vetették föl. 24

25

Az E2 és LH-határozás céljára gyűjtött mintákból az esetleges SRI-indukált, és/vagy diurnális ingadozás kimutatása céljából meghatároztuk a leptin koncentrációját és a vércukor szintjét is. Megjegyzendő, hogy a mintavételi protokoll nem, vagy nem kellő mértékben tette lehetővé az SRI-indukált azonnali glukóz-válasz monitorozását. Ez az információ a kisérlet célját illetően másodlagos volt, ill. egy még az alkalmazottnál is részletesebb mintavételezés már veszélyeztette volna az elővizsgálatok üzemi körülmények közötti kivitelezhetőségét.

25


A posztovulációs P4-szintemelkedés mértéke a vemhesültekben intenzívebb luteinizációról tanúskodott, mint a nem vemhesültekben. A SRI kezelés ugyanakkor semmiféle kimutatható hatással nem volt a luteinizáció ütemére. A sajnálatosan negatív tapasztalatokra tekintettel az adatok további részletezésétől eltekintünk. A SLI kezelés remélt jótékony hatásának az elmaradása a vizsgált állatok feltételezettnél nagyobb fokú inzulin-rezisztenciájával függhet össze, ami a dózis növelésével talán áttörhető lenne. Az alkalmazott 0,15 NE/kg-nél nagyobb dózis azonban egyes állatokban már a hypoglycaemia kockázatával járna, illetve anyagi vonatkozásai miatt semmiképp nem lenne gazdaságos. A 2. kísérletben szerzett tapasztalatok alapján úgyszintén nem eredményezte az első inszeminálások eredményességének költséghatékony növelését, ha az OvSynch protokoll során a második GnRH kezelést a posztovulációs P4szintemelkedés ütemének a fokozása céljából hCG-re cseréltük. Mindezek alapján a további gyógyszeres vizsgálatok takarékossági okból történő felfüggesztése, és a rendelkezésre álló anyagi forrásoknak a kísérleti takarmánykiegészítőkkel végzendő kísérletre történő koncentrálása mellett döntöttünk.

4.4. Az embrionális, illetve a korai magzati veszteségek csökkentése két kísérleti takarmány adalékanyag segítségével 26 Munkánk folytatásaként a SRI kezelés sikertelensége nyomán takarmányozási módszerekkel, két kísérleti takarmány adalékanyag segítségével próbáltuk meg az inzulin és IGF-1 produkciós rátájának, ill. plazmaszintjének, valamint az ettől remélhető szaporodásbiológiai előnyöknek a realizálását. A 7. kísérletben egy glukoneogenetikus hatásúnak remélt, újszerű kiszerelésű (porított formájú, ezáltal a takarmányadagba könnyen bekeverhető) propilénglikol tartalmú takarmány-adalékanyag, a 8. és 9. kísérletben pedig egy új (az e célra hagyományosan alkalmazott, de számos országban, így az EU országokban kifejlett kérődző állatok számára teljes mértékben tiltott halliszt helyett lenmag alapú) PUFA forrás tejtermelésre, szaporodóképességre, ill. az embrióelhalások előfordulására gyakorolt hatásáról kívántunk tapasztalatokat szerezni. 4.4.1. A két kísérleti takarmányadalék fejlesztése A két kísérleti takarmány adalékanyag, azaz egy-egy, a gyakorlatban könnyebben alkalmazható, szükség esetén mikroelem-kiegészítést is magában foglaló, (i) feltételezetten glukoneogenetikus hatású porított propilénglikol (PPG) készítmény, valamint (ii) egy lenmag alapú telítetlen zsírsavakat tartalmazó termék (PUFA kiegészítő) kialakítása és formulázása, valamint a kísérleti munkához szükséges mennyiség előállítása és biztosítása a konzorciumon belül az V.M.D. Állatgyógyászati Kft. feladata volt. A gyártmányfejlesztés részletei részben szabadalom tárgyát képezik, iparjogvédelmi okokról ezért jelen jelentésben annak részletei nem kerülnek ismertetésre. 4.4.2. A két kísérleti takarmány adalékanyag hatékonyságának a vizsgálata Ez irányú vizsgálatainkra nagyrészt megegyező, a 3. és 4. kísérletben kifejlesztett mintavételi és diagnosztikai protokollt alkalmazva, két hazai tehenészetben (porított propilénglikol, PPG kiegészítés: 7. kísérlet, MK üzemben; lenmag alapú PUFA kiegé-

26

A Támogatási Szerződésben alkalmazott jelölés: TR2, TR3 és KF1.

26


szítés: 8. kísérlet, D üzemben) került sor. A szerzett kedvező tapasztalatok megerősítése céljából a lenmag alapú PUFA kiegészítéssel végzett vizsgálatainkat a projekt utolsó évében megismételtük (9. kísérlet, N2 és A2 üzemben), az üzemi viszonyok alapján szükséges telep-specifikus mikroelem-kiegészítést is tervezve. Mivel a két készítmény etetésének a valós gyakorlati hasznáról kívántunk tájékozódni, nem idealizált, hanem a szükséges minimális feltételeket éppen biztosító üzemi helyszíneket választottunk, és nem volt célunk a táplálóanyag ellátás előzetes optimalizálása sem. Anyag és módszer, 7., 8. és 9. kísérlet Vizsgálatainkat egy-egy (7. és 8. kísérlet), ill. két üzem (9. kísérlet) Holstein-fríz fajtájú, a 2. laktáció kezdetén álló, a 2. kísérletben leírtak szerint kiválogatott teheneivel végeztük Az állatok a tavaszi-nyár eleji időszakban ellettek, tartásuk, takarmányozásuk és szaporodásbiológiai gondozásuk, valamint az ivarzók kiválogatásának a rendje az átlagos hazai üzemi viszonyokat tükrözte. A kondíció becslése, az involúció lefolyásának ellenőrzése és a szövődmények kezelése az üzemben szokásos szaporodásbiológiai gondozás részeként, a 2. kísérletben ismertetett módszerekkel történt. A teheneket a komplikációktól mentes ellés után 4-6 nappal vontuk be a kísérletbe. Az üzemben szokásos szaporodásbiológiai gondozás részeként az állatok petefészekműködését a 7. kísérletben az ellés utáni 60. nap körüli időpontban kezdett Ov-Synch (GPG) protokoll27, a 8. és 9. kísérletben pedig az ellés után 30-36 nappal megkezdett Prov-Synch protokoll28 szerint indukáltuk / szinkronizáltuk. Az első termékenyítésre az ivarzási tünetek jelentkezésétől függetlenül, szinkronizálási protokollok részét képező utolsó PGF2 kezelés utáni 56-72. órában – egységesen a kb. 70-80. napon – került sor (fix idejű inszeminálás, fix AI). 7.1. táblázat: A 7 kísérlet állatainak a takarmányfejadagja a szárazonállás idején, ill. a laktáció első hetében. Szárazonállás1 12 kg kukoricaszilázs ad libitum (8-10 kg) réti széna 1 kg búzakorpa 0,5 kg kukoricadara 0,5 kg napraforgódara 0.2 kg szárazonálló premix 1

Frissen ellett tehenek 20 kg kukoricaszilázs 1,5 kg réti széna 5 kg lucerna széna 2 kg roppantott nedves kukorica 6.8 kg tejelő táp 5 kg sörtörköly 1 kg védett fehérje koncentrátum 1,2 kg Nyír-Protamin Energy (védett zsír)

A vemhesség / szárazonállás utolsó kb. 14-16 napján (előkészítés időszak) a tehenek ezen kívül napi 2 kg Hepatoguard kiegészítőt is kaptak.

Kísérleti takarmányadalékok alkalmazása, 7 kísérlet: (1) Készítmény: Egy (szabadalmi okokból nem részletezett összetételű) porított formátumú, és ezért a takarmány-fejadagba könnyen bekeverhető propilénglikol (PPG) készítmény. (2) Elrendezés: A rendelkezésünkre álló állatok közül:  A PPG-kezeltek a vemhesség/szárazonállás utolsó kb. 14-16 napján (továbbiakban: előkészítés időszaka), továbbá az ellést követően 7-8 napon át napi 300

27 28

GnRH inj. – 7 nap múlva: PGF2 inj. – 48 óra múlva: GnRH inj.; (ld. 3 kísérlet is). Heti egy alkalommal induló programként 30-36 nappal az ellés után kezdve: 1. PGF2 + 14 nap: 2. PGF2 +12 nap: 1. GnRH + 7 nap: 3. PGF2 + 2 nap: 2. GnRH; fix AI: kb. 24 órával a 2. GnRH után.

27


g propilénglikolnak megfelelő mennyiségű kísérleti készítményt kaptak, a fejadagba naponként és egyedenként bekevert formában.  A további (kontroll) tehenek nem részesültek PPG kiegészítésben. A további részleteket illetően megegyezett a két állatcsoport takarmányfejadagja (ld. 7.1. táblázat). Kísérleti takarmányadalékok alkalmazása, 8. és 9. kísérlet: (1) Készítmény: Egy (szabadalmi okokból nem részletezett összetételű) lenmag alapú védett PUFA készítmény (Robit). (2) Elrendezés: A rendelkezésünkre álló állatok közül:  Az ellés után 1-3 nappal kezdve az etetést a PUFA-kezeltek a laktáció első kb. 100-120 napján olyan mennyiségű kísérleti készítményt kaptak, ami fejadag összes nyerszsír tartalmát kb. 6 %-ra egészítette ki. A védett zsírforrás az együtt tartott állatcsoport fejadagjába naponként került bekeverésre.  A további (kontroll) tehenek nem részesültek PUFA kiegészítésben, de hidrogénezett pálmaolaj alapú telített zsírforrások biztosításával izokalorikusizonitrogén-izoenergiás takarmányfejadagot kaptak. Az állatok metabolikus (energetikai) státuszának a minősítése: Egyes metabolikus hormonok [tiroxin (T4), trijód-tironin (T3), inzulin, IGF-1 és leptin], illetve metabolitok [vércukor (csak a 7. kísérletben), karbamid-N (csak a 8. és 9. kísérletben), továbbá a nem észterifikált zsírsav (NEFA) és OH-butirát (BHB) (mindhárom kísérletben)] perifériás vérben mért szintjének a meghatározásával: (i) az ellés előtt kb. 2 ill. (ii) 1 héttel (csak a 7. kísérletben) (iii) az ellés utáni első, (iv) második és (v) ötödik héten (mindhárom kísérletben), valamint (vi) a fix AI idején gyűjtött (mindhárom kísérletben) vérmintákból. A 8. és 9. kísérletben gyűjtött mintákból, meghatároztuk az állatok lipidperoxidációs státuszáról tájékoztató paramétereket (malondialdehid (MDA), redukált glutation (GSH), glutation-diszulfid (GSSG), glutation-peroxidáz (GSH-Px) is. A hasnyálmirigy-funkció, ill. állatok / perifériás szövetek inzulin érzékenységének a vizsgálata (csak a 7. kísérletben, reprezentáns számú állatban): Az iv. glukóz tolerancia tesztre (IVGTT)+ iv. inzulin tolerancia tesztre (ITT) adott glukóz- és inzulin válasz nyomon követésével, az ellés utáni 7-10. napon (részletek: ld. 7.2. táblázat). 7.2. táblázat: Az IVGTT + ITT kivitelezése (7. kísérlet) A reggeli fejést követően kb. 60 perc elteltével kezdjük meg a vizsgálatot, amelynek menete: Az állatok kiválasztása: PPG csoport (n= 7-10) és Kontroll (n= 7-10) Testtömegmérés a vizsgálat reggelén Alap vérminta (t0) levétele a glükózinfúzió beadását megelőzően A glukózterhelés elvégzése: Állatonként 0,15 g/ttkg glükóz infúzió (40%-os glükóz oldat), 3 percen belül, a v. epigastrica cranialis superficialisba fecskendezve (a szükséges mennyiség az előző napi mérlegelés eredménye alapján kiszámítva). Vérminta-vétel a glükózterhelést követő glukóz-, ill. inzulin-válasz meghatározására: az infúzió beadását követő 5., 15., 30., 45., 60., 75., 90., 120., 150., 180., és 210. percben a v. jugularisból Az inzulinterhelés elvégzése: A 210. perces vérvételt követően egy percen belül az állatnak intramuszkulárisan 0,1 NE/kg cink-inzulint fecskendezünk be. Vérminta-vétel az inzulinterhelést követő glukóz-, ill. inzulin-válasz meghatározására: a vérminták gyűjtését a továbbiakban még 3 órán keresztül, 30 perces időközökkel folytatjuk, azaz a glukóz infúzió beadását követő 240., 270., 300., 330., 360., 390., 420. és 480. percben további mintákat veszünk.

28


Májbiopszia, szubkután zsírszövet biopszia; a bioptátum molekuláris biológiai módszerekkel történő feldolgozása29: A 7. kísérlet IVGTT + ITT vizsgálatban részesült állatain (PPG-kiegészített: n=10; kontroll: n=7) közvetlenül e vizsgálatokat megelőzően (azaz az ellés utáni 7-10. napon) szubkután zsírszövet- és májbiopsziát is végeztünk. Meghatároztuk a bioptátum teljes lipid tartalmát, továbbá az állatok energiastátuszának pontosabb minősítése érdekében egy metabolikus hormon (leptin) és annak receptorainak (leptin receptor, rövid ill. hosszú forma [Ob-RS, Ob-RL]), illetve egy metabolikus enzim (1-es típusú dejodáz, DIO1) májbeli mRNS-expressziójának a mértékét A májbiopsziás mintavételt az állatok jobb oldalán, a 11. bordaköz és a csípőtarajkönyök egyenes metszéspontjában végeztük. A mintavétel helyét a mintavétel előtt polivinil-pirrolidon-jód oldattal30 fertőtlenítettük, majd procainnal31 infiltrálva érzéstelenítettük. A biopsziás tűvel kimetszett májszövet-mintát a mintavétel után azonnal folyékony nitrogénben fagyasztottuk, majd a laboratóriumi feldolgozásig -75 °C-on tároltuk. A májszövet-mintákból Chomczynski módszere alapján (Chomczynski és Sacchi, 1987) TRIzol reagenssel (Invitrogen) teljes RNS-t vontunk ki. A teljes RNS 3 µg-ját Moloney-Murine Leukemia Virus (M-MLV) reverz transzkriptáz enzim (Promega) és Oligo(dT)15 Primer (Promega) felhasználásával reverz transzkripciós reakcióban cDNSsé írtuk át. Az ismert szarvasmarha génszekvenciák (GenBank, National Center for Biotechnology Information) alapján a vizsgálni kívánt génekre a Light Cycler Probe Design Software 2.0 (Roche) segítségével primerpárokat (7.3. táblázat) terveztünk. 7.3. táblázat: A vizsgált gének szekvenciái és a tervezett primerpárok Gén

GenBank elérési szám

Bos taurus bétaaktin

NM173979

Bos taurus leptin

U50365

Bos taurus Ob-RS

AB199590

Bos taurus Ob-RL

AB199589

Bos taurus DIO1

AF318504

Primerpárok (Forward / Reverse) 5' CGTGACATCAAGGAGAAGCTCTGC 3' / 5' GATGGAGGGGCCGGACTCATCGTA 3' 5' GCAGTCCGTC TCCTCCAAAC AGAG 3' / 5' CATGTCCTGT AGTGACCCCT GCAG 3' 5' cgtttcatttatagcacgtcagtg 3' / 5' CAAAGAATGTCCGTTCTCTTCTGA 3' 5' AGGGTTCTAT TTGTATTAGT GACC 3' / 5' GAAATTTCCCTCAAGTTTCAAAAG 3' 5' ACATCGAAGAAGCACATGCATCAG 3' / 5' CTCCTGGAGCACATAGAGCCTCTC 3'

A primerpárokkal a megfelelő génszakaszokat polimeráz láncreakcióban (PCR) erősítettük ki. Először hagyományos PCR-készülék (Thermolyne Amplitron II) segítségével amplifikáltuk a keresett génszakaszokat (PCR ciklus: 94 °C 2 perc, (94 °C 40 mp, 56-58 °C 40 mp, 72 °C 40 mp) 35×, 72 °C 5 perc), majd a keletkezett termékeket 1%os agaróz gélben elektroforetizáltuk, és etídium-bromiddal (Sigma-Aldrich) festettük, majd ezt követően UV-fényben vizsgáltuk. A cDNS átírás hatékonyságát szarvasmarha 29

30 31

A project keretében ezt a munkát – a SzIE ÁoTK Szülészeti Tanszék és a Nagyállat Klinika munkatársaival, továbbá Dr. Gaál Tibor egyet. tanárral (SzIE ÁoTK, Belgyógyászati Tanszék és Klinika) szoros együttműködésben – a Dr. Bartha Tibor vezetésével a SzIE ÁoTK Élettani és Biokémiai Tanszékén dolgozó munkacsoport végezte. Betadine oldat (EGIS, Budapest) Minocain inj., 10 ml (EGIS, Budapest)

29


specifikus béta-aktin primerpár alkalmazásával ellenőriztük. Csak azokat a primerpárokat alkalmaztuk, amelyek megfelelő méretű és mennyiségű terméket adtak. A génexpresszió kvantitatív meghatározásához LightCycler 2.0 (Roche) valósidejű PCR berendezést használtunk. Minden egyes primerpárral végzett reakciót a valósidejű PCR körülményeire is optimalizáltunk. A valósidejű PCR ciklus: 95 °C 30 mp, (95 °C 0 mp, 56-62 °C 5 mp, 72 °C 21 mp, 84 °C 0 mp) 45×, (95 °C 0 mp, 66-72 °C 1 perc, 95 °C 0 mp 0,1 °C /sec) 1×. A keletkezett termékeket olvadáspont-analízissel, illetve a termékek 1 %-os, etídiumbomiddal kiegészített agaróz gélben történő elektroforetizálása után (l. fentebb), UVfényben vizsgálva ellenőriztük. A kvantitatív meghatározáshoz a béta-aktin „háztartási gén” mRNS-expresszióját mértük, és a többi célgén expressziós adatait ehhez viszonyítottuk. A génexpresszió változásának megállapítását és a statisztikai analízist a REST-XL programmal végeztük (Pfaffl és mtsai, 2002). A petefészek-működés nyomonkövetése (mindhárom kísérletben)32: (1) Az ellés utáni első ovuláció időpontjának a meghatározása / ciklikus petefészekműködés monitorozása: a kb. 7-10. naptól kezdődően, a fix AI utáni kb. 35. napig hetenként 3 alkalommal gyűjtött tejminta progeszteron (P4) tartalmának a meghatározásán alapuló P4 profil segítségével. (2) A posztovulációs progeszteron-szintemelkedésnek ill. a sárgatest (CL) működésének a nyomon követése: A második PGF2 kezelés időpontjában, majd ezt követően 10 napon egy-egy alkalommal gyűjtött tejminták progeszteron (P4) koncentrációjának a meghatározásával (posztovulációs P4-szintemelkedés). A posztovulációs P4 profil értékelése. A vemhesség megállapítása ill. az esetleges embrionális / korai magzati elhalás diagnosztizálása (mindhárom kísérletben): A 3. és 4. kísérletben is alkalmazott módon, azaz a (i) 36. napon végzett ultrahangechográfiás (UH) vizsgálat, ill. (ii) a fix AI után 45-60 nappal végzett rektális tapintás (RP), továbbá (iii) a fix AI után kb. 28 és kb. 35 nappal gyűjtött vérplazma mintákból PSPB-határozás33 segítségével. Sárgatest (CL) / működő luteinszövet jelenlétére utaló jeleként értékeltük a zsírtalanított tejminta 1,60 mmol/l fölötti P4 szintjét. A vemhesülés lehetőségére utalt, ha az állat vizsgált inszeminálására (fix AI) a ciklus tüszőfázisára jellemző alacsony (<1,6 nmol) tej-P4 szint mellett került sor, ezt követően azonban 2-6 napon belül már emelkedett (1.6 nmol/l) tej-P4 koncentrációt mértünk, és a továbbiakban a P4 szintje mindvégig CL jelenlétére utalóan magasnak bizonyult. A vemhesülést azonban csak akkor tekintettük bizonyítottnak, ha azt (a PSPB, UH és RP vizsgálatok is megerősítették. Az embrionális / korai magzati elhalás diagnosztikai kritériumait a 7.4. táblázatban foglaltuk össze

32

A 2., 3. és 4. kísérletben is alkalmazottakkal egységes módon.

33

Biopryn® ELISA teszt, BioTracking LLC, Moscow, ID, US.

30


7.4. táblázat: A fix AI-t követő vemhesülés, illetve az embrionális / korai magzati elhalás (továbbiakban: EM) 7., 8. és 9. kísérletben alkalmazott diagnosztikai kritériumai. A fix AI-t követő 16-23. nap 36. nap Tej P4 (nmol/l) PSPB UH ech. 1-14. nap: a P4 szintje a vemhesülés lehetőségére utaló Nem vemhesült Min. 1 min--Negatív Negatív / tában: < 1.6 ivarzás Vemhesült + +  1.6 Mindvégig: Embrióelhalás (EM),  1.6 bizonyított36-45. nap + +  1.6 bizonyított23-35. nap + Negatív --feltételezett23-35. nap Negatív Negatív ---

45-60. nap RP Negatív / ivarzás + Negatív Negatív Negatív

Szaporodásbiológiai adatgyűjtés (mindhárom kísérletben): Az ellés utáni első 150 napra vonatkozóan. Eredmények és megbeszélés 7. kísérlet: Porított propilénglikolt (PPG) tartalmazó takarmány adalékanyag A nagyüzemi tejelő szarvasmarhatartásban az ellés körül viszonylag gyakran előforduló ketózis és ennek következményeinek megelőzése, illetve kezelése céljából gyakran alkalmaznak különböző antiketogén (propionsav, propilénglikol, glicerin, egyes aminosavak) takarmány-kiegészítést. Jól ismert, hogy az ellés utáni időszakra jellemző energia hiány metabolikus és endokrin következményei kihatással lehetnek az állatok reprodukciós teljesítményére is (Huszenicza és mtsai, 2002, 2003). Egyes metabolikus hormonoknak (inzulin, IGF-1) és metabolitoknak (BHB, NEFA) a korai laktáció idején mért koncentrációi kapcsolatba hozhatók az állatok petefészek-működésének ciklikussá válásával, illetve a vemhesülés esélyével. Ezt támasztja alá az a vizsgálat is, melynek során az inzulin-elválasztást serkentő takarmány etetése lerövidítette az ellés utáni első ovulációig eltelt időintervallumot (Gong, 2002). A propilénglikol (PGL, 1,2-propándiol) az egyik legismertebb glükoneogenetikus anyag, gyakran alkalmazzák a vércukorszint emelésére és közvetlen energia-kiegészítés céljára. Mivel a PGL csökkenti az állatok testzsírraktárainak mobilizációját és a ketonanyagok termelődését (Nielsen és Ingvartsen, 2004), valamint növeli a perifériás inzulin, illetve az IGF-I és kötőproteinjeinek szintjét (Hoedemaker és mtsai, 2004), várhatóan javítania kellene az állatok reprodukciós teljesítményét is. Legelterjedtebb alkalmazási módja a drench, azonban ennek alkalmazása, nagyüzemi körülmények között idő- és munkaigényes folyamat. Ezért egy takarmányba keverhető és a monodiéta részeként alkalmazható készítmény hatékony módja lehet az ellés körüli energiabevitel növelésére. Vizsgálatunk során egy olyan porított formájú PGL kiegészítés metabolikus, hormonális és egyes szaporodásbiológiai hatásait vizsgáltuk, amely a monodiéta részeként nagyüzemi körülmények között is könnyen alkalmazható lenne.

31


a) A propilénglikol kiegészítés takarmányozási vonatkozásai34, a tejtermelésre gyakorolt, valamint metabolikus és hormonális hatásai Vizsgálatunkban 51 többször ellett tehén (PGL-kezelt: n=20; kontroll: n=31) adatai bizonyultak értékelhetőnek (előző laktációs tejtermelés: 8042 ±214 kg FCM; ellésszám: 2,43 ±0,21). A telepen alkalmazott komplett monodiétás takarmányozás adatai alapján a kontroll csoport napi fejadagja (total mixed ration, TMR) az ellés előtt 6,5 MJ laktációs nettó energiát (NEl) és 15,5% nyersfehérjét, az ellés után pedig 6,85 MJ NEl és 19% nyersfehérjét tartalmazott. A kezelt állatok az elletőben való tartózkodás alatt (az ellés előtti 14-10. naptól, az ellés utáni 7-10. napig) a kontroll csoport fejadagjához képest naponta 350 g propilénglikol-kiegészítést kaptak, por formájában (V.D.M. Állatgyógyászati Kft.) a monodiétás takarmányra szórva, ami kb. 5,05 MJ NEl energiakiegészítésnek felelt meg. Az alkalmazott PGL kiegészítés a számításaink szerint kb. 5,05 MJ NEl energiatartalmat képviselt, ami az ellés előtt a napi energia-szükséglet kb. 14%-át, a korai laktáció napjaiban pedig mintegy 5%-át tette ki. A PGL takarmányfejadagba történő bekeverése nagyon gyakorlatias, azonban ez a PGL kesernyés íze miatt esetleg csökkentheti a szárazanyag-felvételt (Miyoshi és mtsai, 2001). Vizsgálatunk során az üzemi körülmények nem tették lehetővé az állatok egyedi szárazanyag-felvételének pontos meghatározását, ezért azt sem tudhatjuk, hogy az egyes állatok a napi adaggal pontosan milyen mennyiségű PGL-t vettek fel, illetve a PGL-kiegészített csoportban nem csökkent-e a napi szárazanyag-felvétel. Az állatok napi tejtermelését az ellés utáni 10. naptól az ellés utáni 90 napig követtük nyomon. Az ellés körüli PPG kiegészítés – a vonatkozó irodalmi adatokkal (Nielsen és Ingvartsen, 2004) teljes összhangban – nem befolyásolta a tejtermelést (7.1. ábra; P<0.05). Az átlagos napi tejtermelés a kontroll csoportban 33,1± 1,19 liter, a PGL csoportban 33,8± 1,32 liter volt (P=0.48). Az összes tejtermelés az első 3 hónapban 2462,5± 118 liter volt a kontroll, 2575± 130 liter a PGL csoportban (P=0.59). 7.1. ábra: Átlagos napi tejtermelés a propilénglikol-kiegészített (PGL) és a kontroll csoportban (7. kísérlet). Napi átlag tejtermelés 50

tej/liter

40

30

20

Kontroll PGL

10

0 1

8

15

22

29

36

43

50

57

64

71

78

85

ellés utáni napok

A munkánk során alkalmazott PGL kiegészítés idején jelentősen növekedett az inzulin koncentrációja, azonban a vérplazma glükóz szintje nem mutatott különbséget a két csoport között (7.2. ábra). Az inzulin szint növekedésének magasabb mértéke több té34

A takarmányozási adatok elemzése a Dr. Mézes Miklós vezetésével a SzIE Mezőgazdasági és Környezettudományi Karának Takarmányozástani Tanszékén dolgozó munkacsoport munkája

32


nyezővel magyarázható. Ennek oka lehet a mintavételezés időpontja (Christensen és mtsai., 1997; Nielsen és Ingvartsen, 2004). Az inzulin-szint nagyfokú emelkedése viszont gátolja a glükóz koncentrációjának túlzott fokú növekedését (Grummer és mtsai, 1998). Christensen és mtsai. (1997) arról is beszámolnak, hogy a PGL kiegészítés módja (drench, abrakhoz keverve, TMR-re szórva) jelentősen befolyásolja a glükóz és az inzulin szintjét. PGL adagolása csökkenti a NEFA és a BHB szintjét a vérplazmában, valamint csökkenti a ketonanyagok koncentrációját a vérben, tejben és vizeletben (Nielsen és Ingvartsen, 2004). Vizsgálataink nem mutattak különbséget az állatok NEFA-szintjét illetően. Ugyanez igaz a BHB-ra is, azzal a különbséggel, hogy az ellés előtti napokban a PGL-csoportban a kontroll csoporthoz viszonyítva kisebb mértékben növekedett a BHBszint. A feltehető magyarázat az lehet, hogy egyik csoportban sem mértünk nagyon magas értékeket. A kezelés ugyanakkor nem volt hatással az IGF-I perifériás koncentrációjára. Hoedemaker és mtsai (2004) vizsgálata során az IGF-I koncentráció csak egy héttel később csökkent le a PGL-drench hatására, mint a kontroll állatokban, míg mások nem találtak különbséget (Butler és mtsai, 2006). 7.2. ábra: Plazma metabolitok és hormon szintek ellés körüli alakulása PGL és kontroll csoportban.

Az ellés utáni 7.-10. nap között vizsgálva a PGL nem befolyásolta jelentősen az iv. glukóz tolerancia tesztre (IVGTT) és iv. inzulin tolerancia tesztre (ITT) adott glukózés inzulin válaszokat, valamint a máj elzsírosodásának mértékét (P>0.5). Kezeléstől függetlenül magas összlipid-tartalmat találtunk azokban az állatokban, amelyekben utólag magasabb NEFA és ketonanyagszinteket mértünk.

33


b) A propilénglikol kiegészítés energetikai státuszra gyakorolt hatásainak minősítése génexpressziós vizsgálatokkal35 A PGL kiegészítésnek az állatok energiastátuszára gyakorolt hatását génexpressziós vizsgálati módszerekkel is meg kívántuk erősíteni, ezért a 7. kísérlet állatainak reprentáns részén (PGL-kiegészített: n=10; kontroll: n=7) egy metabolikus hormonnak (leptin), e hormon receptorainak (leptin receptor, rövid ill. hosszú forma [Ob-RS, Ob-RL]), illetve egy, a pajzsmirigy-hormonok élettani hatásával szorosan összefüggő metabolikus enzimnek (1-es típusú dejodáz, DIO1) a májbeli mRNS-expresszióját is meghatároztuk. A propilénglikollal kezelt csoportban mind a leptin (1,1×, p=0,48, SE=±3,9,) és a leptin-receptorok (Ob-RS: 4,4×, p=0,001, SE=±46; Ob-RL: 2,7×, p=0,48, SE=±23), mind az 1-es típusú dejodáz (1,2×, p=0,001, SE=±1,7,) mRNS-ének májbeli expressziója megnövekedett a kontroll csoporthoz képest (7.3. ábra).

7.3. ábra: A májban mért mRNS-expresszió (sárga téglalap: kontroll csoport, zöld téglalap: a kontroll és a kezelt csoport közötti különbség)

A leptin hormon elsődleges forrása a fehér zsírszövet (Laharrague és mtsai, 1998). A leptin mennyisége alapvetően a testzsír-tartalékok mennyiségét tükrözi (Chilliard és mtsai, 2005). Testsúly csökkenés esetén ennek mennyisége lecsökken, ami negatívan befolyásolja a szaporodásbiológiai funkciókat (Zieba és mtsai, 2005). Eredményeink szerint az alkalmazott PGL hatására a máj leptintermelése gyakorlatilag nem változott, a májbeli leptinreceptorok mennyisége pedig megnövekedett, ami alapján feltételezzük, hogy a kezelt állatok leptinszintje nem csökkent le annyira, mint a kezeletlen állatoké; ami kedvezően érinti a szaporodásbiológiai folyamatokat. A különféle pajzsmirigy-hormonok alapvető szerepet játszanak a szervezet energetikai homeostasisának beállításában. Az aktív és inaktív pajzsmirigyhormonok mennyisége a szervezet energia-állapotának megfelelően változik (Bauman és Currie, 1980). Megfelelő energia-ellátottság esetén a szervezet elsősorban aktív pajzsmirigyhormonokat igényel, amelyeket emlősökben főleg a májban megtalálható DIO1 állít elő. Pezzi és mtsai. (2003) kimutatták, hogy a szarvasmarhák májának DIO1-aktivitása a laktáció elején szignifikánsan alacsonyabb, mint más életszakaszokban, ami valószínűleg a máj adott időszakban jellemző elzsírosodásának a következménye (Romo és mtsai, 1997). Az ala35

A jelentésnek ez a fejezete a Dr. Bartha Tibor vezetésével a SzIE Állatorvos-tudományi Karának Élettani és Biokémiai Tanszékén dolgozó munkacsoport munkája

34


csony aktív pajzsmirigyhormon-koncentráció összefüggésbe hozható a post partum tehenek alacsony szaporodási mutatóival is (Huszenicza és mtsai, 2002). A kísérletünk során tapasztalt megnövekedett májbeli DIO1 mRNS-expresszió egyrészt arra enged következtetni, hogy a PGL-kiegészítésben részesült állatok aktív pajzsmirigyhormon-igénye megnövekedett, tehát energia-állapotuk kedvezőbb volt, mint a kezeletlen állatoké; másrészt utal arra, hogy a kezelt állatok májfunkciója valószínűleg jobb volt, mint a kezeletlen állatoké. c) A propilénglikol kiegészítés szaporodásbiológiai hatásai A P4 profilok alapján az ellés utáni 70. napig mindkét csoport valamennyi állatában ciklikussá vált a petefészek működése, és nem volt az ellés utáni első ovuláció időpontjában (kontroll: 34.2 ±2.9 nap; PGL: 34.1±4.5 nap; p= 0.98). Az első termékenyítésre, illetve a 150. napig bekövetkezett vemhesülés (10.7% vs. 17%, illetve 16% vs. 35%) arányában sem találtunk lényeges különbséget a kontroll és PGL csoportok között, megjegyzendő azonban, hogy a vemhesülési arány mindkét csoportban alacsony volt (7.5. táblázat). A termékenyítést követő P4 profil alapján 7 állat nem reagált megfelelően a szinkronizációs kezelésre, ezért ezeket az állatokat a vizsgált termékenyítés eredményének értékelése során nem vettük figyelembe. Így összesen 40 (23 kontroll és 17 PGL) állat vemhesülését értékeltük. A vizsgált termékenyítésből összesen 7 állat vemhesült; ebből 4 (10%) állat a kontroll és 3 (8 %) állat a kezelt csoportba tartozott. A 21.-24. napon mért emelkedett P4 szintek, valamint a 35. napi PSPB eredmény és az UH vizsgálat alapján mindössze 4 esetben (10 %) vetették föl (EM feltételezett23-35. nap; n=2) vagy bizonyították (EM bizonyított23-35. nap; n=2) a 23-35. napok között bekövetkezett EM lehetőségét (7.5. táblázat). 7.5. táblázat: Egyes szaporodásbiológiai mutatók alakulása a kontroll és PGL kiegészítésben részesült csoportokban Kontroll PGL P Módszer Mantel-Hassel Első ovuláció napja 34.1±12.9 34.9±4.5 0.98 teszt Első AI eredménye Vemhes 4 (17,4 %) 3 (17,6%) Üres 16 (69,6 %) 13 (76,6%) 0.54 Fisher-próba EM 3 (13 %) 1 (5.8%) -EM feltételezett 2 1 -EM bizonyított 1 Vemhesség a150. napon Chi négyzetVemhes 6 (21.5%) 7 (36%) 0.20 próba Üres 22 (78.5%) 12 (63%) Vemhesülésig eltelt nap 93.3±11.2 103.5±12.9 Kétmintás t0.56 próba AI száma/vemhesülés 1.33 1.57 Kétmintás t0.43 próba A vonatkozó irodalmi adatokat áttanulmányozva elmondható, hogy Miyoshi (2001) és Chagas (2007) a PGL kedvező hatását mutatták ki a petefészek ellés utáni ciklikussá válására, más vizsgálatok azonban nem tudták bizonyítani a tüszők növekedésére, a domináns tüsző ösztradiol termelő kapacitására és az ellés utáni aciklia időtartamára

35


kifejtett pozitív hatást (Hoedemaker, 2004; Butler, 2006). A legelőn tartott, alacsony kondíció-pontszámú üszők esetében a PGL-etetés pozitív hatásairól számoltak be Chagas és mtsai. (2007) is, bár kísérletükben magasabb dózisban (7,5 MJ NEl) és drench formájában alkalmazták a PGL-t: valószínűleg ez okozhatta az inzulinszint tartósabb emelkedését. Más vizsgálatokban ez okozhatta, hogy a drench nem befolyásolta a petesejt, valamint az in vitro fertilizáció során nyert blasztociszták minőségét többször ellett Holsteinfríz tehenekben (Rizos és mtsai., 2008). Következtetések és javaslatok Összességében megállapítható, hogy az alkalmazott porított propilénglikol készítmény az üzemi gyakorlatban könnyen alkalmazható, és a vemhesség utolsó napjaiban és a laktáció kezdetén pozitívan befolyásolta a kísérletbe vont állatok energiaháztartását. A jótékony hatás azonban az adott körülmények között csak kisebb mértékű volt, csupán molekuláris diagnosztikai és endokrinológiai vizsgálómódszerek alkalmazása révén vált felismerhetővé, és nem bizonyult elégségesnek a petefészek-működés ciklikussá válásának, illetve az esetleges embrionális - korai magzatkori veszteségeknek a befolyásolására sem. A készítménynek a napi takarmányfejadagba történő egyszerű bekeverhetősége lehetővé teszi a megelőzés céljára történő rutinszerű üzemi használatot. Tapasztalataink alapján megfontolandó azonban, hogy a negatív energiaegyensúly dekompenzálódása esetén a veszélyeztetett állatcsoportokban az ennél valószínűleg hatékonyabb, drench formájú alkalmazást célszerű előnyben részesíteni. 8. kísérlet: A takarmányfejadag lenmag alapú PUFA (Robit) adalékanyag kiegészítésével szerzett első tapasztalatok Kérődzőkben, mindenek előtt tejhasznú tehenekben, a takarmányok védett zsírforrásokkal történő kiegészítése egyike azoknak a lehetőségeknek, amelynek révén – a tejtermelés növelése mellett – a szaporodási mutatók alakulása is pozitív irányban befolyásolhatók. Zsírkiegészítéssel növelhető a takarmányfejadag energiakoncentrációja, és ennek révén javítható az állat energetikai státusza. Az ellés után a petefészek működése rendszerint hamarabb ciklikussá válik, ami pozitív összefüggést mutat az újravemhesülés idejével és arányával. A zsírkiegészítés egyes, intrafolliculárisan is ható metabolikus hormonokon (inzulin, IGF-I) keresztül is stimulálja a tüszőnövekedést. A kiegészítésként alkalmazott zsírforrások koleszterin tartalma prekurzorként szolgálhat az ovariális szteroidok, PUFA tartalma pedig az egyes eikozanoidok [prosztanoidok, azaz a luteolitikus prosztaglandin F2 (PGF2), valamint a luteotrop hatású prosztaglandin E2 (PGE2)] endometriális szintéziséhez. Ezen túlmenően a bendőbeli biohidrogenációt és lebontást megkerülő többszörösen telítetlen zsírsavak a tej zsírsav profilját is módosíthatják. A különböző zsírforrások eltérő zsírsav összetételének is fontos szerepe lehet különböző reprodukciós folyamatok szabályozásában. Egyes n-3 zsírsavakban, pl. -linolénsavban (C18:3, n-3) gazdag lenmag etetése csökkentheti a PGF2 szintézisét, mely jelenségnek fontos szerepe lehet a magzatnak az anyai szervezet által történő felismerésében, ezáltal csökkentve a korai embrió/magzatvesztések előfordulását. A kísérletben azt vizsgáltuk, hogy a laktáció kezdetén álló Holstein-fríz tehenek takarmányának ellés utáni időszakban (kb. a laktáció első 3 hónapjában) a kísérleti fejlesztés tárgyát képező lenmagdara alapú, többszörösen telítetlen zsírsavakban gazdag védett (by-pass) zsírkészítménnyel történő kiegészítése befolyásolja-e (a) egyes metabolitok (BHB, NEFA; karbamid-N), valamint az állat ellés utáni energiaháztartását szabályozó egyes hormonok (inzulin, IGF-1, T4, T3) perifériás vérszintjét, (b) az állatok lipidperoxidációs státuszát, (c) az ellés utáni első 36


ovuláció időpontját, valamint (d) az ellés után kb. 70-80 nappal végzett termékenyítés utáni luteális aktivitást, vemhesülési arányt, illetve az esetlegesen előforduló embrionális / korai magzati mortalitás (EM) gyakoriságát. A vizsgálatok helyszínéül szolgáló tehenészet korábban már többször ellett, tavaszi ellésű hatvan, kontroll (n=30) és kezelt (n=30) csoportba sorolt állatának az életkora, átlagos ellésszáma, paritása, előző laktációs tejtermelése és elléskori kondíciója nem tért el lényegesen (kontroll: BCSellés: 2,70±0,5; ellésszám: 2,8±0,2; tej 7203,4±158; Kezelt: BCSellés: 2,60±0,5; ellésszám: 2,7±0,4; tej 7155,7±166; P>0.05). Közülük 48 (25 kontroll és 23 kezelt) tehén adatai bizonyultak értékelhetőnek. a) A takarmányozási adatok36 A kezelt csoport az ellés napjától kezdve lenmagdara alapú védett zsírkiegészítést kapott, amelyet a telepen hagyományosan alkalmazott monodiétás (TMR) takarmányadagba kevertek. A kontroll csoport hozzávetőleg azonos mennyiségben egy hagyományos (hidrogénezett pálmaolaj alapú) védett zsírkiegészítésben részesült, az üzemben alkalmazott, a Taurina receptúrája szerint összeállított, szokásos fejadag formájában. A két csoport takarmánya izokalorikusnak (azonos energia tartalmúnak), izonitrogénnek (azonos nyersfehérje tartalmúnak) és izolipidnek (azonos zsírtartalmúnak) volt tekinthető, mert az állatok teljes napi igényéhez viszonyítva az eltérések elhanyagolható mértékűek (terjedelmi okokból csak a kb. 20-27. nap után, a csúcslaktáló csoportban etetett fejadag beltartalmi értékeit közöljük; 8.1. táblázat). 8.1. táblázat: A vizsgálati időszak alatt a kontroll és a kiegészítő takarmányt fogyasztó csoport által etetett napi adag mért táplálóanyag tartalma Táplálóanyag Mértékegység Kontroll Kezelt Eredeti szárazanyag tartalom g/kg takarmány 545,4 550,2 Nyersfehérje tartalom g/kg szárazanyag 169,4 170,1 Nyerszsír tartalom (összes) g/kg szárazanyag 48,4 52,7 Védett nyerszsír tartalom g/kg szárazanyag 40,3 35,6 Nyersrost tartalom g/kg szárazanyag 134,6 124,2 Nyershamu tartalom g/kg szárazanyag 60,2 60,8 Nitrogén-mentes kivonható anyag g/kg szárazanyag 587,4 592,1 Energia tartalom (NEl) 7,14 7,23 Az irodalmi adatok alapján jól ismert, hogy a lenmag nagy mennyiségű többszörösen telítetlen zsírsavakat – pl. kb. 36,9% linolsavat (C18:2, n-6) és 21,4% linolénsavat (C18:3, n-3) tartalmaz (Cenkvári és mtsai., 2005). A várakozásoknak megfelelően a kísérlet során alkalmazott kétféle védett zsírforrás közül a lenmagdara alapú kísérleti készítmény (Robit) a hidrogénezett pálmaolaj alapú hagyományos terméknél (Taurina) lényegesen magasabb n-3 zsírsav-tartalommal (linolénsav, C18:3) rendelkezett (8.1. ábra).

36

A takarmányozási adatok elemzése a Dr. Mézes Miklós vezetésével a SzIE Mezőgazdasági és Környezettudományi Karának Takarmányozástani Tanszékén dolgozó munkacsoport munkája

37


8.1. ábra: Védett zsírforrásként használt koncentrátumok, a Taurina (kontroll) és a Robit (kezelt) zsírsav-összetétele. 50.0

40.0

30.0 Taurina Robit 20.0

10.0

0.0 Taurina Robit

16:0

18:0

18:1 n-9

18:1 n-7

18:2

17.3

3.1

38.4

1.5

35.5

18:3 4.3

8.6

3.3

20.1

1.0

19.0

48.1

b) A lenmag alapú PUFA (Robit) kiegészítés tejtermelésre gyakorolt hatása A kísérleti termék etetése idején, vagyis az ellés utáni első 90 napon a napi átlagos tejtermelés a kezelt csoportban magasabb volt, mint a kontroll csoportban (Kezelt: 33,8 ±1,9 liter/nap vs. Kontroll: 30,3±1,9 liter/nap, P=0.16). A kezelt csoport tejtermelése a későbbiekben is, egészen az ellés utáni kb. 180. napig magasabbnak bizonyult (Kezelt: 31,5 ±1,3 liter/nap vs. Kontroll: 27,2 ±1,7 liter/nap, P=0.05). Ez megegyezik egyes irodalmi adatokkal, mely szerint bizonyos védett zsírforrások etetése nyomán növekszik az állatok tejtermelése (Staples és mtsai, 1998). Lényegesen különbözött a két állatcsoport által termelt tej zsírsav-összetétele is: a lenmag alapú kísérleti terméket tartalmazó takarmányadagot fogyasztó állatok által termelt tej lényegesen több linolénsavat (C18:3) tartalmazott (P>0.05; 8.2. ábra). Adataink részben ellentmondanak Flowers (2008) eredményeinek, amelyek szerint a különböző mennyiségű (napi 0, 170, 340, ill. 510 g) lenmagolaj-kiegészítés nem befolyásolta a tejtermelést, csak kisebb mértékben emelte a tej linolénsav (C18:3, n-3) tartalmát (0.59, 0.78, 1.01, ill. 1.03 g/100g zsírsav, P<0.01), viszont jelentősebben növelte egyes konjugált linolsavak (pl. cis-9, transz-11CLA) mennyiségét.

38


8.2. ábra: Védett zsírforrásként hidrogénezett pálmaolaj alapú hagyományos koncentrátumot (kontroll), illetve a lenmag alapú kísérleti terméket (Robit) fogyasztó állatok tejének zsírsav-összetétele. Tej zsírsav összetétele 70 60

FA mg/ml

50 40

Telített

30

Monoen n6 (C18:2)

20

n3 (C18:3)

10 0 Kísérleti átlag

Kontroll átlag

c) A lenmag alapú PUFA (Robit) kiegészítés metabolikus következményei A vizsgált időpontokban a két csoport ellés utáni átlagos kondíció pontszáma azonos volt (1. hét: 2,76±0,1 vs. 2,7±0,08, p=0,6; 16. hét: 2,2±0,09 vs. 2,15±0,09, p=0,7). Ez az eredményünk megfelel annak a megfigyelésnek, hogy a kétféle zsírkiegészítés nem befolyásolta az állatok energia egyensúlyát (Staples és mtsai., 1998). Staples és mtsai (1998) szerint a NEFA szint majdnem mindig emelkedik a zsírkiegészített takarmányfejadagot fogyasztó tehenekben. Esetünkben a kísérleti csoportban egy, a kontroll csoport értékekhez képest kevésbé csökkenő tendenciát állapíthatunk meg. A kezelt állatok karbamid szintje az ellés utáni 2. héten szignifikánsan alacsonyabb volt, mint kontroll állatokban (4,13 ±0,21 mmol/l vs. 5,41 ±0,25 mmol/l; P= 0,0006). A BHB szintek az ellés utáni 2. héten a kísérleti csoport értékei a kontroll csoportéhoz képest alacsonyabb értéket mutattak (0,38 mmol/l vs. 0,50 mmol/l, p=0,55). Az ezt követő mintavételezésekből származó eredmények egyre jobban közelítenek egymáshoz (5. héten: 0,18 mmol/l vs. 0,27 mmol/l, p=0,23, a 10-11. héten: 0,17 mmol/l vs. 0,15 mmol/l p=0,59 a kezelt, illetve kontroll csoportokban).

39


8.3. ábra: Egyes plazma metabolitok és hormon szintek alakulása az ellés után a kontroll és kezelt csoportban.

A vizsgálat szinte teljes ideje alatt a kontroll csoportban magasabb karbamid szinteket mértünk. Az ellés utáni 2. héten alacsonyabb volt, mint a kontroll csoportban (4,10 mmol/l vs. 5,46 mmol/l, p<0,05), majd az 5. hétre (4,76 mmol/l vs. 5,16 mmol/l, p=0,19), valamint a 10-11. hétre ezek a különbségek csökkentek (4,33 mmol/l vs. 5,00 mmol/l, p=0,08). Nem volt különbség a két csoport plazma inzulin-szintjében. Lammoglia és mtsai. (1997) hasonló megállapításra jutottak. A PUFA-kiegészített kísérleti és a kontroll csoport egyedeinek vérében található keringő inzulin mennyisége közel azonosnak bizonyult. Ugyanezen tényeket támasztja alá Staples és mtsai. (1998) által írt tanulmány, melyben 17 korábbi kísérlet adatait vetik össze egymással. A 17 vizsgálatból mindössze 8 estében tapasztalható szignifikáns különbség a zsírkiegészítésben részesült állatok e paraméterében. Az IGF-I szinteket vizsgálva megállapítható, hogy a különbségek statisztikailag nem voltak szignifikánsak (P=0,27 és 0,60 között). Beam és Butler (1998) a laktáció első három hetében védett zsírkiegészítésben részesült tehenekben alacsonyabb plazma IGF-Iszinteket mértek, mint a kontrollokban (37,6 ill. 47,7 ng/ml, P<0,1); megjegyzendő azonban, hogy e csoportban a kondícióvesztés mértéke is kifejezettebb volt. Mások a zsírkiegészítésben részesített állatok jobb vemhesülési aránya ellenére sem találtak különbséget az IGF-I szintjében (Staples, 1998). Ez megegyezik azzal a megfigyeléssel is, amely sze40


rint zsírkiegészítés hatására magasabb volt a tüszőfolyadék IGF-I szintje, annak ellenére is, hogy a plazma IGF-I- koncentrációjában nem mutatkozott különbség (Thomas és mtsai., 1997). A zsírkiegészítés nem volt hatással a pajzsmirigy hormonok alap szintjére. A T3 és T4 hormonszintek az ellés utáni időben érik el legalacsonyabb szintjüket, majd fokozatosan növekszenek, hasonlóan más irodalmi adatokhoz (Huszenicza és mtsai, 2002). Nem volt különbség a plazma leptin szintekben sem, ami megegyezik egy korábbi vizsgálatunk eredményeivel (Kokkonen és mtsai., 2004 ). d) A lenmag alapú PUFA (Robit) kiegészítés szaporodásbiológiai következményei A petefészek-működés ciklusba lendülése Kísérletünkben PUFA-kiegészítésben részesült kísérleti csoport az ellés után hamarabb lendült ciklusba. Ebben a csoportban az első ovuláció átlagos időpontja 30,9  2,6 napra tehető, míg a kontroll csoportunkban ez csak később, átlagosan a 47,1  3,6 napon következett be (P<0,05) (8.4. ábra). Első ovuláció napja 1,2

8.4. ábra: Az ellés után már ciklikussá vált petefészekműködésű tehenek arányának a változása a kontroll és kezelt csoportban (túlélési görbe módszerével elemezve).

1,0

Az ovuláló egyedek aránya

,8

,6

,4

CSOPORT ,2 Kezelt

0,0 10

Kontroll

20

30

40

50

60

70

80

Ovuláció napja

Hasonló eredményre jutott Beam és Butler (1997), amikor is az ellés utáni első 84 napon faggyú és baromfizsír keverékét etettek tejelő szarvasmarhákkal, ami jelentősen csökkentette az elléstől az első tüszőnövekedésig eltelt időszakot (21,4 ill. 45,3, és 37,4 nap). Néhány vizsgálatban azonban – valószínűleg a jelentősen növekvő tejtermelés nyomán kifejezettebbé váló NEB nyomán – zsírkiegészítésben részesült tehenekben az acikliás periódus meghosszabbodását (Scott és mtsai., 1995), és az első 100 napban ivarzási tüneteket nem mutató állatok arányának a növekedését figyelték meg (Carroll és mtsai., 1990). A zsírsavak tüszőnövekedésre és sárgatest működésére kifejtett hatásának egyik feltételezett mechanizmusa az inzulin és IGF-I közvetlen ovariális hatásán keresztül érvényesül (Staples, 1998), de esetünkben e két hormon perifériás koncentrációja nem különböztek a két állatcsoportban. Vemhesülés, embrió / korai magzati elhalás A termékenyítést követő P4 profil alapján 7 állat nem reagált megfelelően a szinkronizációs kezelésre, ezért ezeket az állatokat a vizsgált termékenyítés eredményének értékelése során nem vettük figyelembe. Így összesen 40 (17 kontroll és 23 kísérleti) állat vemhesülését értékeltük. A kezelt csoportból 5 (21,7%), a kontroll csoportból 5 állat (29,4%) vemhesült. Az UH, a PSPB eredmények és a termékenyítés utáni progeszteron 41


profil alapján a 25. és a 60. nap között embrió/korai magzati elhallást a kezelt csoportban 4 (17,3%), a kontroll csoportban 1 (6%) esetben diagnosztizáltunk (Fisher-próba, P>0.05) (8.5. ábra). A 16-23. napon mért P4 szintek, valamint a 35. napi PSPB határozás, és UH vizsgálat alapján a kontroll csoportban diagnosztizált egy esetben bizonyítottan embrióelhalás áll a háttérben az AI utáni 23. és 35. napok között. A kezelt csoportban 1 esetben bizonyítottan, 2 esetben feltételezetten EM következett be a 23. és 35 napok között. A 35. és 60. napokon végzett UH, valamint a PSPB eredmények alapján a 35. és 60. napok között a kísérleti csoportban csak egy esetben fordult elő a magzatvesztés. 8.5. ábra: A vemhesülés és embrió mortalitás (EM) előfordulási aránya a vizsgált termékenyítéseket követően a kontroll és kezelt csoportokban. A fix AI eredménye 100 90 80

Vemhes

Üres

EM

70 60 50 40 30

CSOPORT

%

20 10

Kontroll

0

Kezelt

Számos megfigyelés tanúskodik a takarmány zsírsav-összetételének a reprodukciós teljesítményre, vemhesülési arányra gyakorolt hatásáról. Lenmag- és napraforgó olaj hatását összehasonlítva azt állapították meg, hogy a lenmagban található magas αlinolénsav (C18:3, n-3) tartalom hatására intenzívebb volt a tüszőnövekedési ráta, nagyobb volt a preovulácós tüsző mérete, és magasabb volt a vemhesülés aránya, mint a napraforgó olajjal kiegészített izokalorikus és izonitrogén takarmány esetén (Ambrose és Kastelic, 2003). In vitro bovine endometrium sejtjeinek n-3 zsírsavakkal történő inkubációja esetén – az arachidonsav szintézisének gátlásán keresztül – csökkent a prosztaglandin F2 szintézis (Thatcher és mstai, 2001). Petit és mtsai (2002) vizsgálata során azonban az oxitocin indukálta prosztaglandin szintézis hasonló volt a kontroll csoportéval, amely a zsírsavak sejtekbe való beépülésének eltérő módjára hívhatja fel a figyelmet. Esetünkben a kezelt csoport takarmánya magas arányban tartalmazott n-3 zsírsavat (C18:3), azonban vizsgálatunk során nem sikerült a embrió mortalitás esélyének csökkenését bizonyítani.

42


e) A lenmag alapú PUFA (Robit) kiegészítés lipidperoxidációs státuszra gyakorolt hatása37 A lipidperoxidációs státuszról tájékoztató paraméterek – a lipid-peroxidáció fokát jelző malondialdehid (MDA), valamint az antioxidáns vegyületek közül a redukált glutation (GSH) mennyisége, továbbá a glutation-peroxidáz (GSHPx) aktivitás – értékelése során megállapítottuk, hogy a szaporodásbiológiai állapot, kiemelten a korai embrióvesztés és az általunk vizsgált lipidperoxidációs és antioxidáns paraméterek között statisztikailag értékelhető, illetve egyértelműen tendenciaszerű összefüggés nem mutatkozik. A PUFA-gazdag kísérleti takarmány etetésének hatására úgy a vérplazmában, mint a vörösvérsejt hemolizátumban megnőtt a malonialdehid mennyisége, amelynek oka a kísérleti takarmány védett zsírtartalmának jelentősen nagyobb telítetlen zsírsav tartalma. A telítetlen zsírsavak fokozottan érzékenyek az oxidációra, így azok nagyobb mennyiségben és arányban történő etetésének hatására, vizsgálataink eredményei alapján megnő a lipidperoxidációs folyamatok intenzitása is a szervezetben. A fokozott lipidperoxidáció hatására mérsékelten csökkent a biológiai antioxidáns rendszer részét képező redukált glutation tartalom, valamint ezzel összefüggésben a glutation peroxidáz aktivitás is, amely az antioxidáns rendszer fokozott terhelésére, valamint a hatékony védelemre utal. Miután a vizsgált csoportok szaporodásbiológiai állapotában lényeges eltérések nem voltak kimutathatók, így levonható az a következtetés, hogy a fokozott zsírbevitel hatására jelentkező lipidperoxidációs változások nem voltak olyan mértékűek, amelyek az állatok szaporodásbiológiai folyamatait érdemben megváltoztatták volna. Az eredmények alapján azonban levonható az a következtetés, hogy a megnövelt mennyiségű telítetlen zsírsav kiegészítés terheli a szervezet antioxidáns védőrendszerét, amely antioxidáns kiegészítéssel (pl. E-vitamin és szelén) csökkenthető. Következtetések, javaslatok. A többszörösen telítetlen zsírsavakkal való kiegészítés az ellés után, – amellett, hogy jelentősen nőtt a termelt tej mennyisége is – számos más vizsgálathoz hasonlóan a jelen kísérletben is lerövidítette az ellés utáni aciklia időtartamát. Esetünkben ez nem magyarázható az állatok kedvezőbb energetikai állapotával, sem a vizsgált perifériás hormon (inzulin, IGF-I, leptin, T3, T4) szintekkel. A zsírkiegészítés hatásmechanizmusának tisztázása még számos további vizsgálatot indokol. Ennek ellenére sem túlzó az a kijelentés, hogy kérődzőkben az egyes védett zsírforrások tudatos megválasztása a fenntartható állati termék-előállítás egyik ígéretes módszere, amelytől a jövőben a termelési eredmények és a szaporodási mutatók javulása egyaránt remélhető. 9. kísérlet: A mikroelemekkel és vitaminokkal komplettált lenmag alapú PUFA (Robit) kiegészítésével szerzett tapasztalatok38 A kísérlet keretében két üzemben (A2 és N2 tehenészet) azt vizsgálatuk, hogy a lenmag alapú, többszörösen telítetlen zsírsavakban gazdag kísérleti takarmány adalékanyag (Robit) mikroelemekkel és vitaminokkal is kiegészített változatának az etetése (i) milyen metabolikus következményekkel jár, ill. milyen hatást gyakorol (ii) az ellés utáni első ovuláció, valamint (iii) az ellés után kb. 70-80 nappal (előzetes ovuláció37

A vonatkozó mérések elvégzése és az adatok elemzése a Dr. Mézes Miklós vezetésével a SzIE Mezőgazdasági és Környezettudományi Karának Takarmányozástani Tanszékén dolgozó munkacsoport munkája 38 A takarmányozási adatok elemzése, és a mikroelem-kiegészítés megtervezése a Dr. Mézes Miklós vezetésével a SzIE Mezőgazdasági és Környezettudományi Karának Takarmányozástani Tanszékén dolgozó munkacsoport munkája.

43


szinkronizálást követően végzett) mesterséges termékenyítés eredményességére / az ezt követően előforduló esetleges embrióelhalások gyakoriságára. Az A2 tehenészetben gyűjtött adatok Az A2 telepen a vizsgálatba 31 március-áprilisi hónapban ellett tehenet vontunk be. Az állatokat az ellés napján kontroll (n=18) és kezelt (n=11) csoportokra osztottunk. A vizsgálat során két kezelt állat selejtezésre került, ezért 29 állat adatait elemeztük. A havi befejési adatok alapján a kísérleti takarmányt kapott csoportban magasabb volt az átlagos napi tejtermelés (9.1. ábra). 9.1. ábra: A kontroll és kezelt csoport napi átlag tejtermelése a havi befejések alapján az A2 tehenészetben Tejtermelés: A. telep 60 P<0.0.5

P<0.0.5

50

liter

40 30 20 Kezelt 10

Kontroll

0 n hó 1.

ap h 2.

a ón

p h 3.

a ón

p h 4.

a ón

p

n hó 5.

ap

n hó 6.

ap

A PUFA+mikroelem+vitamin-kiegészítés jelentősen javította a kezelt csoport metabolikus paramétereit. Jelentősen alacsonyabbak voltak a plazma BHB szintek az ellés utáni első (kezelt: 0,36 mmol/l vs. kontroll: 0,57 mmol/l, p=0,05) és második (kezelt: 0,57 mmol/l vs. kontroll: 1,02 mmol/l, p=0,04) héten. Ezt követően kedvezően alakultak a kezelt állatok NEFA szintjei is az ellés utáni harmadik (kezelt: 0,036 mmol/l vs. kontroll: 0,61 mmol/l, p=0,01) és negyedik (kezelt: 0,30 mmol/l vs. kontroll: 0,43 mmol/l, p=0,05) héten. A takarmány-adalékanyagot tartalmazó takarmányadagot fogyasztó csoportban a perifériás inzulin és az IGF-I szintek ellés után alakulása szintén kedvezőbb energetikai státuszról tanúskodott. Az IGF-I szintek az egész mintavételezés idején, vagyis egészen a termékenyítés időpontjáig magasabbak voltak a kezelt csoportban. Az inzulin szint az ellés utáni 1. és 2. héten volt magasabb a kezelt állatokban. Nem tapasztaltunk lényeges különbségeket az egyéb metabolitokban és hormonokban (karbamid, T3, T4, leptin) (9.2. ábra).

44


9.2. ábra: Plazma metabolitok és hormonszintek alakulása az ellés után a kezelt és kontroll csoportban az A2 telepen. A tej progeszteron profilok alapján megállapítható volt, hogy a kontroll csoportból az állatok 61%-a (11 állat), a kezelt állatoknak pedig mintegy 45%-a (5 állat) lendült ciklusba az elléstől számított 35. napig (Chi2 próba, p=0.41). A kedvezőbb metabolikus állapot ellenére (alacsonyabb BHB és NEFA szint, valamint magasabb inzulin és IGF-I az ellés után) sem volt magasabb a korábban ciklusba lendülő tehenek aránya a kezelt csoportban. A termékenyítést követő P4 profil alapján 5 kontroll állat nem reagált megfelelően a szinkronizációs kezelésre, ezért ezeket az állatokat a vizsgált termékenyítés eredményének értékelése során nem vettük figyelembe. Így összesen 24 (13 kontroll és 11 kísérleti) állat termékenyítésének az eredményét értékeltük. A kontroll csoportban egy állat sem vemhesült a vizsgált termékenyítésre. A 16-23. napok között mért P4 szintek, valamint a 35. napi PSPB meghatározás és az UH vizsgálat alapján mindössze egy esetben merült fel az AI utáni a 23. és 35 nap közötti embrió mortalitás lehetősége. A kezelt csoportban a 11 állatból összesen 5 állat (45%) vemhesült a vizsgált termékenyítésre. Embrionális / korai magzati veszteségeket ebben a csoportban nem diagnosztizáltunk. A kont-

45


roll csoport rossz vemhesülési eredményeiben a ciklus-szinkronizációra adott szabálytalan ovariális válasz állhat a háttérben, amelyek a vizsgált termékenyítésből nem vemhesülhettek. Az N2 tehenészetben gyűjtött adatok A vizsgálatba 30, február-április között ellett, Holstein-fríz tehenet vontunk be. Az állatokat az ellés napján kontroll (n=15) és kezelt (n=15) csoportokra osztottunk. A takarmánykiegészítés ideje alatt nem volt különbség a két csoport napi átlag tejtermelése között (P>0,05). Az első 105 napban a napi átlag tejtermelés a kontroll csoportban 39,6± 0,8 liter, a kezelt csoportban 38,9± 1,09 liter volt (P=0,61). Az összes tejtermelés 3844± 111 liter volt a kontroll, illetve 4008± 111 liter a kezelt csoportban (P=0,31). Hasonlóan az A2 telepen tapasztalt eredményekhez, a kísérleti takarmányadalékanyag javította a kezelt csoport metabolikus paramétereit. Jelentősen alacsonyabb volt a plazma BHB szint az ellés utáni 1., 2. és 4. héten (P=0,04-0,09), majd a NEFA szint is az ellés utáni 1. héttől kezdve egészen a termékenyítés időpontjáig (P=0,0030,06) (9.3. ábra).

9.3. ábra: Plazma metabolit és hormonszintek alakulása az ellés után a kezelt és kontroll csoportokban az N2 telepen. A takarmány energia-kiegészítése kedvezően befolyásolta a kezelt csoport ellés utáni plazma inzulin és az IGF-I koncentrációját. A kezelt csoportban magasabb IGF-I szintet mértünk a post partum 1. és 4. hetekben (P=0,04-0,09). Emelkedettebb volt az in-

46


zulin szint is, amely a termékenyítés idejére vált szignifikáns mértékűvé (kezelt: 3,54±0,3 ųUI/l vs. 2,54±0,1 ųUI/l, P=0,03). Szintén kedvezőbb energia ellátottságról tanúskodik a magasabb T4 és T3 koncentráció is. Nem tapasztaltunk lényeges különbségeket a karbamid szintekben. A kontroll csoportból az állatok 66%-a (10 állat), a kezelt állatok mintegy 60%-a (9 állat) lendült ciklusba az elléstől számított 35. napig (Chi2 próba, P=0,7). Mind a kezelt, mind a kontroll csoportban az állatok 33,3%-a vemhesült (csoportonként 5-5 tehén) (9.4. ábra). A termékenyítés utáni 23. napon mért P4 érték, a PSPB és az UH vizsgálat eredmények alapján a kísérleti csoportban 3 (20%), a kontrollban 4 állat esetében (26,6%) merült fel az AI utáni 23. és 35. napok közötti embrió elhalás lehetősége. A 1623. napok között mért P4 szintek, valamint a 35. napi PSPB határozás, valamint UH vizsgálat alapján a kísérleti csoportban 1 esetben bizonyítottan, 2 esetben feltételezetten állt fenn az embrióelhalás. A kontroll csoportban 2 esetben feltételezetten, 2 esetben pedig bizonyítottan diagnosztizáltunk embrió mortalitást. A fix AI eredménye 100 90 80 70

Üres

60

Vemhes

EM

50 40 30

KEZELÉS

%

20 10

Kontroll

0

Kezelt

9.4. ábra: A vizsgált (fix idejű) termékenyítés eredménye a Kontroll és Kezelt csoportban (N2 telep). Következtetések. Az ellés után alkalmazott, többszörösen telítetlen zsírsavakban gazdag, mikroelemekkel és vitaminokkal kiegészített takarmány adalékanyag etetése mindkét tejhasznú szarvasmarha telepen kedvezően befolyásolta az ellés után az energia állapotot tükröző hormonok szintjét, csökkentette a ketonémia és fokozott lipidmobilizáció veszélyét. A kedvezőbb metabolikus állapot ellenére sem volt azonban különbség az ellés után 35. napig ovuláló állatok arányában, illetve a ciklus-szinkronizácót követő termékenyítés eredményességében.

47


A projekt gyakorlatnak átadható fontosabb tapasztalatainak összegzése 1. Az termékenyítés utáni 23. és 35. napok közötti embrió elhalás üszőkben is előfordul, gyakorisága azonban tehenekben, a laktáció első heteiben lényegesen magasabb. 2. A negatív energiaegyensúly dekompenzációja valószínűleg elsősorban a vemhességnek az anyai szervezet részéről történő felismerése előtti időszakában (<16 nap) veszélyezteti az embrió életben maradását. Az embrionális / korai magzati veszteségek mértéke ezt követően már kisebb mértékű. 3. A projekt keretében alkalmazott kombinált diagnosztikai módszer (a P4 profilok elemzése, a kb. 35. napi ultrahang-echográfiás vizsgálat, valamint az ugyanakkor elvégzett PSPB meghatározás) alkalmas a vemhességnek az anyai szervezet részéről történő felismerése utáni időszakban előforduló embrionális / korai magzati veszteségek megállapítására. 4. A negatív energiaegyensúly dekompenzációja közrejátszhat egyes vírusinfekciók – pl. a bovin Herpesvirus-4 fertőzések – aktiválódásában. A mechanizmus lényeges eleme lehet a fogamzási eredmények romlásának. 5. Lente inzulin készítményekkel nem lehet érdemben befolyásolni a tejelő tehenek ovarialis funkcióit. 6. A kísérleti fejlesztés tárgyát képező két – egy-egy porított propilénglikol tartalmú, ill. egy lenmag alapú, magas linolénsav (C18:3 n-3) tartalmú – takarmány adalék anyag alkalmas az állat metabolikus státuszának a javítására. 7. A lenmag alapú, magas linolénsav (C18:3) tartalmú takarmány adalékanyag etetése révén egyes üzemekben növekedhet a tejtermelés, illetve a petefészek működése előbb ciklikussá válik. E jótékony hatás azonban legfeljebb csak indirekt módon, kisebb mértékben – gyakran egyáltalán nem – befolyásolja az első termékenyítések eredményességét.

48


A projekt eredményeit ismertető publikációk 1. Tudományos folyóíratokban megjelent, lektorált, teljes szövegű közlemények, magyar nyelven 1.1.

Keresztes M., Faigl V., Márton A., Ihnáth Z., Kulcsár M., Mézes M., Husvéth F., Huszenicza Gy.: A takarmány védett zsírokkal történő kiegészítésének szaporodásbiológiai vonatkozásai kérődzőkben. Irodalmi áttekintés. 1. rész. Magy. Áo. Lapja, 2007. 129. 525-530. (IF: 0,104)

1.2.

Keresztes M., Faigl V., Márton A., Ihnáth Z., Kulcsár M., Mézes M., Husvéth F., Huszenicza Gy.: A takarmány védett zsírokkal történő kiegészítésének szaporodásbiológiai vonatkozásai kérődzőkben. Irodalmi áttekintés. 2. rész. Magy. Áo. Lapja, 2007. 129. 707-712. (IF: 0,104)

2. Tudományos folyóíratokban megjelent, lektorált, teljes szövegű közlemények, idegen nyelven 2.1.

2.2.

Huszenicza Gy., Keresztes M., Balogh O., Faigl V., Kátai L., Földi J., Lemoniati, K., Kulcsár M.: Peri-parturient changes of metabolic hormones and their clinical and reproductive relevance in dairy cows. Magy. Áo. Lapja, 2008. 130. Suppl. 1, 45-51. (utolsó ismert 2007. évi IF: 0,104) Győrffy A., Keresztes M., Faigl V., Frenyó L., Kulcsár M., Gaál T., Mézes M., Zsarnovszky A., Huszenicza Gy., Bartha T.: Glycogenic induction of thyroid hormone conversion and leptin system activation in the liver of postpartum dairy cows. Acta Vet. Hung., accepted for publication (utolsó ismert 2007. évi IF: 0,474)

2.3.

Szenci O.: Diagnosis of early pregnancy and embryonic mortality by means of ultrasonography in the cow. Cattle Practice, 2007. 15. (Part 3) 283-288. (IF: 0.298)

2.4.

Egyed L. Gábor G. Kulcsár M. Tompó V. Szelényi Z. Sassi G. Tóth F. Huszenicza G. Szenci O.: Correlation between Bovine herpesvirus 4 level and infertility in dairy cow. Reprod. Dom. Anim.,2008, (közlésre elküldve)

3. Tudományos folyóíratokban megjelent abstractok 3.1. Egyed L, Gábor Gy, Kulcsár M, Tompó V, Szelényi Z, Sassi G, Tóth F, Huszenicza Gy, Szenci O: Correlation between bovine herpesvirus 4 level and late embryonic loss in dairy cow. Slovenian Veterinary Research 2006.43.Supplement 10.1.336 291. 3.2. Faigl V., Kátai L., Kulcsár M., Keresztes M., Gábor Gy., Balogh O., Földi J., Tóth F., Fébel H., Szenci O., Solti L., Huszenicza Gy.: Conception rate and embryonic mortality in Holstein-Friesian heifers. Abstract. Reprod. Dom. Anim., 2006. 41. 347. 3.3. Keresztes M., Faigl V., Győrffy A., Kulcsár M., Márton A., Gaál T., Fébel H., Gábor Gy., Bartha T., Szenci O., Huszenicza Gy.: Periparturient propylene glycol supplementation in Holstein-Freasian cows. Abstract. Reprod. Dom. Anim., 2007. 42. 118. 3.3.

Keresztes M., Sassi G., Faigl V., Kulcsár M., Mezes M., Febel H., Gabor Gy., Szenci O., Huszenicza Gy.: The effect of linseed based inert fat on reproductive and metabolic performance in Holstein-Frisian cows. Abstract (No 940). Magy. Áo. Lapja, 2008. 130. Suppl. 2., 215.

3.4.

Kátai, L., Kulcsár, M., Földi, J., Driancourt, M-A., Huszenicza, Gy.: Estrus control regimes in large-scale dairy herds with impaired reproductive performance. Abstract (No P056). Reprod. Dom. Anim., 2008. 43. Suppl. 3., 46.

49


3.5.

Keresztes, M., Faigl, V., Győrffy, A., Márton, A., Langer D., Kulcsár M., Gaal, T., Fébel, H., Húsvéth, F., Gábor, Gy., Bartha T., Szenci O., Huszenicza, Gy.: The effect of periparturient propylene glycol administration on metabolism and on reproductive performance in Holstein-Friesian cows. Abstract (No P058). Reprod. Dom. Anim., 2008. 43. Suppl. 3., 47.

3.6.

Kulcsár, M., Kátai, L., Földi, J., Gáspárdy, A., Fébel, H., Gábor, Gy., Driancourt, M.-A., Huszenicza, Gy: The slope of the postovulatory progesterone rise modulates pregnancy rate in Holstein-Friesian heifers. Abstract (No P063). Reprod. Dom. Anim., 2008. 43. Suppl. 3., 48.

4. Kongresszusi kiadványban megjelent idegennyelvű abstractok: 4.1. Egyed L, Gábor G, Kulcsár M, Tompó V, Szelényi Z, Sassi G, Tóth F, Huszenicza G, Szenci O.: Effect of bovine herpesvirus 4 level on fertility in dairy cow. (Szóbeli előadás), 24th World Buiatrics Congress, Nice, Franciaország, 2006. okt.15-19. OS-13-2. 5. Proceedingsben megjelent teljes szövegű magyar nyelvű közlemények: 5.1. Sassi G., Szelényi Z., Szenci O.: Gyakorta használt ivarzás-szinkronizálási módszerek tejhasznú szarvasmarha állományokban. (Irodalmi áttekintés). XVI. Magyar Buiatrikus Kongresszus, Balatonfüred, Proceedings, 2005.pp.37-43. 5.2. Mézes M, Balogh K, Szelényi Z, Gábor Gy, Szenci O.: A vérplazma és a vörösvérsejtek lipidperoxidációs és glutation redox státuszának változása az ellés körüli időszakban tejelő tehenekben. XVII. Magyar Buiatrikus Kongresszus, Gyula, Proceedings, 2006.pp.19. 5.3. Szelényi Z, Szenci O.: Az involúció lefolyásának, valamint komplex szaporodásbiológiai kezelések hatékonyságának ellenőrzése egy nagyüzemi holstein-fríz állományban (Előzetes közlemény). XVII. Magyar Buiatrikus Kongresszus, Gyula, Proceedings, 2006.pp.39-43. 5.4. Sassi G, Szelényi Z, Szenci O.: Ov-Synch és a Pre-Synch alkalmazása során szerzett hazai tapasztalatok. XVII. Magyar Buiatrikus Kongresszus, Gyula, Proceedings, 2006.pp.44-46. 5.5. Egyed L, Gábor Gy, Kulcsár M, Tompó V, Szelényi Z, Sassi G, Tóth F, Huszenicza Gy, Szenci O.: A BoHV-4 szint és a fertilitás közötti összefüggés vizsgálata tejhasznú tehenészetekben. XVII. Magyar Buiatrikus Kongresszus, Gyula, Proceedings, 2006.pp.6164. 5.6. Szenci O.: Szarvasmarha korai vemhességének megállapítása. XVIII. Buiatrikus Kongresszus. Siófok, 2007, pp.192-203. 6. Proceedingsben megjelent teljes szövegű idegen nyelvű közlemények: 6.1.

Szenci O.: Recent possibilities for the diagnosis of pregnancy and embryonic mortality in the cow. Congreso Nacional de Buiatría, Acapulco, Mexico, Memorias, 2006.pp.215.

50

2004

Recommend Documents