0318
HCV Ab Katalogové číslo: DBE-4250 (51001139) DBE-4251 Souprava pro enzymové imunostanovení
(96 testů) (192 testů)
ZKRÁCENÝ POSTUP
1. Napipetujte do jamek 200 μl negativní kontroly, kalibrátoru a pozitivní kontroly. Vynechejte jednu jamku pro blank. Napipetujte do jamek 200 μl diluentu vzorku a přidejte 10 μl vzorku. 2. Napipetujte do všech jamek 50 μl assay roztoku. Zkontrolujte, že barva v jamkách se vzorkem se změnila na tmavě modrou. 3. Inkubace 45 min při 37°C. 4. Promyjte 4-5x (350 μl). 5. Napipetujte 100 μl enzymového konjugátu kromě jamky A1 určené pro blank. 6. Inkubujte 45 min při 37°C. 7. Promyjte 4-5x (350 μl). 8. Napipetujte 100 μl substrátu do všech jamek i A1. 9. Inkubace 15 min při laboratorní teplotě (18-30°C) 10. Napipetujte 100 μl stop roztoku. 11. Odečtěte absorbanci při 450 nm a 620 nm.
POUŽITÍ ELISA metoda třetí generace pro kvalitativní detekci protilátek proti hepatitidě C (HCV Ab) v lidském séru nebo plasmě. Tato souprava může být použita pro screening krevních jednotek a sledování pacientů s HCV infekcí. Použití pouze pro in vitro diagnostiku.
SHRNUTÍ A VÝKLAD
Hepatitida C je virová infekce jater. Původce tohoto onemocnění byl identifikován v roce 1989. Objev a charakterizace viru hepatitidy C vedl k porozumění jeho primární role v potrasfúzní hepatitidě a tendenci přivodit perzistující hepatitidu 1-3. HCV je hlavní příčinou akutní hepatitidy, chronických jaterních onemocnění, jaterní cirhózy a karcinomu jater. Je odhadováno, že globálně je nakaženo 170 miliónů osob HCV s chronickou formou a k tomu jsou 3-4 miliony lidí infikovány nově každý rok 4. HCV se šíří primárně přímým kontaktem s lidskou krví. Hlavní příčinou infekce celosvětově je použití infikovaných krevních transfúzí, opakované používání injekčních stříkaček bez dostatečné sterilizace. V současné době není dostupná žádná vakcína na HCV a léčba chronické HCV je velmi drahá a většina lidí v rozvojových zemích si ji nemůže dovolit. Z globálního hlediska by mělo největší dopad na onemocnění hepatitidy C zvýšení úsilí v prevenci jejího nozokomiálního přenosu, tj. bezpečné krevní transfúze a injekční stříkačky, rizikové chování (užívání drog intravenózně) 5-7. Infekce HCV je virulentnější než HAV, HBV, HDV, HEV, které tvoří většinu případů virové hepatitidy. HCV je obalený RNA virus rodiny flaviviridae, která má velmi úzký hostitelský druh. Lidé a šimpanzi jsou jedinými známými druhy náchylnými k této infekci. Významným rysem tohoto viru je mutabilita jeho genomu, která pravděpodobně souvisí s častým přechodem této infekce do chronické formy (80%). HCV má několik různých genotypů, které mají vliv na průběh onemocnění a odpovědi na léčbu 8-12. Inkubační doba HCV před nástupem klinických symptomů je 15-150 dnů. U akutní infekce jsou nejčastějšími příznaky: únava a žloutenka. Nicméně ve většině případů 60-70% je průběh asymptomatický, i u těch, u kterých se vyvine chronická infekce. Asi u 80% nově infikovaných se rozvine chronická forma. K vývoji cirhózy dochází v 10-20% s chronickou formou onemocnění, karcinom jater se vyvine u 1-5% osob s chronickou formou do 2030 let. Většina pacientů trpících karcinomem jater, kteří nemají HBV, mají HCV infekci. Mechanismy, kterými HCV vede k rozvoji karcinomu jater, jsou neznámé. Jiná jaterní onemocnění rychleji progradují u pacientů s alkoholickou cirhózou a HCV. HCV se primárně šíří přímým kontaktem s lidskou krví. Přenos krevní transfúzí, které nejsou ošetřeny screeningem pro HCV, opětovné používání nedostatečně sterilizovaných injekčních stříkaček a dalších zdravotnických zařízení, nebo prostřednictvím jehel drogově závislých. Vyskytuje se také sexuální a prenatální přenos, ale v mnohem menší míře. Dalším způsobem přenosu jsou: tetování, piercing, obřízka při nedostatečné sterilizaci použitých předmětů. HCV se nepřenáší kýcháním, kašláním, objímáním, jídlem ani vodou 13-16. Ve vyvinutých i rozvojových zemích jsou vysoce rizikovou skupinou narkomani, příjemci transfúze, která nebyla podrobena screeningu HCV, hemofilikové, dyalizovaní pacienti a promiskuitní osoby provozující nechráněný sex. Je odhadnuto, že ve vyspělých zemích 90% pacientů s chronickou HCV jsou současní nebo bývalí narkomani. V rozvojových zemích, kde není screening krevních transfúzí, jsou nejčastějším zdrojem nákazy transfúzní přípravky a nesterilizované injekční jehly 17. WHO odhaduje, že asi 170 miliónů lidí, 3% populace lidí jsou infikováni HCV a jsou v riziku rozvinutí cirhózy jater a/nebo karcinomu jater. Prevalence HCV v některých zemích jako je Afrika, východní středomoří, jihovýchodní Asie je vysoký ve srovnání s některými zeměmi v severní Americe nebo Evropě 18-22 . Použití diagnostických testů na HCV jsou prevencí v přenosu HCV krevními deriváty a slouží k diagnostice pacienta, což umožní léčbu. Komerčně dostupné diagnostické testy jsou založeny na Enzyme immunosorbent assays (EIA) detekci specifických protilátek. EIA může odhalit více než 95% chronicky infikovaných pacientů, ale může detekovat pouze 50-70% akutních infekcí. Recombinant immunoblot assay (RIBA), které reagují s individuálními HCV antigeny jsou často používány pro konfirmaci. Detekci cirkulujícího HCV lze provést pomocí PCR, tato metoda se používá pro konfirmaci ELISA metod a sledování účinnosti antivirové terapie. Pozitivní výsledek ukazuje na přítomnost akutní infekce, možné šíření infekce nebo její přechod do chronické formy 23-26.
Antivirové léky, jako je interferon samotný nebo v kombinaci s ribavirinem, mohou být použity pro léčbu chronicky nemocných osob, ale náklady na tuto léčbu je velmi vysoké. Léčba interferonem je účinná u 10-20% pacientů. Interferon kombinovaný s ribavirinem je účinný asi u 30-50% pacientů. Ribavirin se zdá neúčinný při samostatném užívání 27. Není vakcína proti HCV. Výzkum probíhá, ale vysoká mutabilita HCV genomu komplikuje vývoj vakcíny. Nedostatek znalostí imunitní odpovědi také brání vývoji vakcíny. Není známo, zda imunitní systém může virus eliminovat 28-29. Nicméně některé studie ukazují přítomnost virus neutralizačních protilátek u pacientů s HCV infekcí. Protože neexistuje vakcína, musí se přenosu infekce zabránit následujícími způsoby: screening krevních dárců, inaktivace virů v derivátech plasmy, implementace a podpora zdravotní péče, zejména sterilizace lékařského a stomatologického vybavení, podpora změny chování široké veřejnosti a pracovníků ve zdravotnictví, poradenství pro vysoce rizikové skupiny jako jsou drogově závislí a promiskuitní lidé 30. V genomu jsou zakódovány strukturální komponenty proteinová nukleokapsida a dva obalené glykoproteiny; a funkční prvky, které zahrnují replikaci viru a zpracování proteinů. Nukleokapsida obsahuje oblast, která se zdá být konzervativní u většiny izolátů získaných po celém světě.
PRINCIP STANOVENÍ Mikrotitrační destička je koutována HCV specifickými antigeny “core” a “ns” , konzervativní oblasti a antigenní determinanty (jaderný peptid, rekombinační NS3, NS4, NS5 peptidy). Na pevné fázi je inkubován ředěný vzorek, jestliže jsou ve vzorku přítomny protilátky, naváží se na antigen. odstraní se nenavázané protilátky a přidá se konjugát. Po inkubaci se promytím odstraní nenavázaný konjugát a přidá se substrát. Vytvoří se barevný produkt, jehož intenzita je nepřímo úměrná koncentraci anti-HCV ve vzorku. Porovnáním optické denzity cut-off amoků jsou vzorky interpretovány jako pozitivní nebo negativní na přítomnost protilátky.
REAGENCIE Katalogové číslo
4250
4251
Počet testů
96
192
Mikrotitrační destička
1
2
Negativní kontrola
2 x 1,8 ml
3 x 1,8 ml
Pozitivní kontrola
1 x 1,8 ml
2 x 1,8 ml
Kalibrátor
1 lyo
2 lyo
Promývací roztok 20x koncetrovaný
1 x 60 ml
2 x 60 ml
Enzymový konjugát
1 x 16 ml
1 x 32 ml
Chromogenní substrát
1 x 20 ml
1 x 40 ml
Assay diluent
1 x 10 ml
1 x 20 ml
Stop roztok
1 x 20 ml
1 x 40 ml
Ředící roztok
1 x 50 ml
2 x 50 ml
Před použitím reagencie vytemperujte na laboratorní teplotu. Antigenem potažené jamky (mikrotitrační destička) „Antigen Coated Wells“ 12x8 lámacích stripů mikrotitrační destičky koutovaná jaderným peptidem, rekombinační NS3, NS4, NS5 peptidy, zatavená v obalu se sušidlem. Negativní kontrola „Negative Control“ Obsahuje 0,5% kasein, 10% glycerolu 25mM, natrium-citrátový pufr pH 4,8 +/-0,1, 0,5% NP40, 1mM DTT, 0,1% Kathon GC jako konzervant. Barevně kódováno olivově zeleně. Připraveno k použití. Pozitivní kontrola „Positive Control“ Obsahuje 2% BSA, lidské HCV protilátky, 100 mM Tris-HCL pufru pH 7,4±0,1 a 0,1% Kathon GC jako konzervant. Barevně kódováno tmavě zeleně. Připraveno k použití. Poznámka: i když je reagencie chemicky inaktivovaná, zacházejte s ní jako s potenciálně infekční. Kalibrátor „Calibrator“ Lyofilizovaná reagencie. Rekonstituujte s destilovanou vodou jak je uvedeno na štítku reagencie. Obsahuje 4% hovězích sérových proteinů, lidskou protilátku proti HCV kalibrovanou podle NIBSC Wirking Standard kód 99/558-003-WI, 0,2 mg/ml gentamicin sulfátu a 0.1% Kathon GC jako konzervant. Poznámka: objem nutný k rekonstituci se může u různých šarží lišit. Používejte přesný objem uvedený na štítku. I když je reagencie chemicky inaktivovaná, zacházejte s ní jako s potenciálně infekční. Koncentrát promývacího roztoku (20x) „Wash Buffer Concentrate“ 20x koncentrovaný roztok. Naředěný roztok obsahuje 10 mM fosfátového pufru pH 7±0,2, 0,05% Tween 20 a 0,05% Kathon GC. Konjugát „ Enzyme Conjugate “ Červeně zbarvený HRP konjugovaný s kozí polyklonální protilátkou proti IgG a IgM v MOPS pufru pH 6,2-6,7. Připraveno k použití. Obsahuje hovězí protein s 0,02% methylisothiazolone a bromonitrodioxane, 20 ppm Proclin 300.
Substrát „Chromogen Substrate“ 50 mM roztok citrát-fosfátového pufru. Připraveno k použití. pH 3,5-3,8, 4% dimethylsulfoxid, 0,03% tetrametylbenzidin (TBM), a 0,02% peroxid vodíku. Připraveno k použití. Poznámka: Chraňte před světlem. Assay roztok „Assay diluent“ 10 mM roztok pro odstranění interferencí. Obsahuje Tris pufr pH 7,8+/-0,1, 50% kozí sérum, 0,09% azid sodný, 0,1% Kathon GC jako konzervační prostředek. Připraveno k použití. Ředící roztok „Sample diluent“ Připraveno k použití. Obsahuje 0,5% kasein, 10% glycerol 25 mM, sodnocitrátový pufr pH 4,8+/-0,1, 0,5% NP40, 1mM DTT a 0,1% Kathon GC jako konzervant. Stop roztok „ Stop Solution“ Roztok 0,3 M kyseliny sírové. Připraveno k použití. Adhezivní fólie
DALŠÍ POTŘEBNÝ MATERIÁL
Inkubátor na 37 °C. Reader (vlnová délka 450 nm nebo 450/620 nm). Promývačka na mikrotitrační destičky. EIA voda (dvojitě destilovaná nebo deionizovaná voda, s použitím uhlí jako desinfekčního prostředku a pro odstranění oxidačních chemikálií. Stopky. Buničina. Vortex. Běžné laboratorní skleněné nádobí: odměrné válce, zkumavky atd. Mikropipety pro přesné dávkování 5 až 150 μl roztoku a jednorázové plastikové špičky.
SKLADOVÁNÍ A STABILITA REAGENCIÍ Reagencie musí být skladovány při 2-8 °C. Datum expirace je uvedeno na každé komponentě a na štítku na krabičce. Po otevření (a přípravě) mají reagencie omezenou stabilitu. Mikrotitrační destička: otevřete balení na protější straně od identifikačního kódu. Nepoužité stripy vraťte zpět do obalu a ten vložte do polyetylenového sáčku s vysoušedlem, zabraňte přístupu vzduchu. Negativní kontrola: Připraveno k použití, před použitím promíchejte na vortexu. Pozitivní kontrola: Připraveno k použití, před použitím promíchejte na vortexu. Kalibrátor: Rekonstituujte objemem uvedeným na štítku. Před použitím promíchejte na vortexu. Rekonstituovaný kalibrátor není stabilní. P o rekonstituci uchovávejte v alikvotech při -20 °C. Koncentrát promývacího roztoku: Nařeďte koncentrát EIA vodou na konečný objem 1200 ml a promíchejte. Zamezte tvorbě bublinek, mohlo by dojít k nedostatečnému promytí. Poznámka: Naředěný promývací roztok je stabilní 1 týden při teplotě 2-8°C. Enzymový konjugát: připraveno k použití. Před použitím promíchejte na vortexu. Zabraňte kontaminaci oxidačními chemikáliemi, prachem nebo mikroorganismy. Nevystavujte slunečnímu záření, styku s oxidačními agens a kovy. Pokud reagencii přeléváte, použijte plastové, pokud možno sterilní jednorázové nádobky. Diluent vzorku: Připraveno k použití. Před použitím promíchejte na vortexu. Substrát: Připraveno k použití. Před použitím promíchejte na vortexu. Zabraňte kontaminaci oxidanty, chemikáliemi, prachem nebo mikroby. Chraňte před světlem, oxidačními činidly a kovovými povrchy. Pokud reagencii přeléváte, použijte plastové, pokud možno sterilní jednorázové nádobky. Assay roztok: Připraveno k použití. Před použitím promíchejte na vortexu. Stop roztok: Připraveno k použití. Před použitím promíchejte na vortexu.
VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Použití pro in vitro diagnostiku. 1. Souprava může být použita pouze řádně proškoleným personálem, pod lékařským dohledem zodpovědným za laboratoř. 2. Personál provádějící tuto analýzu musí používat ochranné pomůcky: plášť rukavice, brýle. Personál by měl být školen v biologických procedurách, jak je doporučeno Centrem pro kontrolu nemocí v Atlantě a národní instituci pro zdraví: “Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories”, ed. 1984. 3. Personál, který přichází do styku se vzorky, by měl projít bezpečnou a efektivní vakcinací pro HBV, HAV. 4. Laboratoř by měla být zabezpečena tak, aby se zabránilo vstupu kontaminujícím látkám jako je prach nebo mikrobiální agens do ampulek a mikrotitračních destiček a při manipulaci s nimi. Substrát (TBM) chraňte před světlem. Zabraňte pohybu povrchu stolu kde se test provádí. 5. Soupravu skladujte v chladničce při teplotě 2-8°C. 6. Nezaměňujte komponenty různých šarží. 7. Zkontrolujte, zda jsou reagencie čiré bez viditelných částic nebo zákalu. 8. Vyhněte se kontaminaci mezi vzorky použitím jednorázových špiček a jejich výměny mezi jednotlivými vzorky. 9. Vyhněte se kontaminaci mezi reagenciemi použitím jednorázových špiček a jejich výměny mezi jednotlivými reagenciemi.
10. Nepoužívejte soupravu po uplynutí doby expirace. 6x otevřená souprava nevykazuje významnou ztrátu aktivity až do 6 měsíců po otevření. 11. Se všemi vzorky zacházejte jako s potenciálně infekčními. 12. Pro přípravu a použití kapalných komponent používejte plastové nástroje. 13. Odpad vzniklý použitím soupravy musí být likvidován v souladu s národními předpisy a zákony vztahujícími se k laboratornímu chemickému odpadu, zvláště tekutý odpad z promývacích kroků, rezidua kontrol a vzorků považujte za potenciálně infekční materiál. Navrhovaný proces inaktivace a ošetření infekčního materiálu je 10% Savo po dobu 16-18 hodin, nebo 20 min autoklávování. 14. Náhodně rozlité vzorky musí být otřeny papírovými utěrkami namočenými do desinfekce a poté utřeny vodou. Utěrky by pak měly být likvidovány jako laboratorní/nemocniční odpad. 15. Další odpadové materiály vygenerované při analýze např.: špičky, kontroly, mikrotitrační destička by měly být likvidovány jako potenciálně infekční matriál podle příslušných národních zákonů a směrnic týkajících se laboratorního odpadu. 16. Pipety musí být kalibrovány pro dávkování správných objemů požadovaných pro analýzu. Měly by být pravidelně kontrolovány, aby udržovaly přesnost do 1%. Komponenty pipety, které mohou přijít do náhodného kontaktu se vzorkem nebo komponentami soupravy se musí pravidelně dekontaminovat (70% ethanol, 10% roztok desinfekce). 17. ELISA inkubátor musí být nastaven na +37°C+/- 1°C a pravidelně kontrolován, zda udržuje teplotu. Pro inkubaci je vhodný suchý inkubátor i vodní lázeň za předpokladu, že je validován pro inkubaci ELISA testů. 18. Promývačka ELISA destiček je velmi důležitá. Promývačka musí být validovaná a správně nastavená pro tuto soupravu. Obvykle 4-5 promývacích cyklů (aspirace a dispenzace 350 μl promývacího roztoku do každé jamky na jeden cyklus. Promývací roztok by měl v jamce zůstat 23-30 sec. Je doporučeno, aby v každém běhu byly stanoveny negativní a pozitivní referenční vzorky. 19. Inkubační časy mají toleranci +/- 5%. 20. Reader musí být vybaven filtry 450 a 620-630 nm. Rozsah absorbance by měl být 0 až >2,0; linearita do >2,0 a opakovatelnost >1%. Pro správné určení optických hustot je zapotřebí, aby byl reader pravidelně kalibrován. Kontrola readeru by měla být uvedena výrobcem v manuálu. 21. Jestliže použijete ELISA automat, musí být zabezpečeny přesně všechny kritické kroky (inkubace, promytí, míchání, třepání, zpracování dat atd). V protokolu musí být jednotky a pracovní postup, zvláště pozornost se musí věnovat krokům pro dávkování vzorků a promývání, musí být zabráněno kontaminaci vzorků mezi jednotlivými jamkami. Použití ELISA automatu je doporučeno pro screening, kde je počet pacientů na jeden běh 20-30. V případě použití automatu musíte reagencie převést do jiných nádob, přelepujte štítky z originální ampulky. Tato operace je nutná, aby se zabránilo záměně reagencií. Po skončení testu uchovávejte přelité reagencie při 2-8°C.
ODBĚR VZORKU 1. Vzorek je plasma nebo sérum odebrané standardním způsobem ze žíly, se kterým se zachází podle zásad správné laboratorní praxe. Nebyl pozorován vliv citrátu, EDTA, heparinu. 2. Vyhněte se přidání konzervačních látek ke vzorku, obzvláště azid sodný může ovlivnit enzymovou aktivitu konjugátu. 3. Vzorky musí být jasně identifikovány a popsány, aby nedošlo ke špatné interpretaci výsledků. U souprav pro screening krevních jednotek by se měly používat čárové kódy. 4. Hemolytické a lipemické vzorky musí být z testu vyřazeny, protože mohou generovat falešné výsledky. Vzorky obsahující zbytky fibrinu nebo mikrobiální filamenta a těla musí být také vyřazeny, protože mohou dávat falešné výsledky. 5. Sérum a plasmu lze skladovat při 2-8 °C po dobu 5 dnů, zamražené při -20 °C po dobu delší. Vyhněte se opakovanému zamrazovanírozmrazování vzorku. 6. Jestliže jsou ve vzorku shluky, přefiltrujte vzorek pomocí filtru s 0,2-0,8 μm póry nebo centrifugujte při 2 000 rpm 20 min.
PRACOVNÍ POSTUP PŘED ANALÝZOU 1. Zkontrolujte datum expirace na štítku na obalu soupravy. Nepoužívejte proexpirované soupravy. 2. Zkontrolujte kapalné komponenty soupravy, zda nejsou kontaminované – viditelné částečky nebo agregáty. Zkontrolujte substrát, zda je bezbarvý nebo bledě modrý, aspirujte malý objem sterilní průhlednou pipetou. Zkontrolujte, zda nedošlo k vylití kapalin, přítomnost kapalin na obalu soupravy. Zkontrolujte, zda není poškozen hliníkový kryt na mikrotitrační destičce. 3. Připravte si promývací roztok, 20x nařeďte koncentrát, jak je popsáno výše. 4. Rekonstituujte kontroly, jak je popsáno výše. 5. Všechny ostatní komponenty vytemperujte na laboratorní teplotu a před použitím promíchejte. 6. Předehřejte si inkubátor na 37°C a připravte promývačku podle instrukcí výrobce. Nastavte správný počet promývacích cyklů. 7. Zkontrolujte ELISA reader, aby byl zapnutý alespoň 20 min před použitím. 8. Jestliže používáte ELISA automat, vyberte správný protokol metody. 9. Nastavte si pipety na požadované objemy. 10. Zkontrolujte, zda máte připraveno vše potřebné pro provedení analýzy. 11. V případě problému nepokračujte v analýze, ale poraďte se supervizorem.
PRACOVNÍ POSTUP
ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ
Automatické zpracování V případě, že test zpracováváte na Elisa automatu, navrhujeme nejdříve aspirovat 200 μl ředící roztoku a poté 10 μl vzorku. Celá směs je pak napipetována do příslušné jamky mikrotitrační destičky. Před aspirací dalšího vzorku je nutné jehlu promýt, aby nedošlo ke kontaminaci mezi vzorky. Kalibrátory a kontroly neřeďte, jsou připraveny k použití. Napipetujte 200 μl kontrol, kalibrátorů do příslušných jamek. Další operace jsou shodné s manuálním zpracováním popsaným níže. Je důrazně doporučeno kontrolovat čas mezi napipetováním prvního a posledního vzorku
Jestliže není dosaženo očekávaných výsledků, zkontrolujte následující:
Manuální zpracování: 1. Připravte si potřebný počet stripů. Vynechejte jamku A1 prázdnou pro blank. 2. Napipetujte 200 μl negativní kontroly v triplikátu, 200 μl kalibrátoru v duplikátu a 200 μl pozitivní kontroly v singletu. Kontroly a kalibrátor se neředí, jsou připraveny k použití. 3. Napipetujte 200 μl diluentu vzorku, poté napipetujte 10 μl vzorku do příslušných jamek. Opatrně promíchejte, vyhněte se kontaminaci mezi jednotlivými jamkami. 4. Napipetujte 50 μl assay roztoku do všech jamek, kontroly, kalibrátor, vzorky. Zkontrolujte, že barva vzorků se změnila na tmavě modrou. 5. Inkubujte 45 min při 37°C. 6. Promyjte mikrotitrační destičku pomocí automatické promývačky, jak je popsáno v sekci VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTÍ OPATŘENÍ. 7. Napipetujte 100 μl konjugátu do všech jamek s výjimkou jamky určené pro blank. Destičku překryjte. Zkontrolujte, že se barva ve všech jamkách s výjimkou jamky pro blank změnila na červenou. 8. Inkubujte 45 min při 37°C. 9. Promyjte mikrotitrační destičku, jak je popsáno v bodu 6. 10. Napipetujte 100 μl substrátu i do jamky určené pro blank 11. Inkubujte 15 min při laboratorní teplotě. 12. Napipetujte 100 μl stop roztoku ve stejné frekvenci jako jste pipetovali substrát. Zkontrolujte, zda pozitivní kontroly a pozitivní vzorky změnily barvu z modré na žlutou. 13. Změřte barevnou reakci na readeru při 450 nm, popř. i při 620-630 nm proti blanku v jamce A1.
Problém
Možná chyba
Absorbance blanku > 0,100
Kontaminovaný substrát
Negativní kontrola odečtení blanku OD > 0,050
po
1. Nedostatečné promytí 2. Nedostatečně připravená promývačka 3. Chyba v postupu metody, napipetování pozitivní kontroly namísto negativní 4. Kontaminace negativní kontroly, vzorku nebo konjugátu 5. Kontaminovaná pipeta nebo jehly promývačky vzorky nebo konjugátem 6. Jehly promývačky jsou ucpané
Kalibrátor Co/S OD < 1,1
1. 2. 3. 4.
Nebyl dodržen pracovní postup Došlo k chybě během pipetování Špatně nastavená promývačka Došlo ke kontaminaci kalibrátoru
Pozitivní <1,000
1. 2. 3. 4.
Nebyl dodržen pracovní postup Došlo k chybě během pipetování Špatně nastavená promývačka Došlo ke kontaminaci
kontrola
OD
VÝSLEDKY Cut-off hodnotu stanovíte podle následující formule:
Cut-Off (Co) = NC + 0,350 Důležité poznámky: Jestliže výsledky zpracováváte na automatu, výsledky budou vypočítány automaticky, pro správnou interpretaci zajistěte správnou formulaci výpočtu.
INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Výsledky můžete interpretovat podle následující tabulky:
DŮLEŽITÉ POZNÁMKY 1. Vizuálně kontrolujte, že byly vzorky naředěny a napipetovány do příslušných jamek. 2. Zkontrolujte, že barva diluentu vzorku po přidání vzorku se změní ze světle zelené na modrozelenou 3. Stripy překrývejte adhezivní fólií pouze při manuálním zpracování, při zpracování na automatu stripy nezakrývejte. 4. Dejte pozor, abyste se při pipetování konjugátu nedotýkali vnitřních částí jamek. Mohlo by dojít ke kontaminaci. 5. Konjugát nevystavujte silnému slunečnímu světlu. 6. Jestliže při měření nemáte k dispozici sekundární filtr, zabraňte otiskům prstů na dně mikrotitrační destičky při měření při 450 nm. Otisky prstů mohou způsobit falešně pozitivní výsledky. 7. Měření výsledků by mělo být provedeno ihned po přidání stop roztoku, nejpozději do 20 min po přidání. Oxidace chromogenu může způsobit vyšší pozadí. 8. Třepání při 350+150 rpm během inkubace zvyšuje citlivost metody asi o 20%.
KONTROLA KVALITY Validace testu se provádí pomocí kontrol s cílem ověření očekávaných hodnot při 450 nm nebo zda hodnoty vzorku/ kontroly jsou sladěny s analýzou. Kontrola
Absorbance
Blank
< 0,100
Negativní kontrola po odečtení blanku
<0,050
Kalibrátor 10 mIU/ml
Co/S ≥ 1,1
Pozitivní kontrolal
> 1,000
Jestliže výsledky splňují požadavky pro kontrolu kvality, můžete pokračovat další částí.
Co/S
Interpretace
< 0,9
Negativní
0,9 – 1,1
Hraniční
> 1,1
Pozitivní
Negativní výsledek indikuje, že pacient není infikovaný HCV nebo že jednotka krve může být podána. Každý hraniční výsledek by měl být znovu stanoven s novým odběrem vzorku za 1-2 týdny, krevní jednotka nesmí být podána. Pozitivní výsledek ukazuje na infekci HCV a podle toho by se s pacientem mělo zacházet. Krevní jednotka by měla být zlikvidována. Poznámka: 1. Interpretace výsledků by měla být pod dohledem laboratorního supervizora, aby se snížilo riziko nesprávných výsledků. 2. Pozitivní výsledek by měl být před stanovením diagnózy konfirmován. 3. Tato souprava může detekovat serokonvervzi protilátek anti-HCV core dříve než jiné soupravy. Proto pozitivní výsledek nepotvrzený těmito komerčními soupravami soupravami nemusí být falešně pozitivní! Vzorek musí být v každém případě konfirmován. 4. Skutečná pozitivita vzorku musí být vždy konfirmovaná. 5. Musí se zabránit chybě při přenosu výsledku z laboratoře na další oddělení. 6. Diagnóza virové hepatitidy může být pacientovi sdělena pouze kvalifikovaným lékařem. Negative Control: 0,019 – 0,020 – 0,021 OD450nm Mean Value: 0,020 OD450nm Lower than 0,050 Accepted Positive Control: 2,189 OD450nm Higher than 1,000 Accepted Cut-Off 0,020+0,350 = 0,370 Calibrator: 0,550 - 0,530 OD450nm Mean value: 0,540 OD450nm S/Co 1,4 S/Co higher than 1,1 Accepted Sample 1: 0,070 OD450nm Sample 2: 1,690 OD450nm Sample 1 S/Co < 0,9; negative Sample 2 S/Co > 1,1; positive
BBI WWHV 301
FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY Vyhodnocení výkonnostních charakteristik bylo provedeno podle běžných technických specifikací nebo CTS ((art. 5, Chap-ter 3 of IVD Directive 98/79/ EC).
Vzorek ID
HCV Ab výsledek S/Co
Ortho HCV 3 S/Co
Vzorek ID
HCV Ab Výsledek S/Co
Ortho HCV 3 S/Co
Limit detekce
01
11,3
> 5,0
11
3,2
> 5,0
02
11,3
> 5,0
12
11,3
> 5,0
03
11,3
> 5,0
13
11,3
> 5,0
04
10,7
> 5,0
14
11,2
> 5,0
05
0,1
0,0
15
8,0
> 5,0
06
11,2
> 5,0
16
6,3
> 5,0
07
4,2
> 5,0
17
9,0
> 5,0
08
0,2
0,1
18
10,6
> 5,0
09
8,5
> 5,0
19
1,6
> 5,0
10
11,3
> 5,0
20
10,7
> 5,0
Vzorek ID
HCV Ab S/Co
Ortho SAVe S/Co
01
0,1
0,0
Detekční limit stanovení byl vypočítán podle Britského pracovního standardu pro anti HCV NIBSC kód 99/588-003-WI. Tabulka níže obsahuje průměrné hodnoty při 450 nm, uvedený standard byl ředěn negativní plasmou a poté testován. Ředící faktor
Lot # 1 S/Co
Lot # 2 S/Co
1X
2,0
2,0
2X
1,1
1,2
4X
0,7
0,8
8X
0,5
0,5
Negativní plasma
0,3
0,3
Byly testovány vzorky Accurun 1 – series 3000 – dodávané Boston Biomedica Inc., USA výsledky jsou uvedeny níže:
BBI PHV 920
HCV Ab Lot ID
Accurun 1 Serie
S/Co
1201
3000
1,5
02
0,1
0,0
1,5
03
0,2
0,0
1,9
04
0,7
0,4
05
2,0
2,1
06
4,4
2,9
07
4,7
> 4,8
08
4,9
> 4,8
09
5,7
> 4,8
10
6,2
> 4,8
0602
3000
1202
3000
Bylo testováno 7 pozitivních vzorků na HCV Ab s Ortho HCV 3.0 SAVe, kód 930820, lot. # EXE065-1, byly ředěny negativní plasmou a testovány znovu soupravou HCV Ab lot. # 1202, a Ortho. Výsledky jsou uvedeny níže: Vzorek č
Limit ředění
HCV Ab S/Co
Ortho 3.0 S/Co
1
256 X
1,9
1,3
2
256 X
1,9
0,7
3
256 X
2,4
1,0
BBI PHV 908
4
128 X
2,5
3,2
Vzorek ID
5
85 X
3,3
1,4
HCV Ab S/Co
Ortho 3.0 S/Co
6
128 X
2,2
0,8
01
0,1
0,0
7
135 X
3,2
2,2
02
0,2
0,0
03
0,2
0,0
04
2,0
0,5
05
2,6
0,7
06
4,2
1,6
Diagnostická specificita
07
5,5
3,2
Specificita byla stanovena na panelu více než 5000 negativních vzorků získaných od dárců krve, klasifikovaných jako negativní metodami USA FDA. Bylo testováno 5043 dárců krve, specificita soupravy byla stanovena 99,5%. Bylo testováno 210 hospitalizovaných pacientů na HCV Ab, byla stanovena diagnostická specificita 99,5%. Mimoto byla diagnostická specificita stanovena testováním 162 vzorků, které obsahovaly potenciální interferenty (jiná infekční onemocnění, pozitivní protilátky proti E. coli, pacienti s nevirovým onemocněním jater, dialyzovaní pacienti, těhotné ženy, hemolytické a lipemické vzorky. Specificita byla 100%. Nebyla pozorována falešná reaktivita v závislosti na přípravě vzorku. Plasma (citrate, EDTA and heparin) ani sérum neovlivnily hodnotu specificity. Byly testovány také zmrazené vzorky, pro kontrolu interferencí u vzorků které se sbírají a zamrazují. Nebyla pozorována žádná interference.
08
5,8
3,7
09
7,8
4,5
10
8,2
4,8
11
8,2
4,9
12
9,1
5,1
13
8,5
5,1
Diagnostická specificita a senzitivita Vyhodnocení výkonnostních charakteristik bylo na základě testování více než 5000 vzorků.
BBI PHV 905
Diagnostická senzitivita
Vzorek ID
HCV Ab S/Co
Ortho 3.0 S/Co
Je definována jako pravděpodobnost pozitivity při přítomnosti daného analytu. Diagnostická senzitivita byla externě analyzována na celkovém počtu 359 vzorcích. Diagnostická senzitivita byla stanovena na 100%. Interně bylo testováno více než 50 vzorků, diagnostická senzitivita 100%. Byly také testovány pozitivní vzorky s jinými genotypy než je HCV. Byly studovány serokonverzní panely dostupné od Boston Biomedica Inc. Výsledky jsou uvedeny níže.
01
0,1
0,0
02
0,1
0,0
03
0,1
0,0
04
0,2
0,5
05
0,2
0,8
06
0,6
1,7
07
1,3
3,0
08
8,6
5,9
09
6,9
6,0
Nakonec byl výrobek testován na panelu EFS Ac HCV, lot 01/08.03.22C/01/A, dodávaný Etablissement Francais Du Sang (EFS), Francie, s následujícími výsledky: EFS Panel Ac HCV Vzorek
Lot # 1 S/Co
Lot # 2 S/Co
Lot # 2 S/Co
Očekávaný výsledek
HCV 1
2,2
2,4
2,6
positive
HCV 2
1,6
2,0
2,1
positive
HCV 3
1,5
1,7
1,6
positive
HCV 4
5,2
6,5
5,5
positive
HCV 5
1,6
1,8
1,6
positive
HCV 6
0,4
0,4
0,4
negative
Přesnost Přesnost byla vypočítána podle výsledků testování dvou vzorků, jeden negativní a jeden slabě pozitivní v 16 replikátech ve třech oddělených bězích. Výsledky jsou uvedeny níže: HCV Ab: Lot # 1202 16 negat. vzorků Mean
1st RUN
2nd RUN
3rd RUN
Průměrná hodnota
OD 450 nm
0,094
0,099
0,096
0,096
SD
0,008
0,007
0,008
0,007
CV%
8,7
6,6
7,9
7,7
Cal # 2 – 7K (N = 16) Mean
1st RUN
2nd RUN
3rd RUN
Průměrná hodnota
OD 450 nm
0,396
0,403
0,418
0,406
SD
0,023
0,029
0,027
0,026
CV%
5,9
7,1
6,4
6,5
S/Co
1,1
1,1
1,2
1,1
HCV Ab: Lot # 0602 16 negat. vzorků Mean
1st RUN
2nd RUN
3rd RUN
Průměrná hodnota
OD 450 nm
0,097
0,096
0,094
0,096
SD
0,009
0,010
0,008
0,009
CV%
8,9
10,1
8,4
9,1
Cal # 2 – 7K (N = 16) Mean
1st RUN
2nd RUN
3rd RUN
Průměrná hodnota
OD 450 nm
0,400
0,395
0,393
0,396
SD
0,021
0,025
0,026
0,024
CV%
5,4
6,2
6,6
6,1
S/Co
1,2
1,2
1,1
1,2
HCV Ab: Lot # 0602/2 16 negat. vzorků Mean
1st RUN
2nd RUN
3rd RUN
Průměrná hodnota
OD 450 nm
0,087
0,091
0,088
0,089
SD
0,009
0,007
0,008
0,008
CV%
10,0
8,2
8,6
8,9
Cal # 2 – 7K (N = 16) Mean
1st RUN
2nd RUN
3rd RUN
Průměrná hodnota
OD 450 nm
0,386
0,390
0,391
0,389
SD
0,023
0,021
0,023
0,022
CV%
6,0
5,3
5,8
5,7
S/Co
1,1
1,2
1,2
1,2
Variabilitu hodnot v tabulce nezpůsobilo nesprávné zařazení v tabulce.
Delta Biologicals S.r.l. Subsidiary of IVAX Diagnostics, INC. Via Nicaragua, 12/14 00040 - Pomezia (Roma) - ITALIA Tel. 06 91190 / Fax 069105244 www.deltabiologicals.it
OMEZENÍ Falešně pozitivní výsledky nebyly konfirmovány RIBA, nebo podobnými konfirmačními metodami, byly hodnoceny jako méně než 0,1% zdravé populace. Zmrazené vzorky obsahující partikule fibrinu nebo sraženiny mohou po rozmražení generovat falešné výsledky
LITERATURA 1. CDC. Public Health Service inter-agency guidelines for screening donors of blood, plasma, organs, tissues, and semen for evidence of hepatitis B and hepatitis C. MMWR 1991;40(No. RR-4):1-17. 2. Alter MJ. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology 1997;26:62S-5S. 3. McQuillan GM, Alter MJ, Moyer LA, Lambert SB, Margolis HS. A population based serologic study of hepatitis C virus infection in the United States. In Rizzetto M, Purcell RH, Gerin JL, Verme G, eds. Viral Hepatitis and Liver Disease, Edizioni Minerva Medica, Turin, 1997, 267-70. 4. Dufour MC. Chronic liver disease and cirrhosis. In Everhart JE, ed. Digestive diseases in the United States: epidemiology and impact. US Department of Health and Human Services, Public Health Ser-vice, National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases. Washington, DC: US Gov-ernment Printing Office, 1994; NIH publication no. 94-1447, 615-45. 5. Alter MJ, Hadler SC, Judson FN, et al. Risk factors for acute non-A, non-B hepatitis in the United States and association with hepati-tis C virus infection. JAMA 1990;264:2231-35. 6. Alter HJ, Holland PV, Purcell RH, et al. Posttransfusion hepatitis after exclusion of commercial and hepatitis-B antigen-positive do-nors. Ann Intern Med 1972;77:691-9. 7. Alter HJ, Purcell RH, Holland PV, Feinstone SM, Morrow AG, Mo-ritsugu Y. Clinical and serological analysis of transfusion-associated hepatitis. Lancet 1975;2:838-41. 8. Seeff LB, Wright EC, Zimmerman HJ, McCollum RW, VA Coopera-tive Studies Group. VA cooperative study of post-transfusion hepa-titis and responsible risk factors. Am J Med Sci 1975;270:355-62. 9. Feinstone SM, Kapikian AZ, Purcell RH, Alter HJ, Holland PV. Transfusionassociated hepatitis not due to viral hepatitis type A or B. N Engl J Med 1975;292:767-70. 10. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepa-titis genome. Science 1989;244:359-62. 11. Kuo G, Choo QL, Alter HJ, et al. An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human non-A, non-B hepatitis. Science 1989;244:362-4. 12. Alter HJ, Purcell RH, Shih JW, et al. Detection of antibody to hepa-titis C virus in prospectively followed transfusion recipients with acute and chronic non-A, non-B hepatitis. N Engl J Med 1989;321:1494-1500. 13. Aach RD, Stevens CE, Hollinger FB, et al. Hepatitis C virus infec-tion in post-transfusion hepatitis. An analysis with first- and second-generation assays. N Engl J Med 1991;325:1325-9. 14. Alter MJ, Margolis HS, Krawczynski K, Judson, FN, Mares A, Alex-ander WJ, et al. The natural history of community-acquired hepati-tis C in the United States. N Engl J Med 1992;327:1899-1905. 15. Alter, MJ. Epidemiology of hepatitis C in the west. Semin Liver Dis 1995;15:5-14. 16. Donahue JG, Nelson KE, Muåoz A, et al. Antibody to hepatitis C virus among cardiac surgery patients, homosexual men, and intra-venous drug users in Baltimore, Maryland. Am J Epidemiol 1991;134:1206-11. 17. Zeldis JB, Jain S, Kuramoto IK, et al. Seroepidemiology of viral infections among intravenous drug users in northern California. West J Med 1992;156:30-5. 18. Fingerhood MI, Jasinski DR, Sullivan JT. Prevalence of hepatitis C in a chemically dependent population. Arch Intern Med 1993;153:2025-30. 19. Garfein RS, Vlahov D, Galai N, Doherty, MC, Nelson, KE. Viral in-fections in short-term injection drug users: the prevalence of the hepatitis C, hepatitis B, human immunodeficiency, and human T-lymphotropic viruses. Am J Pub Health 1996;86:655-61. 20. Brettler DB, Alter HJ, Deinstag JL, Forsberg AD, Levine PH. Prevalence of hepatitis C virus antibody in a cohort of hemophilia pa-tients. Blood 1990;76:254-6. 21. Troisi CL, Hollinger FB, Hoots WK, et al. A multicenter study of vir-al hepatitis in a United States hemophilic population. Blood 1993;81:412-8. 22. Kumar A, Kulkarni R, Murray DL, et al. Serologic markers of viral hepatitis A, B, C, and D in patients with hemophilia. J Med Virology 1993;41:205-9. 23. Tokars JI, Miller ER, Alter MJ, Arduino MJ. National surveillance of dialysis associated diseases in the United States, 1995. ASAIO Journal 1998;44:98-107. 24. Osmond DH, Charlebois E, Sheppard HW, et al. Comparison of risk factors for hepatitis C and hepatitis B virus infection in homo-sexual men. J Infect Dis 1993;167:66-71. 25. Weinstock HS, Bolan G, Reingold AL, Polish LB: Hepatitis C virus infection among patients attending a clinic for sexually transmitted diseases. JAMA 1993;269:392-4. 26. Thomas DL, Cannon RO, Shapiro CN, Hook EW III, Alter MJ. He-patitis C, hepatitis B, and human immunodeficiency virus infections among nonintravenous drug-using patients attending clinics for sexually transmitted diseases. J Infect Dis 1994;169:990-5. 27. Buchbinder SP, Katz MH, Hessol NA, Liu J, O’Malley PM, Alter, MJ. Hepatitis C virus infection in sexually active homosexual men. J Infect 1994;29:263-9. 28. Thomas DL, Zenilman JM, Alter HJ, et al. Sexual transmission of hepatitis C virus among patients attending sexually transmitted diseases clinics in Baltimore--an analysis of 309 sex partnerships. J Infect Dis 1995;171:768-75. 29. Thomas DL, Factor SH, Kelen GD, Washington AS, Taylor E Jr, Quinn TC. Viral hepatitis in health care personnel at The Johns Hopkins Hospital. Arch Intern Med 1993;153:1705-12. 30. Cooper BW, Krusell A, Tilton RC, Goodwin R, Levitz RE. Seropre-valence of antibodies to hepatitis C virus in high-risk hospital per-sonnel. Infect Control Hosp Epidemiol 1992;13:82-5. Datum poslední revize: 26.6.2013
Distributor: Erba Lachema s.r.o., Karásek 1d, 621 00 Brno, CZ e-mail:
[email protected], www.erbalachema.com
