111. BAHAN DAN METOOE
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Nutrisi Ikan, Fakuttas Perikanan dan llmu Kelautan, lnstitut Pertanian Bqor. Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap.
Pada penelitian I dilakukan kajian untuk : 1) menentukan besarnya
penurunan suhu yang dapat menyebabkan ikan stres namun tidak mematikan, 2) mempelajari peran aklivasi insulin dalam mengatasi hiperglisemia ahbat stres. Data yang diperoleh akan digunakan sebagai acuan pada penditian selanjutnya. Pada penelitian I! dilakukan kajian terhadap: I) kadar kromium valensi tiga
(dalam bntuk kromium-ragi) untuk meningkatkan ketahanan ikan terhadap stres
suhu, 2) pertumbuhan pascastres ikan gurami yang mengkonsumsi pakan mengandung kmnium-ragi dan rnenentukan lama pemberian kromium-ragi.
3.1. PenelMan I 3.1.1. Peneman Besamya Penurunan Suhu yang Menyebabkan lkan Stms
Namun Tidak Mematikan Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh stres akibat berbagai tingkat penurunan suhu terhadap kelangsungan hidup dan pola kadar glukosa
datah pacastres. lkan gurami b e W t rata-rata 52.15i3.10 gramlekor sebanyak 160 ekor diadaptasikan dalam wadah penelttian selama 2 minggu. Selama masa adaptasi ikan d i k r i pakan komersial. Sebanyak 20 buah akuarium digunakan sebagai wadah ikan uji dengan kepadatan 5 ekor (untuk 1 kali sampling glukosa darah). Suhu air dalam wadah adaptasi maupun wadah uji dipertahankan pada kisaran
29-30% dengan cara diberi thermostat. Untuk menjaga homenitas suhu air
25 antar wadah diupayakan melalui sistem sirkubsi air dengan menggunakan pornpa. Setelah dipuasakan selama 48 jam, ikan dibefl perlakuan stres akut suhu dingin. Pemberian stres dilakukan dengan cara mengangkat dan memindahkan ikan ke dalam wadah yang mempunyai perubahan suhu air sebesar A-0, A-3, A
4
dan A-9 OC yang lebih rendah dari suhu air media pemdiharaan mula-mula. Setelah berlangsung d a m a lima menit,
ikan uji dipindahkan ke wadah
pemeliharaan sernula. Contoh darah diambil pada saat 0, 1, 2,3, 4, 5, 7, 9, 18 jam pascastres untuk dianalisis kadar glukosa darah. Sedangkan penghitungan jumlah ikan yang tahan hidup dilakukan selama pemberian stres suhu. Kedua informasi tersebut digunakan untuk menentukan besamya perubahan suhu dingin
yang mengakibatkan ikan stm pada tingkat paling tinggi namun belum mematikan. Kematian ikan diamati selama proses pemberian stres suhu.
3.1.2. Pemn Aktivasi Insulin dafam Mengatasi Hipergtlsemia Akibat S h s Penetitian ini bertujuan untuk mengetahui penganrh aktivasi insulin melatui injeksi insulin secara intrarnusular terhadap penrbahan pola kadar glukosa darah
pascastres. lkan gurami b r h b o t rata-rata 52.15f3.10 g yang telah beradaptasi dalam wadah pemeliharaan diberi injeksi insulin (Monotard HM, Novo Nordisk, Denmark)
yang mengandung Human Monocomponent Insulin 40 IUlmf.
Dosis yang
digunakan s e b r 0 dan 2 MI1 00 g BB W r a intramuskular pada bagian dorsal ikan.
Selanjutnya ikan tersebut dipindahkan ke lingkungan yang mengalami
penurunan suhu 9°C setama 5 menit dan dikembalikan lagi ke wadah semula.
26 Sampel darah diambil pada saat 0, 1, 2, 4, 10, 20, 40 dan 60 menit pascastres dan selanjutnya diukur k d a r glukosanya.
3.2. Penelitian II 3.2.1. Penentuan Kadar Optimum Krorniumagi yang Dapat Meningkatkan Ketahanan lkan Terhadap Pengaruh Stres Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji kadar kromium valensi tiga dalam bentuk kromium-ragi yang dapat meningkatkan ketahanan ikan terhadap stres perubahan suhu.
3.2.1.1. Pakan uji Pakan uji disusun dari bahan utama tepung ikan dan tepung bungkil kedelai sebagai sumber protein (Suprayudi
ef a/., 2000), tepung terigu sebagai
sumkr karbohidrat, dan ditambah dengan bahan-bahan sumber lemak dari minyak ikan dan minyak jagung.
Komposisi vitamin-mix dan mineral-mix
disesuaikan dengan kebutuhan vitamin dan mineral bagi ikan gurami (Mokoginta
et a!., 1996). Carboxymethyl cellulose (CMC) digunakan sebagai pengikat dan selulose ditambahkan sebagai penyisip.
Bahan-bahan tersebut difomulasikan
untuk menjadi pakan yang mengandung protein, karbohidrat dan EIP ratio beflurut-turut s e m r 32.1496, 41.98%, 8.0 kkaVg protein.
Formulasi bahan-
k h a n penyusun pakan dan hasil analisis pmksimat pakan petlakuan disajkan pada Tabel 2.
Pakan dibuat dengan cara mencampurkan semua bahan penyusunnya, yang dimulai dengan jumlah bahan yang terkecil hingga terbesar. Pencetakan
dilakukan dengan aiat penggiling mie dan dikeringkan dalarn oven pada suhu 40°C hingga kering.
Pada penelitian ini digunakan 4 perlakuan pakan uji yang mempunyai kandungan protein dan energi yang sama. Ke empat ransum tersebut mempunyai
pakan dibuat, hasil kandungan kromium 0.0, 1.5, 3.0,4.5 ppm ~ r ' ~ Setelah . analisis ~ r pakan ' ~ ternyata 0.0, 153.2dan 4.9 ppm. Tabel 2. Komposisi Bahan dan Proksimat Pakan Uji* Bahan Pakan (%)
Tepung ikan Tepung kedek
Tepung terigu Minyak ikan Minyak jagung Vitamin Mineral Ragi Kromium-Ragi (900.0ppm
Pakan dengan Kadar Kromium-ragi (ppm C i ' ) A (0.0) 8 (1.5) C (3.2) D (4.9)
21.03 35.54 23.93 2.12 1.26
21.03
21.03 35.54
21.03 35.54
23.93 2.12 1.26
23.93 2.d 2
23.93
2.00 5.87
2.00
0.50
0.33
2.00 5.87 0.77
35.54
5.87
1.26
2.12 1.26
2.00 5.87 0.W
0.00 0.17 0.33 0.50 Selulosa 5.90 5.90 5.W 5.90 Carboxymethil Cellulose 1.85 1.85 1.85 1.85 Komposisi proksimat (% bobot kering): Protein 32.55 32.53 32.79 32.4 BETN 39.30 40.50 40.73 41 -85 Lemak 6.33 6.26 6.22 6.17 Serat Kasar 9-16 8.32 7.77 7.11 Energi (kkal) 263.43 265.79 266.95 268.32 Kromium {ppm ~ r * ~ ) 0.00 I .50 3.20 4.W "Dimodifikasi dari formula Mokoginta et al. (1996) dan Suprayudi et at. (20W
3.2.1.2. Pemelihaman dan pengumpulan data lkan gurami (Osphonemus gournmy,Lac.) berbobot rata-rata 25*2.18 glekor dan telah diiaptasikan dengan lingkungan pembaan digunakan sebagai ikan uji. Sebanyak 20 buah akuariurn dengan ukuran 50x35~40cm,dgunakan
sebagai wadah pemeliharaan ikan, dengan padat penebaran 10 ekorhadah. Pemeliharaan ikan uji berlangsung selama 40 hari, dengan pemberian pakan 2 kali sehari pada pagi dan sore hari secara at satiation. Selama e i h a r a a n ,
suhu air dipertahankan 29-30 "C dengan rnenggunakan terrnostat. Kotoran ikan disifon dan volume air yang terbuang diganti setiap hari sebanyak
* 50 %.
K u a l i s air media pemeliharaan yang terdiri dari oksigen terlanrt, karbon dioksida
bebas, pH, amonia dan alkalinitas masing masing mempunyai nilai kisaran 6.026.25 ppm, 3.93-3.96ppm, 6.887.25, 0.15-0.53 ppm dan 16.50-21-36ppm. Nilai tersebut berada pada kisaran byak untuk mendukung kehidupan ikan dan proses-
proses metabotisrne secara normal.
Pada awal dan akhir pemelihaman ikan ditimbang untuk mengetahui bobotnya.
Pakan yang diberikan selama pemeliharaan ditimbang untuk
mengetahui bbot pakan yang dikonsumsi.
Pada akhir pemeliharaan, ikan
dipuasakan d a m a 48 jam dan setanjutnya diberi uji tantang stres pmurunan
suhu. Stres suhu diberikan dengan cara mengangkat dan memindahkan i k n ke
dalam wadah berisi air dengan suhu 20-21% (A-9% seperti pada basil penelitian I) selama 5 menit dan selanjutnya dikemklikan ke wadah semula. Sampel darah diambil pads jam ke 0, 0.6, 2, 3, 4, 5, 7 , 9, 18 pascastres guna pengukuran kadar glukosanya. Sampel darah pada 40 menit pascastres diukur h d a r kortisolnya. Pengukuran W a r glukosa darah dan kortisol digunakan untuk mengetahui resistensi ikan terhadap sires suhu. Untuk merninimumkan pengaruh stres akibat pengambilan contoh darah, maka ikan terlebih dulu dibius dengan MS 222.
Setdah pemeliharaan selama 40 hari, 6 ekor ikan pada setiap perlakuan diinjeksi dengan 10' sel bakteri Aemonas sp. secara intramuscular. Selanjutnya
29 ikan dipelihara selama 14 hari.
Penghitungan sel eribd, total leukosit,
hematokrit dan pengukuran Fe plasma dilakukan pada saat sebelum dan 14 hari setelah infeksi bakteri. Pengukuran Imunoglobulin total dilakukan pada 14 hari
setelah infeksi. Data tersebut digunahn untuk mengetahui respons imunitas ikan terhadap infeksi baheri.
Kromium pada hati, daging dan plasma diukur pa& akhir pemeliharaan
dari tiga ekor ikan dad setiap perlakuan. Pengukuran kromium dilakukan guna mengetahui kadamya dalam jaringan ikan setelah mengkonsumsi pakan mengandung berbagai kadar kromium-ragi.
3.2.1.3. Analisis kimia 3.2.1-3.1. Kadar glukosa darah
Kadar glukosa darah diukur dengan menggunakan metode Wedemeyer dan Yasutake (1977). Plasma sebanyak 50 pl dicampurkan ke dalsm 3.5 ml
pereaksi wama Gtoluidin dalam asam asetat glasial, clan dipanaskan dalam air mendidih sdama 10 menit. Nilai absohansinya dibaca dengan spektroftorneter
pada panjang gelombang 635nm. Kadar glukosa darah dihitung dengan formula
(Wedemeyer dan Yasutake, t 977) dengan:
[GD] : Konsentrasi glukosa darah (mgldl) AbsSp : Absohansi sarnpel AbsSt : Absorbansi standar [w] KonssnhaJi ghtkosa standm (mgfdl).
3.2.1.3.2. Kadar kortisol plasma
30
Kadar kottisol plasma diukur dengan teknik radioifnunoassay (RIA).
Sebanyak 25 p1 plasma darah dimasukkan ke dalam tabung polipropilen dan ditambahkan 1 ml kit reagen "Coat-A-Count Cortisol" yang mengandung radio
aM '251cortisol. Selanjutnya divorteks dan diinkubasikan selama 45 menit pada suhu 37°C. Penghitungan dilakukan dengan alat penghiung 'gamma counter", angka yang diperoleh kemudian dikonversi melalui cara kalibrasi untuk menghitung kadar kortisol. 3.2.1.3.3. Kadar kromium
Pengukuran kadar kromium dilakukan pada pakan uji, hati, daging dan plasma ikan pada saat awal dan akhir penelitian, dengan menggunakan prosedur Takeuchi (1988).
Sampel sebanyak 0.2-0.5 g mula-mula didestruksi dengan
asam nitrat dan dipanaskan selama 30 menit, kemudian didinginkan dan ditambah asam perklorat serta dipanaskan kembali hingga larut dan berwama oranye. Larutan tersebut diencerkan menjadi 100 ml clan dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 350 nm.
3.2.1-3.4. Leukosit, hernatokrit, eritrosit dan irnunoglobulin Penghitungan leukosit, hematokrit dan total irnunoglobulin mengikuti metode Anderson dan Siwicki (1993). Sampel darah diencerkan dengan laruian Tuk
sebanyak 20 kali, selanjutnya total sel leukosit dihitung dalam
haemasitometer dengan bantuan mikroskop. Hematokrit diukur dari prosentase
endapan sel darah dari contoh darah yang telah disentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 10 menit
dahm kapiler hematokrit. Pengukuran eritrosit
mengikuti metode Wedemeyer dan Yasutake (1977). Sampel darah diencerkan
dengan Larutan Hayern sebanyak 100 kali, selanjutnya sel eritrosit dihitung dalarn haemasitometer. 3.2.1 A.
Analisis statktik
Desain dari penelitian kedua mew pakan mdel eksperimental laboratoris, dengan menggunakan rancangan acak tengkap, yang terdiri atas 4 perlakuan dan
tiga ulangan. Perlakuan tersebut adalah 4 kelompok pakan standar (isoproteinisokalori) dengan suplementasi kromiumragi pada tingkat yang berbeda ; yaitu
pakan A (0.0 ppm C+3,), pakan 6 (1-5ppm c'~,), pakan C (3-2ppm Ct3,), dan pakan O (4.9 ppm C'3).
Respons dari berbagai tingka! suplementasi kromium pakan yang terdiri atas pertumbuhan, konsumsi pakan, efisiensi pakan, deposisi kromium, leukosit,
imunoglobulin, eritrosit, hematokrit, kortisol dan kadar Fe plasma, serta
kehngsungan hidup ikan dianalisis keragamannya dengan ANOVA yang dilanjutkan dengan uji Tukey serta dilakukan analisis regresi korelasi.
Data
performa g l u k m damh dianalisis secara diskriptif. Grafik ditampilkan dengan program Excel 2000.
3.2.1.5.
Peubah dan pengukurannya
3.2.15 1 . Kadar glukosa darah
Pota kadar glukosa darah dgarnharkan dari konsentrasi glukosa darah pada beberapa penode waktu. 3.2.1.5.2. Perturnbuhan relatif
dengan:
a
w, W,
: Peitumbuhan relatif (%) : ~ i b a n ~ ~ ~ p ~ d i t j a n ( g ) : Bobot ikan ratarata pada akhir penditian (g)
3.2.1.5.3. Efisiensi pakan
-
E
dengan:
w*+u-w, ..
E Wt Wo D F
: : : : :
-
,
x f00 (NRC, 1977)
Efisiensi pakan (%) Bobst ikan padpl akhir penelifian (g) Bobot ikan pada a w l penelitian (g) B o k t t d i k a n y a n g & ~ ~ ( g ) Jumlah total pakan yang dikonsumsi (g).
3.2.15 4 . Tingkat kelangsungan hidup
di mana:
SR Nt
: Tingkat kelangsungan hidup (%) : J u m M h n yang hidup pacia Edshir pmddmf~
No
(ekor) : &&ah &anp&a 4 pmihan (ekor)
3.2.2. Pertumbuhan Pascastms lkan Gurami sdalah Mengkonsurnsi Pakan Mengandung Kromium-mgi
Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji efek lanjut dari stres penurunan
suhu terhadap pertumbuhan ikan gurami setelah mengkonsumsi pakan mengandung kromium-ragi optmum hasil penelitian utama 1 (1.5 pprn ~ r ' dan ~ ) menentukan lama pernberian kromium-ragi.
3.2.2.1.
Pakan uji Bahan dasar pakan uji dan forrnulasinya seperti pada penelitian
sebelurnnya.
Pada penelxian ini digunakan 2 macam ransum isoprotein dan
isokalori dengan kandungan krorniumragi 0.0 dan 1.5 ppm ~ r yang ' ~selanjutnya
33 dikebut s e m i pakan A (kontrol) dan pakan 8 (1.5 ppm CT'~dalam bentuk
kromium-ragi).
3.2.2.2.
Pemellharaan ikan dan pengambilan data
lkan hasil stok dari formulasi terbaik yang diperoleh pada penelitin kedua 1. digunakan sebagai ikan uji yang selanjutnya dipelihara selama 40 had. Jadi
total lama pemeliharaan adalah 80 hari. lkan stok ini dibagi dalam 18 perlakuan dengan padat penebaran 10 ekorlakuarium. lkan diberi pakan 2 kali sehari pada pagi dan sore hari secara afsatiation. Wama priode pemdiharaan ke 2 (40 hari selanjutnya), ikan dibagi dalam dua kekmpok. Kelompok perkma, ikan sebanyak 90 ekor yang terdapat dalarn 9 akuarium diberi stres akut suhu dingin
A-9°C
selama 5 menit) W r a perbdik dengan frekuensi mingguan a n M m p o k lainnya tidak diberi stres. Wadah dan sistem pmeliharaan seperti pada peneliiian II. 1.
Pada tahap pemeliharaan pertama, 270 ekor ikan gurami yang berbobot rata-rata 16.41H.76g dibagi ke &lam 2 kebmpok. Kelompok A diberi pakan
kontrol dan kelompok 8 ( p l a n B,1.5 ppm ~ r ' ~dan ) dipdiharan selarna 40 hari. Kemudian pada fahap perneliharaan kedua, ikan pada kelompok A dibagi dalarn 2 sub kelompok, yaitu perlakuan AOT (pakan A + tanpa stres suhu) dan perlakuan AOS (pakan A + diberi stres suhu). Sedangkan ikan kelompok B dibagi dalam 4
sub kelompok, yaitu perlakuan B40T (pakan B seiarna 40 hari + tanpa stres suhu), perlakuan 640s (pakan B sehma 40 han' + sires suhu), perlakuan B80T (pakan B
sdama 80 hari + tanpa stres suhu), dan pdakuan B80S (pakan B selama 80 hari
+ stres suhu).
Setelah dibagi dalam 6 kelornpdr perlakuan. ikan dipeliham lagi
selama 40 hari.
Dengan penyiponan, pemakaian krmostat dan wrasi serta peQantian air yang baik menghasilkan kualitas air yang sangat baik.
Hal ini terlihat dari
kandungan oksigen yang tinggi antam 6.47 hingga 7.05 pprn dan bwngan rnetabolik yang rendah, yaitu COz, dan amonia masingmasing dengan nilai kisaran 3.93 hingga 3.96 ppm dan 0 sampai 0.059 ppm. Suhu air cukup stabil dengan kisaran 29 sampai 30 OC. Nilai pH berada pada kisaran 6.88 dan 8.16. Lingkungan yang sangat baik ini mampu mendukung kehidupan dan tidak menjadi
kendala dalam pmses pertumbuhan ikan gurami.
Pada awal dan akhir pemeliharaan tahap 2, ikan ditimbang untuk mengetahui bobotnya.
Pakan yang diberikan selama pemeliharaan tahap 2
ditimbang untuk mengetahui bbot pakan yang dikonsumsi.
Pada akhir
pemeliharaan, ikan dipuasakan selama 48 jam dan selanjutnya diberi uji tantang stres penurunan suhu.
Stres suhu diberikan dengan cam mengangkat dan
memindahkan ikan ke dalam wadah berisi air dengan suhu 20-21°C (d-g°C seperti
pada hasil peneliian pedarna) selarna 5 menit dan selanjutnya dikembalikan ke wadah semula.
Sampel darah diambl pada jam ke 0, 0.6, 2, 3, 4, 5, 7,9, 18
pascadres guna pengukuran kadar glukosanya.
Pengukuran kadar glukosa
darah digunakan untuk mengetahui resistensi ikan terhadap stres suhu.
Setelah pemeliharaan selama 80 hari, 6 ekor ikan pada setiap perlakuan diinjeksi dengan 10' seI bakteri A e m o n a s sp. secara intramuscular. Selanjutnya
ikan dipelihara selama 14 hari.
Penghitungan sel eritrrwit, t e l bukmit,
hernatokrit dilakukan pada saat sewurn dan 14 setelah infeksi bakteri.
35 Pengukuran lmunoglobulin total dibkukan pada 14 hari setelah infeksi. Data
tersebut digunakan untuk mengetahui respons irnunitas ikan terhadap infeksi bakleri.
Kromium pada hati, daging dan plasma diukur pada akhir pemeliharaan tahap 2 dengan menggunakan tiga ekor ikan dari setiap perlakuan. Pengukuran
k m i u m diiakukan guna mengetahui kadamya dalam jaringan ikan setdah mengkonsumsi pakan mengandung krornium-ragi optimum dan diberi stres penurunan suhu.
3.2.2.3. Analisis kimia Analisis kimia yang diiakukan pada percobaan 2 ini tepdiri atas kadar glukosa darah, kadar kromiurn, leukasit, hematokrit, eritrosit dan imunoglobulin.
Metode pengukuran yang digunakan sama dengan metode pada penelitian I!. 1.
3.2.2.4.
Anarmis statistik Oesain dari penelitian ini merupakan model eksperimental laboratoris,
dengan menggunakan rancangan acak lengkap brfaktor (3 x 2). Faktor pertama adalah lama waktu pemkrian kromiurn-ragi 1.5 pprn ~ r dalam * ~ pakan isoprotei-
isokalori. Faktor pertama terdiri atas tiga taraf, yaitu A (pakan kontml tanpa kromium-ragi), B (lama pemberian krornium-ragi 40 hari), dan C (lama pemberian kromium-ragi 80 hari). Sedangkan faktor kedua terdiri atas dua taraf pertakuan, yaitu dikri dan tidak diberi stres suhu dingin A-g°C selama 5 menit yang
diaplikasikan secara berulang setiap minggu. Pada penelitian ini terdapat 6 macam perlakuan dan setiap perlakuan mempunyai 3 ulangan.
36 Untuk mengetahui penganrh lanjut dati stres penurunan suhu dan lama waktu pernberian kromium-ragi terhadap variabd pertumbuhan, kelangsungan
hidup, efisiensi pakan, leukosit, eritrosit, hematokrit dan imunogloulin dilakukan analisis ragam model faktorial.
Untuk mengetahui lama waktu efektiirtas
pernberian kmiurn-ragi dilakukan analisis regresi korelasi.
Pertumbuhan
kompensasi dihitung dari selisih antara pertumbuhan ikan yang tidak diberi stres dengan pertumbuhan ikan yang diberi stres. Data kadar glukosa darah dianalisis secara deskriptrf. Garfik ditampilkan dengan menggunakan program Excell 2000.
3.2.2.5.
Peubah dan pengukurannya Pengukuran peubah yang terdiri atas pola glukosa darah, laju
pertumbuhan, efisiensi pakan, tingkat kelangsungan hidup dilakukan dengan wra
yang sama dengan penelitian II. 1.
