1 Význam používání barviv v potravinách a důležitost jejich stanovení

Obsah 1 Význam používání barviv v potravinách a důležitost jejich stanovení .............................2 2 Barviva a jejich vlastnosti...................................................................................................3 2.1 Přírodní barviva ...........................................................................................................3 2.2 Syntetická barviva........................................................................................................4 2.3 Vlastnosti a použití ......................................................................................................5 3 Používané analytické metody pro stanovení barviv ...........................................................7 3. 1 Ultrafialová a viditelná spektrofotometrie ..................................................................9 3. 2 Chromatografické metody ........................................................................................12 3. 2. 1 Plynová chromatografie ....................................................................................13 3. 2. 2 Kapalinová chromatografie...............................................................................16 3. 2. 3 Adsorpční kapalinová chromatografie..............................................................19 3. 2. 4 Rozdělovací kapalinová chromatografie ..........................................................20 3. 2. 5 Iontově–výměnná chromatografie ....................................................................21 3. 2. 6 Gelová permeační chromatografie....................................................................22 3. 3 Elektromigrační metody ...........................................................................................23 3. 3. 1 Kapilární elektroforéza .....................................................................................25 3. 3. 2 Kapilární elektroforéza ve volném roztoku ......................................................29 3. 3. 3 Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie .......................................29 3. 3. 4 Kapilární elektrochromatografie.......................................................................30 3. 3. 5 Izotachoforéza...................................................................................................30 4 Rozbor literatury zabývající se stanovením barviv...........................................................32 5 Závěr .................................................................................................................................37 6 Literatura...........................................................................................................................38

2

1 Význam používání barviv v potravinách a důležitost jejich stanovení Barviva (barevné látky, pigmenty) jsou významnou skupinou senzoricky aktivních látek potravin. Stabilizují přirozenou barvu potravin

a jejich barvení se provádí od

nepaměti z důvodů estetických, ale nezanedbatelné nejsou ani fyziologické důvody. Dalším důvodem je standardizace zbarvení, např. kompenzace sezónních výkyvů. Atraktivní barva potraviny souvisí se spotřebitelskou oblibou, zvyšuje sekreci žaludečních šťáv a dochází k lepšímu využití dané potraviny. V některých případech může být přirozená barva barvou nežádoucí a odstraňuje se potom pomocí bělidel. Zájem o sledování barviv v potravinách vzrostl poté, co byly zjištěny karcinogenní účinky některých barviv. Jednalo se o syntetické barviva rozpustné v tucích. U mnohých je prokázáno hemolytické působení, inhibice některých enzymů a negativní působení na žaludeční sekreci. Některá syntetická barviva mohou škodit také obsahem reziduí z výroby (různých uhlovodíků, těžkých kovů), jiná jsou podstatně méně akceptovatelná než ostatní vzhledem ke způsobení alergických reakcí. Potravinářská barviva musí splňovat ještě i další požadavky. Nesmí nepříznivě ovlivnit ostatní organoleptické vlastnosti přibarvené potraviny, zejména chuť a vůni. Musí mít vysokou barevnou mohutnost a být dobře rozpustná ve vodě. Nesmí docházet k interakcím s jinými složkami potravin. Barvivo musí být stálé vůči změnám pH, oxidačně redukčním vlivům, vůči světlu, teplu a u pevných potravin i vůči vlhkosti. V neposlední řadě musí být i ekonomicky dostupné. Povolení využívání barviva jako potravinářského aditiva je autorizováno státem a musí zajistit spotřebiteli zdravotní nezávadnost. Druhy a počty povolených barviv se v jednotlivých zemích liší. Ve většině zemí je povoleno okolo deseti druhů syntetických barviv. V České republice upravuje barvení potravin zákon č. 110/197 Sb. o potravinách a tabákových výrobcích a vyhláška MZ ČR č. 298/1997 Sb. Ve smyslu těchto legislativních předpisů jsou za barviva považovány látky získané z potravin a dalších složek přírodního původu extrakcí fyzikální a chemické povahy, která má za následek selektivní oddělení barevné látky. Potraviny, chuťové a aromatické látky a jejich složky, které se přidávají během výroby do potravin pro své aromatické nebo chuťové vlastnosti a přitom mají sekundární barvicí účinek (např. mletá paprika, šafrán, kurkuma) a dále barviva používaná k barvení nejedlých vnějších částí potravin (např.

3

povrchové povlaky sýrů, salámová střívka), se za barviva ve smyslu této vyhlášky nepovažují. Seznam barviv povolených v ČR je uveden tabulce (str. 5).

2 Barviva a jejich vlastnosti Rozdělení barviv: Barviva (pigmenty) nacházející se v potravinách se podle původu dělí na: •

Přírodní barviva

•

Syntetická barviva identická s přírodními

•

Syntetická barviva

2.1 Přírodní barviva Přírodní barviva jsou barevné látky a mohou být: •

Přirozenou součástí potravin živočišného nebo rostlinného původu danou genetickými dispozicemi daného organismu

•

Součástí jiných než potravinářských materiálů přírodního původu (pigmenty řas, hub, lišejníků či mikroorganismů), ze kterých se získávají v původním stavu; jako takové nebo strukturně pozměněné se používají k barvení potravin. Mezi přírodní barviva se často také řadí barevné produkty získávané z přírodních

surovin různými technologickými procesy, např. karamel a sladový extrakt, které obsahují melanoidiny. K přírodním barvivům se běžně řadí také měďnaté komplexy chlorofylů a chlorofyllinů, které se v přírodě nenacházejí (nebo se mohou vyskytovat v zanedbatelném množství), anorganické pigmenty (např. uhličitan vápenatý, oxid železitý, titaničitý) a syntetická barviva identická s přírodními. Přírodní barviva se klasifikují podle struktury, výskytu v biologických materiálech či důležitých vlastností (rozpustnost ve vodě a v tucích). Podle struktury se rozeznávají následující základní skupiny barviv: •

Dusíkaté heterocyklické sloučeniny, kam náleží pigmenty odvozené od pyrrolu a dále pigmenty odvozené od indolu, isochinolinu, pyrimidinu, resp. purinu, pterinu a příbuzného lavinu, Renatinu a fenoxazinu; některé z nich patří současně mezi alkaloidy; k nejvýznamnějším barvivům se řadí hemová barviva odvozená od pyrrolu.

4

•

Kyslíkaté heterocyklické sloučeniny, kam náleží množství fenolových sloučenin, zejména tzv. flavonoidy, z nichž nejdůležitějšími barvivy jsou anthokyany; k nim se řadí příbuzné pigmenty odvozené od isochromenu a xanthonu.

•

Další fenoly a od nich odvozená barviva zahrnují stilbeny, kurkuminoidy, nerůznější chinony, jejich oligomery, kondenzační a jiné produkty.

•

Terpenoidy, kam se řadí tetraterpenové a některé další od tetraterpenů odvozené pigmenty zvané karotenoidy a některé monoterpenové pigmenty iridoidy; nejvýznamnější skupinou těchto barviv jsou karotenoidy.

2.2 Syntetická barviva Syntetická barviva mají obecně intenzivnější barvu než barviva přírodní, stálý odstín barvy a nevnášejí do barvené potraviny charakteristické vůně a chuti. Syntetická barviva proto nalezla v potravinářské praxi široké uplatnění, a to hlavně z ekonomických a praktických důvodů (kromě shora uvedených důvodů jsou levnější a stabilnější než přírodní barviva). Podle struktury se rozeznávají: •

Azobarviva (monoazo-, bisazo-, trisazo- až polyazobarviva)

•

Difenylmethanová a trifenylmethanová barviva

•

Pyrazolonová barviva

•

Nitrobarviva

•

Xanthenová barviva

•

Anthrachononová barviva

•

Chinolinová barviva

•

Indigoitní barviva

Podle rozpustnosti se syntetická barviva dělí na: •

Rozpustná ve vodě

•

Rozpustná v tucích

Podle fyzikálně-chemických vlastností se syntetická barviva klasifikují na: •

Kyselá

•

Zásaditá

•

Neutrální

5

Všechna syntetická barviva povolená k barvení potravin jsou ve vodě rozpustné sloučeniny. Nejvíce zastoupena jsou kyselá barviva obsahující sulfonové skupiny, karboxylové skupiny a hydroxyskupiny. Náleží k nim většinou azobarviva, některá di- a trifenylmethanová barviva, nitrobarviva a xanthenová barviva. Zásaditá barviva obsahují jednu nebo více volných nebo substituovaných aminoskupin. Patří mezi ně většina di- a trifenylmethanových barviv a některá azobarviva. Všechna barviva se používají ve formě solí (nejčastěji sodných, také draselných nebo vápenatých). Specifické vlastnosti barviv závisí na přítomných funkčních skupinách. Charakteristická je přítomnost dvou druhů funkčních skupin, chromoforů a autochromů. Chromoforové skupiny souvisí s klasifikací barviv podle struktury (azoskupiny, nitroskupiny aj. ) a jsou zodpovědné za chování barviv při oxidačních reakcích. Auxochromní skupiny jsou zodpovědné za barvící vlastnosti a chování vůči kyselinám, alkáliím, světlu a teplu.

2.3 Vlastnosti a použití Požadavky na syntetická barviva: Nejdůležitějším požadavkem je zdravotní nezávadnost, syntetická barviva musí být chemickými individui a kromě barvy nesmí ovlivňovat jiné organoleptické vlastnosti potraviny. Dalšími podmínkami je stálost při změnách pH, na světle a vůči působení některých dalších vlivů. Obecně není žádné současné barvivo zcela vyhovující pro všechny aplikace a situace. K barvení se většinou používá několikasložkových směsí barviv. V potravinářství se používají barviva, která jsou stabilní při zpracování surovin, výrobě a skladování. Důležité je zamezit přístupu světla. Azobarviva se mohou poměrně snadno redukovat ionty kovů a některými redukčními činidly, (např. oxidem siřičitým nebo askorbovou kyselinou přítomnou v nápojích), na bezbarvé produkty. Trifenylmethanová, indigoitní a xanthenová barviva jsou stabilnější, působením UV záření však dochází k odbarvení indigotinu a erythrosinu. Syntetická barviva se dodávají: •

Ve

formě

disperzí,

past,

vodných

nebo

nevodných

roztoků

(hlavně

v propylenglykolu či glycerolu) nebo pevném stavu (jako ve vodě rozpustné granule, prášek) •

Ve formě ve vodě nerozpustných laků

6

Pevné přípravky jsou vhodné hlavně pro barvení nápojů, disperze a pasty pro barvení cukrářských a pekařských výrobků, tekuté barvy pro mléčné výrobky. Laky (aluminiové laky) se získávají adsorpcí barviv na hydratovaný oxid hlinitý. Mají různý obsah barviva, běžně 10-40%. Minimální obsah není určen, neboť barevná mohutnost laků souvisí i s technologií jejich výroby, která určuje jejich barvící mohutnost, odstín a disperzibilitu v prostředí. Laky, které obsahují jednotlivá barviva nebo jejich směsi, se dodávají v pevném stavu nebo jako disperze (v hydrogenovaných rostlinných olejích, propylenglykolu, glycerolu, cukerném sirupu). Laky vykazují ve srovnání s příslušnými barvivy vyšší chemickou a tepelnou stabilitu. Vhodné jsou zejména pro barvení potravin obsahujících více tuků a pro potraviny s nízkým obsahem vody [1]. Tabulka č.1 Přírodní barviva a anorganické pigmenty povolené v ČR Číslo E

Název

100 Kurkumám 101 (i) riboflavin, (ii) riboflavin-5´-fosfát 120 košenila, karminová kyselina, karminy 140 chlorifyly a chlorofyliny, (i) chlorofyly, (ii) chlorofyliny měďnaté komplexy chlorofylů a chlorofylinů, (i) Cu komplexy chlorofylů, (ii) 141 Cu komplexy chlorofyllinů 150a karamel, kulér 150b kaustický sulfinový karamel 150c amoniakový karamel 150d amoniak-sulfitový karamel 160a karoteny, (i) směs karotenů, (ii) ß-karoten 160b annatto, bixin, norbixin 160c paprikový extrakt, kapsanthin, kapsorubin 160d Lykopen 160e ß-apo-8´-karotenal 160f ethylester ß-apo-8´-karotenové kyseliny 161b Lutein 161g Kanthaxanthin 162 betalainová červeň, betanin (včetně extraktů z červené řepy

7

163 anthokyany (získané fyzikální postupy z ovoce a zeleniny) 170 uhličitan vápenatý 171 oxid titaničity (titanová běloba) 172 oxidy a hydroxidy železa 173 hliník (v podobě pigmentu) 174 stříbro (v podobě pigmentu) 175 zlato (v podobě pigmentu)

Syntetická potravinářská barviva a některé jejich atributy číslo E Název 102 tartrazin chinolinová 104 žluť 110 žluť SY 122 azorubin 123 amaranth

Synonymum

Gelborange S

karmoisin viktoriarubin O košenilová červeň A

FD&C název Druh barviva Yellow No. 5 pyrazolonové chinolinové Yellow No. 6 monoazo monoazo monoazo

Barva citronové žlutá žlutá oranžová modročervená modročervená

124 ponceau 4R červená monoazo 127 erythrosin Red No. 3 xanthenové červená monoazo modročervená 128 červeň 2G červeň Allura 129 AC monoazo červená patentní modř 131 V trifenylmethanové zelenomodrá 132 indigotin indigokarmin Blue No. 2 indigoidní tmavě modrá 133 brilantní modř brilliant blue FCF Blue No. 1 trifenylmethanové zelenomodrá 142 zeleň S trifenylmethanové zelená 151 čerň BN brilliant blue BN bisazo černá směs monoazo, 154 hněď FK bisazo a trisazo hnědá 155 hněď HT bisazo hnědá 180 litholrubin BK karmin 6B monoazo červená

3 Používané analytické metody pro stanovení barviv Zájem hygieniků o potravinářská syntetická barviva vzrostl, zejména když u řady běžně používaných barviv byly zjištěny pravděpodobné kancerogenní účinky. Výsledkem byl zákaz jejich používání ve většině zemí. Z uvedeného vyplývá, že stále existuje nutnost

8

neustálého zkoumání rizik používání syntetických barviv na lidské zdraví, s čímž souvisí i detekce těchto barviv v potravinách a nápojích a stanovení jejich koncentrací. Pro stanovení obsahu jednotlivých syntetických barviv ve vzorcích potravin, nápojích a jejich koncentrátech lze použít řadu separačních a optických metod. K nejstarším známým metodám důkazu přítomnosti syntetických barviv v různých druzích potravinářských výrobků patří vybarvovací zkoušky na odtučněném vlněném vlákně nebo metoda vybarvování polyamidového prášku. U kapalných vzorků se dokazuje přítomnost barviv přímo, u tuhých vzorků je po homogenizaci třeba barviva extrahovat vodou. Kyselá barviva se dají izolovat extrakcí amylalkoholem a následnou vícenásobnou extrakcí do vody. Z bílého vlněného vlákna se nejprve odstraní tukové složky a nečistoty a takto připravené vlákno se namočí do roztoku vzorku a při 70-100 oC se po dobu 10-30 minut nechá adsorbovat syntetické barvivo. Adsorbují se i antokyaniny, pokud jsou přítomny, ty se však odstraní vypráním ve studené vodě. Pokud zůstane vlákno po vyprání zabarvené, je to důkaz přítomnosti syntetického barviva. U metody vybarvování polyamidového prášku se postupuje obdobně. Při identifikaci jednotlivých barviv se využívají spektrální metody v UV a viditelné oblasti, charakteristika absorpčních spekter, fluorescence. Ke stanovení potravinářských barviv se dají využít chromatografické, spektrofotometrické, elektrometrické a elektromigrační metody. V minulosti se jakožto metody analýzy potravinářských barviv používaly především chromatografické metody papírová, tenkovrstvá a kolonová. V současnosti se nejvíce používá vysoce účinná kapalinová chromatografie, kapilární zónová elektroforéza, micelární elektrokinetická chromatografie, iontově párová chromatografie a iontově výměnná chromatografie. Kapilární elektroforéza je vhodná především pro kyselá azo- a triarylmetanová aniontová barviva. Výsledky všech metod jsou obvykle ve velmi dobré shodě s výjimkou vzorků obsahujících směs barviv s podobnými absorpčními maximy. V tomto případě je jednoduchá metoda metoda UV/VIS spektrometrie zatížena velkou chybou. Tato metoda je výhodná především u vzorků jednotlivých barviv. V případě složitějších směsí barviv nebo barviv s podobnými optickými charakteristikami je vhodné použít více či méně komplikované postupy vícesložkové analýzy. Kapilární elektroforéza poskytuje velmi dobré výsledky i postačující citlivost stanovení. Její hlavní výhodou je především malá spotřeba vzorku a základního

9

elektroforetického pufru a krátká doba analýzy. Uvedená metoda dává velmi dobré výsledky nejen v oblasti syntetických barviv potravinářských, ale i dalších barviv obsahujících sulfo-, karboxy- nebo hydroxyskupinu. Tato barviva v neutrálním nebo zásaditém prostředí tvoří negativně nabité ionty a to umožňuje jejich snadné a rychlé stanovení. Naopak u přírodních barviv se tyto skupiny nevyskytují vůbec nebo jen velmi ojediněle a to spolu s velikostí molekul jednotlivých přírodních barviv komplikuje jejich stanovení. Ke stanovení těchto barviv je mnohem jednodušší využít metodu vysoceúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Kapalinová chromatografie dovoluje separaci ionogenních i neionogenních barviv, vyznačuje se jednoduchostí kvantifikace i snadností identifikace barviv na základě jejich spektrálních charakteristik.

3. 1 Ultrafialová a viditelná spektrofotometrie Absorpční optické metody jsou metody, při kterých dochází k absorpci záření vzorkem. Pokud dochází k absorpci ve viditelné (VIS) nebo ultrafialové oblasti (UV) světelném záření, mluvíme o metodách pracujících v oblasti elektronových spekter. Absorpcí záření těchto vlnových délek se zvyšuje vnitřní energie molekul a atomů, dochází k přeskoku elektronů z energeticky chudších orbitalů na orbitalů energeticky bohatší. Absorbovaná energie je pak vyzářena ve formě fluorescenčního záření o jiné vlnové délce, nebo většinou jako tepelné záření. Studium absorpce umožňuje odhalit nejen strukturu molekuly, ale především slouží jako kvantitativní metoda stanovení. Ve viditelné oblasti se absorpce projevuje barevností látek, kdy barevná látka absorbuje část dopadajícího spojitého záření – bílého světla. Její zbarvení je dáno zbylým, doplňkovým (komplementárním) zbarvením. Prochází-li kyvetou, obsahující roztok vzorku, zářivý tok Φ0, je prošlý zářivý tok ochuzen o odrážené, rozptýlené a absorbované záření. Předpokládejme, že rozhodující část úbytku záření připadá na jeho absorpci. Odraz a rozptyl záření zanedbejme. Transmitance T je relativní část prošlého záření. Často se uvádí v procentech. T=

Φ ⋅ 100[%] Φ0

Φ…..dopadající zářivý tok Φ…..prošlý zářivý tok Je-li absorbance záření nulová, transmitance je jednotková (100%).

Absorbance ( starším názvem extinkce ) je záporný dekadický logaritmus transmitance.

10

A = − log T = log

Φ Φ0

Je-li absorpce záření nulová, je nulová i absorbance. S rostoucí absorpcí záření roste absorbance. Blíží-li se transmitance nule, blíží se absorbance nekonečnu. Pro praktické měření zpravidla mívají význam hodnota nepřekračující jednotku. Lambertův-Beerův zákon

A = ε λ cl Absorbence je přímo úměrná koncentraci absorbující látky a tloušťce absorbující vrstvy.

ε λ …..molární absorpční koeficient (konstanta pro danou látku za daných podmínek při určité vlnové délce; dm3 mol-1 cm-1) c……látková koncentrace (mol dm-3 ) l……tloušťka absorbující vrstvy (cm) Absorbance je aditivní veličinou; absorbují-li záření dané vlnové délky dvě a více složek, je celková absorbance součtem absorbance jednotlivých složek. n

n

i =1

i =1

A = ∑ Ai = ∑ ε λ ,i ci l Lambertův-Beerův zákon je splněn jen pro zředěné roztoky do koncentrací zhruba 10-2 dm3

. Využívá se v kvantitativní analýze u většiny absorpčních metod.

Přístroje Spektrofotometry obsahují zdroj záření (u emisních metod je jím sám vzorek), optické prvky pro vedení paprsku přístrojem, prvek pro výběr vhodné vlnové délky k měření, zařízení pro vzorek u absorpčních metod (např. kyvetu) a detektor elektromagnetického záření. Výstupní zařízení ukazuje, zaznamenává, případné dále vyhodnocuje signál detektoru. Současné moderní spektrometry zaznamenávají a vyhodnocují spektra pomocí počítače. Základní

konstrukcí

mohou

být

spektrometry

přístroje

jednopaprskové

nebo

dvoupaprskové. Přístroj nastavujeme na nulovou koncentraci analytu pomocí slepého srovnávacího vzorku (čisté rozpouštědlo, tzv. „blank“), což u jednopaprskových přístrojů provádíme před měřením. U dvoupaprskových přístrojů se porovnávání děje průběžně, protože paprsek je dělen v pravidelných intervalech na část procházející vzorkem a část procházející srovnávacím prostředím pomocí rotujících zrcadlových segmentů tvaru

11

kruhových výsečí (tzv. čoprů z ang. chopper). Detektor střídavě měří jeden a druhý paprsek.

Elektronová absorpční spektra Elektronové absorpční spektrum je závislost absorbance na vlnové délce, Vzhledem k závislosti absorbance na koncentraci se pro účely srovnávání spekter používá závislosti logaritmu molárního absorpčního koeficientu na vlnové délce. Vnitřní energie je dána součtem tří druhů energií: elektronové, vibrační a rotační. Tyto energie nabývají jen určitých diskrétních hodnot odpovídajících hladinám energie. Mezi základní a excitovanou elektronovou hladinou je velký rozdíl a energií (102 kJ/mol). Menší rozdíl je mezi energiemi rotačních hladin (10-2 kJ/mol). Dostatečnou energii nesou fotony z ultrafialové nebo viditelné oblasti spektra. Fotony z infračervené oblasti mají nižší energii, proto jejich absorpce již nemůže vést ke změnám elektronových stavů molekul. Molekula se za běžných podmínek nachází na základní vibrační hladině a její elektrony nejsou excitovány. Absorpcí fotonu přijme energii, která vede k přechodu elektronu na excitovanou hladinu a molekula přejde na jednu z mnoha vibračních a rotačních hladin. Ta je možná absorpce fotonů jen o málo se lišících energií a vytváření velmi blízkých absorpčních čar ve spektru, které splývají v pás. Ve spektrofotometrech se jako zdroje záření používají pro viditelnou oblast světla wolframová a halogenová žárovka, pro ultrafialovou oblast deuteriová lampa.

Wolframová žárovka je využívána pro rozsah vlnových délek 350-3000nm. Energie emitovaná z wolframového vlákna je přímo úměrná čtvrté mocnině vloženého napětí. Značná citlivost ke změnám napětí znamená, že napětí musí být dobře stabilizováno.

Halogenová žárovka je wolframová žárovka s obsahem malého množství jodu v křemenné baňce. Jod reaguje s plynným wolframem, který vzniká sublimací ze žhavého wolframového vlákna, a vytváří WI2. Když molekuly WI2 narazí na vlákno, jodid se rozloží, a wolfram se tak vrací zpět na vlákno. Halogenová žárovka má asi dvojnásobnou životnost než běžná wolframová žárovka. Je velmi účinná a její spektrum je rozprostřeno až do ultrafialové oblasti. Je používána v mnoha moderních spektrofotometrech.

Deuteriová lampa je ideálním zdrojem pro ultrafialovou oblast záření. Elektricky excitovaný vodík nebo deuterium při nízkém tlaku produkují kontinuální ultrafialové spektrum. Mechanismus vzniku fotonu ultrafialového záření ukazuje rovnice.

12

D2 + elektrická energie

D2*

D´ + D“ + hv

Obě lampy – deuteriová i vodíková – emitují záření v rozsahu 160 – 375 nm. Lampa obsahuje křemenné okénko, protože sklo záření pod 350 nm absorbuje.

Monochromátor zpravidla využívá konstrukci Czerny-Turnerovu. Vzorek je umístěn v kyvetě, Skleněná je použitelná pro viditelnou oblast (propouští vlnové délky 350-2000 nm), křemenná pro ultrafialovou oblast. Kyveta být udržována v dokonalé čistotě a je nutno zabránit otiskům prstů, které by způsobily rozptyl světla a chyby v měření. Jako detektory záření se používají fotonásobiče, polovodičové fotoelektrické články, diodová pole a detektory charg couple device-CCD. Fotonásobič je běžně používaný detektor v ultrafialové a viditelné spektrometrii. Lineární diodové pole je multikanálový detektor, jehož elementy měří najednou paprsek rozložený disperzním prvkem. Obsahuje mnoho malých fotodiod na jediném křemíkovém čipu (64-4096). Nejběžnější užívaný počet je 1024 fotodiod. Tento detektor je užitečný pro záznam absorpčních spekter vzorků, které rychle procházejí průtočnou kyvetou, jaká je používána např. v HPLC. Nově používané detektory CCD jsou ve svém uplatnění podobné diodovému poli.

3. 2 Chromatografické metody Princip chromatografie Chromatografie je separační metoda, tedy metoda, při které se oddělují – separují složky obsažené ve vzorku. Svým určením je to především metoda kvalitativní a kvantitativní analýzy vzorku. V chromatografii se vzorek vnáší mezi dvě vzájemně nemísitelné fáze. Stacionární fáze je nepohyblivá, mobilní fáze je pohyblivá. Vzorek umístíme na začátek stacionární fáze. Pohybem mobilní fáze přes stacionární fázi je vzorek touto soustavou unášen. Složky vzorku mohou být stacionární fází zachycovány, a proto se při pohybu zdržují. Více se zdrží složky, které jsou stacionární fýzí poutány silněji. Tím se postupně složky od sebe separují a na konec stacionární fáze se dostávají dříve složky zadržované.

Rozdělení chromatografických metod Chromatografických metod je velké množství, Proto je účelné jejich rozdělení do určitých skupin. Vzhledem ke značné různorodosti se dělí podle několika hledisek:

13

•

Podle skupenství mobilní fáze

- Kapalinová chromatografie ( Liquid Chromatography-LC)-mobilní fáze je kapalina

- Plynová chromatografie (Gas Chromatography-GC)-mobilní fáze je plyn •

Podle uspořádání stacionární fáze

- Kolonová chromatografie-stacionární fáze je umístěna v trubici (koloně) - Plošné techniky:

Papírová chromatografie (Paper Chromatography-PC)-stacionární fáze je součástí chromatografického papíru

Tenkovrstvá chromatografie (Thin Layer Chromatography-TLC)-stavionární fáze je umístěna na pevném plochém podkladu (např. skleněné desce nebo hliníkové fólii) •

Podle povahy děje, který převládá při separaci Obvykle se při separaci uplatňuje několik fyzikálně-chemických dějů současně, ale jeden z nich převládá.

- Rozdělovací chromatografie-o separaci rozhoduje odlišná rozpustnost složek vzorku ve stacionární fázi (kapalina) a mobilní fázi (kapalina nebo plyn)

- Adsorpční chromatografie-o separaci rozhoduje různá schopnost složek poutat se (adsorbovat se ) na povrch stacionární fáze (tuhá látka)

- Iontově-výměnná chromatografie-o separaci rozhodují různě velké elektrostatické přitažlivé síly mezi funkčními skupinami stacionární fáze (iontoměnič) a ionty vzorku.

- Gelová chromatografie-složky se separují podle velikosti na pórovité stacionární fázi (gelu); menší molekuly vzorku se v pórech gelu zdržují déle (molekulově sítový efekt).

- Afinitní chromatografie-stacionární fáze je schopna vázat ze vzorku právě určité složky, ke kterým má úzce selektivní vztah (afinitu).

3. 2. 1 Plynová chromatografie Vzorek se dávkuje do proudu plynu, který jej dále unáší kolonou. Mobilní fáze je nosný plyn. Aby vzorek mohl být transportován, musí se ihned přeměnit na plyn. V koloně se složky separují na základě různé schopnosti poutat se na stacionární fázi. Složky

14

opouštějící kolonu indikuje detektor. Signál z detektoru se vyhodnocuje a z časového průběhu intenzity signálu se určí druh a kvantitativní zastoupení složek. Pro nutnost přeměny analytů v plyny můžeme separovat takové látky, které mají dostatečný tlak syté páry, jsou tepelně stálé a mají relativní molekulovou hmotnost menší než 1000. Obecně může být plynová chromatografie použita k separaci plynů, většiny nedisociovatelných kapalin a pevných organických molekul a mnoha organokovových látek. Není použitelná pro separaci makromolekul, organických a anorganických solí.

Častým postupem je chemická změna analytů nevyhovujících vlastností na deriváty, které mohou být v analýze plynovou chromatografií použitelné. Plynová chromatografie se nepoužívá ke stanovení barviv, uvádím ji jen pro úplnost.

Popis chromatogramu Chromatogram je graficky znázorněný výsledek chromatografické analýzy, kdy je graficky znázorněno rozdělení látek za určitý čas. h……výška píku Y……šířka píku v základně Z1/2……šířka píku v polovině výšky A……plocha píku Y a Y1/2 souvisí s účinností separace, A a h s kvantitativním zastoupením složky. Zadržování rozpuštěné látky stacionární fází způsobuje, že kolonou migruje menší rychlostí než je průměrná rychlost mobilní fáze. Molekula složky stráví v koloně určitou dobu, která se nazývá retenční čas tR. Tato doba se dělí na čas, který molekula setrvává v mobilní fázi – mrtví retenční čas – tM a čas strávený ve stacionární fázi – redukovaný retenční čas t´R. Tyto časy splňují retenční rovnici: tR=tM + t´M Pro inert, který se nepoutá na stacionární fázi a putuje stejnou rychlostí jako mobilní fáze, je retenční čas totožný s mrtvým retenčním časem. Retenční charakteristiky se používají ke kvalitativní analýze, protože v daných podmínkách můžeme konkrétní složku charakterizovat jejím retenčním nebo redukovaným retenčním časem.

Hodnotící faktory pro chromatografii

Kvalitativní analýza

15

Pro identifikaci látky je podstatné umístění maxima píku v chromatogram. Toto umístění lze vyjádřit retenčními daty.

Absolutní retenční data
Retenční čas tR nebo retenční objem VR – mají nejhojnější využití ze všech retenčních charakteristik, zejména pro analýzy za stejných podmínek, neboť kromě analytu ovlivňují velikost těchto údajů podmínky stanovení.


Čistý retenční objem VN
Specifický retenční objem Vg nebo VS je teoreticky velmi vhodnou veličinou pro identifikaci látky, ale praktivky málo používanou. Pro výpočet musíme znát přesné údaje o množství stacionární fáze, objemovém průtoku, tlacích na vstupu a výstupu z kolony a teplotu kolony. Není-li některý z údajů dostupný nebo se mění, nelze je použít.

Relativní retenční data
Relativní retence (retenční poměr) r12 je poměr redukovaných retenčních časů složky (1) a standardu (2). Veličiny nezávisí na tlakovém spádu, průtoku ani množství stacionární fáze. Největším problémem je najít vhodný standard takových vlastností, aby tvořil samostatný pík a relativní retence byla nejvýše 4.


Rentenční indexy I počítáme z jednotné stupnice standardů, kterými jsou nerozvětvené alkany. Pro určitou látku jsou standardy sousední n-alkany splňující podmínky, aby pík látky ležel mezi píky těchto standardů.

Jestliže zjistíme, že standard a neznámá látky mají odlišné retenční chování, je to jednoznačným potvrzením toho, že jde o různá chemická individua. Shoda retenčních dat na jedné stacionární fázi ještě neznamená důkaz totožnosti obou látek. To můžeme s vysokou pravděpodobností tvrdit, když nastane retenční shoda se standardem dvakrát – na stacionárních fázích různé polarity při různé teplotě.

Kvantitativní analýza Plocha píku a jeho výška roste s obsahem složky ve vzorku. Výšku píku lze snadněji změřit, ale je mnohem více ovlivnitelná malými změnami podmínek při průběhu stanovení. U moderních přístrojů se určuje plocha píků počítačovou integrací. Způsoby nezaložené na moderní instrumentaci:

16


Triangulace – píkem proložíme trojúhelník, změříme šířku píku v základně Y, výšku trojúhelníku h´ a spočítáme jeho plochu ( pro symetrické píky).


Kvadratura – píkem v polovině výšky proložíme obdélník a spočítáme jeho plochu (pro symetrické píky).

3. 2. 2 Kapalinová chromatografie V kapalinové chromatografii je mobilní fází kapalina. Na rozdíl od plynové chromatografie rozhodují o separaci složek vzorku nejen jejich interakce se stacionární fází, ale velmi výrazně i použitá mobilní fáze. Během separace se analyt rozděluje mezi mobilní a stacionární fázi. Čas, jaký stráví v jedné nebo druhé fázi, závisí na afinitě analytu ke každé z nich. Jsou využitelné všechny možné mechanismy separace – adsorpce, rozdělování na základě různé rozpustnosti, iontová výměna, molekulově sítový efekt nebo specifické interakce v afinitní chromatografii. Podle uspořádání stacionární fáze rozlišujeme kolonovou a tenkovrstvou či papírovou kapalinovou chromatografii. Protože je možno pracovat za laboratorní teploty bez nutnosti převádět vzorek na plyn, je kapalinová chromatografie vhodná i pro separaci tepelně nestálých a netěkavých sloučenin. Pracujeme obvykle eluční metodou. Srovnáme-li kapalinovou a plynovou chromatografii z hlediska účinnosti, je v kapalinové chromatografii nižší příspěvek molekulární difuze složky, protože kapalina má vyšší viskozitu než plyn.

Kapalinový chromatograf V klasické kapalinové chromatografii naplníme skleněnou trubici délky asi 0,5m a průměru asi 2 cm, dole zakončenou fritou a kohoutem, zrnitým sorbetem s velkým průměrem částeček (např. oxidem hlinitým). Na horní vrstvu náplně dávkujeme malé množství vzorku a pak přidáváme mobilní kapalnou fázi (eluent). Působením gravitační sály mobilní fáze postupuje kolonou, složky vzorku se od sebe separují a v různých časech opouštějí spodní část kolony. Klasické kolonové provedení nemá potřebnou účinnost, ale stalo se základem vysoce účinné kapalinové chromatografie (High Performance Liquid Chromatography HPLC). K účinné separaci je třeba použít dostatečně malých zrníček sorbetu, která kladou prostupující kapalině značný odpor. Proto je nutno pracovat při vysokém tlaku.

17

•

Čerpadlo-kapalina se do kolony čerpá pístovými nebo membránovými čerpadly. Dobré čerpadlo dociluje průtoku v rozsahu od mikrolitů do desítek mililitrů za minutu s méně než 1% kolísáním průtoku při tlaku až 35 MPa. Materiál čerpadla (nerezová ocel, keramika, plast)nesmí být narušován mobilní fází a nesmí do ní uvolňovat žádné látky. Ventily řídící tok eluent jsou často zhotoveny z pryže nebo safíru.

•

Směšovací zařízení-složení mobilní fáze může zůstávat stálé (izokratická eluce) nebo se během separace mění (gradientová eluce). Naprogramované směšovací zařízení může s využitím zásobníků různých kapalin připravovat směs kapalin stálého složení nebo řídit změny ve složení výsledné mobilní fáze v průběhu separace.

•

Dávkovací zařízení-dávkování injekční stříkačkou přináší nevýhody z hlediska těsnosti, udržení tlaku a zejména vnášení stop materiálu injekční stříkačky. Pokud je použito injekčních zařízení, musí být zhotovena z inertních materiálů (nerezová ocel, titan, některé polymery). Injekční zařízení může být ovládáno ručně i automaticky. Byly vyvinuty techniky označované jako dávkování při zastavení toku (stop-flow injection), které odstraňují některé tyto nedostatky. Injekční dávkování v nich provádíme za běžného tlaku při přerušení toku eluentu. V současné době bývají injekční systémy nahrazeny dávkováním obtokovým dávkovacím kohoutem. Podstata

šesticestného

dávkovacího

kohoutu

byla

zmíněna

v plynové

chromatografii. Dávkovací smyčka má obsah 10 nebo 20µl. Oblíbený je i systém se sedmicestným kohoutem, který přináší možnost měnit dávkovací smyčky různého objemu. Smyčka je připojena na kohout a plněna pomocí inkreční stříkačky. •

Kolony-používáme pouze náplňové. Mnoho rozličných aplikací kapalinové chromatografie podmiňuje existenci velkého množství kolon různé délky, vnitřního průměru a náplně. Pro většinu rutinních analýz jsou kolony zhotoveny z nerezové oceli. Kolony pro analytické využití jsou poměrné krátké (zpravidla10, 15 nebo 25 cm). Vnitřní průměr je 4,6 nebo 5 mm, vnější průměr ¼ palce (palec = coul = 2,54 cm). Běžný průtok eluentu je 1 – 2 ml za minutu. Pro rychlé separace, stačí-li účinnost do 4000 teoretických pater, jsou vhodné krátké analytické kolony délky jen 3 cm. Jsou levnější a spotřebují malé množství mobilní fáze. Objemový průtok eluentu je 4 ml za minutu. Náplňový materiál pro analytické kolony má průměr 3

18

až 10 µm (kratší kolony jsou plněny jemnější náplní). Kolony s velmi malým vnitřním průměrem mají vnitřní průměr 1 – 2 mm a délku 25 – 50 cm. Mají vysokou účinnost, nejsou drahé a spotřebují málo rozpouštědla (10 – 100 µl za minutu). Jako ochrana hlavní kolony jsou hojně používány předklony umístěné mezi čerpadlo a dávkovací zařízení nebo ochranné kolony umístěné mezi dávkovací zařízení a analytickou kolonu. Způsobují jen malé rozšíření pásů a chrání kolonu před nečistotami a nerozpustnými materiály. •

Nastavení teploty. Většinou separací HPLC probíhá při laboratorní teplotě a nevyžaduje termostatování. Některé separace se významně zlepší zvýšením teploty, což většina nových chromatografů umožňuje. Programová změna teploty se však v HPLC nevyužívá.

Detektory v kapalinové chromatografii Detektory v HPLC by měly být selektivní pro analyty a málo citlivé na mobilní fázi. Průtočná cela detektoru musí snést tlak mobilní fáze a udržet těsnost. Nejpoužívanějšími detektory jsou fotometrický, refraktometrický a fluorescenční.

Fotometrické detektory patří k nejběžnějším detektorům. Měří absorbance eluátu vycházejícího z kolony. Pro optimální citlivost detektoru musí být zajištěna dostatečná absorpční dráha průtočné kyvety, jíž prochází paprsek. Jednodušší detektory měří při jedné vlnové délce v ultrafialové oblasti (například 254 nm – rtuťová výbojka), složitější dovolují nastavení vlnové délky pomocí monochromátoru. Nejdokonalejší jsou schopny pomocí diodového pole (Diode Array detektor – DA) nebo CCD prvku proměřit absorpční spektrum v určené oblasti vlnových délek a uložit ho do paměti. Detekční limit je až 10-10 g/ml) ale je velmi univerzální. Při jeho použití je třeba přísně udržovat konstantní teplotu.

Fluorescenční detektor je založen na principu fluorescence – schopnosti látek absorbovat ultrafialové záření a pak vysílat záření o vyšší vlnové délce, které se měří fotonásobiče kolmo na směr vstupujícího záření. Detektor má detekční limit až 10-12 g/ml analytu. Je vysoce selektivní. Vhodně lze kombinovat s fotometrickým detektorem.

FTIR detektor je univerzálním detektorem. Zpracovává infračervená spektra složek v mobilní fázi.

19

Elektrochemické detektory jako vodivostní nebo voltametrické lze použít tam, kde jsou v roztocích obsaženy ionty, respektive složky oxidovatelné nebo redukovatelné na polarizovatelné elektrodě.

Hmotnostní spektrometr jako detektor je použitelný nejen v plynové, ale i v kapalinové chromatografii.

3. 2. 3 Adsorpční kapalinová chromatografie Adsorpční

kapalinová

chromatografie

(LSC)

využívá

mezimolekulových

přitažlivých sil mezi stacionární fázi a analytem. Jako adsorbent v LSC se používají zrnité materiály na bázi silikagelu, která jeví kyselé vlastnosti, a méně často na bázi oxidu hlinitého, který má zásadité vlastnosti a někdy uplatňuje nevhodné katalytické účinky. Pro dobrou adsorpci je nutný velký povrch těchto adsorbent. Kulovité částice adsorbentu v sobě obsahují póry. Částicí adsorbentu může být kulička zhotovená z tohoto materiálu, kterou prostupují póry v celém objemu, nebo může jít o adsorbent s povrchovou pórovitostí, který obsahuje kulovité inertní jádro, na jehož povrchu je adsorbent. Využívány jsou také jiné materiály (aktivní uhlí, celulosa, uhličitan vápenatý). Adsorpční aktivita adsorbentu je dána jeho polaritou a počtem adsorpčních míst. Přítomnost vody v systému snižuje jeho aktivitu, neboť se váže na adsorpční místa. Rozpouštědlo i rozpuštěné látky soutěží o místa na povrchu stacionární fáze. Proto je vhodná volba rozpouštědla důležitá pro eluci analytu. Adsorpční chromatografie je užitečná pro separaci nízko a středně polárních vzorků relativní molekulové hmotnosti do 1000. Nevýhodou této techniky jsou zkreslené píky (s rozmytou frontou nebo chvostující). Obecně platí, že nepolární analyty jsou eluovány nepolárními rozpouštědly a polární polárními. Mobilní fáze by neměla mít příliš velkou viskozitu, aby nekladla velký odpor proti převodu hmoty a protékala kolonou při určitém tlaku s dostatečnou rychlostí. Neměla by chemicky narušovat nebo vymývat stacionární fázi. Mobilní fáze v LSC se charakterizuje svou eluční silou. Čím má rozpouštědlo větší eluční sílu, tím více se adsorbuje na stacionární fázi, a tím rychleji eluuje složky, neboť s nimi úspěšněji soutěží o místo na povrchu adsorbentu. Eluční síla roste v pořadí pentan, toluen, benzen, ethylbromid, propanol, ethylacetát, isopropylalkohol, dioxin, ethanol, aceton. Velikost adsorpce dané složky roste s klesající hodnotou eluční síly rozpouštědla a rostoucí polaritou vlastních funkčních skupin. Nejkratší retenční časy proto budou mít nepolární

alifatické

uhlovodíky,

po

nich

následují

aromatické

uhlovodíky,

20

halogensloučeniny, ethery, terciární aminy, nitrosloučeniny, ketony, aldehydy, primární aminy, alkoholy, fenoly a nejdelší retenční časy mají velmi polární karboxylové a sulfonové kyseliny.

3. 2. 4 Rozdělovací kapalinová chromatografie V rozdělovací kapalinové chromatografii (LLC) se analyty rozdělují mezi dvě nemísitelné kapalné fáze. Mobilní fáze unáší analyty, stacionární fází je kapalina zakotvená na pevném nosiči. Retenční čas analytů závisí na tom, jak jsou rozpustné v každé z obou fází rozdílné polarity. V počátcích rozdělovací chromatografie byla používána polární stacionární fáze (např. voda na silikagelu), zatímco mobilní fáze byla nepolární (např. hexan). Zvýšení polarity mobilní fáze (stává se podobnější stacionární fázi) snižuje retenční čas analytů. Jde o chormatgrafii na normálních fázích (Normal-Phase Chromatography – NPC). Normální je prostě z toho důvodu, že byla používána nejdříve. Separace v NPC závisí na interakci složek s polární stacionární fází. Nejméně polární analyt je eluován jako první, protože je nejméně mísitelný se stacionární fází. Středně polární analyt eluuje později a polární analyt nakonec. NPC je vhodná pro separaci polárních vzorků, ale interakce polárních molekul se stacionární fází mohou být tak silné, že v rozumném čase nevyjdou z kolony. Proto byla vyvinut metoda, ve které jsou polarity mobilní a stacionární fáze proti NPC naopak. Je to chromatografie na obrácených fázích (Reversed-Phase Chromatography – RPC). Stacionární fáze je nepolární (uhlovodíky nebo alkyly vázané na silikagel) a mobilní fáze polární (voda, acetonitril). Růst polarity mobilní fáze v RPC (stává se méně podobnou stacionární fázi) vede k růstu retenčních časů analytů. Retence složek roste s jejich klesající polaritou a zvětšující se nepolární částí molekul. Separace na obrácených fázích se hodí pro látky jakékoliv polarity. Je univerzální technikou pro separaci nepolárních, polárních a disociovatelných vzorků. Rozhodující podmínkou v LLC je vzájemná nemísitelnost mobilní a stacionární fáze. To v praxi často nelze zcela splnit, a tak hrozí vymývání stacionární fáze z kolony. Proto se nyní nejčastěji používají jako stacionární fáze kapaliny, které jsou chemicky vázány na nosič. Nosičem je silikagel nebo sklo. Póry prostupují celý objem kuličky nosiče nebo mohou být povrchové. Stacionární fáze se kotví různými reakcemi, například

21

silanizací

silanolových

skupin

trialkylchlorsilany,

dialkyldichlorsilany

nebo

alkyltrochlorsilany. Skupinami R mohou bát nepolární alkyly jako methyl, oktyl nebo oktadecyl. Tyto skupiny mohou nést i středně polární substituenty (nitro, kyano, aminoskupin apod.). Proto lze volit zakotvené fáze různé polarity. Rozdělovací chromatografie je obecné nejvhodnější pro látky menších a středních relativních molekulových hmotností. Přítomnost vody není překážkou jako u LSC.

3. 2. 5 Iontově–výměnná chromatografie Stacionární fází v iontově-výměnné chromatografii (Ion Exchange Chromatography – IEC) je měnič iontů. Tím je makromolekulární matrice (polystyren, celulosa, dextran aj.) s vhodnými funkčními skupinami kyselé nebo zásadité povahy. Každá funkční skupina je pevně vázaným iontem, na který je iontovou vazbou připojen protiion s opačným nábojem. Ten je vyměňován iontem obsaženým v mobilní fázi. Při tom se uplatňuje elektrostatické přitažlivé síly mezi ionty opačného náboje (Coulombovy síly). Iontoměniče (ionexy) se dělí na: •

Anexy, jejichž funkční skupiny jsou zásadité (aminoskupin, kvartérní amoniové báze) a slouží k výměně aniontů.

•

Katexy, jejichž funkční skupiny jsou kyselé (sulfoskupiny, karboxylové skupiny) a slouží k výměně kationtů.

Výměnnou kapacitu iontoměniče vyjadřuje v molech vyměněných iontů na 1 g iontoměniče (až 3 mmol g-1). Mezi různými ionty se nejpevněji váže ten, který má největší náboj a objem. Ion s větším objemem je méně hydratován molekulami vody a hydratační obal se při navázání iontu na iontoměnič snáze naruší. Z tohoto důvodu se na katex lépe váže draselný i vápenatý kation než sodný. Roli při výměně mohou hrát i jiné faktory. Iontově-výměnná chromatografie je hojně využívána jak k separaci slabých organických kyselin a zásad, tak i anorganických iontů. Stala se oblíbenou metodou přo separaci léčiv, nukleových kyselin, aminokyselin, iontů přechodných kovových prvků, lanthanoidů a aktinoidů. Určitým problémem je rozšiřování pásů při separaci. Mobilní fází bývají pafry. Retence je řízena změnou pH nebo změnou iontové síly pufru. Např. pro separaci anorganických iontů na katexech můžeme použít gradientovou eluci kyselinou methylsírovou nebo chlorovodíkovou. Kovové ionty je možné separovat i na anexech,

22

když je před tím převedeme do záporně nabitého komplexu vhodným komplexotvorným

činidlem. Naopak anionty schopné tvořit ligandy lze separovat na katexech, které před tím nasytíme kationem kovu (např. Ni2+). Tyto fixované kationty poslouží jako centrální atomy komplexů vznikajících při separaci aniontů (ligandová výměna). K detekci jednoduchých iontů se obvykle používá vodivostních detektorů. Vzhledem k vysoce vodovému elučnímu činidlu by ovšem citlivost detektoru na ionty vzorku byla snížena. Proto se před detektor předřazuje sekundární kolona (sepresor), potlačující jejich účinek, Toto zařízení pracuje dvěma možnými způsoby: •

Chemické potlačení vlivu iontů (neutralizace), kdy se po separaci kationtů kyselinou zařadí anex v podobě mikromembrány, na jejímž povrchu se zachytí aniont kyseliny a kyselý vodík se neutralizuje uvolněným hydroxidovým aniontem.

•

Elektrochemické potlačení vlivů iontů využívá elektrodialýzy přes iontověvýměnné membrány které oddělují katodový a anodový prostor a mezi nimiž protéká eluát.Při separaci aniontů s elučním činidlem hydroxidem sodným jsou tyto membrány katexové. V anodovém prostoru vzniká elektrolýzou vody kyslík a vodíkový kation, kation prostupuje membránu a v eluátu neutralizuje hydroxidový anion. Sem se dostává z eluátu sodný kation a jako odpad odchází hydroxid sodný. Tím se vlastně eluční činidlo převádí do katodového prostoru. Obdobně při separaci kationtů se eluční činidlo, (například methylsírová kyselina), dostává jako odpad do anodového prostoru přes Alexovou membránu.

3. 2. 6 Gelová permeační chromatografie V gelové permeační chromatografii (Gel Permeation Chromatography – GPC neboli Size Exclusion Chromatography – SEC) jsou molekuly separovány podle své velikosti. Dochází k rozdělování látek mezi pohyblivou část mobilní fáze, která se nachází mezi jednotlivými zrny gelu, a nepohyblivou část mobilní fáze, nacházející se uvnitř pórů gelu. Při průchodu kolonou jsou molekuly složek zdržovány v důsledku svého pronikání (permeace) do rozpouštědlem naplněných pórů. Malé molekuly pronikají hlouběji, a mají tudíž vyšší hodnoty retenčních objemů než větší molekuly. Interakce molekul analytů se stacionární fází nenastává.

23

3. 3 Elektromigrační metody Elektromigrační separační metody využívají dvou elektrokinetických jevů – elektroforézy a elektroosmózy. V prostředí obsahujícím roztok s nabitými částicemi a pevné povrchy stýkající se s roztokem, které mohou nést elektrické náboje, (stěny kapiláry, povrchy přítomných částic), se vytvářejí elektrické dvojvrstvy. Časem vzniká určité rovnovážné rozdělení nábojů. V elektromigračních separačních metodách je na toto prostředí připojeno stejnosměrné elektrické pole, které poruší rovnováhu v rozložení nábojů a vyvolá jejich pohyb. •

Elektroforéza – po aplikaci napětí se nabité částečky pohybují k opačně nabité elektrodě.

•

Elektroosmóza – po aplikaci napětí se v křemenné nebo skleněné kapiláře pohybuje voda k záporné elektrodě.

Principem separace složek vzorku je rozdílná rychlost jejich migrace, neboť nabité

částice různých složek se v určitém prostředí liší svou elektroforetickou pohyblivostí. Elektromigrační separační metody mají celou řadu modifikací, v nichž se může používat jak samotné elektroforézy a její kombinace s elektroosmózou, tak i dalších separačních principů, které doplňují využití odlišných elektroforetických pohyblivostí o další rozdíly v chování analytů v daném prostředí (např. molekulově sítový efekt, rozdělování a adsorpce).

Princip elektroforézy Elektroforéza spočívá v migraci elektricky nabitých částic ve stejnosměrném elektrickém poli. Toto elektrické pole vytváří vkládáním konstantního stejnosměrného napětí mezi elektrody. V zónové elektroforéze je prostředí mezi elektrodami tvořeno základním elektrolytem, který zajišťuje dostatečnou elektrickou vodivost v celém systému. Vzorek je dávkován do určitého místa tohoto systému. Kationy migrují k zápornému pólu, anionty ke kladnému pólu a neutrální molekuly či částice se nepohybují. Vlivem odlišné rychlosti migrace složek vzorku se v průběhu separace vytvářejí oddělené zóny jednotlivých složek. Velikost nabitých částic vzorku může být různá, od jednoduchých iontů až po makromolekuly. Elektroforetická pohyblivost µe určité nabité částice je rychlost jejího pohybu v elektrickém poli o jednotkové intenzitě. Jsou-li na začátku separace částice v jednom

24

místě, dostávají se během separace dopředu nabité částice, které mají větší pohyblivost, a opožďují se částice s menší pohyblivostí. Tím dochází k jejich oddělení. Na nabitou částici o náboji Q působí v elektrickém poli o intenzitě E dvě síly: elektrocká síla F1, která ji uvádí do pohybu, a odpor viskózního prostředí F2, který ji brzdí. Je-li v počátečním okamžiku rychlost v nulová, částici uvede síla F1 do zrychleného pohybu. S rostoucí rychlostí v se zvětšuje síla F2, dokud se nevyrovná síle F1. Nastane stacionární stav, ve kterém se nabité částice pohybují stálou rychlostí. V roztocích slabých elektrolytů jsou vedle sebe disociované (nabité) a nedisociované (nenabité) molekuly. Podíl nabitých částic je určen stupněm disociace α. Molekula takového elektrolytu proto vykazuje efektivní elektroforetickou pohyblivost danou součinem α · µe. Disociaci slabých kyselin a zásad lze měnit volbou pH prostředí, a tím také ovlivňovat separaci těchto látek. Pokud budeme provádět zónovou elektroforézu ve volním roztoku, naše úsilí o oddělení zón bude mařit difuze, kterou se snaží roztok vyrovnávat v celém objemu koncentrace složek. Proto je třeba složky během separace fixovat a elektroforézu provádět ve vhodném separačním loži. Jeho uspořádání je plošné nebo kapilární.

Elektroforéza v plošném uspořádání Plošný nosič je napuštěn základním elektrolytem a je umístěn v elektroforetické komoře nasycené parami rozpouštědla. Vzorek nanášíme zpravidla do středu nosiče. Po vložení napětí se oddělí zóny obsahující jednotlivé složky. Zóny se pohybují různou rychlostí. Podobně jako u papírové nebo tenkovrstvé chromatografie separaci zakončíme dříve, než dorazí první zóny ke konce, nebo dříve, než dojde k jejich přílišnému rozšíření. Zóny se po vysušení detekují a elektroforegram se vyhodnotí. Poloha zóny souvisí s kvalitou, tedy s druhem nabitých částic. Kvantitativní vyhodnocení se provede jako u tenkovrstvé chromatografie. Elektrody jsou od nosiče odděleny porézní přepážkou, která brání proniknutí produktů elektrolýzy do nosiče. V nejjednodušším případě lze jako nosiče použít filtrační papír, který je dvěma konci ponořen v pufru a těmito konci je napojen na zdroj stejnosměrného napětí. Hojně se používají jako nosiče tenké vrstvy gelu na skleněných deskách (gelová elektroforéza). Elektrody se připojijí na konce desek přes filtrační papír ponořený do pufru nebo přes gelové mosty napuštěné pufrem. V gelové elektroforéze se při separaci uplatňuje vedle elektroforetické pohyblivosti molekulově sítový efekt.

25

Toto provedení je manipulačně i časově náročné. Zóny se detekují a vyhodnocují až po separaci. Separaci nelze urychlit použitím vyšších hodnot napětí, protože vznikající Jouleovo teplo by mohlo způsobit chemické změny a ohrozit separaci.

3. 3. 1 Kapilární elektroforéza Kapilára je naplněna základním elektrolytem, která vede proud. Její konce jsou ponořeny do zásobníků s elektrolytem, společně s elektrodami z inertního materiálu (Pt). Mezi elektrody se aplikuje vysoké napětí (10 – 30kV). Malý objem vzorku se dávkuje do konce kapiláry. Kapilára prochází přes detektor, obvykle fotometrický (sledování absorpce ultrafialového záření). Záznam závislosti odezvy detektoru na čase se nazývá elektroforegram. Elektroforegram je podobný chromatogramu. Poloha píků určuje kvalitu, plocha nebo výška píků kvantitu. Kapilární elektroforéza nabízí možnost počítačového řízení a zpracování analýzy. Doba analýzy v kapiláře se oproti plošnému uspořádání zkracuje zejména z těchto důvodů: Teplo tvořené uvnitř kapiláry je účinně odvádělo jejími stěnami, proto lze použí vysokých napětí. Kapilára prochází detektorem a je prováděna on-line detekce zón a počítačové vyhodnocování píků. Elektroforézu doplňuje elektroosmóza. Elektroosmotický to (EOF) má za následek pohyb roztoku kapilárou k detektoru. Snižuje analytické časy a k detektory unáší i částice elektroforeticky migrující opačným směrem. Je vypracována celá řada separačních technik, které doplňují prostou kapilární zónovou elektroforézu o další možnosti. •

Kapilární zónová elektroforéza (Capillary Zone Elevtrophoresis – CZE) neboli kapilární elektroforéza ve volném roztoku (Free Solution Capillary Electrophoresis – FSCE) je separace založená na rozdílech v náboji analytu a prváci se jako volná elektroforéza bez nosiče v tenké kapiláře.

•

Micelární

eletrokinetická

kapilární

chromatografie

(Micellar

Electrokinetic Capillary Chromatogrphy MECC) se používá k separaci neutrálních sloučenin a využívá povrchové aktivity micel. •

Kapilární gelová elektroforéza (Capillary Gel Elektrophoresis – CGE) využívá molekulově sítového efektu rozpuštěných látek v prostředí gelu.

26

•

Kapilární isoelektrocká fokusace (CApillary IsoElektric Focusing – CIEF) slouží k separaci amfolytů v gradientu pH.

•

Kapilární elektrochromatografie (Capillary ElectroChromatography – CEC) využívá k pohybu mobilní fáze elektroosmotického toku a separace nastává na silikagel jako stacionární fázi. Separační selektivita v CEC je kombinací elektroforetického a chromatografického procesu.

Nejvíce používané separační techniky v kapilární elektroforéze jsou FSCE a MECC. CGE a CIEF jsou důležité pro separaci biomolekul jako DNA a proteinů a roste jejich význam v rozvoji biotechnologií léčiv. Všeobecně je kapilární elektroforéza využitelná pro vodné i nevodné roztoky.

Instrumentace

Kapiláry Kapiláry jsou vyráběny z taveného křemene a mají ochranný polyamidový povlak (kapilára je křehká). V místě detekce je malý podíl povlaku odstraněn. Kapilára je běžně 20 – 100 cm dlouhá a nejčastěji používané vnitrřní průměry jsou 50 až 75 µm. Vnitřní povrch kapiláry může být chemicky modifikován kovalentním navázáním různých látek. Úprava povrchu je využívána pro různé účely, např. ke snížení adsorpce vzorku nebo ke změně iontového náboje na kapilární stěně.

Regulace teploty Regulací teploty kolem kapiláry se zajišťují stále podmínky separace. Teplota může být regulována vzduchem nebo kapalnou chladící směsí.

Dávkování vzorku Roztok vzorku je dávkován do konce kapiláry vzdálenějšího do detektoru. Zpravidla jde o 10 – 100 ml a zóna vzorku tvoří asi 1 – 2 % celkové délky kapiláry. Dávkování lze provádět několika způsoby: •

Dávkování tlakem patří k nejběžnějším. Konec kapiláry je ponořen do nádobky s roztokem vzorku a je aplikován zvýšený tlak.

•

Dávkování rozdílem hladin je založeno na principu spojitých nádob.

•

Elektrokinecké dávkování je méně používané. Konec kapiláry je ponořen do nádobky s roztokem vzorku a je přivedeno napětí. Nevýhodou je nepoměr mezi

27

původním složením po dávkování, protože pohyblivějších částic migruje do kapiláry více než měně pohyblivých.

Detektory Detektory musí být velmi citlivé, protože průměr kapiláry je malý. Nejpoužívanější detektory jsou založeny na sledování absorpce ultrafialového záření a většinou využívají diodového pole. Citlivost je nižší (10-6 mol . dm-3). Další typy detektoru využívají fluorescenci, velmi citlivý je detektor s laserem indukovanou fluorescencí (Laser Induced Fluorescence – LIF), je však drahý. V poslední době se často využívá spojení kapilární elektroforézy a hmotnostního spektrometru (MS), které umožňuje snadnou identifikaci analytu a poskytuje informace o struktuře analyzovaných látek.

Elektroosmotický tok Stěny kapiláry z taveného křemene obsahují silanolové skupiny, které se v kontaktu s roztoky o vyšším pH disociují. Disociací se vytváří záporný náboj stěny. Ke stěně je přitažena vrstva kovových iontů základního elektrolytu a vzniká stabilní elektrická dvojvrstva (tzv. Steinova vrstva). Kationy blíže středu kapiláry tvoří tzv. difuzní vrstvu. Je-li zavedeno napětí, tyto kationty migrují ke katodě. Kationy H+ bývají silně hydratovány a jejich pohyb společně s asociovanými molekulami vody vyvolá tok celého roztoku k detektoru umístěnému před katodou. Jev se nazývá elektroosmóza a tok se označuje jako elektroosmotický tok (ElektroOsmotic Flow – EOF). Tok je tak silný, že nese ke katodě i anionty. Neutrální

částice se pohybují rychlostí elektroosmotického toku, nabité částice rychleji (kationty) nebo pomaleji (anionty) v závislosti na jejich elektroforetické pohyblivosti. Ustavením Sternovy a difuzní vrstvy se vytvářejí potenciálové rozdíly. Difuzní vrstvě přísluší potenciálový rozdíl, který se nazývá elektrokinetický potenciál neboli zeta potenciál ζ. Úroveň EOF je velmi závislá na pH základního elektrolytu, protože zeta potenciál roste s disociací kyselých silanolů na povrchu kapilární stěny. Pod pH 4 je disociace malá a EOF není významný, nad pH 9 jsou silanolové skupiny plně disociovány a EOF je nejsilnější. Úroveň EOF klesá s rostoucí koncentrací základního elektrolytu, protože se snižuje zeta potenciál. Pohyblivost elektroosmotického toku lze vyjádřit rovnicí:

µ eo =

εζ 4πηr

µ….pohyblivost EOF

28

ε…..permitivuta základního elektrolytu η…..viskozita ζ ….zeta potenciál r…..poloměr kapiláry Z rovnice je zřejmé, EOF ovlivňuje nejen vlastnosti základního elektrolytu, ale i poloměr kapiláry. Jako jev se uplatňuje u kapilár s poloměrem do 100 µm.

Účinnost separace v kapilární elektroforéze Odpor proti převodu hmoty Povšimněme se rozšiřování zón způsobeného odporem proti převodu hmoty v kapalné fázi a porovnejme jeho následky pro účinnost kapilární elektroforézy a vysoce účinné kapalinové chromatografie. Molekuly složky se difuzí dostávají do různých vzdáleností od středu kapiláry. Liší-li se rychlost v různých místech profilu kapiláry, molekuly se od sebe vzdalují. Protože elektroosmotický tok je generován po celé délce kapiláry, je výsledkem stálý průtok v jejím libovolném místě. Rychlostní profil je pístový a složky roztoku jsou neseny stejnou rychlostí během transportu celou kapilárou s minimálním rozšířením zóny. Laminární tok vyvolaný čerpadlem v HPLC má rychlostní profil parabolický. Roztok se v HPLC na okrajích kolony pohybuje nejpomaleji a ve středu kolony nejrychleji. Molekuly složky mají různé rychlosti v profilu kolony a laminární tok rozšiřuje píky podstatně více než eletroosmotický.

Molekulární difuze Hlavní příčinou rozšiřování zón je molekulární difuze rozpuštěných složek při postupu kapilárou. Tato difuze je nejmenší u velkých molekul (např. proteinů a nukleotidů), protože mají malé difuzní koeficienty. Pro tyto látky je možné dosahovat počtu teoretických pater (N) v řádu milionů, pro menší molekuly v řádu set tisíc.

Rozšíření zón způsobené dávkováním Druhým

hlavním

faktorem

nepříznivě

ovlivňujícím

účinnost

v kapilární

elektroforéze je dávkování vzorku, které může vytvořit startovní zónu analytů dosahující několika mm délky kapiláry. Délka startovní zóny může být snížená využitím tzv. „stacking“ efektu (z angl. stack – hromadit). „Stacking“ efekt nastává, je-li vzorek rozpuštěn v roztoku nižší iontové síly než má elektrolyt použitý k separaci. Za těchto okolností je elektrické pole silnější ve startovní zóně než ve zbytku rozhraní se základním

29

elektrolytem. Kationty vzorku se pohybují ve své zóně rychle vpřed, dokud nenarazí na rozhraní se základním elektrolytem, kde je však intenzita elektrického pole menší, což jejich rychlost sníží. Tak se startovní zóna vzorku i více než desetinásobně zaostří. Tento efekt se výrazně uplatní tehdy, když je vzorek rozpuštěn v čisté vodě nebo je alespoň zředěnější než základní elektrolyt.

3. 3. 2 Kapilární elektroforéza ve volném roztoku Separace iontů ve volním roztoku je nejjednodušší formou kapilární elektroforézy (FSCE). Rozpuštěné složky se disociují v závislosti na pH základního elektrolytu. Ionty disociovaných složek jsou separovány v důsledku rozdílných poměrů náboje ku hmotnosti. Ve FSCE všechny neutrální sloučeniny přicházejí k detektoru společně. (Pro separaci těchto neutrálních látek je používána micelární elektrokinetická kapilární chromatografie – MECC). Rychlost toku iontů je určena jejich zdánlivou pohyblivostí. Složka elektroforetické pohyblivosti je řízena velikostí a nábojem iontů. Menší molekuly s větším nábojem se pohybují rychleji než větší molekuly s menším nábojem. Účast elektroosmotického toku na separaci dovoluje separaci a detekci kationtů i aniontů jedinou analýzou, protože EOF je při vyšších pH natolik silný, že nese anionty ke katodě bez ohledu na jejich náboj. Rychlé separace dosáhneme s vysokým napětím v Krátké kapiláře. Migrační rychlost je závislá na teplotě (ovlivnění viskozity). Při vyšších teplotách je roztok pufru méně viskózní a klade menší odpor proti pohybu iontů. Pohyblivost složek můžeme změnit navázáním iontů do komplexů.

3. 3. 3 Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie MECC byla původně vyvinuta pro separaci nenabitých sloučenin, které se nedělí užitím kapilární elektroforézy ve volném roztoku. Separace se provádí za použití základního elektrolytu s vysokým pH, který obsahuje relativně vysokou hladinu povrchově aktivních látek (surfaktantů), např. dodecylsíranu sodného (Podium Dodechl Sulphate – SDS). Nad určitou mezní koncentrací povrchově aktivní látky (tzv. kritická micelární koncentrace) začnou spolu molekuly povrchově aktivní látky agragovat a vytvářejí micely. V micelách jsou hydrofilní hlavičky umístěny ve vnější vrstvě a hydrofobní řetězce tvoří nepolární jádro, které může rozpouštět složky vzorku. Nepolární jádra vytvářejí tzv. pseudostacionární fázi.

30

Micely SDS nají záporný náboj a migrují proti elektroosmotickému toku, který je dostatečně silný na to, aby je unášel k detektoru. Složky vzorku se rozdělují mezi pseudostacionární fázi v micelách vodný pufr jako mobilní fází. Nastává jejich retence obdobně jako v HPLC. Retence se liší v důsledku rozdílných koeficientů složek, což vede k jejich separaci.

3. 3. 4 Kapilární elektrochromatografie Kapilární elektrochromatografie (Capillary ElectroChromatography – CEC) je rychle se rozvíjející technika, která kombinuje principy kapilární elektroforézy a HPLC. Jako kolony jsou používány kapiláry plněné mikročásticemi stacionární fáze o rozměrech 1,5 – 5 µm. K plnění kolon se používá rozličných technik, např. tlakového plnění suspenzí mikročástic v organickém rozpouštědle nebo v nadkritickém oxidu uhličitém, aplikace EOF apod. Jde o náročnou operaci, při které nesmí vznikat bublinky ani být poškozena křehká kapilára. Jindy může být náplň vytvořena polymerací přímo v koloně. Jsou používány náplňové kolony, které jsou rozměry samy o sobě kapilárními, i kapilární kolony, u nichž je stacionární fáze na vnitřním povrchu kapiláry (analogie podobných kapilárních kolon z plynové chromatografie). Pro posun mobilní fáze kolonou není používáno čerpadlo jako v HPLC, ale aplikace stejnosměrného napětí a vyvolání elektroosmotického toku. V koloně nastává separace složek na stejných principech jako v HPLC (separace na obrácených fázích, na normálních

fázích,

gelová

permeační

chromatografie

nebo

iontově-výměnná

chromatografie). Pro účinnost separace je velkou výhodou pístový profil EOF.

3. 3. 5 Izotachoforéza Princip metody Vzorek se vnáší mezi dva elektrolyty s odlišnou pohyblivostí iontů. Separují se buď jenom kationty, nebo jenom anionty. Separujeme-li kationty (pro separaci aniontů je postup analogická), vzorek se vnáší mezi vedoucí elektrolyt, jehož kationty mají vyšší pohyblivost, a koncový elektrolyt, jehož kationty mají nižší pohyblivost než kterýkoliv kation vzorku. Vedoucí elektrolyt je na začátku izotachoforézy obsažen v katodovém prostoru a v koloně, koncový elektrolyt v anodovém prostoru. Kromě separovaných kationtů jsou vždy obsaženy i opačně nabité

31

protiionty, jejichž přítomnost je podmínkou zachování elektroneutrality v zónách. Je vhodné, aby protiionty ve všech elektrolytech (vedoucím, separovaném i koncovém) byly stejné. Po připojení stejnosměrného napětí se udržuje konstantní proud řádově 102 µA a vzorek se začne dělit podle pohyblivostí svých složek. Rychlejší kationty se dostávají dopředu a pomalejší se opožďují. Po jisté době se ustaví stacionární stav. V něm tvoří jednotlivé kationty zóny seřazené za sebou podle klesající elektroforetické pohyblivosti kationtů. Ve stacionárním stavu se zóny pohybují stálou a všechny stejnou rychlostí. Koncentrace iontu uvnitř zóny je konstantní. Závisí na jeho elektroforetické pohyblivosti a na koncentraci a druhu vedoucího elektrolytu. Obsahuje-li vzorek více určitých kationtů, vytvoří širší zónu. O koncentraci v zóně dané látky vždy rozhoduje koncentrace látky v předcházející zóně, počínaje vedoucím elektrolytem. To, že se méně pohyblivé ionty ve stacionárním stavu pohybují stejně rychle jako ionty pohyblivější , je způsobeno tím, že v každé zóně je jiný gradient potenciálu (potenciálový spád). Gradient potenciálu se vytváří tím vyšší, čím méně pohyblivé ionty se v zóně nacházejí. Proto na méně pohyblivé ionty působí větší hnací síla. Jednotlivé zóny jsou ve stacionárním stavu velmi ostré, protože zde působí samozaostřující efekt. Opustí-li kation vlivem difuze svou zónu a dostane se do zóny méně pohyblivých kationtů, kde na něj působí větší gradient potenciálu, je zvýšením hnací síly kation popohnán zpět do své zóny (tracking efekt). Opačným vlivem působí pokles gradientu potenciálu, a tím i hnací síly, když se náhodou kation dostane do zóny pohyblivějších kationtů. Základní rozdíly proti elektroforéze jsou:




Pracuje s konstantním proudem (u elektroforézy s konstantním napětím).




Jednotlivé zóny se liší potenciálovým spádem, který silně závisí na pohyblivosti daných iontů (u elektroforézy byl potenciálový spád po délce kapiláry nebo desky rovnoměrný).




Rychlost pohybu zón je ve stacionárním stavu konstantní (u elektroforézy se pohybují různými rychlostmi).




Zóny v izotachoforéze na sebe navazují, v elektroforéze jsou odděleny.




Nehrozí promísení zón díky samozaostřujícímu efektu (u elektroforézy se zóny molekulární difuzí rozšiřují).

Experimentální uspořádání

32

K separaci dochází v teflonové kapiláře vnitřního průměru asi 0,5 mm a délky asi 50 cm. Zařízení obsahuje zásobníky na vedoucí a koncový elektrolyt a vzorek. Dávkovat je možno podle potřeby a anodového nebo katodového prostoru. Elektrodové prostory jsou odděleny fritou, která brání proniknutí produktů elektrolýzy do kapiláry. Detektory Detektory pro izatochoforézu se dělí na dvě skupiny: •

Univerzální detektory, jejichž odezva je určena pohyblivostí iontů v zóně: Vodivostní detektory měří vodivost zóny procházející přes detektor. Činidlem u kontaktních detektorů jsou dva platinové drátky vzdálené ve směru osy kapiláry asi 0,1 mm. Napětí mezi těmito drátky je úměrné gradientu potenciálu zóny.

Teplotní detektory (termočlánky, termistory) měří teplotu v určitém místě kapiláry. Zóny, ve kterých je větší potenciálový spád, mají vyšší teplotu, protože v nich vzniká vyšší Jouleovo teplo (pro malou citlivost se již nepoužívají). •

Specifické detektory, jejichž odezva je určena jinými vlastnostmi látky v zóně než elektroforetickou pohyblivostí. Zejména je využíván fotometrický detektor sledující absorpci ultrafialového záření.

Izotachoforegram poskytnutý univerzálním detektorem má charakteristický průběh: Informaci o kvalitě poskytuje výška zóny h a o kvantitě šířka zóny l. Zóna dané složky má za daných podmínek právě určitou koncentraci. Proto, když je obsah této složky ve vzorku vyšší, je zóna širší. Izotachoforéza má využití všude tam, kde potřebujeme zjistit obsahy nepříliš složitých směsí iontů – v půdě, ve vodě, nápojích, hnojivech i vzorcích biologického původu [2].

4. Rozbor literatury zabývající se stanovením barviv Používání aditiv v potravinách je známo již od dob prvních civilizací. Již staří

Řekové a Římani barvili víno, ve středověku se v Evropě v měšťanských sídlech barvilo máslo kůrou z citronů. Většinou se tato první aditiva přidávala do potravin z důvodů maskování jejich nedostatečné kvality. Mnoho barviv se také přidávalo z důvodů zvýšení doby trvanlivosti a skladovatelnosti potravin především v arabském světě, kde je subtropické klima s vyššími teplotami a odkud se tento zvyk rozšířil do celého světa.

33

V 19. století byly veškeré cukrovinky kontaminovány: sulfidem rtuťnatým (HgS), octanem mědnatým (CH3COO)2Cu, síranem měďnatý (CuSO4), octanem olovnatým (CH3COO)2Pb, uhličitanem olovnatým (PbCO3) a arsenitan měďnatým Cu(AsO3)2. V současné době se používá v potravinářství tisíce aditivních látek. Ve své práci jsem se zaměřil především na barviva a v literární rešerši, zpracované za poslední 3 roky, jsem nalezl 32 článků zabývajících se stanovováním barviv v potravinách. Pro stanovení barviv byla z hlediska metodologického použita vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) 17krát, kdežto elektromigrační metody byly použity jen 10krát a jiné metody stanovení barviv (voltametrie, spektrofotometrie) 5krát. Rozdělení nejčastěji používaných metod pro stanovení barviv za poslední 3 roky (graf č.1). Graf č.1 18 16 14 12 HPLC

10

Elektromigrační metody 8

Jiné metody

6 4 2 0 1

Chromatografické metody K nejednodušším chromatografickým metodám s velmi dostupnou instrumentací patří

tenkovrstvá

chromatografie,

která

byla

použita

pro

stanovení

barviv

v nealkoholických nápojích [3]. Tenkovrstvá chromatografie byla použita pro barviva indigotinu a ponceau 4R. Aplikace metody slouží ke stanovení vzorků, které navíc obsahují sacharózu a kyselinu

34

citronovou jako jsou práškové nápoje, bonbóny, želatiny aj. Jako detekce pro stanovení tenkovsrstvou chromatografií se běžně používá UV spektrofotometrie [4]. Běžnější, ale instrumentací ekonomicky náročnější jsou HPLC metody, které byly použity při kontrole pro stanovení sudanu I-IV. Sudanová barviva jsou azobarviva, jejichž metabolity, primární aminy, jsou podezřelé z karcinogenity. V Evropské unii (EU) není povoleno užívat těchto barviv k upravování potravin. Hlavním sledovaným artiklem byl

čili prášek, vyskytující se v rybí omáčce, worchestrové omáčce, nudlové polévce a v koření pro pizzy [5]. Sudan se dále může sledovat v ostatním kořením, těstovinách, palmovém oleji [6]. Další použití HPLC je pro stanovení barviv v nealkoholických nápojích jako jsou E102 tartrazin, E 104 chinolinová žluť, E 110 žluť SY, E 122 azorubin, E 123 amaranth, E 124 ponceau 4R, E 131 patentní modř V, E 133 brilantní modř [7]. Některá syntetická barviva se přidávají k nealkoholickým nápojům společně s přírodními barvivy. Stanovení syntetických a přírodních barviv vedle sebe je nenáročné, jednoduché a snadno aplikovatelné na většinu nealkoholických nápojů. Stanovují se především E102 tartrazin, E 104 chinolinová žluť, E 110 žluť SY, E 122 azorubin, E 124 ponceau 4R [8]. Přítomnost přírodních barviv neovlivňuje stanovení syntetických barviv. Detekce probíhá ve viditelné oblasti pomocí spektrofotometrie [9]. Dle nařízení EU se musí stanovit nejen barviva z hledisky kvalitativního, ale především kvantitativního. Důsledkem toho došlo k zdokonalení HPLC, která se schopná stanovit i velmi nízká množství. Stanovení se provádí na 14 nejsledovanějších barviv ve směsi (E 102, E104. E 110, E 122, E 123, E 124, E 127, E 128, E 129, E 131, E 132, E 133, E 142, E 151) [10]. Jak již bylo řečeno, sledování nejen vlastních barviv, ale především jejich změn v metabolizmu, kdy může dojít ke vzniku karcinogenních látek s následnými negativními vlivy na organismus, což se týká zmíněných azobarviv, která se vyskytují v potravinách, ale i v jiných produktech jako jsou hračky, kůže, oblečení, léčiva atd. Pro přípravu vzorku pro chromatografické metody se s výhodou používá superkritická extrakce [11]. Superkritická extrakce s CO2 slouží ke stanovení přírodních barviv jako jsou např. anthokyanová barviva v červeném zelí [12]. Vzhledem ke změnám barviv, která nastávají během skladování potravin nebo při destrukci syntetických a přírodních barviv, je třeba validovat používané metody pro

35

výrobky skladované různou dobu. V článku byla kontrola zaměřena na stanovení syntetických barviv, jednalo se o E 102, E 123, E 124, E 129, E 127, E 132, E 133, a byly porovnávány koncentrace barviv na počátku skladování ve srovnání s dobou trvanlivosti jednotlivých potravin [13]. Moderním trendem je používání tzv. „Green“ metod chromatografie, které jsou šetrné k životnímu prostředí, ve vztahu k používaným rozpouštědlům. Pomocí těchto ekologických metod lze stanovit tartrazin, brilantní modř, žluť SY [14].

Elektromigrační metody Stanovení barviv v potravinářství pomocí elektromigračních metod není tak běžné (viz graf č.1) jako použití chromatografických metod, i když je možné elektromigrační metody využít od stanovení barviv ve farmacii až po stanovení barviv v jídle a potravinách. Zajímavé je stanovení barviv v potravinách, pocházejících z Indie, která sama nemá jednotné normy pro použití barviv v potravinářství. Z pohledu evropského konzumenta je nutné sledovat zda dovážené potraviny splňují požadavky evropských norem [15]. Kapilární elektroforéza byla použita pro 11 potravinářských barviv, předností bylo rychlé stanovení s velmi nízkým detekčním limitem, vzorku byly lízátka, instantní ovocné nápoje a žvýkačky [16]. Elektromigrační metody byly použity pro stanovení antokyaninových barviv v zelenině a červeném víně, stejně jako chromatografické metody a bylo dosaženo reprodukovatelných a srovnatelných výsledků jako chromatografie [17]. Kapilární elektroforéza (CE) se rovněž uplatňuje při stanovení barviv v nejrůznějších potravinách [18, 19, 20]. V nealkoholických nápojích a bonbónech se pomocí CE stanovuje 12 syntetických barviv [21], rovněž pro stanovení barviv v alkoholických nápojích lze využít metodu CE [22]. Kapilární zónová elektroforéza (CZE) se používá pro stanovení barviv v mléčných nápojích, které jsou oblíbené pro jejich vysokou nutriční hodnotu, a v mléčných výrobcích obsahující ovoce. Zde byly sledovány barviva E 102, E 133 brilantní modř, Fast Green FCF (Green no. 3), Allura Red AC (Red no.4), E 132, E 110, E 124 [23]. Dalším typem potravinových vzorků pro CZE jsou sirupy, želé a nealkoholické nápoje. CZE detekovala barviva E 102, E 110, E 123, E 124, E 131, E 129 [24].

36

Příkladem kombinace metod stanovení barviv v potravinách je MEEKC (Mikroemulsion Elektrokinetic Chromatography) která je kombinací chromatografie a elektromigračních metod. Pomocí této metody je stanovuje 9 základních potravinářských barviv ve vzorcích od bonbónů po nápoje. Zatím je tato metoda ve vývoji a vznik této metody byl podmíněn snahou zpřesnit analýzu [25]. Metody, které se používají s ohledem na menší ekonomickou náročnost v instrumentalistce jsou voltametrie a spektrofotometrie. Voltametrie našla uplatnění ve stanovení azobarviv, E 110 a E 102 v želatině, bonbónech, sladkostech, dropsech, nealkoholických nápojích, ale i prezervativech [26, 27, 28]. Pomocí spektrofotometrie byly bez předešlé separace stanoveny barviva tartrazin E 102, azorubin E 122, riboflavin E 101 [29]. Podobným způsobem lze stanovit kombinace amarantu, brilantní modři, žluti SY a tartrazinu, detekční limit však závisí na poměru stanovovaných látek ve vzorku, barviva lze detekovat, jsou-li v poměru od 1:1 až po 1:8, ve srovnání s HPLC byly doloženy srovnatelné výsledky [30].

Z literární rešerše vyplývá, že používání HPLC je četnější a více obvyklé v oblasti stanovení barviv v potravinách než jsou metody elektromigrační. Chromatografické metody jsou starší a jsou pro stanovení barviv v potravinách standardizovány a mezinárodně uznávány, jsou více univerzální s ohledem na povahu barviva, lze stanovit i např. nepolární barviva jako polyenová barviva (karoten aj.). Výhodou chromatografie je běžně komerčně dostupná instrumentace a servis přístrojového vybavení. Nevýhodou chromatografických metod je delší doba analýzy, vyšší ekonomická náročnost (cena kolony, cena rozpouštědel).

Pro elektromigrační metody hovoří především ekonomická dostupnost analýzy, srovnatelnost stanovení a základní vybavení je již poměrně běžně dostupné, nevýhodou metod je, že stanovení barviv pomocí těchto metod není standardizováno a vzhledem ke vzorku nelze pomocí elektromigračních metod určit látky neiontového charakteru. Ostatní metody, stojí jen na okraji zájmů v oblasti stanovení barviv v potravinách a výsledky těchto stanovení je nutno srovnávat s výsledky, kterých je dosaženo pomocí standardních metod.

37

5. Závěr Závěrem lze říci, že stanovování barviv v potravinách je velmi důležité z pohledu kvality potravin jejich účinků na lidské zdraví, ž tohoto pohledu jakákoliv metoda, která pomáhá odhalit i nízké koncentrace zájmových látek v potravinách je velmi cenná a pakliže je ekonomicky méně náročná a zároveň šetrná k životnímu prostředí, můžeme ji považovat za optimální. Z tohoto pohledu je možné hodnotit elektromigrační metody jako do budoucna velmi nadějné.

38

6. Literatura [1] Velíšek, J. Chemie potravin. 2 vydání. Nakladatelství: OSSIS Tábor 2002. ISBN 80902391-3-7. [2] Klouda, P. Moderní analytické metody. 2 vydání. Nakladatelství: P. Klouda Ostrava 2002. ISBN 80-86369-07-2 [3] Milojkovic-Opsenica DM, Lazarevic K, Ivanovic V, Tesic ZL, JPC-Journal of planar chromatography-modern TLC 16 (4): 276-279 JUL-AUG 2003 [4] Altinoz S, Toptan S, Journal of food composition and analysis 16 (4): 517-530 AUG 2003 [5] Waite S, Hansen D, McGinley M, LG GC North America 46-64 Suppl. S, FEB 2006 [6] Sproll C, Ruge W, Strichow N, Attig D, Marx G, Deutsche Lebensmittel-rundschau 101 (11): 481-484 NOV 2005 [7] Gianotti V, Angioi S, Gosetti F, marango E, Gennaro MC, Journal of liquid chromatography and related technologies 28 (6): 923-937 2005 [8] Garcia-Falcon MS, Simal-Gandara J, Food control 16 (3): 293-297 MAR 2005 [9] M.S. García-Falcon and J. Simal-Gándara, Nutrition and Bromatology Group, Chromatographia 53: S236-S239 Part 2 Suppl. S 2001 [10] Kirschbaum J, Krause C, Pfalzgraf S, Bruckner H, Chromatographia 57: S115-S119 Suppl. S, 2003 [11] Alstrom LH, Eskilsson CS, Bjorklund E, Trac-trends in analytival chemistry 24 (1): 49-56 JAN 2005 [12] Mantell C, Rodriquez M, Ossa EM, Journal of supercritical fluids 25 (1): 57-68 JAN 2003 [13] Prado MA, Godoy HT, Journal of liquid chromatography a related technologies 25 (16): 2455-2472 2002 [14] Vidotti EC, Costa WF, Oliveira CC, Talanta 68 (3): 516-521 JAN 15 2006 [15] Jain R, Sharma N, Bhargava M, Journal of the indian chemical society 81 (9): 765769 SEP 2004 [16] Jager AV, Tonin FG, Tavares MFM, Journal of separation science 28 (9-10): 957-967 JUN 2005 [17] Bednar P, Papouskova B, Miller L, Bartak P, Stavek J, Pavlousek P, Lemr K, Journal of separation science 28 (12): 1291-1299 AUG 2005

39

[18] Huang HY, Chiu CW, Sue SL, Cheby CF, Journal of chromatography A 995 (1-2): 29-36 MAY 2 2003 [19] Kuo KL, Huang HY, Hsieh YZ, Chromatographia 47 (5-6): 249-256 MAR 1998 [20] Hsi-Ya Huang, Chen-Wen Chiu, Show-Li Sue and Chi-Feng Cheng, Journal of chromatography A 995 (1-2): 29-36 MAY 2 2003 [21] Ishikawa F, Oishi M, Kimura K, Zasuj A, Saito K, Journal of the food hygienic society of Japan 45 (3): 150-155 JUN 2004 [22] Patsovskii AP, Rudometova NV, Kamentsev YS, Journal of analytical chemistry 59 (2): 150-154 FEB 2004 [23] Huang HY, Shih YC, Chen YC, Journal of chromatography A 959 (1-2): 317-325 JUN 14 2002 [24] Perez-Urquiza M, Beltran JL, Journal of chromatography A 898 (2): 271-275 NOV 17 2000 [25] Huang HY, Chuang CL, Chiu CW, Chung MC, Electrophoresis 26 (4-5): 867-877 FEB 2005 [26] Alghamdi AH, Journal of AOAC International 88 (5): 1387-1393 SEP-OCT 2005 [27] Baranowska I, Przemysl Chemiczny 84 (6): 430-433 JUN 2005 [28] Alghami AH, Journal of AOAC International 88 (3): 788-793 MAY-JUN 2005 [29] Kara D, Asian Journal of chemistry 17 (2):743-754 APR-JUN 2005 [30] Vidotti EC, Cancino JC, Oliviera CC, Rollemberg MDC, Analytical Science 21 (2): 149-153 FEB 2005