1. Proteiny. relativní. proteinu. Tento. České republiky

Urččení konccentrace celkovýých proteeinů v krrevním sééru za vyyužití růzzných metod Teoreticcká část: kráátký úvod k metodám pro p stanovenní, analýzu a separaci pproteinů. Praktickká část: testt tří různýchh technik prro stanoveníí koncentracce celkovýcch proteinů v krevním séru. K aanalýze budde použito aautomatickéhho analyzátooru a UV-V Vis spektrom metrie.

I. 1.

ÚVO OD

P Proteiny P Proteiny (bíílkoviny) jssou z aminnokyselin slložené vysookomolekullární přírodnní látky s

relativníí molekulárrní hmotnosstí 103 až 1106. Proteinny jsou poddstatou všecch živých oorganismů. Jejich záákladní povvahu rozpoznnal Braconnnot již v r. 11819 při zahhřívání klihuu s kyselinoou sírovou. Za podrrobnější znaalost struktuury bílkovinn vděčíme E. E Fischerovvi a L. Paullingovi. V proteinech p jsou am minokyselinyy vzájemněě vázány am minoskupinnami –NH2 a karboxyylovými skuupinami – COOH amidovou vazbou –N NH–CO– (am midy), kteráá se v příppadě proteinnů nazývá ppeptidická P počtuu aminokysselin v mollekule rozliišujeme oliggopeptidy (2–10 ( aminnokyselin), vazba. Podle polypeptidy (11–1000) a proteiny (více nnež 100 am minokyselin). Pořadí am minokyselinn v řetězci proteinuu označujem me jako prim mární struktuuru nebo takké sekvencii. Struktura mnoha protteinů je již známá, např. n myogllobinu a hem moglobinu; u blízce přííbuzných živvočišných ddruhů jsou si struktury velmi poodobné. M Molekuly pproteinů moohou vytvářřet protáhléé, vláknité, ve vodě nnerozpustné struktury, skleroprroteiny (též fibrilární), a kulovité nebo elipsooidní, ve voodě rozpusttné sferoprooteiny (též globulárrní). V protiikladu ke skkleroproteinnům (kolageen, keratin, fibroin – tvvořící vlasy, rohovinu, chrupavvky) lze skorro u všech ssferoproteinnů (např. enzzymy, svaloová tkáň) vaarem nebo ppůsobením

CZ.1.07/2.4.00/3 31.0023 Tento o projekt je spolufinanccován z Evro opského sociálního fon ndu a státníh ho rozpočtu u České republiky..

měnou hodnnoty pH) rozzrušit jejich terciární a sekundární strukturu (kkoagulace, kyselin a louhů (zm m se ztrácejí některé biologické vvlastnosti prroteinů, nappř. schopnosst enzymů denaturaace). Přitom štěpit pootravu nebo svalová konntraktivita.

2.

S Studium p proteinů V polovině 80. let minuulého stoletíí vznikl náppad zjistit seekvenci genoomu našehoo vlastního

druhu. O několik llet později, v roce 19990, se projeekt pro sekvvenaci lidskkého genom mu nesoucí název H Human Genoome Projectt rozběhl. V roce 20033 bylo ohláššeno úplné sekvenovánní lidského genomuu. Velmi přřekvapivým m závěrem projektu byl b zjištěný počet gennů, kterýchh je podle nejnovějjších inform mací 20 488. Je to skuteečně výraznýý posun, kddyž se ještě v roce 20000 věřilo, že člověk ddisponuje vvíce než 1000 tisíci genny. Proto see pozornost vědců obraací směrem ke studiu proteinoové výbavy jednotlivýých organism mů. Vědní obor věnoovaný tomuto tématu se nazývá proteom mika. Pro účeely proteom miky jsou hleedány nové postupy a teechnologie. P Pro studium m proteinů se s dnes vyuužívá širokáá baterie anaalytických nnástrojů. Prro studium sekundáárních, terciiárních a kvvartérních struktur s se dnes využívá rentgenno-strukturnní analýzy, nukleárnní magneticcké rezonannce, modernních výpočeetních systém mů a dalšícch technik. Analýzou primární struktury a senzitivnní detekce pproteinů se dnes velm mi intenzivnně zabývá hhmotnostní spektrom metrie s různnými typy iionizace. Přřes nespornéé výhody výýše zmíněníí techniky jssou ovšem náročné na instrum mentaci, kvaalifikovanosst obsluhy a čas. Mezii levnější aalternativy, které jsou použitellné pro studiium proteinnů, patří elekktrochemickké a spektroffotometrickké metody.


II.

PR RAKTICK KÁ ČÁST T

3.

S Stanoveníí proteinu u Biuretovvou reakccí

3.1

P Princip M Měďnaté ioonty v alkallickém prosstředí reaguují s peptidiickými vazbbami v protteinech za

tvorby ffialovo-moddrého kompplexu. Pro zzvýšení stabbility Cu2+ iontů i se do činidla přiddává tatrát (vínan) ddraselno-sodný a jodidoové ionty. U zdravého jjedince jsouu hodnoty ceelkových prroteinů: Novorozzenec……… …5,2 – 9,1 gg/dl Dítě…… ………………5,4 – 8,7 g/dl Dospělí…………… ……6,7 – 8,77 g/dl 3.2

S Složení Biu uretova rozttoku

Tatrát drraselno-soddný………… …… 15 mm mol/l Jodid soodný…………………… ……100 mm mol/l Jodid drraselný………………… …… 15 mm mol/l Síran měěďnatý…… ……………… …… 3.3

5 mm mol/l

P Pipetujemee Blank

Standard

Vzorek

Stanndard (µl)

-

25

-

Vzoorek (µl)

-

-

25

Biuretůův roztok (m ml)

1

1

1

3.4

S Stanovení P Po pipetováání roztok mícháme m a iinkubujeme 15 min přii 30 – 37 °C C a poté jejj necháme

stát 5 m min při labooratorní tepplotě. Po upplynutí tétoo doby měřříme oproti blanku přii 540 nm. Zbarvenní je stabilníí 30 min.


3.5

V Výpočty: celkový protein g / dl  

Avzoorek  konc. stt.g / dl  Asts .

1 g / dl d  10 g / l


4.

K Kolorimetrické staanovení prroteinů pyyrogalovoou červeníí

4.1

P Princip P Protein reagguje v kysellém prostředí s pyrogaalolovou čerrvení a mollybdenem nna barevný

komplexx. Intenzita zbarvení je úměrná konncentraci prroteinu ve vzzorku. 4.2

K Klinické hoodnoty U zdravého jedince mooč neobsahuuje žádný protein, p nebbo jen stopoové množstvví. Zdravý

ledvinnýý glomeruluus zabraňujee průchodu proteinů z krve do gloomerulárníhho filtrátu. P Příznakem poraněnní ledvinnéhoo glomeluruu je zvyšováání propustnnosti plazmaatických prooteinů, z tohho vyplývá proteinuurie, kterou popisuje přřítomnost prroteinu v m moči. Dlouhoodobé zjištěění proteinuu v moči je nejvýznamnější inddikací ledvinnové nemocci. Zdravý jeedinec má hhodnotu protteinu v močči ‹100 mg / 24 h a u těhotnýchh ‹150 mg / 24 h. 4.3

V Vzorky M Moč – stabillní 8 dnů, jee-li uchovánna při 2-8 °C C.

4.4

M Měření A A. Podmínkky měření:

Měří se při vlnové ddélce 598 nm m, v 1 cm kkyvetě, při 337°C (15-25 °C) B B. Přístroj Před zappočetím anaalýzy přístrooj vynuluji ppomocí destilované voddy C C. Pipetovánní Blannk

Kalibrátor

V Vzorek

Pyrogalovvá červeň (m ml)

1

1

1

Kalibbrace (µl)

-

20

-

Vzoorek (µl)

-

-

20


4.5

S Stanovení P Po napipetoování roztook míchámee a inkubuujeme 5 m min při 37°C nebo 100 min při

laboratoorní teplotě ((15-25°C). Poté odečteeme absorbaanci oproti bblanku. Barrva je stálá m minimálně 30 min. 4.6

V Výpočty

množžství proteinnu v moč mgg / l  

Avzorrek  konc. kalibrátor k u  objem močč l  Akalibrrátor


5.

S Stanoveníí celkovéh ho množsttví protein nů podle B Bradfordoové

5.1

P Princip P Princip této kolorimetriické technikky spočívá posunu p absoorbance barvviva Coomaassie Blue,

které se váže na argginin a hydroofobní aminnokyselinovvé zbytky přřítomné v prroteinu. 5.2

C Chemikáliee

Činidlo Bradfordovvé: 100 mg Coomassie Brilliant Bllue G250 50 ml 966% ethanoluu a 100 ml 885 % kyselinyy fosforečnéé doplnit destilovanou d u vodou na 1 l 0,1M fosfátový puffr pH 7,6: 13 ml 0,,2M dihydroogenfosforeečnanu sodnného 87 ml 0,,2 M hydroggenfosforečnnanu sodnéhho doplnit na n 200 ml ddestilovanouu vodou 5.3

P Postup K 10 μl vzzorku přidááme 190 μll činidla B Bradfordové. Po pětim minutové inkkubaci při

pokojovvé teplotě m měříme absorrbanci při 595 nm protii slepému vzorku v (10 μ μl fosfátovéhho pufru a 190 μl činidla Brradfordové).. Celkovouu koncentraci proteinůů odečteme z kalibračční křivky m roztoku BS SA fosfátovvým fufrem m v rozmezí koncentracíí od 1 mg/m ml po 0,05 připraveené ředěním mg/ml.


1. Proteiny. relativní. proteinu. Tento. České republiky

Recommend Documents