Protilátky proti HSV-1/HSV-2-gG (IgG) Návod na provedení WESTERNBLOTU
Objednací číslo Protilátky proti Třída Ig DY 2531-1601 G HSV-1/HSV-2 IgG DY 2531-2401 G glykoprotein G2
Substrát HSV-1 celk.Ag HSV-2 gG2
Formát 16 x 01 (16) 24 x 01 (30)
Indikace: Infekce herpes simplex virem Princip testu: WESTERNBLOT souprava umožňuje kvalitativní in- vitro určení lidských protilátek proti virům Herpes simplex –1 a proti glykoproteinu G-2 viru typu Herpes simplex-2. Testovací souprava obsahuje proužky membrány s elektroforeticky rozdělenými extrakty antigenů Herpes-simplex –1 virů a afinitní chromatografií čištěný HSV-2 glykoprotein G-2. Blotované pružky se zablokují a v prvním reakčním kroku se inkubují se zředěným sérem získaným od pacienta. V případě pozitivních vzorků se specifické protilátky třídy IgG (a IgA, IgM) navážou na antigen. K detekování navázaných protilátek slouží druhý inkubační krok, který se provádí pomocí enzymem značených anti-lidských IgG (enzymový konjugát), který potom zajistí vývin barevné reakce. Obsah soupravy: - Testovací proužky s elektroforeticky rozdělenými kompletními antigeny HSV-1 a afinitní chromatografií čištěný HSV-2 glykoprotein G-2; 16 testovacích proužků. -
Kontrolní proužek sloužící k vyhodnocení: 1 testovací proužek s pozitivním kontrolním sérem
-
Koncentrát konjugátu s alkalickou fosfatázou kozích anti-lidských IgG: 1 x 3 ml 10 x koncentrovaného činidla, což poskytne 30 ml konjugátu naředěného pro použití
-
Koncentrát pufru: 1 x 50 ml 10 x koncentrovaného pufru, což poskytne 500 ml univerzálního pufru Plus naředěného pro použití
-
roztok substrátu: 1 x 30 ml, připraven k okamžitému užití, nitrotetrazoliumchlorid/5bromo-4chloro-3-indolylfosfát (NBT/BCIP)
-
Vyhodnocovací protokol: 1 papír
-
Inkubační miska: 2 x 8 žlábků
-
Plastová folie
-
Návod k použití
Skladování: Soupravu uchovávejte při teplotách od +2 °C do + 8 °C.
Poznámka pro použití: Používejte pouze komponenty testu pocházející ze šarže se stejným číslem. Varování: Kontrolní sérum použité pro inkubaci kontrolního proužku bylo testováno na negativní výskyt Hbs-Ag, anti-HIV-1 a anti-HIV-2 pomocí metod enzymoimunologických testů a imunofluorescence. Avšak přesto se vším užívaným materiálem se musí zacházet opatrně, jako s potenciálně nebezpečným a infekčním. Některé z reagencií jsou jedovaté (pufr, roztok substrátu). Vyhněte se kontaktu s pokožkou, v případě potřísnění omyjte postižené místo mýdlem a velkým množstvím vody. Příprava reagencií: Pozor: Všechny reagencie se musí před upotřebením nechat vytemperovat na teplotu místnosti. - Potažené testovací proužky: Přípravené k použití. Jakmile byly proužky vytemperovány na teplotu místnosti, nenastane po otevření balení riziko kondenzace, můžete balení otevřít. Po vyjmutí proužků, které chcete upotřebit, opět balení pečlivě uzavřete a skladujte při doporučené teplotě od +2 °C do + 8 °C. - Univerzální pufr Plus: Pufr je dodávaný jako 10 x koncentrovaný roztok. Pro použití se nejprve musí lahvička s koncentrátem (50 ml) řádně promíchat třepáním. Poté se odebere čistou pipetou množství pufru , které budete používat a naředí se destilovanou nebo deionizovanou vodou 1 : 10. Na jeden použitý proužek odeberte 2 ml koncentrovaného pufru a nařeďte ho 18 ml destilované či deionoizované vody. Naředěný pufr je stabilní při teplotě od +2 °C do + 8 °C maximálně po dobu dvou dnů. - Enxzymový konjugát: Koncentrát anti-lidských IgG je desetkrát koncentrovaný, pro přípravu konjugátu k užití odeberte čistou pipetou z lahvičky požadované množství konjugátu a nařeďte ho 1 : 10 univerzálním pufrem Plus. K provedení testu na jednom proužku budete potřebovat 0,15 ml koncentrátu anti-lidských IgG s 1,35 ml univerzálního pufru Plus. - Substrátový roztok: Připravený k použití. Lahvičku ihned po odebrání alikvotu uzavřete, obsah je citlivý na světlo. Příprava vzorků: Vzorky séra pro analýzu nařeďte 1:51 univerzálním pufrem Plus ( 30 µl séra se přidá k 1,5 ml univerzálního pufru a dobře promíchá).
Inkubace Blokování: Naplňte žlábky inkubační misky podle počtu vzorků séra, které mají být testovány , univerzálním pufrem Plus, do každého žlábku dejte 1 ml pufru. Vyjměte určený počet proužků z balení a umístěte je po jednom do žlábků. Zviditelní se číslo na proužku. Proužky ve žlábcích inkubujte 15 minut při pokojové teplotě na třepačce. Poté odsajte ze žlábků všechnu kapalinu. Inkubace séra- 1.krok: Naplňte každý žlábek v inkubační misce 1,5 ml zředěného testovaného séra a inkubujte při pokojové teplotě 30 minut na třepačce. Promývání: Odsajte opět všechnu kapalinu z každého žlábku a promyjte každý žlábek 1,5 ml univerzálního pufru Plus 3 x 5 minut s použitím třepačky. Inkubace konjugátu – 2.krok: Pipetujte 1,5 ml naředěného konjugátu (konjugát alkalické fosfatázy s anti –lidským IgG) do každého žlábku. Inkubujte 30 minut při pokojové teplotě na třepačce. Promývání: Odsajte opět všechnu kapalinu z každého žlábku a promyjte každý žlábek 1,5 ml univerzálního pufru Plus 3 x 5 minut s použitím třepačky. Inkubace substrátu: Pipetujte 1,5 ml roztoku substrátu do každého žlábku inkubační misky. Inkubujte po dobu 10 minut při pokojové teplotě na třepačce. Zastavení reakce: Odsajte opět všechnu kapalinu z každého žlábku a promyjte každý žlábek 3 x deionizovanou nebo destilovanou vodou.
ANTI-HSV-1/HSV-2 GLYKOPROTEIN G-2 WESTERNBLOT Protokol inkubací Před začátkem testu:
Vložte blotované proužky do žlábků inkubační misky obsahujících 1,5 ml univerzálního pufru Plus
15 minut třepání
1. Inkubace vzorku :
Odsajte obsah, do každého inkubačního žlábku napipetujte 1,5 ml ředěného vzorku séra (1 :1)
Promývání: 3 x 5 min 2.Inkubace s konjugátem:
Odsajte obsah, do inkubačních žlábků napipetujte po 1,5 ml ředěného konjugátu (1 :10)
30 minut třepání Promývání: 3 x 5 min 3.Inkubace se substrátem:
Odsajte obsah, do inkubačních žlábků napipetujte po1,5 ml roztoku substrátu
10 minut třepání Zastavení: : Odsajte obsah, promyjte vodou Vizuálně vyhodnoťte
Vyhodnocení a interpretace WESTERNBLOT (IgG)
testů
ANTI-HSV-1/HSV-2
GLYKOPROTEIN
G-2
Manipulace: Položte inkubované pružky na filtrační papír, překryjte je savým papírem a jemným poklepáváním vysušte. Pomocí průhledné lepící pásky připevněte proužky na plastový film, který je součástí vyhodnocovacího protokolu. Přiložte vyhodnocovací matrici k blotovaným proužkům a umístěte ji tak, že černá čára nad čísly blotů tvoří přímku s čárou na vyhodnocovací matrici, která slouží k porovnání. Číslo šarže na vyhodnocovací matrici musí být shodné s číslem šarže testu, ze kterého byly použité proužky. K vyhodnocení slouží pouze jasně patrné proužky na blotech, které odpovídají značkám na vyhodnocovací matrici. Na proužcích je pod číslem kontrolní proužek. Inkubace proběhla správně, jestliže je viditelná barevná reakce na kontrolním proužku. Antigeny: Zdroj antigenů pro EUROIMMUN Anti-HSV-1/HSV-2 glykoprotein G-2 WESTERNBLOT je tvořen kompletními antigeny HSV-1 a afinitní chromatografií čištěným HSV-2 glykoproteinem G-2 (1-2). Kultivované Herpes simplex viry byly rozděleny podle molekulové hmotnosti pomocí diskontinuální polyakrylamidové gelové elektroforézy a separované proteiny byly přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Potom byla na membránu nanesena slabá linie purifikovaného glykoproteinu G-2. Z každé testovací soupravy byly vyjmuty 2 kontrolní testovací proužky a byly inkubovány s referenčním sérem. Jeden z těchto obarvených kontrolních proužků je součástí soupravy, druhý zůstává v EUROIMMUN pro účely dokumentace. Specifita antigenů na testovacích proužcích Proužek gC-1 gB-1 gD-1 gD-2
Molekulová Antigen Specifita hmotnost 130 kDa HSV-1 glykoprotein C-1 (gC-1) Vysoce specifické pro simplex virus -1 120 kDa HSV-1 glykoprotein B-1 (gB-1) Specifické pro Herpes virus 60 kDa HSV-1 glykoprotein D-1 (gD-1) Specifické pro Herpes virus HSV-2 glykoprotein G-2 (gG-2) Vysoce specifické pro simplex virus -2
Herpes simplex simplex Herpes
IgG třída protilátek proti Herpes simplex viru K vyhodnocení získaných signálů slouží jednak umístění proužků, jednak jejich barevná intenzita. Viz inkubovaný kontrolní proužek na vyhodnocovací matrici. Interpretace výsledků pro IgG protilátky: Na základě zkušenosti s výsledky soupravy ANTI-HSV-1/HSV-2 GLYKOPROTEIN G-2 WESTERNBLOT (IgG) lze detekovat infekci Herpes simplex virem. Proužek odpovídající antigenu HSV-2 gG-2 slouží k odlišení protilátek proti HSV-1 a/nebo HSV-2 (HSV-2 gG je ve vyhodnocovacím protokolu vystínován šedě).
Výsledky HSV-1 negativní HSV-2 negativní HSV-1 pozitivní HSV-2 negativní HSV-1 negativní HSV-2 pozitivní HSV-1 pozitivní HSV-2 pozitivní
Charakteristika Nejsou k rozeznání žádné proužky odpovídající antigenům, nebo jen a proužky, které antigenům neodpovídají gC-1 a alespoň jeden další HSV-1 antigen pozitivní proužek; HSV-2 gG-2 a negativní HSV-2 gG-2 pozitivní a již žádné další pozitivní proužky a gC-1 a alespoň jeden další HSV-1 antigen pozitivní proužek; HSV-2 gG-2 a pozitivní
IgM třída protilátek proti Herpes simplex viru Interpretace výsledků s IgM protilátkou: Pro detekci IgM protilátek se používá stejný pracovní postup, jako pro IgG protilátky, jen je v soupravě použit jiný enzymový konjugát (anti-lidské IgM protilátka značená alkalickou fosfatázou). Výsledky HSV-1 negativní HSV-2 negativní HSV-1 pozitivní HSV-2 negativní HSV-1 negativní HSV-2 pozitivní HSV-1 pozitivní HSV-2 pozitivní
Charakteristika Nejsou k rozeznání žádné proužky odpovídající antigenům, nebo jen a proužky, které antigenům neodpovídají gC-1 pozitivní; HSV-2 gG-2 negativní a gC-1 negativní; HSV-2 gG-2 pozitivní a gC-1 a HSV-2 gG-2 pozitivní a
Klinický význam: Herpes simplex způsobuje onemocnění, které vyvolává vznik puchýřů na kůži a sliznicích. Je celosvětově rozšířen a normálně onemocnění probíhá mírně. Komplikace mohou nastat, dojde-li k zasažení i vnitřních orgánů, ve kterých může dojít k nekrotizujícím zánětům.
Herpes simplex-1 viry preferují oblasti úst a nosu, herpes simplex 2 viry genitálie. Velmi časté je opakování onemocnění. Protilátky proti HSV-2 mohou být detekovány v séru skoro všech pacientů, u nichž se projevilo onemocnění. Více než polovina dospělých byla infikována. Avšak protilátky nejsou schopny zabránit opakování onemocnění, či reinfekci. Literární odkazy: 1. Kuhn, J., Biber, M., Doerr, H.W., Braun, R.: Diagnostik der Herpes-Simplex-Virus (HSV)-Infection. Artz.Lab (32).1986: 91-98. 2. Rabenau, H., Eibner, J., Weber, B., Bahrdt, B., Doerr, H.W.: Detection of Herpes simplex virus (HSV) type specific antibodies by microtechnique Western blot assay. Lab.med. 16, 1992: 327-331. 3. Simmonds, P., Smith, I.W., Peutherer, J.F.: Detection of antibody to viral proteins following primary infection with Herpes simplex virus. J.Med.Virol. 23. 1987: 191-205. 4. Ashley, R., Benedetti, J., Corey, L.: Humoral immune response to HSV-1 and HSV-2 viral proteins in patients with primary genital herpes. J. Med. Virol 17,1985: 153 –166.
