Základy hmotnostní spektrometrie
Hmotnostní spektrometrie Spektrometrické metody – metody založené na interakci hmoty a zá ení Hmotnostní spektrometrie je fyzikáln chemická metoda, která využívá elektrické a magnetické pole k separaci nabitých ástic s cílem ur it jejich hmotnost (pom r m/z)
Organická hmotnostní spektrometrie Kvalitativní k charakterizaci (identifikaci) organických slou enin na základ hmotnosti molekulárních iont , adukt a fragment ke studiu reakcí iont v plynné fázi
Kvantitativní pro kvantifikaci organických slou enin ve vzorku na základ intenzity odezvy detektoru pro vybraný ion nebo skupinu iont
Základní pojmy Hmotnost (m) Da (Dalton), u – po et atomových hmotnostních jednotek, íseln rovný molární hmotnosti m/z – ú inná hmotnost
Po et náboj (z) z - po et elementárních náboj (v tšinou 1)
Ionty pozitivní a negativní – NE kationty a anionty Hmotnostní spektrometrie – NE spektroskopie
Hmotnostní spektrometr
Iontový zdroj - p evod neutrálních (i nabitých) látek na ionty v plynné fázi Hmotnostní analyzátor – separace iont podle pom ru m/z Detektor – detekce iont
Iontové zdroje Iontový zdroj - p evod neutrálních (i nabitých) látek na ionty v plynné fázi
Neexistuje univerzální ioniza ní technika pro všechny molekuly, pro r zné typy slou enin jsou vhodné r zné ioniza ní techniky Rozd lení ioniza ních technik Tvrdé M kké
Ionty • • •
M + eM + HA M + B-
M+• + 2 e[M+H]+ + A[M-H]- + HB
(Viz. následující p ednáška M. Šandy)
Hmotnostní analyzátory Hmotnostní analyzátor – separace iont v plynné fázi podle pom ru m/z (využívá princip pohybu nabitých ástic v elektrickém nebo magnetickém poli)
Hmotnostní analyzátory
Skenující - postupn propouští ionty r zných hmotností (sektor, kvadrupól) Zadržující ionty – zachytí ionty, pak je analyzuje (iontová past, orbitrap, ICR) Pr letový – m í as, který pot ebují ionty k p ekonání dané vzdálenosti (TOF) Viz. p ednáška v 11:00 h
Detektory, vakuová technika Detektor - za ízení p evád jící m enou veli inu na elektrický proud MS – p evádí proud nabitých ástic na elektrický proud ICR a ORBITRAP výjimka – nepot ebují detektor – signálem je proud indukovaný ve st n analyzátoru
Vakuová erpadla
Pro vakuum? Ve vakuu nedochází ke srážkám iont s neutrálními ásticemi – zvýší se st ední volná dráha letu • Dvojstup ová evakuace
1. p edvakuum (100 – 0,1 Pa), rota ní olejová pumpa 2. vysoké vakuum (0,1-10-6 Pa), difuzní pumpa, turbomolekulární pumpa
Vakuová technika difuzní pumpa
turbomolekulární pumpa
Hmotnostní spektrum
Hmotnostní spektrum Hmotnostní spektrum – grafické znázorn ní závislosti intenzity iont na jejich pom ru hmotnosti ku náboji (m/z) Kontinuální (profilové) záznam detektoru • umož uje ode íst ší ku píku Centroidové (histogram) p evedeno na sloupcový graf • p ehledn jší poloha = t žišt píku, intenzita = výška nebo plocha píku Spektra normalizována rozsah osy y – 0 - 100%
spektrum
profilové histogram
Izotopové klastry Izotopy - atomy chemického prvku, které mají stejný po et proton , ale rozdílný po et neutron , tedy stejné atomové íslo a rozdílnou atomovou hmotnost P írodní sm si izotop - zastoupení izotop jednotlivých prvk je konstantní
Prvky
X (monoizotopické): 19F, 23Na, 31P, 127I X+1: vodík (1H, 2H), uhlík (12C, 13C), dusík (14N, 15N) X+2: chlor (35Cl, 37Cl), brom (79Br, 81Br) kyslík (16O, 18O)
Izotopové klastry Izotopové složení víceatomového iontu je dáno kombinací izotopového složení atom , které jej tvo í
Izotopové klastry alkoholdehydrogenáza C1764H2859N469O516S26
Hmotnost iontu v MS Nominální hmotnost: z celo íselných hmotností prvk (p . CO2: 12u + 2 x 16u = 44 u) Monoizotopická hmotnost: z p esných hmotnostní prvk nejvíce zastoupených izotop (p . CO2 : 12.0000 + 2 x 15.9949 = 43.9898) Pr m rná hmotnost: vážený pr m r hmotností jednotlivých izotop podle jejich zastoupení (p . CO2 : 12.01 + 2 x 16.00 = 44.01) P .: inzulín C257H383N65O77S6
Vícenásobn nabité ionty [M + 3H]3+
[M + 2H]2+
[M + H]+
[M + H]+ [M + 2H]2+ [M + 3H]3+
Dimery, multimery [2M + H]+
[M + H]+
i trimery, tetramery,… diference o „m“
Rozlišení
Míra separace dvou p ilehlých pík Rozlišení – 10% údolí
nejmenší rozdíl hmotností mezi stejn vysokými píky, u nichž je výška údolí rovna definovanému zlomku výšky pík (nap . 10% údolí) pro sektorové p ístroje (konstantní rozlišení pro celý hmotnostní rozsah)
Rozlišení – FWHM (full width at half maximum)
pom r hmotnosti iontu a ší ky jeho píku v polovin výšky pro kvadrupóly, iontové pasti, pr letové analyzátory (konstantní ší ka píku)
10% údolí
FWHM
R = m/∆m
P esnost ur ení hmotnosti vyjád ení schopnosti hmotnostního analyzátoru ur it správnou hodnotu m/z Nominální hmotnost – zm ena na p ístroji s jednotkovým (nízkým) rozlišením nap . odlišíme od sebe ionty m/z 500 od 501
P esná hmotnost – zm ena na p ístroji s vysokým rozlišením, p esnost se vyjad uje v ppm (“p esná hmotnost” < 5 ppm) nap . rozlišíme m/z 500 od 500.001 lepší p esnost ur ení elementárního složení
Kalibrace se ízení iontové optiky tak, aby nam ené spektrum sm si látek se známými pom ry m/z odpovídalo jejich teoretickým hodnotám Kalibra ní sm si: polyethylenglykoly, klastry NaI, CsI, sm si peptid , UltramarkTM (fluorované fosfazeny), komer ní sm si
Praktické d sledky
Nízké rozlišení
vysoké rozlišení
Tandemová hmotnostní spektrometrie
MS/MS, MSn
1. separace iontu 2. fragmentace vybraného iontu 3. detekce fragment
CID - procesy v kolizní cele urychlení iont elektrickým polem srážky iont s neutrálními molekulami (N2, Ar, He) v kolizní cele – zvyšování energie ion rozpad iont
ur ování struktury, specifická detekce
MS jako detektor v separa ních metodách
On-line spojení s
plynovou chromatografií (GC/MS) kapalinovou chromatografií (HPLC/MS) kapilární zónovou elektroforézou (CZE/MS)
Výhody vysoká citlivost vysoká selektivita univerzálnost kvantitativní i kvalitativní analýza
Nevýhody vyšší cena p ístroje vyšší odborné nároky na operátora
GC/MS První chromatografická metoda spojená s MS malý pr tok nosného plynu – kompatibilní s MS
Instrumentace iontové zdroje: EI, CI analyzátory: Q, IT
Analyty: mén polární, termáln stabilní, s nízkou molekulovou hmotností
Široce využívaná technika analýza složitých sm sí (nap . environmentální a forenzní analýzy) možnost prohledávat databáze MS spekter – rychlá identifikace látek
GC/MS záznam
HPLC/MS Spojení HPLC pozd ji
• odpa ení – velký objem plynu = technický problém • ešení – API zdroje (APCI, APPI, ESI)
Instrumentace
iontové zdroje: APCI, APPI, ESI analyzátory: Q, IT, orbitrap, TOF
Analyty:
od malých molekul po biopolymery od málo polárních po iontové omezen kompatibilní MF s pufry a iont-párovými inidly analýza potravin, lé iv, proteomika, atd.
Rychle se rozši ující oblast MS
CZE/MS
Zatím málo rozší ená Výhody
velmi vysoká separa ní ú innost analýza iont nízká spot eba vzorku
Technické problémy ovliv ování separa ního nap tí a nap tí zdroje malá kompatibilita separa ních pufr s MS
Analyty analýza peptid , identifikace protein
Historie MS v R ( SSR) Konstrukce prvního hmotnostního spektrometru (1953) V. ermák, V. Hanuš, . Jech, J. Cabicar Ústav fyzikální chemie a elektrochemie SAV
První komer ní MS instrumenty MCH-1303 (po átek 60.let) Ústav fyzikální chemie SAV Ústav organické chemie a biochemie
D kuji za pozornost
