Základy hmotnostní spektrometrie

Základy hmotnostní spektrometrie Lenka Hernychová e-mail: [email protected]

Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Universita obrany Hradec Králové

Historie Koichi Tanaka vyvinul MALDI techniku Tanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., Yoshida T.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988. 2, 151 Tanaka K.

JB Fenn vyvinul ionizaci elektrosprejem Fenn JB., Mann M., Meng CK., Wong SF., Whitehouse CM.: Science 1989, 246, 64

Oba získali Nobelovu cenu v roce 2002 v oboru chemie Fenn J.B.

Princip Hmotnostní spektrometrie (MS) je fyzikálně-chemická metoda, která určuje hmotnosti atomů, molekul a molekulových fragmentů po jejich převedení na ionty Přístroj se nazývá hmotnostní spektrometr Výsledkem je hmotnostní spektrum, které graficky znázorňuje závislost četnosti iontů na hodnotě m/z (efektivní hmotnost, m hmotnost iontu, z náboj iontu)

Princip 9 MS vypovídá o primární struktuře analyzované látky (určuje aminokyselinovou sekvenci) 9 Fragmentace iontů umožňuje získat podrobnější informace o struktuře látek 9 Odhaluje posttranslační a chemické modifikace proteinů (fosforylace, glykosylace, oxidace….) a může určit i místo modifikace 9 Může určit izotopový poměr prvků ve vzorku např. 13C/12C, 34S/32S, 18O/16O - kvantifikace

Princip 9 Umožňuje analýzu komplexních směsí 9 Změření molekulové hmotnosti, kontrola kvality 9 Identifikaci proteinů 9Odhaluje mutace a DNA sekvenační chyby 9Možnost analýzy nekovalentních komplexů

Vlastnosti hmotnostní spektrometrie 9Citlivá 9Specifická 9Rychlá 9Jednoduchá interpretace dat

Popis přístroje Experimentální uspořádání 1. Iontový zdroj 2. Hmotnostní analyzátor 3. Detektor 4. Řídící počítač

Součásti MS systému Vacuum System

Atmosphere Sample Inlet

Ionisation Method

Mass Analyser

Detector

Data System

MALDI-TOF hmotnostní spektrometry MA L (A DI-T pp O lie d B F Vo ya io s yst ger em s)

4800 MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems)

Ultraflex III MALDI TOF/TOF (Bruker)

Princip Ionizace 1.Měkké techniky ionizace Energetický přebytek dodaný molekule je malý a fragmentace primárně vzniklého iontu je malá.

2. Tvrdé techniky ionizace Dodaná energie postačuje k rozsáhlejší fragmentaci primárně vzniklého iontu.

Typy ionizace - nárazem elektronů (EI) - působením elektrostatického pole (FI, FD) - chemickou ionizací (CI) - nárazem rychlými atomy nebo ionty (FAB) - ionizací fotony - ionizací

252Cf

- elektrosprejem, termosprejem (ESI) - ionizace laserem za přítomnosti matrice (MALDI)

Hmotnostní analyzátory Umožňují rozdělit v čase nebo prostoru směs iontů o různých hmotnostech.

Typy analyzátorů 9 Průletový analyzátor (TOF) 9 Kvadrupólový analyzátor (jednoduché, trojnásobné) 9 Iontová past 9 Hybridní (Q-TOF, Q-trap, trap-TOF, trap-ICR, …) 9 Tandemové

(TOF-TOF, QQQ)

9 FT- ICR MS, ORBITRAP

Detektor Poskytuje analogový signál úměrný počtu dopadajících iontů. Dělí se do dvou skupin 1. Detektory pro přímá měření detekují el. proud vznikající přímým dopadem stanovovaných iontů (měření izotopového zastoupení prvků při zjišťování stáří hornin)

2. Násobičové detektory využívají efekt násobení elektronů uvolněných z první konverzní dynody po dopadu iontů (nejčastěji používané detektory v MS, poskytují měřitelný signál pro jednotlivé ionty)

Ionizace

MALDI

Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Metoda využívá ionizace laserem pulsní technika -------- UV (N2) IR (CO2)

9zkoumaná látka je kokrystalyzována v pevné matrici, která je ozářena krátkým laserovým pulsem (3 ns) 9dojde ke vzniku iontů (neutrálních, kladně i záporně nabitých) 9jejich proud je usměrněn do analyzátoru z doby letu (TOF)

MALDI-TOF MS - ionizace Laser

MALDI destička

1.Vzorek (A) je smíchán s matricí (M) a usušen (vykrystalizován) na MALDI destičce 2. Laserový výstřel ionizuje molekuly matrice.

AH+ +

3. Molekuly vzorku jsou ionizovány přenosem protonu z matrice: MH+ + A Æ M + AH+

+20 kV

Ground Grid

Variable Grid

MALDI ionizace 9 Měkká ionizace 9 Malá nebo žádná fragmentace 9 Jednou nabité ionty [M+H]+; [M-H]9 Lze měřit proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy, syntetické polymery … 9 Analýza komplexních sloučenin 9 Rychlá příprava vzorku & analýza 9 Tolerantní k detergentům a solím 9 Jednoduchá interpretace dat 9 Spojený s TOF analyzátorem

ESI - ionizace elektrosprejem 9 9 9 9 9

Měkká ionizace Technika pro disperzi kapalin a aerosolů On-line spojení HPLC a hmotnostního spektrometru Vznik vícenásobně nabitých iontů [M+zH]z+, [M+zH]zPro jeden analyt se ve spektru objevují série píků, které odpovídají iontům téže látky, o stejné molekulové hmotnosti M, s rozdílným počtem nábojů z. 9 Výskyt iontů - aduktů analytu se sodnými ionty [M+zNa]z+ a draselnými ionty [M+zK]z+ (pokud je vzorek zasolený) 9 Není tolerantní k detergentům a solím (před analýzou je nutné přečištění a odsolení vzorku) 9 Spojení s různými typy analyzátorů

ESI MS intaktního proteinu

ESI - ionizace elektrosprejem 9 Výhody 9 Díky přítomnosti analytu ve více iontech s různým nábojem lze snadno určit náboj iontů

9Nevýhody 9 Snížení citlivosti díky rozdělení signálu mezi více píků a menší přehlednost spekter složitějších směsí.

Při ionizaci elektrosprejem probíhají čtyři základní procesy 1) vznik nabitých kapek na konci sprejovací kapiláry 2) zmenšování nabitých kapek v důsledku odpařování rozpouštědla a jejich opakovaný rozpad (Coulombické štěpení) 3) uvolnění iontů do plynné fáze z malých, vysoce nabitých kapek 4) sekundární děje, kterých se účastní ionty v plynné fázi

ESI - ionizace elektrosprejem Coulombické štěpení Sprejovací kapilára

+ ++ + + ++ +

+ -

-

+ -

+

-

-

+

+

-

+

-

+

-

+

+

+

+

-

+

+ -

+ + ++ + + ++ + + ++

+

+

+

-

-

-

+

+ +

+

+

+ ++ + + ++ +

+

+++ ++++ +++

+ ++ + + ++ +

Taylorův kužel

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+ + ++ + + ++ + + ++

+

+ + + ++ + + ++ + + ++

+ + +

+++ ++++ +++

+

+

+

Elektrony

+

Oxidace

+

Zme nšování kapek v důsledku odpařování rozpouštědel

+

-

Zdroj vysokého napětí

Elektrony

Redukce

Foto ESI

Kapilára

Vstup do MS

Hmotnostní analyzátory

TOF analyzátor Ionty o stejné energii nebo o stejném impulsu mají rychlosti závislé na hodnotách efektivní hmotnosti m/z Ionty jsou vypuštěny do urychlovacího pole a se získanou energií postupují analyzátorem rychlostí v, takže dráhu d proletí za dobu t Mezi dvěma ionty rozdílných hmotností je tedy diference v dobách letu t = k ( m1/z - m2/z)

TOF analyzátor Umožňuje měřit v lineárním, reflektronovém a PSD módu Lineární mód – měření proteinů (přímá dráha letu, cca 1m) Reflektronový mód – měření peptidů (dráha letu je prodloužena pomocí reflektronového iontového zrcadla, cca 2-3m) Post-Source Decay (PSD) – kombinace reflektronového módu s fragmentací mateřských iontů (informace o sekvenci peptidů)

Průletový analyzátor (TOF) Letová trubice

15-25 kV

Zdroj iontů

Detektor

Průletový analyzátor (TOF) Letová trubice

15-25 kV

Detektor

Zdroj iontů

Lehčí ionty doletí k detektoru rychleji než ionty těžší.

MALDI MS spektrum proteinů

Lineární mód

Reflektronový mód

Charakteristika – reflektronový mód 9Vysoké rozlišení (až 20 000) a přesnost (10-100 ppm) 9Vysoká citlivost (fmol = 10-15 mol) 9Teoreticky neomezené rozmezí m/z 9Téměř současná detekce všech iontů: zisk úplného spektra v jednom ionizačním pulsu

Tandemový hmotnostní spektrometr 9 tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS), případně hmotnostní spektrometrie n-tého stupně (MSn), slouží k bližší charakterizaci analyzované látky, např. určení aminokyselinové sekvence nebo lokalizace posttranslačních modifikací 9 obsahují dva hmotností analyzátory sériově spojené kolizní celou 9 v prvním analyzátoru dojde k rozlišení prekurzorových (mateřských) iontů a k výběru jednoho z nich 9 tento prekurzor je podroben fragmentaci v kolizní cele a vzniklé produktové (dceřinné) ionty jsou rozlišeny v druhém analyzátoru

Příprava vzorků pro MS Předseparační techniky rozdělení analyzované látky (1D, 2D ELFO,HPLC, capLC, MudPIT HPLC ….) Dělení jak proteinových tak i peptidových směsí

2D-PAGE a MALDI-TOF Postup přípravy vzorků Peptidové mapování Proteasa Separovaný Protein

Proteolytické peptidy

MALDI-TOF

MS spektrum

proteolyt. peptidů

Štěpení proteinů Enzymové 9 proteolýza, nejpoužívanější enzym je trypsin Chemické 9 nejsou běžné, používají se jako doplňkové 9 např. BrCN - bromkyan se používá pro štěpení ve vodě nerozpustných nebo membránových proteinů Molekulová hmotnost vzniklých peptidů se pak měří na hmotnostním spektrometru

Proteolytické enzymy - proteázy Katalyzují exotermní hydrolýzu peptidových vazeb v proteinech a peptidech Výhody jejich použití 9 vysoká specifita 9 minimalizované vedlejší reakce 9 dobrá účinnost štěpení Podmínky použití, důležité je dodržení: 9 9 9 9 9

pH reakčního pufru poměru enzym/substrát teptoty doby inkubace pokud je to nutné provádí se: 9 redukce disulfidových vazeb (např. DTT) 9 alkylace reaktivních cysteinů (např. jodacetamid)

Proteolytické enzymy - proteázy Klasifikace 9 proteinázy - působí na proteiny

(nevyžadují přítomnost volných konců susbstrátů)

9 peptidázy - působí na malé oligopeptidy

(vyžadují alespoň jeden konec substrátu volný a to v blízkosti místa štěpení) 9 endopeptidázy - katalyzují hydrolýzu peptidových vazeb uvnitř řetězce a tvoří peptidy o různé délce 9 exopeptidázy - katalyzují hydrolytické odštěpení koncové aminokyseliny 9 N-koncové (aminopeptidázy) 9 C-koncové (karboxypeptidázy)

Peptidázy Endopeptidázy se získávají: 9 z orgánů trávicího traktu obratlovců (pankreas - chymotrypsin, trypsin, žaludek - pepsin)

9 9 9 9

krve (thrombin) sleziny (kathepsiny) rostlinného materiálu (papain, ficain, bromelain) mikroorganismů (Glu-C, pronase, thermolysin)

Exopeptidázy se získávají: 9 pankreatu 9 rostlin 9 mikroorganismů

Tabulka enzymů a chemických látek používaných pro štěpení proteinů

Trypsin 9 v proteomice nejpoužívanější serinová endopeptidáza 9 štěpí v mírně alkalickém prostředí (pH 7.8) 9 štěpí specificky peptidové vazby na C-konci kladně nabitých zbytků argininu a lysinu, pokud nenásleduje prolin 9 doba štěpení 4 - 24 hodin 9 teplota při štěpení 37 °C 9 methylovaný trypsin štěpí 30 minut při 58 °C

9 poskytuje definované peptidové fragmenty 9 dobře se ionizují 9 výhodná velikost pro MS analýzu

Trypsin 9 jeden z možných typů trypsinu je hovězí trypsin 9 má Mw 24 kDa, pH 9.4

9 trypsin je výhodný pro štěpení v polyakrylamidovém gelu, je schopný difundovat póry gelu k proteinu 9 větší molekuly peptidáz nejsou schopny do gelu difundovat ze stérických důvodů

9 vzhledem k vysoké specifitě štěpení jsou tvořeny databáze obsahující proteiny s teoretickými trypsinovými peptidy včetně jejich m/z hmotností 9 využití k identifikaci proteinů metodou peptide mass fingerprinting (peptidové mapování)

Nevýhody 9 malá termostabilita (při vyšší teplotě klesá aktivita) 9 autolýza (autolytické peptidy trypsinu ruší MS analýzu) 9 štěpí pouze v optimálním pH Modifikace trypsinu (methylace, acylace) zabraňují jeho autolýze a termolabilitě.

Chymotrypsin 9 9 9 9

serinová endopeptidáza někdy nahrazuje nebo doplňuje trypsin vhodný pro štěpení proteinů v roztoku i gelu specifita štěpení je na rozdíl od trypsinu nízká 9 peptidovou vazbu štěpí na C-konci v místě: F (phenylalanin), Y (tyrosin), W (tryptophan), L (leucin), I (isoleucin), V (valin), M (methionin) pokud nenásleduje prolin

Glu-C 9 serinová endopeptidáza 9 produkt bakterie Staphylococcus aureus 9 štěpí peptidové vazby na C-konci kyseliny glutamové případně kyseliny asparagové (3000x pomaleji)

Lys-C 9 serinová endopeptidáza 9 produkt bakterie Lysobacter enzymogenes 9 štěpí peptidové vazby na C-konci lysinu

Enzymatické štěpení vzorku Trávicí enzym trypsin umožňuje specifické štěpení peptidové vazby u kladně nabitých zbytků. Trypsin štěpí peptidové vazby od C-konce v místě argininu a lysinu, není-li následující zbytek prolin.

- Phe - Trp - Met - Gly - Ala - Lys - Leu - Pro - Met - Asp - Gly - Arg -- Cys -

Trypsin

Matrice Matrice slouží jako rozpouštědlo analytu, takže jeho molekuly jsou dostatečně zájemně separovány a jejich intermolekulární působení je redukováno na minimum Matrice musí absorbovat v UV oblasti (pokud používáme N2 laser) a musí být málo těkavá (to souvisí s čerpací rychlostí vakuového systému) Matrice musí vytvořit co nejjemnější směsné krystaly U matric je důležitá přítomnost -OH skupin, které zajišťují ionizaci analytů. Pokud jsou -OH skupiny nahrazeny za CH3CO- skupiny, matrice ztrácí svou funkci

Vzorce a názvy matric

Krystaly vzorku a matrice SA na MALDI destičce

Brucella melitensis CAPM 6374

Burkholderie pseudomallei CAPM 3462 Francisella tularensis CAPM 5541

MALDI-TOF MS Výběr matrice Název matrice

Analyzovaná látka

α-kyano-4-hydroxyskořicová kys. (CHC)

Peptidy, proteiny < 10 kDa, karbohydráty, lipidy

3,5-dimetoxy-4-hydroxyskořicová kys. (SA)

Proteiny, peptidy > 10 kDa, glykoproteiny

2,5-dihydroxybenzoová kyselina (DHB)

Neutrální karbohydráty, syntetické polymery, peptidy, proteiny, glykopeptidy, lipidy, glykoproteiny

3-hydroxypikolinová kyselina (3-HPA)

Oligonukleotidy, glykoproteiny

3,4-dihydroxyskořicová kyselina (CA)

Proteiny, oligonukleotidy

Interpretace spekter Voyager Spec #1 MC[BP = 1112.6, 39593] 1112.57

100

4.0E+

90 80 1508.83

% Intensity

70 60

1337.66

50

1806.97 40 30

721.40 1032.59

20 10 0 700

1278.70 874.52

1718.91

1204.64 1381.70 1530.83 1095.54 1260

2007.11 1851.91 1820

2299.22 2310.25 2380

Mass (m/z)

2940

0 3500

Jaké hmotnosti můžeme změřit? Průměrná Vážený průměr všech izotopů daného prvku podle % zastoupení CH3Br = 12.01115 + 3*1.00797 + 79.90400 = 94.93906

Monoizotopická Součet přesných hmotností „nejlehčích“ izotopů prvků CH3Br = 12.000000 + 3*1.007825 + 78.918336 = 93.941011

Jaké hmotnosti můžeme změřit? Průměrná Vážený průměr všech izotopů daného prvku podle % zastoupení CH3Br = 12.01115 + 3*1.00797 + 79.90400 = 94.93906

Monoizotopická Součet přesných hmotností „nejlehčích“ izotopů prvků CH3Br = 12.000000 + 3*1.007825 + 78.918336 = 93.941011 Monoizotopická vs. Průměrná Mh

Mmono < Mavg

Jaké hmotnosti můžeme změřit? Průměrná Vážený průměr všech izotopů daného prvku podle % zastoupení CH3Br = 12.01115 + 3*1.00797 + 79.90400 = 94.93906

Monoizotopická Součet přesných hmotností „nejlehčích“ izotopů prvků CH3Br = 12.000000 + 3*1.007825 + 78.918336 = 93.941011 Monoizotopická vs. Průměrná Mh

Mmono < Mavg Glukosa C6H12O6 Mmono = 180.0633 Mavg = 180.1576

Peptid: HLKTEAEMK Mmono = 1085.55 Mavg = 1086.28

Peptid: HLKTEAEMK Mmono = 1085.55 Mavg = 1086.28 Pro peptidy a proteiny je rozdíl mezi průměrnou a monoizotopickou hmotností kolem 0.06%

Rozlišení hmotnostního spektrometru bylo 5 000. Pro malé peptidy je obvykle první pík izotopické obálky nejvyšší.

Izotopická obálka proteinu inzulin Mmono = 5803.64 Mavg = 5807.66

Izotopická obálka proteinu BSA Mmono = 66 384 Mavg = 66 427

Izotopická obálka proteinu inzulin Mmono = 5803.64 Mavg = 5807.66

Izotopická obálka proteinu BSA Mmono = 66 384 Mavg = 66 427

U velkých proteinů má izotopická obálka jiný tvar než u malých peptidů, nejintenzivnější píky jsou uprostřed. Monoizotopická hmotnost se určuje obtížně, je nutné použít přístroje s vysokým rozlišením.

¾ Parametr hmotnostního analyzátoru ¾ Může mít hodnoty 1/R = 103 – 106 ¾ Vyjadřuje schopnost hmotnostního analyzátoru rozlišit blízké hodnoty m/z a) pro dva ionty: RP (resolving power) – píky m1 a m2 mají 10% překryv při stejné výšce RP = m1/(m1-m2) kdy z1 a z2 se rovnají jedné b) pro jeden ion: m/∆m nebo t/2∆t (u TOF) FWHM (full width at half maximum)

Rozlišení

R = 1 000 (modrá) R = 3 000 (červená) R = 10 000 (zelená) R = 30 000 (černá) Iontová past < TOF < FT-ICR analyzátor

Přesnost určení hmoty ¾ Parametr hmotnostního analyzátoru ¾ Absolutní – udává se v Daltonech (Da), hodnoty 0.1 – 0.0001 ¾ Relativní (mění se podle m/z) – udává se v % nebo ppm (parts per million), hodnoty 100 – 0.1 ppm Vyjadřuje shodu mezi naměřenou m/změřená a vypočtenou m/zteoretická hodnotou Výpočet: (m/zteoretická - m/změřená)/m/zteoretická x 106

Přesnost určení hmoty ¾ Parametr hmotnostního analyzátoru ¾ Absolutní – udává se v Daltonech (Da), hodnoty 0.1 – 0.0001 ¾ Relativní (mění se podle m/z) – udává se v % nebo ppm (parts per million), hodnoty 100 – 0.1 ppm Vyjadřuje shodu mezi naměřenou m/změřená a vypočtenou m/zteoretická hodnotou Výpočet: (m/zteoretická - m/změřená)/m/zteoretická x 106 Příklad Naměřená hmotnost: 545.4200 Teoretická hmotnost: 545.3234 Relativní chyba: (545.3234-545.4200)/545.3234 = -0,00017714 Relativní přesnost = 177 ppm