ZÁKLADNÍ PRINCIPY A VYUŽITÍ KVANTITATIVNÍ PCR S OHLEDEM NA ONKOLOGICKOU DIAGNOSTIKU

Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Katedra Biochemie

ZÁKLADNÍ PRINCIPY A VYUŽITÍ KVANTITATIVNÍ PCR S OHLEDEM NA ONKOLOGICKOU DIAGNOSTIKU Bakalářská práce

Magdaléna Dvořáková

Brno 2007

Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Katedra Biochemie

ZÁKLADNÍ PRINCIPY A VYUŽITÍ KVANTITATIVNÍ PCR S OHLEDEM NA ONKOLOGICKOU DIAGNOSTIKU Bakalářská práce

Magdaléna Dvořáková

Školitel:

RNDr. Irena Koutná, Ph.D. Centrum analýzy biomedicínského obrazu Masarykova univerzita, ILBIT 3A, Kamenice 3, Brno

Brno 2007

2

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci „Základní principy a využití kvantitativní PCR s ohledem na onkologickou diagnostiku“ vypracovala samostatně, pouze s pomocí uvedené literatury. ..…………………………… Magdaléna Dvořáková 3

Poděkování Děkuji paní RNDr. Ireně Koutné, Ph. D. za vedení a poskytnutí materiálů a studijní literatury k danému tématu a udělení mnoha cenných rad.

4

OBSAH 1

Úvod ................................................................................................................................... 8

2

Historie PCR..................................................................................................................... 10

3

Mechanismus reakce ........................................................................................................ 11

4

3.1

Postup práce.............................................................................................................. 11

3.2

Složení reakční směsi ............................................................................................... 12

3.3

Reakční podmínky jednotlivých kroků cyklu........................................................... 17

3.4

Detekce amplifikovaného produktu PCR................................................................. 18

Kvantitativní PCR ............................................................................................................ 20 4.1

Fluorescence ............................................................................................................. 20

4.1.1 4.2 5

RT – PCR ................................................................................................................. 24

Vybavení – přístroje ......................................................................................................... 24 5.1

Termocyklery ........................................................................................................... 24

5.2

Historie ..................................................................................................................... 24

5.3

Technický popis........................................................................................................ 25

5.4

Přístroje pro real-time PCR ...................................................................................... 25

5.4.1

Zdroje excitačního záření ................................................................................. 26

5.4.2

Filtry ................................................................................................................. 26

5.4.3

Monochromátory .............................................................................................. 27

5.4.4

Detektory záření ............................................................................................... 27

5.5

6

Fluorescenční barviva....................................................................................... 21

Jednotlivé typy přístrojů ........................................................................................... 28

5.5.1

ABI Prism® Systems ....................................................................................... 28

5.5.2

Roche Applied Science..................................................................................... 28

Využití metody PCR ........................................................................................................ 29 6.1

Archeologie .............................................................................................................. 30

6.2

Biologie .................................................................................................................... 30

6.2.1

Moderní systematika ........................................................................................ 30

6.2.2

Zoologie - chování zvířat.................................................................................. 31

6.2.3

Ekologické studie ............................................................................................. 31

6.3

Biomedicínské aplikace............................................................................................ 31

6.3.1

Klonování genů ................................................................................................ 31

6.3.2

Určování otcovství ........................................................................................... 31

5

6.3.3

Zjišťování virových a bakteriálních nemocí..................................................... 31

6.3.4

Zjišťování dědičných chorob a mutací ............................................................. 35

6.3.5

Onkologická diagnostika .................................................................................. 36

6.3.5.1

Onkologická onemocnění způsobená viry a bakteriemi............................... 36

6.3.5.2

Vyhledávání dědičných onemocnění............................................................ 38

6.3.5.3

Zjišťování zbytkové nemoci u pacientů s rakovinou ................................... 39

7

Závěr................................................................................................................................. 47

8

Seznam použité literatury ................................................................................................. 48

SEZNAM ZKRATEK ALL

akutní lymfoblastická leukémie (acute lymphoblastic leukemia)

ALT

alanin-aminotransferasa

AML

akutní myeloidní leukémie (acute myeloid leukemia)

ASO PCR

PCR s alelově-specifickými oligonukleotidy

bp

pár bází

CALLA

běžný ALL antigen (common ALL antigen)

CD

diferenciační skupina (cluster of differentiation)

cDNA

komplementární DNA

CML

chronická myeloidní leukémie (chronic myeloid leukemia)

CMV

cytomegalovirus

CT

Chlamydia trachomatis

CytIg

cytoplazmatický imunoglobulin (cytoplasmatic immunoglobulin)

ddNTP

dideoxyribonukleosidtrifosfát

dNTP

deoxyribonukleosidtrifosfát

dsDNA

dvouvláknová DNA (double-stranded DNA)

ELISA

enzymimunoanalýza (enzyme-linked immunosorbent assay)

EtBr

ethidium bromid

FISH

fluorescenční in situ hybridizace (fluorescent in situ hybridization)

FMTC

familiální medulární karcinom štítné žlázy

HBV

hepatitida B

HCV

hepatitida C

HD

Hodgkinův lymfom (Hodgkin’s disease)

6

HPLC HPV LPNHD

vysokotlaká kapalinová chromatografie (high performance liquid chromatography) lidský papillomavirus nodulární Hodgkinův lymfom s lymfocytární predomonancí (lymphocyte-predominant nodular Hodgkin’s disease)

MC

smíšená buněčnost (mixed cellularity)

MDS

myelodysplastický syndrom (myelodysplastic syndrome)

MEN

mnohočetné endokrinní neoplazie

MRD

minimální zbytková nemoc (minimal residua disease)

mRNA

mediátorová RNA

MTB

Mycobacterium tuberculosis

NG

Neisseria gonorrhoea

NS

nodulární skleróza (nodular sclerosing)

Ph

chromozom Philadelphia

qPCR

kvantitativní PCR

RS buňky

Reed-Sternbergovy buňky

RT-PCR

reverzně-transkripční PCR

SNP SSCP

jednonukleotidový polymorfismus (single nucleotide polymorphism) konformační polymorfismus jednovláknové DNA (single strand conformation polymorphism)

ssDNA

jednovláknová DNA (single-stranded DNA)

SurfIg

povrchový imunoglobulin (surface membrane immunoglobulin)

TdT

koncová deoxynukleotidyl transferasa (terminal deoxynucleotidyl transferase)

7

1

ÚVOD Polymerasová řetězová reakce (polymerase chain reaction, PCR) je biochemická a

molekulárně biologická metoda, která slouží k enzymatické replikaci DNA bez použití živého organismu. Tato metoda se postupem času od svého objevení stala nedílnou součástí laboratoří ať již v oblasti biomedicínské, biologické, ale i archeologické a dalších. Své obliby a používanosti dosáhla vzhledem k tomu, že k jejímu provedení teoreticky stačí jediná molekula DNA nebo RNA a není náročná na realizaci. V dnešní době se její použití zaměřuje na detekci zbytkové nemoci (MRD) u onkologických pacientů, u nichž se zjišťuje přítomnost i jen několika rakovinných buněk, které nemohou být odhaleny běžnými laboratorními technikami. Testy na MRD mohou zjistit nádor již v jeho počátku a u pacienta, který byl léčen toto zjištění poukazuje na to, že léčba nebyla úspěšná. MRD může tedy odlišit pacienta, který potřebuje intenzivní a eventuálně toxičtější léčbu od toho, který ji nepotřebuje. Obecný předpoklad základu MRD je, že znalost MRD může účinně vést klinickou péči a zvýšit počet vyléčených. Ve své práci se budu nejprve věnovat historii PCR a mechanismu této reakce. Dále podrobněji rozeberu kvantitativní PCR a vybavení, které se používá k jejímu provedení, především se zaměřením na nejnovější přístroje. Na závěr bude následovat kapitola zabývající se aplikacemi této metody v praxi s důrazem na onkologickou diagnostiku, zejména detekci zbytkové nemoci u onkologických pacientů, virů a bakterií způsobujících onkologická onemocnění a dědičných forem rakoviny.

8

1. INTRODUCTION Polymerase chain reaction (PCR) is a method largely applied in biochemistry and molecular biology. Its purpose is enzyme-catalyzed DNA replication without the necessity of presence of any viable organism. Since its introduction, this method has become a consistent component of laboratories not only in the realm of biochemistry and biology but also archaeology etc. It has gained its popularity and frequency of application due to the fact that only one single molecule of DNA or RNA is required for its completion. It is also notably easy to perform. Today its primary application is aimed at detection of minimal residua disease (MRD) with oncological patients. The proof of the presence of residual cancer cells, i. e. when only a few cancer cells undetectable by common up-to-date techniques are present, is of highest importance. MRD testing may reveal cancer growth in its early stage and with cancer patients it may suggest that their treatment has not been completed. MRD may also predict which patient needs more aggressive and potentially toxic treatment and which does not. Thus the general point of MRD is to direct the course of treatment and increase the survival rate. In my thesis, I begin to deal with the history of PCR and its mechanism. I further elaborate on the quantitative PCR and the gear necessary for its completion emphasizing the most up-to-date technology available. Special chapter is targeted on PCR applications in use stressing the oncological diagnostics, the detection of viruses and bacteria responsible for cancer as well as hereditary cancer disease. The last chapter in thesis deals with real application of the Method with respect to oncological diagnostics. Eventually a chapter will follow on PCR applications in use stressing the oncological diagnostics, the detection of viruses and bacteria responsible for cancer as well as hereditary cancer disease.

9

2

HISTORIE PCR První zveřejněná práce o PCR, která popisovala hlavní principy, tedy replikaci části

DNA použitím primerů, byl dvaceti stránkový dokument publikovaný v časopise Journal of Molecular Biology v roce 1971 norským vědcem Kjellem Kleppeem a laureátem Nobelovy ceny za lékařství pro rok 1968 Harem Gobundem Khoranaou. Rozvoj metody byl na několik let zastaven vzhledem k problémům se syntézou primerů a čištěním DNA polymerasy. Za objevitele této metody je však považován Dr. Kary Banks Mullis, který přišel s myšlenkou PCR na jaře roku 1983, kdy pracoval pro společnost Cetus Corporation, v souvislosti s novým způsobem analýzy mutací DNA. Později téhož roku se se svým asistentem Fredem Fallonou pokusil tuto myšlenku realizovat. Brzy se k nim připojili další zaměstnanci společnosti Cetus, neboť viděli, že tato metoda má velký potenciál. Část týmu tvořili vědci, kteří se zabývali diagnostikou DNA a identifikací mutací lidského genomu. První článek popisující tuto metodu byl stručný a byl publikován v roce 1985 v časopise Science. Metody PCR bylo použito ke stanovení mutace genomické DNA způsobující srpkovitou anémii. Detaily a použití PCR byly odhaleny v plné šíři v článcích uveřejněných v následujících dvou letech. Nakonec se z metody na analýzu mutací DNA stala také metoda na amplifikaci jakékoli části DNA. Metodu Dr. Mullis postupně zdokonaloval – od teoretického schématu k praktickému provedení. Jeho pracovní postup byl následující: malé množství DNA obsahující požadovaný gen, velká skupina volných oligonukleotidů a primery se vložily do zkumavky, která se zahřála na teplotu blízkou 100 °C a poté zchladila. Ke směsi se následně přidala DNA polymerasa a tím došlo k syntéze DNA. Proces zahřátí a zchlazení se několikrát opakoval. Vzhledem k tepelné denaturaci DNA polymerasy ji bylo nutné přidat k reakční směsi před každým cyklem. Tento proces zajišťoval mnohonásobnou amplifikaci daného úseku DNA a tedy jeho pozdější snadnější detekci. Postup byl ovšem velmi neefektivní, protože vyžadoval neustálou pozornost, byl časově náročný a měl velkou spotřebu DNA polymerasy. Časová náročnost způsobená nutností přidávat DNA polymerasu před každým cyklem přiměla vědce hledat způsob automatizace procesu. To vedlo ke konstrukci prvního termocykleru, který pomohl celý proces urychlit. Při vývoji těchto zařízení vstoupil Cetus do strategického partnerství s firmou PerkinElmer. Jejich spolupráce vedla nejen k vývoji termocyklerů, ale také reakčních souprav pro lékařský výzkum. Dalším problémem byla termolabilita přidávané DNA polymerasy. Díky ní byla spotřeba této látky během reakce vysoká a otevíráním zkumavky po každém cyklu se zvyšovala možnost kontaminace reakční směsi a tím znehodnocení celé analýzy.

10

Proto bylo vynaloženo velké úsilí v hledání látky, která by měla stejné vlastnosti jako přidávaná DNA polymerasa ovšem její termolabilita by byla minimální. Tato práce se vyplatila a po několika letech výzkumu byla představena termostabilní DNA polymerasa, která byla izolována z bakterie Thermus aquaticus žijící v termálních pramenech v Yellowstonenském národním parku. Spojení termocyklerů a termostabilní DNA polymerasy učinilo tuto metodu plně automatickou a nyní vyžaduje obsluhu pouze na vložení reakční směsi, zapnutí a poté vypnutí přístroje. Díky těmto vylepšením se metoda stala citlivější a přesnější. Technika PCR byla patentována firmou Cetus 28. července 1987 a jako hlavní vynálezce byl uveden Dr. Mullis. V následujícím roce firma obdržela mnoho žádostí o propůjčení licence na provádění PCR pro komerční diagnostické účely. 15. ledna 1989 Cetus oznámil rozhodnutí spolupracovat s firmou Hoffmann – La Roche Incorporated na vývoji a komercializaci lidské in vitro diagnostiky a službách založených na PCR technologii. V následujících letech proběhlo několik soudních sporů o patentová práva na technologii a pracovní postupy. Všechny spory, včetně toho nejvýznamnějšího s DuPont Copany, byly pro Cetus vítězné. V roce 1992 firma Roche Molecular Systems po několika letech úspěšné spolupráce odkoupila od Cetusu patentová práva na PCR a další související technologie za $300 000 000 a vlastní je dodnes. V roce 1993 obdržel Dr. Kary B. Mullis Nobelovu cenu za chemii za objev PCR techniky [Konrád; Smithsonian Videohistory Collection 2004].

3 3.1

MECHANISMUS REAKCE Postup práce Metoda PCR je cyklická reakce sloužící k amplifikaci určitého úseku molekuly DNA a

je prováděna ve zkumavce, ve které je obsažen vzorek s dsDNA s cílovou sekvencí, pufrovací roztok s DNA polymerasou, oligonukliotidové primery, čtyři druhy dNTP a kofaktor MgCl2. Každá PCR reakce začíná počáteční denaturací, kdy je nutné, aby nastala kompletní denaturace templátu, a tak vznikla vazebná místa pro primery. Pokud je denaturace nekompletní dochází k neúplnému použití templátu v první amplifikačním cyklu a tím k celkově nízkému zisku PCR produktu. Počáteční denaturace se provádí při 95°C po dobu 2 až 5 minut. U vzorků bohatých na G/C páry je doba prodloužena na 10 minut.

11

Po ukončení počáteční denaturace následuje cyklus, který se skládá ze tří kroků: 1. DENATURACE – zkumavka s reakční směsí se zahřeje na teplotu 94 – 96 °C. Dochází k relaxaci a denaturaci molekuly dsDNA do dvou ss molekul, tzv. templátových DNA. Nedostatečně denaturovaná DNA neumožňuje přístup primerů a příliš dlouhá denaturace může způsobit snížení aktivity DNA polymerasy. 2. PŘIPOJENÍ PRIMERŮ – ochlazení reakční směsi na 50 – 65 °C umožňuje navázání primerů k jejich komplementárním sekvencím na ssDNA. Teplota určuje specifičnost vazby primeru na templát a stanovuje se empiricky. 3. PRODLOUŽENÍ PRIMERŮ, POLYMERIZACE – zahřátí reakční směsi na 70 – 72 °C, následuje navázání DNA polymerasy a prodloužení vlákna DNA od každého primeru až na konec templátové DNA pomocí volných dNTP. Nově syntetizované řetězce slouží jako templáty pro další cyklus reakce. Tento cyklus se mnohokrát opakuje a během krátké doby tak dochází k mnohonásobné amplifikaci sekvence DNA. Během každého cyklu dojde ke zdvojnásobení počtu těchto sekvencí, takže po 30 cyklech bude teoretický počet takto vzniklých sekvencí dosahovat hodnoty 1 073 741 824. Celkový počet skutečně vzniklých produktů bude nižší než tento údaj v důsledku postupné degradace enzymu. PCR reakce končí závěrečnou extenzí. Vzorek je ponechán při 72°C po dobu 5 až 15 minut, aby mohlo dojít k dokončení syntézy a renaturaci jednovláknových produktů [Bustin 2004]. 3.2

Složení reakční směsi

Templátová DNA Tato DNA obsahuje gen (cílovou sekvenci), který chceme amplifikovat a slouží jako matrice pro syntézu komplementárních řetězců. Jako zdroj této DNA se používají mikroorganismy, buňky tkáňových kultur, tělní tekutiny, bioptické vzorky, stěry, vlasy a podobně [Bustin 2004]. Primery Primery jsou krátké uměle vytvořené oligonukleotidové úseky jednovláknové DNA o délce 20 – 30 nukleotidů, výjimečně může jejich délka dosáhnout až 80 nukleotidů a pro některé rozbory jsou naopak nejvhodnější primery o délce 13 či méně nukleotidů. Jestliže jsou primery příliš dlouhé a nepurifikované, hrozí zvýšení počtu nesprávně zařazených bází do oligonukleotidu. Neobsahují vnitřní sekundární struktury (např. vlásenka), mají rovnoměrné 12

rozložení oblastí bohatých na G/C a A/T páry a obsah G/C párů by měl být 40 – 60 %. Sekvence primerů by se měla v místě vazby co nejvíce shodovat se sekvencí templátu, to platí zejména pro poslední bázi na 3‘-konci a neměla by obsahovat repetitivní sekvence, aby nedocházelo k vazbě primerů na více různých míst najednou. Dva protilehlé primery by neměly být vůči sobě komplementární, aby nedocházelo ke vzniku stabilních duplexů. Dvě různé primerové sekvence se váží na vlákna templátové DNA a ohraničují tak oblast, která má být amplifikována. Jeden primer je komplementární se začátkem cílové oblasti jednoho vlákna DNA a druhý primer je komplementární s koncovou sekvencí cílové oblasti na druhém vlákně DNA. Oba primery mají 3‘-konce uzpůsobené tak, aby se na ně mohly vázat volné dNTP. Navázání primerů na vlákna DNA umožňuje připojení DNA polymerasy a může tak začít syntéza cílové sekvence [Bustin 2004]. Následující příklady různých primerů se používají u jednotlivých modifikacích klasické PCR: GSP (gene specific primer) – specifické oligonukleotidy, které se používají při syntéze vybrané části mRNA – používají se u RT–PCR oligo dT – umělý jednovláknový oligomer s 5‘- a 3‘-hydroxylovými konci, počet nukleotidů se pohybuje v rozmezí 12 až 18 – používají se u RT–PCR při syntéze cDNA random hexametr primery – směs jednovláknových náhodných hexanukleotidů s 5‘- a 3‘hydroxylovými konci – používají se u RT–PCR při syntéze cDNA nested primery – používají se dva páry primerů pro dvě následné PCR reakce – první pár je použit pro vznik DNA produktů, které kromě cílové sekvence mohou obsahovat ještě nespecifické fragmenty DNA, které jsou následně odstraněny při amplifikaci těchto produktů pomocí druhého páru, jehož vazebná místa jsou částečně nebo zcela odlišná od vazebných míst prvního páru a výsledný produkt je díky tomuto kratší – používají se zejména při amplifikaci dlouhých fragmentů DNA u Nested PCR stair primery – jsou ekvimolární oligonukleotidy různé délky nahrazující klasické primery – 5‘-koncové sekvence zůstávají nezměněny (délka amplifikovaného úseku je konstantní), ale 3‘-konec je postupně báze po bázi odstraněn – používají při zjišťování přítomnosti enterovirů u kvantitativní PCR 13

alelově specifické oligonukleotidy – používají se jako primery při zjišťování bodových mutací a malých delecí Pufrovací roztok – pufr Pufr je nezbytná součást reakční směsi, která zajišťuje vytvoření potřebných podmínek pro aktivitu DNA polymerasy. Určuje hodnotu pH, která se pohybuje v rozmezí 8,3 až 9,0. Ve většině případů obsahuje Tris-HCl, KCl a někdy také MgCl2 [Bustin 2004]. DNA polymerasa DNA polymerasa je enzym, v důsledku jehož činnosti dochází k syntéze DNA. Jeho typickou vlastností je schopnost rozpoznávat ssDNA jako templát a současně vázat dNTP. Váže se na primer, vzniká tak řetězec komplementární s templátem, a slouží k jeho

prodloužení,

k

čemuž

se Obrázek 1: DNA polymerasa, převzato z používají jednotlivé druhy volných http://www.biopro.de/en/region/rhein/magazin/01172/index.html dNTP. V dnešní době se již používá termostabilní DNA polymerasa, která odolává teplotám až 98°C. Výběr vhodné DNA polymerasy pro danou reakci se řídí několika vlastnostmi tohoto enzymu a to: délkou života při 95°C, rychlostí prodlužování řetězce, přesností, RT aktivitou, 5‘ – 3‘ a 3‘ – 5‘ exonukleasovou aktitivou. Aktivita DNA polymerasy je ovlivněna reakčními podmínkami, a to například pH nebo koncentrací přítomných solí. V následujícím přehledu jsou zmíněny nejčastěji používané DNA polymerasy s jejich charakteristickými vlastnostmi. Následně jsou nejdůležitější vlastnosti shrnuty v tabulce na konci tohoto přehledu [Bustin 2004]. Taq – Thermus aquaticus (mnoho dodavatelů) – první, nejznámější a nejlevnější termostabilní DNA polymerasa – má RT aktivitu při teplotě 68 – 78°C s rychlostí prodloužení řetězce 2 – 6 nukleotidů za vteřinu, nemá 3‘ – 5‘ exonukleasovou aktivitu a optimální přesnosti je dosaženo při 70°C a pH 5 – 6

14

Tth – Thermus thermofilus (různí dodavatelé) – aktivita je obdobná jako u Taq polymerasy s podobným množstvím chyb, ale s nižší rychlostí prodlužování řetězce a proto je její množství používané v reakčních směsích vyšší – je méně termostabilní než Taq polymerasa – při standardní PCR je její použití pouze omezené, ale její RT aktivita při vyšší teplotě a v přítomnosti Mn2+ iontů se využívá při RT-PCR Tfl – Thermus flavus (Promega) – jeho vlastnosti jsou velmi podobné vlastnostem Tth polymerasy, ale je termostabilnější – při vyšších teplotách a v přítomnosti Mn2+ iontů může 5‘ – 3‘ exonukleasová aktivita vystupovat jako RT aktivita Pfu – Pyrococcus furiosus (Stratagene) – velmi stabilní a přesný enzym, ale s nízkou rychlostí prodlužovaní řetězce – nepoužívá se při přítomnosti dUTP Vent – Thermococcus litoralis (NEB) – enzym s vysokou přesností, který neprodlužuje templáty obsahující dUTP Deep Vent – Pyrococcus species GB-D (NEB) – velmi stabilní, umožňuje použití rozpouštědel jako je formamid a DMSO – 3‘ – 5‘ exonukleasová aktivita je 4 x vyšší než u Vent DNA polymerasy a 5-15 x vyšší než u Taq polymerasy – stejně jako Vent neprodlužuje templáty s dUTP Tgo – Thermococcus gorgonarius (Roche) – u tohoto enzymu je skloubena vysoká termostabilita s přesnost Pwo – Pyrococcus woesei (Roche) – tento enzym se vyznačuje vyšší termostabilitou (přežívá více než 2 hodiny při 100°C) – při jeho použití se upřednostňuje MgSO4 před MgCl2 a nepoužívá se v přítomnosti dUTP KOD HiFi – rekombinantní forma Thermococcus kodakaraensis (Novagen) – velmi výrazná 3‘- 5‘ exonukleasová aktivita, která se projevuje nízkým počtem chyb a velkou rychlostí prodlužování řetězce (2 x rychlejší než Taq a 5x než Pfu polymerasa)

15

Enzym Taq Tth Tfl Pfu Vent Deep Vent Tgo Pwo KOD HiFi

Délkou života při 95°C (h) 1,6 0,3 0,6 6 – 18 6,7 23 2 ? 12

Rychlost prodloužení řetězce (nt/s)

RT aktivita

5‘–3‘ exonukleasová aktivita

3‘–5‘ exonukleasová aktivita

60 25 – 33 40 25 67 23 ? 40 – 50 100 – 130

ano ano ano ne ne ne ne ne ano

ano ano ano ne ne ne ne ne ne

ne ne ne ano ano ano ano ano ano

Tabulka 1: Přehled vlastností nejběžněji používaných DNA polymeras, převzato z [Bustin, 2004]

dNTP dNTP jsou deoxynukleotidtrifosfáty, které se v tomto případě vyskytují v roztoku samostatně. Jako cukerná složka vystupuje deoxyribosa, mezi přítomné nukleové kyseliny patří adenin, cytosin, guanin a thymin a poslední složkou jsou tři zbytky kyseliny fosforečné. Tyto dNTP se v reakční směsi vyskytují ve formě sodných nebo litných solí. Během prodlužování primeru se váží svou OH-skupinou poslední kyseliny fosforečné na 3‘–OH konec posledního nukleotidu prodlužovaného řetězce. Váže se vždy ten dNTP, který je komplementární k nukleotidu na templátovém řetězci [Bustin 2004]. MgCl2 Mg2+ iont tvoří rozpustný komplex s dNTP a vytvářejí substrát, který rozpoznává DNA polymerasu. Přítomnost volných Mg2+ iontů je nezbytná pro aktivitu DNA polymerasy, ale jejich nadbytek má za následek snížení její přesnosti a zvýšení hladiny nespecifických amplifikací. Koncentrace Mg2+ se určuje empiricky a závisí na konečné koncentraci dNTP, primerů a templátů a ovlivňuje Tm duplexů primer-templát, primer-primer a templát-templát vznikajících během cyklů [Bustin 2004]. PCR – voda Přidávání vody do reakčních směsí musí být obezřetné. Voda totiž může být zdrojem kontaminace a může dojít ke znehodnocení pokusu. Používá se speciálně upravená voda, většinou redestilovaná (RNase-free water, Ambion DEPC treated water) [Bustin 2004].

16

3.3

Reakční podmínky jednotlivých kroků cyklu Pro každou PCR reakci je nutné určit hodnoty teplot a dobu, po kterou budou apliko-

vány před jejím začátkem. Při jejich určování se řídíme obecně platnými hodnotami. Denaturační čas a teplota Během denaturačního kroku je důležité, aby došlo k oddělení všech dsDNA na jednovlákna. K tomuto účelu je vhodné zahřívat reakční směs na teplotu 94 až 96°C po dobu okolo 45 vteřin, avšak u sekvencí bohatých na G/C páry může být potřeba zvýšit dobu denaturace na 3 až 4 minuty nebo zvýšit teplotu na 97 °C či dokonce 98°C. V takovémto případě je nutné zvolit vhodnou DNA polymerasu. Doba zahřívání směsi závisí také na objemu reakční směsi a tloušťce stěn zkumavky. Čas a teplota pro připojení primerů Teplota pro připojení primerů (Ta) se stanovuje empiricky nebo pomocí teplotního gradientu. Její hodnota se odvíjí od hodnoty Tm duplexu primer-templát a obvykle se pohybuje v rozmezí 50 – 65 °C. V případě výskytu nespecifických produktů může být teplota optimalizována jejím zvýšením o 1 až 2 °C. Doba provedení se pohybuje mezi 30 a 90 vteřin. Optimální hodnota se vypočítá podle vztahu: Τa = 0,3 × Τ primer + 0,7 × Τ produkt − 25 m m Τ primer je hodnota Tm nejméně stabilního páru primer-templát m Τ produkt je hodnota Tm amplifikačního produktu m

Orientačně ji lze vypočítat ze vztahu: Ta= 2 (A+T) + 4 (G+C) – 5°C = Tm – 5°C, kdy je zohledněno zastoupení jednotlivých bází. Polymerizační čas a teplota

Obvyklá teplota při polymerizaci je 70 – 72 °C, protože nejčastěji používaná Taq polymerasa má optimální aktivitu okolo 70 °C. Pro 5‘- nukleasový rozbor se používá teplotního rozmezí 60 – 62 °C [Bustin 2004]. Doba trvání reakce se stanovuje na základě délky syntetizovaných sekvencí a aktivitě DNA polymerasy a obvykle se pohybuje mezi 45 a 90 vteřinami. Počet cyklů

Počet cyklů závisí na množství templátové DNA v reakční směsi a očekávaném výtěžku reakce. Nejčastěji se pohybuje v rozmezí 25 až 40 cyklů.

17

3.4

Detekce amplifikovaného produktu PCR

Stanovení fyzikální velikosti produktu gelovou elektroforézou, detekce obarvením a pozorováním pod UV světlem.

Hlavním principem elektroforézy je pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli. Vzhledem k tomu, že pentosofosfátová kostra všech nukleových kyselin nese stejně velký záporný náboj, budou se fragmenty pohybovat vždy směrem k anodě a rychlost této migrace bude závislá pouze na jejich velikosti. Kratší fragmenty se pohybují rychleji a urazí tedy větší vzdálenost nežli delší fragmenty. Používají se agarosové nebo polyakrylamidové gely. Polyakrylamidové gely se používají, když je vyžadována větší citlivost analýzy. Štěpení produktu restrikčními enzymy a posouzení spektra vznikajících restrikčních fragmentů.

Restrikčními enzymy jsou restrikční endonukleasy, které se váží na specifické rozpoznávací sekvence dsDNA, dlouhé zpravidla 4-6 bp. Oba řetězce jsou štěpeny buď uvnitř, nebo poblíž této sekvence. Činností restriktas je DNA štěpena na fragmenty o různé délce, které lze od sebe oddělit elektroforézou. Fragmenty DNA jsou na gelu detekovány autoradiografií (většinou 35

32

Pa

S) nebo fluorescenčními barvivy (například biotin).

Elektroforetická separace produktů za specifických podmínek pro detekci sekvenčních polymorfizmů.

Při této separaci se nepoužívají agarosové gely, ale speciální polyakrylamidové gely, které umožňují zvýšení citlivosti analýz a současně úsporu času. Používá se například u analýzy SSCP (konformační polymorfismus jednovláknové DNA), při které se amplifikované produkty podrobí denaturaci přidáním formamidu a NaOH a zahřátím. Denaturované molekuly DNA (ssDNA) jsou rychle zchlazeny a přeneseny na gel. Citlivost této analýzy je velmi vysoká, protože i substituce jediného nukleotidu většinou vede ke změně sekundární struktury molekuly DNA. Hybridizace s neradioaktivně značenou sondou komplementární k části sekvence amplifikovaného úseku a detekce enzymoimunoanalýzou v mikrotitrační destičce.

Amplifikovaná sekvence se nejprve podrobí hybridizaci s neradioaktivně značenou sondou. Jako značení se nejčastěji používají enzymy peroxidasa, alkalická fosfatasa, βgalaktosidasa nebo glykosid oxidasa. Poté se nanese na mikrotitrační destičku, na jejíž povrch 18

je sorbována protilátka, na kterou se váže značená sekvence. Vazbou protilátky a značené sekvence dochází k chemické reakci a nejčastěji barevné změně. Barevná změna se poté měří fotometricky. Imobilizace produktů na membráně a tečková hybridizace se značenými alelově - specifickými oligonukleotidy nebo zpětná tečková hybridizace s různými alelově - specifickými oligonukleotidy imobilizovanými na membráně.

Tečková hybridizace se používá k detekci specifických sekvencí vzorků nukleových kyselin imobilizovaných na membráně nitrátu celulosy nebo nylonu. Denaturovaná DNA se v roztoku nanáší na membránu v podobě teček a následuje hybridizace se sondou (alelově-specifické oligonukleotidy). Vyhodnocení je buď vizuální, denzitometrické nebo pomocí β-spektrometru. Zpětná tečková hybridizace spočívá v tom, že na membránu se nejprve fixuje sonda a teprve poté dochází k hybridizaci s DNA z vlastního vzorku. Hybridizace na DNA čipech

DNA čipy jsou oligonukleotidové matice, které se připravují in situ pomocí fotolitotrofie a chemické syntézy oligonikleotidů na pevném nosiči. Umožňují na principu alelověspecifické oligonukleotidové hybridizace opakované a rychlé testování přítomnosti nebo sekvenční analýzy značených nukleových kyselin. Detekce se provádí speciálním laserovým skenerem, který zaznamenává intenzitu fluorescenčního záření. Stanovení sekvence DNA

Stanovuje se pořadí nukleotidů v molekule, tedy primární struktura molekuly. Lze použít chemickou (Maxam-Gilbertovu) metodu, která je založena na bázově-specifické chemické modifikaci a následném štěpení DNA, kdy se nejdříve připraví ssDNA obsahující danou sekvenci a rozdělí se do 4 zkumavek. V každé zkumavce proběhne chemická modifikace jednoho nebo více typů bází a štěpení DNA v místech, kde došlo modifikace. Následuje elektroforéza na denaturačním polyakrylamidovém gelu a autoradiografická detekce (32P) vzniklých DNA fragmentů. Nebo enzymatickou (Sangerovu) metodu, která je založena na terminaci replikace nového řetězce podle matrice zkoumané sekvence ddNTP. Postup je obdobný jako u chemické metody. Připravená ssDNA se rozdělení do 4 zkumavek a do každé je přidán jeden druh ddNTP. Při syntéze nového řetězce DNA polymerasa zařadí místo dNTP jeho analog, ddNTP což způsobí ukončení syntézy. V každé zkumavce vzniknou fragmenty, které jsou

19

zakončeny příslušným ddNTP. Produkty se podrobí denaturaci a elektroforéze v denaturačním polyakrylamidovém gelu. Posledním krokem je autoradiografická detekce.

4

KVANTITATIVNÍ PCR Základem kvantitativní real-time PCR je možnost průběžného sledování množství am-

plifikovaného produktu během jednotlivých cyklů reakce. Množství produktu je sledováno jako množstevní přírůstek na základě změny intenzity fluorescenčního záření, protože intenzita fluorescenčního záření je přímo úměrná množství produktu. Samotné produkty nejsou schopné fluorescenčního záření, a proto se do reakční směsi přidávají fluorescenční barviva, která tuto schopnost mají a žádným způsobem neovlivňují průběh reakce [Bustin 2004]. 4.1

Fluorescence

Fluorescenční

záření

neboli

fluorescence je třífázový cyklický proces, během kterého dochází k absorpci a emisi fotonu: 1. fáze – elektron látky, která pohltila foton o určité energii, je excitován ze základního do energeticky bohatšího stavu.

Obrázek 2: Přechod elektronu mezi základním a excitovaným stavem, převzato z http://probes.invitrogen.com/han-

2. fáze – vybuzený elektron zůstává dbook/figures/0664.html a upraveno v tomto stavu po dobu 10-8 až 10-7 s a poté se vrací zpět do základního stavu. 3. fáze – po návratu elektronu dochází k vyzáření (emisi) přebytečné energie elektronu ve formě fotonu (fluorescenční záření), který má nižší energii (vyšší vlnovou délku) než-li foton absorbovaný. Fluorescenční vlastnost látce uděluje její specifická část, tzv. fluorofor, což je funkční skupina dané látky, většinou heterocyklické nebo polyaromatické povahy, která absorbuje a emituje energii pouze určité vlnové délky. Intenzita fluorescenčního záření je rovněž ovlivněna jeho zhášením. Toto zhášení má několik příčin a to například: blízkost fluoroforu a purinové báze (zejména guaninu); sekundární strukturu sekvence, na kterou se fluorofor váže; ale také přítomnost zhášeče. Zhášeč je nefluoreskující barvivo, které sice světelnou energii absorbuje, ale nevyzařuje ji jako fluorescenční záření nýbrž jako teplo nebo světlo s vyšší vlnovou délkou než je fluorescenční. To

20

umožňuje návrat excitovaného elektronu fluoroforu od základního stavu bez vyzáření fluorescence [Bustin 2004]. 4.1.1

Fluorescenční barviva

Fluorescenční barviva rozdělujeme podle charakteru jejich vazby na nespecifická a specifická. Nespecifické chemické látky Interkalační barviva Interkalační barviva se reverzibilně váží na jakoukoli dsDNA vznikající během PCR a zvyšují intenzitu fluorescenčního záření. Tyto sloučeniny většinou obsahují postranní řetězec, který se s omezenou specifitou váže do žlábku dsDNA molekuly. Real-time PCR rozbory, které využívají těchto barviv (např. SYBR™ Green I a II, SYBR™ Gold) detekují fluorescenci, která je vázána na menší žlábek dsDNA. Důvod proč se tato barviva stále používají je, že jejich fluorescenční emisní spektrum je velmi blízké spektru fluoresceinu, na které jsou často optimalizovány PCR fluorimetry. Dalšími výhodami je jejich citlivost, jednoduchost použití a cena, protože oproti barvivům používajícím

barviva Abmax (nm) Emmax (nm) Cy5 643 667 Cy7 743 767 DABCYL 453 – EtBr 288 602 Fluorescein 492 520 FAM 494 518 LightCycler 625 640 Oregon Green 499 519 Rhodmine 524 550 ROX 585 605 SYBR Green 498 522 SYBR Gold 495 538 TAMRA 565 580 Texas Red 583 603 YoYo 490 508 Yo-Pro 491 506

se pro sondy jsou levné. Nevýhodami těchto Tabulka 2: Přehled nejpoužívanějších fluorescenčbarviv je, že se váží na jakoukoli dsDNA a ně- ních barviv s jejich absorpčními a emisními maximy, která barviva se váží dokonce na ssDNA a způ- převzato z [Bustin 2004] a upraveno sobují tak nespecifickou fluorescenci a proto je nutné, aby výsledky byly ověřeny následnými rozbory. Použití některých barviv: SYBR Green – kvantifikace mRNA, detekce variant spojení mRNA, virových a bakteriálních patogenů, zjišťování genotypu a detekce zbytkové nemoci u pacientů s rakovinou. další barviva – detekce a kvantifikace nukleových kyselin [Bustin 2004]. Specifické chemické látky Vazba těchto látek na templát je specifická a děje se tak prostřednictvím sondy, která se vyrábí pro každý PCR rozbor zvlášť, protože každá cílová sekvence potřebuje vlastní son21

du. Používaná barviva mají většinou jako základ fluorescein, rhodamin nebo cyanin. Uplatňuje se zde molekula zhášeče, která ovlivňuje detekci fluorescence. Princip použití je následující: fluorescenční signál vzniká pouze tehdy, jestliže amplikon-specifická sonda hybridizuje s její komplementární cílovou sekvencí. Zvýšení fluorescence může nastat na konci kroku, kdy se prodlužují primery nebo na konci polymerizačního kroku. Výhodou oproti interkalárním barvivům je, že sondy mohou být označeny různými barvivy a mohou tak být detekovány produkty několika různých sekvencí během jediné qPCR reakce. Na druhou stranu jsou zde i nevýhody. Díky vlastní specifitě nemohou být artefakty detekovány a ovlivňují tak efektivitu amplifikace. A dále je to cena – pro každou sekvenci je nutné vyrobit novou sondu. Sondy se dělí do dvou kategorií: Lineární sondy – jejich výhodou je, že nepřítomnost sekundární struktury poskytuje ideální efektivitu hybridizace. HyBeacons™ Tyto sondy využívají jako zhášeč vlastnosti molekuly DNA. Fluorescenční záření je větší jestliže sonda hybridizuje s komplementární cílovou sekvencí než když je jednovláknová. Fluorescenční barvivo je připojené na vnitřní nukleotid oligonukleotidové sondy, která dále obsahuje skupinu na 3’-konci, která brání prodlužování řetězce. Používají se při analýze SNP mutací [Bustin 2004]. Hydrolysis (TaqMan®) Probes Tento rozbor byl poprvé popsán již v roce 1991 a vychází z 5‘-3‘ exonukleasové aktivity Taq polymerasy, která štěpí značenou TaqMan sondu, jestliže hybridizovala s komplementární cílovou sekvencí. Fluorofor je připojen na 3’- a zhášeč na 5‘-konec sondy. Excitovaný fluorofor předává svou energii zhášeči, který fluoreskuje, ale jedná se o fluorescenci jiné vlnové délky než vydává fluorofor a její hladina je nízká. Při vazbě sondy na komplementární sekvenci se aktivuje Taq polymerasa, která začíná sondu štěpit od 5‘-konce. Dochází tak k oddělení fluoroforu a zhášeče a díky tomu nedochází ke zhášení fluorescence fluoroforu, která nevratně vzroste. Nárůst produktů PCR reakce je zjištěno nepřímo pomocí sledování nárůstu fluorescence fluoroforu. Této metody se používá při analýze SNP mutací, kdy jsou sondy pro každou alelu označeny jiným fluoroforem. Je to nejoblíbenější qPCR metoda [Bustin 2004]. Strukturní sondy – mají strukturně přirozenou stavbu např. s vlásenkovou strukturou a mají významně vyšší hybridizační přesnost než lineární sondy. – mezi nejvýznamnější druhy těchto sond patří Molecular Beacons a Scorpion. Druhé jmenované jsou považovány za o něco více specifické, ale 22

specifita těchto sond závisí také na reakčních podmínkách a způsobu použití, takže v některých případech to může být i naopak. Molecular Beacons Tyto sondy jsou tvořeny oligonukleotidovým řetězcem jehož 5‘- a 3‘-konce jsou navzájem komplementární, takže při jejich spojení dochází ke vzniku vlásenky. Ke koncům jsou připojeny fluorofor se zhášečem a to tak, že každý se nachází na jednom konci. Volně v roztoku sonda zaujímá tuto konformaci, takže vzhledem k blízkosti fluoroforu a zhášeče dochází ke zhášení fluorescence. Při vazbě sondy na cílovou sekvenci se vlásenková struktura otevře, fluorofor a zhášeč se oddělí a vzniká tak fluorescenční záření. Specifita sondy spočívá ve faktu, že jestliže není cílová sekvence zcela komplementární se sondou, sonda se nenaváže a fluorescence nevznikne. Hlavním problémem těchto sond je v jejich konstrukci. Oligonukleotid musí být navržen tak, aby nemohly vznikat struktury, ve kterých by fluorofor a zhášeč neležely v těsné blízkosti. Kdyby tato situace nastala, mohlo by dojít k tomu, že fluorofor by vyzařoval fluorescenční záření bez ohledu na to jestli je sonda navázána či ne. Těchto sond se používá při zkoumání interakcí DNA-protein, detekci enzymatického štěpení ssDNA, k provedení a kvantitativní analýze hybridizace, analýze SNP mutací, přesné detekci Y-chromozomů u blastomer [Bustin 2004]. Scorpions™ U tohoto druhu sond je spojena přítomnost primeru a sondy v jediné molekule. Molekula je tvořena dvěma oligonukleotidovými řetězci. Jeden z nich tvoří specifický primer, PCR blokátor (neamplifikovatelný monomer, který odděluje primer od sondy a zabraňuje přepisu sekvence sondy), sonda a fluorofor na 5‘-konci sondy. Druhý oligonukleotidový řetězec má na svém 3‘-konci zhášeč, je komplementární se sekvencí sondy a váže se na ni. To má za následek zhášení fluorescence. Molekula se v oblasti primeru váže na cílovou sekvenci a dochází k jejímu prodloužení. Poté nastává tepelná denaturace, při které je prodloužený primer oddělen od cílové sekvence a oligonulkeotid se zhášečem disociuje. Po snížení teploty se prodloužený Scorpion nově uspořádá a sonda se váže na prodloužený primer. Vzniká vlásenka a fluorescenční záření. Scorpions se používají při analýze SNP mutací, detekci druhu a množství lidského pappilomaviru a patogenů plísňových onemocnění rostlin [Bustin 2004].

23

4.2

RT – PCR

RT-PCR je modifikací PCR, která slouží k detekci a kvantifikaci mRNA. RNA však nemůže sloužit jako templát PCR, a proto je nejdříve převedena na cDNA pomocí retrovirové zpětné trankriptasy (RT) a poté amplifikována pomocí PCR se dvěma specifickými primery. Nevýhodou je, že RT je termolabilní a obvykle nefunkční nad 42 °C. V případech, kdy je sekundární struktura RNA složitá znemožňuje její převod do cDNA. Proto se používá Tht polymerasa, která je schopná převést RNA do cDNA v přítomnosti Mn2+ iontů. V současné době je nejcitlivější metodou detekce a kvantifikace mRNA a v porovnání s Northern blot a RNase protection assay, dvěma dalšími používanými technikami kvantifikace mRNA, se při RT-PCR používá mnohem menších vzorků. Metoda je tak citlivá, že je detekce možná již u jediné buňky.

5 5.1

VYBAVENÍ – PŘÍSTROJE Termocyklery

Termocyklery jsou přístroje sloužící pro automatickou regulaci teploty během jednotlivých cyklů PCR reakce. Používají se při klasické PCR a jejich dalších modifikacích buď samostatně nebo spolu s dalšími přístroji k amplifikaci cílových sekvencí popřípadě jejich detekci. 5.2

Historie

Na počátku byla PCR metoda náročná na čas a materiál a vynucovala si neustálou pozornost, což bylo nežádoucí. Proto se Cetus Corporation v roce 1985 rozhodnul spojit s firmou PerkinElmer a vznikla tak firma PerkinElmer Cetus Instrument (PECI), která svou činnost zaměřila na sestrojení zařízení, které by bylo automatické a obsluhovalo by celou PCR reakci sa- Obrázek 3: "Mr. Cycle", převzato z http://www.themo. Snaha inženýrů byla úspěšná a již scientist.com/article/display/36690/ téhož roku byl sestrojen první prototyp termocykleru. „Mr. Cycle“, jak je prototyp z roku 1985 nazýván, byl vyroben úpravou vícekanálové automatické kapalinové jednotky a dvou hliníkových bloků. Přes kapalinovou jednotku byl 24

napojen na lázně s teplou a studenou vodou, které střídavě oteplovaly a chladily bloky se zkumavkami s reakční směsí. Přístroj však nebyl plně automatický, protože po každém cyklu, kdy došlo k zahřátí směsi musela obsluha do směsi přidat čerstvý enzym. V následujících letech PECI představila několik druhů termocyklerů, ale plně automatické přístroje byly uvedeny na trh až po objevu termostabilní DNA polymerasy [Sharrer 2006; Smithsonian Videohistory Collection 2004]. V dnešní době jsou na trhu různé druhy termocyklerů i od jiných firem, které postupem času vstoupily na trh. Tyto přístroje jsou dnes programovatelné a objemy analyzovaných vzorků dosáhly mikrolitrových množství. 5.3

Technický popis

Důležitými součástmi termocyklerů jsou tepelný blok a u moderních přístrojů i vyhřívané víko. Tepelný blok má otvory, do kterých se vkládají zkumavky s reakční směsí a umožňuje programovatelnou regulaci teploty v jednotlivých cyklech. Některé termocyklery jsou vybaveny několika bloky, které umožňují současné provedení několika různých PCR reakcí. Přístroje mohou mít dále funkci gradientu, která umožňuje nastavení různých teplot v různých částech bloku. Této funkce se využívá zejména při určování teplot vhodných pro vazbu primerů na templátovou DNA. Vyhřívané víko doléhá k víčkům zkumavek a zabraňuje tak nežádoucí kondenzaci vody na spodní straně víčka, ke které by mohlo docházet při zahřívání. PCR reakce se provádí v úzkých zkumavkách, které umožňují rychlé opakování cyklů a syntézu DNA v průběhu 20 vteřin [Rice 2006]. 5.4

Přístroje pro real-time PCR

Při kvantitativní real-time PCR vzniká fluorescenční záření. Přístrojové vybavení proto odpovídá této skutečnosti a nepoužívá se klasického termocykleru, ale kombinovaného termocykleru s fluorimetrem, který slouží k měření změny intenzity fluorescenčního záření. Fluorimetr má jednoduché uspořádání. Je tvořen zdrojem excitačního záření, filtry nebo monochromátorem a detektorem záření. Záření vznikající ve zdroji excitačního záření prochází filtrem nebo monochromátorem, kde dochází k úpravě jeho vlnové délky, vstupuje do vzorku a jeho interakcí s ním vzniká fluorescenční záření, které ze vzorku vychází a průchodem přes filtr dopadá na detektor záření. Vznik fluorescenčního záření ve vzorku je dáno chemickými vlastnostmi fluoroforu a zhášeče [Bustin 2004].

25

5.4.1

Zdroje excitačního záření

Ve zdroji excitačního záření vzniká světlo, jehož energie dokáže excitovat elektron fluoroforu. Halogenové žárovky Jejich konstrukce je podobná s klasickou žárovku s wolframovým vláknem, ale plyn vyplňující žárovku obsahuje stopu halogenu (obvykle brom). Tyto žárovky vysílají nepřetržité světlo v rozmezí vlnových délek od 350 nm do 2600 nm. Vzhledem k tomu, že obsáhnou všechny vlnové délky viditelného světla, jsou tyto žárovky označovány jako zdroje bílého světla. Toto široké rozmezí vlnových délek velmi usnadňuje výběr fluorescenčního barviva pro daný vzorek. Lze vybrat nejvhodnější typ bez ohledu na vlnovou délku záření potřebnou k excitaci jeho fluoroforu. Oblast vlnové délky excitačního záření se na požadovanou délku zúží při použití filtrů nebo monochromátoru. Hodnotu fluorescence přístroj zobrazí po dopadu světla emitovaného vzorkem na detektor záření [Bustin 2004]. Lasery Vysílají světlo určité vlnové délky, které je monochromatické. Intenzita tohoto světla je vysoká, ale rozmezí vlnových délek je malé. Hodnotu fluorescence přístroje využívající laser získávají matematickým výpočtem jako rozdíl dvou fluorescenčních signálů. Hlavní nevýhodou laserů je, že emise záření má pevně danou vlnovou délkou, protože většina fluorescenčních barviv má excitační spektrum mimo toto rozmezí a proto je výběr barviv velmi omezen [Bustin 2004]. LED diody Mají charakter polovodiče, emitované světlo má vlnové délky 430, 450, 505, 592, 612 a 637 nm s rozmezím 30 až 40 nm, což vyhovuje velké části fluorescenčních barviv. S použitím nových materiálů LED diody emitují světlo také v UV oblasti. Hlavními výhodami je poměrně nízká cena vzhledem k laserům, malá velikost, nízká spotřeba energie, nízké přehřívání, vysoká spolehlivost a odolnost proti nárazům a otřesům. Nevýhodou je omezený výběr vlnové délky a nutnost přítomnosti rezistoru [Bustin 2004]. 5.4.2

Filtry

Optické filtry se používají k vybrání světla určité vlnové délky, která je pro daný pokus vyžadována. Dají se rozdělit do dvou hlavních skupin a to na filtry excitační a filtry emisní. Excitačními filtry prochází světlo, které vychází ze zdroje a to zejména ze zdrojů bílého světla a někdy také LED diod. Emisní filtry se nacházejí mezi vzorkem a detektorem záření. Slouží k výběru fluorescenčního záření, které se bude sledovat a také k odstranění rozptýlené26

ho světla. Optická kvalita filtrů a jejich optimální postavení v optické dráze světla hrají důležitou roli ve výkonu a přesnosti přístroje[Bustin 2004]. 5.4.3

Monochromátory

K výběru světla určité vlnové délky lze také použít difrakční mřížku nebo hranol. Difrakční mřížka Dopad polychromatického světla na mřížku způsobí jeho rozdělení na paprsky, a to destruktivní, které se dále neuplatňují, a konstruktivní. Vlnová délka konstruktivních paprskům závisí na úhlu, pod kterým se šíří po průchodu mřížkou. Úhel lomu světla můžeme přizpůsobit potřebám pokusu a tím získat světlo potřebné pro danou analýzu [Bustin 2004]. Hranol Slouží k disperzi, polychromatického světla na jeho monochromatické složky, ke které dochází na rozhraní hranol-prostředí. K následnému výběru paprsku, který projde analyzovaným vzorkem, se používá štěrbina. V dnešní době je většinou nahrazen difrakční mřížkou. 5.4.4

Detektory záření

Detektor záření mění světelnou energii určité vlnové délky, která na něj dopadá na elektrický signál. CCD (Charge-Coupled Device, zařízení s vázanými náboji) Je elektronická polovodičová součástka, jejíž pole je rozděleno do mnoha samostatných komůrek – pixely. Světlo dopadající na každý pixel je převedeno na elektrický náboj. Velikost elektrického náboje je přímo úměrná množství dopadajícího světla. Elektrony se hromadí v pixelech po celou dobu, kdy je osvícen a teprve po zhasnutí světla jsou zpracovávána výsledná data [Bustin 2004]. Fotonásobič Je složen z fotokatody a dynod. Fotokatoda přijímá fotony všech vlnových délek viditelného oblasti elektromagnetického spektra, které mají dostatečnou energii. Tyto fotony vyrážejí fotoelektrony, které jsou urychlovány směrem k dynodám, kde po jejich dopadu dochází ke kaskádovému efektu a vzniku dalších elektronů. Tento efekt má za následek vznik 105 až 107 elektronů z jediného elektrofotonu fotokatody. Vznikající elektrický signál dopadá na anodu, kde je změřen.

27

5.5 5.5.1

Jednotlivé typy přístrojů ABI Prism® Systems

Firma Applied Biosystems (ABI) je předním výrobcem přístrojů pro real-time PCR, protože byla první firmou, která tyto přístroje začala vyrábět. Chemické látky používané v souvislosti s těmito přístroji jsou TaqMan a SYBR Green a této skutečnosti je přizpůsoben i instalovaný software [Bustin 2004]. ABI 7300 Jedná se o přístroj s halogenovou žárovkou, jedním excitačním a čtyřmi emisními filtry a CCD kamerou. Jeho velikost je 34 x 45 x 49 cm (š x h x v) a hmotnost je 29 kg. Používá se mikrotitrační destička s 96 jamkami o objemu 0,2 ml [Bustin 2004]. ABI 7500 Je mnohem pokročilejší přístroj nežli ABI 7300. Jako zdroj excitačního záření rovněž používá halogenovou žárovku, ale místo jednoho má pět excitačních filtrů, což se odráží na větší citlivosti a přesnosti přístroje. Emisních filtrů je také pět a jako detektor se opět používá CCD kamera [Bustin 2004]. ABI Prism® 7900 Je to poslední vysoce výkonný amplifikační a detekční systém určený pro real-time PCR s 384 jamkovou mikrotitrační destičkou. Je možno s ním zpracovat více než 5 000 vzorků denně. Používá laseru jako zdroje excitačního záření, jako detekčního zařízení spektrograf a chlazenou CCD kameru [Bustin 2004]. 5.5.2

Roche Applied Science

LightCycler™ LightCycler je jeden z nejrychlejších, vzduchem ohřívaných termocyklerů se zabudovaným mikroobjemovým fluorimetrem pro detekci a kvantifikaci amplifikovaných produktů vznikajících během PCR. Amplifikované produkty se hromadí ve skleněných kapilárách a jejich detekce se provádí pomocí fluorescenčního dsDNA vázajícího se barviva nebo fluorescenční sondy. Citlivost a přesnost tohoto přístroje není nižší na úkor rychlosti, ale je srovnatelná s ABI 7700. Přístroj může pracovat s 32 vzorky umístěnými v kruhovém karuselu, který se otáčí kolem modré LED diody a světlo mířící ke špičce kapiláry je filtrováno. Fluorescenční záření emitované vzorkem prochází dichroickým zrcadlem a dopadá na tři fotodetekční diody s třemi pásovými filtry (530 nm, 640 nm a 710 nm). Fluorescenční přírůstek je sledován v intervalech

28

10 – 100 ms a data jsou shromažďována jednou za cyklus, průběžně nebo postupně podle stanovených teplotních intervalů [Bustin 2004]. LightCycler® 2.0 Tento přístroj je nejnovější qPCR zařízení od firmy Roche a vychází z původního LightCycler návrhu. Oproti němu však toto zařízení umožňuje sledování emise fluorescenčního záření pomocí šestikanálového fotometru při šesti různých vlnových délkách (530 nm, 555 nm, 610 nm, 640 nm, 670 nm a 705 nm). Signály se z jednotlivých detekčních kanálů přenášejí do fotohybridu ke konečnému vyhodnocení. Objem kapilár je přizpůsoben požadavkům dnešní doby a je tedy možné použít vzorky o objemu 20 µl a 100 µl. Obvyklý amplifikační cyklus trvá pouze 30 až 60 s, takže celý rozbor trvá méně než 45 minut [Roche, i].

Obrázek 4: Light Cycler®2.0, převzato z http://www.roche-diagnostics.cz/download/mol/analyzatory/LightCycler_2.0%20IVD_CZ_low-res.pdf

6

VYUŽITÍ METODY PCR Tato molekulárně biologická metoda má široké použití v různých vědních disciplí-

nách, kde se pracuje se vzorky DNA nebo RNA. Nejedná se tedy pouze o biologii a lékařství, ale také archeologii, trestní právo, ekologii a další.

29

6.1

Archeologie

Archeologové využívají PCR různými způsoby při zkoumání svých objevů. Přitom využívají toho, že i několik tisíc let stará DNA stále plní svou funkci a lze ji použít pro identifikaci. Zkoumáním DNA desetitisíců kousků dva tisíce let starých pergamenových svitků pocházejících od Mrtvého moře vneslo do archeologického bádání nový impuls. Pomocí PCR lze určit příbuznost jednotlivých zvířat – koz a gazel, z jejichž kůží byly pergameny vyrobeny, a tak je postupem času složit. Analýzou čtyř tisíc let starých nástěnných jeskynních maleb v Texasu, vědci zjistili, že tyto malby neměly pouze dekorativní, ale i náboženský a kouzelný (magický) charakter. Tehdejší lidé při jejich vytváření používali bizoní krev, která byla v této oblasti velmi vzácná a lidé pro jejích získání museli daleko putovat [Powledge 2004]. 6.2 6.2.1

Biologie Moderní systematika

Pomocí DNA lze také zkoumat vývojové vztahy a to nejen ze staré, ale i z DNA jedinců žijících v dnešní době. Systematičtí biologové pomocí PCR zjišťují rozdíly mezi sekvencemi DNA mezi příbuznými druhů a mezi hlavními třídami, a jestli se vybrané sekvence změnily během evoluce. Rychlost a mechanismus tohoto procesu umožňuje vědcům jednoduše srovnávat desítky až stovky jedinců, což dává jejich závěrům pevnější základ. Příkladem je pták Moa z Nového Zélandu, který byl donedávna považován za příbuzného ptáka kiwi či zebra kvaga dříve zástupce afrických koní. Zkoumáním její kůže bylo prokázáno, že je více příbuzná zebrám nežli koňům. Mezi další zkoumaná zvířata patří mamut severní, jehož ostatky byly nalezeny na Sibiři. Vědci shromažďují genetické informace z nejmenších zbytků plachých, vzácných zvířat – moči, výkalů, nepatrných kousků srsti nebo odřené kůže. Mimoto, že tyto informace pomáhají ke klasifikaci živočichů, mohou být použity k určení velikosti populace na určitém místě nebo k určení zeměpisné oblasti pohybu jednotlivého zvířete či celé skupiny. Metoda může být přizpůsobena podobným studiím prováděných u rostlin, pro analýzu charakteru rozptylu semen a úspěchu jejich rozmnožení u zvláštních druhů rostlin. Do okruhu zájmu biologů však nepatří pouze zvířata a rostliny, ale také lidé. Studují se vztahy mezi skupinami lidí již vyhynulých druhů či se určuje původní obyvatelstvo, sleduje stěhování národů v průběhu dějin. Analýzy DNA se používá při studiu egyptských mumií a identifikaci ruských carů [Powledge 2004]. 30

6.2.2

Zoologie - chování zvířat

Vzhledem k tomu, že PCR nevyžaduje vzorky krve ani jiných tkání získaných přímo z živých zvířat, vědci nemusí bezprostředně narušovat jejich život. To umožňuje studium jejich chování v přirozeném prostředí. Zkoumáním DNA získané například z výkalů paviána anubi vědcům umožňuje zkoumat jejich sexuální život a určit, kteří samci jsou ve skutečnosti úspěšní při plození potomků [Powledge 2004]. 6.2.3

Ekologické studie

Metodu lze také použít při potírání ilegálního obchodu s ohroženými druhy a s věcmi z nich vyrobených. Vzhledem k tomu, že PCR je relativně levná, je možné ji použít k těmto účelům i v rozvojových zemích. Je to rovněž nástroj pro sledování geneticky modifikovaných organismů uvolněných do prostředí [Powledge 2004]. 6.3 6.3.1

Biomedicínské aplikace Klonování genů

Metody PCR se používá k amplifikaci určitého genu, jež má specifické vlastnosti, jednoho organismu, který je poté vložen do jiného organismu (například plazmidu). Tento gen je včleněn do DNA tohoto organismu. Organismům s takto upravenou DNA se říká geneticky upravené organismy (GMO). Exprese daného genu probíhá v mnoha těchto organismech, což má za následek vznik velkého množství proteinu, který se dále používá například při výrobě léků nebo enzymů. 6.3.2

Určování otcovství

Genetická příbuznost mezi rodičem a dítětem nebo sourozenci může být určen dvěma či více genetickými znaky, které jsou pro tyto jedince společné. Používají se specifické primery, random nonamery, které se váží na specifické lokusy. 6.3.3

Zjišťování virových a bakteriálních nemocí

V těchto případech se zjišťuje přítomnost genetického materiálu, který se u zdravého jedince nevyskytuje, pomocí metody PCR lze detekovat cizorodou DNA či RNA již ve velmi malých koncentracích, kdy běžně prováděné testy žádnou infekci neodhalily. Cizorodý genetický materiál může pocházet z bakterií a virů. AIDS (syndrom získaného selhání imunity) Je způsoben virem HIV, který patří mezi obalené RNA lentiviry. Hladinu viru v periferní krvi lze stanovit měřením HIV antigenu p24 v séru, kvantitativní kultivací HIV z plazmy, přímým měřením virové RNA v plazmě použitím metod ampli31

fikace nukleové kyseliny nebo technologiemi amplifikace signálu. Antigen p24 je hlavním proteinem jádra HIV a v séru se vyskytuje buď volně nebo ve vazbě na protilátku proti p24. Citlivost testů na p24 se sice zvyšuje, ale i tak zůstává tento virový protein u většiny asymptomatických pacientů nezjistitelný. PCR se používá k detekci malého množství buněk infikovaných virem HIV. Díky tomu může být virus HIV detekován dříve, již během několika prvních týdnů po infikaci, než použitím standardního testu ELISA [Powledge 2004]. Jiné testy používají PCR ve spojení s klinickými daty a dalšími laboratorními markery k určování klinické terapie pacientů infikovaných HIV. Pomocí těchto testů lze posuzovat pacientovu diagnózu stanovením výchozí hladiny RNA HIV nebo sledovat účinky antiretrovironé terapie stanovením změn koncentrací RNA HIV v průběhu terapie. K provedení testů se používá periferní krev nebo krevní plazma [Roche, h]. TBC (tuberkulosa) Chronické infekční onemocnění způsobené bakteriemi Mycobacterium tuberculosis (MTB), které jsou nejdůležitějším mykobakteriálním patogenem člověka. Z důvodu hrozícího rizika rozšíření nemoci a nebezpečí vzniku rezistentních kmenů je rychlá diagnostika přítomnosti MTB komplexu nesmírně důležitá. Podmínkou konečné diagnózy TBC je izolace MTB komplexu z organismu. Rutinní kultivace jsou časově náročné (8 týdnů). Mikroskopické vyšetření MTB tyček je nejrychlejší metodou detekce, avšak jedná se o metodu málo senzitivní a nespecifickou. Imunologické a sérologické metody mají omezené využití, a to obecně z důvodu nízké citlivosti a specifity. Analýza mykových kyselin pomocí HPLC je užitečnou doplňkovou metodou ke kultivačním a biochemickým testům. Vývoj testů založených na metodě PCR a určených k detekci mykobakterií významně zlepšil rychlou diagnostiku TBC tím, že byla umožněna jejich přímá detekce v klinických vzorcích. Používá se sekvence asi 584 nukleotidů z vysoce konzervativní oblasti genu kódujícího 16S rRNA. Jako klinických vzorků se používá vzorků získaných z lidských dýchacích cest a to ze sputa, z bronchiálního výplachu a z bronchoalveolární laváže [Roche, f]. Virová meningitida Je infekční, nehnisavý zánět mozkových blan (plen) způsobený viry (čeleď Flaviridae – klíšťová encefalitida a Herpes simplex 1 a 2 – herpetická encefalitida)

32

Na rozdíl od hnisavé meningitidy (jejím původem jsou bakterie) obvykle neohrožuje život, ale zanechává řadu trvalých následků, které vznikají v důsledku trvalého poškození nervového systému [Powledge 2004]. Hepatitida – viry hepatitidy B a C patří mezi onkoviry. • hepatitida B (HBV)

Jeden z několika celosvětově rozšířených virů, které způsobují virovou hepatitidu. Chroničtí přenašeči tohoto viru jsou vystaveni riziku vzniku chronické hepatitidy, cirhózy jater a hepatocelulárního karcinomu. Schopnost detekce DNA HBV má prognostickou hodnotu s ohledem na výsledek akutní i chronické HBV. Metody PCR se v tomto případě nepoužívá přímo k detekci viru, ale ve spojení s klinickým nálezem a dalšími laboratorními markery se používá jako pomůcka k posouzení odezvy viru na antivirovou terapii, kdy se měří jeho koncentrace v séru nebo krevní plazmě. K detekci se využívá sekvence o délce 104 nukleotidů předjádrového/jádrového regionu HBV genomu [Roche, c]. • hepatitida C (HCV)

V souvislosti s tímto virem se hovoří o virové pandemii, která je daleko většího rázu než infekce virem HIV. Diagnostika pomocí imunoserologických testů se opírá o fakt, že imunitní systém lidí nakažených HCV produkuje protilátky, na které jsou tyto testy specifické. Přítomnost protilátek je sice ukazatelem expozice HCV, ale neznamená, že člověk byl v době testování infikován. Dalším ukazatelem je hladina ALT. Jedná se ovšem o hrubý indikátor, který není přímou mírou přítomnosti virů v krvi, protože hladina ALT může být zvýšena při celé řadě jiných příčin zánětu jater. Přímá detekce metodami kultivace virů není doposud k dispozici. Metody PCR se používá ke stanovení HCV v krevním séru nebo plazmě a používá se ve spojení s klinickými nálezy a dalšími laboratorními markery jako pomůcka k posouzení virové odezvy na antivirovou terapii měřením změn koncentrace RNA, která se určuje jako sekvence 244 nukleotidù ve vysoce konzervovaném 5'-UTR genomu HCV. Nepřítomnost detekovatelné RNA HCV v séru po léčbě bývá spojena s ústupem poškození jater, poklesem hepatické fibrózy a nízkou pravděpodobností recidivy HCV. PCR se rovněž používá při testech, které určují konkrétní genotyp HCV. Podle zjištěného genotypu se určuje druh léčby. Tyto testy se provádějí u pacientů s potvrzenou pozitivitou na chronickou infekci HCV [Roche, d].

33

Zánět středního ucha Je zánětlivé onemocnění způsobené bakteriemi Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella, Branhamella.

PCR umožňuje detekci bakteriální DNA v endo a peri-lymfě středního ucha, která upozorňuje na aktivní infekci, i když standardní kultivační metody přítomnost bakterií neprokázaly [Powledge 2004]. Lymská borelióza Bolestivý kloubní zánět způsobený spirochétou Borrelia burgdorferi, která se na člověka přenáší zejména klíšťaty. Obvykle se diagnostikuje na základě symptomů jako je zarudnutí kůže kolem kousnutí klíštěte, horečka, bolesti svalů či únava. Pomocí PCR lze zjistit přítomnost DNA bakterie způsobující onemocnění v kloubním mazu, a tím zajistit rychlou léčku, která může zabránit závažným komplikacím [Powledge 2004]. Sexuálně přenosné nemoci • cytomegalovirus (CMV)

Tento virus patří do početné skupiny herpesvirů a je jedním z původců mononukleosy. Standardní laboratorní metody diagnostiky rozšířené infekce a onemocnění organismu zahrnuje izolaci viru kultivací z leukocytů periferní krve, histologii bioptických nálezů, sérologické metody a měření antigenu pp65. Analýzy kultur však vykazují nedostatečnou prediktivní hodnotu, vyžadují čas 48 hodin až 3 týdny a zejména u imunologicky oslabených pacientů mají jen omezené použití. Analýza antigenu pp65 je velmi pracná, vyžaduje zpracování do 6 hodin od odběru krve a nelze ji provést u všech pacientů. Daleko vhodnější je použití metody PCR na detekci DNA CMV, kdy se zjišťuje přítomnost 362 nukleotidů dlouhé sekvence nacházející se v aminohranicích DNA polymerasového genu CMV přímo v krevní plazmě. Testů využívajících PCR se ovšem nepoužívá jen k diagnostice přítomnosti CMV, ale slouží také jako pomocný prostředek při hodnocení odezvy na antivirovou léčbu měřením změny hladiny RNA CMV [Roche, b]. • Chlamydia trachomatis (CT)

Vyvolává onemocnění děložního čípku, zánětlivá onemocnění ledvinové pánvičky, zánět očních spojivek u dětí, dětskou pneumonii, zánět močové trubice, zánětlivé onemocnění nadvarlete a zánět sliznice konečníku.

34

K detekci CT v klinických vzorcích se používá přímé Giemsovo barvení, zjišťování přítomnosti shluků chlamydiálních inkluzí fluorescenčním barvením protilátek, přímou detekcí antigenu měřením fluorescence obarvených protilátek a sond nukleových kyselin. Kultivace je sice vysoce specifická, ale v běžné klinické praxi není stoprocentně citlivá, a proto se u vzorků, které byly při kultivaci vyhodnoceny jako negativní, používají násobné nekultivační testy. Nekultivační zkušební testy zjišťují přítomnost proteinů nebo nukleových kyselin infekčních organismů. Vzhledem k tomu, že se nejedná o metody stoprocentně specifické, doporučuje se ověření přítomnosti antigenu nebo nukleové kyseliny CT některou další metodou. Pro provedení identifikaci metodou PCR se používá části kryptického plazmidu (sekvence o délce zhruba 207 nukleotidů), který je izolován z buněk získaných z moči žen i mužů nebo z poševního výtěru u žen [Roche, e]. • Neisseria gonorrhoeae (NG)

Jedná se o původce kapavky. Onemocnění postihuje muže i ženy a je doprovázeno záněty a hnisavými výtoky. Stanovení diagnózy je založeno na zjištění přítomnosti NG v kultuře a následném morfologickém vyšetření, které zjišťuje přítomnost cytochromoxidasy. Jiné testy potvrzující správnost diagnózy NG jsou založeny na spotřebě sacharidů, aglutinaci, fluorescencí obarvených DNA sond. Pro provedení PCR se provádí odběr vzorků moči mužů i žen, výtěr močové trubice u mužů in vitro a výtěr děložního krčku u žen. Detekuje se v nich přítomnost nukleových kyselin, kdy se jako vzoru používá vysoce konzervativní část genomu NG [Roche, g]. 6.3.4

Zjišťování dědičných chorob a mutací

Zjišťování dědičných chorob daného genomu je zdlouhavý a těžký proces. Použitím PCR může být zkrácen, protože lze zjišťovat pouze mutace určitých podezřelých genů a není nutné zkoumat celý genom. Příkladem takové dědičné choroby může být dystrofie svalová Duchennova. Jedná se o monogenně podmíněnou chorobu s X-chromozomovou recesivní dědičností vyznačující se progresivním ochabováním svalů, která postihuje chlapce. Základem je geneticky pozměněný protein dystrofin, který je kódován genem DYS, jedním z nejdelších známých genů [Rosypal 2001]. Velikost genu znemožňuje jeho celé prozkoumání najednou a jeho mutace se zjišťuje pomocí multiplex PCR. Pro amplifikaci je použito 9 různých primerů avšak všechny amplifi-

35

kace probíhají v jedné zkumavce a ve stejnou dobu. Následná elektroforéza produktů odhalí u nemocných jedinců nižší počet produktů [Bloom ]. 6.3.5

Onkologická diagnostika

6.3.5.1 Onkologická onemocnění způsobená viry a bakteriemi lidský papillomavirus (HPV) Infekce HPV je hlavní příčinou karcinomu děložního krčku a jeho prekursoru, intraepitelární neoplazie děložního krčku (CIN). Existuje více než 100 genotypů HPV a zhruba 40 z nich je schopných infikace člověka. HVP je malý virus s neobalenou dsDNA a geonomem o zhruba 8000 nukleotidech, který obsahuje otevřené čtecí rámce (open reading frame, ORF) pro časné geny, pozdní geny a nekódující oblast.

Obrázek 5: HPV 16 - linearizované schéma

Časné geny (early, E) kódují regulační genomu, převzato z http://www.baclesse.fr/ proteiny uplatňující se při transkripci a translaci cours/fondamentale/7-carcino-virale/Virale-6. virového genomu (E1, E2, E4) a onkogenní htm transformaci buňky (E6, E7). Gen E6 kóduje jeden ze dvou hlavních onkoproteinů HPV. Jeho onkogenní účinek spočívá v E6-AP zprostředkované vazbě na protein p53. Tato vazba označí p53 pro degradaci ubikvitinovou cestou a tím způsobí ztrátu kontroly buněčné proliferace a destabilizaci genomu. Gen E7 kóduje druhý důležitý onkoprotein. Tento protein interaguje s dalším regulátorem buněčné proliferace, nefosforylovanou formu proteinu retinoblastoma (pRb) a jeho příbuzných proteinů p107 a p130. Tato interakce má za následek přeskočení Sfáze buněčného cyklu a ztrátu kontroly proliferace. Dále se pE7 podílí na indukci DNA syntézy, transaktivaci některých buněčných i virových promotorů a schopnost interakce s junproteiny (c-jun, jun-B), která ovlivňuje maligní transformaci buňky. Pozdní geny (late, L), které kódují majoritní a minoritní kapsidový protein (L1, L2). L1 gen kóduje kapsidový protein a je zodpovědný za vazbu na buňku a tvorbu struktury virionu. Je vysoce sekvenčně konzervativní, a proto se používá pro porovnání jednotlivých typů a variant papillomavirů. L2 gen kóduje protein odpovídající za vazbu virové DNA při syntéze virionu. V nekódující oblasti (long kontrol region, LCR) se nacházejí regulační sekvence.

36

Podle onkologického potenciálu se HPV dělí na vysoce rizikové typy (high risk, HR): HPV – 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 69 a další a nízce rizikové typy (low risk, LR): HPV – 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 70, 74 a další. HPV – 16 a 18 jsou hlavními původci karcinomu děložního krčku, rakoviny vulvy, nádorů hlavy a krku, análního karcinomu a karcinomu penisu. Při zjišťování přítomnosti HPV v klinických vzorcích pomocí PCR jsou amplifikovány nukleotidové sekvence regionu L1, E1, E6 nebo E7. Obvykle se používají primery cílené do oblasti L1 genu, který je relativně sekvenčně konzervovaný a tedy spolehlivě využitelný pro typizaci. Podle druhu testovaného materiálu a možného poškození DNA volíme primery amplifikující kratší nebo delší oblast [Bioptická laboratoř; Roche, a]. název primeru

gen

CPI/IIG MPCR

E1 E6 E7 L1 L1 L1 L1

CP 65/70 CP 66/69 A 6/8 FAP 59/64

délka amplikonu (bp) 188 144 – 601 81, 82 466 388 265 478

název primeru

gen

FAP 6085/6319 GP 5+/6+ GP 5+/6+ BIO MY 09/11; HMB 01 PGMY 09/11 SPF

L1 L1 L1 L1 L1 L1

délka amplikonu (bp) 235 140 – 150 150 450 450 65

Tabulka 3: Typy primerů pro PCR detekci HPV, převzato z http://www.biopticka.cz/sluzby/molekularni-genetika/diagnostika-HPV.html a http://www.papillomavirus.cz/diagnostika_metody.html, [Lamarcq 2002] a upraveno

Helicobacter pyroli Helicobacter pyroli je významným lidským patogenem, který je zdrojem onemocnění

žaludku a dvanáctníku. Tato bakterie způsobuje vředy trávicího traktu (dvanáctníku a žaludku) a záněty žaludku a je spojována se vznikem rakoviny těchto dvou orgánů. Klinické projevy nakažení se projevují desítky let po infikaci a u takto postižených lidí se může za tu dobu rozvinout zánět žaludku, vředy, druh lymfomu vázaný na sliznici a žaludeční atrofie s nebo bez střevní metaplazie [Czinn 2005]. Rozbory prováděné v dnešní době založené na PCR metodě zjišťují přítomnost DNA H. pyroli pomocí několika určitých genů, a to cagA, ureC, vacA a iceA. CagA gen kóduje

protein o molekulární hmotnosti od 120 do 140 kDa, která závisí na počtu vnitřních repetic genu. Tento protein je spojován s produkcí cytotoxinu a se zvýšeným rizikem vzniku vředů trávicího traktu, atrofického zánětu žaludku a rakoviny žaludku [Lage 1995, Vaira 2002]. Další využití PCR je zjišťování bodových mutací spojovaných s fenotypovou rezistencí protilátek H. pyroli. Příkladem je bodová mutace smyčky genu 23S rRNA, kdy A je nahra-

37

zeno G v nukleotidové pozici 2143 [A2143G] nebo 2144 [A2144G][Matsumura 2001]. Když jsou objeveny specifické mutace spojené s rezistencí, je mutantní sekvence detekována pomocí PCR využívající primerů určených přímo pro tuto mutantní sekvenci [Vaira 2002]. Citlivost detekce PCR metody se pohybuje v rozmezí 10 až 100 bakterií. 6.3.5.2 Vyhledávání dědičných onemocnění Onkogen RET Příkladem mutace vedoucí k onemocnění je změna protoonkogenu v onkogen. Protoonkogeny jsou strukturní geny, které kódují proteiny podílející se funkčně na regulaci dělení buněk a jejich diferenciaci. Jejich přítomnost v buňce je jednou z hlavních podmínek normálního růstu, dělení a regulované diferenciace. Onkogen je varianta protoonkogenu vyvolávající neoplastickou transformaci buňky a vzniká přeměnou protoonkogenu. Tento proces je označován jako aktivace protoonkogenu. Protoonkogen a onkogen jsou vlastně dvě alelické formy téhož strukturního genu, přičemž onkogen vystupuje jako alela dominantní. Příkladem dědičného onkogenu je onkogen RET. Zodpovídá za: • familiální medulární karcinom štítné žlázy (FMTC) • mnohočetné endokrinní neoplazie (MEN), které se vyskytují jako MEN 2A a MEN 2B

novotvary/abnormality FMTC MEN 2A MEN 2B medulární karcinom + + + hyperplazie C-buněk + + + feochromocytom – + + hyperplazie paratyreoidey – + – pagagangliom (ganglioneurom) – – + abnormality v kostře – – + abnormality v očích – – + Tabulka 4: Klinické formy FMTC, MEN 2A, a MEN 2B, převzato z [Rosypal, 2000]

medulární karcinom – nádor štítné žlázy z parafolikulárních buněk, které produkují kalcitocin feochromocytom – nádor dřeně nadledvin, který produkuje velké množství adrenalinu a noradrenalinu hyperplazie paratyreoidey – hyperplazie příštítného tělíska, žlázy produkující parathormon, který zvyšuje obsah vápníku v krvi pagagangliom – orgán nervového původu, který se nachází v oblasti sympatických nervových pletení (oblast břišní aorty)

38

RET-protoonkogen

je

lokalizován

v lokusu

10q11.

Kóduje

receptor

s tyrozinproteinkinasovou aktivitou a exprimuje se v různých tkáních (štítná žláza, nervová tkáň, nadledvinky). Jeho mutace vede ke vzniku onkogenu kódujícímu protein se změněnou primární strukturou. Mimo familiálních dědičných nádorů, u nichž lze mutační změnu dokázat v kmenových buňkách, se vyskytují rovněž somatické mutace ve sporadicky nedědičných klinických formách MTC, a to ve stejných místech jako u familiálních dědičných nádorů. Aktivace RET-protoonkogenu probíhá buď mutacemi (bodové mutace, dalece) nebo chromozomovými translokacemi [Rosypal 2000]. Dědičné nádory prsu a vaječníků Mezi hlavní původce dědičné formy nádorů prsu a vaječníků patří mutace genů BRCA1 a BRCA2 (breast cancer, rakovina prsu). Tento dědičný syndrom může být rovněž způsoben mutacemi genů MSH1, MSH2, p53, PTEN nebo STK11. BRCA1 a BRCA2 geny se nacházejí na nepohlavních chromozomech v lokusech 17q21 (BRCA1) a 13q12.3 (BRCA2) [OMIM Gene map], a proto je pravděpodobnost jejich dědičnosti 50%. Jsou součástí všech tělních buněk. Kontrolují buněčné dělení a opravy chyb v genetickém materiálu. Při mutacích genu BRCA1 se nádory objevují již v mladém věku a kromě nádorů prsu a vaječníků je zvýšené riziko vzniku nádorů tlustého střeva u žen i mužů a nádorů prostaty u mužů. U mutací genu BRCA2 se zvyšuje riziko vzniku nádorů slinivky břišní, žaludku, žlučových cest, tlustého střeva, prostaty, melanomu a u mužů se může objevit nádor prsu [Foretová 2002]. Metoda PCR se používá při zjišťování přítomnosti mutací těchto dvou genů u potenciálních nositelů [Chan 1999]. Při pozitivním výsledku následují další vyšetření, která pacienty rozdělí na přenašeče a nemocné. název primeru gen délka amplikonu 185delAG BRCA1 335 – 354 5382insC BRCA1 271 – 295 6174delT BRCA2 151 – 171 Tabulka 5: Primery používané při detekci mutací BRCA1 a BRCA2, převzato z [Chan 1999]

6.3.5.3 Zjišťování zbytkové nemoci u pacientů s rakovinou I po ukončení léčby jsou lidé s rakovinou nadále sledováni na přítomnost rakovinných buněk. Metoda PCR se používá pro stanovení minimálních množství rakovinných buněk, které se u těchto pacientů mohou znovu objevit. Což umožňuje včasné zahájení léčby.

39

Chronická myeloidní leukémie (CML) CML je WHO definována jako myeloproliferační onemocnění, které vzniká z abnormálně pluripotenčních kmenových buněk kostní dřeně a je spojena s chromozomem Philadelphia (Ph, chromozom 22), který je kratší než normální chromozom 22, a BCR-ABL fuzním genem. Hlavní charakteristikou tohoto onemocnění je translokace t(9;22)(q34;q11), kdy nastávají nejprve zlomy těchto chromozomů (9 a 22) a následuje výměna takto vzniklých částí. Zlom na chromozomu 9 přeruší gen ABL (Abelson, dle objevitele tohoto genu) v lokusu a2 a dochází k mutaci tohoto genu. Zlom Obrázek 6: Vznik Philadelphia chromozochromozomu 22 zahrnuje gen BCR (breakpoint clus- mu, převzato z http://users.rcn.com/jkimter region) a vzniká v lokusech b2 nebo b3. Tyto ball.ma.ultranet/BiologyPages/T/Trans_9_2 translokace se označují jako B2A2 a B3A2 [Child

2.gif a upraveno

1998]. Ke vzniku BCR-ABL fuzního genu dochází přemístěním zmutovaného genu ABL na konec zlomeného chromozomu 22, kde se spojí se zbylou částí genu BCR. Část chromozomu 22, která vznikla jeho zlomením, se váže na chromozom 9 [The Leukemia and Lymphoma Society]. Nově vzniklý BCR-ABL gen je funkční a jeho produktem je zmutovaný protein, který má funkci enzymu tyrosin-kinasy. Délka proteinu je ovlivněna místem zlomu BCR a pohybuje se v rozmezí 190 až 230 kDa.. Tento zmutovaný protein je delší nežli protein, který je produktem normálního ABL genu a není tedy funkční při regulaci buněčného růstu a leukemické přeměně hematopoetických kmenových buněk [Bagg 2002; The Leukemia and Lymphoma Society]. Tyrosin-kinasa je druh protein-kinas, který přenáší fosfátovou skupinu z ATP na tyrosinových zbytcích proteinu. Fosforylace proteinů kinasami jak se tomuto ději říká, je důležitým mechanismem přenosu signálu při regulaci enzymové aktivity. Tato translokace chromozomových částí se vyskytuje pouze v kmenových buňkách a krvinkách vznikajících z těchto kmenových buněk. Chromozomy buněk ostatních tkání postiženy nejsou. CML je onemocnění dělící se do 3 fází: • chronická fáze – diagnostika nemoci spadá téměř u všech pacientů do této fáze. Kromě ab-

normálních buněk vznikají rovněž normální krevní buňky a příznaky jsou tudíž nepatrné.

40

• intenzivní a blastická fáze – dochází ke zvýšení počtu bílých a nezralých krvinek v krvi.

V blastické fázi dochází k přechodu do akutní leukémie [The Leukemia and Lymphoma Society]. Detekce CML je nutná ke včasnému zahájení léčby, která se odvíjí od fáze, ve které se pacient nachází. K tomu je nutné používat rychlých citlivých metod, které by se měly doplnit cytogenetickou analýzou na pozitivní Ph chromozom (BCR-ABL pozitivní buňky). Příkladem takové metody je karyotypová analýza preparátů kostní dřeně, ovšem v dnešní době se jako její alternativa nebo doplněk začínají stále častěji používat metody molekulární biologie a to zejména PCR, dále FISH a Southern blotting [Tchirkov 1998]. PCR se používá pro detekci množství transkriptu BCR-ABL genu v krvi, dále k určení úbytku BCR-ABL pozitivních buněk po léčbě a k měření, zda BCR-ABL pozitivních buněk nepřibývá během období po ukončení léčby. Zbytkové BCR-ABL pozitivní buňky jsou detekovány pomocí amplifikace mRNA s BCR-ABL fuzním genem [Elmaagacli 1999]. Metodou PCR lze detekovat 1 BCR-ABL pozitivní buňku z 500 000 normálních. Malé procento pacientů s klinickým projevem CML nemusí mít cytogeneticky stanovitelný Ph chromozom, ale jsou pozitivní na BCR-přesmyk na chromozomu 22[The Leukemia and Lymphoma Society]. Akutní myeloidní leukémie (AML) Zhoubné buňky u AML jsou označovány jako myeloblasty, což jsou nevyvinuté bílé krvinky. Při normální krvetvorbě jsou myeloblasty nezralými prekursory myeloidních bílých krvinek, které postupně zrají do zralých bílých krvinek. U AML se v myeloblastu hromadí genetické změny, které nedovolí buňce dozrát a zabraňují její diferenciaci. I když mutace sama není příčinou leukémie, toto zastavení diferenciace ve spojení s dalšími mutacemi způsobujícími přerušení proliferace má za následek nekontrolovaný vznik nezralých buněk, což je podstatou AML. Druhy chromozomálních abnormalit jsou významné při diagnostice AML: • t(8;21)(q22;q22) – tato translokace vzniká mezi genem ETO chromozomu 8, u kterého do-

chází ke zlomu na 5‘-konci tohoto genu, a AML1 chromozomu 21, který je zlomen mezi pátým a šestým exonem AML1 genu. Vzniká fuzní gen ETO-AML1 jehož produkt má funkci transkripčního faktoru a zůstává mu schopnost rozpoznat vazebné místo pro AML1, což má negativní vliv na normální AML1, protože fuzní protein je dominantním kompetitorem. AML1 je aktivátor mnoha hematopoetických genů. Fuzní protein přebírá jeho funkci regulátoru transkripce těchto genů [Huret]. 41

• inv(16)(p13;q22) – tato genetická mutace vzniká pouze

na jediném chromozomu 16, kdy se vymění gen MYH11 z p13 a gen CBFβ z q22. Ke zlomům dochází u MYH11 v intronu A a u CBFβ v intronu číslo 5. Produkt takto vzniklého fuzního genu CBFβ-MYH11 je transkripčním faktorem, který snižuje množství aktivní CBF (transkripčním faktor) a konkuruje jí při regulaci transkripce.

Genetické

mutace

způsobené

t(16;16)(p13;q22) nebo del(16)(q22) mají shodné důsledky jako inv(16)(p13;q22) [Huret]. • t(15;17)(q22;q21)

–

translokací

genu

PML Obrázek 7: inv(16) , převzato z chromozomu 15 a genu RARα chromozomu 17 vzniká http://www.slh.wisc.edu/cytogenetics/ fuzní gen PML-RARα. Ke zlomům chromozomů cases/oct1998/karyo.php dochází v případě PML mezi intronem 3 a exonem 7a a u genu RARα v intronu 2. Produktem fuzního genu je abnormální receptor na vitamín A s dominantním vlivem na RARα a působí tak proti růstu a diferenciaci buněk.

• +8, +21, +22, del(7q), del(9q), -5, -7, del(5q), abnormální 3q – tyto genetické mutace se

vyskytují spolu s t(8;14), inv(16) nebo t(15;17) a při diagnostice AML nejsou významné. • neobvyklé genetické poruchy jako jsou Fanconiho anémie, Schwachman-Diamondův syn-

drom či Downův syndrom jsou spojeny s vyšším rizikem vzniku AML Většina rozdílů vychází z faktu, že k leukemické přeměně může dojít při různých krocích v průběhu diferenciace. Klasifikace AML je dvojího druhu, a to FAB (Francouzsko-americko-britská) a podle WHO, které je v dnešní době upřednostňováno:

42

FAB označení typ buňky M0 myeloblastický myeloblastický, M1 bez mutace myeloblastický, M2 s mutací M3 promyelotický M4 myelomonocytický M5 monocytický M6 erytroleukémie M7 megakaryocytický

WHO označení AML s chromozomálními abnormalitami AML s multirodovou dysplasií

popis

změna myelodyspastického syndromu (MDS) nebo myeloproliferačního onemocnění v AML

AML a MDS, therapy-related

vznik AML nebo MDS po chemoterapie nebo ozařování

AML bez zařazení

typy nespadající do žádné předcházející kategorie

t(8;21), inv(16), t(15;17)

Tabulka 6: Klasifikace AML podle FAB a WHO, převzato z http://clovek12.blogspot.com/2006_ 09_01_archive.html a [Vardiman 2002]

Vzhledem ke vzniku leukemických buněk dochází u pacientů k neutropenii (snížení počtu granulocytů v krvi), anémii a trombocytopenii (nedostatek krevních destiček v periferní krvi). Ve vzácných případech může u pacientů dojít ke vzniku chloromy (vzácná forma akutní blastické leukémie s tvorbou nádorů pod okosticí, jež obsahují zelenavý pigment). PCR se stala nezbytným nástrojem při detekci a sledování zbytkové AML. Kvantitativní PCR se používá k určení prahových úrovní AML buněk těsně po přerušení léčby a k pozdějšímu sledování jejich koncentrace, stejně tak jako ke zjišťování vzniku recidivy [Jaeger, Kainz 2003]. Přesný počet AML buněk slouží k individuálnímu přístupu při léčbě a tím ke zvýšení pravděpodobnosti vyléčení každého pacienta. Pro sledování MRD se využívají produkty fuzních genů vznikajících translokacemi. U t(8;21) je produktem ETO-AML1, u inv(16) CBFβ-MYH11 a u t(15;17) PML-RARα [Sperr 2005]. Ke sledování v období po ukončení léčby se k přípravě vzorků používá kostní dřeň a periferní krev, v nichž se určuje množství produktů fuzních genů (chromozomové translokace, inverze, dalece) na úrovni RNA. Akutní lymfoblastická leukémie (ALL) ALL je rakovina bílých krvinek. Je charakteristická zvýšenou tvorbou a neustálým množením lymfoblastů v kostní dřeni, které znemožňují fungování normálním krvinkám. Dále bráněním vzniku normálních buněk kostní dřeně, což vede k nedostatku červených krvinek, krevních destiček a normálních bílých krvinek (zvláště neutrofilních granulocytů) v krvi. Onemocnění se rychle šíří krví do životně důležitých orgánů, a proto je nutná jeho rychlá léčba.

43

Chromozomální změny zapříčiňující vznik nemoci: • t(9;22)(q34;q11) – jedná se o translokaci mezi chromozomem 9 a 22, při které vzniká Phila-

delphia chromozom a BCR-ABL fuzní gen. V případě ALL se vyskytuje kromě translokací B2A2 a B3A2 také translokace E1A2, která vzniká zlomem BCR v lokusu e1. BCR-ABL fuzní geny s velkou BCR oblastí jsou přepisovány do chimerní 8,5 kb mRNA a vytváří p210 protein, zatímco fuzní geny s malou BCR oblastí jsou přepisovány do chimerní 7,0 kb mRNA a vytvářejí p190 protein. Oba fuzní proteiny vykazují neřízenou tyrosin-kinasovou aktivitu [Child 1998; Levitt 1996]. • t(8;14)(q24;q32) – při této translokaci je cmyc protoonkogen přemístěn z chromozomu

8 na konstantní oblast těžkého řetězce, což se projeví narušenou regulací c-myc genu a tím zvýšeným rizikem zhoubné přeměny buněk.

Obrázek

8:

t

(8;14)(q24;q32),

převzato

z

Translokacemi s obdobným účinkem jsou http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPa t(2;8)(p12;q24) a t(8;22)(q24;q11). Zde ovšem ges/T/Trans_8_14.gif a upraveno c-myc zůstává na chromozomu 8 a části genů κ (chromozom 2) nebo λ (chromozom 22) lehkého řetězce jsou přemístěny do oblasti lokusu c-myc [Levitt 1996]. • t(4;11)(q21;q23) – produktem fuzního genu vznikajícího translokací genu AF4

z chromozomu 4 a genu HRX (MLL) z chromozomu 11 je gen MLL-AF4, který vystupuje jako na DNA vázající se transkripční faktor, který může postupně narušit regulaci dalších genů [Child 1998; Levitt 1996]. • t(1;19)(q23;p13) – touto translokací vzniká fuzní gen E2A-PBX obsahující sekvenci z E2A

genu chromozomu 19 a gen PBX pro homeobox chromozomu 1. Fuzní protein E2A-PBX, transkripční faktor, vznikající transkripcí tohoto genu ovlivňuje regulaci transkripce a hraje roli při vzniku leukémie. Tento typ translokace je spojen také s t(11;19)(q23;13), t(9;11)(p22;q23) [Child 1998; Levitt 1996]. • t(12;21)(p12;q22) – nejběžnější genetická abnormalita u ALL. Vzniká fuzní gen skládající

se z TEL genu chromozomu 12 a AML1 genu chromozomu 21 [Child 1998]. • 9p-,12p- – při výskytu těchto delecí se zvyšuje riziko přítomnosti tumor-supresorových ge-

nů, ale ještě nebyly v těchto lokusech zjištěny [Child 1998].

44

• hyperdiploidie – v tomto případě mají buňky mezi 47 a 57 chromozomy, méně častý je po-

čet chromozomů blízký triploidii (58 – 80 chromozomů) a tetraploidii (83 – 103 chromozomů) [Child 1998]. • hypodiploidie – v případě, že některý z chromozomů chybí, jedná se o hypodiploidii (35 –

45 chromozomů), velmi vzácný je počet blížící se haploidii, tedy menší než 27 [Child 1998]. • TAL1delece – jedná se o deleci na dlouhém raménku chromozomu 1. Gen TAL1 se dostává

pod kontrolu promotoru genu SCL. Následuje nadměrná exprese transkripčního faktoru TAL1 [Child 1998]. V dnešní době existují dva druhy klasifikace různých druhů ALL. První z nich je podle FAB a vychází z morfologického rozdělení buněk. Pochází ze 70. let 20. století a předcházelo detailnímu pochopení lymfatické imunofenotypové analýzy. druh ALL typ buněk L1 malé uniformní lymfoblasty L2 větší pleomorfní lymfoblasty L3 buňky podobné buňkám Burkittova lymfomu Tabulka 7: Klasifikace ALL podle FAB, převzato z [Levitt 1996]

WHO doporučuje používání nové klasifikace (její shrnutí je v následující tabulce i s příslušnou charakteristikou jednotlivých typů). Rozdělení na základě morfologických znaků nemá klinickou ani prognostickou souvislost.

klasifikace ranné pre-B CALLA-negativní CALLA-pozitivní pre-B buňky B-buňky pre-T buňky T-buňky

CD faktory a buněčné markery CD19 CD10 (CALLA) CD20 CytIg SurfIg TdT + + + + CD7 + +

– + +/– +/– CD5 + +

CD2 +/– +/–

– +/– + + CD1 – +

– – + – CD4 – +

– – – + CD8 – +

+ + + – TdT + +

Tabulka 8: Klasifikace ALL podle WHO, převzato z [Levitt 1996]

U části dětských a většiny dospělých pacientů s ALL se po ukončení léčby objeví recidiva. Rozpoznání těchto pacientů před klinickou recidivou pomocí důkazu zbytkové nemoci může v budoucnosti umožnit, aby se jim dostala efektivnější léčba, bez toho aniž by ostatní pacienti museli podstoupit další chemoterapii. Pokud by blastické buňky měly být zjišťovány 45

morfologicky nebo imunofenotypovou analýzou, pacient by měl poměrně značné nádorové zatížení a příznaky recidivy by byly pravděpodobně nevyhnutelné.Tradiční morfologické metody detekce minimální residuální leukémie nejsou na detekci leukemických buněk představujících 2 – 5% buněk kostní dřeně dostatečně citlivé. Imunofenotypová analýza, DNA průtoková cytometrie a cytogenetika mají také omezenou citlivost a přesnost pro tuto detekci. ALL vznikající chromozomálními aberacemi jsou charakteristické svými fuzními geny. Po reverzní transkripci do cDNA mohou být transkripty těchto fuzních genů použity jako cíle pro MRD-PCR analýzu. U t(9;22) se jedná o produkt BCR-ABL fuzního genu a tedy protein tyrosin-kinasu, u t(4;11) o MLL-AF4, u t(1;19) o E2A-PBX a u t(12;21) o TELAML1[van der Velden 2004]. Při t(8;14) se uplatňuje detekce genu c-myc, která je spojena s těžkým řetězcem imunoglobulinu, kdy je citlivost metody zvýšena sekvenční analýzou PCR produktu ze vzorku a přípravou specifických oligonukleotidových sond pro každého pacienta [Child 1998]. TAL1delece jsou detekovány na úrovni mRNA pomocí RT-PCR analýzy produktu fuzního genu SIL-TAL1 [van der Velden 2004]. Hodgkinův lymfom (HD) Hodgkinův lymfom je onemocnění postihující lymfatický systém, které jako první popsal Thomas Hodgkin v roce 1832. Toto onemocnění bylo po 170 let nazýváno Hodgkinova nemoc a její název byl oficiálně změněn na Hodgkinův lymfom, když bylo prokázáno, že rakovina má původ v lymfocytech. Onemocnění se odlišuje od ostatních druhů lymfomů přítomností abnormálních lymfatických buněk známých jako Reed-Sternberg buňky (pojmenované po svých objevitelích, RS). Tyto buňky jsou schopné vylučováním cytokinů nebo jiných buněčných mechanismů stimulovat reakce zahrnující lymfatické buňky, makrofágy, granulocyty a pojivovou tkáň [Child 1998]. Chromozomální aberace u tohoto onemocnění nejsou časté, ale lze zjistit del(1p), dup(1q), del(6q), del(7) a změny na chromozomu 4 (4q25 – 28). Dále lze detekovat aneuploidie, diploidie, triploidie, tetraploidie (65 – 80 chromozomů) a hyperploidie (chromozomy 1, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 17) a časté jsou také trisomie různých chromozomů. V některých případech se mohou objevit t(2;5)(p23;q53) a t(14;18)(q32;q21), ale nelze je považovat za charakteristické translokace pro HD [Atkin 1999]. Onemocnění se rozděluje podle Rye klasifikace (název je odvozen od místa konference, kde byla tato klasifikace poprvé představena) do 2 základních typů: • nodulární Hodgkinův lymfom s lymfocytární predomonancí (LPNHD)

46

RS buňky mají laločnaté, zvrásněné jádro s malým jadérkem. Dále jsou přítomny velké jednojaderné B-buňky a T-lymfocyty. Je pro něj charakteristické zvětšení krčních mízních uzlin, někdy také v podpaží. Může docházet k pronikání do sleziny nebo kostní dřeně. • klasický Hodgkinův lymfom (HD)

Rozděluje se na 2 podtypy: nodulární skleróza (NS) a smíšená buněčnost (MC). Normální RS buňky, které mají průměr lymfocytu s velkým množstvím cytoplazmy a mají dvojlaločnatá jádra se symetrickými jadérky, se vyskytují u MC HD. RS buňky s lakunami jejichž velikost je podobná, ale objevuje se smršťování cytoplazmy a je v nich více dvoj- a mnoholaločnatých jader a malých jadérek, nacházíme u NS HD. Další buňky, které se zde vyskytují, jsou B- a T-lymfocyty, mikrofágy a eosinofilní granulocyty. Tento typ zahrnuje nejčastěji se vyskytující druhy Hodgkinova lymfomu. Diagnostika této nemoci je hlavně založena na lékařské prohlídce, která zahrnuje vyšetření prováděné počítačovou tomografií a magnetickou rezonancí břicha [Child 1998]. Podle řady studií je recidiva HD často spojena s přítomností viru Epstein-Barrové. PCR se zde používá k detekci virové DNA v RS buňkách. Zjišťuje se přítomnost opakující se 110 bp genomové sekvence BamHI oblasti [Lauritzen 1994].

7

ZÁVĚR Uvedená bakalářská práce poukazuje na to, že techniky PCR jsou důležité pro dia-

gnostiku mnoha nemocí, v popředí se zjišťováním zbytkové nemoci u leukemických pacientů. Tato technika se dynamicky rozvíjí, a to i přes počáteční problémy s navrhováním primerů, které byly vyřešeny s příchodem výpočetní techniky a softwarů, a přístrojovým vybavením, které je již v dnešní době velmi kvalitní a cenově dostupné. Zařadila se mezi klasické metody molekulární biologie a stala se nedílnou součástí klinické praxe. Vědci předpokládají, že pomocí této techniky bude v budoucnu možné provádět predispoziční testy na dědičné nemoci, jako jsou srdeční vady či rakovina a bude tedy možné jim předcházet. Získané poznatky budou dále uplatněny při zpracování diplomové práce, která bude realizována na pracovišti Centra analýzy biomedicínského obrazu, ILBIT 3A, Kamenice 3, Brno.

47

8

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

1. Atkin, N. B. (1999): Hodgkin's disease. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. http://AtlasGeneticsOncology.org/Anomalies/HodgkinID2068.html

2. Bagg, A. (2002): A minimalistic view of post-therapeutic monitoring in chronic myeloid leukemia. Journal of Molecular Diagnostic; 4 (1): 1 – 10

3. Bioptická laboratoř: Klinická diagnostika – Lidské papillomaviry (Human papillomaviruses, HPV). http://www.biopticka.cz/sluzby/molekularni-genetika/diagnostika-HPV. html

4. Bloom, M. V.: Polymerase chain reaction. DNA Learning center, Cold Spring Harbor, New York; http://www.accessexcellence.org/RC/CT/polymerase_chain_ reaction.html 5. Bustin, S. A. (2004): A-Z of quantitative PCR. International University Line; 5: 4-29, 141 – 432 6. Chan, P. C. R, et al. (1999): Simple and rapid detectionof BRCA1 and BRCA2 mutations by multiplex mutagenically separated PCR. Clinical Chemistry; 45 (8): 1286

7. Child, J.A., Jack A. S., Morgan, G. J., Jack, A. S., Morgan, G. J. (1998): The lymphoproliferative disorders: Handbook of diagnosis, investigation and management. Chap-

man & Hall; 1: 125 – 182 8. Czinn, S. J. (2005): Helicobacter pyroli infection: Detection, investigation, and management. J Pediatr; 146: S21 – S26

9. Elmaagacli, A. E., et al. (1999): The risk of residual molecular and cytogenetic disease in patients with Philadelphia–chromosome positive first chronic phase chronic myelogenous leukemia is reduced after transplantation of allogeneic peripheral blood stem cells compared with bone marrow. Blood, 94: 384 – 386

10. Foretová, L. (2002): Rizikové faktory – Dědičnost nádorů. Masarykův onkologický ústav; http://www.prevencenadoru.cz/ 11. Huret, J-L.: Atlas of genetic and cytogenetic in oncology and haematology. http://atlasgeneticsoncology.org/

12. Jaeger, U., Kainz, B. (2003): Monitoring minimal residual disease in AML: the right time for real time. Annals of Hematology; 82 (3): 139 – 147

13. Konrad, M.: A (short) history of PCR. http://www.scienceisart.com/A_PCR/PCR history_2. html

48

14. Lage, A. P., et al. (1995): Diagnostic of Helicobacter pyroli infection by PCR: Comparison with other invasive technique and detection of cagA gene in gastric biopsy specimens. Journal of Clinical Microbiology; 33 (10): 2752 – 2756

15. Lamarcq, L., et al. (2002): Measurements of Human Papillomavirus Transcripts by Real Time Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction in Samples Collected for Cervical Cancer Screening. Journal of Molecular Diagnostic; 4 (2):

98 – 99 16. Lauritzen, A. U., Hording, U., Nielsen, H. W. (1994): Epstein-Barr virus and Hodgkin’s disease: a comparative immunological, in situ hybridization, and polymerase chain reaction study. Acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica;

102 (7): 495 17. Levitt, L., Lin, R. (1996): Biology and treatment of adult acute lymphoblastic leukemia. West J Med; 164 (2): 143-155

18. Matsumura, M., et al. (2001): Detection of mutation in the 23S rRNA gene of Helicobacter pyroli that cnfers resistence to Clarithromycin treatment to the bacterium.

Journal of Clinical Microbiology; 39 (2): 691 19. OMIM Gene Map; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/getmap.cgi 20. Powledge, T. M. (2004): The polymerase chain reaction. Advances in Physiology Education 28: 44 – 50 21. Rice, G. (2006): Polymerase chain reaction: (PCR). Montana State University http://serc.carleton.edu/15924

22. Roche, a: Amplicor® Human Papilloma Virus (HPV) Test. http://www.rochediagnostics.cz/download/mol/virologicke/hpv/AMPLICOR%20Human%20Papilloma%20 Virus%20(HPV)%20Test.pdf

23. Roche, b: COBAS AMPLICOR CMV MONITOR™ Test. http://www.rochediagnostics.cz/download/mol/virologicke/cmv/Cobas%20Amplicor%20CMV%20Monitor %20Test.pdf

24. Roche,

c:

COBAS

AMPLICOR

HBV

MONITOR

Test.

http://www.roche-

diagnostics.cz/download/mol/virologicke/hbv/COBAS%20AMPLICOR%20HBV%20 MONITORTest.pdf

25. Roche, d: COBAS

AMPLICOR™

Hepatitis

C

Virus

Test,

version

2.0.

http://www.roche-diagnostics.cz/download/mol/virologicke/hcv/CCOBAS%20AMPLI COR%20Hepatitis%20C%20Virus%20Test%20verze%202.0.pdf

49

26. Roche, e: COBAS AMPLICOR™ Chlamydia trachomatis Test. http://www.rochediagnostics.cz/download/mol/mikrobiologicke/ct_ng/Cobas%20Amplicor%20Chlamydia %20Trachomatis%20Test.pdf

27. Roche, f: COBAS AMPLICOR™ Mycobacterium tuberculosis Test. http://www. rochediagnostics.cz/download/mol/mikrobiologicke/mtb/COBAS%20AMPLICOR% 20Mycobacterium%20Tuberculosis%20(MTB).pdf

28. Roche, g: COBAS AMPLICOR™ Neisseria gonorrhoeae Test. http://www.rochediagnostics.cz/download/mol/mikrobiologicke/ct_ng/Cobas%20Amplicor%20Neisseria% 20Gonorrhoeae%20Test.pdf

29. Roche, h: COBAS® TaqMan HIV-1 Test. http://www.roche-diagnostics.cz/download/ mol/virologicke/hiv/COBAS%20TaqMan%20HIV-1%20Monitor%20Test.pdf

30. Roche, i: LightCycler. http://www.roche-diagnostics.cz/download/mol/analyzatory/Light Cycler_2.0%20IVD_CZ_low-res.pdf

31. Rosypal, S., et al. (2001): Terminologie molekulární biologie. Brno; 1: 39 32. Rosypal, S. (2000): Úvod do molekulární biologie, díl třetí. Brno; 827, 837 - 838 33. Sharrer, T. (2006): Mr. Cycle: An “automated“ PCR prototype. The Scientist; 20 (12): 92 34. Smithsonian Videohistory Collection (2004): The history of PCR (RU 9577). Smithsonian Institution http://siarchives.si.edu/research/videohistory_catalog9577. html 35. Sperr, W. R., et al (2005): Quantification of minimal residual disease in acute myeloid leukemia by tryptase monitoring identifies a group of patients with a high risk of relapse. Clin Cancer Res; 11 (18): 6537

36. The Leukemia and Lymphoma Society: About CML. http://cml.leukemia-lymphoma.org/ CMLApp/Controller?action=loadContent&itemid=191240&ln=2

37. Tchirkov, A., et al. (1998): Interphase cytogenetics and competitive RT–PCR for residua disease monitoring in patients with chronic myeloid leukaemia during interferon-α therapy. British Journal of Hematology; 101: 552-557

38. Vaira, D., et al. (2002): Review article: diagnosis of Helicobacter pyroli infection. Aliment Pharmacol Ther; 16 (1): 18 39. Vardiman, J. W., Harris, N. L., Brunning, R. D. (2002): TheWorld Health Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasms. Blood; 100 (7): 2293

40. van der Velden, V. H. J., et al (2004): Detection of minimal residual disease in acute leukemia. J Biol Regul Homeost Agents; 18: 148

50