Welkom in de wereld van de
Legionella kweek
Simon in ‘t Veld Teammanager Microbiologie Vitens Laboratorium
Inhoud • Historie • Invloed toepassing diverse technieken
• Legionella in praktijk • Ontwikkelingen ISO norm Legionella
Legionella • • • •
1976 1977 1978 1979
Philidelphia Legionella geïsoleerd Legionella gekweekt Genus Legionella
• • • • •
> 50 Legionella species 21 pathogeen 70% Legionella pneumophila SG1 20%-30% Legionella pneumophila SG 2-16 5%-10% Legionella non pneumophila
Legionella in Nederland • 1977 eerste patient Leiden • 1981 6 patienten AMC • 1991 Bonte Wever Slagharen
Legionella in Nederland • • • • •
1977 1981 1991 1999 2006
eerste patient Leiden 6 patienten AMC Bonte Wever Slagharen Bovenkarspel Westfriese Flora Koeltoren Amsterdam
Wetgeving • 2001 Tijdelijke regeling legionellapreventie • 2004 AI-32 Legionellapreventie voor industriële watersystemen • 2004 Waterleidingbesluit • 2007 Registratie van koeltorens • 2011 Regeling Legionella preventie
Meldingen Legionella pneumonie 1998-2013
Bron: RIVM Jaarrapportage Surveillance Respiratoire Infectieziekten 2013
Invloed toepassing diverse technieken
Ontwikkeling diverse media • 1978 Mueller Hinton Agar + toevoegingen • 1978 FG medium (L-cysteine en ijzerpyrofosfaat) • 1979 CYE medium (actieve kool en gistextract) • 1979 CYE+antibiotica (Polymixine en Vancomycine) • 1980 BCYE (ACES buffer) • 1981 WY (CYE+antibiotica + glycine) • 1981 BMPα (CYE + mix antibiotica+ α-ketoglutaraat) • 1982 MWY (WY+AB+kleurstoffen+α-ketoglutaraat) • 1984 GVPC (WY + antibiotica + α-ketoglutaraat) • 1984? BCYE+ab
Ontwikkeling diverse media • 1978 Mueller Hinton Agar + toevoegingen • 1978 FG medium (L-cysteine en ijzerpyrofosfaat) • 1979 CYE medium (actieve kool en gistextract) • 1979 CYE+antibiotica (Polymixine en Vancomycine) • 1980 BCYE (ACES buffer) • 1981 WY (CYE+antibiotica + glycine) • 1981 BMPα (CYE + mix antibiotica+ α-ketoglutaraat) • 1982 MWY (WY+AB+kleurstoffen+α-ketoglutaraat) • 1984 GVPC (WY + antibiotica + α-ketoglutaraat) • 1984? BCYE+ab
Normen wereldwijd • ISO 11731: 1998 • ISO 11731-2: 2008 • T90-431:2003 (Frankrijk) • AZ/NZS 3896: 2008 (Australie/Nieuw Zeeland) • Standard Methods (USA) • NEN 6265:2007
Score ringonderzoek (1) Koloniegetal 22 °C
Score ringonderzoek (2) Koloniegetal 37 °C
Score ringonderzoek (3) Coliformen
Score ringonderzoek (4) Enterococcen
Score ringonderzoek (5) Clostridium perfringens
Score ringonderzoek (6) Legionella pneumophila
Recovery Legionella spp diverse media (1) • Legionella pneumophila BCYE
BCYE
BMPα
GVPC
MWY
non-selective
+selective
(Oxoid SR111)
(Oxoid SR152
(Oxoid SR118)
kve/l
(=NEN) %
%
%
%
L. pneumophila
100 ± 6
107 ± 6
79 ± 11
86 ± 5
serogroup 1
100 ± 17
105 ± 19
75 ± 3 69 ± 8
95 ± 4
80 ± 12
L. pneumophila
100 ± 25
90 ± 18
73 ± 10
75 ± 8
86 ± 18
serogroup 3
100 ± 20
103 ± 14
88 ± 13
81 ± 28
71 ± 18
L. pneumophila
100 ± 20
110 ± 4
92 ± 20
66 ± 21
76 ± 3
serogroup 6
100 ± 17
99 ± 12
64 ± 18
74 ± 15
64 ± 23
Recovery Legionella spp diverse media (2) • Legionella non-pneumophila BCYE
BCYE
BMPα
GVPC
MWY
non-selective
+selective
(Oxoid SR111)
(Oxoid SR152
(Oxoid SR118)
kve/l
(=NEN) %
%
%
%
90 ± 6 92 ± 15 88 ± 6
111 ± 7 98 ± 9
serogroup 1
100 ± 25
111 ± 5
88 ± 10
52 ± 10 47 ± 8 52 ± 6 77 ± 2
60 ± 9 45 ± 8
L. longbeachae
100 ± 9 100 ± 9 100 ± 8
L. longbeachae
100 ± 16
99 ± 15
54 ± 9
94 ± 7
95 ± 11
serogroup 2
100 ± 20
130 ± 6
122 ± 10
79 ± 17
114 ± 20
L. anisa
100 ± 5 100 ± 12
91 ± 10 91 ± 5
88 ± 9 113 ± 6
117 ± 15 114 ± 12
125 ± 7
100 ± 3 100 ± 7 100 ± 3
7± 3 66 ± 7 0 0
101 ± 8 87 ± 13 95 ± 14
123 ± 1 81 ± 4
L. bozemanii
100 ±
8
99 ± 18
87 ± 7
88 ± 14
serogroup 1
100 ± 19
101 ± 15
100 ± 8
122 ± 7
serogroup 2
100 ± 14
112 ± 28
51 ± 16 119 ± 14 72 ± 26
106 ± 5
L. bozemanii
0 0 0 2± 2 0 0 0 0
9 6 9 8 7
79 ± 4
100 ± 9 100 ± 20 100 ± 16
78 ± 71 ± 35 ± 40 ± 77 ±
L. dumoffii
L. gormanii L. jordanis L. micdadei
71 ± 6
96 ± 3
70 ± 5 91 ± 11
90 ± 2
54 ± 8 49 ± 3 94 ± 12
98 ± 11
107 ± 10 119 ± 9
Nederland vs Duitsland Vitens
NLGA
• Jan2006 – Dec 2008
•
Jan2006-July2009
• 15 % Legionella positief
•
28 % Legionella positief
• 20% Legionella pneumophila
•
89 % Legionella pneumophila
• 80% Legionella species
•
11 % Legionella species
Oorzaak verschillen opbrengst (1)
Onbehandeld Hitte (30 min 50 °C) Zuur (5 min pH2) MWY 88 89 91 103 87 95 93
MWY 100 78 101 121 123 109 88
MWY 85 99 104 94 97 104 90
Oorzaak verschillen opbrengst (2)
Onbehandeld Hitte (30 min 50 °C) Zuur (5 min pH2) Filter zuur (5 min pH2) MWY 88 89 91 103 87 95 93
MWY 100 78 101 121 123 109 88
MWY 85 99 104 94 97 104 90
MWY 1 1 5 3 8 0 2
Oorzaak verschillen opbrengst (3)
Onbehandeld Hitte (30 min 50 °C) Zuur (5 min pH2) Filter zuur (5 min pH2) Filter onbehandeld MWY 88 89 91 103 87 95 93
MWY 100 78 101 121 123 109 88
MWY 85 99 104 94 97 104 90
MWY 1 1 5 3 8 0 2
MWY 1 2 2 8 7 4 11
Cellulose Nitrate membraan filters, 0,45µm
L. L. anisa pneumophila
L. bozemanii
L. longbeachae
Lab 1
19
0
29
0
Lab 2
69
7
1
0
Lab 3
53
0
41
2
Tuffryn membraan filters, 0,45µm
L. pneumophila
L. anisa
L. bozemanii
L. longbeachae
Lab 1
NB
833
59
61
Lab 2
91
100
90
118
Lab 3
125
130
101
204
Legionella in de praktijk
% Positieve monsters Vitens lab Drinkwater 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013
% Positieve monsters Vitens lab Proceswater 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013
% monsters Niet Te Bepalen 5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
drinkwater
2,5
proceswater 2,0
1,5
1,0
0,5
0,0 2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013
Verdeling Legionella spp drinkwater 0,3 0,1 1,5 2,1 5,8
NON_PN SG2_14
4,0
SG1 NON_SG_1
NON_SG2_14 SG1_SG2_14
86,2
NONPN_SG1_SG2_14
Verdeling Legionella spp proceswater 7
NON_PN
3
SG2_14
10
39
SG1 NON_SG_1
8
NON_SG2_14 SG1_SG2_14
15
NONPN_SG1_SG2_14
18
Soorten Legionella species • • • • • • • • • •
Legionella anisa Legionella gormanii Legionella feeleii Legionella dumoffi Legionella erythra Legionella micdadei Legionella maceachernii Legionella rubrilucens Legionella faurnensis Legionella jamestowniensis
Ontwikkelingen
Ontwikkeling ISO standaard • Integreren beide normen • Onderzoek QC voor membraanfilters • Centrifugatietechniek; moeilijk filtreerbare monsters • Hitte/zuurbehandeling combineren • Introductie BCYE+ab en MWY • “Keuze” in werkwijze
Ontwikkeling ISO standaard • “Schoon” water – Monster direct opbrengen – Directe membraanfiltratie – Membraanfiltratie – “aftrillen” – concentraat opbrengen • “Vervuild” water – Membraanfiltratie – “aftrillen” – concentraat opbrengen – Verdunnen
