ANALYTISCH-CHEMISCHE METHODEN BIJ HET BEPALEN VAN HENRY CONSTANTEN, SEDIMENT/WATER VERDELINGSCOEFFICIENTEN EN DESORPTIEKINETIEK VOOR PAKs Werkdocument nr. 95.04IX
RIZA Hoofdafdeling Watersystemen Auteurs: H. van den Heuvel en D. ten Hulscher Lelystad, maart 1995
SAMENVATTING In dit werkdocument zijn de analytisch-chemische methoden beschreven welke kunnen worden gebruikt bij het bepalen van Henry constanten, sediment/water verdelingscoefficienten en desorptiekinetiek van polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAKs). De hier gepresenteerde resultaten hebben betrekking op naftaleen, bifenyl, 2-methylnaftaleen, fluoreen, fenantreen, anthraceen, fluorantheen, pyreen en chryseen. Er is een literatuuronderzoek verricht naar de mogelijkheden van Hoge Prestatie Vloeistof Chromatografie (HPLC) bij de analyse van PAKs. De HPLC analyse voor PAKs is uitgevoerd m.b.v. fluorescentiedetectie. De golflengten zijn geoptimaliseerd (golflengten met hoogste gevoeligheid gekozen). Na de optimalisatie zijn er detectiegrenzen vastgesteld welke liggen tussen 0.7 en 11.5 ,ug/l extract. Het bereiden van waterige oplossingen met daarin PAKs is op 3 verschillende wijzen uitgevoerd: a) chromosorb coaten met PAKs en vervolgens het chromosorb mengen met water, b) chromosorb coaten met PAKs en vervolgens doorpompen met water en c) PAKs opgelost in methanol toevoegen aan water en mengen. Het is gebleken dat de eerste methode zeer lage concentraties aan PAKs opleverde. De tweede methode leverde voor de hogere PAKs aanvaardbare gehaltes op, echter de lichtere PAKs (naftaleen, bifenyl en 2-methylnaftaleen) werden in deze oplossing niet teruggevonden. Mogelijk is het gebruik van methanol als oplosmiddel in deze bereiding het probleem geweest. Wanneer een waterige oplossing wordt bereid door PAKs in methanol toe te voegen dan levert dat een oplossing op met aanvaardbare gehaltes op voor alle onderzochte PAKs. De invloed van methanol op de Henry constante zal dan echter onderzocht moeten worden. De analyse van PAKs in water is onderzocht. Er zijn extracties uitgevoerd m.b.v. dichloormethaan en hexaan. Gebleken is dat de gemiddelde recovery van de hexaan extractie hoger ligt dan die met dichloormethaan (hexaan: 94% en dichloormethaan: 75%). Omdat de extractie van water met hexaan ook nog gebruikersvriendelijker is, wordt er aanbevolen deze extractie te gaan gebruiken. Het extraheren van PAKs uit sediment is onderzocht door 3 verschillende extractiemethoden uit te voeren en vervolgens met elkaar te vergelijken. De onderzochte methoden waren a) soxhlet extractie met dichloormethaan, b) extractie met aceton en petroleumether en c) reflux extractie met hexaan. De eerste twee extractiemethoden zijn uitgetest met standaard referentie materiaal (SRM 1941). De recoveries waren voor de soxhlet 41-141% en voor de aceton/petroleumether extractie 24-121%. De laatste twee extractiemethoden zijn uitgetest m.b.v. Ketelmeersediment. De gemeten gehalten in dit sediment bleken voor de verschillende methoden gelijk te zijn. Van de hexaan reflux extractie methode is ook een rendementsbepaling uitgevoerd door aan een hoeveelheid water een bekende hoeveelheid teststoffen toe te voegen. Daarna is het mengsel gerefluxed (recovery 73-92%). Vanwege de gebruikersvriendelijkheid en de opbrengsten is uiteindelijk van de hexaan reflux extractie bevonden dat deze het meest geschikt is voor gebruik tijdens desorptieexperimenten. Het bepalen van Henry constanten en sorptieparameters wordt doorgaans uitgevoerd m.b.v. de gas-purge methode. Bij deze methode worden uitgeblazen teststoffen opgevangen op een adsorbens. In dit onderzoek zijn van drie adsorbentia recoveries bepaald. De onderzochte adsorbentia waren C-18, chromosorb en Tenax. Gebleken is dat de recoveries van C-18 voor
de lagere PAKs laag waren. Van een aantal hogere PAKs waren ze zeer hoog (tot 185%). De recovery resultaten van chromosorb waren zeer slecht (gemiddeld 2%), en daarom wordt het gebruik van dit type adsorbens afgeraden. De recoveries van Tenax waren redelijk goed. Ook hier scoorden de lagere PAKs wat aan de lage kant (75%) en waren er bij de hogere PAKs wederom enkele hoge uitschieters (anthraceen, fluorantheen en pyreen; alien >110%). Tevens is het gebleken dat er in bianco Tenax enkele PAKs werden geanalyseerd. Op de analyses van Tenax uit experimenten zal dus een correctie toegepast moeten worden. Algemeen wordt er gesteld dat het gebruik van Tenax tijdens gas-purge experimenten geprefereerd wordt. Daarnaast zal ook het gebruik van C-18 nader uitgezocht worden. Er is vastgesteld dat er tijdens het indampen van monsters geen verliezen van PAKs optreden. Toegevoegde PAKs aan oplosmiddel wat vervolgens werd ingedampt tot circa 1 ml werden voor 90% terug gevonden. Tijdens opwerking van monsters vinden er waarschijnlijk ook geen verliezen plaats door fotochemische afbraak. Van een standaardoplossing, die gedurende een week in het licht werd gezet, bleef de concentratie constant. Dit was ook het geval met een oplossing welke in het donker werd gezet. Er is onderzocht of oplosmiddelen als hexaan en dichloormethaan, welke mogelijk na de indampstap van monsters hierin nog aanwezig is, storen op de HPLC analyse van PAKs. Er blijkt een geringe invloed van deze oplosmiddelen te zijn (max. 7% lagere concentraties voor bifenyl o.i.v. dichloormethaan). Algemeen wordt gesteld dat de analytisch-chemische methoden voor het PAK onderzoek naar vervluchtiging en sorptie voldoende zijn uitgezocht. De grootste problemen doen zich voor bij de lagere PAKs (lage recoveries bij naftaleen, bifenyl en 2-methylnaftaleen) en bij sommige hogere PAKs (onwaarschijnlijk hoge recoveries). De analytisch-chemische methoden die uiteindelijk gekozen zijn zullen middels vervluchtigings- en desorptieexperimenten nader worden geevalueerd.
IMKH DSOPGAVE 1. 2.
INLEIDING METHODEN UIT DE LITERATUUR EN PROBLEEMSTELLING 2.1 Analyse van PAKs m.b.v. HPLC 2.2 Analyse van PAKs in water 2.3 Analyse van PAKs in sediment 2.4 PAK analyse tijdens gas-purge experimenten 2.5 Probleemstelling
1 2 2
3 3 4 4
3.
MATERIALEN EN METHODEN 3.1 Chemicalien en hulpstoffen 3.2 Herkomst onderzochte sedimenten 3.3 Keuze van de onderzochte stoffen 3.4 Voorbehandeling glaswerk 3.5 Onderzoek naar HPLC PAK analyse 3.6 Bereiden van waterige oplossingen 3.7 Bepalen rendement waterextractie 3.8 Bepalen rendement sedimentextractie 3.9 Bepalen rendement adsorbentia 3.10 Aanvullende onderzoeken 3.10.1 Controle op verliezen tijdens indampen 3.10.2 Controle op verliezen door fotochemische afbraak 3.10.3 Invloed van hexaan of dichloormethaan op HPLC analyse
4.
RESULTATEN EN DISCUSSIE 4.1 Analyse van PAKs m.b.v. HPLC 4.2 Bereiden waterige oplossingen 4.3 Rendementen waterextractie 4.4 Rendementen sedimentextractie 4.5 Rendementen adsorbentia 4.6 Verliezen tijdens indampen 4.7 Verliezen door fotochemische afbraak 4.8 Invloed hexaan of dichloormethaan op HPLC analyse
10 10 10 12 12 14 15 15 17
5.
CONCLUSIES EN AANBEVELINGEN
18
6.
LITERATUUR
20
Bijlage Bijlage Bijlage Bijlage Bijlage Bijlage Bijlage Bijlage Bijlage Bijlage Bijlage
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10: 11:
Gebruikte chemicalien en hulpstoffen Structuurformules onderzochte PAKs Instellingen HPLC PAK analyse volgens Wierenga [9] Bereiden van waterige PAK oplossingen Gebruikte methoden voor het extraheren van waterige PAK oplossingen Sedimentextractie met dichloormethaan soxhlet Sedimentextractie met aceton/petroleumether Sedimentextractie met hexaan reflux Chromatogram HPLC analyse PAK calibratieoplossing Chromatogram bianco adsorbentia Invloed hexaan of dichloormethaan op calibratiestandaard
6 6 6 6 7 7 7 7 X 8 9 9 9 9
22 23 24 25 27 28 29 30 31 32 34
1. INLEIDING Polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAKs) zijn microverontreinigingen die de kwaliteit van het oppervlaktewater en de waterbodem (sediment) bedreigen. PAKs worden tijdens verbranding van organisch materiaal bij hoge temperatuur gevormd [1]. Ze worden niet industrieel gevormd maar zijn bij sommige produktieprocessen als niet-bedoelde verontreinigingen of restprodukten aanwezig. Door grootschalig gebruik van bijvoorbeeld creosootolie als houtverduurzamingsmiddel en koolteerpek in de wegenbouw zijn PAKs in het milieu terecht gekomen. Tevens blijkt het verkeer ook nu nog een grote bron van emissies te zijn. Wanneer PAKs eenmaal in het aquatische milieu terecht komen binden ze zich, vanwege het hydrofobe karakter, voornamelijk aan zwevende delen in het oppervlaktewater. Metingen in zwevende stof wat is verzameld in Lobith laten zien dat gehalten aan totaal PAKs rond 8 mg/kg liggen [2]. Gebonden aan het zwevende stof worden ze getransporteerd naar sedimentatiegebieden zoals het Ketelmeer [3]. In deze gebieden kunnen PAKs dan gedurende lange tijd blijven. Het is echter bekend dat PAKs zowel biotisch als abiotisch onder aerobe condities afbreekbaar zijn [4,5]. Deze processen zullen dus voornamelijk in de waterfase een rol spelen. De mate van binding aan sediment bepaalt de hoeveelheid PAKs die zich in de waterfase bevinden. Hierdoor bepaalt de binding dus ook de mate van omzetting in de waterfase. De mate van binding van organische microverontreiningen aan sediment kan worden beschreven m.b.v. een partitiecoefficient. Reeds eerder zijn er bij het RIZA partitiecoefficienten vastgesteld van chloorbenzenen en PCBs [6-8]. Om het beeld van partitie van organische microverontreinigingen completer te maken is onderzoek naar de partitie van PAKs gewenst. De wijze waarop de partitie onderzocht wordt is gelijk aan die waarop chloorbenzenen en PCB's onderzocht zijn namelijk m.b.v. de gas-purge methode. Om gebruik te kunnen maken van de gas-purge methode is het noodzakelijk bekendheid te krijgen over de vervluchtiging van PAKs uit een watersysteem. Dit werkdocument behandelt de optimalisatie van de analytisch-chemische methoden die worden gebruikt bij vervluchtigings- en sorptieexperimenten met PAKs. In dit werkdocument zullen de resultaten worden besproken van een literatuurstudie hoe PAKs kunnen worden geanalyseerd (hoofdstuk 2), welk analytisch-chemisch onderzoek er is uitgevoerd (hoofdstuk 3) en wat de resultaten van dit onderzoek waren (hoofdstuk 4). Aan het eind van het document zullen er conclusies worden getrokken en zullen er aanbevelingen worden gedaan van onderzoek naar partitie van PAKs aan sediment.
2. METHODEN UIT DE LITERATUUR EN PROBLEEMSTELLING Polycyclische aromatische koolwaterstoffen worden doorgaans geanalyseerd m.b.v. Hoge Prestatie Vloeistof Chromatografie (HPLC). De detectie hierbij is meestal fluorescentiedetectie. Bij het gebruik van de gas-purge methode voor het bepalen van partitiecoefficienten zijn een aantal analytisch-chemische methoden nodig, te weten: a) extractie van de uitgangsmateriaal (water en sediment) b) opvangen van de uitgeblazen componenten op een adsorbens c) elueren van het adsorbens om de opgevangen componenten weer in een oplossing te krijgen. In dit hoofdstuk worden optimale golflengten uit de literatuur besproken die gebruikt kunnen worden bij het bepalen van PAKs met fluorescentiedetectie. Tevens worden de verschillende analytisch-chemische methoden die bij de gas-purge methode gebruikt worden besproken. 2.1 Analyse van PAKs m.b.v. HPLC Doorgaans worden PAKs geanalyseerd m.b.v. Hoge Prestatie Vloeistof Chromatografie (HPLC). Daarnaast is het ook mogelijk deze stoffen te analyseren m.b.v. gaschromatografie al dan niet gekoppeld aan een massaspectrometer (GC/MS). Gebleken is dat analyse m.b.v. HPLC het meest hanteerbaar is op dit moment. Daarom is er in het verleden bij het RIZA ook voor gekozen om bij onderzoek naar PAKs, HPLC te gebruiken als analysemethode [9]. Bij voorgaande onderzoeken is er voor gekozen om fluorescentie te gebruiken als detectiemethode. Bij deze methode wordt er gebruik gemaakt voor een excitatie- en een emissiegolflengte. Voor iedere PAK zijn de meest gevoelige golflengten verschillend. Wanneer er gebruik wordt gemaakt van een variabele golflengte fluorescentiedectector, dan is het mogelijk om iedere PAK zo gevoelig mogelijk te kunnen detecteren. Men moet echter altijd rekening blijven houden met de chromatografische aspecten van de analysemethode. Sommige PAKs worden chromatografisch slechts een klein beetje gescheiden. Dit komt er op neer dat er voor sommige PAKs andere golflengten gekozen moeten worden dan de meest optimale. Verandering van golflengte op de piek heeft namelijk nadelige gevolgen voor de vorm van de piek. Wierenga [9] heeft voor de PAK-analyse bij milieuchemie een goede aanzet gemaakt. Van een aantal door hem gemeten PAKs is in tabel 1 vermeld bij welke golflengten ze zijn gemeten. Tabel 1:
Excitatie- en emissiegolflengten van een aantal PAKs (Wierenga [9]).
stofnaam
^ex
^•em
naftaleen fluoreen fenantreen anthraceen fluorantheen pyreen chryseen
230 210 350 350 237 237 277
330 314 368 368 440 440 367
De door hem gebruikte golflengten komen redelijk overeen met die uit de international literatuur [10]. Voor fenantreen en anthraceen wordt er echter een excitatiegolflengte van 250 nm aangeraden omdat deze golflengte een hogere gevoeligheid geeft voor deze stoffen. In het onderhavige onderzoek zijn ook de stoffen bifenyl en 2-methyl-naftaleen onderzocht (motivatie hoofdstuk 3). Er was tot voor kort geen ervaring met deze stoffen v.w.b. de HPLC analyse. Uit de internationale literatuur zijn voor bifenyl drie verschillende golflengteparen (excitatie/emissie) gevonden [11-13]. Deze waren respectievelijk 254/315,245/350 en 258/320 nm. Voor 2-methylnaftaleen is een golflengtepaar gevonden van 290/335 [14]. PAKs worden doorgaans chromatografisch gescheiden m.b.v. HPLC waarbij een mengsel van acetonitril en water als eluens fungeert. 2.2 Analyse van PAKs in water Bij de analyse van PAKs in water is het grondbeginsel dat alle aanwezige PAKs d.m.v. extractie met een organisch oplosmiddel uit de waterfase worden gehaald en hierdoor in de organische fase terecht komen. Daarna wordt de organische fase verder opgewerkt voordat het wordt geanalyseerd. De methoden om PAKs te extraheren uit het water zijn verschillend. De gebruikelijke methode bij het RIZA is een extractie m.b.v. dichloormethaan [15]. Hierbij wordt een ruime hoeveelheid water (doorgaans 500 tot 1000 ml) geextraheerd met dichloormethaan. De dichloormethaan fractie wordt daarna ingedampt waardoor een concentrering van de PAKs ontstaat. Over recoveries van deze extractiemethode wordt niet gesproken. Het gebruik van dichloormethaan komt ook in de internationale literatuur terug [16]. Een extractie met hexaan wordt ook wel gebruikt [17]. Hierbij wordt een continu-extractor gebruikt. Over recoveries van deze methode wordt niets vermeldt. Watermonsters kunnen ook op de conventionele wijze geextraheerd worden met hexaan [18]. Naast allerlei vormen en tussenvormen van vloeistof-vloeistof extractie is het ook mogelijk om PAKs on-line te concentreren en te analyseren [19]. Deze methode vraagt echter hoge eisen aan de gebruikte apparatuur. De onderzoekers vermelden dat ze recoveries hebben bepaald welke liggen tussen 75 en 113 %. 2.3 Analyse van PAKs in sediment Net als bij de analyse van PAKs in water is bij de analyse van deze stoffen in sediment het grondbeginsel dat de in het sediment aanwezige PAKs uit het sediment worden gehaald. Doorgaans worden hier organische oplosmiddelen voor gebruikt. Net als bij de analyse van PAKs in water zijn er voor de analyse van PAKs in sedimentmonsters verschillende technieken in de literatuur beschreven. Bij deze analyse is het uit het sediment extraheren van de PAKs de belangrijkste stap. De gebruikelijke methode bij het RIZA is een soxhlet-extractie met dichloormethaan [20]. Hierbij wordt een hoeveelheid sediment (doorgaans 10 gram) met een ruime hoeveelheid dichloormethaan gedurende 4 uur geextraheerd. Na een clean-up over silicagel worden de PAKs m.b.v. HPLC geanalyseerd. Over recoveries wordt in dit voorschrift niets genoemd. Een refluxextractie met hexaan wordt ook regelmatig gebruikt [18]. Een hoeveelheid sediment wordt met een hoeveelheid hexaan gedurende 1 Vi uur gerefluxed. Er worden recoveries van
nagenoeg 100 % vastgesteld. Andere onderzoekers refluxen met een 2 molair oplossing van KOH in methanol waarna ze vervolgens het mengsel filtreren [16]. Het filtraat wordt geextraheerd met cyclohexaan. Ze vermelden matige tot slechte recoveries (20-76 %). Voor de bepaling van PAKs in grondmonsters wordt o.a. een extractie met aceton beschreven [21]. In dit artikel wordt vermeld dat volgens de onderzoekers aceton een efficienter extractiemiddel is dan tolueen of dichloormethaan. Ze vermelden dat na extractie met aceton het sediment wordt gemengd met een 2 molair KOH oplossing in methanol. Na deze stap wordt de bovenstaande vloeistof vervolgens geextraheerd met hexaan. Ze vermelden dat de recoveries tussen de 75 en 98 % liggen. Als laatste is er nog een methode gevonden hoe PAKs uit grond kunnen worden geextraheerd d.m.v. uitschudden met isopropanol [22]. Deze eenvoudige methode levert volgens de auteur recoveries op van 80 tot 95 %. Duidelijk is geworden dat er veel verschillende methoden te gebruiken zijn voor het bepalen van PAKs in water en sediment. Onderzoek naar verbetering van de PAK analyse in Nederlandse waterbodems loopt nog [23]. 2.4 PAK analyse tijdens gas-purge experimenten Voor het onderzoek naar vervluchtiging, partitiecoefficienten en desorptiekinetiek wordt er bij het RIZA gebruik gemaakt van de zogenaamde gas-purge methode. Bij deze methode worden de te onderzoeken organische microverontreinigingen uit een watersysteem (al dan niet in aanwezigheid van sediment) geblazen en opgevangen op een adsorbens. De opgevangen componenten worden vervolgens van het adsorbens af geelueerd m.b.v. een sterk organisch oplosmiddel. Met deze methode is reeds veel ervaring opgedaan [6,7,8,24]. Voor het bepalen van Henry constanten (maat voor de vervluchtiging) van PAKs is gebruik gemaakt van C-18 als adsorbens [24]. De C-18 is na gebruik in gas-purge experimenten geelueerd met dichloormethaan. De auteurs vermelden dat Tenax, wat gebruikt is voor het zelfde onderzoek maar dan met chloorbenzenen en PCBs, niet bruikbaar is voor onderzoek aan PAKs. Het adsorbens Tenax bevat namelijk fluorescerende componenten die mee geelueerd worden en vervolgens de HPLC analyse storen. Het gebruik van Tenax bij gas-purge experimenten met PAKs is echter niet ongewoon. In de internationale literatuur wordt enkele malen het gebruik van Tenax genoemd [25,26]. De Tenax kolommen worden geelueerd met hexaan [25] en met aceton of methanol en daarna isooctaan [26]. Er wordt ook gebruik gemaakt van een graft et kolom (Carbotrap C) [27]. De kolommen worden, na gebruik in het gas-purge systeem. thermisch gedesorbeerd. De gedesorbeerde componenten worden direct gemeten met gaschromatografie. 2.5 Probleemstelling Binnen het project MIV*STOFEIG wordt onderzoek verricht naar desorptiekinetiek van organische microverontreinigingen. Tot nog toe is dit onderzoek vooral gericht op de desorptiesnelheid van gechloreerde verbindingen: PCB's en chloorbenzenen. In de toekomst zal ook de desorptiesnelheid van PAK's onderzocht gaan worden.
In het onderhavige onderzoek zijn de volgende analytisch-chemische methoden, welke nodig zijn om desorptiekinetiek van PAKs te gaan meten, onderzocht: a) hoe worden de PAKs geanalyseerd en wat zijn de detectiegrenzen van de analyseapparatuur? b) volgens welke methode wordt water geextraheerd en wat zijn de recoveries van deze extractie? c) volgens welke methode wordt sediment geextraheerd en wat zijn de recoveries van deze extractie? d) met welk adsorbens worden de gas-purge experimenten uitgevoerd en wat zijn de recoveries van het elueren van de adsorbens kolommen?
3. MATERIALEN EN HULPSTOFFEN 3.1 Chemicalien en hulpstoffen Voor een lijst van de gebruikte chemicalien en hulpstoffen wordt verwezen naar bijlage 1. 3.2 Herkomst onderzochte sedimenten Tijdens dit onderzoek is er gebruik gemaakt van Ketelmeersediment. De gegevens van dit sediment die bekend zijn, zijn als volgt: x/y coordinaten; x: 179.883 en y:510.847 bemonsteringsdatum: 19/2/1993 bemonsteringsdiepte: 30-60 cm organisch koolstofgehalte: ????? Het sediment is voor gebruik gezeefd over een filter van 500 um. Tijdens dit onderzoek is er tevens voor zover mogelijk gebruik gemaakt van een standaard referentie materiaal (NBS SRM 1941 Marine Sediment [28]). 3.3 Keuze van de onderzochte stoffen Bij de keuze van de onderzochte PAKs zijn een aantal criteria onder de loep genomen, te weten: vluchtigheid hoog genoeg, voorkomen in milieu en analyse/opwerking hanteerbaar. Bovendien wordt het wel of niet verdacht carcinogeen van de stof meegenomen. Uiteindelijk zijn er 7 PAKs gekozen waaraan een gemethyleerde PAK en bifenyl werden toegevoegd. In tabel 2 zijn de criteria voor de keuze van PAKs voor desorptieexperimenten op een rijtje gezet. Tabel 2:
Criteria voor stofkeuze desorptieonderzoek met PAKs
PAK
vluchtigheid
voorkomen
analyse/opwerking
2-me-naftaleen
-
?
-
naftaleen
*
?
+
bifenyl
+
•>
+/-
fluoreen
+/-
~
+
+
chryseen
carcinogeen
ja
anlhraceen
+/-
~
-
fcnantrccn
* / •
-
+
i.i
lluoranthcen
•
-
ja
pyreen
i
+
De structuurformules van de onderzochte PAKs zijn weergegeven in bijlage 2.
3.4 Voorbehandeling glaswerk Al het gebruikte glaswerk is voor gebruik gereinigd met een zeepoplossing. Hierna is het glaswerk grondig gespoeld met gedemineraliseerd water en daarna met aceton om vervolgens gedroogd te worden bij 105 °C in een stoof. Het glaswerk dat is gebruikt bij de sedimentextracties is afhankelijk van het extractieoplosmiddel gespoeld met gedemineraliseerd water, aceton en oplosmiddel (uitgezonderd de refluxextracties met hexaan waarvan het glaswerk enkel is gespoeld met gedemineraliseerd water en aceton). 3.5 Onderzoek naar HPLC PAK analyse De HPLC PAK analyse is opgestart met als grondbeginsel de instellingen welke eerder zijn gerapporteerd door Wierenga [9]. Deze instellingen zijn te vinden in bijlage 3. De instellingen van de gradient elutie zijn tijdens het onderhavige onderzoek gehandhaafd. De instellingen van de fluorescentiedetector zijn onderzocht. De golflengten die in de literatuur zijn gevonden zijn uitgetest [10-14]. Na optimalisatie van de HPLC analyse zijn er detectiegrenzen vastgesteld. Hierbij is een standaard met een bekende concentraties lOx geanalyseerd om de respons te bepalen. Daarna is dezelfde standaard lOx verdund en nog eens lOx maal geanalyseerd om de standaardafwijking in het piekoppervlak te bepalen. Hierna is de detectiegrens berekend volgens formule (1) [29]. MD == 3,29 * waarin
a,n-l
MD f
=
(1) detectiegrens (in jUgT1) standaardafwijking piekoppervlak (area) responsfactor dug*r'/area)
3.6 Bereiden van waterige oplossingen Er zijn op drie verschillende wijzen waterige PAK oplossingen bereid. Uitgangspunt bij het bereiden van de oplossingen is dat het water, waarin de PAKs uiteindelijk worden opgelost, 0,6 gram K2HP04 per 5 liter bevat. Om microbiele afbraak van de PAKs te voorkomen is er 25 mg HgCl2 per 5 liter toegevoegd. De wijzen waarop de oplossingen zijn gemaakt zijn: a) coaten van chromosorb met PAKs en hierna het chromosorb overbrengen naar het water b) toevoegen van PAK in methanol standaarden aan het water c) coaten van chromosorb met PAKs en hierna het chromosorb met het water elueren. Voor een uitgebreide methodenbeschrijving voor het maken van waterige PAK oplossingen wordt verwezen naar bijlage 4 3.7 Bepalen rendement waterextractie Daar er al enige ervaring was opgedaan met de extractie van water m.b.v. dichloormethaan is deze extractiemethode als eerste uitgetest. Daarnaast is er een extractie m.b.v. hexaan uitgetest. Bij het bepalen van de recovery van beide extractiemethoden is er aan water een
bekende hoeveelheid PAKs in acetonitril toegevoegd waarna het water direct is geextraheerd. De gebruikte extractiemethoden staan vermeld in bijlage 5. 3.8 Bepalen rendement sedimentextractie Er zijn drie verschillende sedimentextracties uitgetest te weten: soxhletextractie met dichloormethaan, extractie met aceton/petroleumether en een refluxextractie met hexaan. De soxhletextractie met dichloormethaan is bij het RIZA algemeen in gebruik. Deze methode is voor de toepassing in het desorptieonderzoek enigszins aangepast. De dichloormethaan extractie staat beschreven in bijlage 6. De extractie met aceton en petroleumether wordt algemeen gebruikt voor de analyse van chloorbenzenen en PCBs. De methode staat beschreven in bijlage 7. Met de refluxextractie met hexaan is enige ervaring opgedaan tijdens een sorptie ringtest. Deze methode blijkt voor chloorbenzenen recoveries op te leveren van 90-100 %. Deze methode is in het onderhavige onderzoek getest voor PAKs. De methode staat beschreven in bijlage 8. De extractiemethoden zijn getest met Ketelmeersediment en met het gecertificeerde marine sediment SRM 1941. Van de hexaan reflux extractie is ook getracht een rendement te bepalen. Er is in 4-voud een bekende hoeveelheid PAKs in water gerefluxed met hexaan. De opwerking van de monsters was gelijk aan die beschreven in bijlage 8. Dit is bedoeld om een beeld te krijgen van eventuele verliezen die kunnen optreden tijdens de reflux extractie. 3.9 Bepalen rendement adsorbentia Er zijn in dit onderzoek drie verschillende adsorbentia getest, te weten: C-18, Tenax en Chromosorb. Bij het onderzoek naar het rendement is er telkens een bekende hoeveelheid PAKs in methanol aan de adsorbentia gevoegd. Na een schudperiode van circa 2 uur is de overmaat methanol onder stikstof afgeblazen. Daarna zijn de adsorbentia verder gedroogd bij circa 80 °C in een stoof. Na drogen is ieder adsorbens verdeeld over een aantal kolommen en zijn de kolommen geelueerd met dichloormethaan (C-18). Het extract is ingedampt tot circa 1 ml. De dichloormethaanextracten zijn geschoond d.m.v. een silicagel clean-up stap (zie bijlage 8). Het rendement voor C-18 is ook nog op een andere wijze uitgevoerd: er zijn kolommen gevuld met C-18 waaraan vervolgens bekende hoeveelheden PAKs in methanol aan zijn toegevoegd. De oplossingen zijn bovenop het C-18 aangebracht. Daarna zijn de kolommen geelueerd met dichloormethaan en verder behandeld als eerder is beschreven. Bij het bepalen van het rendement van Tenax en Chromosorb is iedere PAK (in methanol) afzonderlijk aan een hoeveelheid adsorbens toegevoegd. Na schudden is het methanol afgedampt en is er van iedere PAK-adsorbens combinatie 1 kolom afgevuld. De kolommen zijn geelueerd met hexaan. Er is geen clean-up uitgevoerd. Het bepalen van het elutierendement van Tenax is ook nog op twee andere wijzen uitgevoerd, te weten: a) iedere PAK afzonderlijk coaten op Tenax en b) alle onderzochte PAKs coaten op een hoeveelheid Tenax welke na drogen is verdeeld over een aantal kolommen. Bij deze twee bepalingen zijn alle kolommen eerst geelueerd met hexaan tot 10 ml en vervolgens met acetonitril tot wederom 10 ml.
3.10 Aanvullende onderzoeken Om de analytisch-chemisch aspecten van het PAK onderzoek volledig te krijgen zijn er enkele aanvullende onderzoeken gedaan, te weten: controle op verliezen tijdens indampen, controle op verliezen door fotochemische afbraak en invloed van hexaan of dichloormethaan op de HPLC analyse.
3.10.1 Controle op verliezen tijdens indampen Om te controleren of er verliezen optreden tijdens het indampen van de diverse monsters is aan 1 ml van de calibratieoplossing (in acetonitril bereid) 10 ml aceton of dichloormethaan toegevoegd. Hierna is deze oplossing ingedampt tot circa 0,5 ml. Vervolgens is er een circa 5 ml acetonitril toegevoegd waarna het weer is ingedampt tot 1 ml acetonitril. Daarna is het monster geanalyseerd. 3.10.2 Controle op verliezen door fotochemische afbraak Het is van PAKs bekend dat ze fotochemisch afbreekbaar zijn [30]. Om dit te controleren in de toepassing van het onderhavige onderzoek zijn er twee PAK calibratieoplossingen bereid in acetonitril waarvan er een is afgeschermd van het licht d.m.v. aluminiumfolie. De concentratie van de oplossingen is gedurende een week gemeten. 3.10.3 Invloed van hexaan of dichloormethaan op HPLC analyse Tijdens een aantal extractieprocedures wordt er na het indampen van het extractiemiddel (hexaan of dichloormethaan) tot circa 0,5 ml een hoeveelheid acetonitril toegevoegd wat daarna ook weer tot 1 ml wordt ingedampt. Verondersteld wordt dat het extractiemiddel daarna als eerste wordt afgedampt (vanwege een lager kookpunt dan acetonitril) en er zodoende enkel acetonitril overblijft. Wanneer het laatste niet het geval zou zijn, dan is het mogelijk dat het extractiemiddel de PAK analyse op de HPLC kan storen. Om eventuele storing te controleren zijn er calibratiestandaarden in 50 ml maatkolven bereid waaraan bekende hoeveelheden extractiemiddel is toegevoegd (100, 250 en 500 p.1). Deze oplossingen zijn geanalyseerd en vergeleken met een standaard zonder extra toevoegingen. Hierbij is bij de interpretatie gelet op het verschil in gemeten concentratie en het verschil in retentietijd.
4. RESULTATEN EN DISCUSSIE 4.1 Analyse van PAKs m.b.v. HPLC De golflengten voor de fluorescentiedetector zijn geoptimaliseerd. Bij het optimaliseren is het niet altijd mogelijk de meest ideale condities te gaan gebruiken. Bij verandering van excitatieen emissiegolflengte verandert de basislijn ook enigszins. Hier wordt wel op gecorrigeerd. Sommige pieken van de PAKs liggen echter zo dicht bij elkaar dat de basislijn correctie niet optimaal meer werkt. In tabel 2 is de uiteindelijke golflengte voor de fluorescentiedetector weergegeven. De tijd wanneer er wordt overgeschakeld naar andere golflengten is slechts een indicatie. Aan het begin van iedere meetserie wordt middels testruns de tijd van overschakelen indien nodig aangepast. Tabel 2:
Golflengtetabel fluorescentiedetector (HP 1046) tijd (min.)
Kx
Km
stof
0.00
230
330
naftaleen
10.00
210
314
bifenyl 2-methylnaftaleen fluoreen
1 12.75
250
366
fenantreen anthraceen
15.00
237
440
fluorantheen pyreen
18.00
277
367
chryseen
30.00
230
330
-
Na het optimaliseren zijn er detectiegrenzen bepaald. De berekende detectiegrenzen staan vermeld in tabel 3. Met deze detectiegrenzen zal rekening mee moeten worden gehouden op het moment dat er gas-purge experimenten worden uitgevoerd. Er zal voldoende uit geblazen moeten worden om voldoende component op het adsorbens te krijgen wat vervolgens meetbaar moet zijn. Een typisch voorbeeld van een HPLC chromatogram van een standaard is te vinden in bijlage 9. 4.2 Bereiden waterige oplossingen Er zijn op drie verschillende manieren waterige PAK oplossingen bereid (zie 3.6). Het water wat is bereid d.m.v. de 'chromosorb-roer-methode' is geextraheerd met dichloormethaan. Het water wat is ontstaan m.b.v. de 'methanol-methode' en m.b.v. het doorpompen van chromosorb kolommen is geextraheerd met hexaan. De gehaltes aan PAKs in de diverse oplossingen staan vermeld in tabel 4. 10
Tabel 3:
Detectiegrenzen HPLC PAK analyse (HP 1050) in ug/1.
stofnaam
f (ug*l Varea)
o-n-i (area)
MD (ug/1)
naftaleen
2.36688
0.57787
4.5
bifenyl
1.90144
0.52380
3.3
2-methylnaftaleen
1.20646
0.74257
2.9
fluoreen
0.33303
1.27674
1.4
fenantreen
0.38424
0.88122
1.1
anthraceen
0.29991
0.75661
0.7
fluorantheen
0.86088
0.83618
2.4
pyreen
3.24071
1.07961
11.5
chryseen
2.29541
0.22407
1.7
Tabel 4:
Gehaltes aan PAKs in waterige oplossingen (in ug/1).
stofnaam
chromosorb-roermethode
methanol-methode
chromosorbdoorpomp-memode
naftaleen
0.1
7.6
0
bifenyl
0
2.8
0
2-methylnaftaleen
0.3
5.8
II
fluoreen
0.3
2.2
23.8
fenantreen
5.1
2.8
35.2
anthraceen
4.2
1.0
18.3
fluorantheen
40
3.1
173.7
pyreen
38
2.1
140.4
chryseen
5.3
1.3
0
De gehaltes in de methanol oplossingen zijn gemiddeld gezien hoger dan die in de 'chromosorb-roer-memode'. De vraag is alleen hoeveel methanol er nog in deze oplossing zit en wat het effect van de methanol is op bijvoorbeeld het bepalen van Henry-constanten. Het is onduidelijk waarom de gehalten van een aantal PAKs in de 'chormosorb-doorpomp' oplossing zo laag zijn. Het kan te maken hebben het type oplosmiddel waarmee de PAKs zijn gecoat (i.d.g. methanol).
11
4.3 Rendementen waterextractie Zoals reeds eerder is vermeld zijn er rendementen bepaald van de waterextractie door aan een hoeveelheid water een bekende hoeveelheid PAKs in acetonitril toe te voegen. De gecontamineerde oplossingen zijn hierna geextraheerd met dichloormethaan of hexaan. De resultaten van de rendementen zijn vermeld in tabel 5. Tabel 5:
Rendementen extractie van PAK bevattend water met dichloormethaan of hexaan (in %).
stofnaam
dichloormethaan
hexaan
gemiddelde
standdev.
gemiddelde
standdev.
naftaleen
55.1
14.0
89.7
3.3
bifenyl
58.0
15.8
98.2
9.8
2-methylnaftaleen
59.8
13.6
94.2
6.7
fluoreen
68.2
10.0
97.6
1.9
fenantreen
80.7
5.1
98.3
3.7
anthraceen
75.1
5.2
94.8
4.6
j fluorantheen
89.4
4.4
94.3
5.9
1 pyreen
89.8
4.0
86.6
10.0
95.0
5.2
90.5
7.2
chryseen
In deze tabel valt het op dat de rendementen van de hexaan extractie hoger zijn dan die van de dichloormethaan extractie en dat de spreiding bij deze extractie lager is. Tevens valt op te merken dat deze extractie ook veel sneller is omdat er maar eenmaal geextraheerd wordt (dit in tegenstelling tot de dichloormethaan extractie waarbij er driemaal geextraheerd wordt). 4.4 Rendementen sedimentextractie Zoals reeds eerder is vermeld zijn er drie verschillende sedimentextractie technieken uitgetest, te weten: soxhletextractie met dichloormethaan (DCM), extractie met aceton/petroleumether (Ac/PE) en een refluxextractie met hexaan. De eerste twee extracties zijn uitgetest met SRM sediment en met Ketelmeersediment. De laatstgenoemde extractie is enkel uitgetest met Ketelmeersediment. In tabel 6 zijn de resultaten van de extracties met het SRM sediment weergegeven.
12
Tabel 6:
Resultaten verschillende sedimentextracties met SRM 1941 Marine Sediment. De gehaltes zijn weergegeven in ug/kg. Weergegeven is het gemiddelde met de standaarddeviatie. Tussen haakjes is het percentage t.o.v. de gecertificeerde waarde weergegeven. Soxhlet DCM (n=4)
geccrtificeerd1
Ac/PE (n=12)
541.8 1 109.2 (41)
323.5 ± 110.7 (24)
1322 1 14
bifenyl
58.4 + 39 t (51)
93.6 1 19.3 (81)
115 1 15
2-methylnaftaleen
290 6 ± 58.3 (72)
312.0 1 47.4 (77)
406 1 36
50.8 ± 5.2 (49)
39.1 ± 6.2 (38)
104 1 5
fenantreen
534.5 1 44.1 (93)
457.0 1 77.2 (79)
577 ± 59
anthraceen
160.1 ± 15.4 (79)
115.7 1 10.1 (57)
202 1 42
fluorantheen
1386 ± 94.8 (114)
1142.1 1 320.7 (94)
1220 1 240
pyreen
1001.8 ± 99.0 (93)
990.4 1 285.9 (92)
1080 1 200
633.0 + 112.6 (14l|
543.0 1 157.7 (121)
449
naftaleen
fluoreen
chryseen
Enkel fenantreen, anthraceen. fluorantheen en pyreen zijn gecertificeerd. De gecertificeerde waarde is tot stand gekomen door analyse van verschillende extracten. Er is geextraheerd met dichloormethaan voor GC-FID en GCMS analyses en met hexaan/aceton (1/1) voor HPLC fluorescentie metingen. Het is niet helemaal duidelijk wat het aantal waarnemingen is geweest waaruit de in de lijst opgenomen gehaltes zijn ontstaan (vermoedelijk n=19)
Het Ketelmeersediment is geextraheerd m.b.v. een aceton/petroleumether extractie en een hexaan reflux extractie. De resultaten van de extractie van het Ketelmeersediment zijn vermeld in tabel 7. In deze tabel is tevens de rendements bepaling van de hexaan reflux extractie (PAKs toegevoegd aan water) opgenomen. De resultaten van het Ketelmeersediment is hier vervolgens op gecorrigeerd en de verkregen gecorrigeerde waarden zijn ook in tabel 7 vermeld. In tabel 7 is te zien dat een extractie met aceton/petroleumether of een extractie met hexaan vrijwel dezelfde resultaten oplevert. De recovery bepaling van de hexaan reflux extractie is voor chryseen mislukt. De reden van mislukken is niet duidelijk.
13
Tabel 7:
Resultaten extracties Ketelmeersediment (in ng/kg) en de resultaten van de rendementsbepaling hexaan reflux. Weergegeven is het gemiddelde en de standaarddeviatie. Ac/PE (n=4)
reflux hexaan
rendement reflux hexaan (n=4 in %)
reflux hexaan gecorrigeerd2
naftaleen
1431 1 155
1445 ± 98
85
1700
bifenyl
548 1 58
239 1 23'
92
259
2-methylnaftaleen
5368 1 283
4652 1 579
86
5410
fluoreen
1129 1 70
774 1 74
sr.
900
| fenantreen
3959 1 178
3417 1 188'
89
3839
anthraceen
1716 1 54
2012 1 66
82
2454
fluorantheen
5064 1 165
5696 ± 141
73
7803
pyreen
4111 : 98
1005 v 512
75
5340
chryseen
3980 1 307
3697 1 234
?
?
1
?
n=3 rekening houdend met de recovery van de hexaan reflux extractie niet kunnen vaststellen
4.5 Rendementen adsorbentia De gemiddelde recoveries van de adsorbens-eluties staan vermeld in tabel 8. Opgemerkt dient te worden dat het hexaan tijdens het elueren van de Chromosorb en Tenax kolommen snel door de kolommen liep. Dit heeft vermoedelijk invloed gehad op de contacttijd tussen hexaan en Chromosorb of Tenax (met daaraan gecoat de PAKs). In tabel 8 valt het op dat de rendement bepaling voor C-18 volgens methode B hogere recoveries geeft. (uitgezonderd fenantreen). Vermoedelijk heeft dit te maken met de wijze van coaten. Het is onverklaarbaar waar de hoge recoveries voor fluorantheen, pyreen en chryseen door veroorzaakt zijn. Deze hoge recoveries worden ook gevonden bij het rendement van de Tenax elutie, ook voor anthraceen. Het is onduidelijk waarom de recoveries van de Chromosorb kolommen zo laag zijn. De opbrengst van de bereiding van waterige oplossingen m.b.v. de 'Chromosorb-roer* methode waren ook al laag (zie 4.2). Mogelijk is het gebruik van methanol als oplosmiddel hiervan de oorzaak. Van de adsorbentia zijn ook bianco duties uitgevoerd om na te gaan in hoeverre er PAKs of andere storende verontreinigingen in de adsorbentia aanwezig zijn. De chromatogrammen van de diverse eluaten zijn weergegeven in bijlage 10. In het C-18 materiaal zit ongeveer 50 ug/1 totaal aan PAKs. In het Chromosorb is het totaal PAK gehalte beduidend lager, namelijk 7 ug/1. In bianco Tenax zijn de volgende PAKs aangetoond: naftaleen (30 ug/1), bifenyl (12 fig/1), 2-methylnaftaleen (27 ug/1), fluoreen (3 ug/1) en fenantreen (16 ug/1).
14
Tabel 8:
1
?
Recoveries adsorbens-eluties voor PAKs. Weergegeven is het gemiddelde met standaarddeviatie in procenten. C-18 A1
C-18 H
Chromosorb2
Tenax A'
Ienax B'
naftaleen
28.7 ± 4.4
51.6 ± 12.6
0.1
43.3
76.5 ± 3.6
bifenyl
33.1 ± 8.3
45.5 ±11.2
0.0
47.9
74.9 ±5.2
2-methylnaftaleen
29.8
45.5 ± 10.9
0.9
22.7
75.4 ± 4.0
fluoreen
45.4 1 12.7
63.0 ± 12.1
0.1
?
85.2 ± 3.3
fenantreen
66.5 ± 19.4
36.1 ± 5.8
0.5
95.3
91.5 ±2.5
anthraceen
15.1 ±2.4
107.8 ± 14.3
0.2
135.8
140.6 ± 3.5
fluorantheen
73.2 ± 7.3
184.9 ± 12.6
0.3
116.3
96.1 ±2.1
pyreen
56.5 ± 3.3
120.8 ± 10.2
0.6
155.9
138.7 ±4.7
chryseen
85.6 ± 3.6
136.4 ± 5.6
14.6
104.0
92.2 ± 5.4
A
8.8
C-18 A: alle PAKs op 1 batch C-18 gecoat en daarna verdeeld. C-18 B: alle PAKs aan C-18 in afzonderlijke kolommen toegevoegd. vanwege slechte recovery zijn de Chromosorb kolommen na elutie nog een halve dag dag in hexaan weggezet. De hexaanfractie is vervolgens en indampen en opnemen in acetonitril geanalyseerd. Tenax A: PAKs afzonderlijk gecoat en vanaf afzonderlijke kolommen geelueerd (n=l). Tenax B: alle PAKs aan bulk Tenax gecoat en geelueerd (n=7). mislukt
4.6 Verliezen tijdens indampen Na indampen van de aceton of dichloormethaan standaardoplossing tot circa 1 ml acetonitril is de standaard opnieuw geanalyseerd. Daarna zijn er recoveries bepaald welke staan vermeld in tabel 9. De recoveries liggen voor alle PAKs (uitgezonderd bifenyl; 89.2%) boven de 90%. Er treden blijkbaar geen grote verliezen op tijdens het indampen. 4.7 Verliezen door fotochemische afbraak Gedurende 7 dagen is een standaardoplossing PAKs in het daglicht gezet (in de zuurkast). Op bepaalde tijdstippen is de standaardoplossing geanalyseerd. Tijdens dezelfde periode is ook een standaardoplossing in het donker (omwikkeld met aluminiumfolie) weggezet en op bepaalde tijdstippen geanalyseerd. De resultaten van dit onderzoek zijn weergegeven in figuur 1 t/m 3.
15
Tabel 9:
Recoveries indampen van standaardoplossing in aceton of dichloormethaan (DCM) en de totale gemiddelde recovery. aceton A
aceton B
DCM A
DCMB
totaal
naftaleen
90.0
91.0
94.3
93.3
92.1 + 2.0
bifenyl
84.2
90.9
94.4
87.2
89.2 ± 4.4
2-methylnaftaleen
94.2
94.9
96.9
96.0
95.5 ± 1.2
fluoreen
95.9
96.7
100.3
97.4
97.6 ± 1.9
fenantreen
95.5
99.4
97.4
96.1
97.1 ± 1.7
anthraceen
87.3
92.6
94.3
92.0
91.6 ± 3.0
fluorantheen
90.9
99.0
96.5
96.5
95.7 ± 3.4
pyreen
84.1
97.6
92.1
92.9
91.7 ± 5.6
chryseen
90.2
102.8
96.0
97.7
96.7 ± 5.2
/ ' • • • :
"*-—z~—«
- • • > -
r
-
• ; : «
rr15
T^*''-^.---^'----
.
.-.— - - . _ ^ _
f-:°::....:-:.
:r::
*..:. |M
tijd tOoq*n)
uid(ao9«i)
Haf qof»-r Noffkht 2-m4maf donker 2-nwe-af flcfti
PI' g o n » b» llcM fluora Oon>«r llgcro licht pyr « i * « r
figuur 1: Concentratieverloop van naftaleen 2-methylnaftaleen in licht en donker.
figuur 2: Concentatieverloop van bifenyl, fluorantheen en pyreen in licht en donker.
140 130 r.Jrrrr|r--'J*rrrr.-rrr. - - • * • ' " * ' * " ' ^~~• -*-~r
. . . . ?mj3
I" 0 |
100
tijd <doo«n) tkrorijookm
-
Hwjtchl ortJlrM
tmrx doni.tr tamJkHl cftfy •
#
pjrllcM
"
figuur 3: Concentratieverloop van fluoreen, fenantreen, anthraceen en chryseen in licht en donker.
16
In de figuren is te zien dat er nagenoeg geen sprake is van fotochemische afbraak tijdens de onderzochte 7 dagen. Normaliter kost een totale extractie of elutie niet langer dan 2 dagen. Dit is het enige moment dat licht van invloed kan zijn op de analyse. 4.8 Invloed hexaan of dichloormethaan op HPLC analyse De invloed van hexaan of dichloormethaan op de calibratiestandaard is weergegeven in bijlage 11. Uit de gegevens van bijlage 11 blijkt dat beide oplosmiddelen een geringe invloed hebben op de gemeten concentratie van de calibratiestandaard. Wanneer er dichloormethaan wordt toegevoegd aan de standaarden dan blijkt de retentietijd toe te nemen (toename van 0.040-0.084 voor chryseen). Het verschil in retentietijd is na toevoegen van hexaan veel minder. Het is niet duidelijk of tijdens de indampstap de oplosmiddelen dichloormethaan en hexaan geheel verdampen. De kookpunten van de gebruikte oplosmiddelen zijn: 81 °C (acetonitril), 40 °C (dichloormethaan) en 69 °C (hexaan). Het is aannemelijk dat tijdens het indampen van acetonitril, waarin nog wat hexaan zit, niet al het hexaan verdampt.
17
5. CONCLUSIES EN AANBEVELINGEN De analyse van de onderzochte PAKs m.b.v HPLC en fluorescentiedetectie is geoptimaliseerd. Deze optimalisatie had betrekking op de golflengten waarmee de stoffen zijn gemeten. Na de optimalisatie zijn er detectiegrenzen vastgesteld tussen 0.7 en 11.5 ug/1 hetgeen redelijk is te noemen. Wanneer bij gas-purge experimenten kolommen worden geelueerd en uiteindelijk in 1 ml acetonitril komen, dan zijn uitgeblazen hoeveelheden van 0.7 - 11.5 ng meetbaar. Het bereiden van waterige PAK-oplossingen is op verschillende wijzen uitgevoerd om na te gaan wat de beste methode is. De bereiding volgens de 'chromosorb-roer' methode is de minst optimale; de gemeten gehalten zijn te laag. De bereiding volgens de 'chromosorb-doorpomp' methode is een goede methode. Er worden echter enkele PAKs met deze methode niet in oplossing gebracht. Het zou mogelijk kunnen zijn dat het gebruik van het oplosmiddel methanol van invloed is geweest. Er wordt daarom aanbevolen bij herhaling van deze methode een meer apolair oplosmiddel als hexaan te gebruiken. Het bereiden van een waterige oplossing d.m.v. het toedienen van PAK standaarden in methanol geniet op dit moment de voorkeur. De gehalten in de waterfase zijn goed meetbaar. De waterige oplossingen zullen worden gebruikt voor het bepalen van Henry-constanten en het is de vraag wat de invloed van methanol is op het uitvoeren van een experiment voor het bepalen van deze constanten. Gebleken is dat voor het bepalen van PAK gehalten in water de hexaan extractie het meest geschikt is. Deze methode is snel en levert een betere recovery dan een extractie met dichloormethaan (gemiddelde 94% voor hexaan tegen gemiddeld 75% voor dichloormethaan). Ook voor het extraheren van sediment geniet een refluxextractie met hexaan de voorkeur. De extractie is makkelijk uitvoerbaar en levert goede recoveries (gemiddeld 84% op basis van extractie van water). Deze extractiemethode is tevens goed inzetbaar voor het bepalen van concentraties in sediment welke worden gebruikt voor desorptieexperimenten met lage sediment dichtheden. Voor de gas-purge experimenten heeft het gebruik van Tenax als adsorbens de voorkeur. De recoveries van de Tenax elutie zijn redelijk te noemen. Sommige PAKs geven echter een onwaarschijnlijk hoge recovery hetgeen niet is te verklaren (anthraceen, fluorantheen en pyreen; alien >110 %). Dit probleem zou kunnen worden veroorzaakt door verontreiningen in de Tenax of de oplosmiddelen. Analyses van bianco Tenax en bianco oplosmiddelen heeft echter aangetoond dat dit niet het geval kan zijn. Het gebruik van C-18 is, ondanks dat de recoveries lager zijn dan bij Tenax, aan te bevelen. Het gebruik van Chromosorb als adsorbens wordt afgeraden omdat de recoveries zeer slecht waren (gemiddeld 2%). Waarom deze recoveries zo slecht zijn is niet duidelijk. Het is aangetoond dat er tijdens de opwerking van de monsters (water, sediment en adsorbens) er geen sprake zal zijn van verliezen door indampen of fotochemische afbraak. Het is aangetoond dat er nauwelijks invloed van hexaan of dichloormethaan is tijdens de HPLC analyse. De gemeten concentraties van PAK standaarden, met daaraan toegevoegd dichloormethaan of hexaan, zijn nagenoeg gelijk aan de concentraties van standaarden zonder toevoeging van oplosmiddelen. Het is wel vastgesteld dat er enige verschuiving optreedt in de retentietijd. Dit zou een probleem kunnen zijn wanneer een chromatogram pieken bevat die dicht bij de pieken liggen van de te analyseren stoffen. Het is onduidelijk hoeveel hexaan of dichloormethaan er. na indampen van het eindoplosmiddel acetonitril, achterblijft. Met deze experimenten is het dus nog niet duidelijk geworden waarom er in sommige gevallen hoge recoveries worden gevonden (tot 140%).
18
Als eindconclusie kan er gesteld worden dat er optimale analytisch chemische memoden voor het bepalen van Henry constanten en sorptieconstanten zijn vastgesteld. Tevens is gebleken dat de grootste problemen zich bij de lagere PAKs hebben voorgedaan. De keuze van de verschillende methoden en stoffen zal m.b.v. gas-purge experimenten nader geevalueerd worden.
19
6. LITERATUUR [I]
[2] [3]
[4] [5]
[6] [7]
[8]
[9]
[10]
[II]
[12]
[13]
[14]
[15]
Polycyclische aromatische koolwaterstoffen in het Nederlandse milieu; Coordinatiecommissie voor de metingen van radioactiviteit en xenobiotische stoffen; CCRX rapport juni 1987. Venema, R : Kwaliteit zwevende stof, de kwaliteit van het zwevende stof in de rijkswateren; RIZA nota nr. 91.040, juli 1991. Beurskens, J.E.M., Mol, G.A.J., Barreveld, H.L., van Munster, B. and Winkels, H.J.: Geochronology of Priority Pollutants in a Sedimentation Area of the Rhine River; Environm. Toxicol. Chem. (1993), 12, 1549. Wierenga, J.: Microbiele afbraak van fenantreen: karakterisering van afbraakroute en groeikinetiek; Adviesburo Interproject rapport nummer 004.40.11.400, juni 1992. Kochany, J. and Maguire, R.J.: Abiotic transformations of polynuclear aromatic hydrocarbons and polynuclear aromatic nitrogen heterocycles in aquatic environments; Sci. Total Environ. (1994), 144, 17. van der Velde, L.E.: Sorptiegedrag van hexachloorbenzeen in kunstmatig en natuurlijk verontreinigd sediment; RIZA werkdocument nr. 90.065X, mei 1990. van den Heuvel, H., ten Hulscher, Th.E.M. en Beurskens, J.E.M.: Sorptiecoefficienten en desorptiekinetiek van polychloorbifenylen en hexachloorbenzeen. Experimented verkennend onderzoek met Ketelmeersediment; RIZA werkdocument nr. 94.003X, februari 1994. van den Heuvel, H.: Analytisch-chemische methoden bij het bepalen van verdelingscoefficienten en desorptiekinetiek voor HCB en PCB's. Eerste stap naar optimalisatie van de gas-purge methode; RIZA werkdocument nr. 94.066X, april 1994. Wierenga, J.: Bepalingsmethode voor PAK's in water en sediment monsters met behulp van HPLC met UV- en Fluorescentie detectie; Adviesburo Interproject, juli 1991. Marriott, P.J., Carpenter, P.D., Brady, P.H., McCormick, M.J., Griffiths, A.J., Hatvani, T.S.G. and Rasdell, S.G.: Optimisation of Fluorescence Detection for Polyaromatic Hydrocarbon Determination by Using High Performance Liquid Chromatography; J. Liq. Chromatogr. (1993), 16, 3229. Nakazato, M., Saito, K., Kikuchi, Y., Ibe, A., Fujinuma, K. and Nishima, T.: Ion-pair high performance liquid chromatographic separation and determination of thiabendazole, biphenyl and o-phenylphenol in citrus fruit and banana; Eisei Kagaku (1988), 34, 401. Hori, S., Ueguchi, M.T. and Tanaka, Y.: Determination of thiabendazole, ophenylphenol and biphenyl in citrus fruits by ion-pair high performance liquid chromatography; Osaka-furitsu Koshu Eisei Kenkyusho Kenkyu Hokoku, Shokuhin Eisei Hen (1988), 19, 1. Gieger, U.: Determination of residues of fungicide preservatives and antioxidants on fresh fruit by HPLC and automatic column control; Lebensmittelchem. Gerichtl. Chem. (1986), 40, 25. Krahn, M.M., Ylitalo, G.M., Joss, J. and Chan, S-L.: Rapid, Semi-quantitative Screening of Sediments for Aromatic Compounds using Sonic Extraction and HPLC/Fluorescence Analysis; Marine Environ. Res. (1991), 31, 175. Beekers, H en Kruger, E.: Afvalwater - Bepaling van de polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAKs) d.m.v. HPLC chromatografie; RIZA IM werkvoorschrift W 8140 5.601, april 1994. 20
[16]
[17]
[18] [19]
[20]
[21]
[22] [23]
[24]
[25]
[26] [27]
[28] [29] [30]
Kayal, S.I. and Connell, D.W.: Partitioning of Unsubstituted Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Between Surface Sediments and the Water Column in the Brisbane River Estuary; Aust. J. Mar. Freshwater Res. (1990), 41, 443. Hermans, J.H. en Smedes, F.: Onderzoek naar de monstername en bepaling van OMIVE (PCBs en PAKs) in oppervlaktewater; DGW nota GWIO-91.060, oktober 1991. mondelinge mededeling Marca Schrap; voorheen RITOX thans RIZA. Vera-Avila, L.E. and Covarrubias, R.: On-Line Trace Enrichment and HPLC Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Water; Intern. J. Environ. Anal. Chem. (1994), 56, 33. Derks, J., Rahman, A. en Zee, T.: De vloeistof-chromatografische bepaling van het gehalte aan polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK) in sediment en zwevende stof; RIZA IM werkvoorschrift W 8140 5.352, april 1994. Eschenbach, A., Kartner, M., Bierl, R., Schaefer, G. and Mahro, B.: Evaluation of a New, Effective Method to Extract Polycyclic Aromatic Hydrocarbons form Soil Samples; Chemosphere (1994), 28, 683. van der Elst, D.: Pak's analyse ondergaat facelift; Laboratorium Praktijk juni/juli 1991. Freriks, I.L., Wegener, J.W., Cofino, W.P., Maaskant, J.F.N, en Boekholt, A.H.: Verbetering PAK-analyses in waterbodem; noodzaak en oplossing: PAK-QIP; H 2 0 (1994), 27, 702. ten Hulscher, Th.E.M., van der Velde, L.E. and Bruggeman, W.A.: Temperature Dependence of Henry's Law Constants for Selected Chlorobenzenes, Polychlorinated Biphenyls and Polycyclic Aromatic Hydrocarbons; Environm. Tox. Chem. (1992), 11, 1595. Karickhoff, S.W.: Sorption kinetics of hydrofobic pollutants in natural sediments; In Contaminants and Sediments; Baker, R.A., Ed.; Ann Arbor Press: Ann Arbor, MI, 1980; vol.2, chapter 11. Karickhoff, S.W. and Morris, K.R.: Sorption dynamics of hydrofobic pollutants in sediment suspensions; Environm. Tox. Chem. (1985), 4, 469. Connaughton, D.F., Stedinger, J.R, Lion, L.W. and Shuler, M.L.: Description of Time-Varying Desorption Kinetics: Release of Naphtalene from Contiminated Soils; Environ. Sci. Technol. (1993), 27, 2397. National Institute of Standards & Technology: Standard Reference Material 1941 Organics in Marine Sediment Deelder, R.S., Tommassen, P.H. en van den Berg, J.H.M.: Chromatografie; ISBN 90-10-05675-9 eerste druk Amsterdam 1985. Payne, J.R. and Phillips, C.R.: Photochemistry of petroleum in water; Environ. Sci. Technol. (1985), 19, 569.
21
BIJLAGE 1 Gebruikte chemicalien en hulpstoffen naftaleen bifenyl 2-methylnaftaleen fluoreen fenantreen anthraceen fluorantheen pyreen chryseen aceton hexaan petroleumether acetonitril dichloormethaan Milli-Q water methanol zoutzuur kwikchloride chromosorb 45-60 mesh G-acid washed Tenax-TA 60-80 mesh octadecyl C-18 40 (am kal iummonowaterstoffosfaat kieselgel 60 reinst (silicagel) glaswol silane treated
Sigma Boom Meppel Sigma Sigma Boom Meppel Sigma Aldrich Sigma Sigma Promochem Promochem Promochem Promochem Baker Millipore Baker Baker Baker Serva Chrompack Baker Baker Merck Supelco
22
N-2380 803090 P-2146 F-6379 822122 A-3885 F80-7 P-2146 C-6898 0018 4159 4977 2856 9315 8402 Dilut-it 1 molair 1127 42512 2440 7025-00 0241 7754.0500 2-0411
BIJLAGE 2 Structuurformules onderzochte PAKs Tussen haakjes is de molmassa van de PAK weergegeven
/ \y/ \ Bifenyl (154)
Naftaleen (128)
/
2-methylnaftaleen (142)
r ^ X
Fluoreen (166)
Anthraceen (178)
Fluorantheen (202)
r
^
r
^
KSKS Fenantreen (202)
^
Chryseen (228)
Pyreen (202)
23
BIJLAGE 3 Instellingen HPLC PAK analyse volgens Wierenga |9| De HPLC opstelling is van het merk Hewlett Packard type 1050. De gebruikte eluens is water en acetonitril (ACN). Er wordt bij de PAK analyse gebruikt van gradient elutie. De gebruikte gradient is in de onderstaande tabel weergegeven. 0 - 4 min 4 - 10 min 10 - 21 min 2 1 - 2 9 min 2 9 - 3 1 min 3 1 - 3 5 min 35 - 40 min
50 % ACN 50 % —> 65 % ACN 65 % —> 85 % ACN 85 % —> 100 % ACN 100 % ACN 100 % —> 50 % ACN 50 % ACN
De golflengtetabel voor de fluorescentiedetector (HP 1046) waren als volgt: tijd
K
Xm
0.00 10.00 12.75 15.00 18.00 30.00
230 210 350 237 277 230
330 314 368 440 367 330
24
BIJLAGE 4 Bereiden van waterige PAK oplossingen Er zijn op drie verschillende wijzen waterige PAK oplossingen bereid, te weten: a) coaten van chromosorb met PAKs en hierna het chromosorb overbrengen naar het water b) toevoegen van PAK in methanol standaarden aan het water c) coaten van chromosorb met PAKs en hierna het chromosorb met het water elueren. Voor alle bereidingswijzen geldt: laat de PAK oplossingen zo min mogelijk in contact komen met het licht. ad a): weeg circa 0,5 g Chromosorb 45-60 mesh af in een platbodemkolf. voeg een hoeveelheid hexaan toe en schud de kolf rustig gedurende twee uur op een schudmachine. giet na het schudden het hexaan af. droog het Chromosorb eerst aan de lucht in een zuurkast en daarna gedurende circa 6 uur in een stoof bij 105 °C. voeg PAK oplossingen in medianol toe schud de kolf rustig gedurende twee uur op een schudmachine. droog het Chromosorb onder stikstof tot bijna droog. droog het Chromosorb verder in de stoof bij 105 °C gedurende circa 6 uur. weeg in een hexaan gespoelde erlenmeyer circa 0,6 g K2HP04 af en voeg circa 5 liter Milli-Q water toe en een roervlo. roer de oplossing krachtig en voeg net zoveel 1M HC1 toe todat de pH van de oplossing 6,4 bedraagt. breng met een overmaat Milli-Q water het Chromosorb over in de erlenmeyer. Vul de erlenmeyer tot bijna aan de rand toe aan. sluit de erlenmeyer af met aluminiumfolie. roer de oplossing rustig m.b.v. een roermotor. Zorg ervoor dat het op de bodem liggende Chromosorb niet teveel opwoelt. laat de oplossing in deze toestand minimaal een week staan. adb): weeg in een hexaan gespoelde erlenmeyer circa 0,6 g K2HP04 af en voeg circa 5 liter Milli-Q water toe en een roervlo. roer de oplossing krachtig en voeg net zoveel 1M HC1 toe totdat de pH van de oplossing 6,4 bedraagt. voeg aan het water PAK oplossingen in methanol. Zorg ervoor dat er zo min mogelijk methanol wordt toegevoegd. roer de oplossing.
25
- vervolg bijlage 4 ad c): weeg circa 0,5 g Chromosorb 45-60 mesh af in een platbodemkolf. voeg een hoeveelheid hexaan toe en schud de kolf rustig gedurende twee uur op een schudmachine. giet na het schudden het hexaan af. droog het Chromosorb eerst aan de lucht in een zuurkast en daarna gedurende circa 6 uur in een stoof bij 105 °C. voeg PAK oplossingen in methanol toe schud de kolf rustig gedurende twee uur op een schudmachine. droog het Chromosorb onder stikstof tot bijna droog. droog het Chromosorb verder in de stoof bij 105 °C gedurende circa 6 uur. weeg in een hexaan gespoelde erlenmeyer circa 0,6 g K2HP04 af en voeg circa 5 liter Milli-Q water toe en een roervlo. roer de oplossing krachtig en voeg net zoveel 1M HC1 toe todat de pH van de oplossing 6,4 bedraagt. breng het gedroogde gecoate chromosorb over in een zogenaamd 'Chromosorb-buisje'. pomp het water over het chromosorb in een erlenmeyer van 5 liter met een snelheid van ongeveer 1 ml/min; zorg ervoor dat het chromosorb niet droog komt te staan en laat het eluens op de bodem van de erlenmeyer terecht komen. Een variant op de bereiding m.b.v. chromosorb is dat alle PAKs afzonderlijk worden gecoat. Gebleken is dat dit betere oplosbaarheid geeft.
26
BIJLAGE 5 Gebruikte methoden voor het extraheren van waterige PAK oplossingen extractie met dichloormethaan: neem 100 ml waterige PAK oplossing extraheer dit 3 maal met 15 ml dichloormethaan gedurende 15 min. tap na iedere extractie de dichloormethaan fractie af (onderste laag) damp de samengevoegde dichloormethaan fracties in m.b.v. Kuderna-Danish tot circa 5 ml. damp verder in onder stikstof tot circa 0,5 ml dichloormethaan voeg circa 5 ml acetonitril toe en damp hierna verder in tot circa 1 ml bepaal de exacte hoeveelheid acetonitril d.m.v. weging na filtratie over Millex 50 um is het monster gereed voor analyse extractie met hexaan: neem 10 ml waterige oplossing extraheer dit 1 maal met circa 5 ml hexaan gedurende 1 minuut breng zoveel mogelijk hexaan over naar een puntbuis damp in onder stikstof tot circa 0,5 ml hexaan voeg circa 5 ml acetonitril toe en damp hierna verder in tot circa 1 ml bepaal de exacte hoeveelheid acetonitril d.m.v. weging na filtratie over Millex 50 um is het monster gereed voor analyse
27
BIJLAGE 6 Sedimentextractie met dichloormethaan soxhlet Extractieprocedure: weeg het sediment af in af porseleinen schaal voeg MgS0 4 .7H 2 0 toe maak een homogeen mengsel en laat dit drogen maal het vervolgens tot een fijn poeder en weeg hiervan een gedeelte af in een soxhlet hulsje soxhleteer gedurende 4 uur met dichloormetJiaan in een waterbad van 50 °C. breng na soxhlet het extract over naar een maatkolf van 50 ml en vul aan met dichloormethaan clean-up: plaats een Baker Silica kolom op het SPE-10 apparaat conditioneer de kolom met 2 * 1 ml dichloormethaan pipetteer 3 ml extract op de kolom en elueer met een flow van 5 ml.min"1 spoel de kolom na met 2 * 1 ml dichloormethaan damp het eluaat in onder stikstof tot bijna droog neem het damprest op in 1 ml methanol na filtratie over Millex 50 u,m is het monster gereed voor analyse
28
BIJLAGE 7 Sedimentextractie met aceton/petroleumether Extractieprocedure: Weeg circa 2 gram nat sediment nauwkeurig af in een afsluitbare centrifugebuis. Voer een droge stof bepaling van het sediment uit. Voeg 25 ml aceton toe en sluit de centrifugebuis hermetisch af. Extraheer gedurende 15 minuten op een schudmachine en centrifugeer hierna het extractiemiddel gedurende 5 minuten. Spoel de benodigde scheitrechters van I liter 3 maal met aceton en vervolgens 3 maal met pelroleumether. Decanteer het gecentrifugeerde extract in een scheitrechter. Herhaal de extractieprocedure 1 maal. Voeg 5 ml verzadigde natriumsulfietoplossing toe en schud gedurende 5 minuten op een schudmachine (voor het verwijderen van zwavel). Extraheer met 50 ml petroleumether gedurende 10 minuten op een schudmachine. Houd er rekening mee dat er regelmatig ontlucht zal moeten worden. Voeg 300 ml milli-Q water toe en schud gedurende 5 minuten (om aceton en andere polaire stoffen te verwijderen). Tap de waterfase af in een tweede scheitrechter en extraheer deze gedurende 30 minuten met 50 ml petroleumether. Voeg de eerste petroleumetherlaag bij de tweede scheitrechter en tap hierna de waterfase af. Spoel de eerste scheitrechter na met petroleumether. Extraheer de gecombineerde petroleumetherfasen nogmaals met 300 ml milli-Q water gedurende 5 minuten (schud niet te hard om teveel emulsie te voorkomen). Spoel een platbodemkolf van 500 ml met aceton en petroleumether. Tap de waterlaag af en breng de petroleumetherfase over in een platbodemkolf. Spoel de scheitrechter na met petroleumemer. Droog de petroleumether met natriumsulfaat. Breng 3 kooksteentjes in een puntbuis. Breng de petroleumetherlaag over in een "spatbol-combinatie" gekoppeld aan de puntbuis. Spoel bij het overbrengen de platbodemkolf 3 maal na met petroleumether. Damp bij 70°C in op een Kuderna Danish opstelling tot ongeveer 10 ml en damp verder in tot 1 ml onder stikstof. Clean up: Weeg 2,00 ± 0,03 gram gedeactiveerde silicagel (6%) af in een elueerbuis. Breng het extract op de kolom met een pasteurspipet. Was de puntbuis 4 maal na met 1 ml petroleumether en breng iedere keer die ene ml in de elueerbuis. Was de puntbuis vervolgens na met 9 ml petroleumether en breng dit vervolgens stapsgewijs in de elueerbuis. Damp het extract in onder stikstof tot 0,5 ml, voeg vervolgens circa 5 ml acetonitril toe en damp verder in tot 1,00 ml. Bepaal de exacte hoeveelheid acetonitril d.m.v. weging. Na filtratie over Millex 50 um is het monster gereed voor analyse.
29
BIJLAGE 8 Sedimentextractie met hexaan reflux Extractieprocedure: weeg in een erlenmeyer van 250 ml een hoeveelheid sediment af voeg circa 50 ml Milli-Q water en een roerboon toe voeg circa 50 ml hexaan toe reflux het mengsel gedurende 6-7 uur (roerend koken) laat mengsel afkoelen spoel de refluxkoeler met hexaan breng een bekende hoeveelheid hexaan over naar Kudema-Danish spatbol combinatie damp het hexaan in tot circa 5 ml m.b.v. Kuderna-Danish damp het hexaan verder in onder stikstof tot circa 1 ml Clean up: Weeg 2,00 ± 0,03 gram gedeactiveerde silicagel (6%) af in een elueerbuis. Breng het extract op de kolom met een pasteurspipet. Was de puntbuis 4 maal na met 1 ml hexaan en breng iedere keer die ene ml in de elueerbuis. Was de puntbuis vervolgens na met 9 ml hexaan en breng dit vervolgens stapsgewijs in de elueerbuis. Damp het extract in onder stikstof tot 0,5 ml, voeg vervolgens circa 5 ml acetonitril toe en damp verder in tot 1,00 ml. Bepaal de exacte hoeveelheid acetonitril d.m.v. weging. Na filtratie over Millex 50 (am is het monster gereed voor analyse.
30
BIJLAGE 9 Chromatogram HPLC analyse PAK calibratieoplossing
Km. MCI *
ADC C « » w e » oi 11019-0201 D 2 A%1
200 .
3 737 195 . 1.502
'
16 371
69!
190 _
195 -
180 -
Ml 33
175 .
1" !S9 Bl 555
L
170 -
L
JJp^iTVri
.1
22; a
165 -
9
8.768 11.133 11.502 12.467 13.737
—,
.
.
naftaleen bifenyl 2-methylnaftaleen fluoreen fenantreen
.
,
i
.
.
1
1—
1
•
1
IE
14.892 16.371 17.369 21.555
31
i IB
•
i
•
20
anthraceen fluorantheen pyreen chryseen
•
'
i
•
BIJLAGE 10 Chromatogrammen bianco adsorbentia
Chromatogram bianco C-18
Chromatogram bianco Chromosorb
32
Chromatogram bianco Tenax
33
o o t- o o 0*1 oH oH
01 ro t> CO r 0*1 Cf\
51 (j1
O O O
o
C-- \0 ro
ro
T
r-
H
0*1
or-l
CO t - CO H 0*1 0*1 0 1 O
o o
H
r-l
1 - oi CO OI
H
X CD -C
Q o o
o
in
m + *> 0 1 U 1 H
CN 11 CN CN 4
^^
Ll
rH
SP " \
cn
a5
r- u-> t - m r- ro o ro (N CN
"••—
X OJ -C
rH
o u o fl LTI 0
o o
+ u
+
u a
in
O
OI CO CD o 0*1 01 0*1 o
o H
H
-l H
rH
**^ E Cn CJ ^ a .
ies tand
u£ u a =
a r:
hloorm
-: X *^
01 0 1 r o
10 CN CN i n CJI CN
o
H
OJ J3
H
0
= r. n
5 JJ
loed * - B
o o rH
as
:-: V A 3
H
CJ*.
in
0*1 0*1 01 0*1 0*1 cn
CO
O 01 CO o o r H r-\ H rt o o i cn o o o O O O H rH H H rt rt rt
K 01 3
Ol
CD
+ ro• co• r-• 0*1 CN i n c- CN cn H • H V O C - H H i n r- o r-l 1 * CO CO CN C- (N o ro t r rt CO CN r; H rl
:•:
CD
A o o
u
C 0
rJ
+ CO VD CN
Ii
J3
com rt
CN I i U I 0*1 r H CN CN I H * H H
CN O
• CN •*
rr-
CO
rH
- i
T
H CN
m -i
dr
^-. r-H **^. Cn
iH
A
o
•rl
T3
•0 0 0
> c M
(N CO
Ii
11 rH
CN CN
rH
rt
CJ C 0 CJ
">«
CO l O
CN
Cn
3
r-i in o i CN 11 H <-J> r l CO 0 1
H H
-T
n
. r-. -.r-l r~ rl
O CO rt 1" • • CN rt Tf rH ro CN r-i
•
O C 0
>
0 CJ
£OJ
O 9J
d
rH
3ui
4J IW
ro
V B
c
U 0
•a
|»!
« o 2c
"3
• •H
H
rt
(J -C 0
ri
i - r- i n r-i i n CO ro i n I O 01 o CN CN r- 1 " rt ro
rH
> u
0 H 43 0
CO CO 01 -!•
£
c 0 0
IN r- -r ro o \ r-
rH
•*-» 4J Cn -G
5
-r O O I O
oV»
rt
i
.
o o
r-l
0
.
+ o
CJ
rH
<
Cn
1 * vo o i ro i n CO CN 1< rt r-\ ro i n o i o N CN rIi H I i H rH CN rt
0 + o
—
>™•
••-N.
ro
CN
rj.
rH
c
X!
8 c
>
ro
o CN CN H 1< H
J ^ ^
CJ
"
C rfl rfl X
C
a
• CO
a
E cn Q£
0
•— •3 "—
•
in . . t1> C- 10 CN m 0*1
cn o . CN 10
co i n CO CN f>
in
*-~ H
•~>
'
+ #> M f l H
a
*--«
OI
rt in co
I i rH
o r H CN rt C0 1 0 1 CJ1 O o o O O 01 rH H rt H
CN
rH
Oi
lO ro
rt
rH
t-
o o
^
CN CN
CJ
o
i
•H
c0
0
+
H
CJ
o u in
E CJ Q
a
rg
• J d t
01 CO 0*1
o o cn 01
r0 i n CN i i i i co
CO 4-1
N
«t CO CN1 r-t i n rt ro CN C- I
ro i n
+ u
M co T3
Cn
£
in
o m r-i
^^
T3
Ulrt
ii n CJ-I o CN
OI
+ •*>
r.
in
ro
ro f> H
o LTI CN
f i
CN H CO CO 01
rH
CN nrji CN CN "J? U I O l O CN CN «-)• H f H H
CO CO t - i n CJ1
•p •-
O O 01 o H H r-i
O
+ *» ^, fj
r- o r- co H rt m o
UJ
0
JJ 01
a c rH
•-I rt) JJ
0
OJ
Q
c a> H 1)
CO
OJ C OJ OJ U OJ H >sOJ U u c B rH >.£ OJ 4J « CO C OJ U c M M OJ B m c -u JJ OJ OJ 0 cfl j 0 0) >• • J H g 3 C U 3 h ro - H i r-l OJ C rH H >ij= C . 0 CN I J HH ro UJ a CJ
C C 01 rH G 0) r H > , OJ
a
g 3 « >: 0
UH 0 JJ
43
co
C g 0)
OJ B
oj a CD OJ JJ R u uH COJ C COJD u OJ (0 c U VJ ro J : 0 OJ S
r-\ >,s: 1 ) (0 C J J i n JJ OJ OJ 0 5 3 C J-i S U M ro -H 1 r H OJ C r-i > , . C C j a CN UH UH CB «H P , U
r-i
inrocooirtroi|CNro
V O C N C J I C N I i r O l N i n i i
X rH OJ - H
inininioiot-oc-co o o o o o o o o o o o o o o o o o o
X H 0J -rH 43 43
X43 CJ O 0)
u
o Cl o M if) a;
o n m OJ
+ >
+
>
incoi"rtOiu-)Oiror-rjcNrtroiioioioi
~
O E O
—
in H
+ «
rtC-1"l~t*-OOr*0 ini-mininvoujior-o o o o o o o o o o o o o o o o o o
X rrt OJ -H
XIX
CJ
CJ n M OJ
>
X OJ — X! C -H
rtU3rtrOinin01COCN X OJ — X! C •rl
crirtiNroiiiniot-rt r H r H r H r H r H r H r H C ^
+ K ioinioioifiui«i <|i'jf o o o o o o o o o o o o o o o o o o
XrH OJ -H XI XI
o u
rt 4)
+ >
0)
O rH
01
rtCNu->oioovoinoro inoiiLnvoiorortOD inoicNrtroiioicrico
VJ
x
OJ — X! C -H
OlrHCNrOliinujr-rt THrHrHrHrHrHrHOI
inc0CNrtrO1*0101O"i OlrtCNrOI-invot-rt rHrHrHrHrHrHrHrs)
rH EH + fti
cooi«rooi(Nr-oro r O O I l ^ l i n i O C ^ I i C O C N incocNrtroiicjioicn
COI'COCMrtrtOOlOl' liCOrtOrOliCOCOCO
JJ
airtcNroi-inior-rt
—
X C
CJ - H
rHrHrHrHrHr-irHC^
S-B
a-.
CN
ro i« in 10 t-
rH rH rH rH rH rH
S-B VJ
OJ E-i
OJ H > fti
> a.
a B
a 3
CD rH
CD
l*J C8
m
JJ
c
a
V
DO
i i r t r - c o i ' r t u - ) i n t - -, roo1rOlnr-co11CN1
o E o—
oiioinoiinror-cDro
UJ 0 JJ
i«rtroininoirtinii O O O O O O O O C N O O O O O O O O O O O O O O O O O O
o
o
+ >
+ ft!
rH
rHrHrHrHrHrHrHC<
in — CN EH C N V D r t O r O r O C lD C N O
0 0
ina3CNrtroi"cocooi oirtCNroiiinior-rt
o E
+ «
JJ — X! C CJ - H
O O O O O O O O O I I I I I I I I I
cDcocovoor-vooio
CN H
X OJ — X! C •H O g O — •H H
C N C N r t r t r t r t i n i i O O O O O O O O O O
+ >
o e• i n >—
X H Q) - r l X! XI CJ O 01
ocNior-oiinrtrtro
O 01 in u CN OJ
orooiiocNrol'-inro lioiroinr-r-i-rort inconrtrTimaim
-H T3
THr-lrHrHrHrHrHC^
•rH
X rH OJ •rH X! X
43 U
OlrtCNCOIiinVDr-rt
xi a
rHrHrHrHrHr-irHOi
in +
O in r-i +
ror-ioiicoairocouj cNC-cNiiinioinr-cN iriCOCNrtCOIiCOCOOl
X OJ
oirtcNroi
: • :
aj 43 o o
rtrtOOrtOO-linO O O O O O O O O O O O O O O O O O O
H
a c a
c
r0 JJ
OJ
UJ
OJ
OJ OJ X ! OJ OJ J J
CJ a JJ rfl CO aOJ OJ 01 C h h O m w E 3 cflX! a JJ 3 Cfl - H I r H C 4 3 CNUH OJ C rH >,X! UJ rfl UJ tt CJ OJ rH CO JJ
rH > , C OJ
> 1 OJ X OJ JJ H 01 o
u
C OJ
3 rO X
I
•
•
*
-
O JJ
OJ OJ rH rfl JJ i j Cfl
•
a 0) C G OJ OJ 0J X OJ OJ J J
0
r H C3 > , 0) OJ VJ CJ a X ! OJ C OJ J J VJ JJ rfl rfl OJ oi I VH VH 0J O UJ £ 3 - r t I r H 0J C r H > , 4 3 rH >, C 0J
Jjq o
a JJ C43CNUHUH rflUH
a u