VYUŽITÍ KMENOVÝCH BUNĚK V LÉČBĚ DEFEKTU KLOUBNÍ CHRUPAVKY EXPERIMENTÁLNÍ STUDIE

KLINIKA DĚTSKÉ CHIRURGIE, ORTOPEDIE A TRAUMATOLOGIE LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERZITY FAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO

DISERTAČNÍ PRÁCE

VYUŽITÍ KMENOVÝCH BUNĚK V LÉČBĚ DEFEKTU KLOUBNÍ CHRUPAVKY EXPERIMENTÁLNÍ STUDIE

Řešitel: Školitel: Přednosta: Doba řešení:

MUDr. David Starý doc. MUDr. Ladislav Plánka, Ph.D. prof. MUDr. Petr Gál, PhD., MBA 1. 1. 2006 – 31. 12. 2009

Podpořeno Národním programem výzkumu NPV II 2B06130

1

OBSAH

PŘEDMLUVA .......................................................................................................... 4 1. ÚVOD ............................................................................................................... 6 1.1. Historie chirurgie.................................................................................... 6 1.2. Fyziologie chrupavky ............................................................................. 9 1.3. Rozdělení chrupavky ............................................................................ 12 1.3.1. Hyalinní chrupavka...................................................................... 12 1.3.2. Elastická chrupavka .................................................................... 13 1.3.3. Vazivová chrupavka ..................................................................... 14 1.4. Patofysiologie chrupavky .................................................................... 15 1.5. Patologie chrupavky ............................................................................. 16 1.5.1. Degenerativní postižení kyčelního kloubu ................................. 16 1.5.2. Disekující osteochondróza kyčelního kloubu ............................. 20 1.5.3. Idiopatická avaskulární nekróza hlavice kosti stehenní .............. 21 1.5.4. Chondrolýza................................................................................. 22 1.5.5. Disekující osteochondróza kolenního kloubu.............................. 22 1.5.6. Poranění chrupavky kolene ........................................................ 25 1.6. Diagnostika postižení kloubní chrupavky ............................................ 26 1.7. Současné možnosti léčby poranění kloubní chrupavky ....................... 27 1.8. Moderní trendy v léčbě poranění a degenerativních onemocnění kloubní chrupavky ................................................................................ 21 1.9. Kmenové buňky ................................................................................... 37 1.9.1. Zdroje kmenových buněk ............................................................ 39

2

1.9.2. Etické aspekty .............................................................................. 40 2. CÍLE EXPERIMENTÁLNÍ STUDIE ........................................................................ 41 2.1. Cíle práce.............................................................................................. 42 3. MATERIÁL A METODIKA .................................................................................. 43 3.1. Příprava kmenových buněk ................................................................. 43 3.2. Kultivace kmenových buněk ................................................................ 47 3.3. Příprava skafoldu.................................................................................. 47 3.4. Anestesie u prasat ................................................................................. 50 3.5 Operační výkony ................................................................................... 52 3.6. Histologické vyšetření .......................................................................... 61 4. VÝSLEDKY ...................................................................................................... 64 4.1. Statistické hodnocení............................................................................ 69 4.1.1. Testování hypotéz ........................................................................ 69 4.1.2. Steel – Dwassův test .................................................................... 71 4.1.3. Fisherův exaktní test .................................................................... 72 4.1.4. Výsledky statistické analýzy........................................................ 74 5. DISKUSE ......................................................................................................... 76 6. ZÁVĚR ............................................................................................................ 80 7. LITERATURA ................................................................................................... 81 8. SEZNAM VYOBRAZENÍ ..................................................................................... 98 9. PUBLIKACE VÝSLEDKŮ .................................................................................. 102

3

PŘEDMLUVA Řešení předkládané experimentální studie úzce navazuje na předchozí projekty Kliniky dětské chirurgie, ortopedie a traumatologie Fakultní nemocnice Brno, zejména na experimentální studii možnosti využití mezenchymových kmenových buněk v prevenci a léčbě kostního můstku. Autoři se zde pokusili o důkladnou analýzu vzniku a chování kostního můstku, který je závažným problémem dětské skeletální traumatologie, stejně tak jako traumatologie veterinární. V předkládané disertační práci se autor zabývá dalším možným využitím kmenových buněk, tentokrát v léčbě defektu chrupavky kloubní. Na experimentálních zvířatech byla vytvořena modelová poranění kloubní chrupavky a byly prověřovány nové možnosti jejich léčby s využitím alogenních mezenchymových kmenových buněk. Experimentální studie byla časově i technicky velmi náročná. V jejím průběhu bylo provedeno 30 operačních výkonů v celkové anestezii, všechna experimentální zvířata absolvovala zobrazovací vyšetření a po jejich utracení pokračovala velmi podrobná analýza průběhu hojení kloubního povrchu, histologická vyšetření, skórování, radiografické analýzy a statistická hodnocení. Poděkování autora patří všem spolupracovníkům, především doc. MUDr. Ladislavu Plánkovi, PhD. a jeho kolegům, za profesionální a kamarádské vedení v průběhu celého mého postgraduálního studia. Chtěl bych také poděkovat prof. MVDr. Aloisi Nečasovi, PhD. za konzultace při sestavování metodického postupu, Ústavu živočišné fyziologie a genetiky Akademi věd v Liběchově za poskytnutí prostorového i odborného zázemí cytologické laboratoře, operačního sálu a chovu zvířat. Dík patří rovněž mému přednostovi prof. MUDr. Petru Gálovi, PhD. za inspiraci a motivaci a všem ostatním nejmenovaným osobám za příjemnou spolupráci. Je třeba touto cestou poděkovat Ministerstvu školství České republiky za maximální podporu celého projektu, díky které jej bylo možné v plném rozsahu realizovat. David Starý, Brno 3. 8. 2010.

4

Seznam zkratek

AS AVČR CII CCD CM-DiI CVA ECM EDC EDTA EKG ES ETCO2 FBS FN Brno HR IFS ITS KB KDCHOT MAP MAPC MEM MR MSCs MSC NHS OCD OD PAS PBS RR SpO2 TEP TGF

Adult stem cells Akademie věd České republiky Kolagen II Kolodiafyzální úhel Chloromethylbenzamid derivát DiI Coxa vara adolescent Extra cellular matrix 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Etylen diamin tetraoctová kyselina Elektrokardiografie Embryonic stem cells Koncentrace oxidu uhličitého na konci výdechu Fetal Bovine Serum Fakultní nemocnice Brno Srdeční frekvence Imunofluorescence Insulin Transferin Selenium Kmenové buňky Klinika dětské chirurgie, ortopedie a traumatologie Střední arteriální tlak Multipotentní progenitorové buňky Modified Eagles Medium Magnetická resonance Mesenchymal stem cells Mesenchymal stem cell N-Hydroxysukcinimid Osteochondritis dissecans Hodnota O´Driscolova skore Periodic Acid Schiff Phosphate Buffered Saline Dechová frekvence Saturace krve kyslíkem Totální endoprotéza Transforming Growth Factor

5

1. Úvod

Klinický výzkum, zajímavé experimenty na pokusných zvířatech, smysluplné výsledky vědeckého bádání a přínos pro humánní medicínu jsou důvody pro trvalé pokračování v časově náročném procesu jako je experimentální věda. Jak bylo již v předmluvě zmíněno, Klinika dětské chirurgie, ortopedie a traumatologie Fakultní nemocnice Brno je již po několik let úspěšným nositelem výzkumných projektů. Proto mohlo být v předkládané studii navázáno na dobré a pozitivní výsledky transplantace kmenových buněk do poraněné oblasti růstové zóny dlouhé kosti. Nová experimentální studie je založená na již zjištěných skutečnostech a prvořadým úkolem bylo ověření nových možností využití mesenchymových kmenových buněk a jejich transplantace do iatrogenně poraněné kloubní chrupavky. Hojení defektů kloubní chrupavky je všeobecným problémem, proto se experimentální práce zaměřuje na hledání nových možností, které by se přiblížily ideálnímu způsobu terapie. Úspěch projektu byl dán diagnostickými možnostmi, špičkovým přístrojovým vybavením a hlavně velkým nasazením celého pracovního týmu. Inspirace byla čerpána ze zahraniční literatury, kde jsou podobné experimenty již popisovány. 1.1. Historie chirurgie Chirurgie patří a vždy patřila k základním a nejstarším kamenům lékařské vědy, její psaná historie sahá až do dávného Egypta a Mezopotámie (cca 2500 – 2000 let př. n. l), kde byly nalezeny spisy, které obsahují

Obr. 1 – Historie traumatologie, zdroj www.zdravcentra.cz

6

základní principy léčby ran (díla Celsova, Gallenova a díla alexandrijských lékařů), traumat – zlomenin, vymknutí a jsou zde zmíněné i některé jednoduché operační výkony. Již v této době využívali lékaři při léčbě pohybového aparátu jednoduchých dřevěných dlah a plátěných obinadel. (Obr. 1) Z jednoduchých operačních zákroků se prováděly incize, reposice zlomenin, odstraňování nádorů a kastrace. Avšak právě úrazy byly nejčastější a nejpochopitelnější děje, které dávní lékaři pozorovali a různými způsoby se je snažili léčit. Historické nálezy dokumentují poranění skeletu a primitivní způsoby jejich léčby, dokazují i to, že některé zlomeniny se po těchto primitivních způsobech léčení zhojily. Větší množství dochovaných nálezů pochází z antického Řecka, z Homérových a především Hippokratových spisů. Ve středověku se traumatologie rozvíjela do podoby současné, zejména zásluhou francouzských a anglických chirurgů, jako např. Ch. J. Duverney, J. L. Petit, P. J. Desault, F. Chiparit, P. Pott. Základním omezením rychlejšího rozvoje operačního řešení zlomenin byla v té době ranná infekce. Teprve s objevem principů asepse a antisepse nastal zlom v léčbě různých poranění. V průběhu 19. století se postupně chirurgie rozvíjí a spolu s tím se objevují i práce, které popisují příznaky zlomenin (Dupuytren, 1847) a způsoby léčby zlomenin (Desault 1811, Cooper, 1832). Na konci 19. století se chirurgové V. J. Kuzmin, P. Delbet, A. Lambotte a další snažili o první nitrodřeňové fixace dlouhých kostí, které byly

Obr. 2 – Schéma artroskopie ramena, zdroj www.allmedicaltourism.com Obr. 3 – Rtg paže a osteosyntéza ESIN, zdroj archiv autora

7

propracovány G. Küntcherem. Ten začal v roce 1940 provádět nitrodřeňovou fixaci hřebem. Zdokonalené a daleko více propracované modifikace této metody se používají dodnes. Začaly se používat dlahovací techniky, které opět ve zdokonalené podobě používáme i v této moderní době. Pro další rozvoj a vývoj chirurgie a traumatologie bylo nezbytné zdokonalení anestezie a resuscitačních postupů, další pokrok v asepsi a antisepsi, objev a použití antibiotik a v neposlední řadě i objev rentgenových paprsků W. Obr. 4 – Rtg lokte a osteosyntéza Kirschnerovými dráty, zdroj archiv autora

K. Röntgenem v roce 1895, který zdokonalil diagnostiku nejrůznějších poranění a onemocnění. V poslední době se začaly prudce rozvíjet miniinvazivní techniky ošetřování skeletálních traumat a dalších patologii skeletu. Patří mezi ně

Obr. 5 – Experimentální transplantace chondrocytárního štěpu do defektu růstové chrupavky, zdroj archiv autora

artroskopie (Obr. 2), metody nitrodřeňové stabilizace ESIN (Obr. 3), široká škála využívání perkutánní fixace Kirschnerovými dráty (Obr. 4). V posledních letech přibývá i různých experimentálních studií, které se zaměřují na poranění kloubní chrupavky a možnosti léč-

Obr. 6 – Histologický preparát chrupavky-chondrocyty, zdroj www.cytochemistry.net

8

by těchto struktur pomocí

autologních chondrocytů (Obr. 5) a mezenchymových kmenových buněk. Léčba poranění kloubní chrupavky je komplikovaným problémem dospělé i dětské traumatologie a ortopedie, a to zejména díky jejímu nízkému hojivému potenciálu. Pracoviště KDCHOT se od roku 2004 aktivně podílí na výzkumných experimentech s kmenovými buňkami u modelových diagnóz na laboratorních zvířatech. 1.2. Fyziologie chrupavky Chrupavka je pojivová tkáň složená z chondrocytů, amorfní mezibuněčné hmoty, kolagenních a elastických vláken, je téměř bezcévná a bez inervace (Obr. 6) Mezibuněčná hmota zaujímá z hlediska objemu největší podíl chrupavčité tkáně, zatím co chondrocyty tvoří jen její malou část (Obr. 7) Kromě kloubní chrupavky kryje její povrch vazivový obal zvaný perichondrium, který je inervován a obsahuje cevní zásobení. Z cévního řečiště perichondria difundují do nitra chrupavky základní stavební komponenty proteoglykanů i vláken, především aminokyseliny a uskutečňuje se tak látková výměna chrupavky. Prostřednictvím perichondria chrupavka roste do šířky a probíhá zde začátek hojení. Chondrocyty jsou tvarově proměnlivé buňky (Obr. 8) v povrchových vrstvách chrupavky jsou vřetenovité, v hlubších vrstvách maObr. 7 – Histologický preparát chrupavky, zdroj www.cytochemistry.net

jí spíše kulovitý tvar. Povrch

9

buněk vybíhá v drobné zoubkovité výběžky, kterými jsou buňky zakotveny v amorfní základní hmotě chrupavky. Chondrocyty mají dobře vyvinutý proteosyntetický aparát a intenzivní látkovou výměnu. Amorfní mezibuněčná hmota je proteoglykanový komplex, ve kterém probíhá Obr. 8 – chondrocyt, zdroj www.msm.cam.ac.uk

látková výměna tkáně a slou-

ží jako prostor, který izoluje chondrocyty od vnitřního prostředí organismu, podmiňuje základní fyziologické a biomechanické vlastnosti chrupavky a zajišťuje vazbu vody. Kolagenní a elastická vlákna jsou zcela zavzata do amorfní hmoty chrupavky. Jemná a značně ohebná elastická vlákna jsou typická především pro elastickou chrupavku. Růst chrupavky probíhá dvěma mechanismy: Apoziční růst – fibroblasty perichondria se dělením pomnoží a na ploše přivrácené do nitra chrupavky se diferencují v chondroblasty, které začnou produkovat mezibuněčnou hmotu chrupavky a začleňují se do novotvořené chrupavky. Od hlubokých vrstev perichondria tak přirůstají nové vrstvy chrupavky. (Obr. 9) Intersticiální růst vychází z nitra chrupavky. Je typický pro mladé chrupavky s velkou plasticitou základní hmoty. Podstatou intersticiálního růstu je intenzivní dělení chondroblastů, které jsou obklopeny jen malým množstvím vláken, takže se novotvořené chondroblasty množí do amorfní základní hmoty a zahajují její mohutnou produkci. (Obr. 10) Růst chrupavek je řízen a ovlivňován řadou látek. Hormon předního laloku hypofýzy – somatotropin- urychluje pomocí tkáňového somatomedinu aktivitu buněčného dělení a rychle se množící chondroblasty produkují velké množství mezibuněčné hmoty. Podobný stimulační účinek mají i hormony štítné žlázy, testosteron

10

Obr. 9 – Histologický preparát apoziční růst chrupavky, zdroj www.sci.muni.cz

Obr. 10 – Histologický preparát intersticiální růst chrupavky, zdroj www.sci.muni.cz

a vitamíny C a D. Estrogeny a kortizon mají brzdící účinky na dělení buněk chrupavky a tím i na produkci mezibuněčné hmoty. Z hlediska chemické stavby tvoří chrupavku ze 60 % voda, a ze 40% bílkoviny. Z bílkovin připadá 60 % na kolagen, a 40 % na proteoglykany. Z biomechanického pohledu je chrupavka proto velmi heterogenní směs, která se těžko definuje. Maximální pevnost v tahu dosahuje u chrupavek hodnot, které odpovídají pouze asi 5 % pevnosti kosti. Pružnost chrupavek je závislá na její hydrataci. Nelze ji proto obecněji stanovit – chrupavka se chová jako porézní materál, např. jako houba. Tak jako v houbě, je i v základní hmotě chrupavky vázána voda jen velmi volně. Při zatížení dochází proto v iniciální fázi k poměrně rychlému vytlačení vody ze základní hmoty a tím i ke změně tvaru chrupavky, např. k jejímu oploštění. V následné fázi zatížení se uplatňuje vyšší rigidita vláknité komponenty základní hmoty a tvar chrupavky se již téměř nemění. Toto bifázické chování zatížených chrupavek je velmi významné především pro biomechaniku pohybujícího se kloubu (tření) a pro chování meziobratových destiček.

11

1.3. Rozdělení chrupavky 1.3.1. Hyalinní chrupavka Kloubní, hyalinní chrupavka je nejrozšířenějším typem chrupavky v těle (Obr. 11, 12). Kromě buněk a základní beztvaré hmoty obsahuje velmi tenká kolagenní vlákna, která jsou při běžném histologickém barvení maskována základní hmotou. Buňky hyalinní chrupavky tvoří kulovité ostrůvky nebo se řadí do štíhlých sloupců. Sklovitá chrupavka je porcelánově bílá, velmi tvrdá, hladká, křehká a ve slabších ploténkách je i průsvitná. Kloubní – hyalinní chrupavka tvoří konce žeber, pokrývá kloubní hlavice, tvoří skelet hrtanu, průdušnice, bronchů a vytváří část podkladu nosu. Hyalinní chrupavka je základem skeletu plodu a novorozenec má většinu kostry tvořenou sklovitou Obr. 11 – Schéma histologického řezu hyalinní chrupavkou, zdroj The University of Western Australia

chrupavkou.

Stavba hyalinní chrupavky: Chondrocyty hyalinních chrupavek jsou buňky okrouhlého až vřetenovitého tvaru s krátkými, ostnitými výběžky. Buňky se po dělení nevzdalují a zůstávají ve skupinách, kterým vzhledem ke stejnému původu buněk říkáme izogenetické skupiny. Kolem izogenetických skupin jsou jemná pouzdra tvořená kolagenními vlákny chrupavky a základní hmotou. Chondrocyty hyalinní chrupavky produkují kroObr. 12 – Histologický preparát hylinní chrupavky, zdroj Lakeland Community College

mě amorfní základní hmoty i velmi jemná

12

kolagenní vlákna. Vlákna se na celkovém objemu mezibuněčné hmoty podílejí asi 50%. Tvoří je kolagen II. typu, formující prostorové sítě, které mají u některých chrupavek určitou architektonickou úpravu, odpovídající zatížení chrupavky. V případě kloubních chrupavek jsou typickým architektonickým prvkem arkády vzájemně se křížících vláken. Vlákna v hrtanových chrupavkách se kříží pod různými úhly. Mechanismus, kterým chrupavky distribuují kolagenní vlákna do míst zatížení, a jak probíhá prostorová orientace vláken chrupavky, není známo. Hyalinní chrupavka je vzhledem ke své stavbě ideálním biologickým materiálem pro krytí pohyblivých povrchů – kloubních ploch. 1.3.2. Elastická chrupavka V její struktuře převládají hojná a dobře viditelná elastická vlákna (Obr. 13). Čerstvá chrupavka je žlutavé barvy, je pružná a ohebná. Vyskytuje se ve stěně průdušek, tvoří některé chrupavky hrtanu, je podkladem ušního boltce a části zevního zvukovodu. Čerstvá elastická chrupavka je žlutě zbarvena.

Obr. 13 – Histologický preparát elastická chrupavka, zdroj Histology atlas, Palomar college

13

Stavba elastické chrupavky: Chondrocyty (-blasty) elastické chrupavky jsou buňky podobné chondrocytům hyalinní chrupavky. Jsou ale v celé vrstvě (tloušťce) chrupavky rovnoměrněji rozptýleny a v hloubce chrupavek netvoří izogenetické skupiny. Elastická vlákna chrupavky nemají pravidelnou architekturu a tvoří husté, plsťovité sítě často doplněné i kolagenními vlákny. Elastická chrupavka může být kombinována s hyalinní chrupavkou. Elastická chrupavka je velmi pružná a ohebná. Její pružnost je především dána strukturou elastinu, v jehož molekule jsou jen ojedinělé příčné vazby. Po deformaci se elastická chrupavka vrací do svého původního tvaru. Pružnost chrupavek ovšem ve vyšším věku velmi výrazně klesá. 1.3.3. Vazivová chrupavka Obsahuje kromě menšího množství chrupavčitých buněk hlavně velmi silná kolagenní vlákna. Beztvaré základní hmoty je poměrně málo. Vazivová chrupavka (Obr. 14) je matně bílá a velmi odolná na tlak a tah. Vyskytuje se v nitrokloubních a v meziobratlových destičkách. Je ale přítomná i ve sponě stydkých kostí, tvoří některé chrupavčité destičky (disky a menisky) uvnitř kloubů, povléká kloubní povrchy čelistního kloubu a plochy spojení klíční a hrudní kosti. Stavba vazivové chrupavky: Chondrocytů je ve vazivové chrupavce málo – převažuje vláknitá složka. Kulaté a ovoidní buňky leObr. 14 – Histologický preparát vazivová chrupavka, zdroj Dept. of Anatomy & Cell Biology, Indiana University School of Medicine

14

ží v malých skupinách mezi svazky kolagenních vláken. Amorfní

mezibuněčné hmoty je velmi málo a nestačí zakrýt vazivová vlákna – ta proto ve vzorcích chrupavky dominují. Kolagenní vlákna s velkým průměrem (kolagen I. a II. typu) dodávají vazivové chrupavce velkou mechanickou odolnost v tahu, tlaku i ve zkrutu. Tyto vlastnosti se plně uplatňují především ve stavbě meziobratlových destiček. Z funkčního hlediska lze vazivové chrupavky rozdělit do dvou skupin, 1. meziobratlové ploténky a spona stydkých kostí, které mají svoji stavbou a fyziologickým uplatněním blíže k vlastnostem hyalinních chrupavek, 2. jiné typy vazivových chrupavek, jako jsou disky, menisky, okraje kloubních jamek, které se stavbou i funkcí podobají tuhému vazivu. Tam, kde disky nebo menisky vazivové chrupavky přiléhají ke kloubním pouzdrům, mají z cévních sítí pouzder různě rozsáhlé krevní zásobení. 1.4. Patofysiologie chrupavky Hojení a regenerace chrupavek poškozených úrazem nebo degenerativním procesem je pochod podobný apozičnímu růstu, a je tedy velmi závislý na perichondriu. Do defektu v chrupavce vrůstají z perichondrií nebo z přiléhající kosti cévy a defekt se vyplňuje bohatě vaskularizovaným vazivem. Fibroblasty vaziva se mohou transformovat na chondroblasty, které pak nahrazují poškozenou chrupavku. Dochází ke zvýšení mitotické aktivity spojené s lokálním vzestupem produkce glykosaminoglykanu a kolagenu (Edwards 1967), ve výsledku však nedochází k efektivnímu zhojení defektu. (Mankin 1974). Z klinického hlediska je hojení většiny chrupavek dospělého člověka problematické. Hojení je vždy pomalé a velmi závislé na věku pacienta. Podmínkou obnovy a náhrady pojivových tkání je totiž přítomnost cév (perichondria) a přítomnost krevního oběhu. Tato podmínka je u chrupavek zčásti splněna jen v dětství. Z hlediska hojení chrupavek je určitým paradoxem, že se lépe hojí defekty zasahující až do kostěného podkladu chrupavek, např. do kloubních konců kostí. Kost je totiž u těchto typů zranění zdrojem cév, které zahajují reparativní pochody poškozené chrupavky. Dokud není poraněna i subchondrální kost, není adekvátní odpověď hojení. Pokud

15

je, tak se buňky kostní dřeně rekrutují a vyplňují defekt novou tkání, méněcennou fibrochrupavkou (Mitchell and Shepard 1976, Shapiro et al. 1993). Spontánní regenerace větších defektů kloubních chrupavek, které na kontaktních plochách nemají perichondria, je u dospělých osob prakticky nulová. Do jaké míry se novotvořená tkáň podobá hyalinní kloubní chrupavce záleží na věku, druhu a místu poranění chrupavky, ale kompletní obnovení hyalinní chrupavky a subchondrální kosti je vidět jen velice zřídka, s tím souvisí i rozvoj artrózy. 1.5. Patologie chrupavky 1.5.1 Degenerativní postižení kyčelního kloubu Patří mezi velmi časté postižení chrupavčité tkáně u dospělých. Nosologicky se jedná o osteoarthrosis coxae a osteochondrosis dissecans. Jedná se o degenerativní, pomalé a progresivní onemocnění hyalinní chrupavky synoviálního kloubu. Všechny stavy a procesy, které změní přirozené mikroprostředí kloubu, normální strukturu a funkci chrupavky a tkání, které ji obklopují, mohou vést k preartróze, která vyústí vždy do artrózy. (Obr. 15)

Obr. 15 – Schéma artróza, zdroj www.longevity-medicine.de

Dříve se tato postižení mylně

přisuzovala následku stárnutí, i když věk jedince je poměrně významným predispozičním faktorem. Mezi změny charakterizující stárnutí patří zúžení kloubní štěrbiny jako důsledek částečné ztráty elasticity, proporcionální úbytek kostní hmoty a lehké zmenšení kolodiafyzárního úhlu (CCD). Vznik osteofytů neřadíme mezi projevy stárnutí. Přítomnost degenerativních změn charakteru artrosy nejsou důsledkem vyššího věku, ale vznikly následkem působení dalších patogenetických faktorů v dostatečně dlouhém čase. Dysfunkce a stárnutí vedou k postupnému opotřebení kloubu. Patologické změny kloubní mechaniky jsou projevem

16

dysfunkce, která vzniká následkem preartrotických změn. Jako důležitý se považuje také faktor tkáňové méněcennosti, který je způsoben vrozenými i získanými změnami, mezi které patří úrazy, pooperační stavy, záněty a systémové vady. Musí se myslet i na vrozenou méněcennost chrupavky, která má vliv na mechanickou odolnost tkání, růstový a regenerační potenciál. Časové období přechodu preartrosy v artrózu nelze jednoznačně určit. Většinou donutí pacienty k návštěvě specialisty až déle trvající bolestivost kyčelního kloubu, to je ale artróza většinou již plně rozvinutá. Období klinicky němé skončí, jakmile dojde k vývoji strukturálních změn na Obr. 16 – Artróza kloubů ruky, zdroj www.stemcellclinic.com

kosti nebo pokročilému zúžení kloubní štěrbiny. Mezi jasné známky artrózy patří subchondrální skleróza, snížení kloubní štěrbiny, porucha sféricity a nerovnost kloubních ploch, nepravidelnost trabekulárního systému spongiózy, cystické subchondrální změny a tvorba

Obr. 17 – Artróza kloubů ruky, zdroj www.stemcellclinic.com

osteofytů na okrajích kloubních ploch. (Dungl 2005) Artrózu rozlišujeme primární idiopatickou a sekundární. Primární začíná častěji u žen středního věku. Postihuje drobné klouby ruky, krční a be-

Obr. 18 – Artróza kloubů ruky, zdroj www.stemcellclinic.com

17

derní páteře a rovněž kyčelní

a kolenní kloub (Rozkydal 2007). (Obr. 16, 17, 18, 19) Znaky primární artrózy a její projevy jsou subchondrální skleróza, snížení kloubní štěrbiny, inkongruence kloubních ploch, porušení pravidelnosti spongiózy, subchondrální změny a tvorba osteofytů na okrajích kloubních ploch (Dungl 2005). Sekundární artróza postihuje pacienty nejčastěji kolem 40. roku života, je častějším postižením než postižení primární. Stav se vyvíjí z preartrotického stavu a je od artrózy zřetelně odlišen. Zahrnuje postižení kloubu se zjevnou příčinou. Její výskyt je v současnosti vyšší než u artrózy idiopatické. U se-

Obr. 19 – Rtg artróza kolena zdroj www.sportmedizin-samedan.ch

kundární preartrózy je zachová-

na normální šíře kloubní štěrbiny, nejsou přítomny degenerativní strukturální kloubní změny a chybí produktivní změny. Mohou se vyskytovat subchondrální cysty jako obraz tkáňové méněcennosti. Změny v tomto stavu mohou být ještě reverzibilní, ale po určitém čase tento vyústí v pravou artrózu. Nejčastější příčinou je kyčelní dysplázie s procentuálním zastoupením mezi 20–50% dle různých zdrojů, dále pak koxitídy různé etiologie- metabolické poruchy, systémová onemocnění, hormonální dysbalance, opakované krvácení do kloubu u hemofilie, osteonekróza hlavice, zánětlivé procesy a nezanedbatelný vliv mají i mechanické faktory a jejich následky (např. při inkongruenci kloubních ploch zejména při coxa vara congenita, u stavu po vývojové dislokaci kyčelního kloubu, při nadváze a po traumatu). Nejčastější formou osteoartrotického procesu je superolaterální forma zastoupená v 60 % případů, která vede k destrukci hlavice proximálního femoru. (Obr.20) Méně častou formou zastoupenou 25 % je mediokaudální forma, která často

18

Obr. 20 – Rtg coxartrosa, zdroj www.achot.cz

způsobuje snížení CCD a retroverzi hlavice proximálního femoru. Mezi typické příznaky patří bolest v kyčli při flexi a addukci s omezením zejména zevní rotace. Dále se může dělit na typ hypertrofický (osteoproduktivní) s výraznou produkcí osteofytů a subchondrální kostní sklerózou a atrofický se značným úbytkem kosti i chrupavky, zúžením kloubní štěrbiny a lytickou destrukcí hlavice. Další dělení koxartrózy je dle závažnosti dle Kellgrena-Lawrence I. stadium: zúžení kloubní štěrbiny mediálně a počátek tvorby osteofytů II. stadium: určité snížení kloubní štěrbiny mediálně a počátek tvorby osteofytů v okolí hlavice III. stadium: kloubní štěrbina je výrazně zúžena s přítomností osteofytů, sklerotických změn, detritové cysty hlavice i acetabula, deformace tvaru hlavice i acetabula IV. stadium: vymizení kloubní štěrbiny se sklerózou a cystami, pokročilá deformace hlavice i acetabula (Rozkydal 2007, Dungl 2005). Artróza postupuje v několika stupních. Nejprve dochází k rozvláknění a změknutí hyalinní chrupavky, která později zcela zaniká. Dalším následkem jsou změny na subchondrální kosti, ta se skleroticky zahušťuje a zmnožuje, což

19

snižuje její odolnost vůči zátěži a může pak snadněji docházet k frakturám. V takto vytvořených zlomeninách se tvoří cysty, které jsou ohraničeny sklerotizovanou spongiózní kostí s aktivovanými osteoklasty. Cysty jsou vyplněny obvykle fibrózní tkání a synoviální tekutinou, kostní drtí nebo organizovaným hematomem. Na okraji kloubního povrchu jsou vytvořeny osteofyty, které mají rozšířit kloubní spojení a tak jej stabilizovat. Synovialis může obsahovat i ložiska chrupavčitých buněk, které vznikají metaplázií synoviální membrány, nebo se zde zachytily části rozpadlé chrupavky. Ložiska se mohou uvolňovat jako kloubní myšky. Degenerovaná měkká chrupavka je nakonec zcela mechanicky obroušena až na subchondrální kost, která výrazně sklerotizuje. (Rozkydal 2007) 1.5.2 Disekující osteochondróza kyčelního kloubu Disekující osteochondróza hlavice kosti stehenní může vznikat na primárně zdravé hlavici nebo častěji ji pozorujeme u Perthesovy choroby, u postdysplastické avaskulární nekrózy či po koxitidách. Popisuje se i familiární výskyt, který je však poměrně vzácný. Rozlišujeme dvě formy: 1. Idiopatická forma je zpravidla oboustranná, vyskytuje se u adolescentů, častěji mužského pohlaví, může být i součástí generalizované osteochondrosis dissecans, kdy disekáty nacházíme kromě kyčle i na mediálních kondylech femurů a na kladce talu. Druhý vrchol je poté popsán v 5. deceniu. 2. Sekundární forma je častější, bývá jednostranná. Vyskytuje se již u mladších dětí, můžeme ji vidět jako asymptomatické reziduum již ve věku 5–7 let, který zpočátku nečiní obtíže. Jde o kostní sekvestr, krytý normální kloubní chrupavkou, která je v místě disekátu vkleslá. Disekát může mít různou velikost od několika mm až po podstatnou část hlavice. Sekvestr je spojen s okolní vazivovou tkání. V adolescentním období se objevují nespecifické bolesti kyčelního kloubu, častěji po větší mechanické zátěži s projevy šetření postižené strany. Většinou nedochází k blokádě kloubu. Z terapeutického hlediska se

20

doporučuje odlehčení postiženého kloubu, pokud je stav v pokročilém stadiu, pak následuje ošetření disekátu, jeho elevace, odstranění sklerózy z lůžka, autospongioplastika a fixace resorbovatelným materiálem. (Dungl 2005) 1.5.3 Idiopatická avaskulární nekróza hlavice kosti stehenní Osteonekróza je chorobný proces charakterizovaný dosud ne zcela vysvětlenou poruchou nitrokostní cirkulace. Postihuje převážně muže ve věku 30–40 let, ale neohrožuje život. Léčebná metoda pomocí kloubních náhrad vykazuje vysoké procento selhání. Postupným odumíráním buněk dochází ke vzniku

Obr. 21 – Rtg avaskulární nekróza hlavice, zdroj www.gait.aidi.udel.edu

21

venostázy a edému, tím se zvyšuje nitrokostní tlak a periferní odpor, perfúze dále klesá a začarovaný kruh se uzavírá. Proces je pomalý, ale končí nekrózou. Nekrotická tkáň postupně ztrácí pevnost a kolabuje, což vede ke ztrátě kloubní kongruence a vývoji degenerativní artrózy. (Dungl 2005) (Obr. 21) 1.5.4 Chondrolýza Vyskytuje se na kyčelním kloubu jako idiopatická nebo sekundární jako komplikace u coxa vara adolescens. Manifestuje se jako nekróza kloubní chrupavky, která se projeví jejím snížením až vymizením. Virtuální kloubní štěrbina na RTG snímku kyčelních kloubů vymizí nebo se zmenší. Tento stav souvisí s terapii coxa vara adolescens, kdy implantát penetruje do kloubu, podkladem může být i autoimunitní reakce v rámci coxa vara adolescens (CVA). V klinickém obraze nastává zmenšení rozsahu pohybů v kloubu, kloub je fixován ve flexi, abdukci a zevní rotaci. Proces je často spontánně reverzibilní. V léčbě se uplatňuje odtížení kloubu a rehabilitace. (Poul et al.2009) 1.5.5 Disekující osteochondróza kolenního kloubu Disekující osteochondróza (osteochondrosis dissecans OCD) je lokální aseptická nekróza subchondrální kosti postihující kloubní povrch. (Obr. 22) Kloubní chrupavka nad defektem je vyživována ze synoviální tekutiny. Postupně dochází k resorpci nekrotické kosti a chrupavka ztrácí svou opěrnou strukturu. Dále pak dochází k uvolnění fragmentu do kloubní štěrbiny.

Obr. 22– Rtg kolena osteochondrosis dissecans

22

U OCD rozlišujeme variantu juvenilní (u pacientů do 15 let s přítomnou růstovou zónou) a adolescentní (věk nad 15 let nebo s uzavřenou růstovou štěrbinou). Postižení je ve 20–30% oboustranné, proto je důležité při podezření na tuto diagnosu provádět vyšetření i druhé končetiny. Nejčastěji postižená místa jsou dle incidence sestupně femorální kondyly, kloubní plochy talu a kapitulum humeru. Kolenní kloub je postižen v 75 %, zátěžová plocha mediálního femorálního kondylu v 85%. Byly zaznamenány i vícečetné defekty. Zřídka se toto postižení vyskytuje i na patele, hlavici femoru, lopatce, tibiálním platu, hlavičce talu a obratlech. Nejčastěji bývají postiženi dospívající chlapci, značně tělesně aktivní (atletika, basebal, basketbal) ve věku 10 až 20 let.(Hixon et Gibbs 2000) Muži bývali postiženi 2–3× častěji než ženy, avšak v poslední době vzrůstá počet tohoto postižení i u dívek ve stejné věkové kategorii. Důvodem může být stále častější zapojování dívek do vrcholových sportovních aktivit. Příčinnou je nejčastěji opakující trauma (např. narážení tibiální eminence na laterální okraj mediálního kondylu femuru při vnitřní rotaci tibie), dále ischémie, abnormální osifikace epifýz, konstituční a genetická predispozice. Všeobecně se považuje její vznik za multifaktoriální s opakujícím se střihovým nebo kompresivním mechanismem mikroporanění. Většina pacientů nemá v historii žádné signifikantní poranění, ale spíše opakující se mikrotraumata, kteObr. 23– Schéma místa nejčastějšího výskytu OCD léze, zdroj Dungl a kol. Ortopedie

23

rá vedou ke stresu subchondrální

kosti, zejména u atletů. Ale díky 30% incidenci oboustranného postižení na nezátěžových plochách, je třeba brát v úvahu i vznik spontánní. Svou roli může hrát i ischemie způsobená vasospasmem, tukovou embolii, infekcí nebo trombózou. Nejčastější lokalizací je mediální kondyl femuru cca v 80 % (Obr. 23), méně často laterální kondyl femuru (15 %), raritně pak patela a ostatní klouby. (Dungl et al 2005) Dle postižení kloubní chrupavky a stability tkání pod ní rozlišujeme 4 stadia. I. a II. stadium popisuje stabilní léze, III. a IV. stadium popisují nestabilní léze, kde se nitrokloubní tekutina nachází mezi fragmentem a pod ním ležící subchondrální kostí. Diagnostika spočívá v rtg vyšetření postiženého kloubu i jeho protějšku na druhé straně, při positivním nálezu se stav verifikuje magnetickou resonancí (MR). (Obr. 24) MR má 97 % sensitivitu pro detekci nestabilních lézí. V případě juvenilní formy je ve 30 % postižen i párový kloub, úraz nebývá hlavním etiologickým faktorem, léčba je konzer-

Obr. 24 – MR lokte-osteochondrosis dissecans, zdroj www.aap.org

vativní a prognóza dobrá. Dívky

mladší 11 let a chlapci mladší 13 let mají vynikající prognózu a výsledky konservativní léčby. Adolescentní forma již většinou vyžaduje terapeutický zásah, pokud postupujeme konzervativně tak u pacientů starších 20let jsou výsledky výrazně horší. Úraz je hlavním vyvolávacím faktorem a prognóza je zatím přes všechny moderní postupy horší. Prognóza se zhoršuje s věkem a uzavíráním růstových štěrbin, proto by měl být léčebný postup proveden před dokončeným růstem pacienta. V případě konzervativní léčby je třeba vynechat soutěžní sporty na 6 až 8 týdnů a pohybovou aktivitu pacienta přesměrovat na denní zátěž, která nevyvolává symptomy onemocnění. Vhodná je i rehabilitační péče. Imobilizace

24

končetiny je metodou zastaralou, která vedla k atrofiím kvadricepsu. V případě nutnosti chirurgické intervence je metodou volby artroskopická vizualizace povrchu chrupavky a stabilizace léze. Při výskytu volného fragmentu v kloubu (myška) následuje jeho extrakce. (Šnajdauf et al 2002) Dále se provádí debridement chrupavky a návrt defektu k podpoře revaskularizace. Pokud není fragment odloučen od léze provádí se jeho stabilizace vstřebatelným nebo nevstřebatelným osteosyntetickým materiálem. Defekt se téměř vždy zhojí méněcennou tkání. Vždy musíme brát v potaz riziko vzniku následné osteoartrózy postiženého kloubu. Ideální způsob léčby je takový, který vede k obnovení hyalinní chrupavky na povrchu poraněného kloubu. Současná medicína zná několik terapeutických postupů vedoucích k částečnému obnovení architektoniky kloubní chrupavky v místě léze a několik technik excize poraněné části kloubního povrchu a transplantace biologické náhrady. (Benjamin 2009) Jsou používány abrazivní metody (mikrofraktury, návrty), které předpokládají obnovení kloubní chrupavky vycestováním buněčných progenitorů po prolomení subchondrální kosti z dřeňové dutiny do místa defektu. Pokud je zachyceno poranění včas, je také možné osteochondrální fragment fixovat a obnovit kongruenci kloubního povrchu. Při náhradě poškozeného kloubního povrchu bývá užíváno metody mozaikoplastiky osteochondrálním autoštěpem nebo jinými autologními tkáněmi, nověji transplantace autologních chondrocytů, které se jeví jako velmi perspektivní v procesu hojení směrem k hyalinní chrupavce. Problémem zůstává metodika retence transplantátu v defektu. 1.5.6. Poranění chrupavky kolene Osteochondrální a chondrální zlomeniny jsou běžné a typické úrazy postihující mladou a pohybově aktivní populaci. Při poranění samotné chrupavky se jedná o její okrskové léze postihující buď jen částečně její tloušťku nebo jí poraní v celém rozsahu a zasahuje až k subchondrální kosti, která je neporušena. Vznikají nejčastěji na mediálním a laterálním kondylu femuru a na patele,

25

většinou přímým mechanismem (náraz na koleno) nebo nepřímým mechanismem kompresně rotačními silami. Klasifikujeme na kontuzi (subchondrální hematom, figura), impresi ( impresní zlomenina, pérující imprese, imprese kloubní hrany) a zlomeniny ( izolovaná chodrální zlomenina, osteochondrální zlomenina). Příznaky závisí na typu poranění. Pohybuje se od negativního nálezu, přes neurčitou bolest s omezenou hybností, napodobující lézi menisku, instabilitu kloubu až po haemarthros, což značně stěžuje diagnostiku. Často se však jedná o náhodné nálezy při artroskopii, která je spolu s MR postiženého kloubu spolehlivou diagnostickou metodou. Menší volné fragmenty se operativně odstraní, větší se refixují. K ošetření hlubokých defektů chrupavky se používají různé metody. Abraze, návrty a mikrofraktury spodiny defektu stimulují subchondrální kost k tvorbě vazivové chrupavky. 1.6. Diagnostika postižení kloubní chrupavky Základním diagnostickým vyšetřením je stále klinické vyšetření pacienta, resp. jeho postiženého kloubu. Po stanovení hypotézy jsou k dispozici pomocné vyšetřovací metody, které nám upřesní typ a rozsah postižení. Diagnostika postižení kloubní chrupavky začíná provedením prostého rtg snímku kloubu postižené oblasti, který nám ukáže eventuelní poranění kostěného skeletu. Další relativně dostupnou, šetrnou a důležitou diagnostickou zobrazovací metodou je vyšetření sonografické, to nám vypovídá daleko více o stavu měkkých tkání kloubu. Další metodou, která nám velice podrobně vypovídá o stavu měkkých tkání kloubu je magnetická rezonance, která má své limitující faktory a není kdykoliv dostupná jako předchozí metody. Pro konečnou verifikaci postižení provádíme artroskopické vyšetření kloubu, při němž jsme schopni postižení nejen přesně diagnostikovat, ale provádět i různé terapeutické výkony.

26

1.7. Současné možnosti léčby poranění kloubní chrupavky Kloubní chrupavka není v dospělosti zásobena cévně, ani v ní neprobíhá lymfatická tkáň. Poranění kloubní chrupavky má velice malý potenciál hojení a často vede k nitrokloubnímu krvácení. (Calandruccio et Gilmer 1962, Convery et al.1972, Mitchell et Shepard 1976, Hardaker et al. 1990) Není napojena na homeostatický systém těla. Ve skutečnosti jsou chondrocyty skryté i před imunologickým účinkem extracelulární matrix. Ačkoliv buňky udržují produkci extracelulární matrix celý život, neefektivně odpovídají na poranění. Poranění ohraničené pouze na chrupavku samotnou, bez poranění subchondrální kosti, vyvolá jen mírnou hojivou reakci přilehlých chondrocytů. Nepřítomnost cév má však pro chrupavku i jeden pozitivní důsledek. Chrupavky vykazují velmi nízkou antigenicitu, to umožňuje využívat chrupavek nejen jako homo-, ale i jako heterotransplantátu. Současné metody se dělí na dva základní proudy. První z nich směřuje k restauraci poraněné chrupavky a obnovení kloubní plochy stimulací vlastních reparativních procesů, druhý k náhradě buď pouze excidované léze nebo celého kloubu. Volba metody závisí na charakteru léze, jejího rozsahu a zejména na věku pacienta. (Rand et Ilstrup 1991) K běžnému ošetření chondrální léze patří abraze a metoda mikrofraktury (nepřímé nárazy tupým hrotem) (Detterline et al.2008), (Obr. 25) nebo přímé či retrográdní návrty (nejčastěji se používá Kirschnerův drát). (Kon 2008) (Obr. 26) Metody vycházejí z faktu, že kloubní chondrocyty sídlí v avaskulárním prostředí bez přístupu mediátorů zánětu a elementů procesu hojení. Při poškození subchodrální kosti dojde ke spuštění hojení migrací pluripotentních Obr. 25 – Artroskopie kolena – ošetření léze chrupavky metodou mikrofraktury

buněk kostní dřeně. U pacientů do 12 let

27

Obr. 26 – Experimentální ošetření léze chrupavky metodou forrage, zdroj archiv autora

Obr. 27 – Artroskopické vyšetření kolena – archív autora

28

se takto ošetřuje až léze větší než 20mm v průměru, přednostně artroskopicky (Obr. 27), menší léze lze v tomto věku ponechat spontánnímu hojení. U starších dospívajících je indikací k takovémuto výkonu již léze 10mm v průměru, zejména pak na zátěžové ploše. Průkazně lepší hojení bylo u pacientů do 40let. Již Meachim provedl pokus na králičích kolenech a vytvořil defekty v kloubní chrupavce s obnažením subchondrální kosti. Ani po 2 letech nedošlo k úplnému zahojení plnohodnotnou chrupavkou. (Meachim 1963.) Další experiment potvrdil i na modelu koně, že defekt vytvořený v chrupavce zasahující subchondrální kost se hojí vazivovou chrupavkou. (Vachon et al. 1986). Jako doplňující léčba bývá používáno několik postupů vedoucích k podpoře hojení chrupavky. Jde zejména o kontinuální pasivní pohyb kloubu, laser (studií prokázán přínos excimer laseru), systémová, intraartikulární nebo lokální farmakoterapie (kortikosteroidy, hyaluronová kyselina nebo růstové faktory), výjimečně elektrická stimulace (přínos není jednoznačně potvrzen). (Planka et Stary 2008) V případě časného záchytu uvolněného osteochondrálního fragmentu je nejlepší metodou léčby artroskopická nebo otevřená stabilizace úlomku (ošetření spodiny lůžka, dle potřeby spongiózní plomba a fixace šroubkem nebo kostními či vstřebatelnými hřebíčky). Pokud již tvoří sekvestrovaný disekát volnou „myšku“ v kloubu, je nutná její extrakce. (Obr. 28) Metody, které vedou k odstranění rozsáhlé léze kloubního povrchu implantací kloubní náhrady jsou indikovány zejména ve věku 40–65 let. Zcela běžným postupem je autologní mozaikoplastika, prováděná s výhodou i artroskopicky. (Obr. 29) U pacientů s otevřenou růstovou ploténkou je tento výkon kontraindikován, vzhledem k nebezpečí jejího poranění při odběru osteochondrálních štěpů. Výsledky jsou lepší než při abrazních metodách, občas jsou popisovány vzniklé drobné nitrokloubní osteofyty. (O'Driscoll, S.W. 1998) Variantou uvedeného postupu je periostální artroplastika s použitím periostálního štěpu umístěného kambiovou vrstvou směrem ke kloubnímu povrchu nebo perichondriální artroplastika výplní defektu chrupavkou odebranou ze žeberního oblouku.

29

Obr. 28 – Rtg hlezna – myška v hlezenním kloubu

Obr. 29 – Mozaikoplastika defektu chrupavky kolena, www.surreryorthoclinic.co.uk

Zcela novou možnost přineslo tkáňové bankovnictví a příprava autologního chondrocytárního štěpu. Transplantace vlastních kultivovaných chondrocytů je komplikována na kloubním povrchu s vysokou mechanickou zátěží. (Obr. 30) Standardním postupem je tedy opět překrytí štěpu periostálním lalokem nebo Obr. 30 – Schéma transplantace chondrocytů do defektu chrupavky mediálního kondylu tibie, zdroj www.luotain.uku.fi

lalokem ze svalové fascie. Avšak ani tyto studie nepřináší převratné výsledky hojení ve smyslu tvorby hyalinní chrupavky v celém rozsahu transplantace.

1.8 Moderní trendy v léčbě poranění a degenerativních onemocnění kloubní chrupavky Dnešní experimentální ortopedie a traumatologie hledá další metody léčby defektů kloubní chrupavky vedoucí k úplné regeneraci původní tkáně se zachováním stejných funkčních vlastností, které měla tkáň před poraněním. Již

30

v předchozím textu byly zmíněny stromální kmenové buňky kostní dřeně, které po abrazním výkonu vycestují ze subchondrální kosti do defektu a jsou základem pro novou tkáň. Při současných možnostech odběru a manipulace s mesenchymovými buňkami kostní dřeně (MSCs – Mesenchymal stem cells) je možné připravit autogenní nebo allogenní transplantát progenitorů hyalinní chrupavky. Navíc při neustále se prohlubující znalosti chondrogeneze je možné již in vitro poměrně přesně MSCs směrem k chondrocytům v diferenciaci nasměrovat . To vše je předpoklad pro primární hojení defektu kloubní plochy. V experimentech se intenzivně řeší problematika mechanické stability transplantátu v komplikovaných podmínkách kloubního povrchu, což je hlavní problém tohoto léčebného postupu. V tomto směru se otevírá prostor pro širší spolupráci s bioinženýry a techniky, kteří jsou schopni připravit materiály s takovými biologickými vlastnostmi, aby tvořili kmenovým buňkám dostatečnou oporu a přísun výživy, než dojde k zapojení do cílové tkáně, tzv. nosiče (skafoldy). Ideální nosič by měl nejen dopravit nakultivované MSCs do tkáně, ale měl by jim také dodávat příslušné bioaktivní faktory, které budou podporovat proliferaci, specifickou cestu diferenciace, produkci specifické ECM (ECM – extra cellular matrix) a konečně také tkáňovou modulaci vedoucí k podpoře funkční regenerace. Teoreticky by multifunkční skafold mohl sloužit jako reservoár cytokinů a biologických faktorů, které by byly postupně uvolňovány, aby přitahovaly lokálně umístěné a cirkulující MSCs do místa určení. Navíc má ideální skafold podobnou mechanickou strukturu, jako cílová tkáň, aby mohl sloužit jako dočasná náhrada tkáňového defektu. (Gao et al.2007) V případě kloubního povrchu je mechanická stabilita transplantátu a možnost jeho retence v defektu po implantaci stěžejní. Nabízí se dvě základní varianty ideálního skafoldu pro kloubní povrch. V prvním případě by šlo čistě jen o náhradu tenké vrstvy chrupavky v patřičném nosiči, který by svoji elasticitou splňoval vlastnosti chrupavky a netraumatizoval tak protější kloubní plochu. Udržení implantátu s MSCs by pak zajišťoval centrálně vedený vstřebatelný hřebíček, tkáňové lepidlo nebo jiný způsob. Druhou možností by byl pevný skafold, který by se metodou „press and fit“ zaváděl do odvrtaných defektů podobně

31

jako u mosaikoplastiky. Uvedený skafold by měl mít pevnou strukturu v té části, která má být pevně ukotvená v kosti, povrchová část otočená ke kloubnímu povrchu by naopak měla být šetrná k protilehlé kloubní chrupavce. K moderní radikální léčbě nevratně postiženého kyčelního kloubu patří jeho totální náhrada. Tato moderní metoda nabývá stále většího významu se zvyšující se průměrnou délkou života. Podle amerických autorů potřebuje endoprotézu kyčelního kloubu 306 mužů na 100000 ve věku 65–74 let a 421 žen ve věku mezi 75. až 84. rokem věku vztaženo na 100 000 žen této věkové kategorie. Jde o primární koxartrózu a v našich podmínkách jsou tyto počty modifikované věkovým složením obyvatelstva a vysokým, až 40% podílem sekundární, zejména postdysplastické koxartrózy. Ročně je v naší republice implantováno více než 10.000 kyčelních endoprotéz, s očekávaným stárnutím populace se toto číslo bude stále zvyšovat. Ještě v roce 1989 byla v České republice implantována totální endoprotéza (TEP) kyčelního kloubu jen zhruba u 2500 pacientů, tato operace byla vyhrazena klinickým a větším ortopedickým pracovištím. (Dungl 2005) (Obr. 31 )

předoperační snímek - koxartrosa vpravo

pooperační snímek – po implantaci TEP

Obr. 31 – TEP, zdroj www.achot.cz

32

stav po 66 měsících od operace

Endoprotézy kyčelního kloubu byly uvedeny do běžné klinické praxe koncem šedesátých let minulého století a jejich základní princip i technika implantace prodělaly značné změny. Základem zůstává jamka, vyrobená z vysokomolekulárního polyetylenu pevně ukotvená do vyfrézovaného acetabula kostním cementem, a femorální dřík, vyrobený z ušlechtilé slitiny nebo korozivzdorné oceli, zacementovaný do lůžka v proximálním femuru. Cement umožňoval okamžitou pevnou fixaci implantátu do kosti, a tím dovoloval i časnou zátěž. Během dalších desetiletí se měnil tvar jednotlivých komponent, jejich materiálové složení i způsob ukotvení do kosti. Principem však zůstalo nízké tření mezi kulovou hlavičkou femorální náhrady a jamkou acetabula. V 80. letech dvacátého století byly do klinické praxe zavedeny necementované implantáty, materiálově začal převládat titan, hlavičky se začaly vyrábět z korundové nebo zirkoniové keramiky. Každý nový typ endoprotézy byl spojován s nadějemi na delší trvanlivost a snadnější způsob implantace. Tyto kontroverze týkající se optimálního způsobu fixace acetabulárních i femorálních komponent však u vybraných skupin pacientů stále trvají. Byla objevena role otěrových částic v selhání implantátů a s tím získala na důležitosti diskuse o prevenci osteolýzy, způsobené polyetylenovým granulomem. Z historického hlediska si můžeme techniku cementování při implantaci endoprotéz rozdělit do tří období. Rozdíly jsou dány způsobem aplikace kostního cementu a úpravě kontaktního povrchu femuru i acetabula, typ a tvar implantátu hrají v tomto případě sekundární roli. První je generace cementovaných endoprotéz, kdy po neúspěších s teflonem byl doporučen k výrobě acetabulárních komponent polyetylen, k přístupu ke kyčelnímu kloubu se odtínal velký trochanter, který se refixoval distálněji a laterálněji oproti původnímu místu originální tahovou kličkou. Počet selhání vykazuje lineární křivku s 1% ročním přírůstkem reimplantací, s přežíváním asi u 80 % po dobu 15–20 let. Cementované acetabulum vydrželo méně než femorální komponenta v poměru dvě ku jedné. Lineární opotřebení acetabulární komponenty dosahovalo v průměru 0,1 mm ročně. Cementované dříky mají oblý tvar, aby nedocházelo k tlakovým trhlinám v cementu a liší se v základním tvaru podle techniky či spíše filozofie cementování.

33

S rozšířením indikací na mladší pacienty, např. posttraumatické koxartrózy s defektem acetabula, dysplastické kyčle a kyčle s různou kostní patologií, se podstatně zvyšuje riziko uvolnění. V sérii 680 kyčlí bylo časné uvolnění (do 10 let) vždy spojeno s kostním defektem acetabula, jako vývojovou dysplazií, frakturou acetabula nebo protruzní koxartrózou. Pozdní uvolnění se vyskytlo u 56 % případů s opotřebením jamky větším než 2 mm. Dalším rizikovým faktorem je mladší věk v době implantace. Dlouhodobě je pravděpodobnost revize do 20 let u 27 % pacientů mladších 59 let v době implantace, 13 % pro věkovou skupinu 60–65 let a 7,5 % pro 66 leté a starší. Další rizikové faktory představují nadváha, mužské pohlaví, vysoká aktivita pacienta a diagnóza osteonekrózy hlavice. (Dungl 2005) Názory na rozhraní cement-kost rovněž prodělaly s dvacetiletou zkušeností svůj vývoj. Při normálním průběhu se během 6–12 měsíců vytvoří kolem cementu denzní neokortex. Tento tvrdý lem je od cementu oddělen tenkou radiolucentní vrstvou, která byla považována za vazivovou membránu. Vyšetřením post mortem odebraných vzorků (průměrně za 17 let od operace při asymptomatickém průběhu po celou dobu života pacienta) bylo zjištěno, že kost je v přímém kontaktu s povrchem cementu a popisovaná vazivová membrána byla pouze vzácně patrná. Denzní neokortex (tvrdý lem) byl spojen s původní kortikalis, na kterou naléhal cement, kostními trámečky, původní kortikalis byla porotická a ztenčelá. Z toho lze usuzovat, že tenká zóna projasnění kolem cementu je výsledkem endostální a kortikální remodelace a je známkou dobré funkce endoprotézy. Platí to stejně pro cementované i necementované implantáty. Vazivová membrána mezi cementem a kostí obsahuje histiocyty, jejichž činností, po indukci fagocytovanými otěrovými partikulemi, dochází k tvorbě agresivního granulomu a osteolýze a vzniká tak tzv. měkký lem. Při původním cementování, později označeném jako cementování první generace, byl kostní cement (polymetylmetakrylát) do vyfrézovaného acetabula i do femorálního lůžka zaváděn manuálně po vypláchnutí od kostní drtě a vysušení. Tlak na jamku během tuhnutí cementu měl být mírný, aby nedošlo k asymetrickému rozložení cementu.

34

Do femuru se cement vkládal po vypláchnutí a vysušení lůžka zformovaný do válečku, do vyfrézované kavity se pak vložila hadičková drenáž delší o 1 cm než dřík endoprotézy, aby se cementová vrstva dostala až pod hrot dříku. Cement se pěchoval do femuru ukazovákem, po naplnění lůžka se utlačil palcem. Později se vkládal asi 1-2 cm pod apex dříku bloček spongiózy nebo cementový bolus, aby cement mohl být účinněji upěchován. V dalším vývoji se doporučovalo vytvořit difuzní obal cementu kolem celého dříku nejméně 2 mm silný, což znamenalo udržení dříku ve středu dřeňové dutiny apikální a někdy i proximální centralizační pomůckou. Cementování druhé generace spočívá v podstatě v používání cementové pistole k retrográdní výplni femorálního lůžka endoprotézy, uzavření dřeňové dutiny zátkou, která současně zajišťuje centrické postavení apexu dříku a v používání pulzující laváže k vyčištění femorální dutiny. Tento pokrok v cementování přinesl snížení počtu selhání femorální komponenty při stejném počtu selhání části acetabulární. Cementování třetí generace obsahuje všechna zlepšení předchozí s akcentem na přípravu cementu a zvýšeni pevnosti spojení cement-implantát. Snaha o snížení porozity cementu, která vzniká příměsí bublinek vzduchu, vedla k míchání cementu ve vakuu a jeho centrifugaci, zvýšení pevnosti spojení cement-implantát bylo dosaženo povrchovou úpravou implantátů. U některých evropských typů je místo leštěného povrchu proximálni část nebo celý dřík zhrubělý nebo pokrytý tenkou vrstvou polymetylmetakrylátu. Zvýšení rotační stability změnou tvaru dříku ve spojení s pevnější vazbou cementu na povrch endoprotézy má ještě více zmenšit pravděpodobnost selhání. Pokus o zvýšení životnosti cementované acetabulární komponenty přidáním povrchové kovové skořepiny se neukázalo jako šťastné řešení. Při srovnání dvou skupin - klasická polyetylenová jamka a jamka s kovovou výztuží se stejným typem cementovaného femorálního dříku a s hlavicí o průměru 28 mm, vyšla jako úspěšnější klasická celopolyetylenová jamka. Základem dlouhodobých dobrých výsledků je kvalitní fixace endoprotézy do kosti. Tato fixace (stabilita) prochází během životnosti cementované i necementované endoprotézy vývojem, který můžeme rozdělit do tří stadií:

35

1. Primární stabilita (primární fixace) fixuje endoprotézu bezprostředně po implantaci a její trvání je ohraničeno dobou 3 měsíců. Závisí zejména na správné operační technice (příprava lůžka, volba správné velikosti komponent, správné ukotvení implantátů). 2. Sekundární stabilita nastupuje po primární a představuje vrůstání kostních trámců do povrchové struktury necementovaného implantátu, je závislá na vlastnostech použité povrchové úpravy a materiálu. U cementovaných endoprotéz je to proces, který se nazývá endostální a kortikální remodelace. Probíhá několik prvních let od implantace. 3. Terciární stabilita, k níž dochází za 5–10 let od implantace, představuje optimální osteointegraci endoprotézy, kdy se kost remodeluje podle zátěže. Závisí na reakci na otěrové částice, uvolnění cementu, na kvalitě použitého materiálu a konečně i na reakci tkáně hostitele. (Dungl 2005) Necementované endoprotézy Necementované endoprotézy byly navrženy již koncem šedesátých a počátkem sedmdesátých let 20. století, ve zvýšené míře se začaly používat v 80. letech s cílem snížit počet selhání a usnadnit reimplantaci bez zbytečných ztrát kosti a nesnadného odstraňování cementu. Vycházelo se z předpokladu, že zmenšením kostní resekce a přesným usazením obou komponent do vyfrézovaného lůžka dojde k těsnému kontaktu endoprotézy se spongiózní kostí, což umožní vrůstání kostních trámců do strukturovaného povrchu femorální i acetabulární náhrady pochodem, který byl označen jako vazebná osteogeneze. K aktivaci osteoblastů je povrch kromě rozmanité drsnosti ještě u některých výrobků opatřen tenkou vrstvou hydroxyapatitu s cílem urychlit spojení kosti hostitele s povrchem implantátu, který má být inkorporován do novotvořené kosti. Stejně jako u cementovaných náhrad je snahou eliminovat tvorbu vazivové membrány, obsahující histiocyty, které hrají významnou roli v indukci osteolýzy, a tím i uvolnění implantátu. Primární stability je dosaženo na rozdíl od cementovaných náhrad press-fit mechanismem, zaražením dříku femorální náhrady do přesně padnoucího lůžka. Aby fixace necementované endoprotézy

36

byla pevná a trvalá, musí primární stabilita přejít ve stabilitu sekundární, které je dosaženo vrůstem kosti do povrchu implantátu. Proto je doporučováno odlehčení po dobu nejméně 3 měsíců, které se však v praxi při bezproblémovém průběhu stejně nedodržuje. (Dungl 2005) V současnosti se operace TEP kyčle stala základní ortopedickou operací. S tímto zvýšením souvisí i růst nákladů. V našich podmínkách představují ceny implantátů asi 80 % z ceny výkonu včetně průměrné doby hospitalizace a léků při nekomplikovaném průběhu. S vyrovnáním poměrů v našem státě a zemích Evropské unie se dá očekávat prudké zvýšení cen lékařského výkonu i služeb, takže cena implantátu bude činit asi 30 % z ceny výkonu. V roce 2001 dosahovaly náklady na standardní TEP asi 7000 USD, v západní Evropě jsou poměry obdobné. Nutno si však uvědomit, že doba pobytu na nemocničním lůžku je zhruba poloviční a do nákladů se nepočítá následná rehabilitační péče na levnějším lůžku. (Dungl 2005) Náš experiment by mohl přispět k dalšímu výzkumu nahrazení postižené kloubní chrupavky vhodným nosičem s kmenovými buňkami a dokonalejšímu způsobu zhojení chrupavky kyčelního kloubu s obnovením jeho funkce. 1.9. Kmenové buňky Jsou základní stavební jednotkou mnohobuněčných organismů a vyznačují se dvěma základními funkcemi. Mohou tvořit další kmenové buňky a mají schopnost se diferencovat ve specializované buňky jako jsou neurony, myocyty, hepatocyty, krvinky, chondrocyty atd. Kmenové buňky třídíme podle toho, kdy a kde se vytvořily v průběhu vývoje organismu a jak jsou použitelné. Dvě hlavní skupiny představují embryonální kmenové buňky (embryonic stem cells = ES buňky) a dospělé, nebo také orgánově specifické kmenové buňky (adult stem cells – AS buňky) (Obr. 32). Pluripotentní kmenové buňky mohou být zdrojem všech typů buněk. Nejlépe jsou charakterizovány embryonální kmenové buňky (embryonic stem cells = ES). Jsou to linie pluripotentních buněk odvozených od nediferencovaných

37

Obr. 32 – Schéma mesenchymální kmenová buňka, zdroj: archív autora

embryonálních buněk, jejichž charakteristikou je téměř neomezené samoobnovování v nediferencované formě a velmi široká diferenciační schopnost (pluripotence). Mají tedy podobné vlastnosti nediferencované embryonální zárodečné buňky. Lidské pluripotentní kmenové buňky představují možný zdroj obnovy diferencovaných buněk při náhradě poškozených nebo nemocných tkáních buněčnou transplantací. Kmenové buňky z tkání dospělých jedinců (nebo embryí z pozdějších fází vývoje) jsou více omezeny ve svých schopnostech růstu a diferenciace. Kmenové buňky pozdějších stádií vývoje se vyskytují ve většině orgánů jako jsou kmenové buňky hematopoetické, gastrointestinální, epidermální, jaterní, mesenchymové nebo nervové. Tyto multipotentní progenitorové buňky (MAPC) nemusí diferencovat pouze v buňky téže buněčné linie, tedy že nejsou zcela tkáňově specifické. Tyto AS se mohou diferencovat na prekurzorové buňky mozkové, jaterní i svalové tkáně. Jejich plasticita tedy není o mnoho menší, než u embryonálních KB. Takto plastických je jen nepatrný zlomek buněk v dřeni – asi 1 na 10 miliard. Převážná část výzkumu KB byla realizována na modelu laboratorních myší, které nepředstavují optimální model pro lidské kmenové buňky.

38

Obr. 33 – Biomedicínský model miniaturního prasete, zdroj archív autora

Proto bylo použito AS buněk prasete jako vhodného biomedicínského modelu (Obr. 33). Je nezbytné přímé srovnání buněk derivovaných z kostní dřeně experimentálních zvířat a člověka. Jenom dlouhodobé sledování buněk diferencovaných in vitro ze stromálních buněk kostní dřeně a jejich přímé srovnání s buňkami izolovanými z mezenchymových tkání, především s chondrocyty a osteocyty, může poskytnout dostatek informací pro vypracování bezpečných metodik, které budou navrženy ke klinickým zkouškám. 1.9.1. Zdroje kmenových buněk Kvalitativně nejlepší zdroj kmenových buněk (KB) jsou lidská embrya, ale etické rozpory vedou ke hledání alternativních zdrojů. V úvahu připadá plodová voda, která obsahuje řadu buněk, které pochází ze zárodků a kultivace těchto buněk navíc nevyvolává takové etické rozpory jako embryonální výzkum. Kvalitativně jsou srovnatelné s buňkami, které se získávají z lidských embryjí. (De Copi 2007)

39

Dalším vhodným zdrojem je pupečníková krev (Erices et al. 2000) kde je jich poměrně málo. Zatím je proto využití pupečníkové krve v klinické medicíně spojeno především s transplantací krvetvotných buněk při různých onemocněních krvetvorné tkáně. Dalším zdrojem je tuková tkáň (Zuk et al. 2001), synoviální tekutina nebo placenta (Igura et al. 2004). Nově se rozvíjí získávání kmenových buněk z dřeně mléčných zubů (Miura M.2003) V našem experimentu jsme jako zdroj KB použili kostní dřeň, tento postup jsme provedli na základě zkušeností z předchozího experimentu. Kostní dřeň jsme vzhledem k dostupnosti odebírali z křídla kosti kyčelní, i když jsou literárně uváděny lokalizace bohatší na MSCs – tibie a humerus. (Jackson et al. 2007). 1.9.2. Etické aspekty Při vytvoření lidských embryonálních kmenových buněk je proměněno lidské embryo (a tudíž potenciální lidská bytost) v masu buněk, ze které již tato bytost vzniknout nemůže. Tvorbu lidských embryonálních buněk proto mnozí lidé vnímají jako zmaření lidského života a je pro tuto skupinu lidí nepřijatelná, podobně jako umělé přerušení těhotenství. Společnost se tak dostává do nelehké situace. Na jedné straně se jí nabízí perspektiva úspěchů v boji s chorobami, které dnešní medicína zvládá jen s obtížemi, nebo je léčit vůbec neumí. Na druhé straně je tento příslib zatížen faktem, že tu dochází k dezintegraci lidského zárodku. Řešení tohoto sporu lze nalézt jen diskusí a kompromisy. Diskuse o lidských embryonálních kmenových buňkách bohužel nejednou sklouzává z věcné konfrontace stanovisek v hádky plné emocí. V USA mohou vědci nově od roku 2009 jako zdroj kmenových buněk využívat lidská embrya, avšak vyvíjejí intenzivně techniky získávání KB z alternativních zdrojů. V Německu je klonování i získávání kmenových buněk z lidských embryí zakázáno, vyjímku tvoří pouze potracené plody. Ve Velké Británii podléhá výzkum na lidských embryích a klonování embryonálních buněk velice přísným

40

vládním pravidlům. Využití adultních kmenových buněk prostým odběrem kostní dřeně naproti tomu velmi elegantně řeší i tento etický aspekt a v případě úspěšných studií s AS tento problém prakticky zcela odpadne. (Sax 2006)

2. Cíle experimentální studie

Traumata a následně degenerativní změny kloubního povrchu končetin představují nepříznivá poranění s vysokým rizikem trvalých následků a značným diskomfortem pro pacienta. Klinické následky mohou být velmi vážné a jejich řešení mnohdy spočívá ve složitých operacích. V předchozím experimentu KDCHOT s kmenovýmí buňkami a jejich využitím při poranění růstové ploténky provedli autoři vyplnění uměle vytvořeného defektu v růstové ploténce chondrocytárním štěpem na nosiči z tkáňového lepidla. V tomto místě následně došlo ve většině případů k novotvorbě chrupavčité tkáně a nevytvořil se zde kostní můstek. Potvrdili tak možnost cíleně nasměrovat diferenciaci mesenchymální kmenové buňky v chondrocyty. V tomto experimentu s kmenovými buňkami bylo navázáno na předchozí poznatky a do uměle vytvořeného defektu kloubní chrupavky byly implantovány na vhodném nosiči mezenchymové kmenové buňky a jejich diferenciace byla směřována k tvorbě hyalinní chrupavky a ke zhojení tohoto defektu plnohodnotnou kloubní chrupavkou. Cílem je detailně propracovat metodu prevence a léčby defektů kloubní chrupavky po jejím iatrogenním poranění tak, aby jí bylo možné aplikovat do klinické praxe. Experimentálně získané výsledky, které navážou na poznatky získané v minulých studiích, by mohly významným způsobem obohatit současné postupy léčby poranění a následně degenerativních procesů v kloubech, které doprovázejí některé případy poranění kloubního povrchu u dospělých i dětí. Stejným způsobem by mohly být velkým přínosem pro léčbu tohoto poranění i v oblasti veterinární medicíny.

41

2.1. Cíle práce 1. Vypracování metodiky experimentálního operačního postupu 2. Specifikace zdroje, kultivace a dalšího zpracování kmenových buněk včetně jejich značení 3. Vývoj nového skafoldu pro přenos MSCs 4. Vyhodnocení léčebných výsledků metody s využitím různých druhů verifikace (skorovací, radiologická, morfometrická, histologická, klinická) 5. Doporučení dalších kroků aplikace závěru experimentu do klinické humánní a veterinární praxe

Obr. 34 – Miniaturní prasata, zdroj archív autora

42

3. Materiál a metodika

Experimentální skupinu tvořilo 30 miniaturních prasat z certifikovaného chovu Ústavu živočišné fyziologie a genetiky Akademie věd (Liběchov, Česká republika), stáří při operaci v rozmezí 5–7 měsíců, přibližně stejné hmotnosti (18,21±4 kg). (Obr. 34) Prasata byla rozdělena do tří skupin. Experimentální skupina A tvořená 10 prasaty, kterým byl vytvořen defekt v oblasti zátěžové plochy chrupavky levého kolena. Léze byla vytvořena v oblasti zátěžové plochy mediálního kondylu a do defektu kloubní chrupavky byl transplantován skafold s MSCs. (Obr. 35) Experimentální skupina B tvořená 10 prasaty, kterým byla vytvořena léze v oblasti zátěžové plochy chrupavky levého kolena. Léze byla vytvořena v oblasti zátěžové plochy laterálního kondylu a do defektu kloubní chrupavky byl transportován pouze nativní skafold bez kmenových buněk. (Obr. 36) Kontrolní skupina C tvořená 10 prasaty, jímž byl vytvořen defekt kloubní chrupavky v oblasti mediálního kondylu levého distálního femoru. Léze byla vytvořena v oblasti zátěžové plochy mediálního kondylu a byla ošetřena metodou mikrofraktury (Detterline et al. 2008). (Obr. 37) 3.1. Příprava kmenových buněk Jako zdroj mesenchymových kmenových buněk byla zvolena kostní dřeň kyčelní kosti. (Friedenstein et al. 1996, 1987, Kim et al. 2003) Po pečlivé desinfekční přípravě operačního pole byla krev kostní dřeně odebrána injekční jehlou (hypodermic needle 20 G/40 mm) z kyčelní kosti (tuber coxae ala osis illii) (Risbud et al. 2006, Grande et al. 1995, Guo et al. 2004) do 5ml stříkačky se 2 ml PBS (Phosphate Buffered Saline, Dulbecco), 2% FBS (Fetal Bovine Serum, StemCell Technologies) a heparinem 5 IU/ml. Krev kostní dřeně (zhruba 4 ml) byla za sterilních

43

Obr. 35 – Defekt zátěžové plochy mediálního kondylu femoru, zdroj archív autora

Obr. 36 – Defekt zátěžové plochy laterálního kondylu femoru, zdroj archív autora

44

Obr. 37 – Experimentálně vytvořený defekt kloubní chrupavky ošetřen metodou mikrofraktury, zdroj archív autora

podmínek umístěna do 3 ml roztoku FPP (Ficoll-Paque PLUS, StemCell Technologies). (Obr. 38) Po centrifugaci (400 g, 30 minut) při pokojové teplotě došlo

Obr. 38 – Odběr kostní dřeně, zdroj archív autora

45

k odloučení erytrocytů a granulocytů ve formě peletu na dně zkumavky (Obr. 39). Mononukleární buňky se objevily jako opaleskující vrstvička mezi Ficollem a krevní plazmou. Tuto vrstvičku jsme odebrali, provedli jsme oplach v kultiObr. 39 – Odloučení erytrocytů a granulocytů ve formě peletu na dně zkumavky po centrifugaci, zdroj archív autora

vačním médiu (viz níže) a použili jsme ji pro kultivaci in vitro. Průměrné množství mononukleárních buněk získané z každé izolace bylo 3,25 × 106 . Množství buněk a jejich životaschopnost byla zjiš-

Graf 1 – Imunofenotypizace kmenových buněk

těna pomocí zařízení

Vi-CELL (Series Cell Viability Analyzers) a bylo nalezeno asi 90 % životaschopných buněk. Nakultivované buňky byly otestovány pomocí obecně používaných pozitivních markerů MSC (CD29, CD44, CD90, CD105 a nově dle některých prací i CD147). Byl použit následující panel protilátek: anti-CD29 (clone MEM101A), anti-CD105 (clone MEM 229), anti-CD147 (clone MEM-M6/2, Exbio Praha a.s., Praha), anti-CD44 (clone IM7), anti-CD90 (clone 5E10, BD Biosciences, San Jose, CA USA), anti-CD45 (clone K252-1E4, AbD Serotec, Kidlington, UK). (Tisato et al. 2007) (Graf 1).

46

3.2. Kultivace kmenových buněk Buňky byly přeneseny do kultivační láhve (75 cm2) při hustotě zhruba 5 × 105 buněk/cm2 a kultivovány při teplotě 37 °C v prostředí 5% CO2. Pro kultivaci bylo použito médium α-MEM (Gibco) doplněné o 10% FBS (Sigma Aldrich) a gentamycin (50 mg/ml, Sigma Aldrich). Po 24 hodinách byly odstraněny neadherentní buňky a v průběhu následující kultivace (3 týdny) bylo médium měněno každé 3 dny. První kolonie MSC se objevily 4. – 5. den kultivace (Obr. 40) a 80% pokrytí kultivační misky bylo dosaženo po 10 dnech kultivace (Obr. 41). Byla provedena pasáž buněk v roztoku 0,5% trypsinu a EDTA (Sigma Aldrich) po dobu 5 minut při teplotě 37 °C a jejich rozvrstvení na ploše 150 cm2 při hustotě 5000–6000 buněk/cm2. Pro značení fluorescenčním barvivem CM-DiI (Molecular Probes) v koncentraci 5 μg/2,5 ml PBS byly buňky získány v den transplantace a inkubace probíhala 5 minut při teplotě 37 °C a 15 minut při teplotě 4 °C. Poté byly buňky důkladně promyty v PBS. S cílem vyvolat diferenciaci směrem k chondrocytům (Miura et al. 2002, Jorgensen et al. 2001, Gao et al. 2007) jsme značené buňky umístili do média α-MEM s přídavkem 100 ng/ml lidského rekombinantního TGF ß1 (R&D Systems), 100 nM dexametazonu (Medochemie), 50μg/ml roztoku askorbát-2-fosfátu (Sigma Aldrich) a 1% ITS (Insulin – Transferrin – Selenium, Gibco) na dobu 30 minut. Poté byly buňky centrifugovány (700 g, 5 minut) a buněčné pelety byly připraveny k přenesení do skafoldu. (Obr. 42) 3.3. Příprava skafoldu Skafoldy byly připravovány zpočátku jako plošné houbovité polotovary požadované výšky, které byly do konečného tvaru připraveny přímo v 96-jamkové destičce. Na základě hodnocení in-vitro v Ústavu experimentální medicíny AV ČR Praha, byl jako nejvhodnější materiál vykazující jak požadované biologické chování, stabilitu v simulovaném tělním prostředí, tak biomechanickou odezvu a chování skafoldu v místě plánované implantace (ex vivo inzerce skafoldu

47

Obr. 40 – Výsev kmenových buněk 4-5.den, zdroj archív autora

Obr. 41 – Kultivace kmenových buněk 10.den, zdroj archív autora

48

Obr. 42 – Peletky, zdroj archív autora

do iatrogenního defektu kloubního povrchu a zkoušky mechanických vlastností skafoldu na vypreparovaných kolenních kloubech prasat ve spolupráci s Veterinární a farmaceutickou univerzitou Brno a Masarykovou univerzitou), vybrán skafold na bázi kolagenu obsahujícího mikro- a nanovlákna z chitosanu. Byla rovněž optimalizována lyofilizační procedůra tak, aby bylo dosaženo propojených pórů s velikostí cca 100 μm. Tímto postupným testováním vhodného složení trojrozměrného nosiče MSCs jsme dospěli k optimálně se jevící variantě porézního válečku ve složení 0,5 % kolagenu + 30 % chitosanu, síťováno EDC (1-ethyl-3Obr. 43 – Nosič mikroskopicky, zdroj archív autora

(3-dimethylaminopropyl) – carbodiimid

49

hydrochloridu) a katalyzováno NHS (N-hydroxysukcinimid 98%), se strukturou chitosanových nanovláken. (Obr. 43) Pro zjednodušení manipulace při implantaci byly válcovité substráty po lyofilizaci předány k osazení buňkami v 96-jamkové destičce. (Obr. 44)

Obr. 44 – Nosiče v 96ti jamkové destičce, zdroj archív autora

3.4. Anestesie u prasat U všech zvířat byl intramuskulárně aplikován Tiletamin-Zolazepam (Zoletil 100, Virbac, Francie) v dávce 2 mg/kg, Xylazin (Sedazine, Fort Dodge, USA) v dávce 2 mg/kg a Ketamin (Ketaset, Fort Dodge, USA) v dávce 2 mg/ kg. Látky byly aplikovány společně jednou stříkačkou. Po nástupu sedace, tj. 10 minut po aplikaci, byl zaveden do ušní žíly intravenózní katetr s Propofolem (Propofol 1%, Fresenius, Rakousko) v dávce 1 mg/kg a byla zavedena endotracheální trubice. (Obr. 45) Prase bylo uloženo do polohy na pravém boku a napojeno na anesteziologický inhalační přístroj. Zvířatům byla podávána směs kyslíku a rajského plynu (1:1) v dávkování 25 ml/kg/min. Všechna zvířata byla napojena na monitor životních funkcí (Datex Cardocap II, USA). Byla

50

Obr. 45 – Anestesie u experimentálního zvířete

Obr. 46 – Anestesie u experimentálního zvířete – měření saturace

51

sledována srdeční frekvence (heart rate – HR), dechová frekvence (respiratory rate – RR), střední arteriální tlak (mean arterial pressure – MAP), saturace (hemoglobin saturation by oxygen – SpO2) a koncentrace CO2 na konci výdechu (end-tidal CO2 concentration – ETCO2). HR bylo měřeno za pomoci 3-svodového EKG s elektrodami umístěnými na hrudníku zvířete. Střední arteriální tlak byl měřen pomocí jednorázového snímače krevního tlaku, který byl po kalibraci napojen na monitor. Dechová frekvence a ETCO2 byly zjišťovány sidestreamovou metodou se senzorem umístěným na kraji endotracheální trubice. SpO2 bylo měřeno pomocí senzoru umístěného na jazyku zvířete. (Obr. 46) 3.5 Operační výkony Miniaturnní prase bylo po uvedení anestezie zbaveno srsti v oblasti levého kolenního kloubu, byla provedena opakovaná toaleta kůže mýdlovou vodou a roztokem iodu. Finální desinfekce operačního pole byla provedena Chlorhexidinem (Gaba GmbH, Lörrach, SRN) a prase bylo uloženo do polohy na pravém boku. (Obr. 47)

Obr. 47 – Příprava operačního pole, zdroj archív autora

Do kolenního kloubu bylo proniknuto laterální artrotomií. (Obr. 48, 49) Po odklopení pately laterálně a vizualizaci laterálního a mediálního kondylu distálního femuru byly vytvořeny defekty o průměru 6mm do subchondrální kosti, dle

52

Obr. 48 – Příprava artrotomie kolene u experimentálního zvířete, zdroj archív autora

Obr. 49 – Artrotomie kolene u experimentálního zvířete, zdroj archív autora

53

Obr. 50– Operační nástoje, zdroj archív autora

Obr. 51 – Vrtání defektu kloubní chrupavky, zdroj archív autora

54

toho, o jakou se jednalo experimentální skupinu. V celém experimentu byla používána bateriová vrtačka (Colibri system, SYNTHES, USA). (Obr. 50, 51) V případě skupiny A byl do vytvořeného defektu v oblasti zátěžové plochy mediálního kondylu chrupavky levého kolena miniaturní pinzetou vložen skafold osazený MSCs metodou pres and fit. (Obr. 52, 53, 54) U skupiny B byl do defektu vytvořeného v oblasti zátěžové plochy laterálního kondylu levého kolena vložen pouze nativní skafold bez MSCs opět metodou pres and fit. (Obr. 55) Defekty průměru 6mm byly vrtány do oblasti mediálního a laterálního kondylu levého distálního femoru přes subchondrální kost do hloubky 12mm od povrchu kloubní plochy v oblasti zátěžové plochy chrupavky. Zbytky tkání po odvrtání defektů byly opláchnuty. Skafoldy s MSCs byly vyjmuty z inkubátoru, kde byly připraveny v den transplantace a uchovávány při teplotě 37 °C v 96 jamkové destičce. Každý skafold s MSCs a nativní skafold byl označen na destičce příslušným číslem a toto číslo bylo přiřazeno příslušnému defektu chrupavky pokusného zvířete také definovaného písmenem a číslem. Destička se skafoldy byla tedy vyjmuta z inkubátoru jen na nezbytně nutnou dobu potřebnou k vyjmutí příslušného skafoldu a jeho transplantaci za sterilních kautel do místa defektu. V případě kontrol skupiny C byla vytvořena léze kloubní chrupavky průměru 6mm pomocí kruhového skalpelu v oblasti zátěžové plochy mediálního kondylu levého distálního femoru (Obr. 56) a byla ošetřena metodou mikrofraktury. (Obr. 57, 58, 59) Po skončení transplantace v případě skupiny A a B a po ukončení chirurgických výkonů v případě skupiny C byl proveden oplach kolenního kloubu roztokem Ringer Lactat (Ringer Lactat I.V.Inf., Braun Medical AG). Kloubní pouzdro bylo uzavřeno jednotlivými křížovými stehy (PDS 0, Ethicon). U fascie a podkožní vrstvy byl použit pokračovací steh (PDS 2/0, Ethicon). Sutura kůže byla provedena jednotlivými stehy (3/0 ETHILON, Ethicon). (Obr. 60) Po skončení zákroku byla provedena antagonizace všech 3 složek anestezie intramuskulární aplikací naloxonu (0,03 mg/kg (INTRENON inj., Léčiva a.s.)),

55

Obr. 52 – Nosiče s kmenovými buňkami, zdroj archív autora

Obr. 53 – Transport nosiče s kmenovými buňkami, zdroj archív autora

56

Obr. 54 – Přenos nosiče s kmenovými buňkami do operačního pole, zdroj archív autora

Obr. 55 – Umístění nosiče s kmenovými buňkami do vytvořeného defektu kloubní chrupavky laterálního kondylu femoru experimentálního zvířete, zdroj archív autora

57

Obr. 56– Kruhový skalpel, zdroj archív autora

Obr. 57 – Vytváření léze kloubní chrupavky kruhovým skalpelem, zdroj archív autora

58

Obr. 58 – Experimentální léze kloubní chrupavky vytvořená kruhovým skalpelem, zdroj archív autora

Obr. 59 – Ošetření experimentální léze kloubní chrupavky metodou mikrofraktury, zdroj archív autora

59

Obr. 60 – Sutura kůže

flumazenilu (0,1 mg/kg (ANEXATE, Hoffmann-La Roche Ltd.)) a atipamezolu (1,0 mg/kg (ANTISEDAN inj.ad us. vet., Pfizer Animal Health)). K analgezii v pooperačním období byl použit carprofen (RIMADYL inj. ad us. vet., Pfizer Animal Health) v dávce 2 mg/kg/den po dobu 3 dnů. Po zotavení bylo zvířatům umožněno volně se pohybovat a zatěžovat končetiny dle jejich možností. V průběhu sledovaného období byla zvířata krmena, ustájena a bylo s nimi zacházeno v souladu s vyžadovanými zásadami (Sýkora et al. 1983). Všechna zvířata byla sledována celkem 16 týdnů, každý týden bylo zaznamenáno event. napadání na zadní končetinu. Na konci experimentu (4 měsíce po zákroku) byla všechna zvířata protokolárně utracena. Nejprve byla navozena celková anestezie intravenózním podáním thiopentalu ve dávce 20 mg/kg. Poté byl intravenózně aplikován přípravek T 61 inj. ad us. vet. (Hoechst Roussel Vet.) v dávce 1 ml pro toto. Byly vypreparovány stehenní kosti, provedena fotodokumentace zhojených lézí kloubní chrupavky a distální epifýza byla po odříznutí od diafýzy vložena do 10% formalínu k dalšímu zpracování.

60

Veškeré postupy byly prováděny se souhlasem Etické komise (č. 46613/2003–1020). 3.6. Histologické vyšetření Fixované preparáty byly dále histologicky zpracovány v Ústavu patologie FN Brno. Po makroskopickém hodnocení provedl patolog řez středem defektu a připravil ultratenké řezy oblasti defektu, přilehlé chrupavky a subchondrální kosti. Základním barvením byl Hematoxilin eosin pro přehled tkání v celém preparátu, pro ověření přítomnosti extracelulární matrix hyalinní chrupavky jsme použili barvení PAS (detekce zásaditých mukopolysacharidů – složka mezibuněčné hmoty hyalinní chrupavky) a dále imunohistochemické barvení značenou protilátkou proti kolagenu typu II (typ kolagenu v hyalinní chrupavčité tkáni). (Obr. 61, 62) Makroskopicky bylo hodnoceno zhojení defektů, sledována byla přítomnost osteofytů, erozí (trhlin) nebo adhezí kloubní chrupavky. (Tabulka 1+3) (O´Driscoll et al. 1988, Guo et al. 2004) Makroskopické hodnocení

Bodová hodnota

Hladký povrch

4

Centrální skleslina jinak hladkého povrchu

2

Adheze měkkých tkání

1

Osteofyt, eroze (trhlina), nezhojený defekt

0

Tabulka 1 – Makroskopické hodnocení defektu kloubní chrupavky

K objektivnímu histologickému hodnocení bylo použito modifikovaného schématu (Tabulka 2), popsaného O´Driscollem (O´Driscoll et al. 1988, Guo et al. 2004), který kombinuje výsledky histologického a histochemického vyšetření. Naše modifikace spočívala v nahrazení barvení Safraninem O reakací PAS vzhledem ke zvyklostem spolupracující patologické laboratoře. K detekci kolagenu II jako základní složky mezibuněčné hmoty hyalinní chrupavky bylo použito imunohistochemického vyšetření (Collagen Type II, polyclonal, Novocastra Reagents, Leica Biosystems Newcastle Ltd, UK). Původ

61

Obr. 61 – Histologický preparát - zhojený defekt kloubní chrupavky ošetřený poze transplantací nosiče bez kmenových buněk, zdroj archív autora

Obr. 62 – Histologický preparát - zhojený defekt kloubní chrupavky ošetřený transplantací nosiče s kmenovými buňkami, zdroj archív autora

62

Buněčná morfologie – hyalinní chrupavka v celém rozsahu defektu

4

– granulační tkáň s okrsky hyalinní chrupavky

2

– fibrochrupavka, kost, vazivo

0

PAS reakce – silná pozitivita

3

– střední pozitivita

2

– lehká pozitivita

1

– negativita

0

Pravidelnost povrchu – hladký a pravidelný

3

– povrchové horizontální vrstvení

2

– trhliny – 25% – 100% procent tloušťky

1

– přerušení, prorůstání fibril

0

Strukturální integrita – normální

2

– drobné trhliny nebo cysty

1

– těžká desintegrace

0

Tloušťka vrstvy chrupavky – 100% tloušťky okolní zdravé chrupavky

2

– 50% – 100% tloušťky okolní zdravé chrupavky

1

– 0% – 50% tloušťky okolní zdravé chrupavky

0

Spojení s okolní chrupavkou – spojení na obou stranách defektu

2

– spojení na jedné nebo částečně na obou stranách

1

– nespojeno

0

Tabulka 2 – Histologické a histochemické hodnocení – bodové ohodnocení - pokračuje

63

Tabulka 2 – Histologické a histochemické hodnocení – bodové ohodnocení - pokračování

Buněčnost – normální buněčnost

3

– lehká hypocelularita

2

– mírná hypocelularita

1

– těžká hypocelularita

0

Chondrocytární shluky – bez shluků

2

– ‹25% buněk ve shluku

1

– 25% – 100% ve shluku

0

Přítomnost degenerativních změn v okolní chrupavce – normální celularita, bez shluků, silné barvení

3

– normální celularita, malé množství shluků, středně silné barvení

2

– mírná nebo střední hypocelularita, slabé barvení

1

– těžká hypocelularita, velmi slabé nebo žádné barvení

0

chondrocytů nalezených v defektu kloubní chrupavky byl potvrzen imunofluorescencí detekcí barviva CM – DiI.

4. Výsledky

Zdrojem kmenových buněk byla odebraná kostní dřeň od nepříbuzného zvířete, v naprosté většině se podařilo aspirovat 10 mL od každého z nich. Každý připravený transplantát obsahoval 3×106 MSCs. Při imunofenotypizaci byla v případě CD29, CD44 a CD90 exprese sledované populace více než z 95 % a lze je považovat za homogenní. V případě CD105 a CD147 byla jejich exprese nízká.

64

Obr. 63 – Zhojený defekt kloubní chrupavky ošetřený transplantací nosiče s kmenovými buňkami, makroskopicky, zdroj archív autora

Obr. 64 – Zhojený defekt kloubní chrupavky ošetřený transplantací nosiče bez kmenových buněk, makroskopicky, zdroj archív autora

65

Nevyskytly se žádné peroperační ani pooperační komplikace chirurgického výkonu, všechny operační rány se zhojily per primam intentionem. Defekty kloubní chrupavky levého kondylu stehenní kosti v experimentální skupině A u defektů s výplní skafoldem s MSCs vykazovaly makroskopicky v 60 % hojení bez patologických projevů charakteru osteofytů, adhezí nebo trhlin (Tabulka 3) (graf 2) (Obr. 63) A (Scafold + MSCs)%

B (Scafold) %

C (kontrola) %

Hladký povrch

60

0

0

osteofyt, eroze (trhlina), adheze, nerovnost

40

100

100

Makroskopické hodnocení

Tabulka 3 – Makroskopické hodnocení zhojených defektů kloubní chrupavky

Animal

(A) Defekt vyplněný skafoldem s MSCs

(B) Defekt vyplněný pouze skafoldem

Ani- (C) Mikrofracture mal kontrolní skupina

OD PAS CII IFS OD PAS CII IFS

OD PAS CII IFS

F 125

15

+ +++ +

4

–

+

–

E 56

5

–

+

–

F 186

14

+ +++ +

5

–

+

–

F 60

4

–

+

–

F 185

13

+

–

6

+

++

–

E 11

3

–

+

–

F 127

16

+ +++ +

7

–

+

–

F 70

5

–

++

–

F 197

18

+ +++ +

5

–

++

–

E 52

6

–

+

–

F 139

14

+ +++ +

4

–

+

–

F 71

5

–

++

–

F 196

13

+

+

6

–

+

–

F 28

6

–

+

–

F 126

15

+ +++ +

5

+

+

–

F82

7

–

+

–

F 187

14

+ +++ +

6

–

+

–

F84

7

–

+

–

F 188

15

–

5

–

+

–

E75

4

–

+

–

++

++

+

–

Tabulka 4 – Mikroskopické hodnocení zhojených defektů kloubní chrupavky OD – hodnota O Driscollova skóre PAS: – bez kyselých mukopolysacharidů + v nové chrupavce přítomnost kyselých mukopolysacharodů CII: – imunohistochemicky (Ab proti kolagenu II) nelze prokázat přítomnost kolagenu II + imunohistochemicky (Ab proti kolagenu II) lze prokázat přítomnost kolagenu II IFS: – ve fluorescenčním mikroskopu není nález IF barviva navázaném na membráně CHC + ve fluorescenčním mikroskopu není nález IF barviva navázaném na membráně CHC

66

Graf 2 – Makroskopické hodnocení zhojených defektů

Defekty léčené výplní pouze nativním skafoldem v experimentální skupině B a kontrolní skupina C se tímto způsobem nezhojily ani v jednom případě (Tabulka 3). (Obr. 64) Výsledky histologického a histochemického vyšetření nově formované hylinní chrupavčité tkáně za použití modifikované klasifikace dle O´Driscoll et al. (1988) ukazuje následující hodnoty: 14.7 ± 3.82 bodů u vzorků s novotvořenou hyalinní chrupavkou po transplantaci skafoldu s MSCs (skupina A),

Graf 3 – Grafické zobrazení hodnoty O´Driscollova skore

67

Graf 4 – Grafické zobrazení kolagen II pozitivity

Obr. 65 – Barvení na kolagen II, zdroj archív autora

68

Obr. 66 – Imunofluorescence

5.3 ± 2.88 bodů u transplantace skafoldu bez kmenových buněk (skupina B) a 5.2 ± 0.64 bodů u lézí léčených metodou mikrofraktury (skupina C) ) viz tabulka 4 a graf 3. Imunohistochemické vyšetření detekující přítomnost kolagenu II (+++ silně pozitivní, ++ pozitivní, + slabě pozitivní) v novotovřené chrupavce kloubního defektu bylo silně pozitivní ve skupině A – defekty se skafoldy s MSCs v 70 %, ve skupině B bylo většinou slabě pozitivní, v kontrolní skupině C nebyl kolagen II identifikován. (graf 4, Obr. 65) Imunofluorescenční barvivo CM-DiI bylo fluorescenčním mikroskopem zachyceno v 80 % ve skupině A u defektů hojených s MSCs, ve skupině B a C toto barvivo zachyceno nebylo (Tabulka 4). (Obr. 66) 4.1. Statistické hodnocení 4.1.1. Testování hypotéz Platnost klinické a potažmo statistické (nulové) hypotézy lze ověřit statistickým testem, jehož číselný výsledek můžeme převést na pravděpodobnostní vyjádření, které bude odpovídat pravděpodobnosti od 0 do 1. Jednoduše řečeno, platnost hypotézy ověřujeme pomocí matematické rovnice, jejíž číselný výsledek má určité pravděpodobnostní chování. To znamená, že víme, s jakou pravděpodobností mohou nastat různé hodnoty testové statistiky. Hodně pravděpodobné nebo běžné hodnoty (tedy ty s pravděpodobností blízkou 1) potvrzují platnost statistické

69

hypotézy, zatímco málo pravděpodobné až extrémní hodnoty (tedy ty s pravděpodobností blížící se 0) do tohoto rozdělení zřejmě nepatří, což naznačuje neplatnost statistické hypotézy. Pravděpodobnost toho, že dostaneme na základě našich dat stejný nebo číselně ještě extrémnější výsledek se označuje jako tzv. p-hodnota. Platí tedy, že čím nižší je p-hodnota testu, tím menší je pravděpodobnost platnosti nulové hypotézy. Vyjde-li nám při vyhodnocení statistického testu hodnota testové statistiky, která odpovídá p-hodnotě „blízké nule“ (co znamená „blízká nule“ posuzujeme z rozdělení pravděpodobnosti testové statistiky, standardně jsou přijímány dvě hranice: 5 % a 1 %), znamená to, že naše hypotéza má velmi malou oporu v pozorovaných nebo naměřených datech a můžeme ji zamítnout. Je-li tedy p < 0,05, hypotézu zamítáme a hovoříme o statisticky významném výsledku. Přitom je nutné si uvědomit, že hypotézu zamítáme na dané hladině významnosti testu (tzn. nejčastěji 5 % nebo 1 %) a na základě pozorovaných dat. Na jiných datech, např. naměřených kolegou z jiné kliniky, by výsledek testu mohl samozřejmě dopadnout jinak. Testování klinických hypotéz si tak lze z laického hlediska představit jako číselný indikátor platnosti nebo neplatnosti nulové hypotézy, vyjádřený na pravděpodobnostní škále právě p-hodnotou. A jako každý indikátor, může i p-hodnota dát špatný výsledek, což znamená, že při posouzení pravdivosti testované hypotézy můžeme dojít ke špatnému závěru. Důvodem je samozřejmě variabilita pozorovaných dat, která může zvláště při malých velikostech srovnávaných souborů maskovat skutečné rozdíly. Rozhodnutí o přijetí nebo zamítnutí nulové hypotézy je tedy založeno na pravděpodobnosti (tedy pracuje s náhodou) a je spojeno s dvěma typy chyb, které můžeme při rozhodování udělat. Ty jsou mezinárodně označovány jako chyba I. druhu ( její pravděpodobnost je označována jako α) a chyba II. druhu ( její pravděpodobnost je označována jako ß). Pravděpodobnost chyby I. druhu souvisí s falešně pozitivním závěrem testu, kdy na základě výsledku testu zamítneme nulovou hypotézu, která ale ve skutečnosti platí. A podobně, pravděpodobnost chyby II. druhu souvisí zase s falešně negativním závěrem testu, kdy na základě výsledku testu nezamítneme nulovou hypotézu, která ale ve skutečnosti neplatí.

70

Nevýhodou statistického testování je, že nelze minimalizovat pravděpodobnost obou chyb zároveň. V oblasti zpracování klinických dat je za důležitější považována chyba I. druhu, kterou se snažíme omezit na minimum. Jako standardní hranice, které potom představují riziko falešné pozitivity podstoupené při testování, jsou přijímány hladiny 5 % nebo 1 %, což přímo souvisí s tím, že nulová hypotéza je zamítána ve chvíli, kdy p-hodnota testu klesne pod jednu z těchto hladin ( je nutné si předem vybrat kterou). Dá se tedy říci, že ve chvíli, kdy riziko falešně pozitivního výsledku v souvislosti se zamítnutím nulové hypotézy klesne pod vybranou hladinu (5 % nebo 1 %), pak ji zamítáme. Při jakémkoliv testování tak máme nenulovou pravděpodobnost, že se v závěru testu mýlíme a deklarujeme opak skutečnosti. V klinickém výzkumu se často setkáváme se situací, kdy potřebujeme testovat více hypotéz zároveň. Nemusí to nutně znamenat hodnocení různých dat různých souborů, ale např. i hodnocení stejného primárního parametru v rámci různých podskupin celého souboru pacientů. Když např. sledujeme rozdíl v nějakém faktoru v souboru pacientů se skupinami A, B, C a D, a zjistíme, že se v celkovém pohledu sledované skupiny liší, je samozřejmě z klinického hlediska zajímavé podívat se na tento rozdíl i mezi jednotlivými podskupinami, tedy podívat se, jak se liší skupiny A a B, B a C, apod. Tento fenomén však v praxi vede k tzv. problému násobného testování hypotéz. Ten spočívá v tom, že s narůstajícím počtem testovaných hypotéz nám roste také pravděpodobnost získání falešně pozitivního výsledku, tedy pravděpodobnost toho, že se při našem testování zmýlíme a ukážeme na statisticky významný rozdíl tam, kde ve skutečnosti žádný neexistuje. Můžeme si představit modelovou situaci, kdy provedeme zároveň 60 testů, což v době srovnávání biochemických a genetických parametrů není zase tolik. Použijeme-li klasickou hladinu významnosti 0,05 (resp. 5 %), máme pro každý test 5% riziko získání falešně pozitivního výsledku. Vynásobíme-li 60 a 0,05, vyjde nám, že zhruba u 3 testů bychom měli dospět k falešně statisticky významnému závěru. V případě genomických analýz, kde jsou často různé testy pouze formou exploratorní analýzy, nemusí být přítomnost falešně pozitivních výsledků fatální, v klinické praxi to však může vést k zavádějícím výsledkům a mylným interpretacím.

71

Z tohoto důvodu je nutné při násobném statistickém testování uvažovat tzv. korekční procedury, které by měly brát v úvahu celkový počet provedených testů. Nejznámější korekční procedurou pro násobné testování hypotéz je Bonferroniho procedura, která zamítá nulovou hypotézu ve chvíli, kdy je její p-hodnota menší nebo rovna α/m, kde α je zvolená hladina významnosti testu (obvykle 5 % nebo 1 %), a m je počet provedených testů. Použití Bonferroniho procedury je však konzervativní, což znamená, že je poměrně obtížné při použití Bonferroniho procedury dosáhnout statistické významnosti (zvláště když je počet provedených testů větší než 10). 4.1.2. Steel – Dwassův test Alternativou, která souvisí s použitím neparametrického Wilcoxonova testu a je tak nezávislá na pravděpodobnostním chování pozorovaných dat, je metoda dle Steela a Dwasse (Steel, 1960; Dwass, 1960). Ta je založena na výpočtu všech možných testových statistik Wilcoxonova testu odpovídajících srovnávaným dvojicím. Testová statistika pro jednu dvojici (např. B a D) má následující tvar

kde nB je počet subjektů ve skupině B, nD je počet subjektů ve skupině D a SBD je součet pořadí subjektů souboru B při společném seřazení se subjekty souboru D (subjekty seřadíme vzestupně, nejmenší prvek pak má pořadí 1). Jako testovou statistiku metody dle Steela a Dwasse pak vybereme maximální absolutní hodnotu W ze všech vypočtených W odpovídajících srovnávaným dvojicím. K této maximální hodnotě, maxW, pak stačí nalézt v tabulkách odpovídající hraniční hodnotu wα, se kterou pak srovnáme i ostatní pozorované hodnoty statistiky W. Dvojice subjektů (jako např. výše uvedené B a D), pro které bude absolutní hodnota statistiky W větší než tabelovaná hraniční hodnota wα, pak můžeme označit za statisticky významně rozdílné vzhledem ke srovnávanému faktoru.

72

4.1.3. Fisherův exaktní test Jak bylo naznačeno výše, klasickým postupem v testování hypotéz je ověření platnosti nulové hypotézy pomocí p-hodnoty vypočtené na základě teoretického rozdělení pravděpodobnosti použité testové statistiky. Může se ale stát, že v některých případech chování testové statistiky není známo, např. kvůli nedostatečné znalosti problému nebo pro malý počet dostupných pozorování. Testování v těchto případech může vést k mylným závěrům kvůli nekorektnímu výpočtu p-hodnoty. Abychom se vyhnuli tomuto riziku, respektive nutným předpokladům o parametrech rozdělení testové statistiky, můžeme pro odhad p-hodnoty použít tzv. permutační algoritmus, jednu z metod, která pracuje s opakovaným vzorkováním pozorovaného souboru dat. Principem permutačního testování je srovnání pozorované testové statistiky s testovými statistikami, které bychom mohli získat ze stejného datového souboru, když by přiřazení pozorovaných hodnot do sledovaných skupin subjektů bylo náhodné. Jinými slovy, permutační test vychází z výpočtu všech možných hodnot testové statistiky, které lze získat opakovaným přeskupením pozorovaného datového souboru. Přitom je nutné samozřejmě zachovat celkový počet pozorování (celkové N) i celkové počty pozorování v jednotlivých podskupinách faktorů. Jedním z nejznámějších a nejpoužívanějších permutačních testů je tzv. Fisherův exaktní test (Fisher, 1922), který se používá pro testování závislosti dvou binárních faktorů, tedy faktorů ve formě ano/ne, které lze zapsat do tzv. 2×2 kontingenční tabulky (tabulky četností). Přitom 2×2 tabulka četností vzniká rozřazením subjektů dle dvou kritérií zároveň s tím, že následně ověřujeme, zda spolu použité faktory souvisí, např. zda nedodržení dávkování léku vede k nižšímu počtu dosažených terapeutických odpovědí než v případech, kde dávkování bylo dodrženo apod. Fisherův exaktní test je postaven na jednoduché myšlence, kdy místo spoléhání na teoretickou testovací statistiku generuje všechny dostupné varianty pozorované tabulky četností a určuje pravděpodobnosti výskytu těchto variant. Přitom platí, že jednotlivé varianty pozorované tabulky četností mají stejné součty subjektů v řádcích a sloupcích jako původní pozorovaná

73

tabulka. Fisherův exaktní test tak ověřuje, jak pravděpodobná je pozorovaná tabulka a všechny ještě extrémnější varianty mezi všemi možnostmi, které mohou teoreticky nastat při zachovaných součtech řádků a sloupců tabulky. Faktor 1

Faktor 2

Celkem

Ano

Ne

Ano

I

J

I+J

Ne

K

L

K+L

Celkem

I+K

J+ L

N

Tabulka 5 – Příklad 2 × 2 tabulky četností

Výpočet Fisherova exaktního testu si můžeme představit pomocí konkrétní tabulky četností, viz Tab. 5, kde I, J, K a L jsou četnosti kombinací hodnot obou faktorů, I+K, I+J, J+L, K+L jsou četnosti subjektů v řádcích a sloupcích tabulky (ty zůstávají při výpočtu testu neměnné) a N je celkový počet subjektů v experimentu (velikost vzorku, také neměnná). Postup výpočtu Fisherova testu lze popsat pomocí následujících kroků: Pozorováním na N jedincích získáme konkrétní tabulku četností. Dále vytváříme varianty tabulky odrážející kombinace obou znaků, které mohou teoreticky nastat, i když v reálném měření nenastaly. Pracujeme pouze s daným vzorkem a při zachování jeho velikosti (N) a zachování četnosti subjektů v řádcích a sloupcích tabulky (I+K, I+J, J+L, K+L). Pro každou variantu tabulky spočítáme pravděpodobnost jejího výskytu mezi všemi variantami zjištěné tabulky. Pro výpočet slouží následující vztah (symbol „!“ značí faktoriál, např. 4! = 4×3×2×1):

Zhodnotíme, jak pravděpodobná je naše pozorovaná varianta tabulky a dále všechny varianty extrémnější, tedy více vzdálené od platnosti nulové hypotézy o nezávislosti obou faktorů. Výslednou p-hodnotu Fisherova testu získáme

74

součtem pravděpodobností pro pozorovanou tabulku a všechny tabulky extrémnější (ve smyslu nulové hypotézy). Je-li výsledná p-hodnota Fisherova testu menší než zvolená hladina významnosti testu (opět např. 5 %), hypotézu o nezávislosti obou sledovaných faktorů zamítáme. Hlavní výhodou Fisherova exaktního testu je fakt, že ho lze použít i pro hodnocení souborů s malými pozorovanými a očekávanými četnostmi jednotlivých hodnot uvažovaných faktorů. Skutečně nenahraditelný je u málo četných jevů, kdy očekávaná četnost v některém z políček 2×2 tabulky nepřesahuje hodnotu 10. 4.1.4. Výsledky statistické analýzy Faktor OD – použit neparametrický test: Steel-Dwass Test-Nonparametric Multiple Comparisons. sk.A se hodnotami průkazně liší od sk.B:p=0,0004016 sk.A se hodnotami průkazně liší od sk.C:p=0,0004208 sk.B a C mezi hodnotami není průkazný rozdíl faktor PAS – použit Fisher Exact Probality Test sk.A průkazně odlišná od sk.B: p=0,0163 (po korekci) sk.A průkazně odlišná od sk.C: p=0,0004 (po korekci) sk.B a C – není průkazný rozdíl faktor CII a IFS použit Fisher Exact Probality Test sk.A průkazně odlišná od sk.B a C: p=0,00018(po korekci) sk.B a C nejde vzájemně statisticky srovnávat(testovat), byly dosaženy identické hodnoty.

75

5. Diskuse

Poranění a degenerativní procesy kloubní chrupavky jsou jedny z nejčastějších onemocnění muskuloskeletálního systému a jsou vážným medicínským problémem současnosti (Gao et al. 2007, Grande et al. 1995). Kloubní chrupavka je subtilní a vysoce diferencovaná tkáň bez cévního zásobení, jejíž buňky vykazují jen nízkou mitotickou aktivitu. Její reparační schopnosti jsou proto velice malé. Možnosti léčby defektů kloubní chrupavky se neustále rozšiřují a svoji důležitou roli již dnes hraje i tkáňové inženýrství (Butler et al. 2004, Langer et al. 1993). Prvním buněčným transplantátem pro defekty kloubní chrupavky byly autologní chondrocyty, které přinášely poměrně dobré výsledky již v devadesátých letech (Brittberg et al. 1994, Chu et al. 1999). Vzhledem k použití periostálního laloku k přešití defektu však nelze ani zde vyloučit působení progenitorových buněk a navíc tato metoda vyžaduje odběr vlastní tkáně pro kultivaci štěpu. Na trhu jsou již dnes komerčně nabízené technologie připravující suspenzi autologních chondrocytů v nosném prostředí, která jsou pak různým způsobem vpravována do defektu kloubní chrupavky (ChondronTM). Mezi novinkami poslední doby však stojí v popředí zájmu experimentální použití kmenových buněk, jímž se věnuje velké množství prací ve stejných indikacích (Grande et al. 1995, Guo et al. 2004, Hannouche et al. 2007). Vývoj experimentální léčby dospěl za poslední dobu přes pozitivní výsledky transplantace autologních chondrocytů až k aplikaci MSCs na nejrůznějších typech nosičů. V našem experimentu jsme použili jako experimentální zvíře miniaturní prase v počtu 30 kusů, zdrojem pokusných zvířat byl certifikovaný chov Ústavu živočišné fyziologie a genetiky Akademie věd. Rozhodli jsme se pro miniaturní prase z důvodu určité podobnosti velikosti a biomechaniky kostí a kloubů organismu člověka. Časté jsou studie na jiných zvířecích modelech jako jsou králíci (Grande et al. 1995, Hannouche et al. 2007, Wakitani et al. 1994), krysy (Lucas et al. 1995) nebo ovce (Guo et al. 2004, Hoemann et al. 2005).

76

Odběr a zpracování kmenových buněk byl prováděn v cytologické laboratoři Ústavu živočišné fyziologie a genetiky Akademie věd. Zdrojem MSCs v našem experimentu byla kostní dřeň, protože jde o jednoduchý a efektivní postup. Dalším vhodným zdrojem je pupečníková krev (Erices et al. 2000), tuková tkáň (Zuk et al. 2001) nebo placenta (Igura et al. 2004). Kostní dřeň jsme vzhledem k dostupnosti odebírali z křídla kosti kyčelní, i když jsou literárně uváděny lokalizace bohatší na MSCs (tibia, humerus) (Jackson et al. 2007). Flow – cytometrie byla prováděna s použitím výše uvedených sestav monoklonálních protilátek, v literatuře jsou uváděny další specifické markery MSCs populace (CD13, CD31, CD54,CD73, CD 106CD140b, CD 166 a STRO 1) (Jackson et al. 2007, Mitchell et al. 2003), které nebyly součástí našeho charakterizačního protokolu. Diferenciační protokol inkubací v mediu s TGF-ß1 a dexametazonem dle Miury (Miury et al.2002) je dlouhodobě vyzkoušeným postupem na spolupracujícím cytologickém pracovišti. TGF-ß1 v kombinaci s dexametaztonem je nejčastěji spojován s chondrogenní diferenciací MSCs a následnou produkcí extracelulární matrix obsahující kolagen II. typu, někdy v kombinaci s lidským rekombinantním BMP-2 (Caplan et al. 1997, Johnstone et al. 1998). Solchaga (Solchaga et al. 2005) navíc popisuje zvýšení mitotické aktivity přidáním Fibroblastic growth factor 2 (FGF-2). Dalším velmi často používaným protokolem je použití TGF-ß3. (Ahn et al. 2004). Pro náš experiment jsme vytvořili vlastní nový druh nosiče, na který jsme měli předem základní požadavky – biokompatibilita, biodegradabilita, dostatečná porozita pro inkorporaci MSCs a dále jednoduchá perioperační manipulace. V této části experimentu jsme spolupracovali s Ústavem chemie materiálů Fakulty chemické Vysokého učení technického (Brno, Česká republika). Vyvinutý nosič byl houbovité struktury a představuje proto určitý kompromis. V podobných studiích používané nosiče mají totiž většinou gelovou strukturu (kolagenní gel, PGA skafold (Grande et al 1995) a nemají tedy ideální mechanické vlastnosti ve vztahu k velmi namáhané oblasti kloubní chrupavky. Na druhé straně stojí mechanicky velmi stabilní nosiče z ß-tricalcium

77

phosphate také s dobrým výsledkem(Guo et al. 2004). Námi připravený skafold vykazoval jak vyhovující mechanickou pevnost a odolnost, tak dostatečnou porozitu pro osídlení buňkami, což bylo během příprav prokázáno na konfokálním mikroskopu. Nosič byl metodou press and fit zaklíněn do 12mm hlubokého osteochondrálního defektu a byl tak dostatečně stabilně upevněn v místě transplantace. Náš experiment ukazuje na výrazně lepší výsledky léčby osteochondrálního defektu kloubní plochy kondylu stehenní kosti při použití MSCs ve skafoldu, než u skafoldu samotného a u kontrolní skupiny. Makroskopický nález byl ve 60% příznivý, v ostatních případech se jednalo nejčastěji o hladkou nerovnost s centrální vkleslinou nebo drobnými adhezemi měkkých tkání. Abychom dokázali objektivně zhodnotit výsledek transplantace MSCs, použili jsme modifikovaný O´Driscollův skórovací systém, jehož základ byl použit v několika podobných studiích (O´Driscoll et al. 1988, Guo et al. 2004). Výhodou je numerická charakteristika finálního výsledku a snadné statistické vyhodnocení. Do jisté míry je rovněž eliminován faktor subjektivního hodnocení. Převedení objektivního hodnocení a popisu novotvořené chrupavky do numerických hodnot oceňují zejména statistici, kteří tak mohou zcela jednoznačně určit statistickou významnost rozdílů v dosažených výsledcích. Pozitivní na našem definovaném schématu je rovněž to, že v histologicko – histochemické části (O´Driscollovo skórování) můžeme naše výsledky porovnat s četnými podobnými zahraničním studiemi, které již v tomto směru proběhly. Naše výsledky jasně ukazují na výrazně lepší průběh hojení a taktéž histologický nález v experimentální skupině s MSCs ve skafoldu. Celkově dosažený bodový průměr 14,7±3,82 však svojí hodnotou nadále zaostává za nejvyšším možným dosažitelným skóre (24 bodů), které představuje ideální (původní) kloubní chrupavku. Ve srovnatelné studii na ovcích (Guo et al. 2004) bylo dosaženo průměrné skóre 18±3,38, avšak experimentální zvířata byla ponechána 24 týdnů od transplantace. Ve stejně zvolených kontrolních skupinách vyšly podobné výsledky při použití stejného skórovacího systému (nativní skafold – 10±1,83, prázdný defekt 5±2,08). Na modelu králíka byla podobná studie

78

ukončena 6. a 12. týden po transplantaci a bylo rovněž dosaženo uspokojivých výsledků (Grande et al. 1995). Výsledky mohou být ovlivněny nejen zvolenou metodou, ale rovněž počátečními chybami při práci s nosičem, chirurgickým výkonem. Peroperační manipulace s nosičem a buňkami byla zpočátku obtížná, během experimentu jsme stále zlepšovali metodiku přípravy tvaru nosiče a jeho přenos do tkáně, což se podepsalo na celkovém výsledku. Histologický průkaz přítomnosti základních složek mezibuněčné hmoty produkované novotvořenými chondrocyty je nedílnou součástí experimentu. Průkaz kolagenu II a PAS reakce patří mezi zcela základní metody. Je možné rovněž použít průkaz kolagenu X, dále Safraninu O (průkaz glykosaminoglykanů) (Guo et al. 2004, Grande et al. 1995) nebo aggrecanu (gylcoprotein) (Mackay et al. 1998). Tato vyšetření jsme v našem experimentu neprováděli. Imunofluorescenční barvivo CM-DiI jsme podobně jako další autoři (Ahn et al. 2004) použili k potvrzení původu chondrocytů novotvořené chrupavky v defektu kloubního povrchu. Námi navržený postup a vyrobený skafold v kombinaci s allogenními MSCs kostní dřeně vede k dobrému výsledku hojení defektu kloubní chrupavky. Je otázkou, zda-li bychom dosáhli ještě lepších výsledků, pokud by jsme ponechali transplantát in vivo déle než 16 týdnů. Další otázkou je transplantace allogenních MSCs a dlouhodobé komplikace v tkáni příjemce. Rovněž zůstává otázka případné imunosuprese při allogenní transplantaci. Zajímavé by byly také dlouhodobé výsledky experimentu, v případě ponechání pokusných zvířat k dožití. (Chiu 2003, Batten et al. 2006) Dále se nabízí otázka vzniku maligního bujení, indukce apoptosy aktivovaných T lymfocytů (Plumas et al. 2005) ve spojení s transplantací kmenových buněk, které bylo již popsáno u embryonálních KB.

79

6. Závěr

Transplantace allogenních MSCs získaných z KD v kombinaci s kompozitním kolagen/chitosan skafoldem vede k prokazatelně lepšímu hojení defektu kloubní chrupavky v oblasti zátěžové plochy mediálního kondylu stehenní kosti na modelu miniaturního prasete ve srovnání s kontrolními skupinami. Transplantace mesenchymových kmenových buněk vede tedy k lepšímu hojení traumatického defektu kloubní chrupavky. Díky použitému hodnotícímu schématu můžeme na základě této studie provádět vzájemné srovnání dalších modifikací použití mesenchymových kmenových buněk v léčbě poraněné kloubní chrupavky. K dosažení lepších výsledku v absolutním hodnocení kvality novotvořené chrupavky bude třeba lépe propracovat metodiku implantace kompozitu do tkáně a prověřit nové možnosti diferenciace kmenových buněk.

80

7. Literatura

Ahn JI et all 2004: Stem cell repair of physeal cartilage. Journal of Orthopaedic Research 22: 1215-1221. Alsberg E, Anderson KW, Albeiruti A, Rowley LA, Mooney DL 2002: Engineering growing tissues. Proc N atl Acad Sci, 19:12025–12030. Anderer U, Libera L 2002: In vitro engineering of human autogenous cartilage. Bone Miner Res, 8:1420–1429. Ashcraft KW 2005: Pediatric Surgery. 4th ed. Elsevier Saunders, Philadelphia, pp 229–231. Batten P, Sarathchandra P, Antoniw JW, Tay SS 2006: Human Mesenchymal Stem Cells Induce T Cell Anergy and Downregulate T Cell Allo-Responses via the TH2 Pathway: Relevance to Tissue Engineering Human Heart Valves. Tissue Engineering Larchmont 12: 2263. Brittberg M, Anders L, Nilsson A, Ohlsson C, Isaksson O, Peterson L. 1994: Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med; 331:889–95. Butler DL, Shearn JT, Juncosa N, Dressler MR, and Hunter SA 2004: Functional tissue engineering parameters toward designing repair and replacement strategies. Clin. Orthop. Related Res., 427(Suppl.), S190–S199. Calandruccio RA, Gilmer, WS 1962: Proliferation, regeneration, and repair of articular cartilage of immature animals. J. Bone and Joint Surg., roč. 44–A, s. 431–455.

81

Caparrelli DJ, Cattaneo B, Shake JG 2001: Cellular cardiomyoplasty with al1ogeneic mesenchymal stem cells resuita in improved cardiac performance in a mne model of myocardial infarction. Circulation, 104:11–599. Caplan AI, Elyaderani M, Mochizuki Y, Wakitani S, Goldberg VM. 1997: Principes of cartilage repair and regeneration. Clin Orthop ;342:254–69. Caplan AI 2005: Review: Mesenchymal Stem Cells: Cell-Based Reconstructive Therapy in Orthopedics. Tissue Engineering 11:1198. Clair BL 2009: Cartilage Repair. Foot & Ankle Specialist, Vol. 2, No.4,179–188. Cohen SB, Meirisch CM, Wilson HA, Diduch DR 2003: The use of absorbable co-polymer pads with alginate and cells for articular cartilage repair in rabbits. Biomaterials 24:2653 – 2660. Convery F., Akeson WH, Keown GH.1972: The repair of large osteochondral defects. An experimental study in horses. Clin. Orthop., roč. 82, s. 253–262. Cook L, WilIiams N, Kreeger M, Peacock T, Tomlinson L 2003: Biocompatibility of three-dímensional chondrocyte grafts in large tibial defects of rabbits. Am 1 Vet Res, 64(I):12–20. Cool WP, Carter SR, Grimer R, TilIman RM, Walker PS 1997: Growth after extendible endoprosthetic replacementof the distal femur. Bone Joint Surg Br, 79(6): 938–942. Cooper AP Sir.1832: A treatise on dislocations and fractures of the joints. Boston, Lilly, Wait, Carter & Hendee.

82

DeSault PJ. 1811: A treatise on fractures, luxations, and other affections of the bones. Philadelphia, Kimber&Konrad. De Coppi P, Bartch G, Siddiqui MM, Xu T, Santos C, Perin L, Mostoslavky G, Serre A, Yoo JJ, Furth ME, Atala A 2007: Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy, Nature Biotechnology 25, 100–106. Detterline J, Goldstein JL, Rue JPH, Bach BR Jr. 2008: Evaluation and Treatment of Osteochondritis Dissecans Lesions of the Knee, Alvin The Journal of Knee Surgery. Thorofare: Apr. Vol. 21, Iss. 2; p. 106. Dungl P. a kolektiv. 2005: Ortopedie. 1 vyd. Praha: GRADA, 1280 s. ISBN 80-247-0550-8. Dupuytren BG.1847: On the injuries and diseases of bones. London, Sydenham Society. Dwass M 1960: Some k-sample rank-order tests. In: Olkin I, Ghurye SG, Hoeffding W, Madow WG & Mann HB (eds.): Contributions to probability and statistics. Stanford University Press, Stanford, 198–202. Edwards J 1967: Physical characteristics of articular cartilage. Proc. Ins. Mech. Eng. 181: 16–24. Ecklund K 2002: Magnetic resonance imaging ofpediatric musculoskeletal trauma. Top Magn Reson lmaging,13(4):203–217. Erices A, Conget P, Minguell JJ.2000: Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br J Haematol, 109:235–42.

83

Fisher RA 1922: On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of Royal Statistical Society, 85(1): 87–94. Fortier LA, Nixon AJ, WilIiams L, Cable CS 1998: Isolation and chondrocytic differentiation of equine bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Am Vet Res, 59(9):1182–1187. Fortier LA, Brofman Pl, Nixon AJ, Mohammed HO 1998: Disparate chondrocyte metabolism in three-dimensional fibrin cultures derived from autogenous or commercially manufactured fibrinogen. Am Vet Res, 59( 4):514–520. Frank MH, Sayegh MH 2004: Adult stem cells in the treatment of autoimmune diseases. The Lancet, 363:1411–1412. Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, and Gerasimov UV 1987: Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinetics, 20(3), 263–272. Friedenstein AJ, Latzinik NV, Gorskaya YF, Luria EA and Moskvina IL 1992: Bone marrow stromal colony formation requires stimulation by haemopoietic cells. Bone Miner., 18(3), 199–213. Futami T, Foster BK, Morris LL, LeQuesne GW 2000: Magnetic resonance imaging of growth plate injuries: the efficacy and indications for surgical procedures. Arch Orthop Trauma Surg, 120(7–8):390–396. Gál P, Macháček R 1999a: Miniinvazivní osteosyntéza při poranění dolní končetiny u dětí. Lék obz, 48: 99–102.

84

Gál P, Macháček R 1999b: Miniinvazivní osteosyntéza zlomenin horní končetiny u dětí. Acta chirurgicae orthopedicae et traumat., 66,165–170. Gál P, Nečas A, Adler J, Teyschl O, Fabián P, Bibrová Š 2002: Transplantation of the Autogenous Chondrocyte Graft to Physeal Defects: An Experimental Study in Pigs. Acta Vet Brno 71: 327–332. Gál P, Teyschl O, Kecová H, Fabián P, Bibrová Š 2002: Influence of Transphyseal Pin Placement on Bone Growth: An Experimental Study in Pigs. Acta Vet Brno, 71: 319–325. Gál P 1999f: Poranění ínterkondylické eminence u dětí. Lék. Obz., 48:87–90. Gál P 1999g: Úskalí, selhání a komplikace miniinvazivní osteosyntézy v dětské traumatologii Zpr.Úraz.Chir., 7:1–8. Gao J, Yao J.Q., Caplan AI 2007: Stem cells for tissue engineering of articular cartilage. Proc. IMechE, roč. 221, s. 441–450. Garces GL, Garay M, Coviella LGN, Guerado E 1994: Growth-plate modifications after drilling. J Pediatr Orthop, 14:225–8. Gibson G, Lin DL, Francki K, Caterson B, Foster B 1996: Type X collagen is colocalized with a proteoglycan epitope to form distinct morphological structures in bovine growth cartilage. Bone, 19: 307 15. Grande DA at all 1995: Repair of articular cartilage defects using mesenchymal stem cells. Tissue Ing 1(4): 345–353. Guo X, Wang CH, Zhang Y, Xia R, Hu M, Duan C, Zhao Q, Dong L, Lu J, Song Yq 2004: Repair of Large Articular Cartilage Defects with Implants of

85

Autologous Mesenchymal Stem Cells Seeded into ß -Tricalcium Phosphate in a Sheep Model. Tissue Eng 10(11–12): 1818–1829. Haisch A, Klaring S, Groger A, Gebert C, Sittinger M 2002: A tissue-engineering model for the manufacture of auricularshaped cartilage implants. Eur Arch Otorhinolaryngol, 259(6):316–321. Hannouche D et all 2007: Engineering of Implantable Cartilaginous Structures from Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue Eng 13: 87–99. Hansen AL, Foster BK, Gibbon GJ 1990: Growth – plate chondrocyte cultures for reimplntation into growth-plate defects in Wheel: characterisation of culture. Clin Ortho., 256:286–298. Hardaker WT, Garrett WE, Bassett FH 1990: Evaluation of acute traumatic hemarthrosis of the knee joint. Southern Med. J., roč. 83: s. 640–644. Havránek P 1991: Dětské zlomeniny. Corvus. Hixon AL, Gibbs LM 2000 Osteochondritis dissecans: A diagnosis not to miss, American Family Physician, Leawood, vol.61, p 151. Hoemann CD et all 2005: Chitosan-glycerol hosphate/blood implants improve cartilage repair in ovine microfracture defects. J Bone Joint Surgy (Am) 87: 2671–2687. Horas U, Schnettler R, Pelinkovic D, Herr G, AignerT 2000: Osteochondral transplantation versus autogenous chondrocyte transplantatíon. A prospective comparatíve c1inical study. Chirurg, 71(9):1090–1097.

86

Chen F, Chao Y, Shang Q 1998: Advances in the research on repairing cartilaginous defects of synovial joint. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi, 12(5):297–300. Chen G, Liu D, Tadokoro M, Hirochika R, Ohgushi H, Tateishi T, Tanaka J 2004: Chondrogenic diferentiation of human mesenchymal stem cells cultured in cobweb-like biodegradable scaffold. Biochemical and Biophysical Research Communications, 322:50 –55. Chen MB, James BS, Hui HP, Chan WK, Lee EH 2003: Cultured mesenchymal stem cell transfers in the treatment of partial growth arrest. Journal of Pediatric Orthopaedics, Philadelphia, 23: 425 – 429. Chiu RCJ 2003: Bone-Marrow Stem Cells as a Source for Cell Therapy, Heart Failure Reviews. Norwell 8: 247. Chu CR, Convery FR, Akeson W, Meyers M, Amiel D 1999: Articular cartilage transplantation. Clin Orthop; 360: 159–68. Igura K, Zhang X, Takahashi K, Mitsuru A, Yamaguchi S, Takashi TA 2004: Isolation and characterization of mesenchymal progenitor cells from chorionic villi of human placenta. Cytotherapy 2004;6: 543–53. Indrawattana N, Chen G, Tadokoro M, Shann LH, Ohgushi H, Tateishi T, Tanaka J, Bunyaratvej A 2004: Growth factor combination for chondrogenic induction from human mesenchymal stem cell. Biochemical and Biophysical Research Communications 320:914 –919. Jackson L, Jones DR, Scotting P, Sottile V 2007: Adult mesenchymal stem cells: Differentiation potential and therapeutic applications, Journal of Postgraduate Medicine Vol: 53 Issue : 2 Page: 121–127.

87

Johnstone B, Hering TM, Caplan AI, Goldberg VM and Yoo JU 1998: In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Expl Cell Res., 238(1), 265–272. Johnstone EW, Lea PB, Byers S, Hopwood JJ, Foster BK 2000: Metaphyseal factors promote calcium incorporation in physeal chondrocyte cultures. J Orthop Sci, 5(6):593–599. Jouve JL, Cottalorda J, Mottet V, Frayssinet P, Petit P, Bollini G 1998: Reimplantation of growth plate chondrocyte cultures in central growth plate defects: Part II. Surgical experimentation in rabbits. J Pediatr Orthop, 7(2): 174–178. Jouve JL, Mottet V, Cottalorda J, Frayssinet P, Bollini G 1998: Reimplantation of growth plate chondrocyte cultures in central growth pl.ate defects: Part I. Characterization of cultures. J Pediatr Orthop B, 7(2):167–173. Kim TK, Sharma B, Williams CG, Ruffner MA, Malik A, McFarland EG, and Elisseeff JH 2003: Experimentalmodel for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage. Osteoarthritis Cartilage, 11(9), 653–664. Kish G, Modis L, Hangody L 1999: Osteochondral mosaicplasty for the treatment of focal osteochondral lesions of the knee and talus in the athlete. Rationale, indications, techniques, and results. Clin Sports Med, 18(1):45–66. Kleinman PK, Marks SC Jr 1998: A regional approach to the classie metaphyseal lesion in abused infants: the distal femur. AJRAm J Roentgenol, 170(1):43–47.

88

Kon E, Gobbi A, Filardo G, Delcogliano M, Zaffagnini S, Marcacci M 2008: Arthroscopic Second-Generation Autologous Chondrocyte Implantation Compared With Microfracture for Chondral Lesions of the Knee: Prospective Nonrandomized Study at 5 Years The American Journal of Sports Medicine, 37 (1), 33–41. Laar JM, Tyndall A 2006: Reparative Osteogenesis during Transplantation of Mesenchymal Stem Cells. Rheumatology, 45:1187. Laervon L 1984: Skelet traumata im Wachstumsalter. Hefte Unfalheilk. Spinger, Berlin-Heidelberg. Langer R and Vacanti JP 1993: Tissue engineering. Science, 260(5110), 920–926. Lee EH, Gao GX, Bose K 1993: Management of partial growth arrest: physis, fat, or silasties J Pediatr Orthop, 13:368–72. Lee EH, Chen F, Chan J, Bose K 1998: Treatment of growth arrest by transfer of cultured chondrocytes into physeal defects. J PediatrOrthop, 18: 155–60. Lee EH, Hui JHP 2006: Bone-Marrow Stem Cells as a Source for Cell Therapy. Journal of Bone and Joint Surgery. (British volume), 88:841. Lee JW, Kim YH, Kim SH, Han SH, Hahn SB, Yonsei 2004: Chondrogenic Differentiation of Mesenchymal Stem cells and its clinical applications, Medical Journal 45:41 – 47. Lennox DW, Goldner RD, Sussman MD 1983: Cartilage as an interposition material to prevent transphyseal bone bridge formation: an experimental model. J Pediatr Orthop 3:207–10.

89

Li WJ, Tuli R, Okafor C, Derfoul A, Danielson KG, Hall DJ, Tuan RS 2005: A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells. Biomaterials 26:599 – 609. Liechty KW, MacKenzie TC, Shaaban AF 2000: Human mesenchyma1 stem cells engraft and demonstrate sitaspecific differentiation after in utero transplantation in sheep. Nat Med, 11:1282–1286. Lisignoli G, Cristino S, Piacentini A, Toneguzzi S, Grossi F, Cavallo C, Zini N, Solimando L, Naraldi NM, Ficchini A 2005: Cellular et molecular events dutiny chondrogenesis of human mesenchymalstromal cells grown in threedimensional hyaluronan based scaffold. Biomaterials 26:5677 – 5686. Lo IK, Kirkley A, Fowler PJ, Miniaci A 1997: The outcome of operatively treated anterior cruciate ligament disruptions in the skeletally immature child. Arthroscopy, 5:627–634. Lucas PA, Calcutt AF, Southerland SS, Wilson A, Harvey R, Warejcka D and Young HE 1995: A population of cells resident within embryonic and newborn rat skeletal muscle is capable of differentiating into multiple mesodermal phenotypes. Wound Repair Regen. 3:457–68. MacKenzie TC, Flake AW 2002: Human mesenchymal stem cells: insights from a surrogate in vivo assay system. Cells Tissues Organs, 171(1):90–95. Makino T, Fujioka H, Kurosaka M, Matsui N, Yoshihara H, Tsunoda M, Mizuno K 2001: Histologie analysis of the implanted cartilage in an exact-fit osteochondral transplantation model. Arthroscopy, 17(7):747–51. Mankin HJ 1974: The reaction of articular cartilage to injury and osteoarthritis. N. Engl. J. Med. 291, 1285.

90

Meachim G 1963: The effect of scarification on articular cartilage in the rabbit. J. Bone and Joint Surg., roč. 45–B(1), s. 150–161. Mehls O, Himmele R, Kiepe O, Klaus G 2001: The interaction of glucocorticoids with the growth hormone-insulin-like growth factor and its effects on growth plate chondrocytes and bone cells. J Pediatr Endocrinol Metab, 14 Suppl 6:1475–82. Mendicino RW, Catanzariti AR, Hallivis R 2001: Mosaicplasty for the treatment of osteochondral defects of the ankle joint. Clin Pediatr Med Surg, 18(3):495–513. Métaizeau JP 1983: L 'ostéosznthese chey r enfant: techniques et indications. Rev.chir.ortop., 69:495–511. Mitchell JB, McIntosh K, Zvonic S, Garrett S, Floyd ZE, Kloster A, et al. 2006: Immunophenotype of human adipose-derived cells: Temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells;24:376–85. Mitchell N, Shepard N 1976: The resurfacing of adult rabbit articular cartilage by multiple perforations through the subchondral bone. J. Bone and Joint Surg., roč. 58–A, 230–233. Miura Z, Parvizi J, Fitzsimmons JS et al. 2002: Brief exposure to high-dose transforming growth factor-beta1 enhances periosteal chondrogenesis in vitro: a preliminary report. J Bone Joint Surg. 84–A(5):793–799. Miura M, Gronthos S, Zhao M, Lu B, Fisher LW, Robey PG,Shi S 2003: Stem cells from human exfoliated deciduous teeth, Proc Natl Acad Sci U S A. May 13;100(10):5807–12.

91

Motoki OS, Mulliken JB 1990: The healing of bone and cartilage. Clin Plast Surg, 17(3):527–44. Natalia Juncosa-Melvin, Gregory P. Boivin, Marc T. Galloway, Cindi Gooch et al 2006: Effects of Cell-to-Collagen Ratio in Stem Cell-Seeded Constructs for Achilles Tendon Repair. Tissue Engineering 12:681. Nehrer S, Breinan HA, Ramappa A, Hsu HP, Minas T, Shortkroff S, Sledge CB, Yannas IV, Spector M 1998: Chondrocyte seeded collagen matrices implanted in chondral defectin a canine model. Biomaterials 19:2313–2328. O'Driscoll SW 1998: Current concepts review: The healing and regeneration of articular cartilage. J Bone and Joint Surg. (American volume), roč. 80, s. 1795–1812. O'Driscoll SW, Keeley FW and Salter RB 1988: Durability of regenerated articular cartilage produced by free autologous periosteal graft in major fullthickness defects in joint surfaces under the influence of continuous passive motion. J. Bone Joint Surg. Am. 70, 595. Ochi M, Uchio Y, Kawasaki K, Wakitani S, Iwasa L 2002: Transplantation of cartilage-like tissue made by tissue engineering in the treatment of cartilage defects of the knee. J Bone Joint Surg Br, 84(4):571–578. Park. JS, Ahn JI, Oh DI 1994: Chondrocyte allograft transplantation for damaged growth plate reconstruction. Yonsei Med., 5:567–572. Parsch KD 1997: Modern trends in internal fixation of femoral shaft fractures in children. A critical review. J Pediatr Orthop B, 6(2):117–125.

92

Passaretti D, Silverman RP, Huang W, Kirchhoff CH, Ashiku S, Randolph MA, Yaremchuk MJ 2001: Cultured chondrocytes produce injectable tissueengineered cartilage in hydrogel polymer. Tissue Eng, 7(6):805–815. Pelinkovic D, Horas U, Engelhard M, Lee LY, Huard J, Fu FH 2002: Gene therapy for cartilage repair. Z Orthop lhre Grenzgeb, 140(2):153–159. Peterson L, Brittberg M, Kiviranta I, Akerlund EL, Lindahl A 2002: Autologous chondrocyte transplantation. Biomechanics and long-term durability. Am J Sports Med, 30(1):2–12. Petit P, Panuel M, Faure F, Jouve JL, Bourliere-Najean B, Bollini G, Devred P 1996: Acute fracture of the distal tibial physis: role of gradient-echo MR imaging versus plain film examination. Am J Roentgenol, 166(5):1203–6. Planka L, Stary D 2008: Nové možnosti v léčbě poúrazových defektů kloubní chrupavky. Rozhl Chir., roč. 87, č. 1, s. 621–625. Plumas J, Chaperot L, Richard MJ, Molens JP 2005: Immunomodulatory functions of mesenchymal stem cells. Leukemia 19:1597. Poul J. et al. 2009: Dětská ortopedie, Galén, první vydání. Puspa B, Padmini S, Antoniw JW 2006: Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Larchmont, 12:2263. Quintavalla J, Uziel-Fusi S, Yin J, Boehnlein E, Pastor G, Blancuzzi Singh HN, Kraus KH, O´Byrne E., Pellas TC 2002: Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects. Biomaterials 23:109–119.

93

Rand JA, Ilstrup DM 1991: Survivorship analysis of total knee arthroplasty. Cumulative rates of survival of 9200 total knee arthroplasties. J Bone and Joint Surg., roč. 73–A, s. 397–409. Ray C.-J. Chiu 2003: Human Mesenchymal Stem Cells Induce T Cell Anergy and Downregulate T Cell Allo-Responses via the TH2 Pathway: Relevance to Tissue Engineering Human Heart Valves Heart Failure. Reviews. Norwell 8:247. Risbud MV, Shapiro IM, Guttapalli A, Di Martino A, Danielson KG, Beiner JM , et al.2006: Osteogenic potential of adult human stem cells of the lumbar vertebral body and the iliac crest. Spine;31: 83–9. Rozkydal Z 2007: Artrózy. In: Pavel Janíček (ed.): Ortopedie. Brno: Masarykova Univerzita, Lékařská fakulta, s. 94–97. Saito T, Kuang JQ, Bittim B, Al-Khaldi A, Chiu RCJ 2002: Xenotransplant cardiac chimera: Immune tolerance of aduIt stem cells. Ann Thorac Surg, 74: 19–24. Sax JK 2006: The States „Race“ with the Federal Government for Stem Cell Research, 15 Ann. Health L.1 Shapiro F, Kolde S and Glimcher M 1993: Cell origin and differentiation in the repair of full-thickness defects of articular cartilage. J. Bone Joint Surg. 75A, 532, 1993. Schulze TG, de Souza P, Castrejon VH, John T, Merker HJ, Scheid A, Shakibaei M 2002: Redifferentiation of dedifferentiated human chondrocytes in high-density cultures. Cell Tissue Res, 308(3):371–379

94

Sims CD, Butler PE, Cao YL, Casanova R, Randolph MA, Black A, Vacanti CA, Yaremchuk MJ 1989: Tissue engineered neocartilage using plasma derived polymer substrates and chondrocytes. Plast Reconstr Surg, 101(6):1580–1585. Smoot EC 3rd, Bergman B, Lyons S 1995: Effect of the carbon dioxide laser on viability of ear cartilage in a rabbit model. J Craniofac Surg, 6(2):147–150. Solchaga, L. A., Penick, K., Porter, J. D., Goldberg, V. M., Caplan, A. I., and Welter, J. F.2005: FGF-2 enhances the mitotic and chondrogenic potentials of human adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J. Cell. Physiology, , 203(2), 398–409. Solchaga, L. A., Penick, K., Porter, J. D., Goldberg, V. M., Caplan, A. I., andWelter, J. F. FGF-2 enhances the mitotic and chondrogenic potentials of human adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J. Cell. Physiology, 2005, 203(2), 398–409. Steel RGD 1960: A rank sum test for comparing all pairs of treatments. Technometrics, 2: 197–207. Sýkora I, Dynterová A, Holda J, Marhan O 1983: Chov laboratorních zvířat. Institut výchovy a vzdělávání MZVž Praha. Šnajdauf J, Cvachovec K, Trč T 2002: Dětská traumatologie. 1 vyd. Praha, 180 s. ISBN 80-7262-152-1. Ting V, Sims CD, Brecht LE, McCarthy JG, Kasabian AK, Connelly PR, Elisseeff J, Gittes GK, Longaker MT 1998: In vitro prefabrication of human cartilage shapes using fibrin glue and human chondrocytes. Ann Plast Surg, 40(4):413–420.

95

Tisato V, Naresh K, Girdlestone J, Navarrete C, Dazzi F 2007: Mesenchymal stem cells of cord blood origin are effective at preventing but not treating graft-versus-host disease Leukemia. Baltimore: Sep. Vol. 21, Iss. 9; pg. 1992, 8 pgs. Tobita M, Ochi M, Uchio Y, Mori R, Iwasa J, Katsube K, Motomura T 2002: Treatment of growth plate injurywith autogenous chondrocytes: a study in rabbits. Acta Orthop Scand, 73(3):352–358. Uematsu K, Hattori K, Ishimoto Y, Yamauchi J, Habata T, Takakura Y, Ohgushi H, Fukuchi T, Sato M 2005: Cartilage regeneration using mesenchymal stem cells and three-dimensional poly-lactic-glycolic acid (PLGA) scaffold. Biomaterials 26:4273–4279. Vachon A, Bramlage LR, Gabel AA, Weisbrode S 1986: Evaluation of the repair process of cartilage defects of the equine third carpal bone with and without subchondral bone perforation. Am. J. Vet. Res.,roč. 47, s. 2637–2645. Wakitani S, Yamamoto T 2002: Response of the donor and recipient cells in mesenchymal cell transplantation to cartilage defect. Microsc Res Tech, 58(1):14–18. Wang Z, Goh J, Das De S, Ge Z et al 2006: Efficacy of bone marrow-derived stem cells in strengthening osteoporotic bone in a rabbit model. Tissue Engineering 12:1753. Williamson RV, Staheli LT 1990: Partial physeal growth arrest: treatment by bridge resection and fat interposition. J Pediatr Orthop.10: 769–776.

96

Wirth T, Byers S, Byard RW, Hopwood JJ, Foster BK 1994: The implantation of cartilaginous and periosteal tissue into growth plate defects.lnt Orthop, 18(4):220–228. Xia W, Shang Q, Cui L, Xu R, Ding X, Cao Y 2002: In vitro chondrogenic phenotype differentiation of bone marrow stem cells. Zhonghua Zheng Xing Wai Ke Za Zhi, 18(1):12–4. Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ , et al. 2001: Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng;7:211–28.

97

8. Seznam vyobrazení

Obr. 1 – Historie traumatologie, zdroj www.zdravcentra.cz Obr. 2 – Schéma artroskopie ramena, zdroj www.allmedicaltourism.com Obr. 3 – Rtg paže a osteosyntéza ESIN, zdroj archiv autora Obr. 4 – Rtg lokte a osteosyntéza Kirschnerovými dráty, zdroj archiv autora Obr. 5 – Experimentální transplantace chondrocytárního štěpu do defektu růstové chrupavky, zdroj archiv autora Obr. 6 – Histologický preparát chrupavky-chondrocyty, zdroj www.cytochemistry.net Obr. 7 – Histologický preparát chrupavky, zdroj www.cytochemistry.net Obr. 8 – Chonrocyt, zdroj www.msm.cam.ac.uk Obr. 9 – Histologický preparát apoziční růst chrupavky, zdroj www.sci.muni.cz Obr. 10 – Histologický preparát intersticiální růst chrupavky, zdroj www.sci.muni.cz Obr. 11 – Schéma histologického řezu hyalinní chrupavkou, zdroj The University of Western Australia Obr. 12 – Histologický preparát hylinní chrupavky, zdroj Lakeland Community College Obr. 13 – Histologický preparát elastická chrupavka, zdroj Histology atlas, Palomar college Obr. 14 – Histologický preparát vazivová chrupavka, zdroj Dept. of Anatomy & Cell Biology, Indiana University School of Medicine Obr. 15 – Schéma artróza, zdroj www.longevity-medicine.de Obr. 16 – Artróza kloubů ruky, zdroj www.stemcellclinic.com Obr. 17 – Artróza kloubů ruky, zdroj www.stemcellclinic.com Obr. 18 – Artróza kloubů ruky, zdroj www.stemcellclinic.com Obr. 19 – Rtg artróza kolena, zdroj www.sportmedizin-samedan.ch Obr. 20 – Rtg coxartróza, zdroj www.achot.cz Obr. 21 – Rtg avaskulární nekróza hlavice, zdroj www.gait.aidi.udel.edu

98

Obr. 22 – Rtg osteochondrosis dissecans, zdroj www.learningradiology.com Obr. 23 – Schéma místa nejčastějšího výskytu OCD léze, zdroj Dungl a kol. Ortopedie Obr. 24 – MR lokte-osteochondrosis dissecans, zdroj www.aap.org Obr. 25 – Artroskopie kolena- ošetření léze chrupavky metodou mikrofraktury Obr. 26 – Experimentální ošetření léze chrupavky metodou forrage, zdroj archiv autora Obr. 27 – Artroskopické vyšetření kolena - archív autora Obr. 28 – Rtg hlezna-myška v hlezenním kloubu, zdroj www.acvs.org Obr. 29 – Mozaikoplastika defektu chrupavky kolena, www.surreryorthoclinic.co.uk Obr. 30 – Schéma transplantace chondrocytů do defektu chrupavky mediálního kondylu tibie, zdroj www.luotain.uku.fi Obr. 31 – TEP a) předoperační snímek - koxartróza vpravo b) pooperační snímek – po implantaci TEP c) stav po 66 měsících od operace zdroj www.achot.cz Obr. 32 – Schéma mesenchymální kmenová buňka, zdroj: archív autora Obr. 33 – Biomedicínský model miniaturního prasete, zdroj archív autora Obr. 34 – Miniaturní prasata, zdroj archív autora Obr. 35 – Defekt zátěžové plochy mediálního kondylu femoru, zdroj archív autora Obr. 36 – Defekt zátěžové plochy laterálního kondylu femoru, zdroj archív autora Obr. 37 – Experimentálně vytvořený defekt kloubní chrupavky ošetřen metodou mikrofraktury, zdroj archív autora Obr. 38 – Odběr kostní dřeně, zdroj archív autora Obr. 39 – Odloučení erytrocytů a granulocytů ve formě peletu na dně zkumavky po centrifugaci, zdroj archív autora Obr. 40 – Výsev kmenových buněk 4–5. den, zdroj archív autora Obr. 41 – Kultivace kmenových buněk 10. den, zdroj archív autora

99

Obr. 42 – Peletky, zdroj archív autora Obr. 43 – Nosič mikroskopicky, zdroj archív autora Obr. 44 – Nosiče v 96ti jamkové destičce, zdroj archív autora Obr. 45 – Anestesie u experimentálního zvířete, zdroj archív autora Obr. 46 – Anestesie u experimentálního zvířete – měření saturace, zdroj archív autora Obr. 47 – Příprava operačního pole, zdroj archív autora Obr. 48 – Příprava artrotomie kolena u experimentálního zvířete, zdroj archív autora Obr. 49 – Artrotomie kolena u experimentálního zvířete, zdroj archív autora Obr. 50 – Operační nástoje, zdroj archív autora Obr. 51 – Vrtání defektu kloubní chrupavky, zdroj archív autora Obr. 52 – Nosiče s kmenovými buňkami, zdroj archív autora Obr. 53 – Transport nosiče s kmenovými buňkami, zdroj archív autora Obr. 54 – Přenos nosiče s kmenovými buňkami do operačního pole, zdroj archív autora Obr. 55 – Umístění nosiče s kmenovými buňkami do vytvořeného defektu kloubní chrupavky laterálního kondylu femoru experimentálního zvířete, zdroj archív autora Obr. 56 – Kruhový skalpel, zdroj archív autora Obr. 57 – Vytváření léze kloubní chrupavky kruhovým skalpelem, zdroj archív autora Obr. 58 – Experimentální léze kloubní chrupavky vytvořená kruhovým skalpelem, zdroj archív autora Obr. 59 – Ošetření experimentální léze kloubní chrupavky metodou mikrofraktury, zdroj archív autora Obr. 60 – Sutura kůže, zdroj archív autora Obr. 61 – Histologický preparát - zhojený defekt kloubní chrupavky ošetřený transplantací nosiče s kmenovými buňkami, zdroj archív autora Obr. 62 – Histologický preparát - zhojený defekt kloubní chrupavky ošetřený pouze transplantací nosiče bez kmenových buněk, zdroj archív autora

100

Obr. 63 – Zhojený defekt kloubní chrupavky ošetřený transplantací nosiče s kmenovými buňkami, makroskopicky, zdroj archív autora Obr. 64 – Zhojený defekt kloubní chrupavky ošetřený transplantací nosiče bez kmenových buněk, makroskopicky, zdroj archív autora Obr. 65 – Barvení na kolagen II, zdroj archív autora Obr. 66 – Imunofluorescence Graf 1 – Imunofenotypizace kmenových buněk Graf 2 – Makroskopické hodnocení zhojených defektů Graf 3 – Grafické zobrazení hodnoty O´Driscollova skore Graf 4 – Grafické zobrazení kolagen II pozitivity

101

9. Publikace výsledků

Publikace v časopisech Plánka L., Starý D., Srnec R., Nečas A., Gál P.: Nové možnosti v léčbě poúrazových defektů kloubní chrupavky. Rozhl. Chir. 2008, roč. 87, č. 1, s. 42–45. Nečas A, Plánka L, Srnec R, Crha M, Hlučilová J, Klíma J, Starý D, Křen L, Amler E, Vojtová L, Jančář J, Gál P. Quality of newly formed cartilaginous tissue in defects of articular surface after transplantation of mesenchymal stem cells in a composite scaffold based on collagen I with chitosan micro- and nanofibres. Physiol Res. 2009 Nov 20. [Epub ahead of print] Presentace na odborných akcích Planka L., Stary D., Necas A., Srnec R., Hlucilova J., Kren L., Gal P.: Mesenchymal stem cells in treatment of growth plate and articular cartilage. Provided in 2nd Congress of the European Academy of Paediatrics, Nice 24.–28.10.2008, France, abstrakt No 1357 Planka Ladislav, Gal Petr, Kren Leos, Necas Alois, Rauser Petr, Srnec Robin, Stary David, New composite scaffold and mesenchymal stem cells in treatment of articular cartilage defect. provided on 10th EFORT Congress, 3.6.–6.6.2009 Vienna, Abstract Code F416 L. Plánka, D. Starý, Srnec R., Raušer P.Využití kmenových buněk k léčbě hlubokého defektu kloubního povrchu. Předneseno na XVII. Frejkových dnech, 25.–26.6.2009, Brno

102

D. Starý, L. Plánka, J. Jochymek, R. Srnec, P. Raušer, A. Nečas, P. Gál. Využití kmenových buněk k léčbě hlubokého defektu kloubního povrchu. Předneseno na IV. Moravských ortopedických a traumatologických dnech, Přerov 19.–20.11.2009, uvedeno v elektronickém sborníku abstrakt č. 11

103