20.10.2016
Mikroorganismy v potravinářství III Fermentované mléčné a masné výrobky
Výroba sýrů • první sýry objevily náhodou kočovné kmeny jižní Asie a Středního východu • kočovníci nalili čerstvé mléko do kožených vaků, aby mohli během dlouhých jízd utišit žízeň – mléko se změnilo v bledou, lehce nakyslou tekutinu (syrovátka), v níž plavaly husté chuchvalce bílé sýřeniny • kožené vaky – ze žaludku mladých zvířat, obsahovaly srážecí enzymy, zvané renniny; zbytek vykonalo slunce a pohyby klusajícího koně • další způsob objevily usedle společností při chovatelství domácích zvířat – skladovali mléko v nádobách, které obsahovaly i zbytky mléka s kyselinou mléčnou – teplé mléko zkyslo a zhoustlo • mnoho současných sýrů se začalo profilovat ve středověku – 879 gorgonzola, 1070 Roquefort, 1200 grana, 1579 parmezán
Druhy sýrů podle tvrdostí: A) čerstvé sýry – vysoký obsah vody, určeny pro rychlou konzumací bez dalšího zrání (tvaroh, Cottage, Mascarpone) B) měkké – krátké období zrání, menší množství vody a tuku (smetanový sýr, bryndza, Brie, Camembert, Romadur, Feta, Jadel) C) polotvrdé – hutná struktura, pružné, snadno se krájí (Gouda, Eidam, Provolone, Moravský bochník) D) tvrdé – robustní, tvrdá sýřenina, kterou často nelze nakrájet (Parmazán, Čedar, Ementál, Gran Moravia, Pecorino) E) tavené sýry – výroba zahřátím jednoho nebo více přírodních sýrů a jejích roztavením za vysokého tlaku při teplotách 120°C, přidává se máslo a tavící soli (homogenita) F) syrovátkové sýry – ze zahuštěné nebo vyvařené syrovátky (Ricotta)
1
20.10.2016
Výroba sýrů o nejvýznamnější mléčné výrobky u kterých probíhá fermentace o základní surovina - mléko plnotučné/odtučněné, smetana a podmáslí Laktóza: • 90% všech sacharidů mléka (4,5 -5%) • přispívá k fyzikálním vlastnostem mléka (osmotický tlak, bod mrznutí, bod varu) • chuť, zdroj energie, podporuje absorpci vápníku
o sražením přídavkem syřidla nebo kyselinou mléčnou vzniklou zkvašením laktosy se vytváří sraženina, která se dále zpracovává na sýr o vlastni výroba sýrů je složitý proces, ve kterém jsou kladeny vysoké technologické i hygienické nároky nejen na mléko ale i na jednotlivé fáze výroby o mléko nesmí obsahovat patogenní mikroorganismy, nevhodné je však i mléko, které je kontaminováno velkým množstvím koliformních bakterii a klostridii respektive bakterii máselného kvašeni o mléko musí být získáno od zdravých, správně krmených a ošetřovaných zvířat
Schéma výroby sýrů Syrové mléko
Pasterace mléka
Výroba sýrů
o mléko s sýření může být zpracováno v syrovém stavu nebo musí být
Šetrná pasterace
upraveno zahříváním (termizace/pasterace)
Standardizace, homogenizace
o syrové mléko se zahřeje na 63-68°C (nebo 15-40s na 70-72°C) –
Úprava mléka před sýřením
Přídavek čistých mlékařských kultur a chloridu vápenatého
Sýření mléka
Přídavek syřidla; sražením mléka vznikne sýřenina
Zpracování sýřeniny
Zpracování na zrno požadované velikosti a tuhosti
Formování sýrů
Syrovátka
Solení Zrání a ošetřování sýrů ve zracích sklepích
Mlékařské kultury Za zákysové bakterie mléčného kvašení se považují ty, které při 36–37°C
zabezpečuje nezávadný mikrobiologicko-hygienický stav mléka k sýření Standardizace a homogenizace mléka o standardizace - mléko se odtučňuje nebo se do něj tuk přidává o homogenizace – zmenšení tukových kuliček v mléce, čímž se usnadňuje rozklad tuku v průběhu zrání a tvorba charakteristické chuti a vůně Úprava mléka před sýřením o do mléka se přidávají bakterie mléčného kvašení, celá směs se ohřívá na 18-32°C (vysrážení bílkovin kys. mléčnou nebo syřidlem) – 10 min až 2h o přidávají se některá aditiva, např. CaCl2, NaNO3, karoten, lipasy, H2O2
Mlékařské kultury
dokáží za 6 hodin vyprodukovat tolik kyseliny mléčné, aby se snížila
Čisté mlékařské kultury (ČMK) - jsou definované, rozmnožování schopné
kyselost mléka z původní hodnoty pH 6.8 na pH < 5.3.
mikroorganismy v sólových či směsných kulturách, selektované podle
Nezákysové bakterie mléčného kvašení (NSLAB) jsou skupinou tvořenou
specifických vlastností.
především mezofilními laktobacily (Lactobacillus casei, L. rhamnosus, L.
paracesei, L. plantarum, L. curvatus) a pediokoky (P. acidilactici, P.
Podle složení jsou ČMK označovány jako:
pentosaceus) - pochází především z nepasterovaného mléka, u sýrů
• monokultury - jeden definovaný kmen jednoho druh
vyráběných z mléka pasterovaného je jejich zdrojem rekontaminace mléka
• složené kultury - více definovaných druhů a kmenů
ze zařízeni či z předešlých výrob.
• směsné kultury - nedefinované kmeny jednoho či více druhů
V sýrech z nepasterovaného mléka může docházet k různým interakcím
mikroorganismů
mezi zákysovými a nezákysovými bakteriemi, např. Lactobacillus casei,
L. rhamnosus a L. plantarum mohou inhibovat enterokoky a propionové bakterie produkci inhibičních látek nebo odčerpáním limitních živin.
2
20.10.2016
Mlékařské kultury
Mlékařské kultury
o primární (základní) kultury – zajišťují prokysání mléka i sýrů, uvolňují
o homofermentativní – výsledným produktem fermentace je pouze
enzymy podílející se následně na tvorbě aroma
kyselina mléčná (Lactococcus lactis subsp. lactis, Streptococcus
• mezofilní – tvoří smetanový zákys, někdy se používají i pro předzrání
thermofilus)
mléka (Lactococcus lactis ssp. lactis, L. lactis ssp. cremoris);
o heterofermentativní – kromě kyseliny mléčné tvoři také kyselinu
optimální teplota pro růst je 16-23°C, inkubační doba 16-20 hodin;
octovou, etanol a CO2 (Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris) o bakterie propionového kvašení – výsledkem fermentace je kyselina
vyznačuje se tvorbou kyselin, CO2 a aromatických látek, především diacetylu; zdrojem uhlíku jsou citrany mléka
propionová (Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii,
• termofilní – využívané pro sýry s vysokodohřívanou sýřeninou (při
P. freudenreichii subsp. freudenreichii); používají se nejčastěji při
teplotě 51-55°C) (Streptococcus salivarus ssp. thermophilus,
výrobě sýrů s vysokodohřívanou sýřeninou a s tvorbou ok v těstě
Lactobacillus helveticus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. d. subsp.
(vytvořená CO2 vzniklým při fermentaci mléčnanu)
lactis); kromě fermentace laktózy na kyselinu mléčnou májí i mírnou proteolytickou aktivitu a spolu s reziduální aktivitou syřidlových enzymů ovlivňují chuť, vůni a reologické vlastnosti sýrů
Mlékařské kultury
Výroba sýrů
o sekundární (doplňkové) kultury – specifické pro jednotlivé druhy sýrů • pro tvrdé sýry – Lactobacillus helveticus, L. casei
Sýření mléka a zpracování sýřeniny
• pro hlubší proteolýzu se volí L. delbruecki ssp. lactis
o pomocí syřidla nebo kultur mléčného kvašení
• u sýru ementálského typu se používají bakterie propionového kvašení
o pouze bakterie – tzv. sýr z kyselého mléka (např. tvaroh, selské sýry)
o pro sýry s plísní na povrchu se přidává Penicillium camemberti (syn.
P. caseicolum a P. candidum)
o použití syřidla – tzv. sladké sýry (Brie, Gouda, Emental, apod.) o účinek syřidla spočívá v působení proteolytických enzymů na kasein
o pro sýry s modrou plísní v těstě se mléko očkuje kulturou P. roquefortii (a P. glaucum)
o syřidlo - enzym chymozin (rozloží mléko na tekutou a pevnou část) se žaludku mladých koz, ovci a telat
o mazová kultura – při výrobě sýrů zrajících pod mazem - Brevibacterium
linens a bakterie rodu Arthrobacter (jsou výrazně proteolytické) spolu s kvasinkami např. Debaryomyces hanseni, Kluyveromyces lactis,
výtažek z rostlin (Svízel syřišťový, fíkovník) mikrobiální - Rhizomucor miehei, R. pusicllus, Mucor miehei, nebo rekombinantní mikroorganismy (Kluyveromyces lactis)
K. marxianus, Geotrichum candidum, Rhodotorula – oxidačně odkyseluji povrch sýrů přeměnou kyseliny mléčné a mléčnanů na CO2 a H2O
Výroba sýrů
Formování sýrů
Výroba sýrů
Sýření mléka a zpracování sýřeniny
o sýřenina se oddělí od syrovátky a umístí se do forem
o syřidlo se vmíchá do zahřátého mléka, dojde k vysrážení a mléko se
o velké bochníky – sýřenina se z kotle vybírá plachtou, syrovátka se nechá okapat a potom se hmota napěchuje do forem nebo se sýřenina tlakem
promění ve dvě substance:
vylisuje a potom se formuje nebo krájí na kusy
• pevnou – tvaroh/sýrařské zrno/sýřenina
o lisováním se odstraní zbytky syrovátky (doba a síla tlaku je odlišná u
• tekutou – syrovátka o zpracování sýřeniny na zrno požadované velikostí a tuhostí - řezáním pomocí sýrařské harfy (větší sýrové zrno obsahuje víc
e
různých druhu sýra) Solení sýrů
vody – čím jemněji se sýřenina rozřeže tím více
o solení v lázni – mechanizace solení, malá spotřeba soli
syrovátky se usadí a tím pevnější bude budoucí sýr)
o solení do těsta – Čedar, Gorgonzola
o čím hutnější sýr chceme vyrobit tím více musí být přihříván
o na sucho – sůl se roztírá na povrchu (Feta, Niva) o solením získávají sýry slanou chuť a zpevňuje se jejich tvar o sůl odebírá přebytečnou syrovátku, chrání před vysycháním, konzervuje
3
20.10.2016
Zrání sýrů
Výroba sýrů
Výroba sýrů
primární (anaerobní) – sýry prozrávají v celé hmotě (pomalejší – u sýrů tvrdých, s plísní ve hmotě) - kvašení sekundární (aerobní) – sýry zrají od povrchu dovnitř (rychleji – u sýrů kyselých a měkkých) - proteolýza o enzymatický pochod, během kterého sýr získává svou charakteristickou vůní, chuť, vzhled a konzistenci o mění se složení sýra, hlavně mléčného cukru a bílkovin o probíhá ve zracích místnostech (optimální teplota a relativní vlhkost) o sýry mohou zrát několik dnů, ale i řadu měsíců (i celé roky) o měkké sýry se ošetřují otíráním 3% solným roztokem nebo roztíráním mazu a současně se obracejí; tvrdé sýry se obracejí, což podporuje vytvoření celistvého povrchu; při zrání pod plísní se sýry jen obracejí; sýry z plísní v těstě se otáčejí, oškrabávají, omývají solným roztokem a 2-3x provzdušňují propichováním
Výroba plísňových sýrů Roquefort vzniká působením kultury Penicillium roquefortii pravý Roquefort měl by splňovat dvě podmínky: 1) být vyroben z nepasterovaného ovčího mléka (52% tuku v sušině) 2) zrát ve vápencových jeskyních na historickém území Roquefortu (zdroj plísně), které jsou větrány přírodními tunely tzv. fleurine (teplota 8-12ºC, vlhkost až 95%) – 3 měsíce až několik let do plnotučného nepasterovaného ovčího mléka, zahřátého na 32ºC, se plíseň přidává zároveň se syřidlem výroba bochníku trvá 1 den, 2 dny sýr schne, 5 dni se otáčí a soli, pak je propíchnut 32 tenkými jehlami (přistup kyslíku a možnost uniku CO 2) a uložen do jeskyni – v průběhu zrání se ručně seškrabují plísně
Výroba plísňových sýrů Camembert vyráběný z nepasterovaného kravského mléka, za použití druhu Penicillium camemberti (P. caseiolum, P. candidum) plísně tvoří husté pokrytí myceliem na vnější straně sýru, a jejích extracelulární proteasy pronikají dovnitř, metabolizují mléčné bílkoviny a dávají sýru hebkost, měkkost a konzistenci másla povrch každého sýra se postříká vodní suspenzí spor P. camemberti a sýry zrají aspoň 3 týdny některé kmeny při teplotě nad 10ºC mohou produkovat mykotoxin kys.
Penicillium roquefortii se kultivuje: na malých šiškách chleba v uzavřených láhvích na polosyrových chlebových bochnících, které se pak rozemelou na povrchu vysterilizovaných krup – do sýrové hmoty se spory splachují vodou může tolerovat vysoký obsah oxidu uhličitého, a nízkou úroveň kyslíku prorůstá do tvarohu v místech umělé vyvrtaných děr některé kmeny mohou produkovat mykotoxin roquefortin – nutné používat striktně netoxinogenní kmeny!
Penicillium glaucum – Gorgonzola, Stilton
Výroba tvarůžků vyrábí se z netučného tvarohu (z pasterizovaného kravského mléka) tvaroh se několik týdnů uchovává v 4 – 5% soli a podléhá určitému zraní (sůl působí jako konzervant proti plísním) tvaroh se mícha, mele a formuje, potom se suši - což umožňuje rozvoj kvasinek - při teplotě 18 – 45°C, sušina pak činí 36% a pH 6.4 proces vlastního zraní začíná až po praní a trvá při teplotě 15 – 20°C 4 - 8 dni zraní působí proteolytická mikroflóra především Brevibacterium linens, vytváří se oranžový maz a typická chuť a vůně mají zcela ojedinělou pikantní chuť, typickou vůni, povrch se
cyklopiazonovou – nutné používat
zlatožlutým mazem a soudržnou poloměkkou až měkkou konzistencí
striktně netoxinogenní kmeny!
s patrným světlejším jádrem
4
20.10.2016
Výroba tvarůžků
Časté vady sýrů mikrobiálního původu časné duření sýrů (projevuje se pod lisem nebo v solné lázni) -
Escherichia, Enterobacter či některé kvasinky pozdní duření sýrů - Clostridium tyrobutyricum a C. butyricum hořká chuť - Bacillus cereus, B. brevis, kvasinky rodu Candida rakovina kůry (měkka místa a propadávaní) - Scopulariopsis brevicaulis,
Penicillium, Geotrichum, Proteus hnilobná chuť - Clostridium sporogenes, Proteus, koliformní bakterie barevné změny: • žluté skvrny - Micrococcus luteus, Aspergillus flavus • hnědé skvrny - Penicillium casei • velké bílé skvrny uvnitř sýrů - Clostridium sporogenes • rezavé skvrny - Lactobacillus plantarum, L. brevis,
Propionobacterium theonii
Výroba jogurtů
Výroba jogurtů vyráběny kysacím procesem z pasterovaného mléka s různým obsahem mléčného tuku, za použití „jogurtové kultury“ směs symbiotických mikroorganismů Streptococcus salivarius subsp.
thermophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ve vhodném poměru (1 : 1 až 1 : 2 až 2 : 1) mléka určena na výrobu jogurtu se obyčejně očkuji 1 – 2% j. kultury jogurty obsahují řadu biologicky aktivních složek a látek, které pozitivně ovlivňují lidský organismus, především bakterie mléčného kvašení použité při jejich výrobě, produkty jejich metabolismu a látky pocházející z mléka; do některých druhů jogurtů se přidávají také zdraví prospěšné probiotické kultury
Jogurtová kultura Streptococcus thermophilus a Lactobacillus bulgaricus mají symbiotický vztah a spolu se vyznačují rychlou tvorbou kys. mléčné a produkci aromatvorné látky acetaldehydu (20-30 mg/l) v 1ml jogurtové kultury má byt řadově nejméně 107 bakt. jednotek Lactobacillus bulgaricus díky větší proteolytické aktivitě uvolňuje aminokyseliny z bílkovin mléka, a tím stimuluje růst Streptococcus
thermophilus
Výroba jogurtů k výrobě se používá nezahuštěné mléko nebo různě zahuštěné mléko o různé tučnosti připravená směs mléka se homogenizuje, pasteruje a temperuje na teplotu zrání, pak jsou přidány mikroorganismy ve formě jogurtového zákysu (ze sterilního mléka a ČMK) METODA TANKOVÁ
Streptococcus thermophilus poté stimuluje růst a metabolismus Lactobacillus bulgaricus tvorbou kys. mravenčí (může také vznikat při výrobě jogurtů zahříváním na 85°C na 20-30 minut nebo 95°C na 5 minut termickým rozkladem laktózy, ale jen v omezené míře)
METODA TERMOSTATOVÁ
5
20.10.2016
Výroba jogurtů
Výroba jogurtů
Metoda termostatová (klasická)
Metoda tanková
do mléka zaočkovaného zákysovou kulturou se přidávají přísady (ovocný
mléko zraje a koagulát vzniká přímo ve fermentačním tanku při teplotě
podíl, aromata) a takto upravená směs se plní do obalů, ve kterých při požadované teplotě (40-45°C) zrají 2-4h
30°C po dobu 16 – 18h je důležité správně určit pH koagulátu pro ukončení kysání (chlazení)
potom se co nejrychleji ochladi pod 10°C, aby se zastavilo kysani
a začátek mísení s přísadami (zhoršení reologických vlastnosti zralého
chlazení ve spotřebitelských obalech je možno začít při kyselosti kolem
koagulátu, zvláště zvýšení oddělování syrovátky) - míchání až po
pH 5.3 (buď cirkulací chladného vzduchu nebo pomocí protékající studené vody) takto vyrobeny jogurt má bílou barvu, hladký povrch a jemnou konzistenci, při obraceni kelímku nevytéká, při vloženi lžíce si zachovává
dosažení pH 4.4 riziko závad při zpracování koagulátu je tím menší, čím nižší je teplota na začátku míchání - pod 7°C není již žádné nebezpečí vzniku závad tento jogurt je méně aromaticky a méně kysely, má řidší krémovitější
jemnou konzistenci, chuť a vůně je čista, výrazně aromatická,
konzistenci (během 24h se konzistence koagulátu zlepši, ale nikdy
jogurtová, správně kysela
nedosáhne stejné struktury jako při fermentaci ve spotřebitelském baleni)
Vady jogurtů mikrobiálního původu •
vady mikrobiálního původu spojené s bakteriemi mléčného kvašeni a chybami v technologii výroby:
bakterii produkujících kyselinu mléčnou (Lactococcus lactis subsp.
hořká chuť vznikající při přílišné proteolýze
lactis a subsp. cremoris) a aromatvorných bakterii Leuconostoc
kovová chuť při přílišném prokysaní
mesenteroides subsp. cremoris případně Lactococcus lactis subsp.
reologické vady
•
o na výrobu kysaných mlék se používá smetanový zákys složeny z
přílišná tvorba slizových látek
prázdna (málo kysela) chuť při nedostatečném prokysaní •
Jiné kysané mléčné produkty
kontaminace: Bacillus cereus - sladké sraženi provázené nesouvislou
diacetylactis o použivá se homogenizované pasterované mléko z obsahem tuku 0,5-3,5%
sraženinou a chuťovými změnami; kvasinky jako Saccharomyces
o vychladí se na kysací teplotu 18-23°C
cerevisiae, Kluyveromyces fragilis, Candida - kvasničnou či ovocnou
o zakvasí se 0,6 až 1,5 % smetanové kultury
chuť a plynatost jogurtu (přítomnost bublinek plynu) eventuálně i
o fermentace probíhá 16 – 20 hodin
křísovitý povlak; plísně - mohou jogurt kontaminovat
o koagulát je hustý a má porcelánovitý vzhled
koliformní bakterie jsou při dobrem prokysaní inhibovaný
o po skončení zrání se plní do obalů a chladí na teplotu pod 10°C
Jiné kysané mléčné produkty
Jiné kysané mléčné produkty
o kysané smetany jsou výrobky jemné, mírně kyselé chuti a viskózní
o acidofilní mléko se tradičně vyrábělo pomoci Lactobacillus acidophilus
konzistence o u smetan s obsahem 10 – 12% tuku se homogenizuje za tlaku 15–20 MPa při teplotě 60 – 70°C o u smetan s 20 – 30% tuku se používá nižší homogenizační tlak 10–12 Mpa
o v současnosti se pro dosaženi vhodných organoleptických vlastnosti tento výrobek připravuje smícháním s mlékem fermentovaným pomoci smetanového zákysu v poměru asi 1 : 9 o získává se metodou oddělené fermentace - 9 dílů vysokopasterovaného
(není dostatečné množství kazeinu k vytvoření membrán na povrchu
(UHT) homogenizovaného mléka se zakysá základní smetanovou kulturou
tukových kuliček)
(fermentace 15–19 hodin při 21–23°C) a 1 díl se zakysá 1% acidofilní
o zaočkovává se 1 až 4% smetanové kultury o fermentace probíhá při teplotě 18 – 21°C po dobu 18 – 20 hodin
kultury (fermentace 12–15 hodin při 37°C) o po skončení fermentace se obě sraženiny smíchají a homogenizují při tlaku 5 – 8 MPa, vychladí pod 10°C a plní do obalů
6
20.10.2016
Jiné kysané mléčné produkty o biokys se získává metodou oddělené fermentace - 9 dílů vysokopasterovaného homogenizovaného mléka se zakysá 0,5 a 1% zákysu složeného z kmenů Bifidobacterium bifidum a Pedicoccus
acidilactici (fermentace 14 – 16 hodin při 33 – 37°C) a 1 díl se zakysá 1% acidofilní kultury (fermentace 14 – 16 hodin při 28 – 37°C); po ukončení zrání se obě směsi opatrně promíchají a ochladí pod 10°C a plní do obalů o na výrobu kefíru se používají směsné kultury bakterii (Lactobacillus
delbrueckii subsp. lactis případně L. casei a Lactococcus lactis subsp. lactis) a kvasinek zkvašujících laktosu (Kluyveromyces lactis, K. marxianus, Candida kefyr); zaočkuje se 2-3% kultury; dvoustupňová inkubace – 12h 22-23°C na pH 4,5 a 12-14h 14-16°C, další pokles pH
Tibetská houba • kefíru podobný mléčný kvašený nápoj • hindukušský hříbek nebo „jogo“ – směsná kultura kvasinek (Candida
tenuis, Kluyveromyces lactis) a bakterií mléčného kvašení (Streptococcus bovis, S. suis) v podobě květákové hmoty • po propláchnutí vodou se jogo přidává do syrového kravského mléka ve skleněné nádobě, zakrývá se prodyšnou tkaninou a ponechá 24-26h při pokojové teplotě • při delší fermentaci (2-3 dny) má tekutina ostřejší chuť • kultura se musí každý den propláchnout a přenést do čerstvého mléka • blahodárné účinky – úprava látkové výměny, krevního tlaku a hladiny cukru, rychlejší odbourávání cholesterolu v cévách, rozpouštění žlučových kamenů, pozitivní vliv na nervy a zlepšení pamětí
Probiotika
Probiotika Probiotika jsou definována jako živé organismy, které pokud jsou konzumovány v adekvátním množství, pozitivně ovlivňují zdraví hostitele Bylo prokázáno, že mrtvé bakterie, části bakteriálních buněk, bakteriální DNA a uvolňované substance mají antibakteriální, protizánětlivý, imunomodulační a další efekty podobné těm, které vykazují živé bakteriální buňky. Mnoho prospěšných účinků bylo připsáno také UV-inaktivovaným nebo mrtvým probiotickým kmenům.
Světová gastroenterologická organizace shrnuje účinky probiotik: imunologický účinek:
Bylo zjištěno, že probiotické druhy jsou schopny rozpoznávat,
• zvýšení přítomnosti antigenu k B lymfocytům a zvýšení produkce IgA
syntetizovat a uvolňovat nízkomolekulární bioaktivní látky různého
• ovlivnění profilu cytosinů
chemického složení, které mohou penetrovat do intestinálního traktu, přilehlých tkání a buněk a modifikovat fyziologické nebo metabolické
• ovlivnění reakce na potravinové alergeny neimunologický účinek:
procesy v lidském těle vyúsťující ve zdraví prospěšný efekt. Probiotické
• kompetice o zdroje energie s patogenními mikroorganismy
kmeny mohou také spouštět kaskádu událostí spojenou s expresí různých
• změna lokálního pH vytvářející nepříznivé podmínky pro patogeny
genů, jejichž produkty mohou ovlivňovat interakce mezi bakteriemi
• produkce bakteriocinů
navzájem nebo mezi bakteriemi a buňkami lidského těla. Mechanismus je
• stimulace produkce mucinu
odlišný u různých probiotických kmenů
• likvidace radikálů
I když probiotické účinky byly potvrzeny i u jiných mikroorganismů (Enterococcus
• zlepšení funkce intestinální bariéry
faecium, E. coli Nissle 1917, Saccharomyses boulardii), tyto účinky jsou připisovány
• kompetice o adhezi ke střevní stěně s patogenními mikroorganismy
a zkoumány převážně u bakterií mléčného kvašení a bifidobakterií.
• modifikace toxinů vytvořených patogeny
7
20.10.2016
Technologické vlastnosti mikroorganismu I.
probiotické mikroorganismy musí v dostatečném množství (106 - 109 KTJ/g výrobku) přežívat technologický i skladovací proces a přinášet výrobku vhodné senzorické vlastnosti
II. nárůst buněk za použití 1 - 10% inokula během 24 h by měl dosahovat denzitu 108 - 109 KTJ/ml a kmeny by měly být tolerantní vůči kyslíku pro kultivaci v mléce Mléčné výrobky patří mezi nejrozšířenější nositele probiotik (fermentovaná i nefermentovaná mléka, syrovátkové nápoje, sýry, tvarohy a jogurty), ale obecně se zkoumá možnosti využití probiotických potravin vyrobených z jiných než mléčných matric (masné výrobky, cereálie, sóju, ovocné džusy, zeleninu a další).
Probiotika Mikroorganismy využívané jako probiotika musí splňovat řadu parametrů: • nesmí být patogenní, mutagenní nebo karcinogenní (také nesmí přenášet geny zodpovědné za přenos antibiotické rezistence, produkovat biogenní aminy vzhledem k jejím toxikologickým účinkům) • schopnost kolonizovat intestinální trakt (upřednostňují se kmeny vykazující schopnost vázat se na střevní buňky) • rezistentní vůči kyselinám a žluči • klinicky prokázané zdravotní účinky: stimulace imunitního systému prevence, snížení intenzity a doby trvání průjmů prevence a snížení závažnosti respiračních infekcí Nejnovější výzkumy se dnes zaměřují na možnosti využití probiotik, jako podpůrnou léčbu u nádorových a kardiovaskulárních onemocnění nebo jejich schopnosti tlumit příznaky alergií.
Bakteriociny
Bakteriociny
látky proteinové struktury produkované při svém růstu některými bakteriemi (především kmeny rodu Lactobacillus ) vykazující
V potravinářském průmyslu se s výhodou používají kmeny, které byly
antimikrobiální vlastnosti
izolovány ze stejné potravinové matrice, protože jsou už na podmínky
produkce antimikrobiálních peptidů je první linií obrany a také součástí vrozené imunity u většiny mikroorganismů mechanismus účinku - poškození permeability plasmatické membrány, což následně vede k úniku buněčného materiálu a ke smrti buňky v potravinářském průmyslu mohou být použity jako vhodná alternativa přírodních konzervačních látek náhradou za chemické sloučeniny při výrobě produktů s prodlouženou trvanlivostí u mnoha bakteriocinů byl detekován synergický efekt s dalšími antimikrobiálními látkami využívanými v potravinářském průmyslu (např.
dané potraviny adaptovány. Při procesu výroby potravinových produktů lze využít tři způsoby přidání bakteriocinů jako přírodních konzervantů: a) inokulace potravinové matrice mikroorganismy definovanými jako ochranná kultura, která produkuje inhibiční antimikrobiální látky b) přidat mikrobiální metabolity, především bakteriociny v semipurifikované nebo purifikované formě c) pro výrobu daného potravinářského výrobku lze použít suroviny, které byly dříve fermentované bakteriální kulturou produkující bakteriocin
přírodní fenolové sloučeniny a další antimikrobiální proteiny)
Výroba nisinu
Bakteriociny subtilin – Bacillus subtilis epidermin – Staphylococcus epidermidis
propionicin (MicroGard®) - sušená kultura Propionibacterium freundreichii ssp. shermanii vykultivována na odtučněném mléce
nisin, 1928 - Lactococcus lactis ssp. lactis •
velice aktivní vůči G+ bakteriím, nemá vliv na G-, kvasinky a plísně
•
kontrola bakteriálního kažení potravin E234 (v konzervách, tepelně ošetřené) – kontrola sporulujících MO např. B. sporothermodurans v UHT
•
inhibice kažení během přípravy kysaného zelí
•
vysoká LD50 7g/kg, GRAS status
o kontrolovaná fermentace Lactococcus lactis ssp. lactis v mléčném mediu o pH 2.0 (při pH>3.0 nisin se adsorbuje na buňky, při pH<3.0 je úplně disociovaný –> nisin přítomný v mediu) o izolace: extrakce rozpouštědly a jednokroková immunoafinitní chromatografie o nebo v průmyslově praxi: medium je zakoncentrováno, a separováno pomoci jednoduchého „pěnového procesu“ – kolona z fermentačním mediem je probublávána dusíkem nebo vzduchem, nisin se akumuluje ve vznikající pěně, která je následně sebraná, mechanický rozbita a nisin je izolován, dále je vysušeny, pomletý najemno a standardizovaný přídavkem chloridu sodného
8
20.10.2016
Fermentovaná zelenina fermentovat lze nejrůznější rostlinné suroviny zeli, okurky, olivy a jiné vyrábí se spontánní fermentaci, které podléhají lehce využitelné sacharidy, zatímco celulosa (balastní látky) a bílkoviny zůstávají nezměněné
Fermentovaná zelenina při anaerobní fermentaci rostlinných produktů se obyčejně rychle rozmnožuji bakterie mléčného kvašeni, které potlačuji růst nežádoucí mikroflóry jejich růst je stimulován přiměřeným solením - sůl podporuje přechod
vstupní suroviny jsou velmi často kontaminovaný velkým množstvím mikroorganismů (Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Bacillus,
Enterobacteriaceae, Clostridium a různé druhy kvasinek a plísni) na zelenině jsou vždy (v malém množství) přítomné bakterie mléčného
lehce fermentovatelných sacharidů z buněk a selektuje poměrně halotolerantní bakterie mléčného kvašeni od ostatní konkurenční mikroflóry kysané zelí - nakrouhané zeli se smíchá se soli asi 1,5 - 2,5% (zvýšena
kvašení - na živých rostlinách dominuji zástupci rodu Leuconostoc
koncentrace soli na 5 – 6% zastavuje činnost bakterii máselného
oproti méně zastoupeným tyčinkovitým bakteriím mléčného kvašeni
kvašeni, ale také snižuje i činnost žádoucích bakterii mléčného kvašeni
jako Lactobacillus plantarum, L. fermentum a L. brevis
na 30%) a ukládá do kádi přičemž se dusá (odstranění vzduchu) kvašeni by mělo probíhat při teplotě 18 – 20°C 4 - 6 týdnů
Výroba kysaného zelí 1) trvá asi tři dny, dochází k rozvoji heterogenní převážně aerobní mikroflóry - kvasinek, plísni, G- tyčinek (Enterobacter, Ervinia,
Klebsiella, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Acinetobacter), G+ tyčinek (Bacillus) a bakterii octového kvašeni; tvoři se řada aromatických látek jako kyselina octová, kyselina mravenči a různé estery 2) trvá přibližně stejnou dobu jako první, dochází k velké tvorbě CO2 prosazuji se heterofermentativní bakterie mléčného kvašeni např.
Leuconostoc mesenteroides, tvoři se významné množství kyseliny
Výroba kysaného zelí 3) charakterizovaná růstem halotolerantnich druhů bakterii mléčného kvašeni (až 106/ml), zejména homofermentativního Lactobacillus
plantarum, který může zvýšit koncentraci kyseliny mléčné až na 1,5-2%, pak je sám inhibován; potom nastupuji heterofermentativní mikroorganismy Lactobacillus brevis, druhy rodu Pediococcus a
Enterococcus (E. faecalis); v teto fázi jsou fermentovaný i hůře fermentovatelné pentosy jako arabinosa a xylosa; při obsahu kyseliny mléčné 1,5 - 2,5% a pH 3,8 - 3,6 je kysané zeli při uchovávaní v prostředí o 3°C skladovatelné asi měsíc
mléčné, čímž dochází k potlačeni nežádoucí mikroflóry
Mikrobiální kažení kysaného zeli je zapříčiněno především pozdní
(Enterobacteriaceae, Clostridium); tato fáze konči při nárůstu kyseliny
fermentaci – při vyšším pH enterobakterie (biogenní aminy), v aerobním
mléčné na 1% kdy je inhibován i Leuconostoc
prostředí kvasinky, v anaerobním klostridia působící máselné kvašeni
Fermentované masné výrobky 1) trvanlivé masné výrobky jsou produkty, které získaly trvanlivost díky poklesu hodnoty aktivity vody aw (max. hodnota aw 0,93) 2) vyhláška Ministerstva zemědělství č. 326/2001 Sb. ve znění pozdějších předpisů definuje minimální trvanlivost lhůtou 21 dní při teplotě 20°C 3) podle technologie výroby se trvanlivé masné výrobky dělí na fermentované a tepelně opracované. Fermentované trvanlivé masné výrobky zahrnují salámy a trvanlivé – sušené šunky (pršuty) 4) fermentace označuje děje, které probíhají působením mikrobiálních enzymů; zrání je souhrn procesů zahrnující fermentaci i sušení, tj. ztrátu vody z výrobku
Výchozí suroviny: A. Maso ze starších zvířat (menší obsah vody) řádně vyzrálé (účinkem proteas přítomných ve svalových buňkách calpainy a katepsiny) maso libové s vysokým obsahem čistých svalových bílkovin čerstvé maso se zmrazí těsně před zpracováním (mražené NE) B. Vepřové sádlo – má rozhodující roli při vytváření struktury výrobku ve fázi mělnění a míchání jadrné, tuhé – nejlépe hřbětní C. Koření – pepř, paprika, kardamon, muškátový květ a oříšek, zázvor, jalovec, česnek, fenykl, chilli, kmín, hřebíček částečně antioxidační účinek, antimikrobiální účinek založený na přítomnosti fytoncidů a podporuje sekreci trávících šťáv
9
20.10.2016
Výchozí suroviny: D. Sůl - NaCl, KCl, NaNO2, NaNO3
Výchozí suroviny: G. Startovací kultury - pozitivní vliv na okyselení (a tím na mikrobiální
zvyšuje chuť
stabilitu), barvu a chuť (aroma); dávkování startovacích kultur do
rozpouští bílkoviny masa a ovlivňuje interakce mezi aktinem a
salámového díla musí zaručit minimální počet 107 bakt. buněk na 1 g díla
myozinem
bakterie mléčného kvašení a mikrokoky
zlepšuje se textura masných výrobků (vliv aktivace bílkovin) snižuje aktivitu vody aw zvýhodňuje růst G+ bakterií namísto G- mikroorganismů mírný posun izoelektrického bodu ke kyselejší hodnotě pH DSS - podílí se na vybarvení, tvorbě aroma, má konzervační a antioxidační efekt E. Sacharidy – glukosa, fruktosa, sacharosa, laktosa, škrobový sirup přídavek sacharidů ovlivňuje intenzitu procesu fermentace F. Kyselina askorbová – urychluje proces vybarvení a stabilizuje barvu
Složení mikroflory: baktérie mléčného kvašení (Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus
plantarum, L. curvatum, L. brevis, L. sakei, L. fermenti) – 106-107/g • požadovaný profil snížení pH (produkce kyseliny mléčné a jiných) • snížení vazebné kapacity masa pro vodu (vysušení) • kompetice s nežádoucími bakteriemi, produkce bakteriocinů • tvorba látek aromatických a chuťově aktivních mikrokoky a stafylokoky (Staphylococcus xylosus, S. carnosus) • katalasapozitivní, redukují dusičnany na dusitany, aromatizace kvasinky (Debaryomyces) povrchové plísňové kultury (Penicillium nalgiovense, P. candidum,
P. chrysogenum, P. expansum) • typický vzhled, přispívají k aroma výrobku • udržují suchý povrch, chrání před nadměrným přístupem kyslíku
Zrání: I.
2-4 dny
Zrání a fermentace: • komplex procesů, většinou mikrobiálních, které se ve svém průběhu navzájem ovlivňuji a rozhoduji o údržnosti, textuře, vybarveni, chuti i aromatu finálních výrobků • během zraní jsou odbourávány a přeměňovány jednotlivé složky díla: bílkoviny se štěpí působením zejména mikrobiálních enzymů na jednodušší sloučeniny z volných aminokyselin vznikají aldehydy a těkavé organické kyseliny, které se podílí na aroma výrobků (současně vzniká i amoniak a aminy) působením soli a snižováním pH dochází k denaturaci bílkovin a tvorbě správné textury výrobků tuky podléhají oxidaci a hydrolýze působením nativních i mikrobiálních lipas štěpeni tuků a následná oxidace mastných kyselin velmi výrazně ovlivňuji aroma výrobků sacharidy jsou zkvašovaný na organické kyseliny především na kyselinu mléčnou, což vyvolává silné okyseleni
Výroba
• 18-25°C, RVV 90-94%, rychlost proudění vzduchu 0,5-0,8m.s-1
4 základní kroky:
• pH v díle 5.6-5.0, aw 0,96-0,94
výběr a ošetření suroviny
• vybarvení výrobku v důsledku reakci dusitanu a myoglobinu
příprava díla (mělnění a míchání)
II. 5-10 dnů • 18-22°C, RVV 80-90%, rychlost proudění vzduchu 0,2-0,5m.s-1 • pH v díle 5.0-4.8, aw 0,95-0,90 III. u trvanlivých salámů
plnění díla do obalových střev (přírodní nebo klihovkové) zrání v klimatizovaných komorách (stanovený režim)
• 12-15°C, RVV 65-80%, rychlost proudění vzduchu 0,05-0,1m.s-1 • pH v díle 4.7, aw 0,93-0,85 Plísňové kultury se nanášejí na povrch salámu ponořením, sprchováním nebo rozprašováním – plísňový pokryv musí být suchý a čistě bílý.
Pátým krokem je balení (příp. krájení a balení), které však představuje finální úpravu již vyrobených produktů
10
20.10.2016
Fermentované salámy s plísní na povrchu neudí se používají se plísňové startovací kultury obsahující toxikologický prověřené a nezávadné kmeny (vyloučení tvorby mykotoxinů) zaočkování povrchu salámů nastává ponořením salámů nebo sprchováním jejích povrchu suspenzí konidií těchto plísní povrchové plísně udělují salámům zvláštní aroma režim zrání: 12h 24°C, RVV 50-60% (24°C - aktivování metabolismu laktobacilů) 24h 19°C, RVV 70% 30 dní 8-10°C, RVV 80-85% (pokles teploty zabraňuje nadměrnému růstu plísní na počátku fermentace)
Výroba kyseliny L-glutamové o v potravinářství se kyselina L-glutamová používá jako stabilizátor barviv nebo jako antioxidant E620 o značné množství kyseliny se průmyslově přeměňuje neutralizací hydroxidem sodným na její monosodnou sůl (glutaman sodný), která slouží k ochucování potravin (dokáže několikanásobně zesílit chuť potravin - E621) o od 60-tych let se vyrábí fermentaci, ročně přes 400 000 tun (2001) o produkovaná rody Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium,
Microbacterium a Micrococcus – G+, nepohyblivé, vyžadují biotin 𝐤𝐲𝐬𝐞𝐥𝐢𝐧𝐚 𝐨𝐱𝐨𝐠𝐥𝐮𝐭𝐚𝐫𝐨𝐯á + 𝐍𝐇𝟒+ + 𝐍𝐀𝐃 𝐏 𝐇 + 𝐇 + 𝐤𝐲𝐬𝐞𝐥𝐢𝐧𝐚 𝑳 − 𝐠𝐥𝐮𝐭𝐚𝐦𝐨𝐯á + 𝐍𝐀𝐃 𝐏
20 dní 8-10°C, RVV 85-92%
Výroba kyseliny L-glutamové o Corynebacterium glutamicum – vysoká koncentrace kys. L-glutamové v buňce (aktivita glutamátdehydrogenasy 1.8 mmol.min-1(mg protein)-1 o WT C. glutamicum – zpětná inhibice 5% kyseliny L-glutamové o regulační a auxotrofní mutanti (také phage resistant) – akumulace 30% kyseliny L-glutamové (výnos 1 mol na 1,4 mola glukosy)
+
𝐠𝐥𝐮𝐭𝐚𝐦á𝐭𝐝𝐞𝐡𝐲𝐝𝐫𝐨𝐠𝐞𝐧𝐚𝐬𝐚
+ 𝐇𝟐 𝐎
Výroba kyseliny L-glutamové Uvolňování kyseliny L-glutamové do media omezení množství biotinu omezení biosyntézy fosfolipidů díky přídavku C16-C18 nasycených mastných kyselin během fáze růstu
o průmyslová výroba v míchacích tancích o objemu až 500m3
přídavek surfaktantů (Tween 40)
o vsádkový proces, dosahuje se produkci 80g/l
přídavek penicilinu
o podmínky – teplota 30-37°C, pH 7-8, 35-40h
auxotrofie kyseliny olejové nebo glycerolu
o anorganické sole – Mg, Mn, P, K a omezené množství biotinu
přídavek lysozymu
o zdroj uhlíku – glukosa nebo sacharosa, také třtinová nebo řepná melasa o zdroj dusíku – močovina, amoniak, amonné soli – pomalé davkování o často je potřeba přidat vitaminy, aminokyseliny, puriny či pirimidiny
Výroba kyseliny L-glutamové
Výroba L-lysinu
Downstream processing
o esenciální aminokyselina
separace buněk z media
o roční světová výroba přes 380 000 tun, z toho
kyselina glutamová je nejčastěji ve formě amonné soli iontoměnič – aniony kyseliny glutamové se navážou na pryskyřici, eluce pomoci hydroxidu sodného (destilace NH3 - recyklace) krystalizace glutamanu sodného (a ošetření na „food-grade“ kvalitu)
90 000 tun pomocí mikrobiální fermentace nebo biotransformace (2001) o produkční organismus - Corynebacterium glutamicum o přesná metabolická kontrola produkce
o mutace (např. auxotrof homoserinu, mutace aspartátkinasy) – 170g/l
11
20.10.2016
Výroba L-lysinu Produkční proces o zdroj uhlíku – třtinová nebo řepná melasa, kyselina octová, ethanol, sacharosa, hydrolyzáty sójové nebo arašídové mouky o zdroj dusíku – amoniak nebo močovina, amonné soli o koncentrace biotinu musí být vyšší než 30µg/l o teplota 28°C, pH neutrální o růstové faktory (kukuřičný výluh, hydrolyzát rostlinných proteinů) o lag fáze zkrácená díky vysoké koncentraci inokulum – obvykle 10% (v/v) objemu
Výroba L-lysinu Downstream processing I.
separace buněk z media; zvýšení kyselostí na pH 2 pomoci HCl; adsorpce na iontoměnič a eluce zředěným roztokem amoniaku; krystalizace L-lysinu ve formě chlorovodíku -> 98,5% L-lysine.HCl)
II. separace biomasy; odpařování; filtrace -> alkalický koncentrovaný roztok obsahující 50% L-lysinu III. formování fermentačního media sušením a granulací -> granulovaný sulfát lysinu obsahující 50% L-lysinu
o produkce lysinu začíná v exponenciální fázi, pokračuje ve stacionární fázi – 60h o výtěžek - 40-50g lysinu z 200g/l melasy
Alternativní biotransformační metody produkce aminokyselin Produkce aminokyselin může být také provedená pomoci selektivní hydrolýzy optických izomerů z racemické směsi prekurzorů. kyselina L-glutamová: Bacillus brevis produkuje hydantoinasu, která přeměňuje D-L-hydantoin 5-propionic acid z 90% výtěžkem L-lysin: D-L--aminocaprolactam (derivát cyklohexanu) se přidává do fermentačního media (100g/l) spolu s kvasinkou Cryptococcus laurentii a bakterii Achromobacter obae – úplná konverze substrátu na L-lysin
12
