UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Katedra antropologie a genetiky člověka
DIPLOMOVÁ PRÁCE
VROZENÁ IMUNITA A CIRKULUJÍCÍ MONOCYTY VÝZNAM A FUNKCE V PATOGENEZI CELIAKIE The innate immunity and circulating monocytes - their significance and function in pathogenesis of coeliac disease
Bc. Iva Němečková Školitelka: RNDr. Pavlína Čejková, Ph.D.
Prohlašuji, že jsem svou diplomovou práci „Vrozená imunita a cirkulující monocyty - význam a funkce v patogenezi celiakie“, vypracovala samostatně pod vedením RNDr. Pavlíny Čejkové, Ph.D., s použitím odborné literatury a dalších informačních zdrojů, které jsou v práci citovány a uvedeny v seznamu použité literatury na konci práce.
V Praze dne 27. 8. 2012
…………………………. Iva Němečková
Ráda bych poděkovala své školitelce RNDr. Pavlíně Čejkové, Ph.D. za věnovaný čas, odborné vedení, cenné rady a tematické připomínky k diplomové práci, kolektivu laboratoře Molekulární antropologie (Bc. Lence Baierové,Bc. Věře Chromé, Bc. Alžbětě Zinkové a Mgr. Romanu Šolcovi), Doc. MUDr. Miloši Dvořákovi, CSc. a MUDr. Hoffmanové za spolupráci a všem pacientům s celiakií za darování krve. Na závěr bych chtěla poděkovat Grantové agentuře UK (316211) za finanční podporu.
Obsah 1
Úvod ....................................................................................................................... 10 1.1 Celiakie ............................................................................................................... 10 1.1.1 Environmentální faktory............................................................................... 11 1.1.2 Imunologické faktory................................................................................... 11 1.1.3 Genetické faktory......................................................................................... 14 1.2 Toll-like receptory (TLRs) ................................................................................... 15 1.2.1 Toll-like receptor 2....................................................................................... 17 1.2.2 Toll-like receptor 4....................................................................................... 18 1.2.3 Toll-like receptor 7....................................................................................... 19 1.2.4 TLRs a celiakie ............................................................................................ 20 1.3 Prolaktin .............................................................................................................. 22 1.3.1 Mimohypofyzární PRL ................................................................................ 23 1.3.2 Prolaktinový receptor (PRL-R)..................................................................... 24 1.3.3 Signální dráhy PRL ...................................................................................... 24 1.3.4 Prolaktin a autoimunita ................................................................................ 26 1.3.5 Prolaktin a celiakie....................................................................................... 28 1.4 Monocyty ............................................................................................................ 29 1.4.1 Neklasické CD14+CD16++ monocyty ......................................................... 30 1.4.2 Membránové molekuly na monocytech ........................................................ 31
2
Hypotézy a cíle diplomové práce........................................................................... 34
3
Materiál a metody.................................................................................................. 35 3.1 Pacienti................................................................................................................ 35 3.2 Kontrolní soubor.................................................................................................. 36 3.3 Studium genové exprese na úrovni mRNA........................................................... 36 3.3.1 Imunomagnetická separace monocytů .......................................................... 37 3.3.2 Izolace RNA ................................................................................................ 40 3.3.3 Reverzně transkriptázová polymerázová řetězová reakce (RT PCR)............. 44 3.3.4 Polymerázová řetězová reakce v reálném čase (Real Time PCR).................. 45 3.4 Studium frekvence PRL -1149 G/T SNP .............................................................. 49 3.4.1 Izolace DNA ................................................................................................ 49 3.4.2 Polymerázová řetězová reakce (PCR)........................................................... 50
4
3.4.3 Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)................................... 52 3.4.4 Elektroforetická separace ............................................................................. 53 3.5 Statistické zpracování .......................................................................................... 54 3.6 Kultivace a stimulace monocytů – optimalizace postupů pro in vitro studium funkce mimohypofyzárního prolaktinu v rámci vrozené imunity.................................. 55 3.6.1 Izolace mononukleárních buněk (PBMCs) z plné krve či buffy coat ............. 55 3.6.2 Kultivace a stimulace monocytů................................................................... 57 4
Výsledky ................................................................................................................. 66 4.1 Studium genové exprese na úrovni mRNA........................................................... 66 4.1.1 Změny exprese TLR mRNA u monocytů pacientů s celiakií......................... 66 4.1.2 Změny exprese PRL mRNA monocytů pacientů s celiakií vůči kontrolám a v souvislosti s klinickými parametry........................................................................ 69 4.1.3 Změny exprese mRNA vybraných cytokinů monocyty................................. 70 4.1.4 Vliv polymorfismu -1149 G/T v mimohypofyzární promotorové oblasti PRL na jeho expresi na úrovni mRNA ............................................................................. 74 4.1.5 Výsledky optimalizace metody in vitro kultivace a stimulace monocytů....... 75
5
Diskuze ................................................................................................................... 76
6
Závěr ...................................................................................................................... 81
7
Seznam použitých zkratek..................................................................................... 82
8
Seznam použité literatury ..................................................................................... 86
9
Přílohy.................................................................................................................. 102
5
Abstrakt Úvod: Celiakie je označována jako ztráta orální tolerance k lepku, jedná se o orgánově specifické autoimunitní onemocnění, na jehož rozvoji se podílí jak adaptivní, tak vrozená imunita. Monocyty jsou důležitou složkou imunitního systému, kde mají mnoho funkcí a na svém povrchu exprimují velice rozmanité membránové receptory. Exprimují také Toll-like receptory (TLRs), které se podílejí na vrozené imunitní odpovědi, konkrétně TLR2 a TLR4 jsou klíčové pro rozpoznání bakteriálních komponent a TLR7 je schopen rozpoznávat ssRNA virů. Monocyty je produkován také prolaktin (PRL), cytokin, jenž moduluje imunitní reakce. Pro objasnění role vrozené imunity a cirkulujících monocytů jsme se zaměřili na změny exprese vybraných Toll-like receptorů (TLR2, TLR4, TLR7), prolaktinu, a některých cytokinů (TNF-α, IL-6, IL-12, IL-10). Sledovali jsme i vliv SNP- 1149 G/T na expresi PRL mRNA. Dalším cílem práce bylo zavedení metody in vitro kultivace a stimulace periferních monocytů. Materiál a metody: Do pilotní studie bylo zahrnuto 21 pacientů s celiakií a 40 zdravých jedinců jako kontroly. Pro stanovení hladin mRNA studovaných genů jsme z monocytů získaných imunomagnetickou separací izolovali RNA; kvantitativní RNA testování bylo provedeno metodou Real Time PCR s PGK1 jako endogenní kontrolou. Pro detekci PRL -1149 G/T SNPjsme použili metodu PCR-RFLP s enzymem XapI. Výsledky: Hladiny TLR2, TLR4 a TLR7 mRNA v monocytech periferní krve byly značně zvýšené oproti hladinám u kontrol, konkrétně TLR2 mRNA 52,4 × (P < 0,0001), TLR4 mRNA 7,8 × (P < 0,0001), TLR7 20,3 × (P< 0,0001). Exprese PRL mRNA nebyla u pacientů s celiakií statisticky významně (P = 0,9) zesílena. Statisticky významná odlišnost nebyla pozorována ani v případě sledované asociace PRL -1149 s expresí PRL mRNA (P = 0,1483). Signifikantně snížená exprese TNF, IL-6 a IL-10 byla detekována u pacientů vůči kontroláma to TNF 103,2 × (P < 0,01), IL-6 10,9 × (P < 0,0001) a IL-10 16,25 × (P < 0,0001). Byla detekována signifikantní 2,97× zvýšená exprese IL-12 mRNA u kontrol vůči pacientům dodržujícím bezlepkovou dietu. Závěr: Výsledky naznačují, že imunitní dysbalance v podobě celiakie zřejmě vede ke zvýšené expresi sledovaných Toll-like receptorů (TLR2, TLR4 a TLR7 mRNA) a snížení exprese protizánětlivého IL-10. Zvýšená exprese sledovaných zánětlivých cytokinů u kontrol může být způsobena pozdním zpracováním krevních vzorků buffy coat od dárců. Zdá se, že SNP -1149 G/T nemá vliv na expresi PRL mRNA.
6
Klíčová slova: celiakie, monocyty, prolaktin, Toll-like receptory, cytokiny
7
Abstract Introduction: Celiac disease is indentified as the loss of oral tolerance to gluten, it is an organ-specific autoimmune disease in which both, adaptive and innate immunity participate. Monocytes are important part of immune system; they have many functions and express very diverse membrane receptors including Toll-like receptors (TLRs). TLRs are involved in the innate immune response, specifically TLR2 and TLR4 are crucial for recognition of bacterial components and TLR7 recognizes virus’s ssRNA. Monocytes also produce prolaktin (PRL), which acts as a cytokine that modulates immune responses. To clarify the role of innate immunity and circulating monocytes in pathogenesis of celiac disease, we focused on changes in expression of selected Toll-like receptors (TLR2, TLR4, TLR7), prolactin, some pro- a anti-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-6, IL-12, IL-10). We monitored the influence of the SNP – 1149 G/T on the expression of PRL mRNA. Another objective of this work was the introduction and optimization of in vitromethods for cultivation and stimulation of peripheral monocytes. Material and Methods: This pilot study includes 21 patients with celiac disease and 40 healthy controls. For determination of mRNA levels of the studied genes we isolated RNA from monocytes that were isolated by immunomagnetic separation. Quantitative testing was performed using Real Time PCR with PGK1 as endogenous control. To detect PRL1149 G/T SNP we used PCR-RFLP method with the XapI.enzyme Results: The levels of TLR2, TLR4 and TLR7 mRNA in peripheral blood monocytes were significantly increased compared to levels in controls, specifically TLR2 mRNA 52,4 × (P < 0,0001), TLR4 mRNA 7,8 × (P < 0,0001), TLR7 20,3 × (P< 0,0001). Expression of PRL mRNA was not statistically significantlyincreased in patients with celiac disease (P = 0,9). There was no association between PRL-1149 and the PRL mRNA expression (P = 0,1483). Significantly decreased expression of TNF, IL-6 a IL-10 mRNA in patients compared to controls was detected: TNF 103,2 × (P < 0,01), IL-6 10,9 × (P < 0,0001) and IL-10 16,25 × (P< 0,0001). We observed 2,97× significantly higherexpression of IL-12 mRNA in controls in comparison to patients with gluten free diet. Conclusion: These results suggest that the immune dysbalance in the form of celiac disease apparently leads to increased expression of studied Toll-like receptors (TLR2, TLR4, TLR7 mRNA) and to reduced of expression of anti-inflammatory IL-10. Increased expression of pro-inflammatory cytokines observed in controls may be caused by late
8
processing of buffy coats from donors. It appears that the SNP -1149 does not affect the expression of PRL mRNA. Key words: celiac disease, monocytes, prolactin, Toll-like receptors, cytokines
9
1 Úvod 1.1 Celiakie Celiakie (CD) je popisována jako ztráta orální tolerance k lepku. Jedná se o orgánově specifické autoimunitní onemocnění, kdy autoimunitní reakci vyvolávají peptidy lepku a autoantigenem je zde tkáňová transglutamináza 2 (TG2). Detekce zvýšených hladin protilátek proti tomuto antigenu (anti-transglutaminázové IgA nebo anti-endomisiální protilátky) předurčují k střevní biopsii, tedy k tzv. „zlatému standardu“ diagnostiky celiakie. Pozitivní identifikace střevních abnormalit v rozmezí od téměř normální architektury klků se zvýšenou intraepiteliální lymfocytózou až po naprostou atrofii klků (Marsh 1992) vede k předběžné diagnóze celiakie, po které by mělo následovat dodržování bezlepkové diety, a teprve na základě zlepšení jako reakce na tuto bezlepkovou stravu se provádí konečná diagnóza celiakie. Toto je stručně popsaný postup diagnostiky celiakie na základě doporučení Evropské společnosti pro pediatrickou gastroenterologii, hepatologii a výživu (Riordan and Davidson 1991) a Severoamerické společnosti pro pediatrickou gastroenterologii, hematologii a výživu (Hill et al. 2005). K sérologickým testům se přistupuje na základě charakteristických příznaků celiakie, mezi které patří průjem, abdominální rozšíření a bolest, špatná absorpce či slabost (Green et al. 2001), u dětí bývá celiakie navíc provázena malým vzrůstem, neprospíváním nebo opožděnou pubertou. U mnoha pacientů se však vyskytují jen malé nebo žádné gastrointestinální příznaky, avšak lze u nich pozorovat určité mimostřevní charakteristiky jako např. anémii, osteoporózu, dermatitis herpetiformis, diabetes mellitus I. typu, autoimunitní poruchy štítné žlázy, neplodnost a některé neurologické poruchy (Alaedini and Green 2005). Osoby s těmito onemocněními spojovanými s celiakií patří do tzv. rizikové skupiny a jsou ještě spolu s příbuznými celiaků (prvního a druhého stupně) také predisponovány k sérologickým testům. V současné době je diagnostika celiakie ožehavým tématem na poli imunologického bádání (8th International Congress on Autoimmunity, Granada 2012), nejnovější studie totiž prokazují, že střevní biopsie nemusí být k předběžné diagnostice nutná, což je ceněno především u diagnostiky celiakie u dětí, u nichž je střevní biopsie mnohdy problematická a traumatizující.
10
Prevalence celiakie v Evropě je odhadována na 1% (Mustalahti et al. 2010) a její jedinou možnou léčbou je v současné době celoživotní dodržování bezlepkové diety, které je oproti klasické stravě až 3× finančně náročnější a činí (především u dětí) četné sociální problémy. Odhalování molekulárních mechanismů vzniku celiakie a jejího genetického pozadí může vést k lepší diagnostice a především k alternativním metodám léčby celiakie, k čemuž může přispět i hlubší prostudování vrozené imunity (TLRs a PRL) a role cirkulujících monocytů (PBM) v patogenezi celiakie. Celiakie je multifaktoriální onemocnění, tudíž se na její patogenezi podílejí jak environmentální, tak genetické i imunologické faktory.
1.1.1 Environmentální faktory Kromě hlavního iniciátoru vzniku celiakie, lepku, existují ještě další faktory, jejichž role při vzniku celiakie je zvažována, např. doba kojení a věk, kdy je lepek přidán do stravy (Ivarsson et al. 2002), kouření (Vazquez et al. 2001), virové infekce (Kagnoff et al. 1987), přičemž bylo zjištěno, že konkrétně gastrointestinální infekce zvyšují riziko propuknutí celiakie (Stene et al. 2006). Avšak zautvářeníslizničních lézí u pacientů s celiakií jsou odpovědné především peptidy lepku a ukazuje se, že různé peptidy lepku jsou do tohoto procesu zapojeny odlišným způsobem: některé fragmenty jsou „imunogenní“ (např. p57-73) a vyvolávají adaptivní imunitní odpověď, jiné jsou „toxické“ (p31-43) a podílejí se na aktivaci vrozené imunitní odpovědi. Není všakvyloučeno, že stejný peptid může mít obě schopnosti současně (Fraser et al. 2003).
1.1.2 Imunologické faktory U celiakie nejprve nebyl shledáván rozdíl mezi adaptivní a vrozenou imunitní reakcí na lepek, avšak Mauri a kol. ve své studii ukazuje, že některé peptidy lepku vyvolávají vrozenou imunitní reakci, zatímco jiné řídí adaptivní imunitu (Maiuri et al. 2003). Roli vrozené imunity v patogenezi celiakie také podporují změny v expresi TLR2 a TLR4 v duodenální sliznici pacientů s celiakií (Szebeni et al. 2007). O počátečních krocích, v nichž jsou peptidy lepku transportovány přes střevní epitel a spouští kaskádu imunitních reakcí, nejsou zcela jasné údaje. Uvažuje se o zvýšeném transportu peptidů lepku v důsledku zánětu či nezralosti enterocytů (Matysiak-Budnik et al. 2003), působení zonulinu (Fasano et al. 2000) či translokace gliadinu do vakuol (Zimmer et al. 1998).
11
Adaptivní imunitní odpověď „Imunogenní“ peptid je po průchodu střevním epitelem deaminován tkáňovou transglutaminázou a posléze navázán na molekuly HLA-DQ2 a -DQ8 na APC, tyto molekuly pak prezentují deaminované peptidy CD4+ T lymfocytům, které se tímto aktivují (Obr. 1).
Obr. 1: Spuštění adaptivní imunitní odpovědi „imunogenním“ peptidem lepku (Upraveno podle: Ciccocioppo et al. 2005; van Heel and West 2006) Aktivované CD4+ T lymfocyty spouští expresi pro-zánětlivých cytokinů Th1profilu, zejména interferonu γ (INF-γ) (Kagnoff 2005; Molberg et al. 1998; van de Wal et al. 1998). Expresi INF-γ (a všech Th1 buněk) reguluje IL-12 (Brand et al. 2004), avšak exprese INF-γ v celiakální sliznici zřejmě není spojena s tvorbou IL-12 (Nilsen et al. 1998). Pro-zánětlivé cytokiny stimulují cytotoxické T lymfocyty a fibroblasty k produkci toxických matrixových mataloproteináz, které způsobují porušení extracelulární matrix a remodelaci tkání, což může hrát roli v atrofii klků (Mora et al. 2005) (Obr. 2).
12
Obr. 2: Atrofie klků vyvolaná matrixovými metaloproteinázami (Upraveno podle: Ciccocioppo et al. 2005; van Heel and West 2006) Vrozená imunitní odpověď „Toxický“ peptid indukuje u stresovaných epitelových buněk v tenkém střevě expresi neklasických HLA molekul I. třídy, MIC a HLA-E, a interleukinu 15, avšak tento peptid by mohl být také rozpoznán receptory skupiny Toll-like (TLRs) nebo dalšími receptory střevních makrofágů schopných rozeznávat konzervované struktury určitých patogenů (Schuppan et al. 2003). TLRs rozpoznávají celou řadu chemických struktur charakteristických pro různé patogeny (více viz 1.2 Toll-like receptory). Po navázání patogenní částice na TLR může dojít k ovlivnění exprese některých pro-zánětlivých cytokinů a chemokinů. Neklasické HLA molekuly I. třídy aktivují intraepiteliální lymfocyty (IEL), jež exprimují NK-receptory NKG2D (NK buňky aktivující receptor typu 2D) a CD94 (diferenciační antigen 94) zprostředkovávající přímé zabíjení epitelových buněk (Jabri et al. 2005) (Obr. 3).
13
Obr. 3: Vrozená imunitní odpověď spuštěná „toxickým“ peptidem lepku (Upraveno podle: Ciccocioppo et al. 2005; van Heel and West 2006)
1.1.3 Genetické faktory Genetickou predispozicí celiakie jsou HLA-DQ2 a-DQ8(Sollid and Thorsby 1993), které se vyskytují u 99 % pacientů s celiakií (Karell et al. 2003), avšak podílejí se přibližně pouze na 40 % dědičnosti (Risch 1987).Přítomnost těchto specifických alel je tedy nezbytná, i když ne dostačující k fenotypové expresi celiakie. Proto se hledají další, tzv. kandidátní geny celiakie, které jsou vytipovávány na základě své funkce a lokalizace. Mezi tyto kandidátní geny patří např. geny kódující matrixové mataloproteinázy (MMP-1 a MMP-3), které mohou hrát roli v atrofii klků (Mora et al. 2005), poté geny pro TLR (TLR2 a TLR4), jež mohou rozpoznávat „toxické“ peptidy a následně ovlivňovat expresi cytokinů a chemokinů (Schuppan et al. 2003), či gen MYO9B, jehož produkt zřejmě může měnit epiteliální permeabilitu, a tím umožnit proniknutí peptidů lepku přes střevní epitel (Hunt et al. 2006). Další jsou kandidátní geny, jež exprimují proteiny regulující T-buněčnou aktivitu (CTLA-4, ICOS, CD28) (Brophy et al. 2006) či gen aktivující T lymfocyty (PTPN22) (Vang et al. 2007). Studováno je mnoho kandidátních genů, mnohdy nekonsistentními výsledky, často v závislosti na použité metodě a počtu respondentů, jejich hledání je však důležitým klíčem k odhalení dědičnosti a patogeneze celiakie.
14
1.2 Toll-like receptory (TLRs) Toll-like receptory hrají klíčovou roli v savčí vrozené imunitě, jsou exprimovány na buňkách vrozeného imunitního systému, především na monocytech (Devaraj et al. 2008). Savčí TLRs byly původně nalezeny jako homology Drosophily Toll, kde se podílí na dorzoventrální polaritě těla stejně jako v antimykotické a antibakteriální ochraně(Lemaitre et al. 1996; Medzhitov et al. 1997). TLRs tvoří rodinu transmembránových receptorů I. typu, pro které je charakteristická extracelulární repetitivní doména bohatá na leucin (leucine-rich repeat, LRR) a intracelulární Toll/IL-1 receptorová doména (Toll/IL-1 receptor, TIR)(Medzhitov et al. 1997). LRR se podílí na pestrém množství interakcí mezi ligandem a TLR a na transdukci signálu (Kobe and Kajava 2001). U savců existuje nejméně 11 TLRs a zdá se, že každý receptor má odlišné funkce; rozpoznávají celou řadu chemických struktur charakteristických pro různé patogeny – lipopolysacharidy, lipoproteiny, prokaryotické a virové nukleové kyseliny a další, přičemž některé receptory mohou být stimulovány také endogenními ligandy, tj. molekulami organismu vlastními (např. při stresovém nebo nekrotickém poškození tkáně, slouží jako „signály nebezpečí“). TLRs mohou být rozděleny do skupin podle typu ligandu, jež rozpoznávají a podle toho, zda se nacházejí na buněčném povrchu nebo na intracelulárních membránách (AkashiTakamura and Miyake 2006)(Tab. 1). V genu pro lidský TLR11 je umístěn stop kodon, což vede k nedostatečné produkci proteinu (Zhang et al. 2004). Tab. 1 Typylidských TLRs, jejich ligandy, místa exprese mRNA a proteinu TLR
chromozóm
ligandy
mRNA/protein
Funkce/lokalizace
TLR1
4
tryacyl-lipopeptid
protein: nízké hladiny v monocytech
TLR2
4
peptidoglyken (Gram+) lipotechoová kyselina (Gram+) GPI-proteiny (Trypanosoma) zymozan (kvasinky) lipoprotein netypický LPS (Leptospira) lipoarabinomannan (Mycobaterioum)
mRNA:monocyty, granulocyty, makgofágové
asociace s TLR2 a regulace TLR2 odpovědi; lokalizován na povrchu buňky interakce s mikrobiálními lipoproteiny a peptidoglykeny, aktivace NF-κB dráhy; lokalizován na povrchu buňky
15
TLR3
4
dsRNA (viry)
mRNA: DC, endotelové a epitelové buňky protein: nízké hladiny ve fibroblastech protein:monocyty, endotelové buňky
TLR4
9
LPS (Gam-) fúzní protein (RSV) EDA doména fibronectinu (endogenní) HSP60 (endogenní) taxol HSP70 hyaluronan
TLR5
1
flagellin
mRNA:leukocyty, prostata, játra, plíce
TLR6
4
diacyl-lipopeptid zymozan (kvasinky)
mRNA:leukocyty, vaječníky, plíce
TLR7
X
ssRNA (viry) imichimod, R848 (syntetický) loxiribin (syntetický)
mRNA: slezina, plíce, placenta, makrofágové
TLR8
X
ssRNA (viry) R848 (syntetický)
mRNA:leukocyty, plíce
TLR9
3
mRNA:leukocyty protein: DC, B buňky
TLR10
4
nemetylovaná GpG DNA (bakteriální) Herpes virus (DNA) CpG oligodeoxynukleotidy (syntetické) není stanoveno
TLR11
????
uropatogenní bakterie
16
mRNA: lymfoidní tkáně mRNA: ledviny, játra, makrofágové, epiteliální buňky močového měchýře, nízké hladiny v srdci a slezině
interakce s dsRNA, aktivace NF-κB dráhy; indukce produkce interferonu I. typu; endozomy interaguje s mikrobiálními lipoproteiny, odlišné izofoty, aktivace NFκB dráhy, CD14-závislá a CD14nezávislá odpověď na LPS; lokalizován na povrchu buňky interakce s bakteriálním flagellinem, odpověď na bakterii Salmonella, aktivace NF-κB dráhy; lokalizován na povrchu buňky interaguje s mikrobiálními lipoproteiny, asociace a regulace TLR2 odpovědi; lokalizován na povrchu buňky interaguje s malými anti-virovými komponentami; nejméně podobný ostatním TLR receptorům; endolysozom interaguje s ssRNA, dvě izofoty; endolysozom nepatrně podobný TLR3, odlišné izofoty; endolysozom
většinou úzce souvisí s TLR1 a TLR5 v genu pro lidský TLR11 umístěn stop kodon ???
O TLRs je také známo, že pro rozpoznávání a signalizaci vyžadují ko-receptory, jež jsou nezbytné především pro mikrobiální rozpoznávání (MD-2, CD36, CD14), modulaci následné signální dráhy (např. CD14) a správné vezikulární funkce (Akashi-Takamura and Miyake 2006). TLR signalizace má dvě hlavní signalizační dráhy a to MyD88-závislou a MyD88-nezávislou/TRIF-závislou dráhu. MyD88-závislá signalizace vede k aktivaci NF-κB a je esenciální pro produkci pro-zánětlivých cytokinů všech TLRs. Oproti tomu MyD88-nezávislá/TRIF-závislá signalizace indukuje opožděnou aktivaci NF-κB a produkci IFN-I (Akashi-Takamura and Miyake 2006). MyD88-závislá signalizace chrání proti náchylnosti k infekčním chorobám a poruchám imunity, ovšem na druhou stranu může nadměrná MyD88-závislá signalizace vést k alergiím, autoimunitním onemocněním či arteroskleróze (Akashi-Takamura and Miyake 2006). Vzhledem k odlišné funkci TLRs r jsme se v naší studii zaměřili jen na vybrané z nich, konkrétně na TLR2, TLR4 a TLR7.
1.2.1 Toll-like receptor 2 Bylo prokázáno, že TLR2 se podílí na rozpoznávání širokého spektra mikrobiálních produktů, zahrnující např. peptidoglyken z Gram-pozitivních bakterií (Schwandner et al. 1999), bakteriální lipoprotein (Aliprantis et al. 1999), lipoarabinomannan (Mycobacteria) (Underhill et al. 1999)a další (viz Tabulka 1). Široké spektrum rozpoznávaných ligandů TLR2 lze zčásti vysvětlit jeho spoluprací s dalšími TLRs (TLR1 a TLR6), se kterými tvoří heterodimer udávající specifitu ligandu (Ozinsky et al. 2000). Je zajímavé, že TLR1 a TLR6 jsou exprimovány mnoha typy buněk, zatímco TLR2 je zřejmě omezen na APC a endoteliální buňky(Muzio et al. 2000). Po spuštění signalizačních kaskád dochází v konečné fázi k aktivaci transkripčního faktoru NF-κB a expresi pro-zánětlivých cytokinů(TNF-α, IL-1β, IL-6 a IL-12) (Obr. 4).
17
Obr. 4: Signalizační kaskády TLR4, 1, 6, 2 a 5 po navázání ligandu (Upraveno podle: Akashi-Takamura 2006)
1.2.2 Toll-like receptor 4 TLR4 byl první charakterizovaný savčí TLR (Medzhitov et al. 1997), je exprimován různými buněčnými typy, převážně však buňkami imunitního systému (Medzhitov et al. 1997). TLR4 je receptorem především pro LPS, jehož rozpoznání vyžaduje další příslušné molekuly jako MD-2 a CD14. MD-2 je rozpustný protein, který je asociovaný s extracelulární doménou TLR4, přičemž komplex TLR4/MD-2 rozpoznává LPS. MD-2 přímo interaguje s LPS (Viriyakosol et al. 2000) ovlivňujíce specifitu TLR4 (Akashi et al. 2001) a reguluje následný klastering (shlukování) receptoru (Kobayashi et al. 2006). MD-2 knockoutované myši nereagují na LPS, MD-2 je tudíž nepostradatelný pro rozpoznání LPS a spuštění
18
následné signalizace. U lidí v průběhu septického šoku se předpokládá, že rozpustný MD-2 proniká do extravaskulárního prostoru a podporuje LPS aktivaciTLR4 exprese epiteliálními buňkami a funguje jako zprostředkovatel zánětu orgánu (Pugin et al. 2004). Ko-receptor CD14 je prezentován v plazmě jako rozpustná forma nebo na buněčném povrchu monocytů, váže LPS a usnadňuje jeho signalizaci, avšak reakce na LPS jsou zjistitelné i bez CD14, dochází však ke spuštění jiné signální dráhy (Obr. 5) vedoucí k aktivaci transkripčního faktoru NF-κB a expresi pro-zánětlivých cytokinů(TNF-α, IL-1β, IL-6 a IL-12), zatímco při CD14 závislém rozpoznání je aktivován IRF-3, který vede k produkci IFN-β(Akashi-Takamura 2006).
Obr. 5: CD14-závislá a CD14-nezávislá signalizace po navázání LPS (Upraveno podle: Akashi-Takamura 2006)
1.2.3 Toll-like receptor 7 TLR7 je jeden z TLRs receptorů, který je schopen rozpoznávat endogenní ligandy (ssRNA virů), aktivace těmito ligandy může za určitých podmínek indukovat typické autoimunitní reakce jako je SLE (Barrat et al. 2005). Složky nukleových kyselin některých
19
patogenů mají schopnost vyvolat nejen silné vrozené imunitní reakce, ale také zánětlivou reakci v dané tkáni (Hurst and von Landenberg 2008). TLR7 zprostředkované virové rozpoznání je prominentní u podtypu dendritických buněk, které se vyznačují schopností vylučovat velké množství IFN-α v reakci na virové infekce (Kato et al. 2006). Po navázání ligandu na TLR7 se spouští signální dráha vedoucí k transkripčním faktorům NF-κB, IRF-7 a IRF-3, přičemž aktivace IRF-3 a -7 vede k expresi IFN-β a aktivace NF-κB k expresi zánětlivých cytokinů (Obr.6) (Akashi-Takamura and Miyake 2006).
Obr. 6:Signalizační dráhy TLR 7, 8 a 9 (Upraveno podle: Akashi-Takamura 2006)
1.2.4 TLRsa celiakie Forsberg a kol. objevili ve střevní biopsii pacientů s celiakií tyčinkovité bakterie, jednalo se o nálezy u aktivní i neaktivní celiakie, avšak ne u zdravých kontrol (Forsberg et al. 2004). Produkty těchto bakterií mohou přispět k aktivaci vrozené imunity, bakteriální
20
lipopolysacharidy a peptidoglykany jsou rozpoznávány APC nesoucími specifické receptory jako TLR2, TLR4 a CD14(Akashi-Takamura and Miyake 2006; Wright et al. 1990). Szebeni a kol. zkoumali expresi TLR2, TLR3 a TLR4 mRNA i proteinů ve vzorcích biopsie od dětí s léčenou i neléčenou celiakií a tuto expresi porovnávali se zdravými kontrolami, podařilo se jim detekovat zvýšenou expresi TLR2 a TLR4 mRNA i proteinů v duodenální sliznici u dětí s celiakií, hodnoty byly dokonce vyšší u dětí s léčenou celiakií ve srovnání s dětmi s neléčenou celiakií (Szebeni et al. 2007). Exprese TLR3 mRNA byla zvýšená u dětí s léčenou celiakií oproti kontrolám a dětem s neléčenou celiakií, protein TLR3 se podařilo detekovat pouze u pacientů s léčenou celiakií (Szebeni et al. 2007). Tyto výsledky vypovídají o roli TLRs a vrozené imunity v patogenezi celiakie. Otázkou však zůstává, zda je exprese TLRs pouze lokální (tedy v místě zánětu) nebo zda ji lze detekovat i u buněk imunitního systému, tedy např. u monocytů. Zvýšená exprese TLR2 a TLR4 mRNA a na buněčném povrchu byla detekována u cirkulujících monocytů pacientů s autoimunitním diabetem (Devaraj et al. 2008). Riziko propuknutí CD někdy bývá zvýšeno virovými infekcemi, především gastrointestinálními (Kagnoff et al. 1987; Stene et al. 2006). Virovou ssRNA jsou schopny rozpoznávat některé TLRs, a to TLR7 a TLR8 (Tab. 1). Deane a kol. pozorovali na myších modelech význam exprese TLR7, kdy došli k závěru, že kontrola exprese TLR7 je nezbytná pro regulaci autoimunity; v případě zvýšení dávky TLR7 pozorovali indukci autoimunity, silné zvýšení TLR7 exprese vyvolalo masivní expanzi zánětlivých dendritických buněk a anémii (Deane et al. 2007). V navození autoimunitní dysbalance u celiakie tedy mohou hrát roli určité TLRs, přičemž ve studii Olavarria a kol. bylo zaznamenáno možné zkřížení TLR/NF-κB a PRL/Jak/Stat signálních drah(Olavarria et al. 2010).
21
1.3 Prolaktin Prolaktin (PRL) je peptidový hormon adenohypofýzy s molekulovou hmotností 23 kDa, který je tvořen 198 aminokyselinami (Smith and Norman 1990). Gen kódující PRL se nachází na krátkém raménku 6. chromozómu (Owerbach et al. 1981) v blízkosti genů kódujících hlavní histokompatibilní komplex, což může souviset s detekcí zvýšených hladin prolaktinu u pacientů s autoimunitními onemocněními (Vera-Lastra et al. 2002). PRL má mnohé posttranslační modifikace, které zahrnují např. glykosylaci, deaminaci a fosforylaci (Bole-Feysot et al. 1998; Freeman et al. 2000). Glykosylovaná varianta PRL reprezentuje 10-15% hypofyzárního PRL, má nižší biologickou účinnost a nižší vazebnou afinitu k receptoru než neglykolysovaná varianta PRL (Price et al. 1995). Deaminace účinek PRL neovlivňuje, avšak fosforylace, která je méně častá než glykosylace, dává PRL odlišné biologické vlastnosti (Ueda et al. 2006). Další posttranslační úpravy modifikují především velikost PRL, kdy u lidí existují další, menší a větší varianty než základní 23 kDa PRL. Např. dimerizací a polymerizací vznikají biologicky méně aktivní „big“ PRL (kolem 50 kDa) a „big big“ PRL, tzv. makroprolaktin (nad 100 kDa), naopak proteolytickým štěpením vznikají menší formy PRL, např. 16 kDa, který byl detekován v hypofýze a krevním séru (Freeman et al. 2000). Pestrost variant PRL se zřejmě podílí na množství účinků PRL v organismu. Nejznámější vlastnostíPRL je podpora růstu a diferenciace mléčné žlázy, laktace a ovlivňování reprodukčních dějů, avšak PRL má více funkcí než všechny ostatní hypofyzární hormony dohromady, podílí se na ovlivňování životně důležitých procesů v buňce (proliferace, diferenciace, syntéza komponent potřebných pro růst buňky) a účastní se sekreční aktivity, motility a dalších schopností fungující buňky (Goffin et al. 2005; Matera et al. 2001). Participuje také na aktivaci mnoha imunologických odpovědí, a tím zvyšuje progresi imunitního procesu u autoimunitních onemocnění (De Bellis et al. 2005). PRL je v adenohypofýze uskladněn v sekrečních váčcích. Sekreci prolaktinu z adenohypofýzy stimuluje především thyreoliberin (TRH), kojení a stres, avšak stimulační potenciál je také připisován serotoninu, oxytocinu, interleukinu (IL)-1 (Schettini et al. 1990), IL-2 (Karanth and McCann 1991) a IL-6 (Spangelo et al. 1989). Hlavním inhibitorem je dopamin, prolaktostatin secerovaný hypotalamem, inhibičně však působí také tumor supresorový faktor (TNF)-α , interferon (INF)-γ (Walton and Cronin 1990) a
22
endotelin 3 (Kanyicska et al. 1991). Prolaktin je jediným hormonem adenohypofýzy, který je regulován především inhibicí. Hypofyzární prolaktin vykonává své účinky přes klasické endokrinní cesty, tj. je vylučován žlázou, transportován do oběhového systému a působí na cílové buňky pomocí vazby na prolaktinový receptor (PRL-R).
1.3.1 Mimohypofyzární PRL PRL je produkován nejen adenohypofýzou, ale také dalšími extrahypofyzárními tkáněmi jako např. neurony, prostatou, děložní sliznicí, prsním epitelem a buňkami imunitního systému – lymfocyty, monocyty a dendritickými buňkami (BenJonathan et al. 1996). Prolaktin lze také detekovat v několika tělních tekutinách, např. v mozkomíšním moku, plodové vodě, slzách, mléku, folikulární tekutině a potu (BenJonathan et al. 1996). O důležitosti mimohypofyzárního PRL u myší vypovídá fakt, že neutralizace cirkulujícího PRL anti-PRL protilátkami vede k imunitní dysfunkci a smrti (Nagy and Berczi 1991). Obdobná je však zřejmě tato situace i u lidí, např. byla detekována hypoprolaktinémie u dětí s multiorgánovým selháním (Felmet et al. 2005). Primární struktura maturovaného mimohypofyzárního PRL se od hypofyzárního svou strukturou nějak neliší, odlišné jsou však příslušné promotoryPRL genu. Tzv. mimohypofyzární promotor je charakterizován promotorovou oblastí 5´ až nekódující exon 1a a promotor pro hypofyzární PRL se nachází v oblasti 5´ až exon 1b.V důsledku odlišného umístění promotorů je mRNA mimohypofyzárního PRL o 134 bp delší, obsahuje unikátní 5´ netranslatovaný region (Goffin et al. 2005). Mimohypofyzární promotor se vyskytuje pouze u vyšších primátů a člověka. Dalším rozdílem je regulace transkripčním faktorem Pit-1, kdy mimohypofyzární promotor je na rozdíl od hypofyzárního Pit-1 independentní (Goffin et al. 2005). V tomto mimohypofyzárním promotoru se na pozici -1149 nachází funkční jednonukleotidový polymorfismus G/T, přičemž alela G je asociována s vyšší expresí PRL mRNA v T lymfocytech (Stevens et al. 2001b) a její zvýšená incidence byla pozorována u pacientů se systémovým lupus erythematodus (Stevens et al. 2001a). Mimohypofyzární PRL spouští své účinky navázáním na PRL-R, avšak oproti hypofyzárnímu PRL může jednat přímější cestou (lokálně). Ben-Jonathan ve své publikaci uvádí, že regulace produkce mimohypofyzárního PRLprobíhá na úrovni transkripce, avšak
23
data,
která
by
toto
tvrzení
podpořila,
prozatím
nejsou(Ben-Jonathan
et
al.
2008).V lymfocytech je exprese PRL stimulována PHA (fytohemaglutininem) a fyziologickými stimuly cestou cAMP (cyklický adenosinmonofosfát) (Reem et al. 1999), inhibitory sekrece PRL v T lymfocytech jsou např. IL-2 a 4 (Gerlo et al. 2005). Avšak regulace exprese PRL v T lymfocytech se liší od regulace exprese PRL v buňkách endometria, v nichž je transkripce PRL závislá na trvale aktivní PKA (protein kináza A) (Gellersen et al. 1994). Regulace exprese PRL je tedy zřejmě tkáňově specifická, např. u lymfoidních buněk byl objeven PRL enhancer. Tento enhancer je lokalizovaný -375/-212 bp v exonu 1a, delece či zkrácení tohoto úseku sníží promotorovou aktivitu přibližně o 50% (Berwaer et al. 1994)
1.3.2 Prolaktinový receptor (PRL-R) Prostřednictvím aktivace PRL-R a následných transkripčních faktorů vykonává PRL své účinky. PRL-R je membránový receptor patřící spolu s receptorem pro růstový hormon (GH), leptin, erytropoetin, interleukiny 2,7 a dalšími do rodiny cytokinových receptorů subrodiny I. Lidský PRL-R je kódován genem lokalizovaným na 5. chromosomu (5p13-14) a obsahuje nejméně 10 exonů (Arden et al. 1990). PRL-R se skládá ze tří domén: extracelulární, transmembránové a cytoplazmatické. PRL-R jsou distribuovány na všech buňkách imunitního systému, které exprimují čtyři varianty (Clevenger et al. 2003). Tyto varianty jsou výsledkem alternativního sestřihu mRNA nebo posttranslační proteolýzy, vykazují odlišnou strukturu i funkci, konkrétně odlišnou afinitu k PRL a schopnost spouštět další signalizační dráhy, avšak každá z variant je schopna navázat PRL ve fyziologických koncentracích (Clevenger and Kline 2001). PRL-R je exprimován tkáňově specificky a také v závislosti na fázi estrálního cyklu, těhotenství a kojení (Nagano and Kelly 1994). Po nasednutí PRL na PRL-R dochází k dimerizaci receptoru a aktivaci několika signálních drah, především JAK-STAT, Ras-Raf-MAPK, apoptických drah a dalších (Lee et al. 1999) (viz dále).
1.3.3 Signální dráhy PRL Všechny výše popsané funkce PRL jsou výsledkem interakcí PRL s jeho receptorem v různých cílových buňkách, které vedou k aktivaci intracelulárních cest (viz Příloha 1). Prvním krokem signální kaskády je vazba ligandu (PRL) na extracelulární
24
doménu receptoru (PRL-R), jež způsobí dimerizaci receptoru, tedy změnu konformace celého receptoru, což vede k aktivaci protein-kináz přes jejich reakci s cytosolickou doménou PRL-R. Tyto protein-kinázy autofosforylují a následně fosforylují substrátový protein, to způsobí aktivaci sekundárních signálních molekul. Cytokinové receptory obecně aktivují dvě třídy tyrosinkináz: Janus tyrozin kinázy a Src tyrozin kinázy (Lee et al. 1999). Janus tyrozin kinázy, JAK-STAT signální dráha Janus kinázy zahrnují čtyři kinázy: JAK-1, JAK-2, JAK-3 a Tyk2, jednoznačně hlavní Janus kináza související s PRL-R je JAK-2. Pro katalytickou aktivitu JAK-2 jsou nutné tři substráty: PRL-R, STAT5 a JAK-2 samotný (Clevenger and Kline 2001). JAK-2 velice rychle autofosforyluje po dimerizaci receptoru (PRL-R), zvýší svou aktivitu, to má za následek další fosforylace, především aktivaci STAT transkripčních faktorů (Clevenger and Kline 2001). Bylo identifikováno sedm STAT faktorů, avšak aktivace PRL-R se podílí na spuštění STAT 1, 3 a 5. Neaktivní monomery 1, 3 a 5 jsou volně v cytoplasmě, po fosforylaci se aktivní STAT přemisťují do jádra, kde se váží na specifické DNA promotory a podílejí se na regulaci transkripce, např. IRF-1 a cyklin D (Grimley et al. 1999). Avšak regulace pomocí STAT je pleiotropií, v důsledku dochází k regulaci mnoha buněčných funkcí jako např. proliferace, diferenciace a apoptóza s důrazem na procesy krvetvorby, imunoregulace, reprodukce a metabolismu tuků (Grimley et al. 1999). Zpětná regulace (inhibice) účinků PRL je zajišťována SOCS a CIS. SOCS se liší ve svém vlivu na signalizaci PRL, SOCS1 se váže přímo na JAK2 a inhibuje katalytickou aktivitu, zatímco CIS se váže na cytoplasmatickou doménu PRL-R, čímž pravděpodobně brání signalizaci meziproduktů (STAT) (Starr and Hilton 1998). JAK-STAT signální dráha je zřejmě nejdůležitější signální dráhou spuštěnou cytokinovými receptory, avšak pravděpodobně dochází k iniciaci i dalších signálních kaskád, které mohou být i vzájemně propojeny (Bole-Feysot et al. 1998) (viz Příloha 1). Src tyrozin kinázy Src kinázy se skládají z Src, Lyn, LCK, Fyn, Ano, HCK, FGR a Yrk tyrozin kináz a jsou lokalizovány na buněčné membráně poblíž receptoru (Clevenger and Kline 2001). Src kinázy spojené s PRL-R (především Fyn) aktivují fosfolipázu C (PLC-γ), jenž přes
25
diacylglycerol (DAG) aktivuje proteinkinázu C (PKC), jejíž aktivace prolaktinem byla pozorována (Sauro and Zorn 1991). Src kinázou Fyn může být také aktivována PI-3K, která v důsledku vede ke zvýšení exprese MYC. PI-3K je také aktivována DAG a aktivovaným Ras proteinem. PI-3K fosforyluje proteinkinázu B (Akt), jež zvyšuje přímo i nepřímo expresi MYC(Tripathi and Sodhi 2008). Ras-Raf-MAPK signální dráha Ras proteiny nejsou obvykle spojeny s receptorem přímo, ale prostřednictvím tzv. adaptorových proteinů, které modifikují či aktivují efektorový protein. Těmito adaptorovými proteiny jsou cytosolické proteiny GRB2 a SOS, které zprostředkují aktivaci Ras proteinu. Komplex SHC-GRB2-SOS je aktivován jak Src kinázami (Fyn), tak JAK-2 (Bole-Feysot et al. 1998). Aktivovaný Ras protein váže N-koncovou doménu Raf, jenž váže a fosforyluje MEK kinázu, která fosforyluje a aktivuje MAP kinázu. MAP kináza fosforyluje řadu dalších proteinů, které regulují expresi důležitých proteinů buněčného cyklu a diferenciace, např. Tcf, Jun, Myc(Seth et al. 1992).
1.3.4 Prolaktin a autoimunita Sabharwal a kol. zjistili, že lidské mononukleární buňky z periferní krve syntetizují a sekretují PRL (Sabharwal et al. 1992). Dále bylo zjištěno, že PRL stimuluje produkci chemokinů a cytokinů, jako např. TNF-α, IFN-γ, IL-2 (Cesario et al. 1994; Orbach and Shoenfeld 2007), IL-2 receptoru (IL-2R) (Mukherjee et al. 1990), IL-10 a IL-12 (Matalka 2003). Kromě cytokinů stimuluje PRL také expresi IRF-1, který reguluje maturaci a diferenciaci B a T lymfocytů (Yulee et al. 1990). PRL také indukuje produkci imunoglobulinů (Jacobi et al. 2001b). Tato a další fakta (viz níže) podporují hypotézu, že PRL je nejen hormon, ale také účinný cytokin, který se účastní imunitní odpovědi. V současné době není mnoho pochyb o tom, že PRL se podílí na patogenezi řady onemocnění, především autoimunitních, ale také některých malignit. Hyperprolaktinémie byla pozorována u některých autoimunitních onemocnění, např. systémového lupusu erythematodes (SLE) (Jara et al. 2001), revmatoidní artritidy (AR) (Chikanza et al. 1993), systémová sklerózy a Sjögrenova syndromu (SS) (El Miedany et al. 2004; Orbach and Shoenfeld 2007), a také u některých orgánově specifických
26
autoimunitních onemocnění jako např. diabetes mellitus I. typu (T1D) (De Bellis et al. 2005), Gravesova nemoc (GD) (Li et al. 2001), Hashmitonova tyroiditida (HT) (De Bellis et al. 2005), Addisonova choroba (AD) (Lever and McKerron 1984), lymfocytická hypofyzitida (LYH) (Thodou et al. 1995), roztroušená skleróza (MS) (Azar and Yamout 1999) a celiakie (CD) (Kapur et al. 2004). U některých z těchto autoimunitních onemocnění (RA, T1D, MS a CD) mají patogenní roli T lymfocyty s Th1 profilem (IFN-γ, IL-2, TNF-α), avšak T lymfocyty s Th2 profilem (IL-4, IL-5, IL-6) jsou také aktivovány. PRL stimuluje uvolňování jak Th1 tak Th2 cytokinů (Matera et al. 2000). Aktivované T lymfocyty s Th2 profilem stimulují produkci autoprotilátek, např. u celiakie tkáňové transglutaminázy (De Bellis et al. 2005). Množství PRL v krevním séru u některých onemocnění koreluje s aktivitou (projevem) onemocnění, např. u SLE korelují hladiny PRL v séru s klinickou a sérologickou aktivitou onemocnění (Jacobi et al. 2001a). U SS korelují hladiny PRL se stavem poškození vnitřních orgánů, avšak nekorelují s trváním onemocnění, se stavem biopsie, hladinou autoprotilátek ani imunoglobulinů (Jacobi et al. 2001b). V případě RA může mít PRL vliv na aktivitu onemocnění, avšak data jsou prozatím sporná (shrnuto v (Orbach and Shoenfeld 2007). U celiakie však byla pozorována korelace mezi sérovými hladinami PRL a aktivitou onemocnění (viz dále) (Kapur et al. 2004). Jak již bylo zmíněno, PRL se také zřejmě podílí na patogenezi některých malignit. Vzhledem k funkci PRL při růstu a diferenciaci mléčné žlázy a následné laktaci nepřekvapí, že zvýšené plazmatické hladiny PRL zvyšují riziko rakoviny prsu u žen po menopauze (Hankinson et al. 1999; Tworoger et al. 2004). Spuštění PRL signalizačních kaskád zřejmě vede k expresi genů, jež přispívají k rozvoji a patobiologii rakoviny prsu (Clevenger et al. 2003). Uvažuje se také o vlivu PRL na rozvoji rakoviny prostaty, avšak jeho role prozatím není zcela objasněna (Cunningham et al. 2007). Zvažována je také role PRL v patogenezi non-Hodgkinova lymfomu (Skibola et al. 2005). Patologicky
snížené
hladiny
PRL
(hypoprolaktinémie)
nebývají
oproti
hyperprolaktinémii tak častým jevem, avšak byla pozorována u dětí s multiorgánovým selháním (Felmet et al. 2005) a zdá se, že přispívá k mortalitě hematoonkologických pacientů v sepsi(Cejkova et al. 2012), což jen utvrzuje roli PRL při imunitní odpovědi.
27
1.3.5 Prolaktin a celiakie Ženy mají vyšší fyziologické hladiny PRL v séru a také vyšší incidenci celiakie, konkrétně 3× vyšší než muži (Louka and Sollid 2003). Mezi komplikace celiakie patří neplodnost, která je mimo jiné spojována také s hyperprolaktinémií (Davis 2004). Hyperprolaktinémie byla pozorována u pacientů s aktivní celiakií, tedy u pacientů, kteří nedrželi bezlepkovou dietu; u celiaků, kteří již drželi bezlepkovou dietu, byla hladina PRL v normálu (Kapur et al. 2004; Reifen et al. 1997; Varkonyi et al. 1998).Bylo pozorováno, že po nastolení bezlepkové diety, trvající déle než dva měsíce, se hladina PRL navrátila do normálu (Varkonyi et al. 1998). Zvýšená hladina PRL u pacientů s celiakií také koreluje s aktivitou onemocnění, tedy s malnutricí a se stupněm histologického poškození střev (Kapur et al. 2004). Jak již bylo zmíněno výše, PRL stimuluje produkci TNF-α, IFN-γ (Cesario et al. 1994; Orbach and Shoenfeld 2007) a IL-12 (Matalka 2003), přičemž všechny tyto cytokiny mají určitou souvislost s celiakií. Gen TNF-α je pro svou funkci (podílí se na regulaci proliferace, apoptózy, metabolismu lipidů a koagulaci) a pro svou pozici (6p21.3) řazen mezi kandidátní geny podílející se na patogenezi celiakie (Woolley et al. 2005). S celiakií je také spojena vysoká exprese IFN-γ, jenž se podílí na zánětlivém procesu vedoucímu k poškození enterocytů (Jabri et al. 2005). Velmi brzy po imunitní odpovědi se vytváří pro-zánětlivý cytokin IL-12, který může vyvolat diferenciaci Th1 buněk, zatímco brání vzniku Th2 buněk (Brand et al. 2004). U některých autoimunitních onemocnění (viz výše) bylo prokázáno, že PRL stimuluje uvolňování jak Th1 tak Th2 cytokinů (Matera et al. 2000). Aktivované T lymfocyty s Th2 profilem stimulují produkci autoprotilátek, u celiakie tedy tkáňové transglutaminázy (De Bellis et al. 2005). PRL také posiluje vývoj ko-stimulačních molekul CD40, CD80, CD86 a buněk prezentujících antigen MHC II. třídy (Matera et al. 2001). Gen pro PRL se nachází v blízkosti genů HLA-DQ2 a -DQ8, jež jsou genetickou predispozicí celiakie (viz výše) (Sollid and Thorsby 1993), což může souviset s detekcí zvýšených hladin prolaktinu u pacientů s celiakií (Vera-Lastra et al. 2002). PRL a TLRs se pravděpodobně podílejí na vrozené imunitní reakci v patogenezi některých autoimunitních onemocnění včetně celiakie. PRL, TLR2, TLR4 aTLR7jsou exprimovány monocyty, které se tímto staly předmětem naší studie.
28
1.4 Monocyty Monocyty se vyvíjejí z myleo-monocytárních kmenových buněk v kostní dřeni,poté se dostávají do krve, kde několik dní cirkulují a teprve pak migrují do tkáně, kde se dále vyvíjejí v makrofágy (Ziegler-Heitbrock et al. 2010), jež jsou velmi heterogenní v závislosti na typu tkáně. Tyto buňky se souhrnně nazývají mononukleárními fagocyty či monocyty/makrofágy a v krvi zdravého člověka se jejich množství pohybuje v rozmezí od 1,7 – 9,3 %leukocytů(Koubek 2011), jsou velmi multifunkční a mají svou úlohu v homeostáze, imunitní obraně, opravě tkání a bylo prokázáno, že exprimují velice rozmanité membránové receptory(viz 1.4.2). Dle usnesení na konferenci „Definice lidských krevních monocytů“ („Definition of Human Blood Monocytes“), která se konala v říjnu roku 1999 v Mnichově, mohou být monocyty nelépe definovány pomocí monoklonálních protilátek v průtokové cytometrii. Nejlepší k jejich vymezení je použití CD14 a CD16 protilátek (Ziegler-Heitbrock 2000), protože CD14 jsou charakteristické povrchové markery monocytů a s rozvojem průtokové cytometrie došlo k identifikaci subpopulace monocytů, pro niž jsou charakteristické CD16 receptory(Passlick et al. 1989). Tato CD16 subpopulace ko-exprimuje CD16 a nízké hodnoty CD14. Mezi těmito neklasickými CD14+CD16++ monocyty a klasickými CD14++CD16- byla popsána přechodná forma CD14++ CD16+ (Obr. 8), jenž má nízkou frekvenci, avšak jedinečné vlastnosti expandovat během léčby cytokiny a při zánětu(Ellery et al. 2007; Weiner et al. 1994). Zdá se, že mezi jednotlivými typy monocytů jsou vývojové vztahy (od klasických přes přechodné k neklasickým).V průběhu infekce či léčby M-CSF (kolonie stimulující faktor makrofágů), docházelo nejprve ke zvýšení přechodných monocytů následované zvýšením neklasických monocytů (Weiner et al. 1994) (Obr. 8).
29
Obr. 8: Klasifikace lidských monocytů; modré háky značí CD14, oranžový čtverec CD16, vyšší počet daného symbolu znamená vyšší hustotu příslušného receptoru; šipky představují předpokládaný vývojový vztah (Upraveno podle: Ziegler-Heitbrock 2010)
1.4.1 Neklasické CD14+CD16++ monocyty Tento podtyp monocytů je poněkud méně zastoupen, tvoří přibližně 10% monocytů a jedná se o unikátní typ. Oproti klasickým monocytům mají na svém povrchu určité charakteristické molekuly zahrnujícízvýšenou expresi HLA-DR, mucinu podobný receptor 2 obsahující modul epidermálního růstového faktoru (EMR2), Ig-like transkriptu 4, CD43, CD45RA(Almeida et al. 2001; Kwakkenbos et al. 2002; Rothe et al. 1996)a navíc oproti klasickým monocytům lze na jejich buněčném povrchu detekovat M-DC8(Siedlar et al. 2000). Obdobný vzor povrchových antigenů lze pozorovat u tkáňových makrofágů a in vitro studie ukázaly, že maturující makrofágové exprimují CD16 spolu s nízkou expresí CD14, mohou se tedy vyvíjet z CD14++ monocytů (Zieglerheitbrock et al. 1993). Toto zjištění indikuje, že CD14+CD16+ monocyty jsou maturovanější CD14++ monocyty. Produkce cytokinů v reakci na TLR ligandy je jedním z význačných rysů monocytů a makrofágů. Po stimulaci plné krve LPS (ligand pro TLR4) a Pam3Cys (ligand pro TLR2) byla pomocí intracelulárního značení u CD14+CD16+ detekována zvýšená produkce TNF (Belge et al. 2002), avšak exprese TNF mRNA se nelišila od klasických monocytů, oproti
30
tomu exprese IL-10 mRNA byla velice nízká až nedetekovatelná(Frankenberger et al. 1996). Zvýšená produkce pro-zánětlivého TNF a snížená exprese protizánětlivého IL-10 vedly k hypotéze, že CD14+CD16+ buňky jsou pro-zánětlivé monocyty(Ziegler-Heitbrock 2007). V řadě studií se objevují poznatky o snížení či zvýšení množství CD14+CD16+ monocytů u různých onemocnění, avšak studie se liší nejen metodou výzkumu, ale také výsledky. U pacientů s RA bylo detekováno nižší množství CD14+CD16+ monocytů oproti kontrolám (Cairns et al. 2002), nárůst množství CD14+CD16+ monocytů nebyl zaznamenán ani u pacientů s diabetem I. či II. typu (Bouma et al. 2004; Patino et al. 2000), avšak v průběhu studia diabetu na myších modelech byl tento nárůst pozorován (Nikolic et al. 2005). Tato diskrepance však mohla být způsobena tím, že na myším modelu byl tento nárůst pozorován v počátečních stádiích rozvoje onemocnění, kdežto u lidí bylo množství monocytů sledováno až po rozvoji onemocnění (Ziegler-Heitbrock 2007). Korelace množství CD14+CD16+ monocytů byla odhalena s hladinami LHDL (Rothe et al. 1996), zvýšené procento monocytů CD14+CD16+ bylo také pozorováno v kohortě pacientů s ischemickou srdeční chorobou (Schlitt et al. 2004). Výrazné nárůsty CD14+CD16+ monocytů byly pozorovány u pacientů s těžkou bakteriální sepsí (Fingerle et al. 1993), také bylo zjištěno, že dochází ke zvýšení CD14+CD16+ monocytů u HIV pozitivních pacientů(Pulliam et al. 1997; Thieblemont et al. 1995).
1.4.2 Membránové molekuly na monocytech Monocyty nesou na svém povrchu řadu molekul, které
jim umožňují
zprostředkovávat různé funkce (viz Obr. 9 a Tab. 2). Kvalitativní i kvantitativní zastoupení těchto receptorů se může lišit v závislosti na konkrétním profilu. Monocyty se uplatňují především při obraně proti vzniku nádorů a při různých imunitních reakcích, proto se jejich zvýšené hodnoty a změny v expresi povrchových molekul vztahují k etiopatogenezi a etiopatofyziologii různých chorob(Koubek 2011). Např. kultivace monocytů od zdravých osob a jejich stimulace gliadinem nebo INF-γ vyvolala mírný nárůst povrchových markerů maturace (CD83) a aktivace (CD80,CD40) oproti monocytům kultivovaným v čistém médiu (Cinova et al. 2007). Avšak inkubace monocytů s fragmenty gliadinu a INF-γ zároveň vyvolala zvýšení exprese i počtu buněk exprimujících CD80, CD83, CD86 a CD40 (Cinova et al. 2007).
31
Obr. 9: Některé chemokinové a cytokinové receptory na monocytech; membránové receptory pro cytokiny jsou monomery, dimery popř. trimery, membránové receptory pro chemokiny procházejí 7× membránou (Převzato z Koubek 2011) Tab.2 Příklady povrchových molekul monocytů a jejich funkce MARKER CD14
EXPRESE silně monocyty slabě tkáňovými makrofágy
CD16
makrofágy aktivovanými monocyty monocyty
CD40 CD69 CD80 CD86 HLA-DR
aktivovanými makrofágy monocyty monocyty monocyty makrofágy
FUNKCE membránový glykoprotein zakotvený pomocí glykosylfosfatidylinositolu, receptor pro LPS /LPS vazbu na bílkoviny (LBP) komplexu, LPS aktivace CD14-závislé signální dráhy vede k zvýšené produkci cytokinů a expresi buněčných povrchových molekul včetně adhezních molekul váže konstantní oblast IgG1 a IgG3 s nízkou afinitou podporuje produkci cytokinů v monocytech a dendritických buňkách, signalizace adheze kostimulační ligand pro CD28, inhibiční ligand pro CTLA-4, signalizace (vazba CD28,CD152) signalizace (vazba CD28,CD152), viz CD80 vazba exogenních peptidů
32
Stimulace monocytů nevede jen ke změně povrchových markerů, ale také ke změně spektra produkce cytokinů. Monocyty pacientů s celiakií, jež jsou stimulované gliadinem, produkují zvýšené množství IL-8 a TNF-α oproti monocytům od zdravých kontrol, přičemž monocyty od pacientů s aktivní celiakií produkovaly více IL-8 než pacienti s neaktivní celiakií, které ovšem produkovaly více IL-8 než monocyty od zdravých kontrol(Cinova et al. 2007). Monocyty hrají důležitou roli v imunitní odpovědi, balanci a dysbalanci, proto je důležité se zabývat rolí a expresí jejich povrchových markerů a cytokinů.
33
2 Hypotézy a cíle diplomové práce Abychom rozšířili vědomosti o roli vrozené imunity a cirkulujících monocytů v patogenezi celiakie, zaměřili jsme se v této pilotní studii na detekování změn exprese pro-zánětlivých (TNF-α, IL-6, IL-12A) a protizánětlivých cytokinů (IL-10) a markerů hrajících klíčovou úlohu ve vrozené imunitě (TLRs a PRL). Na základě poznatků z jiných studií jsme postulovali pracovní hypotézy:
Imunitní dysbalance vede ke zvýšení exprese TLR2, TLR4 a TLR7 v monocytech periferní krve.
Imunitní dysbalance vede také ke zvýšení exprese PRL v monocytech periferní krve.
Zvýšená produkce PRL je výsledkem funkčního polymorfismu v PRL genu.
Zánětlivá reakce v průběhu celiakie je výsledkem zvýšené exprese zánětlivých cytokinů (TNF, IL-6,IL-12) a snížené exprese protizánětlivých cytokinů (IL-10)
Na základě předložené pracovní hypotézy jsme definovali cíle diplomové práce:
U zdravých kontrol určit relativní hladiny exprese TLR2, TLR4, TLR7, PRL, TNF, IL-6, IL-10 a IL-12A mRNA a porovnat je s hladinami exprese u pacientů.
U pacientů porovnat hladiny exprese TLR2, TLR4, TLR7, PRL, TNF, IL-6, IL-10 a IL-12A mRNA mezi pacienty s recentní, neboli aktivní celiakií a pacienty s neaktivní celiakií, tedy dodržujícími bezlepkovou dietu (déle než dva roky).
Zjistit, zda potenciální rozdíly v expresi PRL mRNA souvisejí s funkčním SNP -1149 G/T, klinickými daty či pohlavím.
Optimalizace metody in vitro kultivace a stimulace periferních monocytů.
34
3 Materiál a metody Výchozím materiálem pro naše metody byla plná krev získaná od pacientů s celiakií, či buffy coat od dárců krve. Metody zpracování této krve jsou rozděleny do úseků metod založených na získání a zpracování RNA (3.3), získání a zpracování DNA (3.4) a kultivaci a stimulaci monocytů (3.5) se zaměřením na sledovaný výstup, který těmito metodami chceme zjistit.
3.1 Pacienti Vzorky krve pacientů s celiakií byly získávány na základě spolupráce s II. interní klinikou Fakultní nemocnice Královské Vinohrady v Praze a IV. interní klinikou Všeobecné fakultní nemocnice. Do diplomové práce bylo zahrnuto 21 pacientů s celiakií, diagnostikovanou na základě kritérií ESPGHAN(Riordan and Davidson 1991)neboMarsh kritérií (Marsh 1992). V hodnoceném souboru bylo 15 žen a 6 mužůve věku od 19 do 67 let (viz Tab. 3)a jednalo se jak o pacienty s čerstvě diagnostikovanou celiakií, tedy o pacienty s recentní celiakií, tak o pacienty s celiakií, kteří již drželi bezlepkovou dietu a to déle než dva roky. Tab. 3 Sledovaný soubor pacientů PACINETI
ženy
muži
celkem
počet
15
6
21
věk – průměr
31,87
44,17
36,45
(rozptyl)
(19 –62)
(22 – 67)
(19 – 67)
recentní celiakie
4
3
7
bezlepková dieta
11
3
14
Každý vzorek dostal evidenční číslo C1 – C21(pacient s celiakií č. 1 – 21) a pod tímto evidenčním číslem byl vzorek dále zpracováván jak v laboratoři, tak při statistickém hodnocení.
35
3.2 Kontrolní soubor Kontrolní soubor by měl prezentovat stav sledovaných parametrů u zdravé populace, jedná se o vzorky krve (buffy coat) od dárcůz Transfúzního oddělení Fakultní nemocnice Královské Vinohrady v Praze. Zdravých jedincůbylo 40, z toho 12 žen a 28 mužůve věku od 19 do 59 let (viz Tab.4). Tab. 4 Kontrolní soubor (TO) KONTROLY (TO)
ženy
muži
celkem
počet
12
28
40
věk – průměr
37,08
42,86
36,45
(rozptyl)
(23 – 56)
(19 – 59)
(19 – 67)
Každý vzorek byl označen evidenčním číslem TO1 – TO40 (transfúzní oddělení, vzorek č. 1 – 40) a pod tímto číslem bylo se vzorkem dále pracováno. Tyto kontrolní vzorky posloužily k určení hladin exprese TLR2, TLR4 a PRL mRNA, avšak pro detekci exprese mRNA ostatních genů (TLR7, TNF, IL-6, IL-10 a IL-12A) byl vytvořen výběr 23 vzorků s nejkvalitnější RNA (viz Tab. 5). Tab. 5 Kontrolní soubor (výběr TO) KONTROLY (K)
ženy
muži
celkem
počet
7
16
23
věk – průměr
39,14
39,75
39,42
(rozptyl)
(32 – 53)
(19 – 58)
(19 – 58)
3.3 Studiumgenové exprese na úrovni mRNA Pro studium genové exprese na úrovni mRNA byly použity monocyty (PBM - peripheral blood monocytes) vyizolované z periferní krve pacientů (u zdravých kontrol z buffy coatu) pomocí imunomagnetické separace. Z monocytů byla následně vyizolována RNA, jež byla reverzní transkripcí přepsána do cDNA. Ta byla použita pro polymerázovou řetězovou reakci v reálném čase za účelem kvantitativního vyhodnocení exprese mRNA genů pro TLR2, TLR4, TLR7, PRL,TNF, IL-6, IL-10 a IL-12. Jako
36
endogenní kontrolu jsme použili PGK1 (fosfoglycerát kináza 1). Získaná data byla přepočtena na hodnotu 2^-dCt a statisticky vyhodnocena pomocí programu GraphPad Prism 5.
3.3.1 Imunomagnetickáseparace monocytů Separaci monocytů z periferní krve jsme prováděli pomocí magnetických kuliček Dynabeads s navázanou protilátkou anti-CD14. Celá separace probíhala na ledu a vyizolované monocyty byly uskladňovány v lyzačním roztoku (Lysis solution), který je součástí kitu na izolaci RNA nebo ihned po separaci byla vyizolována RNA. Původní protokol: Použité chemikálie Dynabeads CD14; Invitrogen, USA PBS pH=7,4 (vychlazené) (Phosphate Buffered Saline 10×); Invitrogen, Gibko, USA -
pracujeme s 1x PBS
Lysis solution, součástí kitu GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit, Sigma-Aldrich, Německo Postup 1. V 50 ml zkumavce jsme smíchali krev a chlazené PBS v poměru 1 : 1. 2. Přidaly jsme kuličky Dynabeads podle množství krve (na 8 ml 70 μl kuliček, na 7 ml 60 μl, na 6 ml 50 μl atd.). 3. Zkumavku jsme za občasného promíchávání nechali 5 minut na ledu. 4. Poté jsme odšroubovali víčko a zkumavku jím jen přikryli. Na 3 minuty jsme ji umístili do magnetického stojanu, který byl také umístěn v nádobě s ledem. 5. Zkumavka byla stále umístěna v magnetickém stojanu a pipetou jsme odsáli směs PBS a krve; na stěnách zkumavky v místě kontaktu s magnetem zůstaly přichyceny PBM s navázanými imunomagnetickými kuličkami. 6. Zkumavku jsme vyndali ze stojanu a doplnili do cca 15 – 20 ml PBS, promíchali jsme. 7. Opět jsme zkumavku postavili na 3 minuty k magnetu a následně odsáli veškerou tekutinu.
37
8. Krok 5, 6 a 7 jsme opakovali ještě jednou. 9. Na závěr jsme k vyizolovaným buňkám přidali 500 ml lyzačního roztoku a suspenzi přenesli do kryozkumavky, uchovávali při -80°C nebo rovnou vyizolovali RNA (viz dále). Imunomagnetická separace monocytů byla nejprve prováděna podle v laboratoři zavedeného postupu upraveného oproti originálnímu protokolu od výrobce (viz Původní protokol). Vzhledem k velmi nízkým výtěžkům monocytů a následně RNA u vzorků krve získaných od pacientů proběhla optimalizace postupu. Optimalizace imunomagnetické separace Ve finále byl jako nejvhodnější zvolen originální protokol od výrobce (Invitrogen, USA), který dle našich výsledků vedl i u kvantitativně limitovaných vzorků (pacienti) k vyšším výtěžkům PBM (viz Tab. 6). Tab. 6Srovnání výtěžků dvou protokolů na imunomagnetickou separaci PBM buffy coat množství vyizolovaných PBM na 1ml dle původního protokolu množství vyizolovaných PBM na 1ml dle protokolu od výrobce
374
372
408
410
411
1 468 750
1 781 250
1 437 500
2 187 500
2 375 000
4 343 750
7 656 250
4 031 250
4 562 500
5 062 500
Dle protokolu od výrobce je nutné krev i kuličky nejprve pročistit, než se smíchají dohromady, dojde tak k lepšímu navázání protilátky anti-CD14 na monocyty. Současný protokol: Použité chemikálie Dynabeads CD14; Invitrogen, USA PBS pH=7,4 (vychlazené) (Phosphate Buffered Saline 10×); Invitrogen, Gibko, USA Lyzační roztok, součástí kitu GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit, Sigma-Aldrich, Německo Pufr 1:1× PBSw/0,1% BSA, pH=7,4 -
BSA (Albumin from bovine serum); Sigma-Aldrich, Německo
38
Pufr 2: 1× PBS w/0,1% BSA a 2 mM EDTA -
EDTApH=8, Roth, Německo
Postup 1. Nejprve jsme potřebné množství kuličekDynabeads(na 1 ml krve 25 μl kuliček) smíchali se stejným množstvím pufru 1, nejméně však v 1 ml, a promíchali. 2. Zkumavku jsme na 1 minutu umístili do magnetického stojanu a poté odsály supernatant (kuličky zůstaly na stěně zkumavky). 3. Zkumavku jsme vyndali z magnetického stojanu a kuličky rozmíchali v pufru 1 o objemu původního potřebného množství kuliček Dynabeads (na 1 ml krve 25 μl kuliček). Tímto byly promyty kuličky. 4. Plnou krev či buffy coat jsme smíchali s pufrem 2 v poměru 1 : 2 v 50 ml zkumavce. 5. Centrifugovali jsme při 600 × g 10 minut při 18 – 25°C. 6. Odpipetovali jsme svrchní vrstvu plasmy a zbytek jsme doplnili do původního objemu krve pufrem 2 (2 – 8 °C) a promíchali. Tímto byla promyta krev. 7. Smíchali jsme krev s kuličkami a zkumavku jsme za občasného promíchávání nechali 20 minut na ledu. 8. Poté jsme zkumavku přenesli na 3 minuty do magnetického stojanu,který byl také umístěn v nádobě s ledem. 9. Zkumavka byla stále umístěna v magnetickém stojanu a pipetou jsme odsáli směs pufru 2 a krve; na stěnách zkumavky v místě kontaktu s magnetem zůstaly přichyceny monocyty s navázanými imunomagnetickými kuličkami. 10. Zkumavku jsme vyndali ze stojanu a doplnili do původního objemu pufrem 1, promíchali jsme. 11. Opět jsme zkumavku postavili na 3 minuty k magnetu a následně odsáli veškerou tekutinu. 12. Kroky 5, 6 a 7 jsme opakovali ještě dvakrát. 13. Na závěr jsme k vyizolovaným buňkám přidali 500 ml lyzačního roztoku a suspenzi přenesli do kryozkumavky, uchovávali při -80°C nebo rovnou vyizolovali RNA (viz dále).
39
3.3.2 Izolace RNA RNA byla izolována z CD14+ monocytů v lyzačním roztoku, kdy izolace byla prováděna přes kolonky se silikagelovou membránou, jež jsou součástí izolačního kitu. Na této membráně byla RNA zachycena a následně promývána a zbavována kontaminujících látek. Na závěr byla RNA uvolněna z membrány do roztoku pomocí vody. Celý postup byl prováděn v laminárním boxu. Původní protokol: Použité chemikálie RNeasy Mini Kit; Qiagen, Německo - pufr RLT - pufr RW1 - pufr RPE(koncentrát, který naředíme etanolem) - RNase-free voda Postup 1. CD14+ buňky v RNAlateru jsme nechali rozmrazit při pokojové teplotě. 2. Buňky jsme centrifugovali při 8250g 10 minut. 3. Supernatant jsme odsáli pipetou a přidali 600 μl pufru RLT a krátce vortexovali. 4. Buňky jsme homogenizovali pomocí injekční jehly a stříkačky - 5× jsme nasáli a vypustili zpět. Poté jsme přenesli do ependorfky. 5. Přidali jsme 600 μl 70% etanolu a krátce vortexovali. 6. 700 μl vzorku jsme přenesli na kolonku (ta byla usazena ve sběrné zkumavce), aniž bychom potřísnili okraje. Centrifugovali jsme 30 vteřin při 18000g. Filtrát jsme vylili, sběrnou zkumavku jsme použili dále. 7. Do kolonky jsme přidali 700 μl pufr RW1 a centrifugovali 30 vteřin při při 18000g. Sběrnou zkumavku s filtrátem jsme vyhodili. 8. Vzali jsme si novou sběrnou zkumavku a do ní přenesli kolonku. Přidali jsme 500 μl pufru RPE a opět centrifugujeme 30 vteřin při 18000g. Filtrát jsme vylili a sběrnou zkumavku použili znovu.
40
9. Přidali jsme opět 500 μl pufru RPE a centrifugovali jsme 2 minuty při 18000g. Filtrát jsme vylili a sběrnou zkumavku vrátili pod kolonku. Centrifugovali jsme 1 minutu, abychom se úplně zbavili pufru RPE. Poté jsme sběrnou zkumavku vyhodili. 10. Kolonku jsme přenesli na novou sběrnou zkumavku, přidali jsme 100 μl RNase-free vody a inkubovali 2 minuty. Následně jsme centrifugovali 2 minuty při 18000g a filtrát jsme si nechali, kolonku jsme vyhodili. 11. K filtrátu jsme přidali 300 μl pufru RLT a 300 μl 96% etanolu a krátce vortexovali. 12. Směs jsme přenesli na novou kolonku (700 μl) a opakovali jsme kroky 6-9. 13. Přenesli jsme kolonku na novou sběrnou zkumavku, přidali 40 μl RNase-free vody a inkubovali 2 minuty při pokojové teplotě. 14. Poté jsme centrifugovali 2 minuty při 18000g a filtrát (získanou RNA) jsme nepipetovali do kryozkumavky. 15. Na nanofotometru (NanoPhotometer™ Pearl, Implen) jsme změřili koncentraci a čistotu RNA, tu uchováváme při -80°C. Z důvodu častých nízkých výtěžků RNA (především z krve pacientů) proběhla optimalizace postupu izolace RNA. Optimalizace izolace RNA Pro zvýšení výtěžků RNA, která byla nutná pro další pracovní postup (Real Time PCR), jsme vyzkoušeli tři různé izolační kity (viz Tab. 7). Na základě výtěžků těchto kitů jsme vybrali GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit od Sigma-Aldrich, který je oproti RNeasy Mini Kit od Qiagen finančně výhodnější.
41
Tab. 7Srovnání výtěžků izolace RNA pomocí různých kitů izolační kit typ výrobce RNA II Qiagen RNA XS Qiagen
vzorek
přibližný počet buněk v 1 ml
množství RNA ng
A260/ A280
L410
2 250 000
272 ng
1,889
D410
2 031 250
736 ng
1,84
L410
500 000
112 ng
1,867
104 ng
2,36
D410 GenElute Mammalian Total RNA Sigma-Aldrich
L410
2 250 000
368 ng
2,091
D410
2 031 250
672 ng
1,862
V rámci optimalizace pracovního postupu byla také vyzkoušena izolace RNA pomocí TRI Reagent®Soln (Ambion), pro kterou je však nutné minimální množství vstupního materiálu 5×106 buněk a takové množství jsme obvykle k dispozici neměli (viz Tab. 7 i Tab. 6). Dále vzhledem k nízkým výtěžkům RNA byla provedena u 8 vzorků od pacientů amplifikace RNA pomocí kitu QuantiTect Whole Transcriptome Kit (Qiagen, Německo). Pro nekonzistentnost výsledků amplifikované RNA v následném zpracování (Real Time PCR) (viz Tab. 8), jsme však od amplifikace RNA ustoupili. Tab. 8Ukázka Ct hodnot amplifikované a neamplifikované RNA u PGK1 (endogenní kontroly) VZOREK průměr Ct neamplifikované RNA průměr Ct amplifikované RNA 28,04 25,39 C1 25,83 21,6 C2 29,64 Undetermined C3 30,18 33,45 C4 32,14 29,30 C5 29,43 38,07 C6 29,1 43,18 C7 26,5 40,87 C8
42
Současný protokol: Použité chemikálie GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit, Sigma-Aldrich, Německo -
lyzační roztok
-
2 – merkaptoetanol
-
promývací roztok 1
-
promývací roztok 2
70% etanol, připravený naředěním z 96% etanolu, P-LAB a.s., Praha Voda z MILLIPOR Gradient systému; Milli-Q Postup 1. K CD14+ monocytů v lyzačním roztoku jsme přidali 5μl 2-merkaptoetanolu a důkladně jsem zvortexovali. 2. Vzniklou suspenzi jsme napipetovali do GenElute filtračníkolonky(modré) a centrifugovali na 14 000 × g po dobu 2 minuty. 3. Kolonku jsme vyhodili a do zfiltrovaného roztoku jsme přidali 500 μl 70% etanolu, následně jsme zvortexovali. 4. 500 μl vzniklého roztoku jsme napipetovali do GenElute Binding kolonky (červené); roztoku bylo více než 500 μl, musel být proto napipetován na kolonku ve dvou krocích. 5. Centrifugovali jsme na 14 000 × g po dobu 15 vteřin, filtrát jsme vylili, sběrnou zkumavku jsme vrátili zpět pod kolonku a veškerý zbývající roztok jsme napipetovali do kolonky. 6. Opět jsme centrifugovali na 14 000 × g po dobu 15 vteřin, filtrát jsme vylili, sběrnou zkumavku jsme vrátili zpět pod kolonku. 7. Do kolonky jsme napipetovali 500 μl promývacího roztoku 1 a centrifugovali na 14 000 × g po dobu 15 vteřin. 8. Kolonku jsme přenesli do čisté sběrné zkumavky a napipetovali 500 μl promývacího roztoku 2 a centrifugovali 14 000 × g po dobu 15 vteřin. 9. Sběrnou zkumavku jsme vylili, vrátily pod kolonku a opět napipetovali 500 μl promývacího roztoku 2 a centrifugovali 14 000 × g po dobu 2 minut.
43
10. Poté jsme sběrnou zkumavku vylili, vrátili pod kolonku a znovucentrifugovali na 14 000 × g po dobu 1 minuty, abychom membránu úplně zbavili promývacího roztoku. 11. Přenesli jsme kolonku do čisté sběrné zkumavky, napipetovali 40 μl vody a nechali 1 minutu inkubovat při pokojové teplotě. 12. Na závěr jsme centrifugovali na 14 000 × g po dobu 1 minuty, vyizolovaná RNA byla obsažena ve filtrátu. Koncentraci a čistotu RNA jsme změřili na nanofotometru (NanoPhotometer™ Pearl, Implen) a RNA uchováváme při -80°C.
3.3.3 Reverznětranskriptázová polymerázová řetězová reakce (RT PCR) Pomocí RT PCR jsme přepsali RNA do cDNA, která byla dále použita pro PCR v reálném čase. Celý postup byl prováděn v laminárním boxu. Použité chemikálie High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit; Applied Biosystems, USA -
10× RT pufr
-
25× dNTP Mix (100mM)
-
10×RT náhodné primery
-
MultiScribe Reverse Transcriptase (MultiScribe reverzní transkriptáza)
Voda ze systému MILLIPOR Gradient; Milli-Q Postup 1. Všechny komponenty kitu jsme nechali roztát na ledu. 2. Na základě počtu reakcí jsme si připravili základní reakční směs podle Tab. 8, kde je uvedeno množství na jednu reakci. Reakce bez reverzní transkriptázy slouží jako negativní kontrola.
44
Tab. 8Složení reakční směsi pro jednu reakci RT PCR Komponenty 10× RT pufr 25× dNTP Mix (100nM) 10× RT náhodné primery MultiScribe reverzní transkriptáza Voda Celkem
Objem (μl) Směs s reverzní transkriptázou 2,0 0,8 2,0 1,0
Směs bez reverzní transkriptázy 2,0 0,8 2,0 -
4,2 10
5,2 10
3. Reakční smě jsme vortexovali a udržovali na ledu. 4. Do každé mikro-zkumavky jsme napipetovali 10 μl reakční směsi. 5. Přidali jsme 20 ng RNA a doplnili jsme do objemu reakce 20 μl vodou. 6. Zkumavky jsme krátce centrifugovali a do doby, než jsme je vložili do termocykleru jsme je uchovávali na ledu. 7. V termocykleru (C1000TM Thermal Cycler; Biorad) jsme nastavili program: 1. krok (hybridizace s primery):
10 minut při 25°C
2. krok (extenze):
120 minut při 37°C
3. krok (denaturace enzymu):
5 vteřin při 85°C
8. Vložili jsme vzorky do termocykleru a proces spustili, po skončení reakce vzorky uchováváme při -20°C.
3.3.4 Polymerázovářetězová reakce v reálném čase (Real Time PCR) Real Time PCR je oproti klasické PCR, kde dostáváme informaci o stavu na počátku a na konci reakce, zaměřena na sledování průběhu PCR přímo během reakce, proto tedy „PCR v reálném čase“. Ke kvantifikaci (měření genové exprese) specifického produktu dochází pomocí fluorescenčních sond. Tyto sondy detekují množství PCR produktu zvýšením své fluorescenční aktivity. Tato fluorescenční aktivita je zaznamenávána halogenovou lampou zabudovanou ve speciálních cyklerech (viz Použité přístroje), signál z lampy je převáděn do amplifikačních křivek pomocí softwaru (7 000 System SDS Software nebo 7 500 Software 2.0.1). Výstupem jsou 3 hodnoty Ct (PCR cyklus, v němž 45
fluorescence amplifikovaného templátu překročí prahovou fluorescenci) pro každý gen, endogenní kontrolou zde byl gen PGK1 (fosfoglycerát kináza 1). Z těchto hodnot jsme vypočítali průměrné Ct pro daný vzorek, které jsme použili k výpočtu dCt, což je relativní rozdíl exprese námi sledovaného genu a endogenní kontroly v rámci jednoho vzorku. Hodnota dCt nám posloužila k výpočtu 2^-dCt, jenž udává relativní množství templátu normalizované ke genu pro endogenní kontrolu v rámci vzorku. Tyto údaje vypovídající o míře exprese jednotlivých genů byly následně statisticky zpracovány pomocí programu GraphPad Prism 5. Použité přístroje: ABI Prism 7000 SDS, Applied Biosystems, USA (relativní kvantifikace TLR2, TLR4 a PRL mRNA proti PGK1) ABI Prism 7500 Fast Real-Time PCR System, Life Technologies-Applied Biosystems (relativní kvantifikace TLR7, IL-10, IL-12, IL-6, TNF-α mRNA proti PGK1)
Výhoda používání ve srovnání se starším modelem ABI Prism 7000 SDS: o 36 % nižší spotřeba chemie (finanční úspora), vyšší rychlost reakce
Použité chemikálie TaqMan Gene Expression Master Mix;Life Technologies-Applied Biosystems, USA Assays-on-Demand Gene Expression Assay Mix; Life Technologies-Applied Biosystems, USA -
PGK1:
Hs99999906_m1
-
TLR2:
Hs00152932_m1
-
TLR4:
Hs00152939_m1
-
TLR7:
Hs00152971_m1
-
PRL:
Hs00168730_m1
-
TNF-α:
Hs01113624_m1
-
IL-6:
Hs00985639_m1
-
IL-10:
Hs00961622_m1
-
IL-12:
Hs00168405_m1
RNase free voda; Qiagen, Německo
46
Postup 1. Assays-on-Demand (zakryté před světlem) a cDNA jsme nechali rozmrazit při pokojové teplotě. 2. Pro každý gen jsme v závislosti na typu přístroje připravili reakční směs podle Tab. 9, nebo Tab. 10. Tab. 9 Složení reakční směsi pro Real Time PCR pro jednu reakci pro 7000 SDS ABI Prism Komponenty
Objem (μl)
TaqMan Gene Expression Master Mix
12,5
20× Assays-on-Demand Gene Expression Assay Mix
1,25
RNase free voda
1,25
Celkem
15
Tab. 10 Složení reakční směsi pro Real Time PCR pro jednu reakci pro 7500 Fast ABI Prism Komponenty
Objem (μl)
TaqMan Gene Expression Master Mix
7,0
20× Assays-on-Demand Gene Expression Assay Mix
0,7
RNase free voda
2,3
Celkem
10
3. Do 96-ti jamkové destičky jsme napipetovali po 15 μl resp. 10 μl (v závislosti na typu přístroje) směsi pro daný gen, příklad rozmístění vzorků v destičce vizTab. 11. Reakce byla prováděna v technických tripletech.
47
Tab. 11 Příklad rozmístění reakčních směsí pro jednotlivé geny a cDNA PGK1
TLR2
TLR4
PRL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
C1
C1
C1
C1
C1
C1
C1
C1
C1
C1
C1
C1
B
C2
C2
C2
C2
C2
C2
C2
C2
C2
C2
C2
C2
C
C3
C3
C3
C3
C3
C3
C3
C3
C3
C3
C3
C3
D
C4
C4
C4
C4
C4
C4
C4
C4
C4
C4
C4
C4
E
C5
C5
C5
C5
C5
C5
C5
C5
C5
C5
C5
C5
F
C6
C6
C6
C6
C6
C6
C6
C6
C6
C6
C6
C6
G
C7
C7
C7
C7
C7
C7
C7
C7
C7
C7
C7
C7
H
NK
NK
NK
NK
NK
NK
NK
NK
NK
NK
NK
NK
(NK ~ negativní kontrola, vzorek se směsí bez reverzní transkriptázy vyrobený podle Tab. 8) 4. cDNA jsme naředili vodou (10× pro přístroj 7000 SDS ABI Prism a 4× pro 7500 FastABI Prism ) 5. Do příslušných jamek jsme napipetovali 10 μl (10× naředěné cDNA), nebo 4μl (4× naředěné cDNA). Pipetovali jsme tak, aby nevznikaly bubliny, popřípadě jsme vzniklé bublinyodsáli pipetou. 6. Destičku jsme přelepili fólií a dvě minuty centrifugovali při 1 800g. 7. Destičku jsme vložili do přístroje (7000 SDS ABI Prism, nebo 7500 FastABI Prism) a měřili pomocí absolutní kvantifikace. Podmínky reakce byly nastaveny dle následujících parametrů: 1. krok (zničení případné RNA):
2 minuty při 50°C
2. krok (hot start):
10 minut při 95°C
3. krok (denaturace):
15 vteřin při 95°C
4. krok (hybridizace, extenze):
1 minuta při 60°C (kroky 3 a 4 se opakují 50×)
8. Po dokončení byla získaná data uložena a následně statisticky zpracována.
48
3.4 Studiumfrekvence PRL-1149 G/T SNP Alela G jednonukleotidového polymorfismu lokalizovaného v promotoru PRL genu na pozici 1149je spojena s vyšší expresí PRL mRNA T lymfocyty (Stevens et al. 2001b).Tento polymorfismuslzestudovat pomocí restrikčního štěpení, kdy restrikční enzym XapI štěpí DNA právě v přítomnostialely G. K provedení restrikčního štěpení je nejprve třeba vyizolovat DNA a následně ji amplifikovat. Přítomnost konkrétní alely jsme detekovali elektroforetickým rozdělením fragmentů DNA.
3.4.1 IzolaceDNA K izolaci DNA byla použita periferní krev (odebrána do zkumavky s antikoagulační úpravou – EDTA), v případě zdravých dárců buffy coat. Použité chemikálie QIAamp DNA Blood Mini Kit; Quiagen, Německo -
roztok Proteinázy K
-
pufr AL
-
pufr AW1
-
pufr AW2
Voda ze systému MILLIPOR Gradient; Milli-Q 96% etanol, P-LAB a.s., Praha Postup 1. 20 μl roztoku Proteinázy K jsme napipetovali na dno mikrocentrifugační zkumavky. 2. Přidali jsme 200 μl pufru AL a 15 vteřin jsme vortexovali. 3. Inkubovali jsme 10 minut při 56°C. 4. Poté jsme krátce centrifugovali, abychom odstranili kapičky z víčka. 5. Přidali jsme 200 μl 96% etanolu a vortexovali 15 vteřin, následně jsme opět krátce centrifugovali. 6. Směs jsme opatrně přenesli na kolonku a centrifugovali 1 minutu při 6 000g. 7. Filtrát jsme vyhodili a usadili kolonku do čisté sběrné zkumavky, přidali 500 μl pufru AW1 a centrifugovali při 6 000g 1 minutu.
49
8. Filtrát jsme opět vyhodili a kolonku umístili do nové sběrné zkumavky, přidali 500 μl pufru AW1 a centrifugovali při 18 000g 3 minuty. 9. Filtrát jsme vyhodili a kolonku umístili do nové sběrné zkumavky, přidali 200 μl vody. 10. Inkubovali jsme při pokojové teplotě po dobu 1 minuty a poté centrifugovali při 6 000 g 1 minutu. 11. Filtrát (vyizolovynou DNA) jsme přepipetovali do kryozkumavky a uchováváme při 4°C.
3.4.2 Polymerázovářetězová reakce (PCR) Díky PCR dojde k amplifikaci potřebného fragmentu DNA, v našem případě úseku promotorové oblasti PRL o délce 137 bp. Použité chemikálie PCR reakční kit; Fermentas, Kanada -
Taq DNA polymeráza (rekombinantní) 500u, 5u/ul
-
10x Taq pufr s (NH4)2SO4
-
25 mM MgCl2
dNTP; Fermentas, Kanada -
zředěny na koncentraci 10mM; původní koncentrace 100mM
Primery; East Port Praha, Česko -
Primer F 5´- GCA GGT CAA GAT AAC CTG GA -3´
-
Primer R 5´- CAT CTC AGA GTT GAA TTT ATT TCC TT -3´
původní koncentrace byla 100μM, zředili jsme 2×
Voda z MILLIPOR Gradient systému; Milli-Q Postup 1. Přípravu reakční směsi jsme prováděli v laminárním boxu, všechny reagencie (kromě Taq polymerázy) na tuto směs jsme nechali rozmrazit na ledu. 2. Reakční směs jsme připravili podle Tab. 12, směs jsme připravili také pro negativní kontrolu.
50
Tab. 12 Složení reakční směsi pro jednu reakci PCR Komponenty
Objem (μl)
Voda
14,76
25mM MgCl2
2,0
dNTP Mixture
0,4
přímý primer(Forward Primer)
0,32
zpětný primer(Reverse Primer)
0,32
10x PCR pufr s (NH4)2SO4
2,0
Taq DNA polymeráza (5U/μl)
0,2
Celkem
20
3. Napipetovanou směs jsme vortexovali ado každé zkumavky jsme napipetovali 20 μl reakční směsi. 4. Mimo laminární box jsme přidali 0,5 μl DNA, do negativní kontroly jsme přidali vodu. 5. V termocykleru (C1000TM Thermal Cycler; Biorad) jsme nastavili podmínky reakce: 1. krok (počáteční denaturace):
2 minuty při 94°C
2. krok (denaturace):
17 vteřin při 94°C
3. krok (hybridizace):
17 vteřin při 55°C
4. krok (extenze):
17 vteřin při 72°C (kroky 2, 3 a 4 se 35× opakují)
5. krok (konečná extenze):
17 vteřin při 72°C
6. Po předehřátí víka jsme vložily vzorky do termocykleru. Výsledné PCR produkty jsou uschovávány při 4°C, pro dlouhodobější skladování se volí -20°C. 7. Elektroforeticky (viz kapitola 3.4.4) jsme si ověřili výsledek amplifikace žádaného úseku DNA.
51
3.4.3 Polymorfismusdélky restrikčních fragmentů (RFLP) Vyhovující produkty PCR jsme použili pro restrikční štěpení enzymem XapI, jenž štěpí v přítomnosti alely G a navíc díky artificiálnímu restrikčnímu místu vytvořenému v primeru R, odštěpuje od PCR produktu (137 bp) kontrolní fragment (17bp). Použité chemikálie XapI (ApoI) Kit; Fermentas, Kanada -
XapI (ApoI) 500u, 10u/μl
-
10x Buffer Y*Tango
25mM MgCl2 ; Fermentas, Kanada Voda z MILLIPOR Gradient systému; Milli-Q Postup 1. Na ledu jsme nechali rozmrazit reagencie, vyjma restrikčního enzymu. 2. Připravili jsme reakční směs podle Tab. 13. Tab. 13 Složení reakční směsi pro jednu reakci RFLP Komponenty
Objem (μl)
Voda
2,5
25mM MgCl2
1,5
10x Buffer Y*Tango
0,5
XapI restriction endonuclease
0,5
Celkem
5,0
3. Směs jsme vortexovali a do každé zkumavky jsme napipetovali 5 μl. 4. Přidali jsme 5 μl PCR produktu a promíchali pipetováním. 5. V termocykleru (C1000TM Thermal Cycler; Biorad) jsme nastavili podmínky reakce: 1. krok (restrikce):
120 minut při 37°C
2. krok (denaturace enzymu):
25 minut při 80°C
52
6. Produkt RFLP se uchovává při 4°C, pro dlouhodobější skladování se volí -20°C. Pomocí elektroforetické separace jsme zjistili genotypy jednotlivých vzorků (viz kapitola 3.4.4).
3.4.4 Elektroforetickáseparace Pomocí elektroforetické separace jsme hodnotili kvalitu produktů PCR a zjišťovali genotypy vzorků. Pokud nedojde k restrikčnímu štěpení, fragmenty mají délku 137 bp, pokud dojde k odštěpení kontrolního fragmentu o velikosti 17 bp je na gelu patrný fragment o délce 120 bp a jedná se o alelu T, popřípadě tedy o homozygota TT. V případě štěpení při přítomnosti alely G vznikají tři fragmenty, tedy 17 bp, 35 bp a 85 bp, přičemž na gelu viditelný fragment je především 85 bp a jedná se o homozygota GG. U heterozygota GT jsou patrné dva fragmenty – 120 bp a 85 bp, kdy výraznější je fragment 120 bp. Použité chemikálie Agarose; Serva Electrophoresis GmbH, Německo 10 × TBE pufr (Tris-borátový pufr) – připravili jsme smícháním 500ml vody, 108g Tris, 55g kyseliny borité a 40 ml EDTA. Doplnili na 1000ml vodou. -
890 mM Tris base; Amresco, USA
-
890 mM kyselina boritá; Serva Electrophoresis GmbH, Německo
-
20 mM EDTA pH=8; Roth, Německo
Voda z MILLIPOR Gradient systému; Milli-Q GelRed, 10 000x concentrated in water; C-Consulting, Slovensko 6X Loading Dye Solution; Fermentas, Kanada Marker pUC19 DNA/MspI; Fermentas, Kanada Postup 1. Ve 100 ml 0,5× TBE pufru jsme rozpustili 3 gramy agarózy. 2. Roztok jsme pomalu povařili v mikrovlnné troubě, přidali 2,5 μl GelRed, řádně promíchali a nalili do vaničky s vloženými hřebeny na vytvoření jamek. Směs jsme nechali cca 20 – 30 minut ztuhnout.
53
3. Elektroforetickou vanu jsme naplnili 0,5× TBE pufrem, přičemž jsme dbali na to, aby byl gel zcela ponořen v TBE pufru. 4. Do jamek jsme pipetovali 5 μl produktu PCR, či 10 μl produktu restrikčního štěpení s 2 μl loudovacího barviva; do jedné z jamek bylo napipetováno 1,2 μl markeru a mezi produkty restrikčního štěpení jsme pro snazší odečítání TT homozygotních vzorků dali již ověřený produkt PCR. 5. Elektroforézu jsme nechali probíhat přibližně 30 minut při stejnosměrném napětí o velikosti 5V/cm. 6. Po skončení jsme gel vyhodnocovali a fotili pod UV lampou pomocí systému GelDoc XR (Biorad), která umožňuje výsledek zviditelnit. Příklad výstupu z RFLP je na Obr. 10.
Obr. 10: Příklad výsledků genotypizace polymorfismu -1149 G/T M – marker, P – pozitivní kontrola, PCR – produkt PCR, T – alela T, G – alela G
3.5 Statistickézpracování Statistické
vyhodnocení
jsme
prováděli
pomocí
statistického
programu
GraphPad Prism 5, kde jsme nejprve ověřili normalitu dat pomocí D’Agostino Pearson testem normality, v případě menšího souboru dat jsme použili Shapirův-Wilkův test. V případě normálního rozložení obou porovnávaných skupin dat jsme použili nepárový
54
t-test, neparametrický Mann-Whitney test byl použit pro data, u nichž nebylo prokázáno normální rozdělení. Hranice statistické významnosti byla p < 0,05.
3.6 Kultivace a stimulace monocytů – optimalizace postupů pro in vitro studium funkce mimohypofyzárního prolaktinu v rámci vrozené imunity Jedním z cílů této diplomové práce, je optimalizace metody in vitrokultivace a stimulace monocytů, která nám umožní komplexní pohled na funkci cirkulujících monocytů i vrozené imunity v patogenezi celiakie a úlohu monocytárního prolaktinu. Monocyty jsme pro potřeby kultivace vyizolovali z buffy coat
pomocí
Histopaquegradientové centrifugace a adheze za standardních podmínek. Monocyty byly stimulovány lipopolysacharidem a jako kontroly sloužily kultivace monocytů bez LPS. Hladiny buněčných proteinů byly měřeny pomocí průtokové cytometrie (FACS) a pro stanovení hladin mRNA studovaných genů (TNF-α, IL-6 a TLR4) byla použita metoda Real TimePCR (viz 3.3.4 Polymerázová řetězová reakce v reálném čase), kdy endogenní kontrolou byl gen PGK1.
3.6.1 Izolacemononukleárních buněk (PBMCs) z plné krve či buffy coat Izolaci PBMCs jsme prováděli pomocígradientové centrifugace přes Histopaque (také Ficoll-Paque), bezbarvou hustou tekutinu, která umožňuje rozvrstvení krevních elementů na základě jejich hmotnosti (viz Obr. 11). Plná krev či buffy coat naředěný PBS je navrstven na Histopaque a po centrifugaci se vytvoří rozvrstvení podle Obr. 11.
55
Obr. 11: Rozvrstvení krve a krevních elementů před a po Histopaque gradientové centrifugaci (Upraveno podle: URL 2) Použité chemikálie Histopaque – 1077; Sigma-Aldrich, Německo PBS pH=7,4 (Phosphate Buffered Saline 10×); Invitrogen, Gibko, USA -
pracujeme s1x PBS
„promývací roztok“: 1×PBS, 2% FBS, 0,5 mM BSA -
FBS (Fetal bovium serum), Invitrogen, Gibko, USA
-
BSA (Albumin from bovine serum); Sigma-Aldrich, Německo
Pracovní postup 1. Nejprve jsme naředili v 50 ml zkumavce 10 ml buffy coat s 15 ml PBS. 2. Tuto směs jsme pomalu navrstvili na 18 ml Histopaque a centrifugovali na 1750 g při 4°C na 35 minut. 3. V průběhu centrifugace došlo na základě gradientu k vytvoření vrstev (viz Obr.11), pipetou jsme opatrně odebrali prstenec mononukleárních buněkbez kontaminace Histopaque.
56
4. Odsáté PBMCs jsme promyli v 15 ml „promývacího roztoku“, jenž pomáhá odstranit trombocyty, a centrifugovalipři 1 500 g na 10 minut, tentokrát již za pokojové teploty (RT). 5. Supernatant jsme odlili, vzniklou peletu buněk jsme opatrně vortexovali,ještě jednou promyli v 15 ml PBS a centrifugovali na 1 250 g na 10 minut při RT. 6. Opět jsme supernatant odstranili, peletu vortexovali,promyli v 15 ml PBS a centrifugovali na 800 g na 10 minut při RT. 7. Na závěr jsme supernatant odlili, peletu vortexovali, doplnili do 5 ml PBS a vyizolované buňky spočítali v Bürkerově komůrce.
3.6.2 Kultivacea stimulace monocytů Cílem těchto optimalizačních postupů je vytvoření fungujícího modelu, pomocí něhož budeme moci studovat vliv exogenního prolaktinu na imunitní buňky. Jako kontrolní induktor monocytů byl zvolen lipopolysacharid, který nám měl pomoci při sestavení funkčního protokolu pro provádění indukce monocytů periferní krve v naší laboratoři. Na základě dostupné literatury (viz Tab. 17) jsme sestavili následující protokol a očekávali u monocytů od zdravých kontrol zvýšení exprese IL-6 mRNA po stimulaci LPS vůči nestimulovaným. Použité chemikálie Médium
RPMI1640:
RPMI
1640,
10%
FBS,
2mM
L-glutamin
a
1%
Penicilin/streptomycin -
RPMI 1640; Lonza, Belgie
-
FBS (Fetal bovium serum), Invitrogen, Gibco, USA
-
L-glutamin; Sigma-Aldrich, Německo
-
Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized, 100 ml(Sigma-Aldrich, Německo)
-
Lipopolysacharidfrom Escherichia coli 0111:B4; Sigma-Aldrich, Německo
PBS pH=7,4 (Phosphate Buffered Saline 10×); Invitrogen, Gibko, USA -
pracujeme s1x PBS
Protilátky na průtokový cytometr (EXBIO Praha a.s.): Mouse Monoclonal to CD14 (FITC)
57
Mouse Monoclonal to CD16 (PE) Mouse Monoclonal to CD40 (PE) Mouse Monoclonal to CD80 (APC) Mouse Monoclonal to CD86 (PerCP) Mouse Monoclonal to HLA-DR (FITC) Pracovní postup 1. Do jedné jamky 24jamkové destičky (Orange Scientific, Belgie) jsme nasadili 1,5 ×106 buněk. 2. Stimulaci jsme prováděli v dupletech, do jedné jamky jsme dali 100 ng LPS a doplnili médiem RPMI do 1 ml. 3. Kontroly jsme prováděli také v dupletech, buňky jsme doplnili médiem RPMI do 1 ml. 4. Destičky jsme ponechali 2 hodiny v kultivačním boxu, poté jsme pod mikroskopem zkontrolovali adorované monocyty a odsáli médium. 5. K přisedlým monocytům jsme přidali 100 – 200 μl PBS, špičkou pipety jsme mechanicky seškrábali přisedlé monocyty a odsáli do kryozkumavky. 6. Množství neseškrábaných monocytů jsme zkontrolovali pod mikroskopem a v případě jejich většího množství jsme opět přidali 100 – 200 μl PBS, seškrábali a odsáli. 7. Buňky určené na izolaci RNA (100 μl) jsme centrifugovali na 13 000 g 10 minut, odsáli supernatant a přidali 500 μl lyzačního roztoku a dále pokračovali dle protokolu izolace RNA (4.3.2), RT PCR (4.3.3) a Real Time PCR (4.3.4), kde jsme sledovali předevšímexpresi IL-6. 8. Buňky určené na značení (100 μl) jsme napipetovali do FACSové zkumavky, přidali 100 μl PBS a centrifugovali na1 800 g 2 minuty. 9. Poté jsme supernatant odstranili, peletu vortexovali, přidali 500 μl PBS a centrifugovali na1 800 g 2 minuty. 10. Krok 9 jsme zopakovali 2× a poté jsme značili protilátkami pro detekci sledovaných proteinů pomocí průtokovéhocytometru (BD LSR II), příklad značení viz Tab. 14.
58
Tab. 14Příklad značení vzorků na detekci povrchových markerů průtokovým cytometrem VZOREK
DOBA KULTIVACE 0 hodin 0 hodin 0 hodin 0 hodin 0 hodin 0 hodin
STIMULACE
PROTILÁTKY
neznačené CD80 (APC) CD14 (FITC) CD40 (PE) CD86 (PerCP) HLA-DR(FITC) + CD16 (PE) + CD80 (APC) 0 hodin × CD14 (FITC) + CD40 (PE) + CD86 G (PerCP) 2 hodiny × HLA-DR(FITC) + CD16 (PE) + H CD80 (APC) 2 hodiny 100 ng LPS CD14 (FITC) + CD40 (PE) + CD86 I (PerCP) B, C, D, E~ jednobarevné kontroly pro nastavení kompenzací A B C D E F
× × × × × ×
Optimalizace kultivace a stimulace monocytů Vzhledem k zavádění této metody v naší laboratoři vyžadovala mnohé optimalizace. Po provedení experimentu dle předcházejícího postupu jsme nedetekovali rozdíl v expresi IL-6 mRNA mezi LPS stimulovanými a nestimulovanými monocyty (blank). Zvýšenou hladinu exprese IL-6 mRNA jsme zvolili jako indikátor aktivace monocytů. V tomto případě tedy ke stimulaci zřejmě nedošlo. Problematiku kultivací a stimulací jsme dále studovali podle dostupných protokolů a po zvážení možných problematických pasáží navrhli následující inovace: 1. Místo 24jamkových provést kultivace v destičkách 6jamkových. 2. LPS alikvoty po rozmražení 10 - 30 min vortexovat, protože LPS po zmrznutí vytváří agregáty. Doba kultivace byla zvolena na 1 hodinu a množství LPS 1 a 100 ng na jamku, do jedné jamky 6jamkové destičky jsme nasadili 2×106 buněk.Výsledky Real Time PCR shrnuje Tab. 15, z které vyplývá, žeexprese stimulovaných monocytů byla nejvíce zvýšena při stimulaci 100 ng LPS a za použití 6jamkové destičky. Na základě výsledků jsme shledali doporučené inovace za vhodné pro naše využití.
59
Tab. 15 Výsledky (z Real Time PCR) stimulace monocytů s doporučenými inovacemi VZOREK 24jamková destička 6jamková destička
× krát zvýšená exprese vůči blanku 27,79975 35,9353
IL-6 2^-dCt 0,289172 0,373798 0,010402 0,129857 0,084377 0,002302
100 ng LPS 1 ng LPS blank 100 ng LPS 1 ng LPS blank
56,41473 36,65657
Avšak při zopakování pokusu nedošlo ke zvýšení exprese IL-6 mRNA u stimulovaných
monocytů.
Experiment
byl
zopakován
s čerstvě
namíchanými
chemikáliemi. Výsledek však nevypovídal o tak evidentní stimulaci monocytů jako v předcházejícím experimentu. Zkusili jsme také zvýšit dávku LPS až na 1 mg, což expresi IL-6 mRNA razantně nezvýšilo (vizTab 16). Tab. 16 Výsledky (z Real Time PCR) stimulace monocytů až 1 mg LPS VZOREK 100 ng LPS 1 mg LPS blank
IL-6 2^-dCt
× krát zvýšená exprese vůči blanku 1,585568273 4,055837919
0,50697974 1,296839555 0,319746395
Situace, kdy nebyl rozdíl v expresi IL-6 mRNA mezi stimulovanými monocyty a blankem, mohla nastat ze dvou důvodů, buď nedošlo ke stimulaci monocytů LPS, nebo došlo nějakým způsobem i ke stimulaci monocytů blanku. Je znám různý efekt různých LPS na různé typy buněk, nicméně LPS (E. coli0111:B4), který používáme, je v případě stimulací monocytů jedním z nejpoužívanějších (viz Tab. 17) a případ špatné šarže jsme vyloučili použitím nového LPS (viz předešlá optimalizace). Proto jsme sedále zaměřili na vyloučení druhé, výše nastíněné možnosti našeho dosavadního neúspěchu, a rozhodli se otestovat, zda nedochází k aktivaci také buněk neovlivněných LPS (blank).
60
Tab. 17 Shrnutí údajů o lipopolisacharidu ze studií zabývajících se stimulacemi LPS TYP LPS
MNOŽSTVÍ LPS
DOBA
ZDROJ
E. coli(E25:B55)
0.5 ng/μL 20 ng/ml 50 ng/ml
24 hod
(Haidet et al. 2012)
7 dní
(Thevenet et al. 2011)
0, 1 a 4 hod
(Sivapalaratnam et al. 2011)
E.coli O111:B4 katalogové číslo: 1235503; Pharmacopeial Convention Escherichia coli K2 35 LPS
100 ng/ml
30 min
(Henricson et al. 1995)
E. coli 055:B5 Escherichia coli 0111:B4
1 μg/ml 1 μg/ml
24 hod 6 a 12 hod
(Bernstein et al. 1991) (Marsin et al. 2002)
Escherichia coli 011:B4
˃ 0.03 ng/ml
30 min
(Heinzelmann et al. 1998)
Escherichia coli 055:B5
1 ng/ml
3 hod
(Le-Barillec et al. 2000)
Salmonella typhi O901
100 ng/ml
24 hod
(Weinstock et al. 1992)
Escherichia coli 0111:B4
1 a 10 ng/ml
18 hod
(Amura et al. 1998)
Test vlivu kultivačního plastiku na úspěšnost in vitro stimulace Uvažovali jsme, zda nemá na buňky stimulační vliv druh plastu, který používáme. Monocyty adherují a tím pádem jsou s plastem v přímém kontaktu. Vyzkoušeli jsme tedy 6jamkové destičky od dalších dvou výrobců, a to NUNC a Corning, oproti předešlým pokusům jsme stimulaci i kontroly přestali provádět v dupletech, rozšířili sledovaný časový rozptyl, kdy jsme monocyty kultivovali 1, 2 a 8 hodin, přičemž reakci monocytů na LPS v podobě zvýšení exprese IL-6 mRNA jsme očekávali v kratších časech kultivace, neboť IL-6 je odrazem stimulace reagujícím časně po aktivaci. Výsledky jsou zobrazeny v Tab. 17, na jejich základě jsme konstatovali, že mezi použitím plastu není rozdíl, tedy nemá významný vliv na kultivaci a stimulaci monocytů.
61
Tab. 17 Srovnání výsledků(z Real Time PCR) z kultivace v destičkách NUNC a Corning DOBA VÝROBCE KULTIVACE STIMULACE blank NUNC 1 hodina 100 ng LPS blank Corning 1 hodina 100 ng LPS blank NUNC 2 hodiny 100 ng LPS blank Corning 2 hodiny 100 ng LPS blank NUNC 8 hodin 100 ng LPS blank Corning 8 hodin 100 ng LPS
IL-6 2^-dCt 1,450617005 1,447269237 1,709214349 1,531557997 2,948538435 3,226567037 2,77983644 3,963202453 8,263005721 7,745365568 9,860540072 6,055866212
× krát zvýšená exprese vůči blanku 0,99769218 0,89605964 1,0942937 1,42569627 0,9373545 0,61415157
Test vlivu antikoagulačních látek v transfuzních vacích buffy coatu na úspěšnost in vitro stimulace Veškeré optimalizace byly doposud prováděny na materiálu tzv. buffy coat z Transfúzního oddělení. Tyto vaky se nám k zpracování dostávají nejdříve za 10, nejčastěji však do 24 hodin po odběru, protože nejprve musí být provedena všechna patřičná vyšetření. Buffy coaty jsou tuto dobu skladovány při pokojové teplotě ve vacích s antikoagulační látkou CPDA. Je tedy možné, že v tomto čase dochází k úhynu množství buněk (a k preferenční expresi s tímto efektem spojených genů), což může ovlivnit buňky ještě před kultivací. Rozhodli jsme se proto provést stimulace monocytů s krví odebranou do zkumavek (EDTA) a zpracovat tuto krev v co nejkratším intervalu po odběru. Výsledky Real Time PCR sledující zvýšení exprese IL-6 mRNA shrnuje Tab. 18. Nezaznamenali jsme však zásadní rozdíl při stimulaci monocytů vyizolovaných z čerstvé krve odebrané do EDTA vakuových zkumavek oproti stimulaci monocytů z buffy coatů odebraných do odběrových vaků.
62
Tab. 18 Výsledky (z Real Time PCR) stimulacemonocytů z krve odebrané do zkumavek s EDTA DOBA KULTIVACE 1 hodina 2 hodiny 4 hodiny 8 hodin
STIMULACE blank 100 ng LPS blank 100 ng LPS blank 100 ng LPS blank 100 ng LPS
IL-6 2^-dCt 1,853176124 3,317278183 20,86963312 16,33619401 8,653797329 9,168378896 2,614738494 2,143546925
× krát zvýšená exprese vůči blanku 1,790050142 0,782773416 1,059463094 0,819793998
Test vlivu „uklidnění“ monocytů po odběruna úspěšnost in vitro stimulace Stresovou situací pro buňky může být také změna z prostředí periferní krve na médium v jamce kultivační destičky, buňky se potřebují aklimatizovat na toto nové prostředí, proto jsme v rámci optimalizace začlenili 20 – 24 hodinovou stabilizaci monocytů v médiu, po této stabilizaci jsme vyměnili medium a buňky stimulovali LPS. Výsledky jsou znázorněny v Tab. 19, kdy největší zvýšení exprese bylo po 2 hod stimulace, avšak toto zvýšení exprese není dostatečně průkazné. Tab. 19 Výsledky (z Real Time PCR)stimulace monocytů po 20 hodinách stabilizace v médiu DOBA KULTIVACE 2 hodiny 24 hodin 2 hodiny 2 hodiny 6 hodin 6 hodin 24 hodin 24 hodin
× krát zvýšená IL-6 exprese vůči blanku STIMULACE UKLIDNĚNÍ 2^-dCt blank × 1,9363414 blank × 2,3510958 blank 20 hodin 1,5386517 100 ng LPS 20 hodin 4,1506386 2,697581723 blank 20 hodin 1,7735828 100 ng LPS 20 hodin 1,355038 0,764011716 blank 20 hodin 0,4204482 100 ng LPS 20 hodin 0,178418 0,424351986
63
Test vlivu možných endotoxinů přítomných ve FBS na úspěšnost in vitro stimulace FBS obsahuje kromě růstových stimulantů také endotoxiny, jež mají potenciální roli kultivované monocyty stimulovat. Médium bez séra bylo opakovaně popsáno jako nevhodné pro kultivaci PBMC (vedlo k úhynu PBMC), z tohoto důvodu jsme pouze významně snížili koncentraci z 10 % FBS na 0,5 % FBS, které jsme navíc teplotně inaktivovali. V postupu jsme ponechali 20 - 24 hodinovou stabilizaci monocytů v médiu. Výsledky jsou shrnuty v Tab. 20, přičemž snížení FBS nemělo na zvýšení rozdílu exprese mezi stimulovanými a nestimulovanými zřetelný vliv. Přesto z důvodu ochrany monocytů před zvýšeným množstvím endotoxinů pokračujeme v používání tohoto média RPMI s 0,5% FBS. Tab. 20 Výsledky (z Real Time PCR) stimulace monocytů v médiu s 0,5% FBS DOBA KULTIVACE 2 hodiny 24 hodin 2 hodiny 6 hodin 24 hodin
STIMULACE UKLIDNĚNÍ blank × blank × blank 22 hodin 100 ng LPS 22 hodin blank 22 hodin 100 ng LPS 22 hodin blank 22 hodin 100 ng LPS 22 hodin
IL-6 2^-dCt 0,17901 0,83205 0,40523 0,3513 0,16991 0,28883 0,18231 0,26082
× krát zvýšená exprese vůči blanku
0,86692877 1,699843397 1,430598396
Rozpuštěné LPS (o koncentraci 1 mg/1 ml) máme rozpipetované po malých objemech (3 μl) a zmražené, avšak opakované rozmrazování a vortexování se výrazně nedoporučuje, proto jsme předcházející pokus zopakovali s čerstvě naředěným LPS. Exprese LPS stimulovaných monocytů byla oproti nestimulovaným zvýšena, maximálně 4,13×, tento rozdíl byl vyšší než v předcházejícím experimentu, avšak stále nedostatečný.
64
Tab. 21 Výsledky (z Real Time PCR) stimulace monocytů s čerstvě namíchaným LPS, médiem s 0,5% FBS a 22 hodinovou stabilizací monocytů DOBA KULTIVACE 2 hodiny 24 hodin 2 hodiny 2 hodiny 6 hodin 6 hodin 24 hodin 24 hodin
STIMULACE UKLIDNĚNÍ
blank blank blank 100 ng LPS
blank 100 ng LPS
blank 100 ng LPS
× × 22 hodin 22 hodin 22 hodin 22 hodin 22 hodin 22 hodin
IL-6 2^-dCt
× krát zvýšená exprese vůči blanku
1,378724 1,233992 0,66588 1,990779 0,512871 1,632029 0,052556 0,217135
2,989698 3,182146 4,131503
Zaváděním metody in vitro kultivace a stimulace jsme dospěli k úpravám pracovního postupu, nicméně jsou potřebné další optimalizace.Dále se tedy chystáme porovnat stimulaci krve odebrané do zkumavek s EDTA a heparinem. A to na základě doporučení (URL 2), kdy bylo pozorováno, žemonocyty z krve ošetřené EDTA jako antikoagulačním činidlem nereagují na stimulaci LPS, avšak mohou exprimovat zvýšené hladiny cytokinů a to bez stimulace LPS. To tedy ve výsledku vede ke zvýšené expresi IL-6 mRNA nestimulovanými monocyty, což jsme v případě stimulace krve ze zkumavek s EDTA také pozorovali (viz Tab. 18).
65
4 Výsledky 4.1 Studium genové exprese na úrovni mRNA Hodnoty Ct získané pomocí Real Time PCR byly přepočteny na 2^-dCt a ty byly dále statisticky zpracovány pomocí programu GraphPad Prism 5 (více viz 3.5 Statistické zpracování). Získané výstupy podávají přehled o změnách exprese daných markerů, tedy o imunitním nastavení monocytů.
4.1.1 Změny exprese TLR mRNA u monocytů pacientů s celiakií Toll-like receptor 2 Při porovnání exprese TLR2 mRNA pacientů s celiakií vůči kontrolám byla na základě neparametrického Mann Whitney testu zjištěna signifikantně (P< 0,0001) zvýšená exprese TLR2 mRNA u pacientů s celiakií, konkrétně 52,4 × (viz Obr. 12).
Exprese TLR2 mRNA monocyty * * *
1.5
︶
J 1.0 A ︵
t C d - 0.5 ^ 2
TL R
TL
R
2_ C D
2_
ko
nt
ro
pa ci en ti
ly
0.0
Obr. 12: Exprese TLR2 mRNA v monocytech od pacientů s celiakií (zeleně) a kontrol (fialově); černé čáry rovnoběžné s osou x značí medián, hvězdičky míru signifikance
66
Konfrontovali jsme také rozdíl v expresi TLR2 mRNA mezi pacienty s recentní celiakií a pacienty, kteří dodržují bezlepkovou dietu. Zde však nebyla změna exprese pozorována (P = 0,6403). Toll-like receptor 4 Exprese TLR4 mRNAv monocytech byla signifikantně (P< 0,0001) zesílena u pacientů s celiakií oproti kontrolám (viz Obr. 13) a to 7,8 ×.
Exprese TLR4 mRNA monocyty * * *
0.4 0.3
︶
J A
︵
t 0.2 C d ^ 2 0.1
TL
R
TL R 4_ C D
4_
ko
nt
ro
pa ci en ti
ly
0.0
Obr. 13:Exprese TLR4 mRNA v monocytech od pacientů s celiakií (zeleně) a kontrol (fialově); černé čáry rovnoběžné s osou x značí medián,hvězdičky míru signifikance V případě porovnání exprese TLR4 mRNA mezi pacienty s recentní celiakií a pacienty dodržující bezlepkovou dietu byla pozorována 1,3 ×zvýšená exprese TLR4 mRNA u pacientů, jež dodržují bezlepkovou dietu, avšak tento trend k vyšší expresi nedosáhl statistické významnosti (P = 0,0721) (Obr.14).
67
Exprese TLR4 mRNA monocyty 0.4 0.3
︶
J A
︵
t 0.2 C d ^ 2 0.1
di et a TL R 4_ be zl ep ko vá
TL
R
4_
re ce nt
ní ce lia ki e
0.0
Obr. 14: Exprese TLR4 mRNA v monocytechpacientů s recentní celiakií (zeleně) a pacientů, jež dodržují bezlepkovou dietu (fialově); černé čáry rovnoběžné s osou x značí medián Toll-like receptor 7 U CD pacientů byla zaznamenána statisticky významná (P< 0,0001) 20,3 ×zvýšená exprese TLR7 mRNA vůči kontrolám (viz Obr. 15). Rozdíl v expresi TLR7 mRNA mezi pacienty s recentní celiakií a pacienty dodržujícími bezlepkovou dietu nebyl pozorován (P = 0,5758).
68
Exprese TLR7 mRNA monocyty * * *
0.4 0.3
︶
J A
︵
t 0.2 C d ^ 2 0.1
TL R 7_ C D
pa ci en ti
TL R 7_ ko nt ro ly
0.0
Obr. 15:Exprese TLR7 mRNA v monocytech od pacientů s celiakií (zeleně) a kontrol (fialově); černé čáry rovnoběžné s osou x odshora dolů značí 75 percentil, medián a 25 percentil,hvězdičky míru signifikance
4.1.2 Změny exprese PRL mRNA monocytů pacientů s celiakií vůči kontrolám a v souvislosti s klinickými parametry Exprese PRL mRNA nebyla mezi pacienty s celiakií a kontrolami signifikantně odlišná (P = 0,9818), obdobné výsledky přineslo porovnání exprese PRL mRNA mezi pacienty s recentní celiakií a pacienty s neaktivní celiakií (P = 0,1356). Mezi muži a ženami nebyl prokázán statisticky významný rozdíl v expresi PRL mRNA(P = 0,4834), i když je zde pozorován trendzvýšené exprese u žen, konkrétně 1,9 × vůči expresi u mužů. Zajímavé zjištění na hranici statistické významnosti (P = 0,0565) přineslo sledování míry PRL mRNA exprese v závislosti na přítomnosti anti-endomyzium IgA protilátek, neboť u anti-endomyzium IgA pozitivníchpacientů byla patrná tendence k dow-nregulaci (7,5 ×) exprese PRL mRNA vůčianti-endomyzium IgA negativním jedincům.
69
Korelace hladin sledovaných genů s dalšími klinickými daty (např. hladinami anti-transglutaminázy IgA, anti-transglutaminázy IgG, anti-endomyzia IgG, indexem Mash a celkovým IgA, IgG či IgE) nemohla být provedena z důvodu jejich nízké frekvence v souboru.
4.1.3 Změny exprese mRNA vybraných cytokinů monocyty Tumor nekrotizující faktor (TNF-α) Jedním z hlavních zánětlivých cytokinů je TNF-α, porovnání jeho mRNA exprese monocyty mezi pacienty s celiakií a kontrolami vedlo k detekci signifikantně (P = 0,0033) snížené exprese u pacientů s celiakií vůči kontrolám, toto snížení exprese bylo 103,2 × (viz Obr.15).
Exprese TNF-alfa mRNA monocyty 0.4 0.3
︶
J A
* *
︵
t 0.2 C d ^ 2 0.1
TN
F_
TN
C
D
F_
ko
pa
ci
nt ro
en
ti
ly
0.0
Obr. 15:Exprese TNF-α mRNA v monocytech od pacientů s celiakií (modře) a kontrol (růžově); černé čáry rovnoběžné s osou x značí medián,hvězdičky míru signifikance Statisticky významný rozdíl však nebyl prokázán v expresi TNF-α mRNA mezi pacienty s aktivní celiakií a pacienty dodržujícími bezlepkovou dietu (P = 0,1262).
70
Interleukin 6 (IL-6) Je dalším pro-zánětlivým cytokinem, jehož expresi mRNA jsme zaznamenali signifikantně (P< 0,0001) nižší (10,9 ×) u pacientů s celiakiíoproti kontrolám (Obr. 16).
Exprese IL-6 mRNA monocyty * * *
0.03
︶
J 0.02 A ︵
t C d - 0.01 ^ 2
IL -6 _C D
IL 6ko nt ro ly
pa ci en ti
0.00
Obr. 16: Exprese IL-6 mRNA v monocytech od pacientů s celiakií (modře) a kontrol (růžově); černé čáry rovnoběžné s osou x odshora dolů značí 75 percentil, medián a 25 percentil zde není vidět,hvězdičky míru signifikance Opět rozdíl v expresi IL-6 mRNA mezi pacienty s recentní celiakií a pacienty s neaktivní celiakií nebyl statisticky významný (P = 0,8520). Interleukin12 (IL-12) Rozdíl exprese IL-12 mRNA mezi pacienty s celiakií a kontrolami se nachází na hranici statistické významnosti (P = 0,0540), přičemž byl detekován trend ke 2,02 × zvýšené expresi u kontrol vůči pacientům (Obr. 17).Obdobné výsledky byly pozorovány
71
při detekci exprese mezi pacienty s recentní celiakií a pacienty dodržujícími bezlepkovou dietu, kdy se rozdíl exprese IL-12 mRNA pohyboval na hranici statistické významnosti (P = 0,0676) s tendencí 2,5× zvýšené exprese u pacientů s aktivní celiakií vůči pacientům na bezlepkové dietě (viz Obr. 18).
Exprese IL-12A mRNA monocyty 0.0015
︶
J 0.0010 A ︵
t C d - 0.0005 ^ 2
IL -1 2A _C D
IL -1 2A _k on tr ol y
pa ci en ti
0.0000
Obr. 17: Exprese IL-12A mRNA v monocytech od pacientů s celiakií (modře) a kontrol (růžově); černé čáry rovnoběžné s osou x odshora dolů značí 75 percentil, medián a 25 percentil Signifikantní (P< 0.05) snížení exprese IL-12A mRNA (3×) však bylo pozorováno u CD pacientů na bezlepkové dietě oproti kontrolám (viz Obr. 18). Mezi kontrolami a pacienty s recentní celiakií nebyl detekován statisticky významný (P = 0,5896) rozdíl v expresi IL-12A mRNA.
72
Exprese IL-12A mRNA monocyty 0.0015
*
︵ ︶
J 0.0010 A t C d ^ 0.0005 2
y _k on tr ol IL -1
2A
di e
2A IL
-1
IL
-1
_b ez
2A
_r ec
le pk ov á
en tn í
C D
ta
0.0000
Obr. 18: Exprese IL-12A mRNA v monocytech od pacientů s recentní celiakií (modře), CD pacientů na bezlepkové dietě (růžově)a kontrol (zeleně); černé čáry rovnoběžné s osou x odshora dolů značí 75 percentil, medián a 25 percentil, v případě jediné čáry se jedná o medián, hvězdička značí míru signifikance
Interleukin 10 (IL-10) Oproti předchozím zánětlivým cytokinům je IL-10 protizánětlivý cytokin a jeho exprese mRNA byla statisticky významně (P< 0,0001) nižší u pacientů s celiakií, konkrétně 16,25 ×vůči kontrolám (Obr. 19).
73
Exprese IL-10 mRNA monocyty * * *
0.06
︶
J 0.04 A ︵
t C d - 0.02 ^ 2
IL -1 0_ C D
pa ci en ti
IL -1 0_ ko nt ro ly
0.00
Obr. 19: Exprese IL-10 mRNA v monocytech od pacientů s celiakií (modře) a kontrol (růžově); černé čáry rovnoběžné s osou x značí odshora dolů 75 percentil, medián a 25 percentil,hvězdičky míru signifikance Nebyl detekován signifikantní (P= 0,1262)rozdíl v expresi IL-10 mRNA mezi pacienty s recentní celiakií a pacienty s neaktivní celiakií.
4.1.4 Vliv polymorfismu -1149 G/T v mimohypofyzární promotorové oblasti PRL na jeho expresi na úrovni mRNA Na 5% hladině statistické významnosti nebyl prokázán vliv žádného z genotypů (GG, TT, GT) jednonukleotidového polymorfismu na expresi PRL mRNA, přičemž soubor CD pacientů s TT genotypem obsahoval 9,5 %osob, a proto nebylo možné tuto skupinu zahrnout do statistického zpracování. Byla pozorována tendence 4,6 × zvýšené exprese u homozygotního genotypu GG oproti genotypu GT, avšak tento rozdíl exprese PRL mRNA nebyl signifikantní (P = 0,1483).
74
Sledovali jsme také rozdíl v rozložení jednotlivých genotypů mezi kontrolami a pacienty, kde také nebyl pozorován signifikantní rozdíl (P = 0,3106).
4.1.5 Výsledky optimalizace metody in vitrokultivace a stimulace monocytů V průběhu zavádění metody in vitro kultivací a stimulací jsme dospěli k následujícím výsledkům:
Pro naše účely je vhodnější používání 6jamkových destiček, přičemž není rozdíl ve výrobci.
LPS je nutné po rozmrznutí vortexovat.
Není rozdíl v kultivaci krve ošetřené EDTA či CPDA.
Nutnost stabilizace buněk po jejich izolaci z krve se nám nepotvrdila.
Snížení procentuálního zastoupení FBS v médiu je pro buňky šetrnější, na stimulaci však zřejmě nemá vliv.
75
5 Diskuze Naše práce se zaměřila na přiblížení role monocytů v patogenezi celiakie, kdy jsme se soustředili na expresi markerů reprezentujících vrozenou imunitu (TLRs a PRL), prozánětlivé (TNF-α, IL-6 a IL-12) a protizánětlivé cytokiny (IL-10). Byly určeny relativní hladiny exprese mRNA těchto markerů u 40 (pro TLR2, TLR4 a PRL) nebo 23 (pro TNF, IL-6, IL-12A a IL-10) zdravých kontrol a porovnány s hladinami exprese u 21 pacientů s celiakií. Signifikantní rozdíl exprese mRNA mezi kontrolami a pacienty byl detekován u všech zpracovaných Toll-like receptorů, načež u pacientů s celiakií byla exprese TLR2 mRNA zvýšena 52,4 ×, exprese TLR4 mRNA 7,8 × a exprese TLR7 20,3 × oproti zdravým jedincům. Tyto výsledky podporují naši hypotézu zvýšení exprese TLR2, TLR4 a TLR7 monocyty periferní krve při imunitní dysbalanci. Zvýšení exprese TLR2 a TLR4 mRNA cirkulujícími monocyty již bylo pozorováno také u pacientů s autoimunitním diabetem (Devaraj et al. 2008). Zvýšení exprese TLR7 vypovídá o indukci imunity (Deane et al. 2007), k čemuž v průběhu celiakie bezpochyby dochází. Naše zjištění tak ukazují, že exprese TLR2 a TLR4 mRNA u pacientů s celiakií je zvýšena nejen v duodenální sliznici (Szebeni et al. 2007), ale také u monocytů periferní krve. Význam těchto poznatků je zatím nejasný; je otázka, zda lze předpokládat aktivní a obousměrnou komunikaci mezi střevní sliznicí a prostředním periferní krve. Vzhledem k roli prolaktinu v autoimunitních onemocněních (viz 1.3.4 Prolaktin a autoimunita) i v celiakii samotné (viz 1.3.5 Prolaktin a celiakie) jsme očekávali zvýšenou expresi PRL mRNA u pacientů vůči kontrolám, rozdíl v expresi však nebyl statisticky významný. Hladiny prolaktinu v imunitních buňkách jsou obecně velmi nízké (BenJonathan et al. 2008), detekovat jakékoliv případné změny proto více než kde jinde vyžaduje dostatečnou velikost sledovaného souboru. Bude nezbytné rozšířit počty pacientů a teprve poté upřesnit, zda PRL exprimovaný cirkulujícími monocyty hrajeroli v patogenezi či průběhu celiakie či nikoliv. Ženy mají vyšší fyziologické hladiny sérového prolaktinu, proto jsme také pozorovali, zda je exprese mimohypofyzárního PRL obdobně pohlavně specifická. Signifikantní rozdíl v expresi PRL mRNA mezi pohlavími nebyl detekován, ačkoliv byl
76
sledován trend k 1,3 × zvýšené expresi PRL mRNA u žen vůči mužům (P = NS), vliv pohlaví nauvolňování monocytárního prolaktinu vlivem imunitních či stresových stimulů nelze potvrdit. Vzhledem ke schopnosti prolaktinu stimulovat produkci imunoglobulinů a celé řady autoprotilátek (De Bellis et al. 2005) bylo zajímavé provést korelaci expresePRL mRNA s klinickými parametry jako např. hladinami anti-transglutaminázy IgA, antitransglutaminázy IgG, anti-endomyzia IgG a celkovým IgA. Bohužel, kvůli dlouholeté diagnóze některých pacientů nebyl k dispozici kompletní soubor těchto údajů, proto bylo srovnání provedeno pouze mezi anti-endomyzium IgA pozitivními a negativními pacienty s celiakií. Zde se rozdíl exprese PRL mRNA pohyboval na hraně statistické významnosti (P = 0,0565) s tendencí ke zvýšené expresi (7,5 ×) PRL mRNA u anti-endomyzium IgA negativních pacientů vůči anti-endomyzium IgA pozitivním. Zvýšenou expresi PRL mRNA jsme vzhledem funkci PRL stimulovat produkci autoprotilátek očekávali spíše u anti-endomyzium IgA pozitivních pacientů, nicméně porovnávaný soubor byl velmi malý a to se mohlo promítnout do zkreslení výsledků. Dále jsme se zaměřili na změny exprese protizánětlivého (IL-10) a zánětlivých cytokinů (TNF-α, IL-6 a IL-12). Je známo, že produkci většiny těchto cytokinů stimuluje PRL (TNF-α, IL-10 a IL-12, více viz 1.3.4 Prolaktin a autoimunita) a dále, že k expresi pro-zánětlivých cytokinů dochází po stimulaci ligandem TLR2, TLR4 i TLR7 (více viz 1.2 Toll-like receptory). U zánětlivého cytokinu TNF-α jsme očekávali zvýšenou expresi u pacientů s celiakií, především také proto, že TNF-α je indikátor zánětu, patří mezi kandidátní geny celiakie (Woolley et al. 2005) a jeho zvýšená produkce monocyty byla pozorována při stimulaci monocytů gliadinem (Cinova et al. 2007). V naší pilotní studii ovšem byla v souboru pacientů detekována dokonce 103,2 × nižší exprese než u kontrol (P = 0,0033). Obdobné výsledky přinesla studie Romaldini a kol., kde nebyl pozorován rozdíl hladin TNF-α v séru mezi pacienty s recentní celiakií, pacienty dodržujícími bezlepkovou dietu déle než dva roky a zdravými kontrolami (Romaldini et al. 2002). V případě dalšího zánětlivého cytokinu IL-6 byla situace obdobná jako v případě TNF-α, avšak zde byla exprese u pacientů s celiakiísnížena 10,9 × oproti expresi IL-6 mRNA u kontrol. Rozdíl exprese IL-6 mRNA mezi pacienty s aktivní celiakií a neaktivní celiakií nebyl detekován (P = 0,8520). Oproti tomu, ve studii Fornari a kol.
77
pozorovalizvýšenou hladinu IL-6 v séru pacientů s aktivní celiakií, u pacientů na bezlepkové dietě však zaznamenali snížení sérového IL-6 (Fornari et al. 1998). TNF-α a IL-6 jsou známé pro svou schopnost vyvolat zánětlivou reakci. Nicméně, některé cytokiny mají také imunosupresivní funkce a jejich následná exprese asistuje při reparačních procesech, což značí duální roli některých pro-zánětlivýchcytokinů (Correale and Villa 2004). TNF-α je považován za pro-zánětlivý cytokin, který je schopen vyvolat širokou škálu odpovědí od apoptózy v jedněch buňkách po buněčnou proliferaci v jiných. V případě jeho snížené exprese může následně dojít k potlačení apoptózy a tím existenci dysfunkčních buněk, poruchám imunity a rozvoji autoimunitních onemocnění. Ačkoli byl potvrzen benefiční účinek anti-TNF-α léčby pacientů s autoimunitním onemocněním, jako vedlejší efekt této léčby se překvapivě objevila indukce či zhoršení chorob s humorální autoimunitou (Charles et al. 2000). Studie na myších i lidském materiálu naznačují možné propojení mezi sníženou tvorbou TNF-α a rozvojem humorální imunity a to prostřednictvím zabránění indukce cytotoxických T lymfocytů a následné kontroly autoreaktivních B lymfocytů (Via et al. 2001). Zároveň k výše diskutovanému, naše data naznačují v souboru pacientů s celiakií down-regulaci IL-10, Th2 cytokinu. Současné oslabení TNF-α a IL-10 by svědčilo nikoliv o
specifickém
Th1/Th2
profilu,
ale
o
přítomnosti
významné
nerovnováhy
imunoregulačních mechanismů. Obdobná data byla získána pro jiné autoimunitní onemocnění, roztroušenou sklerózu (Perrella et al. 2006), a pro zánětlivé onemocnění očního nervu (Penton-Rol et al. 2009). Snížená exprese protizánětlivého cytokinu IL-10 však byla pozorována také u neklasických monocytů (CD14+CD16+), které jsou spojovány se zánětlivými a infekčními onemocněními (Ziegler-Heitbrock 2007). Výše nastíněné rozdíly v expresi nejen TNF-α, indikátoru zánětu, jenž je v případě celiakie přítomen, ale také IL-6 (exprese IL-6 bývá spojována s aktivací buněk patogenem a se zánětem) a IL-10 však možná můžeme vysvětlit daleko prozaičtějším způsobem. Značně zvýšená exprese mRNA u vzorku zdravých kontrol může být také způsobena pozdním zpracováním krve od dárců. Zatímco krev od pacientů je zpracována nejdéle do 2 hodin po jejím odběru, na krvi od dárců z transfúzního oddělení musí být nejprve provedena vyšetření vhodnosti a neinfekčnosti této krve. Z tohoto důvodu k jejímu zpracování pro účely RNA analýzy nemůže dojít dříve jak za 10 hodin, nejčastěji však byla zpracovávána následující den po odběru. V této časové prodlevě zřejmě dojde k úhynu
78
množství buněk, což vyvolá u ostatních buněk expresi prozánětlivých cytokinů. Pokud se tato domněnka v budoucnu potvrdí, budeme nuceni zvolit jiný, vhodnější kontrolní soubor. Posledním zánětlivým cytokinem, jehož expresi jsme sledovali, je IL-12A. IL-12 se vytváří velmi brzy po imunitní odpovědi (Brand et al. 2004), což by odpovídalo 2,5 × vyšší expresi IL-12A mRNA u pacientů s recentní (aktivní) celiakií vůči pacientům s neaktivní celiakií, tedy vůči pacientům dodržujícím bezlepkovou dietu. Tato změna exprese v našem souboru je však na hraně statistické významnosti (P = 0,0676). Otázkou zůstává, jak vysvětlit nesignifikantní dvojnásobné snížení IL-12 mRNA exprese všech pacientů, které jsme v porovnání ke zdravým kontrolám odhalili, a dokonce 3 x nižší hladiny IL-12 mRNA exprese pacientům s neaktivní celiakií vůči zdravým jedincům (P< 0.05). Významně porušená produkce IL-12 v porovnání s kontrolami byla pozorována také u jiného autoimunitního onemocnění, SLE (Liu and Jones 1998). V této práci však produkce IL-12 koreluje negativně s aktivitou onemocnění (pacienti v remisi měli vyšší hladiny IL12 než jedinci s aktivním SLE) a bylo prokázáno, že je pod vlivem IL-10, který byl naopak u SLE pacientů oproti kontrolám zvýšený, takže se zdá, že nedostatečná tvorba IL-12 je u SLE sekundární k abnormální produkci dalších cytokinů, zejména nadměrné expresi IL-10 (Liu and Jones 1998). V případě naší studie však produkce protizánětlivého cytokinu IL-10 byla u celiaků snížena a nevysvětluje tedy abnormální down-regulaci IL-12 v monocytech pacientů. V promotoru
mimohypofyzárního
PRL
se
na
pozici
-1149
nachází
jednonukleotidový polymorfismus G/T, kdy vyšší incidence alely G byla zaznamenána u pacientů se systémovým lupus erythematodes (Stevens et al. 2001a) a bývá asociována s vyšší expresí PRL mRNA v T lymfocytech (Stevens et al. 2001b). V případě našich dat však nebyla statisticky významně prokázána ani vyšší incidence alely G u pacientů s celiakií (P = 0,3106), ani její asociace s vyšší expresí PRL mRNA v monocytech periferní krve. Pozorovali jsme pouze nevýznamný (P = 0,1483) trend 4,6 × vyšší exprese PRL mRNA u homozygotního genotypu GG. Prezentovaná data představují výsledky pilotní studie, která budou dále i) rozšířena zvětšením počtu sledovaných subjektů, a ii) ověřena. V brzké době navážou práce in vitro kultivací a indukcí periferních monocytů získaných od pacientů s celiakií či dalšími
79
autoimunitními poruchami (např. T1D) a kontrol. Metodiky in vitro práce s primárními buňkami budou využívat poznatků stran zavedení a optimalizace jednotlivých postupů a metod tkáňových kultur, které byly druhým výstupem předkládané práce. Naším hlavním cílem je pochopit význam produkce prolaktinu buňkami imunitního systému a porozumět jeho zapojení do imunitních a zejména pak autoimunitních dějů, studovat jeho úlohu coby stresového cytokinu v rámci vrozené imunitní reakce a určit jeho podíl na patogenezi autoimunitních chorob včetně celiakie.
80
6 Závěr V rámci své diplomové práce jsem pomocí metody Real Timestanovila relativní hladiny TLR2, TLR4, TLR7, PRL, TNF-α, IL-6, IL-10 a IL-12A mRNA u 21 pacientů s celiakií a 23 zdravých kontrol. Metodou RFLP jsem u pacientů s celiakií určila SNP -1149 G/T. Získaná data jsem mezi sebou porovnala a dospěla k následujícím závěrům:
Imunitní dysbalance v podobě celiakie vede ke zvýšení exprese mRNA sledovaných Toll-like receptorů (TLR2 52,4 × (P< 0,0001), TLR4 7,8 × (P < 0,0001), TLR7 20,3 × (P< 0,0001)), což podporuje naši hypotézu.
U pacientů s celiakií nedochází k zvýšení exprese PRL mRNA.
Exprese PRL mRNA monocyty zřejmě nesouvisí s pohlavím ani s pozitivitou antiendomysiálních IgG protilátek.
Zvýšená exprese pro-zánětlivých cytokinů (TNF-α a IL-6) u kontrol může být způsobena odlišným zpracováním krevních vzorků od pacientů a kontrol.
V průběhu celiakie dochází k snížení exprese IL-10 mRNA, což podporuje tvorbu zánětu.
V případě pacientů s celiakií nebyla prokázána vyšší incidence G alely SNP -1149, ani souvislost tohoto polymorfismu se zvýšenou expresí PRL mRNA monocyty.
Metoda in vitro kultivace a stimulace vyžaduje dodatečné optimalizace.
Část těchto výsledků byla prezentována formou posteru na 8. Mezinárodním kongresu autoimunity v Granadě v květnu 2012 (viz Příloha 2).
81
7 Seznam použitých zkratek AD
Addisonova choroba
AJ
arbitrární jednotka
Akt
proteinkináza B
APC
antigen prezentující buňky
AR
revmatoidní artritida
bp
páry bazí
cAMP
cyklický sdenosin monofosfát
CD
celiakie
CD (např. CD14)
diferenciační antigen (např. diferenciační antigen 14)
cDNA
komplementární molekula k DNA
CIS
cytokiny indukující protein obsahující SH2
CPDA
antikoagulační směs z citrátu vápenatého, glukózy a adeninu
Ct
prahový cyklus
CTLA-4
cytotoxický-T- lymfocytární antigen 4
DAG
diacylglycerol
DNA
deoxyribonukleová kyselina
dNTP
deoxyribonukleotidtrifosfát
EDTA
kyselina ethylendiamintetraoctová
EMR2
mucinu podobný receptor 2 obsahující modul epidermálního růstového faktoru
ESPGHAN
Evropská
společnost
pro
pediatrickou
gastroenterologii,
hepatologii a výživu FGR
Gardner-Rasheed feline sarcoma viral oncogene homolog
Fos
FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog
G
guanin
GD
Gravesova nemoc
GH
růstový hormon
GPI
glykosylfosfatidylinositol
GRB2
Growth factor receptor-bound protein 2
82
HCK
krvetvorná buněčná kináza
HIV
virus lidské imunitní nedostatečnosti
HLA-DQ2/DQ8/E/DR hlavní lidský antigen typu DQ2/ DQ8/E/DR HSP60, 70
protein teplotního šoku (heat shock protein) 60, 70
HT
Hashmitonova tyroiditida
ICOS
indukovatelný kostimulátor T-buněk
IEL
intraepiteliílní lymfocyty
IgA
imunoglubolin A,E,..
IL (např. IL-10)
interleukin (například interleukin 10)
INF-gamma, beta
interferon gamma, beta
IRF-3,1,7
interferon regulující faktor 1,3 a 7
JAK-1,-2,-3
Janus kináza 1, 2, 3
kDa
kilodaltony
LCK
specifická lymfocytární protein tyrosin kináza
LHDL
nízký high-density lipoprotein (low high-density lipoprotein)
LPS
lipopolysacharid
LRR
repetitivní domená bohatá na leuci (leucine-rich repeat)
LYH
lymfocystická hypofyzitida
MAPK
mitogenem aktivovaná proteinkináza
M-CSF
kolonie stimulující faktor makrofágů
MHC
hlavní histokompatibilní komplex
MD-2
lymfocytární antigen 96
M-DC8
P lygand selektinu
MEK
kináza mitogenem aktivované proteinkinázy
MICA/B
MHC class I polypeptide-related sequence A/B (neklasické MHC molekuly)
MMP-1 a-3
matrixové metaloproteináza 1 a 3
mRNA
mediátorová ribonukleová kyselina
MS
roztroušená skleróza
Myc
v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog
MyD88
myeloidní diferenciační gen primární odpovědi 88
MYO9B
myosin IXB
83
NF-kappaB
jaderný faktor kappa B
NKG2D
NK buňky aktivujíví receptor typu 3D
PAK
proteinkináza A
Pam3Cys
syntetický triacyl-lipopeptid
PBM
monocyty periferní krve (peripheral bllod monocytes)
PBMCs
mononukleární buňky periferní krve
PBS
phosphat-buffered saline (fosfátový pufr)
PCR
polymerázová řetězová reakce
PGK1
fosfoglycerát kináza 1
PHA
fytohemaglutinin
PI-3K
fosfatidylinositol- 3- kináza
Pit-1
hypofyzárně specifický pozitivní transkripční faktor 1 (pituitaryspecific positive transcription factor 1)
PKC
proteinkináza C
PLC-gamma
fosfolipáza C
PRL
prolaktin
PRL-R
receptor pro prolaktin
PTPN22
protein-tyrosin fosfatáza nereceptorového typu 22
Real Time PRC
polymerázová řetězová reakce v reálném čase
RFLP
polymorfismus délky restrikčních fragmentů
RT
pokojová teplota
RT PCR
reverzně transkriptázová polymerázová řetězová reakce
SHC
(Src homology 2 domain containing) transforming protein 2
SLE
systémovýlupus erythematodes
SNP
jednonukleotidový polymorfismus
SOCS
supresory cytokinové signalizace
SOS
son of sevenless homolog
Src
sarcoma viral onkogen homolog
SS
Sjögrenův syndrom
ss/dsRNA
jednořetězcová/ dvouřetězcová ribonukleová kyselina
STAT1, 3 a 5
signální transduktor a aktivátor transkripce 1, 3 a 5
T
thymin
84
T1D
diabetes mellitus I. typu
Tcf7
transkripční faktor 7 (specifický pro T lymfocyty)
TCR
receptor T lymfocytů pro antigen
TG2
tkáňová transglutamináza
Th1/2
pomocný T lymfocyt 1 /2
TIR
Toll/IL-1 receptorová doména
TLRs, TLR 2,4 a 7
Toll-like receptory, Toll-like receptor 2, 4 a 7
TNF-alpha
faktor nekrotizující nádory
TRIF
TIR-domain-containing adaptor protein inducing IFNβ doménu obsahující adaptér vyvolávající interferon-β)
Tyk2
tyrosin kináza 2
UV
ultrafialové záření
85
(TIR-
8 Seznam použité literatury Akashi-Takamura S, and Miyake K. 2006. Toll-like receptors (TLRs) and immune disorders. J Infect Chemother 12(5):233-240. Akashi S, Nagai Y, Ogata H, Oikawa M, Fukase K, Kusumoto S, Kawasaki K, Nishijima M, Hayashi S, Kimoto M et al. . 2001. Human MD-2 confers on mouse Toll-like receptor 4 species-specific lipopolysaccharide recognition. International Immunology 13(12):1595-1599. Alaedini A, and Green PHR. 2005. Narrative review: Celiac disease: Understanding a complex autoimmune disorder. Ann Intern Med 142(4):289-298. Aliprantis AO, Yang RB, Mark MR, Suggett S, Devaux B, Radolf JD, Klimpel GR, Godowski P, and Zychlinsky A. 1999. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science 285(5428):736-739. Almeida J, Bueno C, Alguero MC, Sanchez ML, de Santiago M, Escribano L, DiazAgustin B, Vaquero JM, Laso FJ, San Miguel JF et al. . 2001. Comparative analysis of the morphological, cytochemical, immunophenotypical, and functional characteristics of normal human peripheral blood lineage (-)/CD16(+)/HLADR+/CD14(-/lo) cells, CD14(+) monocytes, and CD16(-) dendritic cells. Clin Immunol 100(3):325-338. Amura CR, Kamei T, Ito N, Soares MJ, and Morrison DC. 1998. Differential regulation of lipopolysaccharide (LPS) activation pathways in mouse macrophages by LPSbinding proteins. J Immunol 161(5):2552-2560. Arden KC, Boutin JM, Djiane J, Kelly PA, and Cavenee WK. 1990. THE RECEPTORS FOR PROLACTIN AND GROWTH-HORMONE ARE LOCALIZED IN THE SAME REGION OF HUMAN CHROMOSOME-5. Cytogenet Cell Genet 53(23):161-165. Azar ST, and Yamout B. 1999. Prolactin secretion is increased in patients with multiple sclerosis. Endocr Res 25(2):207-214. Barrat FJ, Meeker T, Gregorio J, Chan JH, Uematsu S, Akira S, Chang B, Duramad O, and Coffman RL. 2005. Nucleic acids of mammalian origin can act as endogenous ligands for toll-like receptors and may promote systemic lupus erythematosus. J Exp Med 202(8):1131-1139.
86
Belge KU, Dayyani F, Horelt A, Siedlar M, Frankenberger M, Frankenberger B, Espevik T, and Ziegler-Heitbrock L. 2002. The proinflammatory CD14(+)CD16(+)DR(++) monocytes are a major source of TNF. J Immunol 168(7):3536-3542. Ben-Jonathan N, LaPensee CR, and LaPensee EW. 2008. What can we learn from rodents about prolactin in humans? Endocr Rev 29(1):1-41. BenJonathan N, Mershon JL, Allen DL, and Steinmetz RW. 1996. Extrapituitary prolactin: Distribution, regulation, functions, and clinical aspects. Endocrine Reviews 17(6):639-669. Bernstein MS, Tong-Starksen SE, and Locksley RM. 1991. Activation of human monocyte--derived macrophages with lipopolysaccharide decreases human immunodeficiency virus replication in vitro at the level of gene expression. J Clin Invest 88(2):540-545. Berwaer M, Martial JA, and Davis JRE. 1994. CHARACTERIZATION OF AN UPSTREAM PROMOTER DIRECTING EXTRAPITUITARY EXPRESSION OF THE HUMAN PROLACTIN GENE. Mol Endocrinol 8(5):635-642. Bole-Feysot C, Goffin V, Edery M, Binart N, and Kelly PA. 1998. Prolactin (PRL) and its receptor: Actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in PRL receptor knockout mice. Endocr Rev 19(3):225-268. Bouma G, Lam-Tse WK, Wierenga-Wolf AF, Drexhage HA, and Versnel MA. 2004. Increased serum levels of MRP-8/14 in type 1 diabetes induce an increased expression of CD11b and an enhanced adhesion of circulating monocytes to fibronectin. Diabetes 53(8):1979-1986. Brand JM, Frohn C, Cziupka K, Brockmann C, Kirchner H, and Luhm J. 2004. Prolactin triggers pro-inflammatory immune responses in peripheral immune cells. European Cytokine Network 15(2):99-104. Brophy K, Ryan AW, Thornton JM, Abuzakouk M, Fitzgerald AP, McLoughlin RM, O'Morain C, Kennedy NP, Stevens FM, Feighery C et al. . 2006. Haplotypes in the CTLA4 region are associated with coeliac disease in the Irish population. Genes and Immunity 7(1):19-26. Cairns AP, Crockard AD, and Bell AL. 2002. The CD14+CD16+monocyte subset in rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. Rheumatol Int 21(5):189192.
87
Cejkova P, Cerna M, Markova M, Marek J, Lacinova Z, and Haluzik M. 2012. Monitoring of the course of sepsis in hematooncological patients by extrapituitary prolactin expression in peripheral blood monocytes. Physiol Res. Cesario TC, Yousefi S, Carandang G, Sadati N, Le J, and Vaziri N. 1994. ENHANCED YIELDS OF GAMMA-INTERFERON IN PROLACTIN TREATED HUMAN PERIPHERAL-BLOOD MONONUCLEAR-CELLS. Proc Soc Exp Biol Med 205(1):89-95. Ciccocioppo R, Di Sabatino A, and Corazza GR. 2005. The immune recognition of gluten in coeliac disease. Clinical and Experimental Immunology 140(3):408-416. Cinova J, Palova-Jelinkova L, Smythies LE, Cerna M, Pecharova B, Dvorak M, Fruhauf P, Tlaskalova-Hogenova H, Smith PD, and Tuckova L. 2007. Gliadin peptides activate blood monocytes from patients with celiac disease. J Clin Immunol 27(2):201-209. Clevenger CV, Furth PA, Hankinson SE, and Schuler LA. 2003. The role of prolactin in mammary carcinoma. Endocr Rev 24(1):1-27. Clevenger CV, and Kline JB. 2001. Prolactin receptor signal transduction. Lupus 10(10):706-718. Correale J, and Villa A. 2004. The neuroprotective role of inflammation in nervous system injuries. J Neurol 251(11):1304-1316. Cunningham JM, Hebbring SJ, McDonnell SK, Cicek MS, Christensen GB, Wang L, Jacobsen SJ, Cerhan JR, Blute ML, Schaid DJ et al. . 2007. Evaluation of genetic variations in the androgen and estrogen metabolic pathways as risk factors for sporadic and familial prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 16(5):969-978. Davis JR. 2004. Prolactin and reproductive medicine. Curr Opin Obstet Gynecol 16(4):331-337. De Bellis A, Bizzarro A, Pivonello R, Lombardi G, and Bellastella A. 2005. Prolactin and autoimmunity. Pituitary 8(1):25-30. Deane JA, Pisitkun P, Barrett RS, Feigenbaum L, Town T, Ward JM, Flavell RA, and Bolland S. 2007. Control of toll-like receptor 7 expression is essential to restrict autoimmunity and dendritic cell proliferation. Immunity 27(5):801-810.
88
Devaraj S, Dasu MR, Rockwood J, Winter W, Griffen SC, and Jialal I. 2008. Increased toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 expression in monocytes from patients with type 1 diabetes: Further evidence of a proinflammatory state. J Clin Endocrinol Metab 93(2):578-583. El Miedany YM, Ahmed I, Moustafa H, and El Baddini M. 2004. Hyperprolactinemia in Sjogren's syndrome: a patient subset or a disease manifestation? Joint Bone Spine 71(3):203-208. Ellery PJ, Tippett E, Chiu YL, Paukovics G, Cameron PU, Solomon A, Lewin SR, Gorry PR, Jaworowski A, Greene WC et al. . 2007. The CD16(+) monocyte subset is more permissive to infection and preferentially harbors HIV-1 in vivo. J Immunol 178(10):6581-6589. Fasano A, Not T, Wang WL, Uzzau S, Berti I, Tommasini A, and Goldblum SE. 2000. Zonulin, a newly discovered modulator of intestinal permeability, and its expression in coeliac disease. Lancet 355(9214):1518-1519. Felmet KA, Hall MW, Clark RSB, Jaffe R, and Carcillo JA. 2005. Prolonged lymphopenia, lymphoid depletion, and hypoprolactinemia in children with nosocomial sepis and multiple organ failure. J Immunol 174(6):3765-3772. Fingerle G, Pforte A, Passlick B, Blumenstein M, Strobel M, and Zieglerheitbrock HWL. 1993. THE NOVEL SUBSET OF CD14+/CD16+ BLOOD MONOCYTES IS EXPANDED IN SEPSIS PATIENTS. Blood 82(10):3170-3176. Fornari MC, Pedreira S, Niveloni S, Gonzalez D, Diez RA, Vazquez H, Mazure R, Sugai E, Smecuol E, Boerr L et al. . 1998. Pre-and post-treatment serum levels of cytokines IL-1 beta, IL-6, and IL-1 receptor antagonist in celiac disease. Are they related to the associated osteopenia? Am J Gastroenterol 93(3):413-418. Forsberg G, Fahlgren A, Horstedt P, Hammarstrom S, Hernell O, and Hammarstrom ML. 2004. Presence of bacteria and innate immunity of intestinal epithelium in childhood celiac disease. Am J Gastroenterol 99(5):894-904. Frankenberger M, Sternsdorf T, Pechumer H, Pforte A, and ZieglerHeitbrock HWL. 1996. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: A polymerase chain reaction analysis. Blood 87(1):373-377. Fraser JS, Engel W, Ellis HJ, Moodie SJ, Pollock EL, Wieser H, and Ciclitira PJ. 2003. Coeliac disease: in vivo toxicity of the putative immunodominant epitope. Gut 52(12):1698-1702.
89
Freeman ME, Kanyicska S, Lerant A, and Nagy G. 2000. Prolactin: structure, function, and regulation of secretion. Physiol Rev 80(4):1523-1631. Gellersen B, Kempf R, Telgmann R, and DiMattia GE. 1994. Nonpituitary human prolactin gene transcription is independent of Pit-1 and differentially controlled in lymphocytes and in endometrial stroma. Mol Endocrinol 8(3):356-373. Gerlo S, Verdood P, Hooghe-Peters EL, and Kooijman R. 2005. Modulation of prolactin expression in human T lymphocytes by cytokines. J Neuroimmunol 162(1-2):190193. Goffin V, Bernichtein S, Touraine P, and Kelly PA. 2005. Development and potential clinical uses of human prolactin receptor antagonists. Endocr Rev 26(3):400-422. Green PHR, Stavropoulos SN, Panagi SG, Goldstein SL, McMahon DJ, Absan H, and Neugut AI. 2001. Characteristics of adult celiac disease in the USA: Results of a national survey. Am J Gastroenterol 96(1):126-131. Grimley PM, Dong F, and Rui H. 1999. Stat5a and Stat5b: fraternal twins of signal transduction and transcriptional activation. Cytokine Growth Factor Rev 10(2):131157. Haidet J, Cifarelli V, Trucco M, and Luppi P. 2012. C-peptide reduces pro-inflammatory cytokine secretion in LPS-stimulated U937 monocytes in condition of hyperglycemia. Inflamm Res 61(1):27-35. Hankinson SE, Willett WC, Michaud S, Manson JE, Colditz GA, Longcope C, Rosner B, and Speizer FE. 1999. Plasma prolactin levels and subsequent risk of breast cancer in postmenopausal women. J Natl Cancer Inst 91(7):629-634. Heinzelmann M, Mercer-Jones MA, Flodgaard H, and Miller FN. 1998. Heparin-binding protein (CAP37) is internalized in monocytes and increases LPS-induced monocyte activation. J Immunol 160(11):5530-5536. Henricson BE, Carboni JM, Burkhardt AL, and Vogel SN. 1995. LPS and Taxol activate Lyn kinase autophosphorylation in Lps(n), but not in Lpsd), macrophages. Mol Med 1(4):428-435. Hill ID, Dirks MH, Liptak GS, Colletti RB, Fasano A, Guandalini S, Hoffenberg EJ, Horvath K, Murray JA, Pivor M et al. . 2005. Guideline for the diagnosis and treatment of celiac disease in children: Recommendations of the North American
90
Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 40(1):1-19. Hunt KA, Monsuur AJ, McArdle W, Kumar PJ, Travis SPL, Walters JRF, Jewell DP, Strachan DP, Playford RJ, Wijmenga C et al. . 2006. Lack of association of MYO9B genetic variants with coeliac disease in a British cohort. Gut 55(7):969972. Hurst J, and von Landenberg P. 2008. Toll-like receptors and autoimmunity. Autoimmun Rev 7(3):204-208. Charles PJ, Smeenk RJT, De Jong J, Feldmann M, and Maini RN. 2000. Assessment of antibodies to double-stranded DNA induced in rheumatoid arthritis patients following treatment with infliximab, a monoclonal antibody to tumor necrosis factor alpha - Findings in open-label and randomized placebo-controlled trials. Arthritis Rheum 43(11):2383-2390. Chikanza IC, Petrou P, Chrousos G, Kingsley G, and Panayi GS. 1993. EXCESSIVE AND DYSREGULATED SECRETION OF PROLACTIN IN RHEUMATOIDARTHRITIS IMMUNOPATHOGENETIC AND THERAPEUTIC IMPLICATIONS. Br J Rheumatol 32(6):445-448. Ivarsson A, Hernell O, Stenlund H, and Persson LA. 2002. Breast-feeding protects against celiac disease. Am J Clin Nutr 75(5):914-921. Jabri B, Kasarda DD, and Green PHR. 2005. Innate and adaptive immunity: the Yin and Yang of celiac disease. Immunological Reviews 206:219-231. Jacobi AM, Rohde W, Ventz M, Riemekasten G, Burmester GR, and Hiepe F. 2001a. Enhanced serum prolactin (PRL) in patients with systemic lupus erythematosus: PRL levels are related to the disease activity. Lupus 10(8):554-561. Jacobi AM, Rohde W, Volk HD, Dorner T, Burmester GR, and Hiepe F. 2001b. Prolactin enhances the in vitro production of IgG in peripheral blood mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus but not from healthy controls. Ann Rheum Dis 60(3):242-247. Jara LJ, Vera-Lastra O, Miranda JM, Alcala M, and Alvarez-Nemegyei J. 2001. Prolactin in human systemic lupus erythematosus. Lupus 10(10):748-756. Kagnoff MF. 2005. Overview and pathogenesis of celiac disease. Gastroenterology 128(4):S10-S18.
91
Kagnoff MF, Paterson YJ, Kumar PJ, Kasarda DD, Carbone FR, Unsworth DJ, and Austin RK. 1987. EVIDENCE FOR THE ROLE OF A HUMAN INTESTINAL ADENOVIRUS IN THE PATHOGENESIS OF CELIAC-DISEASE. Gut 28(8):995-1001. Kanyicska B, Burris TP, and Freeman ME. 1991. ENDOTHELIN-3 INHIBITS PROLACTIN AND STIMULATES LH, FSH AND TSH SECRETION FROM PITUITARY CELL-CULTURE. Biochem Biophys Res Commun 174(1):338-343. Kapur G, Patwari AK, Narayan S, and Anand VK. 2004. Serum prolactin in celiac disease. Journal of Tropical Pediatrics 50(1):37-40. Karanth S, and McCann SM. 1991. ANTERIOR-PITUITARY HORMONE CONTROL BY INTERLEUKIN-2. Proc Natl Acad Sci U S A 88(7):2961-2965. Karell K, Louka AS, Moodie SJ, Ascher H, Clot F, Greco L, Ciclitira PJ, Sollid LM, Partanen J, and European Genetics Cluster Celiac D. 2003. HLA types in celiac disease patients not carrying the DQA1*05-DQB1*02 (DQ2) heterodimer: Results from the European genetics cluster on celiac disease. Human Immunology 64(4):469-477. Kato H, Takeuchi O, Sato S, Yoneyama M, Yamamoto M, Matsui K, Uematsu S, Jung A, Kawai T, Ishii KJ et al. . 2006. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature 441(7089):101-105. Kobayashi M, Saitoh SI, Tanimura N, Takahashi K, Kawasaki K, Nishijima M, Fujimoto Y, Fukase K, Akashi-Takamura S, and Miyake K. 2006. Regulatory roles for MD-2 and TLR4 in ligand-induced receptor clustering. J Immunol 176(10):6211-6218. Kobe B, and Kajava AV. 2001. The leucine-rich repeat as a protein recognition motif. Curr Opin Struct Biol 11(6):725-732. Kwakkenbos MJ, Chang GW, Lin HH, Pouwels W, de Jong EC, van Lier RAW, Gordon S, and Hamann J. 2002. The human EGF-TM7 family member EMR2 is a heterodimeric receptor expressed on myeloid cells. J Leukoc Biol 71(5):854-862. Le-Barillec K, Pidard D, Balloy V, and Chignard M. 2000. Human neutrophil cathepsin G down-regulates LPS-mediated monocyte activation through CD14 proteolysis. J Leukoc Biol 68(2):209-215. Lee RCH, Walters JA, Reyland ME, and Anderson SM. 1999. Constitutive activation of the prolactin receptor results in the induction of growth factor-independent
92
proliferation and constitutive activation of signaling molecules. J Biol Chem 274(15):10024-10034. Lemaitre B, Nicolas E, Michaut L, Reichhart JM, and Hoffmann JA. 1996. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell 86(6):973-983. Lever EG, and McKerron CG. 1984. AUTOIMMUNE ADDISONS-DISEASE ASSOCIATED WITH HYPERPROLACTINEMIA. Clin Endocrinol 21(4):451457. Li J, Teng WP, and Shan ZY. 2001. Effects of prolactin on HLA-DR and CD40 expressions by human thyrocytes. Chin Med J 114(11):1151-1156. Liu TF, and Jones BM. 1998. Impaired production of IL-12 in systemic lupus erythematosus. I. Excessive production of IL-10 suppresses production of IL-12 by monocytes. Cytokine 10(2):140-147. Louka AS, and Sollid LM. 2003. HLA in coeliac disease: Unravelling the complex genetics of a complex disorder. Tissue Antigens 61(2):105-117. Maiuri L, Ciacci C, Ricciardelli I, Vacca L, Raia V, Auricchio S, Picard J, Osman M, Quaratino S, and Londei M. 2003. Association between innate response to gliadin and activation of pathogenic T cells in coeliac disease. Lancet 362(9377):30-37. Marsh MN. 1992. GLUTEN, MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX, AND THE SMALL-INTESTINE - A MOLECULAR AND IMMUNOBIOLOGICAL APPROACH TO THE SPECTRUM OF GLUTEN SENSITIVITY (CELIAC SPRUE). Gastroenterology 102(1):330-354. Marsin AS, Bouzin C, Bertrand L, and Hue L. 2002. The stimulation of glycolysis by hypoxia in activated monocytes is mediated by AMP-activated protein kinase and inducible 6-phosphofructo-2-kinase. J Biol Chem 277(34):30778-30783. Matalka KZ. 2003. Prolactin enhances production of interferon-gamma, interleukin-12, and interleukin-10, but not of tumor necrosis factor-alpha, in a stimulus-specific manner. Cytokine 21(4):187-194. Matera L, Mori M, and Galetto A. 2001. Effect of prolactin on the antigen presenting function of monocyte-derived dendritic cells. Lupus 10(10):728-734.
93
Matera L, Mori M, Geuna M, Buttiglieri S, and Palestro G. 2000. Prolactin in autoimmunity and antitumor defence. J Neuroimmunol 109(1):47-55. Matysiak-Budnik T, Candalh C, Dugave C, Namane A, Cellier C, Cerf-Bensussan N, and Heyman M. 2003. Alterations of the intestinal transport and processing of gliadin peptides in celiac disease. Gastroenterology 125(3):696-707. Medzhitov R, PrestonHurlburt P, and Janeway CA. 1997. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature 388(6640):394-397. Molberg O, Lundin KEA, Nilsen EM, Scott H, Kett K, Brandtzaeg P, Thorsby E, and Sollid LM. 1998. HLA restriction patterns of gliadin- and astrovirus-specific CD4(+) T cells isolated in parallel from the small intestine of celiac disease patients. Tissue Antigens 52(5):407-415. Mora B, Bonamico M, Ferri M, Megiorni F, Osborn J, Pizzuti A, and Mazzilli MC. 2005. Association of the matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) promoter polymorphism with Celiac disease in male subjects. Human Immunology 66(6):716-720. Mukherjee P, Mastro AM, and Hymer WC. 1990. PROLACTIN INDUCTION OF INTERLEUKIN-2 RECEPTORS ON RAT SPLENIC LYMPHOCYTES. Endocrinology 126(1):88-94. Mustalahti K, Catassi C, Reunanen A, Fabiani E, Heier M, McMillan S, Murray L, Metzger MH, Gasparin M, Bravi E et al. . 2010. The prevalence of celiac disease in Europe: Results of a centralized, international mass screening project. Ann Med 42(8):587-595. Muzio M, Bosisio D, Polentarutti N, D'Amico G, Stoppacciaro A, Mancinelli R, van't Veer C, Penton-Rol G, Ruco LP, Allavena P et al. . 2000. Differential expression and regulation of toll-like receptors (TLR) in human leukocytes: Selective expression of TLR3 in dendritic cells. J Immunol 164(11):5998-6004. Nagano M, and Kelly PA. 1994. TISSUE DISTRIBUTION AND REGULATION OF RAT PROLACTIN RECEPTOR GENE-EXPRESSION - QUANTITATIVEANALYSIS BY POLYMERASE CHAIN-REACTION. J Biol Chem 269(18):13337-13345. Nagy E, and Berczi I. 1991. HYPOPHYSECTOMIZED RATS DEPEND ON RESIDUAL PROLACTIN FOR SURVIVAL. Endocrinology 128(6):2776-2784.
94
Nikolic T, Bouma G, Drexhage HA, and Leenen PJM. 2005. Diabetes-prone NOD mice show an expanded subpopulation of mature circulating monocytes, which preferentially develop into macrophage-like cells in vitro. J Leukoc Biol 78(1):7079. Nilsen EM, Jahnsen FL, Lundin KEA, Johansen FE, Fausa O, Sollid LM, Jahnsen J, Scott H, and Brandtzaeg P. 1998. Gluten induces an intestinal cytokine response strongly dominated by interferon gamma in patients with celiac disease. Gastroenterology 115(3):551-563. Olavarria VH, Sepulcre MP, Figueroa JE, and Mulero V. 2010. Prolactin-Induced Production of Reactive Oxygen Species and IL-1 beta in Leukocytes from the Bony Fish Gilthead Seabream Involves Jak/Stat and NF-kappa B Signaling Pathways. J Immunol 185(7):3873-3883. Orbach H, and Shoenfeld Y. 2007. Hyperprolactinemia and autoimmune diseases. Autoimmun Rev 6(8):537-542. Owerbach D, Rutter WJ, Cooke NE, Martial JA, and Shows TB. 1981. THE PROLACTIN GENE IS LOCATED ON CHROMOSOME-6 IN HUMANS. Science 212(4496):815-816. Ozinsky A, Underhill DM, Fontenot JD, Hajjar AM, Smith KD, Wilson CB, Schroeder L, and Aderem A. 2000. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between Toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U S A 97(25):13766-13771. Passlick B, Flieger D, and Zieglerheitbrock HWL. 1989. IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF A NOVEL MONOCYTE SUBPOPULATION IN HUMAN PERIPHERAL-BLOOD. Blood 74(7):2527-2534. Patino R, Ibarra J, Rodriguez A, Ruiz-Yague M, Pintor E, Fernandez-Cruz A, and Figueredo A. 2000. Circulating monocytes in patients with diabetes mellitus, arterial disease, and increased CD14 expression. Am J Cardiol 85(11):1288-1291. Penton-Rol G, Cervantes-Llanos M, Martinez-Sanchez G, Cabrera-Gomez JA, ValenzuelaSilva CM, Ramirez-Nunez O, Casanova-Orta M, Robinson-Agramonte MA, Lopategui-Cabezas I, and Lopez-Saura PA. 2009. TNF-alpha and IL-10 downregulation and marked oxidative stress in Neuromyelitis Optica. J InflammLond 6.
95
Perrella O, Sbreglia C, Perrella M, Spetrini G, Gorga F, Pezzella M, Perrella A, Atripaldi L, and Carrieri P. 2006. Interleukin-10 and tumor necrosis factor-alpha: model of immunomodulation in multiple sclerosis. Neurol Res 28(2):193-195. Price AE, Logvinenko KB, Higgins EA, Cole ES, and Richards SM. 1995. STUDIES ON THE MICROHETEROGENEITY AND IN-VITRO ACTIVITY OF GLYCOSYLATED AND NONGLYCOSYLATED RECOMBINANT HUMAN PROLACTIN SEPARATED USING A NOVEL PURIFICATION PROCESS. Endocrinology 136(11):4827-4833. Pugin J, Stern-Voeffray S, Daubeuf B, Matthay MA, Elson G, and Dunn-Siegrist I. 2004. Soluble MD-2 activity in plasma from patients with severe sepsis and septic shock. Blood 104(13):4071-4079. Pulliam L, Gascon R, Stubblebine M, McGuire D, and McGrath MS. 1997. Unique monocyte subset in patients with AIDS dementia. Lancet 349(9053):692-695. Reem GH, Ray DW, and Davis JRE. 1999. The human prolactin gene upstream promoter is regulated in lymphoid cells by activators of T-cells and by cAMP. J Mol Endocrinol 22(3):285-293. Reifen R, Buskila D, Maislos M, Press J, and Lerner A. 1997. Serum prolactin in coeliac disease: a marker for disease activity. Archives of Disease in Childhood 77(2):155157. Riordan FA, and Davidson DC. 1991. Revised criteria for diagnosis of coeliac disease and medical audit. Arch Dis Child 66(4):561. Risch N. 1987. ASSESSING THE ROLE OF HLA-LINKED AND UNLINKED DETERMINANTS OF DISEASE. American Journal of Human Genetics 40(1):114. Romaldini CC, Barbieri D, Okay TS, Raiz R, and Cancado ELR. 2002. Serum soluble interleukin-2 receptor, interleukin-6, and tumor necrosis factor-alpha levels in children with celiac disease: Response to treatment. J Pediatr Gastroenterol Nutr 35(4):513-517. Rothe G, Gabriel H, Kovacs E, Klucken J, Stohr J, Kindermann W, and Schmitz G. 1996. Peripheral blood mononuclear phagocyte subpopulations as cellular markers in hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol 16(12):1437-1447.
96
Sabharwal P, Glaser R, Lafuse W, Varma S, Liu Q, Arkins S, Kooijman R, Kutz L, Kelley KW, and Malarkey WB. 1992. PROLACTIN SYNTHESIZED AND SECRETED BY HUMAN PERIPHERAL-BLOOD MONONUCLEAR-CELLS - AN AUTOCRINE GROWTH-FACTOR FOR LYMPHOPROLIFERATION. Proc Natl Acad Sci U S A 89(16):7713-7716. Sauro MD, and Zorn NE. 1991. PROLACTIN INDUCES PROLIFERATION OF VASCULAR SMOOTH-MUSCLE CELLS THROUGH A PROTEIN-KINASE CDEPENDENT MECHANISM. J Cell Physiol 148(1):133-138. Seth A, Gonzalez FA, Gupta S, Raden DL, and Davis RJ. 1992. SIGNAL TRANSDUCTION WITHIN THE NUCLEUS BY MITOGEN-ACTIVATED PROTEIN-KINASE. J Biol Chem 267(34):24796-24804. Schettini G, Florio T, Meucci O, Landolfi E, Grimaldi M, Lombardi G, Scala G, and Leong D. 1990. INTERLEUKIN-1-BETA MODULATION OF PROLACTIN SECRETION FROM RAT ANTERIOR-PITUITARY-CELLS - INVOLVEMENT OF ADENYLATE-CYCLASE ACTIVITY AND CALCIUM MOBILIZATION. Endocrinology 126(3):1435-1441. Schlitt A, Heine GH, Blankenberg S, Espinola-Klein C, Dopheide JF, Bickel C, Lackner KJ, Iz M, Meyer J, Darius H et al. . 2004. CD14+CD16+ monocytes in coronary artery disease and their relationship to serum TNF-alpha levels. Thromb Haemost 92(2):419-424. Schuppan D, Esslinger B, and Dieterich W. 2003. Innate immunity and coeliac disease. Lancet 362(9377):3-4. Schwandner R, Dziarski R, Wesche H, Rothe M, and Kirschning CJ. 1999. Peptidoglycanand lipoteichoic acid-induced cell activation is mediated by toll-like receptor 2. J Biol Chem 274(25):17406-17409. Siedlar M, Frankenberger M, Ziegler-Heitbrock LHW, and Belge KU. 2000. The M-DC8positive leukocytes are a subpopulation of the CD14(+) CD16(+) monocytes. Immunobiology 202(1):11-17. Sivapalaratnam S, Farrugia R, Nieuwdorp M, Langford CF, van Beem RT, Maiwald S, Zwaginga JJ, Gusnanto A, Watkins NA, Trip MD et al. . 2011. Identification of candidate genes linking systemic inflammation to atherosclerosis; results of a human in vivo LPS infusion study. BMC Med Genomics 4:64. Skibola CF, Bracci PM, Paynter RA, Forrest MS, Agana L, Woodage T, Guegler K, Smith MT, and Holly EA. 2005. Polymorphisms and haplotypes in the cytochrome P450
97
17A1, prolactin, and catechol-O-methyltransferase genes and non-Hodgkin lymphoma risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 14(10):2391-2401. Smith CR, and Norman MR. 1990. PROLACTIN AND GROWTH-HORMONE MOLECULAR HETEROGENEITY AND MEASUREMENT IN SERUM. Ann Clin Biochem 27:542-550. Sollid LM, and Thorsby E. 1993. HLA SUSCEPTIBILITY GENES IN CELIACDISEASE - GENETIC-MAPPING AND ROLE IN PATHOGENESIS. Gastroenterology 105(3):910-922. Spangelo BL, Judd AM, Isakson PC, and Macleod RM. 1989. INTERLEUKIN-6 STIMULATES ANTERIOR-PITUITARY HORMONE-RELEASE INVITRO. Endocrinology 125(1):575-577. Starr R, and Hilton DJ. 1998. SOCS: suppressors of cytokine signalling. Int J Biochem Cell Biol 30(10):1081-1085. Stene LC, Honeyman MC, Hoffenberg EJ, Haas JE, Sokol RJ, Emery L, Taki I, Norris JM, Erlich HA, Eisenbarth GS et al. . 2006. Rotavirus infection frequency and risk of celiac disease autoimmunity in early childhood: A longitudinal study. American Journal of Gastroenterology 101(10):2333-2340. Stevens A, Ray D, Alansari A, Hajeer A, Thomson W, Donn R, Ollier WE, Worthington J, and Davis JR. 2001a. Characterization of a prolactin gene polymorphism and its associations with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 44(10):23582366. Stevens A, Ray DW, Worthington J, and Davis JR. 2001b. Polymorphisms of the human prolactin gene--implications for production of lymphocyte prolactin and systemic lupus erythematosus. Lupus 10(10):676-683. Szebeni B, Veres G, Dezsofi A, Rusai K, Vannay A, Bokodi G, Vasarhelyi B, KorponaySzabo IR, Tulassay TT, and Arato A. 2007. Increased mucosal expression of tolllike receptor (TLR)2 and TLR4 in coeliac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr 45(2):187-193. Thevenet J, Pescini Gobert R, Hooft van Huijsduijnen R, Wiessner C, and Sagot YJ. 2011. Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation. PLoS One 6(6):e21519.
98
Thieblemont N, Weiss L, Sadeghi HM, Estcourt C, and HaeffnerCavaillon N. 1995. CD14(low)CD16(high): A cytokine-producing monocyte subset which expands during human immunodeficiency virus infection. Eur J Immunol 25(12):34183424. Thodou E, Asa SL, Kontogeorgos G, Kovacs K, Horvath E, and Ezzat S. 1995. CLINICAL CASE SEMINAR LYMPHOCYTIC HYPOPHYSITIS CLINICOPATHOLOGICAL FINDINGS. J Clin Endocrinol Metab 80(8):23022311. Tripathi A, and Sodhi A. 2008. Prolactin-induced production of cytokines in macrophages in vitro involves JAK/STAT and JNK MAPK pathways. International Immunology 20(3):327-336. Tworoger SS, Eliassen AH, Rosner B, Sluss P, and Hankinson SE. 2004. Plasma prolactin concentrations and risk of postmenopausal breast cancer. Cancer Res 64(18):68146819. Ueda E, Ozerdem U, Chen YH, Yao M, Huang KT, Sun HQ, Martins-Green M, Bartolini P, and Walker AM. 2006. A molecular mimic demonstrates that phosphorylated human prolactin is a potent anti-angiogenic hormone. Endocr-Relat Cancer 13(1):95-111. Underhill DM, Ozinsky A, Smith KD, and Aderem A. 1999. Toll-like receptor-2 mediates mycobacteria-induced proinflammatory signaling in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A 96(25):14459-14463. van de Wal Y, Kooy Y, van Veelen P, Pena S, Mearin L, Papadopoulos G, and Koning F. 1998. Selective deamidation by tissue transglutaminase strongly enhances gliadinspecific T cell reactivity. J Immunol 161(4):1585-1588. van Heel DA, and West J. 2006. Recent advances in coeliac disease. Gut 55(7):1037-1046. Vang T, Miletic AV, Bottini N, and Mustelin T. 2007. Protein tyrosine phosphatase PTPN22 in human autoimmunity. Autoimmunity 40(6):453-461. Varkonyi A, Boda M, Endreffy E, Nemeth I, and Timar E. 1998. Coeliac disease: Always something to discover. Scand J Gastroenterol 33:122-129. Vazquez H, Smecuol E, Flores D, Mazure R, Pedreira S, Niveloni S, Maurino E, and Bai JC. 2001. Relation between cigarette smoking and celiac disease: Evidence from a case-control study. Am J Gastroenterol 96(3):798-802.
99
Vera-Lastra O, Jara LJ, and Espinoza LR. 2002. Prolactin and autoimmunity. Autoimmun Rev 1(6):360-364. Via CS, Shustov A, Rus V, Lang T, Nguyen P, and Finkelman FD. 2001. In vivo neutralization of TNF-alpha promotes humoral autoimmunity by preventing the induction of CTL. J Immunol 167(12):6821-6826. Viriyakosol S, Kirkland TN, Soldau K, and Tobias PS. 2000. MD-2 binds to bacterial lipopolysaccharide. J Endoxtin Res 6(6):489-491. Walton PE, and Cronin MJ. 1990. TUMOR-NECROSIS-FACTOR-ALPHA AND INTERFERON-GAMMA REDUCE PROLACTIN-RELEASE INVITRO. Am J Physiol 259(5):E672-E676. Weiner LM, Li W, Holmes M, Catalano RB, Dovnarsky M, Padavic K, and Alpaugh RK. 1994. PHASE-I TRIAL OF RECOMBINANT MACROPHAGE-COLONYSTIMULATING FACTOR AND RECOMBINANT GAMMA-INTERFERON TOXICITY, MONOCYTOSIS, AND CLINICAL EFFECTS. Cancer Res 54(15):4084-4090. Weinstock C, Ullrich H, Hohe R, Berg A, Baumstark MW, Frey I, Northoff H, and Flegel WA. 1992. LOW-DENSITY LIPOPROTEINS INHIBIT ENDOTOXIN ACTIVATION OF MONOCYTES. Arterioscler Thromb 12(3):341-347. Woolley N, Mustalahti K, Maki M, and Partanen J. 2005. Cytokine gene polymorphisms and genetic association with coeliac disease in the Finnish population. Scand J Immunol 61(1):51-56. Wright SD, Ramos RA, Tobias PS, Ulevitch RJ, and Mathison JC. 1990. CD14, A RECEPTOR FOR COMPLEXES OF LIPOPOLYSACCHARIDE (LPS) AND LPS BINDING-PROTEIN. Science 249(4975):1431-1433. Yulee LY, Hrachovy JA, Stevens AM, and Schwarz LA. 1990. INTERFERONREGULATORY FACTOR-I IS AN IMMEDIATE-EARLY GENE UNDER TRANSCRIPTIONAL REGULATION BY PROLACTIN IN NB2 T-CELLS. Mol Cell Biol 10(6):3087-3094. Zhang DK, Zhang GL, Hayden MS, Greenblatt MB, Bussey C, Flavell RA, and Ghosh S. 2004. A toll-like receptor that prevents infection by uropathogenic bacteria. Science 303(5663):1522-1526.
100
Ziegler-Heitbrock L. 2007. The CD14+CD16+blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol 81(3):584-592. Ziegler-Heitbrock L, Ancuta P, Crowe S, Dalod M, Grau V, Hart DN, Leenen PJM, Liu YJ, MacPherson G, Randolph GJ et al. . 2010. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood 116(16):E74-E80. Ziegler-Heitbrock LHW. 2000. Definition of human blood monocytes. Immunobiology 202(1):1-1. Zieglerheitbrock HWL, Fingerle G, Strobel M, Schraut W, Stelter F, Schutt C, Passlick B, and Pforte A. 1993. THE NOVEL SUBSET OF CD14+ CD16+ BLOOD MONOCYTES EXHIBITS FEATURES OF TISSUE MACROPHAGES. Eur J Immunol 23(9):2053-2058. Zimmer KP, Naim H, Weber P, Ellis HJ, and Ciclitira PJ. 1998. Targeting of gliadin peptides, CD8, alpha/beta-TCR, and gamma/delta-TCR to Golgi complexes and vacuoles within celiac disease enterocytes. Faseb J 12(13):1349-1357.
Internetově odkazy: URL 1 citováno 24. 08. 2012 URL 2 citováno 24. 08. 2012 URL 3 citováno 24. 08. 2012
101
9 Přílohy Příloha 1: Signální dráhy prolaktinu (Upraveno podle: URL 3) Příloha 2: POSTER: Nemeckova I,Hoffmanova I, Tuckova L, Cerna M, Cejkova P: The role of monocytic TLR2 and TLR4 in pathogenesis of celiac disease.8th International Congress on Autoimmunity, (Granada, Spain) 2012
102
