postery P 20/21 ZMĚNY V MIKROPROSTŘEDÍ NÁDORU VYVOLANÉ POLYMERNÍMI KONJUGÁTY NA BÁZI HPMA E. Baumgartnerová1, O. Hovorka1, D. Větvička1, V. Šubr2, T. Etrych2, K. Ulbrich2, B. Říhová1 1 Mikrobiologický ústav AVČR v.v.i, Praha 2 Ústav makromolekulární chemie AVČR v. v. i, Praha
P 20/22 IMUNOLOGICKÁ A EPIGENETICKÁ MODULACE GENOVÉ EXPRESE LEUKEMICKÝCH BUNĚK V KRÁTKODOBÝCH I DLOUHODOBÝCH KULTURÁCH K. Elknerová, Z. Lacinová, G. Štibríková, J. Němcová, J. Souček, P. Stöckbauer Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha
Polymerní konjugáty na bázi N-(2-hydroxypropyl)methacryla midu (HPMA), nesoucí cytostatikum doxorubiciny byly vyvinuty jako jeden ze systémů pro zlepšení terapeutického indexu a potlačení vedlejších účinků konvenčních cytostatik. Testuje se celá řada těchto konjugátu lišících se směrovací strukturou, sekvencí peptidových řetězců nesoucích cytostatikum a typem vazby léčiva. Ačkoliv některé konjugáty vstoupily ve Velké Británii dokonce do fáze klinických testů a je dokončováno preklinické testování nesměrovaného, hydrolyticky štepitelného konjugátu, mechanismy účinku jsou stále neznámé. Charakterizovali jsme chování různých polymerních konjugátů uvnitř nádoru během terapie. Na modelu myšího thymomu EL4/ GFP jsme stanovili změny v expresi CD3, CD4, CD8, CD69, CD11b a CD11c uvnitř nádorové masy v průběhu terapie jak volným léčivem, tak několika polymerními konjugáty. Dále jsme porovnali morfologické změny v expresi HSP110, HSP90, HSP70 a HSP60. Zatímco u nestresovanych buněk jsou tyto proteiny exprimovany v cytoplazmě a jádře, během terapie polymerními konjugáty mohou být translokovány na buněčný povrch a fungovat jako „eat me“ signál. Umírající buňky s HSP proteiny translokovanými na povrch se stávají imunogenními a mohou vyvolat systémovou protinádorovou imunitní reakci, která se pak podstatnou částí podílí na eradikaci nádoru. Tato systémová protinádorová imunitní reakce byla již dokumentována v několika našich předchozích pracech. Podrobná analýza mikroprostředí nádoru během léčby umožní navrhnout novou generaci polymerních konjugátů, které budou nejen účinnější, ale budou zároveň chránit a podporovat imunitní systém pacientů.
Byl studován inhibiční, diferenciační a antiproliferativní účinek působení monoklonální protilátky proti molekule sialomucinu CD34 a působení epigenetických modulátorů genové exprese – kyseliny valpronové a SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid) na leukemické buněčné linie a leukemické buňky nemocných s myeloidní leukemií v krátkodobých i dlouhodobých kulturách. Byl prokázán jak antiproliferativní, tak i mírný proapoptotický účinek monoklonální protilátky proti CD34 na CD34+ leukemické buněčné linie (HEL, MOLM-7 a 9, JURL-MK1), zatímco účinek na CD34- linie ( ML-2, HL-60, NB-4) byl nevýrazný. Přítomnost epigenetických modulátorů v různých koncentracích kromě inhibice proliferace vyvolávala především apoptotickou i nekrotickou buněčnou smrt, zpravidla během 72 hodin působení. Hodnoty IC50 se pohybovaly v rozmezí 0,28 μM u linie HEL až do 1,26 μM u linie JURL-MK1 působením SAHA a 0,39 mM u linie HEL až do 1,22 mM u linie MOLM-7 působením kyseliny valpronové. Morfologické a imunologické vyšetření prokázalo známky buněčné diferenciace, i když nedocházelo k úplné zástavě buněčné proliferace, především u buněčných linií. Získané výsledky ukazují, že genovou expresi leukemických buněk v kulturách lze „ex vivo“ modulovat žádaným směrem směrem k apoptóze, nekróze nebo buněčné diferenciaci působením vhodných epigenetických i imunologických modulátorů. Tato skutečnost je využitelná pro vývoj a navržení nových cílených terapeutik leukemií a i ostatních maligních onemocnění. Podpořeno výzkumným záměrem MZO 0002373601 Interní grantové agentury MZ ČR.
Tento výzkum je podporován projektem GAAV číslo: IAA400200702 a projektem KAN 200200651.
21 Přirozená imunita a zánět
P 21/1 OCHRANNÝ VLIV PREKOLONIZACE LAKTOBACILY NA VÝVOJ STŘEVNÍHO ZÁNĚTU U MYŠÍ H. Kozáková1, M. Schwarzer1, T. Hudcovic1, T. Hrnčíř1, R. Štěpánková1, H. Tlaskalová1, T. Řezanka1, B. Cukrowska2 1 Mikrobiologický ústav Akademie věd České republiky, Nový Hrádek 2 Dept. Pathology, The Children’s Memorial Health Institute, Warsaw, Poland Cílem naší studie bylo zjistit, zda primární osídlení laktobacily u původně bezmikrobních myší ovlivní vývoj střevního zánětu vyvolaného pitím roztoku dextransulfátu sodného (DSS) v experimentálním modelu ulcerózní kolitidy. Bakterie mléčného kvašení jsou jedněmi z prvních bakterií, které osídlují zažívací trakt a napomáhají vyzrávání imunitního systému. Myši byly kolonizovány třemi kmeny Lactobacillus rhamnosus (Lakcid L, Biomed, Lubin, Poland).
128
K našim pokusům jsme používali SCID myši, které mají imunodeficit T- a B-lymfocytů, jejichž obranyschopnost je dána pouze nástroji přirozené imunity. SCID myši jsou rovněž uznávaným modelem při studiu střevních zánětů tlustého střeva vyvolaného DSS. Původně bezmikrobní pregnantní myši byly kolonizovány třemi kmeny Lactobacillus rhamnosus. Ve stáří dvou měsíců byly myši kolonizovány mikroflórou konvenčně chovaných myší. Za měsíc po kolonizaci byl myším podáván k pití 3% roztok DSS po dobu jednoho týdne v tzv. akutním modelu ulcerózní kolitidy. Denně byly kontrolovány klinické změny charakterizující střevní zánět – snížení hmotnosti, průjem, krvácení z rekta, prolapsy. Po ukončení experimentu byla hodnocena délka tlustého střeva a zánět byl posouzen histologicky. Cytokinové odpovědi byly stanoveny v supernatantech po 48hod. kultivaci slezinných lymfocytů a fragmentů jejuna, ilea, vzestupného a sestupného tračníku. Na histologických řezech sestupného trakčníku jsme pozorovali, že ačkoliv u kontrolních myší se vyvinul masivní zánět, myši prekolonizované laktobacily známky střevního zánětu po týdenním pití DSS nevyka-
Alergie, Supplementum 2/2008
postery zovaly. Tyto nálezy byly podpořeny zjištěním, že rovněž zánětlivý cytokin TNF-alfa byl výrazně redukován, a to jak v supernatantu po kultivaci slezinných lymfocytů (systémová imunitní odpověď), tak v supernatantech po kultivaci fragmentů tlustého střeva (slizniční imunitní odpověď). Imunofluorescenčními a imunohistochemickými metodami jsme analyzovali expresi TLR-4, 5 a 9 u bezmikrobních, laktobacily-osazených a konvenčních myší. Zjistili jsme, že kolonizace laktobacily indukuje expresi TLR-5 a -9 v apikální části střevního epitelu, zatímco TLR-4 byly exprimovány hlavně v kryptách. Plynovou chromatografií jsme stanovili hladiny krátkořetězcových nasycených mastných kyselin ve stolici myší a zjistili jsme vyšší podíl kyseliny máselné a isomáselné u myší prekolonizovaných laktobacily. Pozorovali jsme, že monokolonizace laktobacily ovlivňuje přirozenou obranyschopnost organismu indukcí Toll-like receptorů a že prekolonizace Lactobacillus rhamnosus zabraňuje vývoji střevního zánětu u konvenčních SCID myší. Prezentované výsledky byly získány díky podpoře projektu granty 2B06053, 2B06155 Ministerstva školství a tělovýchovy České republiky a grantu IP-CZD S97/2005 (Polsko).
P 21/2 VLIV BAKTERIÍ STAPHYLOCOCCUS AUREUS A STREPTOCCOCUS UBERIS NA APOPTÓZU BOVINNÍCH LYMFOCYTŮ IN VITRO P. Sláma1,2, Z. Sládek1,2, D. Ryšánek2 1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně 2 Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i., Brno Staphylococcus aureus (S. aureus) a Streptococcus uberis (S. uberis) jsou důležitými grampozitivními patogeny, které způsobují u skotu klinické a subklinické mastitidy. Doposud byla studována role apoptózy neutrofilů v patogenezi akutního zánětu mléčné žlázy způsobené těmito bakteriemi. V průběhu rezoluce zánětu dochází k apoptóze neutrofilů, které jsou následně fagocytovány makrofágy. Vliv uvedených bakteriálních patogenů mléčné žlázy na modulaci apoptózy lymfocytů však není znám. Proto bylo cílem práce zjistit, zda S. aureus a S. uberis modulují apoptózu lymfocytů v in vitro podmínkách. Pro tento účel byly lymfocyty (získané po výplachu mléčné žlázy fyziologickým roztokem) inkubovány tři hodiny s bakteriemi S. aureus anebo S. uberis. Pro detekci apoptózy byl použit průtokový cytometr (FACSCaliburTM, Becton Dickinson, USA). Apoptotické lymfocyty byly detekovány po předchozím simultánním barvení Annexinem-V a propidium jodidem. Po třech hodinách inkubace byl u obou patogenů zjištěn statisticky významně (P < 0,01) nižší podíl apoptotických lymfocytů oproti kontrole. Výsledky tak naznačují, že bakterie S. aureus a S. uberis oddalují apoptózu lymfocytů. Tyto závěry budou potvrzeny nebo vyvráceny následnými pokusy in vivo při experimentálně indukované zánětlivé odpovědi výše uvedenými patogeny. Tato práce vznikla za finanční podpory výzkumného záměru MZE 0002716201.
P 21/3 AKTIVACE LIDSKÝCH KREVNÍCH FAGOCYTŮ SOLUBILNÍM GLUKOMANNANEM IZOLOVANÝM Z CANDIDA UTILIS V. Hájková1, D. Krejčová2, A. Moravcová2, M. Číž2, V. Velebný1, J. El-Benna3, A. Lojek2, L. Kubala2 1 CPN spol. s r. o., Dolní Dobrouč, Česká republika 2 Biofyzikální Ústav AV ČR, v. v. i., Brno, Česká republika 3 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U773, Université Paris 7-Denis Diderot, Site Bichat, 75018 Paris, France
Alergie, Supplementum 2/2008
Fagocyty hrají důležitou roli v nespecifické obraně organismu. V odpovědi na působení rozličných stimulů odpovídají intenzivní produkcí reaktivních metabolitů kyslíku (RKM) zvanou oxidativní vzplanutí. Klíčovým enzymem je NADPH oxidáza produkující superoxidový radikál dávající vznik dalším typům RKM. Přesná kontrola aktivace NADPH oxidázy je nezbytná pro ochranu vlastního organismu proti poškození nepřiměřenou produkcí RKM. Je známo, že produkce RKM fagocyty je ponteciována předchozím ovlivněním fagocytů různými látkami, zejména některými prozánětlivými cytokiny. Avšak efekt jiných solubilních látek izolovaných z patogenních mikroorganismů, jako například endotoxinu nebo polysacharidů, na aktivaci lidských fagocytů, a zejména oxidativního vzplanutí je stále nejasná. Proto jsme se zaměřili na modulaci oxidativního vzplanutí lidských fagocytů solubilním glukomannanem izolovaným z Candida utilis. Zředěná krev nebo izolované polymorfonukleární leukocyty (PMNL) byly inkubovány s různými koncentracemi glukomannanu (0,1–1 mg/ml) a bylo stanovováno oxidativní vzplanutí spolu s degranulací PMNL a analýzou aktivace NADPH oxidázové regulační podjednotky p47phox. Samotný solubilní glukomannan neindukoval signifikantní oxidativní vzplanutí ani v plné krvi ani izolovaných PMNL. Solubilní glukomannan však pontecioval produkci RKM v odpovědi na stimul opsonizovaným zymosanem a phorbol myristát acetátem jak v plné krvi, tak izolovaných PMNL, což bylo doprovázeno fosforylací podjednotky p47phox spojované s její aktivací. Dále solubilní glukomannan indukoval signifikantní degranulaci PMNL, což bylo stanoveno na základě zvýšení povrchové exprese CD11b, CD14, CD66, které jsou v klidovém stádiu uchovávány na membránách primárních a sekundárních granulí fagocytů. Celkově lze shrnout, že solubilní glukomannan aktivoval lidské krevní fagocyty, avšak bez signifikantní přímé indukce tvorby RKM.
P 21/4 VLIV INHIBITORŮ INDUCIBILNÍ SYNTÁZY OXIDU DUSNATÉHO NA PRODUKCI REAKTIVNÍCH KYSLÍKOVÝCH A DUSÍKOVÝCH METABOLITŮ U BUNĚČNÉ LINIE RAW 264.7 M. Pekarová1, L. Kubala1, J. Hrbáč2, A. Lojek1 1 Biofyzikální ústav, AVČR, v. v. i., Brno, Česká republika 2 Katedra fyzikální chemie, Univerzita Palackého, Přírodovědecká fakulta, Olomouc, Česká republika Reaktivní kyslíkové (RKM) a dusíkové metabolity (RDM) představují důležitý mikrobicidní mechanismus profesionálních fagocytů, jsou produkovány během jejich oxidativního vzplanutí. Produkce RKM a RDM, zejména superoxidového anionu a oxidu dusnatého (NO), je výsledkem aktivace enzymů NADPH oxidázy a inducibilní syntázy oxidu dusnatého (iNOS) různými typy aktivátorů. Jedna z nejpoužívanějších metod k detekci oxidativního vzplanutí je luminolem zesílená chemiluminiscence (CL). V našich předešlých experimentech jsme zjistili, že fagocytární CL je snížena pomocí inhibitoru iNOS enzymu, L-nitro-L-arginin methyl esteru (L-NAME). Proto jsme v této studii testovali potenciální efekt iNOS inhibitorů, jako jsou L-NAME, 2-amino-5,6-dihydro-6-methyl-4H1,3-thiazin, aminoguanidin, 2-(2-aminoethyl) isothiourea a LN6-(1-iminoethyl) lysin, na tvorbu RKM a RDM produkovaných makrofágy RAW 264.7 Ověřovali jsme možnost, zda tvorba NO a metabolitů od něj odvozených se může výrazně podílet na CL signálu po 15hodinové stimulaci buněk pomocí LPS. Navíc jsme jako kontrolní skupinu použili transfekovanou linii RAW 264.7 která byla „knocked down“ pro iNOS. Produkce NO byla sledována přímo pomocí elektrochemické detekce a nepřímo pomocí Griessovy metody (koncentrace dusitanů). Exprese iNOS proteinu byla stanovena použitím Western blottingu.
129
postery V našich experimentech jsme zjistili, že všechny výše uvedené iNOS inhibitory jsou schopny snižovat produkci NO v buňkách stimulovaných pomocí LPS, aniž by ovlivnily samotnou expresi iNOS proteinu. Chemiluminiscenční signál byl všemi iNOS inhibitory redukován (o 40 %), přičemž stejní pokles byl detekován také u transfekovaných buněk. Zajímavé je, že při použití L-argininu, substrátu specifického pro iNOS enzym, byl signál chemiluminiscence naopak statisticky významně zvýšen. Tyto výsledky naznačují, že produkce NO vyvolaná stimulací buněk pomocí LPS výrazně přispívá k luminolem zesílené chemiluminiscenci u RAW 264.7. Tento efekt by mohl být vysvětlen formací většího množství vysoce reaktivního peroxynitritu, který vzniká reakcí NO a superoxidového anionu, a jeho přispění k CL signálu. Tato studie vznikla za podpory výzkumního záměru AVOZ50040507 a grantu No.524/08/1753 (GA CR).
P 21/5 VPLYV POTENCIÁLNE PROBIOTICKÝCH KMEŇOV DRUHU LACTOBACILLUS REUTERI NA NEŠPECIFICKÚ IMUNITNÚ ODPOVEĎ H. Koščová, B. Urbančíková, M. Bukovský, M. Dubničková Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra bunkovej a molekulárnej biológie liečiv, Bratislava Medzi hlavné kritéria, ktoré by mal spĺňať probiotický mikroorganizmus, patrí udržiavanie rovnovážneho stavu črevnej slizničnej imunity. Najdôležitejším mechanizmom probiotických mikroorganizmov uplatňujúcim sa pri stimulácii črevného imunitného systému je klonálna expanzia B-lymfocytov produkujúcich IgA a udržiavanie rovnováhy diferenciácie TH1- a TH2-lymfocytov. Probiotiká indukujú reguláciu vrodenej imunitnej odpovede v pozitívnom alebo negatívnom zmysle s cieľom zabezpečiť črevnú rovnováhu a rovnováhu medzi bunkovou a protilátkovou imunitnou odpoveďou. Testovaním imunomodulačnej aktivity in vitro na izolovaných ľudských leukocytoch kmeňa L. reuteri E izolovaného z črevej sliznice jahňaťa chovaného na mliečnej strave, zbierkového kmeňa L. reuteri CCM 3625, ako aj ich kombinácie, sme zisťovali, či tieto kmene spĺňajú základné kritériá pre použitie v praxi. Oba testované kmene L. reuteri signifikantne zvyšujú fagocytovú aktivitu, pričom najvýraznejšie zvýšenie (o 39 %) tejto aktivity pozorujeme pri kombinácii týchto dvoch kmeňov. Novoizolovaný kmeň L. reuteri E inhibuje mikrobicídnu aktivitu ľudských leukocytov voči Staphylococcus aureus, Escherichia coli a Candida albicans. Avšak v kombinácii so zbierkovým kmeňom L. reuteri CCM 3625 signifikantne zvyšujú mikrobicídnu aktivitu leukocytov voči S. aureus o 26 %, voči E. coli o 136 % a voči C. albicans o 54 %. Peroxidázovú aktivitu ľudských leukocytov zbierkový kmeň L. reuteri CCM 3625 zvyšuje o 145 % a L. reuteri naopak znižuje o 91%, ich kombinácia však stimuluje peroxidázovú aktivitu o 54 %. Lyzozýmová aktivita leukocytov je stimulovaná kmeňom L. reuteri o 34 % a inhibovaná kmeňom L. reuteri CCM 3625 o 90 %. Kombinácia oboch kmeňov lyzozýmovú aktivitu leukocytov signifikantne zvyšuje až o 127 %. Testovaniu samotného vplyvu na nešpecifickú imunitnú odpoveď predchádzalo stanovenie citlivosti na antibiotiká a vplyv žlče na prežívanie kmeňov L. reuteri. Oba kmene dobre prežívajú v prostredí s obsahom žlče, pričom v najvyššej koncentrácii (10 g/l) dochádza k poklesu prežívajúcich buniek o 47 % zbierkového kmeňa L. reuteri CCM 3625. L. reuteri E si aj pri tejto koncentrácii žlče udržiava životaschopnosť buniek na úrovni kontroly. Citlivosť na antibiotiká sme testovali štandardnou diskovou metódou. Zistili sme, že oba kmene vykazujú rezistenciu voči tobramycínu a kmeň L. reuteri E aj voči ceftazidímu.
130
Práca vznikla s podporou Grantu Univerzity Komenského č. UK/68/2008 a MŠ SR: VEGA 1/4290/07.
P 21/6 THE EFFECTS OF GLIADIN FRAGMENTS ON HUMAN DENDRITIC CELLS MIGRATORY CAPACITIES B. Pecharová, L. Palová-Jelínková, J. Kamanová, L. Tučková Institute of Mikrobiology, Academy of Science of the Czech Republic, Prague Celiac disease is a chronic inflammatory disease developing in genetically predisposed individuals. Ingested gliadin, the triggering agent of the disease, can cross the epithelial barrier and elicit a harmful T cell mediated immune response. Here we show the effects of gliadin fragments on dendritic cells (DC) migratory capacities and the intracellular signaling driving cytoskeleton rearrangement. During maturation, DCs migrate toward T cell areas, they upregulate chemokine (C-C motif) receptor 7 (CCR7) on the surface and become responsive to CCR7 ligands CCL19 and CCL21. Treatment of DC with gliadin peptic fragments led to up-regulation of CCR7 and increased cell motility. Gliadin-stimulated cells (in the absence of chemokine stimulation) showed higher spontaneous migration compared to the immature DCs. The effect was dosedependent and more pronounced at 48 hours of incubation. However, addition of CCL19 and CCL21 ligands induced a significant increase in the amount of migrating gliadin-treated cells, whereas migration of immature DC was only slightly increased. MAPK p38 was shown to participate in the activation pathway and maturation of DC triggered by gliadin fragments. We have documented that inhibitor of p38 MAPK also decreased expression of gliadin-induced CCR7 to basal level and blocked gliadin-matured DC migration. Small GTPases of the Rho family (RhoA, Rac1 and Cdc42) are involved in cell adhesion dynamics by controlling the actin reorganization as well as formation and turnover of microtubules. Stimulation of DCs with gliadin fragments induced increase in RhoA-GTP level when compared to unstimulated cells, whereas the total amount of RhoA remained constant. Gliadin promotes Rho activation followed by cofilin dephoshorylation and cytoskeleton rearrangement leading to loss of podosomes and forming of dendrites on matured DCs. Altogether, our findings suggest that gliadin fragments improve chemotactic responsiveness of DCs by up-regulating CCR7 expression and triggers the activation of intracellular signaling pathways and microfilament cytoskeleton rearrangement.
P 21/7 VLIV APOCYNINU A DPI NA TVORBU OXIDU DUSNATÉHO MYŠÍMI MAKROFÁGY PO STIMULACI ENDOTOXINEM D. Krejčová1, 2, A. Lojek1, L. Kubala1 1 Biofyzikální ústav AV ČR, v. v. i., Brno 2 Ústav experimentální biologie, Oddělení fyziologie a imunologie živočichů, Přírodovědecká fakulta, Masarykova Univerzita, Brno Endotoxin značnou měrou přispívá k zánětlivým onemocněním plic po chronické expozici prašným podmínkám. Stimuluje buňky plicního epitelu a imunitního systému včetně alveolárních makrofágů, které následně produkují prozánětlivé mediátory rozvíjející zánětlivou reakci, tvorbu reaktivních kyslíkových metabolitů (RKM) a oxidu dusnatého (NO). NO hraje důležitou roli jak v obraně hostitele, tak v regulaci průběhu zánětlivé reakce, avšak nadměrná produkce NO je spojována s poškozením vlastního organismu. Klíčovým zdrojem NO v průběhu imunitní reakce je inducibilní syntáza NO (iNOS). Předpokládá se, že intracelulár-
Alergie, Supplementum 2/2008
postery ně produkované RKM aktivují signální pochody v buňce vedoucí ke zvýšení exprese iNOS. Cílem práce bylo zjistit, jaký vliv mají antioxidant apocynin a DPI (diphenyleneiodonium chlorid – inhibitor enzymů s flavoproteinovou strukturou) na expresi iNOS a tvorbu NO myšími makrofágy RAW 264.7. Byl také testován vliv apocyninu na akutní zánět plic myší vyvolaný expozicí k endotoxinu. V pokusech in vitro bylo zjištěno, že jak apocynin, tak DPI v koncentrační závislosti významně inhibovaly endotoxinem indukovanou expresi proteinu iNOS detekovanou Western blotem a tvorbu NO stanovenou na základě detekce nitritů v médiu. Naproti tomu intranasálně aplikovaný apocynin signifikantně neovlivňoval průběh akutního plicního zánětu myší, který byl monitorován měřením počtu infiltrovaných zánětlivých buněk do plic, a dále analýzou koncentrace nitritů a prozánětlivých cytokinů v bronchoalveolární laváži. Výsledky studie prokázaly, že apocynin a DPI mají silný potenciál inhibovat zvýšení exprese iNOS in vitro. Tento efekt však nebylo možné prokázat in vivo na modelu akutního zánětu plic myší. Práce vznikla za podpory grantu 524/06/1197 Grantové agentury České republiky a výzkumného záměru AVOZ5004050.
P 21/8 DETEKCE A CHARAKTERIZACE POPULACE DENDRITICKÝCH BUNĚK POMOCÍ OSMIBAREVNÉ FACS ANALÝZY I. Zentsová-Jarešová, D. Rožková, J. Kayserová, A. Šedivá Ústav imunologie, 2. lékařská fakulta, Univerzita Karlova a Fakultní nemocnice Motol, Praha
P 21/9 VLIV THYMICKÉHO STROMÁLNÍHO LYMFOPOETINU NA SUBPOPULACE DENDRITICKÝCH BUNĚK J. Kopecká, D. Rožková, A. Šedivá Ústav imunologie, UK 2. lékařská fakulta a FN Motol v Praze Thymický stromální lymfopoietin (TSLP) je nedávno popsaný cytokin, strukturálně podobný IL-7. Produkován je hlavně epiteliálními buňkami. Podle dosud dostupných údajů TSLP in vitro aktivuje lidské myeloidní dendritické buňky (mDC) k indukci tzv. zánětlivých Th2-lymfocytů. Cílem projektu bylo kompletně charakterizovat vliv TSLP na jednotlivé subpopulace DC, a to na dendritické buňky derivované z monocytů (MoDC), myeloidní DC (mDC) a plazmacytoidní DC (pDC). Zaměřili jsme se na studium vzájemného působení TSLP a TLR ligandů, neboť ve slizničních tkáních dochází ke kontaktu DC s bakteriemi v přítomnosti TSLP produkovaného epitelem. Přesto, že všechny studované DC exprimují TSLPR, reagují na stimulaci TSLP odlišným způsobem. Na rozdíl od mDC, u kterých TSLP indukuje výrazné fenotypové změny (indukce exprese kostimulačních molekul) a změny ve stimulační a proliferační kapacitě, u MoDC měl TSLP pozitivní vliv pouze na produkci IL-6 a IL-12 . Rovněž nebyly pozorovány výraznější změny v množství Th1- a Treg-lymfocytů. Překvapivě bylo zjištěno, že MoDC samy o sobě exprimují TSLP na úrovni mRNA. U populace pDC nedocházelo ke změnám ve fenotypu, ale po stimulaci TSLP v přítomnosti agonisty TLR9, CpG ODN typu A, se výrazně zvýšila produkce IFN-α. Z našich výsledků vyplývá, že TSLP rozdílným způsobem ovlivňuje studované populace lidských DC a že za určitých okolností ovlivňuje i pDC, které v souvislosti s TSLP doposud nebyly studovány. Podpora: VZ MSM 002 162 0812.
Dendritické buňky (DC) jsou specifické antigen-prezentující buňky hrající důležitou roli v iniciaci a směřování imunitní reakce. DC jsou většinou definovány na základě expresních markerů, jako jsou CD45, HLA-DR, jejich subpopulace pak jako buňky exprimující CD11c (mDC) a CD123 (pDC). V poslední době však byly dendritické buňky rozděleny do nově definovaných skupin, a to na CD16+, CD1c (BDCA-1) +, BDCA-3+, CD123+ (BDCA-2+). V této studii jsme charakterizovali právě tyto DC subsety v periferní krvi a poprvé v BALu (bronchoalveolární lavage) pomocí osmibarevné FACS analýzy, s cílem popsat jejich zastoupení a a expresi PRRs receptorů (pathogen recognation receptors) v různých prostředích. Vytvořili jsme specifický panel protilátek, který detekuje tři subsety lidských dendritických buněk současně. Tyto populace buněk jsme charakterizovali pomocí CD45, Lin- (CD3,CD19,CD20,CD56), HLA-Dr, CD14, CD16, BDCA-1,3 a BDCA-2. U těchto skupin jsme dále měřili jejich expresi PRRs (DC-SIGN, MR, DEC-205, TLR2, 4) na proteinové úrovni. Předběžná data naznačují, že v obou mikroprostředích se vyskytují všechny čtyři subsety. Zatímco v krvi je nejsilněji zastoupena populace mDC CD11c+CD16+, v BALu je zastoupení subpopulací více variabilní. Důvodem je zřejmě velmi špatná životnost CD11c+CD16+ DC po bronchoskopii. Zajímavé je, že CD11cBDCA-3+DC, které tvoří v krvi minoritní populaci, reprezentují v BALu druhou nejvíce dominantní skupinu. Zajímavé také je, že dendritické buňky v BALu silněji exprimují PRRs receptory než-li DC v krvi. Tato práce byla podpořena granty: IGA NR 8458-5, MZ ČR 00064203 Ministerstva zdravotnictví a projektem GAUK 0021620812 a VZMŠMT MSM 0021620812 Ministerstva školství.
Alergie, Supplementum 2/2008
P 21/10 „EARLY ONSET SARCOIDOSIS“ BEZ TYPICKÉ MUTACE CARD15/NOD2 GENU – KAZUISTIKA A. Poloučková1, J. Bartůňková1, J. Kayserová1, A. Šedivá1, P. Vavřincová2 1 Ústav imunologie UK 2.LF a FN Motol, Praha 2 Dětská poliklinika – revmatologická ambulance, Fakultní nemocnice Motol, Praha „Early onset sarcoidosis“ (EOS) je chronické onemocnění projevující se zánětlivým granulomatózním postižením kůže (granulomatózní dermatitis), kloubů (synovitis, polyartrirtis) a očí (uveitis). Společně s Blau-ovým syndromem je řazeno mezi pediatrické granulomatózní artritidy a „autoinflamatorní“ syndromy. Roli v patogenezi onemocnění hraje defekt v mechanismech přirozené imunity. EOS je silně asociován s mutací v CARD15/NOD2 genu, zejména v NACHT doméně. CARD15/NOD2 gen je lokalizován na chromozomu 16 a kóduje intracelulární receptor, který rozeznává bakteriální muramyl dipeptid. Mutace v genu signifikantně zvyšují bazální NF- кB aktivitu, což následně vede k nadprodukci IL-1 β a k „autoinflamatorním“ klinickým projevům. Recentně byly v literatuře popsány nové klinické jednotky spadající pod „autoinflamatorní“ syndromy, u kterých byly nalezeny mutace v jiných částech genu CARD15/NOD2, případně v genech kódujících jiné proteiny v kaskádě vedoucí k produkci prozánětlivých cytokinů. V léčbě EOS se s úspěchem uplatňuje anti-TNF terapie. Autoři prezentují kazuistiku 6leté pacientky sledované a léčené na Ústavu imunologie FN Motol a v revmatologické ambulanci Dětské polikliniky FN Motol pro recidivující febrilní ataky s vysokými zánětlivými parametry, chronickou uveitidou, erytema nodosum, polyartritidou a mnohočetnými granulomy na kůži a v parenchymatózních orgánech. U dívky nebyla mutace v doméně NACHT genu CARD15/NOD2 prokázána.
131
postery Vzhledem k tomu, že mutace nebyla prokázána i vzhledem k nedostatečné odpovědi na anti-TNF léčbu, autoři diskutují diferenciální diagnostiku v rámci „autoinflamatorních“ onemocnění s podobným fenotypem, ale jiným genetickým podkladem.
modifikovaný kolagen ztrácí schopnost aktivovat krevní destičky a fagocyty. Aktivované krevní destičky mohou modulovat oxidativní vzplanutí fagocytů prostřednictvím uvolněných mediátorů, např. serotoninu.
Práce byla podpořena VZ MŠMT ČR MSM 0021620812.
Práce byla vypracována za podpory projektů GA ČR 524/04/0897 a NATO CBP.EAP.CLG 982048.
P 21/11 SOUČINNOST KOLAGENU, KREVNÍCH DESTIČEK A FAGOCYTŮ V MODULACI TVORBY REAKTIVNÍCH METABOLITŮ KYSLÍKU A DUSÍKU M. Číž1, H. Čížová1, L. Prachařová1, I. Goshev2, V. Jančinová3, R. Nosáľ3, A. Lojek1 1 Biofyzikální ústav AV ČR v. v. i., Brno 2 Institute of Organic Chemistry with Centre of Phytochemistry, BAS, Sofia 3 Ústav experimentálnej farmakológie SAV, Bratislava V práci byla testována hypotéza, že složky mezibuněčné hmoty (kolagen), krevní destičky a fagocyty úzce spolupracují a v konečném důsledku modulují rozsah oxidativního vzplanutí fagocytů. Hlavním cílem studie bylo objasnit mechanismy oxidativní modifikace kolagenu, účinky nemodifikovaného i oxidativně modifikovaného kolagenu na krevní destičky a fagocyty a účinky destičkového mediátoru serotoninu na fagocyty. Vzorky potkaního kolagenu typu I (1 mg/ml v 50 mM kyselině octové) byly podrobeny oxidativní modifikaci peroxidem vodíku (100 mM, 300 mM), hydroxylovým radikálem (100 mM FeSO4/2 mM H2O2, 50 mM FeSO4/5 mM H2O2), peroxylovým radikálem (termální dekompozice 200 mM azobis(2-amidinopropan) dihydrochloridu) nebo 280 μM NaOCl a poté dialyzovány proti 10 mM HCl. Termální denaturace vzorků kolagenu byla monitorována na UV-VIS spektrofotometru Specord M-40 (Carl Zeiss, Německo), vybaveném zařízením pro regulaci teplotního gradientu TSE-1. Byl použit teplotní gradient 0,5 °C/min v teplotním rozsahu 22–50 °C. Agregace izolovaných lidských krevních destiček byla měřena optickou metodou na agregometru Chronolog (USA). Po 1minutové stabilizaci při 37 °C byla agregace krevních destiček (450 μl) iniciována přidáním 20 μl testovaného vzorku. Oxidativní vzplanutí opsonizovaným zymosanem, forbol myristát acetátem, N-formyl-metionyl-leucyl-fenylalaninem nebo vápníkovým ionoforem A-23187 aktivovaných neutrofilů v plné lidské krvi bylo měřeno pomocí luminolem zesílene chemiluminiscence na luminometru Orion II (Berthold, Německo) po dobu 60 minut při 37 °C. Použité metody způsobily oxidativní modifikaci kolagenu, charakterizovanou poklesem denaturačních teplot. Nemodifikovaný kolagen vykazoval podobnou schopnost vyvolat agregaci krevních destiček jako trombin. Všechny vzorky oxidativně modifikovaného kolagenu, bez ohledu na způsob oxidativní modifikace, tuto schopnost vyvolat agregaci krevních destiček úplně ztratily. Nemodifikovaný kolagen indukoval oxidativní vzplanutí neaktivovaných lidských fagocytů. Oxidativně modifikované vzorky kolagenu tuto schopnost ztratily. Méně zřetelná modulace oxidativního vzplanutí fagocytů byla zaznamenána v případě aktivovaných fagocytů. Serotonin, mediátor krevních destiček, inhiboval chemiluminiscenční odpověď fagocytů v závislosti na použité koncentraci, přičemž koncentrace nižší než 10-5 M byly neúčinné. Na základě předběžných pokusů lze usuzovat, že inhibiční účinky serotoninu na aktivitu neutrofilů mohou být alespoň částečně zprostředkovány specifickými receptory pro serotonin, exprimovanými na povrchu fagocytů. Dalším možným vysvětlením inhibice chemiluminiscenční odpovědi fagocytů jsou přímé vychytávací účinky serotoninu. Závěrem lze shrnout, že reaktivní metabolity kyslíku, produkované při oxidativním vzplanutí fagocytů, mohou oxidativně modifikovat kolagen, hlavní složku mezibuněčné hmoty. Oxidativně
132
P 21/12 ÚČINOK EXTRAKTU ZO SLINNÝCH ŽLIAZ LARIEV LUCILIA SERICATA NA LUDSKÉ NEUTROFILY J. Pečivová 1, T. Mačičková1, P. Takáč2, M. Kovácsová2, M. Kozánek2, D. Cupaníková3 1 Ústav experimentálnej farmakológie, Bratislava 2 Ústav zoológie, SAS, Bratislava 3 Národné transfúzne centrum, Bratislava S obnovením záujmu o liečbu chronických nehojacich sa rán, infikovaných baktériami rezistentnými na antibiotiká, pomocou lariev muchy Lucilia sericata, sa zvyšuje aj snaha o charakterizáciu sekrétov účinných látok zo slinných žliaz. Larvy sú aplikované na ranu v štádiu chronického zápalu. V dôsledku mimoteľového trávenia vylučujú zo slinných žliaz zmes aktívnych látok, ktorými rozpúšťajú, natravujú nekrotické tkanivo, dezinfikujú a v konečnom dôsledku prispievajú k hojeniu rany. V tom čase sú tam chemotaxiou nakumulované aj profesionálne fagocyty, tj. neutrofily a makrofágy. Tým vzniká otázka, ako je ovplyvnená funkčná odpoveď neutrofilov, ktoré sa v mieste zápalu podieľajú na fagocytóze a likvidácii prítomných baktérií, pritom však svojou mikrobicídnou výbavou môžu prispievať k ďalšiemu poškodeniu tkanív. Superoxid, ktorý vzniká ako prvý z radu reaktívnych metabolitov kyslíka, a myeloperoxidáza (MPO) sú klúčovými faktormi obrannej reakcie aktivovaných neutrofilov. Podieľajú sa priamo, alebo ako metabolity, na mikrobicídnych dejoch, ako aj na prenose signálu pri fyziologických i patofyziologických stavoch organizmu. Ako modelovú situáciu zápalu sme na aktiváciu neutrofilov použili opsonizovaný zymosan (OZ) (partikulárny) a N-formylmetionyl-leucyl-fenylalanín (fMLP) ako rozpustný stimul. Obi dva stimuly aktivujú neutrofily cez vlastný receptor na membráne a stimulujú tvorbu superoxidu a uvoľnenie MPO. Hrubý extrakt zo slinných žliaz znižil chemiluminescenciu krvi po OZ, tvorbu superoxidu aj uvoľnenie myeloperoxidázy. Jeho inhibičný účinok bol väčší na respiračné vzplanutie vyvolaného látkou fMLP v porovnaní s OZ. Domnievame sa, na základe našich aj literárnych údajov, že k zlepšeniu hojenia prispieva aj zníženie uvoľnenia a tvorby prozápalových faktorov fagocytov, pričom schopnosť fagocytózy ostáva zachovaná, čiže účinok fagocytov a extraktov zo slinných žliaz nie je kontraproduktívny, ale v podstate synergický. Práca bola podporená projektmi VEGA: 2/7019/27, VEGA 2/0147/08.
P 21/13 ÚČINOK ARBUTÍNU A KVERCETÍNU NA TVORBU REAKTÍVNYCH METABOLITOV KYSLÍKA V LUDSKEJ KRVI A NEUTROFILOCH IN VITRO J. Pečivová1, V. Jančinová1, T. Mačičková1, K. Drábiková1, T. Perečko1, M. Petríková1, D. Košťálová3, J. Carbolová3, D. Cupaníková2, R. Nosáľ3 1 Ústav experimentálnej farmakológie 2 Národné transfúzne centrum 3 Farmaceutická fakulta UK, Bratislava
Alergie, Supplementum 2/2008
postery Prírodné látky sa dostávajú do popredia záujmu ako možnosť, v kombinácii so štandardnými terapeutickými postupmi, zvýšiť účinnosť liečby degeneratívnych ochorení zápalového typu. Arbutín a kvercetín sú obsahové látky extraktu z rastliny Arctostaphylos uva-ursi. Na vytvorenie modelovej situácie zápalovej reakcie sme na aktiváciu fagocytov v plnej krvi ako aj izolovaných neutrofilov použili forbol-myristat-acetat (PMA). Pomocou luminoforov sme zosilnili intenzitu prirodzenej chemiluminiscencie (CL) a zmerali tak tvorbu ROS produkovanych profesionálnymi fagocytmi extracelulárne (izoluminol) a intracelulárne (luminol v prítomnosti superoxid dizmutázy a katalázy). Obi dve sledované látky porovnateľne znižovali chemiluminiscenciu (CL) plnej krvi a extracelulárnu CL izolovaných neutrofilov. Kvercetín v konc 10 a 100 μmol/l štatisticky významne znížil aj intracelulárnu CL izolovaných neutrofilov, kým arbutín intracelulárnu CL neovplyvnil. Spektrofotometricky sme stanovili účinok arbutínu a kvercetínu na ovplyvnenie 2 faktorov, podstatatne prispievajúcich k CL tvorbou reaktívnych metabolitov
kyslíka (RMK), a to: tvorbu superoxidu a uvoľnenie myeloperoxidázy. Arbutín a kvercetín pôsobili na tvorbu superoxidu inhibične v závislosti na čase inkubácie a koncentrácii látok, ani jedna zo sledovaných látok neovplyvnila aktivitu intaktných nestimulovaných neutrofilov. Za porovnateľných podmienok bol účinok kvercetínu > arbutínu a v porovnaní s inhibíciou tvorby RMK, menší na aktivitu MPO. Schopnosť kvercetínu znížiť intracelulárnu tvorbu RMK, zistenú ako zníženie CL, by mohla znamenať určité zníženie mikrobicídnej aktivity neutrofilov v prípade akútnej infekcie. Naopak pozitívne je štatisticky významné zníženie extracelulárnej tvorby RMK aj uvoľnenia MPO, ktorých nadmerná nekontrolovaná prítomnosť môže prispievať k poškodzovaniu vlastných tkanív, k zvýšenej aktivácii zápalových buniek, či zmenám v prenose signálov extra- a intracelulárne. Práca bola podporená projektmi VEGA: 2/7019/27, APVV -0315-07, SK-CZ-0114-07.
22 Slizniční imunita
P 22/1 VLIV STŘEVNÍ MIKROFLÓRY NA VZNIK KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU V MYŠÍM MODELU K. Klimešová, P. Rossmann, M. Kverka, T. Hudcovic, H. Tlaskalová-Hogenová Mikrobiologický ústav AVČR, v. v. i., Praha Kolorektální karcinom patří mezi nejčastější nádorová onemocnění ve světě i v České republice. Je obecně přijato, že přítomnost chronického zánětu napomáhá tvorbě nádoru. Pacienti s ulcerózní kolitidou mají 2 až 8× vyšší riziko vzniku kolorektálního nádoru v porovnání se zdravými jedinci. Naším cílem bylo zaznamenat rozdíly v karcinogenezi u myší chovaných v konvenčních a bezmikrobních podmínkách. V experimentu byl použit zavedený model kolorektálního karcinomu. Myším kmene Balb/c byla subkutánně podána dávka azoxymethanu (10 mg/kg) a po týdnu jim byla na 5 dní vyměněna voda za 3% roztok dextran sulfátu sodného. Aby byl porovnán efekt při snížení obsahu bakterií ve střevě, byla jedné skupině myší po celou dobu pokusu podávána antibiotika (ciprofloxacin a metronidazol). V 6. a 12. týdnu byly odebrány vzorky. Byla změřena délka tlustého střeva a zvážena slezina. Distální část kolon a rektum byly poté hodnoceny histologicky a doplněny imunohistochemickým stanovením beta-kateninu a iNOS. V séru byla změřena hladina haptoglobinu pomocí tesu ELISA. Myši s kolorektálním nádorem mají kratší střevo než myši kontrolní. V histologických řezech jsme pozorovali chronické zánětlivé změny, různé stupně dysplazie a adenokarcinomu. V 6. týdnu se karcinom vyskytoval u 80 % konvenčních myší, 40 % myší s antibiotiky a 20 % bezmikrobních myší. Ve 12. týdnu se četnost nálezů u konvenčních myší zvýšila na 87,5 %, ale zůstala 40% u myší s antibiotiky. Imunohistochemií jsme prokázali silné zbarvení jader buněk karcinomu po reakci s protilátkou proti beta-kateninu a podobně také zvýšenou přítomnost iNOS v cytoplazmě. Hladina haptoglobinu je vyšší u myší, u kterých přetrvává chronický zánět nebo se vyvinul nádor. Z výsledků této studie vyplynul význam střevní mikroflóry při vzniku a vývoji kolorektálního karcinomu. Přítomnost střevních komenzálních bakterií hraje důležitou roli při tvorbě a četnosti lézí.
P 22/2 FUNKCE SLIZNIČNÍ BARIÉRY VE ZDRAVÍ A NEMOCI – EXPERIMENTÁLNÍ MYŠÍ MODEL R. Štěpánková1, H. Kozáková1, T. Hudcovic 1, F. Powrie3, O. Kofroňová2, T. Hrncíř1, H. Tlaskalová-Hogenová1 1 Oddělení Imunologie a gnotobiologie 2 Laboratoř electromikroscopie, Mikrobiologický ústav, Praha, Česká repubika 3 Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford, UK Cíl práce: Cílem práce bylo analyzovat efekt střevních bakterií na vývoj kolitidy a stanovit morfologické změny střevní sliznice ve zdraví a nemoci. Metoda: Imunodeficitní SCID-myši s těžkým deficitem Ta B-buněk myši byly chovány v izolátorech pro bezmikrobní chovy. CD4+CD45RB/high T-lymfocyty byly separovány ze slezin konvenčních myší magnetickou separací (MACS) za pomoci protilátek. Výsledek: Kolitida byla vyvolána u imunodeficitních myší (SCID) po i.p. přenosu Th1-buněk (CD4+CD45RB/high) které byly získány ze slezin konvenčních Balb/c myší. Kolitida se vyvinula pouze u SCID myší osazených konvenční střevní mikroflórou. U bezmikrobních SCID myší a myší kolonizovaných koktejlem bakterií, kde převažovaly lactobacily, se kolitida nevyvinula. Vývoj kolitidy je charakterizován zánětlivými změnami na sliznici kolon, v terminálním ileu byla nalezena změna TJs (tight junctions-těsných spojů): stanovili jsme proteiny ZO-1 a Claudin-1, dále pak v Panetových buňkách nebyl přítomen α-defensin (cryptdin -4). Metodu in situ hybridizace (FISH) jsme detekovaly bakterie které adherují na střevní sliznici, zde jsme použili oligonukleotidové proby 16S rRNA (detekující všechny bakterie EUB 338, E. coli ECO 1531, Erectale 482-Clostridia a segmentované filamentózní bakterie 11008) značené FITC nebo Cy3. Po osazení bezmikrobních zvířat koktejlem bakterií pro SPF chovy s vysokým obsahem laktobacilů a následném přenosu CD4+CD45RB/high T-lymfocytů morfologická charakteristika střevní sliznice nebyla změněna a kolitida se nevyvinula. Závěr: Patologický nebo naopak ochranný vliv střevních bakterií je potřeba hodnotit i z pohledu změn na střevní sliznici, a to jak α-defensinu (u myší cryptdinu-4) tak změn TJs (tight junctions), adherence bakterií, počtu pohárkových buněk a produkce hlenu. Podporované Grantem EU No. QLGI-199-00050 Grantem České Grantové Agentury 303/08/0867.
Alergie, Supplementum 2/2008
133
