15/03/2010
TRANSGENOZE ROSTLIN vnášení cizorodých genů či jiné genetické informace do rostlin a manipulace s nimi (GMO)
TRANSGENOZE trvalá - změna genetické i k iinformace f jje přenášená na potomstvo (infekce Agrobakteriem)
TRANSGENOZE dočasná - genetická informace je změněna pouze u vegetativní části rostliny a nepřenáší se na potomstvo (elektroporace, biolistické metody)
1
15/03/2010
PG1
Agrobacterium tumefaciens •
• •
patogenní bakterie přirozeně se vyskytující v kořenovém systému bobovitých rostlin přítomnost baktérie se projevuje tumory tzv. crown gall tissue Agrobacterium je schopné napadat jakékoliv pletivo většiny dvouděložných rostlin a za určitých podmínek i rostlin jednoděložných
Ti plazmid
(tumor inducing)
Agrobacteria tumefaciens (200 kb) ipt,aux,nop syntéza cytokininů auxinů opinů
další geny pro biosyntézu cytokininů, permeasy, přenašeče přes membránu, enzymy metabolizující opiny a ostatní enzymy umožňující infekci
2
Snímek 3 PG1
čeleď Rhizobiaceae, stejně jako symbiotické bakterie fixující dusík např druh Rhizobium galuszka; 18/03/2006
15/03/2010
PG2
rostlina při zranění produkuje fenolické látky (acetosyringon), ty se váží na specifické receptory na membráně Agrobacteria VirA a způsobují transkripci genu s vir regionu Ti plazmidu Agrobacteria
nopalin
• aktivace vir regulonu • VirD2 protein se váže na 5‘ T-DNA (transferred) • denaturace ss T-DNA z Ti plazmidu • VirE2 proteiny stabilizují ss T-DNA • VirD2 Vi D2 a VirE2 Vi E2 proteiny i obsahují b h jí sekvenci potřebnou pro cílení do jádra rostlinné buňky • VirE2 se váže na proteiny VIP1 a VIP2 které zacílí T-DNA řetězec do chromatinu rostlinného chromozomu
3
Snímek 5 PG2
opines: nopaline a octopine, together with cytokinins nand auxins are synthetised in infected cells, serve as a source of nitrogen and energy for agrobacterium galuszka; 18/03/2006
15/03/2010
binární vektory odvozené od Ti plazmidu pro genetickou modifikaci rostlin Ti plazmid je rozdělen na dva: pomocný plazmid (velký): nese větší část Ti plazmidu, všechny geny potřebné pro symbiózu s hostitelem a přenos T-DNA klonovací plazmid (malý): nese pouze T-DNA, do jejíž části se naklonuje požadovaná gen.informace, replikační počátky pro E.coli a Agrobacterium a potřebné selekční markery
klonovací plazmid pBinpBin-Hyg Hyg-TX polylinker
resistence k hygromicinu B (selekce transgenních rostlin))
T-DNA tetracyklinový supresor
replikační počátky ori
resistence ke kanamycinu
• požadovaný gen se překlonuje do polylinkeru a konstrukt se namnoží v E.coli . Pro přenos je nutná jen 25bp repetice z konce původní T-DNA. (kanamycinová selekce) • transformace do Agrobacteria nesoucí pomocný vektor (selekce Kan, Rimf, Gent) • transformace rostliny a selekce transgenního potomstva (selekce hygromycinová)
pomocný plazmid ma resistenci k rimfapicinu a gentamycinu
4
15/03/2010
začlenění TT-DNA do chromozomu Arabidopsis thaliana • začlenění T-DNA T DNA do hostitelské hostitelského chromozomu je víceméně náhodné • nejčastěji se začlení jedna TDNA do jedné buňky, muže však nastat i několikanásobné začlenění • kolem centromer je začlenění méně pravděpodobné • čím blíže telomerám tím větší pravděpodobnost
transgenoze Agrobacteriem •
standardní postupy pro řadu dvouděložných užitkových rostlin (rajče, hořčice, fazole).
•
nevýhoda: zdlouhavá regenerace přes tkáňové kultury
•
ne u všech se dá p použít „g „germ-line“ transformace jjako u Arabidopsis p
•
transformace T-DNA se dá využít i jako inzertní mutageneze. T-DNA přeruší důležitý gen (mutace) a tuto mutaci lze pak pomocí markerů na T-DNA snadno lokalizovat. Existují databanky mutantních (transgeních) rostlin Arabidopsisu, kdy máte mutaci (inzerci) přímo v genu který studujete.
•
od poloviny 90 let možná transformace i jednoděložných - lilie, palmy, obilniny. Použití supervirulentních kmenů Agrobacteria, hlavní problém je v regeneraci. g
5
15/03/2010
transgenoze namáčením květů (floral dipping, germgerm-line) A) rostliny Arabidopsis se vypěstují do fertilního stádia (3-5 v květináči) B) lodyhy l d h sk květy se vymáchají h j vk kultuře l Agrobacteria nesoucí binární systém vektorů s naklonovaným transgenem (5-10 min., přidává se smáčedlo). C) rostliny se nechají pořádně okapat a vrátí do skleníku, kde dozrají (vytvoří semena) D) transgenní semena se selektují vyklíčením na živném médiu obsahující selekční marker (hygromycin)
např. Arabidopsis thaliana
transgenoze namáčením květů (floral dipping) Agrobacterium se dostává do y j j se květů a T-DNA jje vyvíjejících včleněna do samičího gametofytu a přenesená přes vajíčko do další generace (nikdy ne do samičích pohl. buněk, transgenní semena jsou proto vždy heterozygotní na vložený transgen). zlepšení :
vakuová infiltrace přidávání smáčedla silikon Silwet L-77
účinnost: až 20% transgenního potomstva tato metoda funguje i u vojtěšky a petúnie
6
15/03/2010
REPORTÉROVÉ TRANSGENY jsou geny jejichž expresi lze snadno detekovat a kvantitativně stanovovat, slouží hlavně ke stanovování účinnosti různých rostlinných promoterů
MODRÉ ROSTLINY REPORTÉROVÝ GEN pro β-glucuronidasu z E.coli po transformaci se rostlina namočí do barviva X-Gluc p vzniká nerozpustné indigo zabarvení, které jde detekovat v intaktní rostlině. Stabilní enzym bez kofaktoru. • GUS (uidA gen) β-glucuronidasa
X-Gluc
modrý precipitát
5-bromo-4-chloro-3-inolyl -β-D-glucuronic acid
SVĚTELKUJÍCÍ ROSTLINY využívá se cDNA pro gen luciferasu ze světlušky Photinus pyralis nebo baktérie Vibrio harvei substrát luciferin se přidává do substrátu (hlíny), pletivo rostliny pak emituje viditelné záření, které se měří luminimetrem nebo scintilační kamerou = velice citlivá metoda, žádna nespecifická aktivita, velmi nákladná
PG3
REPORTÉROVÉ TRANSGENY FLUORESKUJÍCÍ ROSTLINY malý gen pro GFP (green fluorescent protein) z medúzy Aequorea victoria po ozáření modrým světlem (440-480nm) zeleně fluoreskuje bez jakéhokoliv substrátu a je velice stabilní fluorescenci si zachovává i po fúzi s jiným proteinem (chimerické geny) A. thaliana C24 wild type (vlevo) 35S-mgfp4-ER transformed (vpravo)
Aequorea victoria
7
Snímek 14 PG3
v medúze není třeba osvětlovat, jelikož GFP se váže na aquaporin, který po vazbě Ca2+ vyzařuje modré záření, které aktivuje GFP galuszka; 19/03/2006
15/03/2010
PŘÍKLAD VYUŽITÍ TRANSGENOZE V ZÁKLADNÍM VÝZKUMU:
subcelulární lokalizace AtCKXAtCKX-GFP chimerického proteinu (Werner et al., 2003) GFP kontrola cytosol+ cytosol jádro
mitochondrieJ
AtCKX1-GFP AtCKX3-GFP detekováno ve vakuolách
AtCKX2-GFP lokalizace na endoplasmatickém retikulu s následnou sekreci ven z buňky
transgenoze pomocí listových disků např. tabák
metoda používaná u většiny dvouděložných rostlin
8
15/03/2010
regenerace transgenních tabákových rostlin z kalusu vzniklých na listových discích
Arabidopsis
tabák
9
15/03/2010
TRANSFORMACE TOPOLU
TOP 10 ZEMĚDĚLSKÝCH PLODIN 1. rýže setá 2. sója luštinatá 3. pšenice setá 4. lilek brambor 5. kukuřice setá 6. čajovník 7 banánovník 7. 8. réva vinná 9. tabák virdžinský 10. mák polní
10
15/03/2010
transgenoze jednoděložných např. ječmen (Tingay et al.,1997) • • • • • •
izolace nevyvinutých embryí z obilniny mechanické narušení – odstranění embryonální osy kokultivace s Agrobacteriem kultivace na kalusotvorném médiu detekce reportérového genu v T0 i T1 generaci efektivita do 4% (např. z 1282 embryí vyselektováno 54 transformovaných linií
• poprvé chřest (1988) • problém: jednoděložné obsahují daleko méně fenolických látek zlepšení: ošetření acetosyringonem (aktivace vir regionu) supervirulentní kmeny Agrobacteria: mají zmnožený gen pro virG, který je navíc pod konstitutivním promotorem
SELEKCE HOMOZYGOTNÍ LINIE T0 generace
T1 generace T-DNA inzerce na jednom lokusu ¼ 00 homozygotů † ½ M0+0M heterozygotůU ¼ MM homozygotů U
3:1 75% U T-DNA inzerce na dvou lokusech
všichni transformanti jsou heterozygotní
9:3:3:1 93% U T-DNA inzerce na třech lokusech 1/64 oo 00 00 homozygotů † 27/64 homo-heterozygotůU 36/64 MM hetero-homozygotů U
27:9:9:3:9:3:3:1 98% U
selekce semen na nutričním mediu obsahující selekční antibiotikum
100% U 75% U HOMOZYGOTNÍ LINE
selekce semen na nutričním mediu obsahující selekční antibiotikum
1/14 oo 00 homozygotů † 3/14 oo Mx homo-heterozygotů U 3/14 mx 00 homo-heterozygotů U 9/14 mx MX hetero-homozygotů U
T2 generace
11
15/03/2010
přímá transgenoze TRANSGENOZE PROTOPLASTů odstranění buněčné stěny a inkubace protoplastů s roztokem DNA, DNA vniká do protoplastu endocytózou • polyetylenglycol ↑ • elektoporace ↑ • makroinjekce ↑ protoplasty se dají udělat ze všech rostlin lze z nich však jen velmi obtížně regenerovat celé rostliny
BIOLISTICKÉ METODY TRANSGENOZE p používají j se zlaté nebo wolframové kuličky y (2μm) smíchají se s roztokem plazmidové DNA s transgeny, odpaří se vstřelují se do pletiva pod vakuem transgen společně s reportérovým genem (GUS) snadná detekce transformace
1O% pronikne do pletiva
50% zůstane v epidermis (netvoří kalus)
95% cytoplazma nedochází k transkripci)
5% jádro
99% umírá
1% přežívá a dochází k integraci do genomu
12
15/03/2010
genetické dělo
pokud se nepodaří z buněk zregenerovat kalus, transgenoze je pouze dočasná
PG4 PG5
SELEKČNÍ MARKERY pro ROSTLINN0U TRANSGENOZI
1.ANTIBIOTIKA 1. ANTIBIOTIKA KANAMYCIN – gen nptII pro neomycinfosfotransferasu. Rostliny se buď stříkají, nebo se dává p přímo do média. HYGROMYCIN B gen aphIV pro hygromycinfosfotransferasu –silně toxický i pro člověka – inhibitor proteosyntesy
1
2. HERBICIDY nejpoužívanější GLYFOZÁT inhibitor syntézy aromatických AK (je esenciální u autotrofních organismů) sp. 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntasa (EPSP) tři strategie: 1) overexprese EPSP 2) exprese mutantní ne tak citlivé formy EPSP 3) exprese glyfozátoxidoreduktasy (degradace glyfozátu) transgenní potomstvo se sprejuje glyfozátem, přežívají pouze rostliny nesoucí současně s transgenem jeden ze tří způsobů rezistence
13
Snímek 26 PG4
Hyg i Kan jsou aminotriglycosidy které se váží na ribozom a způsobují nesmyslný přepis mRNA
PG5
glyfozát - fosfometylglycin
galuszka; 19/03/2006
3-fosfošikimát + fosfoenolpyruvát = enolpyruvátšikimát 3 fosfát galuszka; 19/03/2006
15/03/2010
SELEKČNÍ MARKERY pro ROSTLINN0U TRANSGENOZI 3. ZDROJ SACHARIDů v ranných stádiích vývoje rostlin v in vitro podmínkách je plná závislost na zdroji uhlíku v médiu (sacharóza). Selekční marker: v médiu je místo sacharózy xylóza a manóza. Hexokinasou vzniká manóza-6-fosfát, který není schopen podléhat následné glykolýze a je pro rostlinu toxický, kumuluje fosfor. Selekční transgen: fosfomanózaizomerasa přeměňuje manóza-6-fosfát na fruktóza-6-fosfát (použito u tabáku, cukrovky a kukuřice)
4. SELEKCE ROSTLINNÝMI Ý HORMONY transgen isopentenyltransferasa produkuje nadbytek cytokininů (nemusí se přidávat do selekčního média) které podporují tvorbu prytů z transformovaného pletiva, u tabáku a salátu bylo zjištěno že tento nadbytek nemá vliv na celkovou morfologii transgenní rostliny.
PG6
ODSTRANĚNÍ SELEKČNÍCH TRANSGENů Z ROSTLIN někdy je třeba tento transgen odstranit aby nenarušoval vývoj rostliny (ipt,nptII) využití bakteriofágového systému Crelox, přirozený exscisní systém, gen cre kóduje rekombinasu (transpozasu) a lox symbolizují krátké cílové sekvence excise.
14
Snímek 28 PG6
bakterifág p1 využívá systém k zaclenení casti DNA do bakterie loxB místa galuszka; 19/03/2006
15/03/2010
ODSTRANĚNÍ SELEKČNÍCH TRANSGENů Z ROSTLIN SYSTÉM MAT (multi(multi-autotransformation ) rekombinační
systém
z
kvasinky
Zygosaccharomyces rouxii R/RS ,R- gen pro rekombinasu, RS – specifická rozpoznávací sekvence. Gen R je pod inducibilním promotorem ( (např. ř tetracyklin), t t kli ) mezii RS místa í t vložen l ž i t ipt selekční gen. Po transformaci (exprimuje se ipt gen vyrůstají tzv. teratomy (rychle rostoucí výhony ale zakrslé, (a), ESP fenotyp (enormous shooty phenotype) po indukci tetracyklinem, dojde k vyštěpení ipt a z teratomového pletiva začnou vyrůstat normální výhony (b) .
tabák
PG25
topol
SLOŽKY TRANSGENů
konstitutivní 35 S - nejpoužívanější, virového původu, nebezpečí KOSUPRESE ubikvitin – rostlinného původu, exprese kolísá během ontogeneze actin – rostlinného původu, vysoká ale kolísavá exprese
PROMOTOR
tkáňově specifické 2A11 - z rajčete, plodově specifický Lhcb3 - listově specifický, světlem regulovaný z Arabidopsis promoter APasy - indukovaný v kořeni, fosfátem inducibilní In2In2 -2 – je indukovaný benzensulfonamidovým herbicidem Safener tet - indukce tetracyklinem, nejpoužívanější pOp - indukovaný glucocortikoidem DEXAMETHASONE, živočišný systém přenesený do rostliny
CaMV35S:GUS PsMTA:GUS
15
Snímek 30 PG25
pOp/LhG4. The pOp/LhG4 transcription factor system is based on regulatory elements of the E. coli lac operon . It was first described in tobacco , but has subsequently been deployed in numerous developmental studies in tobacco, Arabidopsis, or maize. The pOp/LhG4 system comprises an artificial promoter ‘pOp’ and a chimaeric transcription factor ‘LhG4’ ). The pOp promoter consists of two ideal lac operators positioned upstream of a minimal CaMV 35S promoter ()50 to þ8 relative to the transcription initiation point) and is physiologically silent in the absence of the artificial transcription factor LhG4 . LhG4 binds to the lac operators in the pOp promoter via its DNAbinding domain, which is derived from a high-affinity DNAbinding mutant of the E. coli lac repressor . Once bound, LhG4 promotes transcription from the minimal CaMV 35S promoter of pOp by virtue of a transcription-activation domain derived from the Saccharomyces cerevisiae transcription factor Gal4p (Moore et al., 1998). The sequences that are critical for transcriptional activation in Arabidopsis lie within the carboxy-terminal 17 amino acids of the Gal4 activation domain and conform to the consensus for eukaryotic acidic activation domains (Rutherford et al., 2005). pOp can be activated in specific cells following a cross with ‘activator lines’ that express LhG4 from appropriate promoters galuszka; 31/03/2008
15/03/2010
SLOŽKY TRANSGENů POLYADENYLAČNÍ SIGNÁL a TERMINÁTOR v klonovací kazetě je kromě promotorové sekvence i terminátor transkripce s polyadenylačním signálem nejčastěji používaný terminátor z agrobacteriálního genu pro nopalin syntasu používá se jak u jedno tak dvouděložných rostlin
další používané terminátory: 3´nekódující sekvence rostlinného genu pro pšeničný histon H3 může se použít i vlastní 3´nekódující sekvence transgenu, ale ta nemusí vždy fungovat, je jednodušší mít univerzální již v plasmidu
SLOŽKY TRANSGENů INTRONY ínkorporace intronu do transgenu může zvyšovat sílu exprese transgenu v rostlině např. intron I z genu pro rýžový aktin nebo i t intron I z genu pro kukuřičný k k řič ý ubikvitin bik iti
5´ NEKODUJÍCÍ REGION Kozákova sekvence a podobné sekvence zvyšují postranskripční stabilitu mRNA a tím zvyšují míru exprese
NUKLEOTIDOVÉ SLOŽENÍ pokud vkládáme do rostliny gen z baktérie, hrozí nebezpečí použití odlišného genetického kódu, vyštěpení neexistujícího intronu atd. geny ze vzdálených taxonů se proto musí často syntetický upravovat (mutacemi) aby bylo dosaženo dostatečné exprese v rostlinném hostiteli (např. u Bt toxinu z baktérie)
16
15/03/2010
odchylky v genetickém kódu? snižují výtěžek heterologní exprese výjimky:
jiná preference: kodón pro arginin (6 různých): CGU CGA CGG CGC
E. coli AGA 2.2% AGG 1.6%
AGA AGG
Arabidopsis th.
H. sapiens
AGA 18.9% AGG 11.0%
AGA 11.9% AGG 12.1%
ORGANELOVÉ CÍLENÍ TRANSGENU transgen je začleněn do genomu v jádře, transkripce probíhá v jádře, zralá mRNA je pak transportovaná do cytosolu kde probíhá proteosyntéza na ribozómech, buď volně nebo vázaně na ER POSTRANSLAČNÍ ÚPRAVY PROTEINU ZAHRNUJÍ i OGANELOVÉ CÍLENÍ specifické signály – SIGNÁLNÍ PEPTID, úprava transgenu: cílení do plastidu: genetická informace pro 23AK signální peptid malé podjednotky Rubisca se naklonuje před vlastní N-terminus transgenu cílení do mikrotělísek: ke konci transgenu se připojí posledních 34 AK z isocitrátlyasy zůstává na ER: motiv H/KDEL se zabuduje na C-terminus proteinu transgenu atd.
17
15/03/2010
PŘÍMÁ TRANSFORMACE CHLOROPLASTů začlenění tragenu do chloroplastové DNA VÝHODY: dědí se pouze matrilineárně, tzn. transgen se nepřenáší pylem. k začleňování transgenu dochází pouze na specifických ifi ký h místech í t h DNA h homologní l í rekombinací vysoká exprese, až několik procent celkových proteinů lepší pro expresi bakteriálních genů v rostlinách (stejný gen.kód) NEVÝHODY: provedení: používá se biolistické metody velice silné genetické dělo hnané héliem héliem, musí prorazit dvojitou chloroplastovou membránu, velice malá účinnost specifické vektory: obsahují část genetické informace chloroplastu aby mohla proběhnout homologní rekombinace selekční marker antibiotikum spektinomycin
PŘÍKLAD VYUŽITÍ TRANSGENOZE V ZÁKLADNÍM VÝZKUMU:
CytokininCytokinin -deficient deficientní ní rostliny Nadexprese cytokinin oxidasy pod silným ý konstitutivním promotorem p vyvolává cytokinin-deficientní fenotyp Potvrzení hlavní funkce cytokininů na diferenciaci rostliny Možné aplikace v zemědělství Galuszka et al., Eur.J.Biochem., 2004
18
15/03/2010
Trvalá transgenoze ječmene s ektopickou expresí CKX pomocí Agrobacterium tumefaciens
Umlčení CKX pod specifickými promotory reprodukčních orgánů např. HvLTP2 (lipid transporter protein)
CKX aktivita v aleuronové vrstvě
Nadexprese CKX pod kořenově specifickým promotorem RAF (root abundant factor)
VYUŽITÍ TRANSGENOZE ROSTLIN A) ZMĚNA VLASTNOSTÍ ZEMĚDĚLSKÝCH PLODIN 1. rezistence k herbicidům 2. resistence k hmyzím škůdcům 3 rezistence 3. i t k virům i ů 4. změna obsahu olejů 5. oddálení dozrávaní plodů 6. kontrola opylování 7. zvyšování nutriční hodnoty (zlatá rýže) B) TOLERANCE VůČI STRESU (WeatherGuardGenes)
C) MOLEKULÁRNÍ FARMÁŘSTVÍ 1. plantibodies a jedlé vakcíny 2. produkce léků rostlinami 3. produkce biopolymerů rostlinami
19
15/03/2010
rezistence k herbicidům REZISTENCE KE GLYFOZÁTU (RoundUp ®) A)
nadprodukce enolpyruvylšikimát-3-fosfát syntasy - málo účinné
B)
mutovaný t ý EPSP z E.coli E li v pouze 1 AK máá 8000x 8000 nižší ižší sensitivitu iti it ke k glyfozátu, transgen má navíc ještě signální peptid pro cílení do chloroplastu (transgenní rostlina odolná i vůči 0.5 kg glyfozátu na ha, běžná letální dávka pro nerezistentní druhy) – využito u řady kulturních rostlin firmou MONSANTO
C)
katabolismus glyfozátu glyfozátoxidoreduktasou (gox) z Achromobacteru se signálním peptidem genu pro Rubisco pod konstitutivním promotorem – uplatňuje se u řepky olejné
PG11
rezistence k herbicidům REZISTENCE KE FOSFINOTRICINU (glufozinát, BASTA®) - ireverzibilní inhibitor glutaminsyntasy (fixace amoniaku do glutamátu) geny bar a pat z bakterií Streptomyces inaktivují glufozinát acetylací, byly vneseny do odrůd kukuřice a řepky povolené v USA a Kanadě
REZISTENCE K DERIVÁTůM SULFONYL MOČOVINY (chlorsulfuron, GLEAN ® ) - inhibitory acetolaktátsyntasy (první krok v biosyntéze Val,Leu a Ile) rezistence založená na mutaci původního genu ve vazebném místě pro herbicid účinné u čekanky, topolu, rýže, jabloně, lnu, řepky a tabáku transgenní odrůdy nejsou moc využívaný často byla pozorována samovolná mutace a získaní rezistence
REZISTENCE K BROMOXYNILU – inhibitor fotosystému II půdní baktérie jsou schopny ho metabolizovat transgen klonován z rodu Klebsiella
REZISTENCE K 2,4 2,4-D (2,4(2,4-dichlorfenofyoctová kyselina) nalezeny půdní baktérie schopny ho metabolizovat
20
Snímek 40 PG11
gluphosinate 2-amino-4-hydroxymetylfosfinil butanová kyselina galuszka; 25/03/2006
15/03/2010
PG7
rizika ekologická (pouze teoreticky, nebyla zatím prokázána) 1/ tolerance k herbicidu by mohla přeměnit kulturní rostlinu v plevel - u žádného transgenu nebyl zatím potvrzen pozitivní selekční tlak
2/ gen pro toleranci k herbicidu by mohl mít neočekávány pleiotropní efekt, který by mohl negativně změnit kulturní plodinu - testuje se 3/ šíření transgenu do okolních populací stejné cizosprašné plodiny pylem - největší j riziko i ik u řepky k olejné, l j zabrání b se zavedením d transgenu d do chloroplastu - dodržování základních principu agrotechniky, pokud by se stalo, je třeba na určitou dobu změnit herbicid
rizika zdravotní vnesením transgenu do rostlin se dostávají do potravy tři nové typy molekul: 1/ DNA transgenu – nemá smysl o riziku uvažovat, tento typ h i horizontálního tál íh přenosu ř nebyl b l nikdy ikd prokázán ká á ((např. ř přenos ř d do střevních bakterií). 2/ produkt transgenu – většinou jde o enzymy specifických metabolických drah rostlin či baktérií, které metabolismus člověka neovlivňují, alergické reakce nebyly u žádného prokázány, enzymy jsou v trávicím traktu člověka okamžitě rozkládány 3/ vlastní herbicid – všechny herbicidy mají pro živočichy vysoké letální dá k např. dávky ř glyfozát l f á LD50= LD50 5g 5 na kg, k potenciál iál podráždění d áždě í kůž kůže srovnatelný s detergentem na nádobí nebyly prokázány ani genotoxické, teratogenní či karcinogenní účinky spekulace glyfozát se může v půdě bohaté na nitráty a nitrity měnit na spekulace: slabě mutagenní N-nitroglyfozát (tato konverze však v rostlinách nikdy nebyla prokázána)
21
Snímek 41 PG7
pleiotropní efekt vnášeného genu vyvolaný buď nečekanou interakcí produktu vnášeného genu s některou komponentou rostliny, nečekanou interakcí metabolické cesty podmíněné vnášeným genem s jinou metabolickou cestou, jež je rostlině vlastní, nebo nečekanou aktivací metabolické cesty, jež není v rostlině obvykle aktivní. Vyloučit nelze ani tzv. inzerční mutaci, která vznikne „nabouráním“ vnášeného genu do genu, jenž je rostlině vlastní a jenž je tímto zásahem narušen, takže nemůže zajišťovat obvyklé funkce. galuszka; 19/03/2006
15/03/2010
GMO rezistentní k herbicidům Roundup Ready® bavlna, kukuřice, sója a jarní řepka (kanola)
běžná kanola
Roundup Ready®kanola
PG12
rezistence ke hmyzím škůdcům
Bt - rostliny 1902 – byla v Japonsku objevena baktérie Bacillus thuringiensis, která způsobovala úhyn bource morušového 1987 – byl z této baktérie izolován krystalický protein δ-endotoxin endotoxin, který po projití trávicím traktem hmyzu, způsobuje jeho rozklad 1980 - se začala tato baktérie využívat jako insekticid, postřiky byly drahé a dlouho neúčinkovali 1985 – připraven transgenní tabák overexprimující Bt-toxin (nízká exprese 0.0001% všech listovým proteinu) důvod: nestabilita bakteriální mRNA v rostlině synteticky upravené geny pro δ-endotoxin - byl snížen obsah AT bází - pozměněn genetický kód tak aby vyhovoval rostlinám - vloženy introny exprese se zvýšila až 1000x, většinou se využívá konstitutivní 35S promotor existuje řada genů pro Bt-toxin (CryIA- CryIIIB) s různou specifitou vůči různým hmyzím druhům
22
Snímek 44 PG12
zavíječ kukuřičný motýlek vytvářející chodby ve stéblech a palicích, housenky okusují listy a přezimují v pokosených stvolech na strništi největší škody na jižní Moravě galuszka; 25/03/2006
15/03/2010
BtBt -rostliny 40% pěstované kukuřice v USA jsou BtBt-transgenní odrůdy Bt-kulturní plodiny 1989 rajče jč 1992 kukuřice 1993 bavlník 1995 zelí, brokolice 1997 brambor, baklažán 2000 čínské zelí
běžná rostlina bramboru napadená mandelinkou
země kde jsou povolené odrůdy
další: tabák, topol, borůvka, rýže, sója, rýže sója ořešák
BtBt-brambora
Bt bavlníku Argentina Austrálie Čína Indie
Indonésie Mexiko Jižní Afrika USA
a
Bt kukuřice Argentina Kanada EU (některé) Jižní Afrika USA
PG13
vývoj a zavádění GMO VÝVOJ TRANSGENNÍ ODRUDY RAJČETE primární transgenní rostlina – 6 měsíců (selektování homozygotní populace – 2 roky) vývoj stab stabilní variety va ety – 3 roky o y zkoušky variety – 2 roky uvádění na trh – 1-2 roky 6-7 roku od transgenní rostliny po komerční uvedení ZAVÁDĚNÍ BtBt-BAVLNÍKU V INDII 1994 podání žádosti o dovoz transgenních semen 1995 povolení k dovozu z USA 1996 dovoz, pokusné pěstování ve skleníku 1996 první pokusné pole 1997-98 povoleno pět pokusných lokalit 1998 testy na stepních kozách a alergologické testy na lidech 1998-99 25 lokalit na pěstování 2000-01 první velkoplošné pěstování (100 ha) 2001 první vlastní sklizeň transgenních semen 2002 povolení pro komerční prodej a pěstování
23
Snímek 46 PG13
obsah významných hmyzích druhů v bavlníkových polích jednak konvenčních, jednak Bt bavlníku. Bt bavlník se používá k potlačení černopásky bavlníkové Helicoverpa armigera . V polích transgenního bavlníku zjistili vyšší zastoupení predátorů než na polích konvenčně ošetřených insekticidy, až na parazitické vosičky, jejichž počet byl snížen v odpovědi na sníženou hustotu a nízkou kvalitu larev černopásky. Jelikož je dosti predátorů, je snížen výskyt mšic, ale zvyšuje se počet svilušek, protože se nestříká insekticidem. Pestrost druhů členovců je vyšší v Bt bavlníku, což naznačuje, že Bt bavlník je výhodnou plodinou pro integrovanou ochranu. Kontrolně se testoval vliv pylu Bt bavlníku na bource produkující hedvábí (Antheraea pernyi a Bombyx mori) a zjistilo se, že vliv je zanedbatelný. galuszka; 25/03/2006
15/03/2010
PG14
rizika • Bt-rostliny i samotný endotoxin byly testovány na lidech, psech, morčatech, čolcích, krysách, rybách a ptácích bez žádných příznaků • byly prováděny alergologické testy • nebyl pozorován ani žádny vliv na hmyzích predátorech (1996 včela, slunéčko)
1999 – NEJVĚTŠÍ SKANDÁL GMO případ motýlka Danaus plexipus tento motýl patří v USA mezi ohrožené druhy publikovaná práce kdy byla prokázána zvýšená mortalita larev po poprášení rostlin klejichy (potrava) pylem z Bt kukuřice v roce 1999 byl však zaznamenán nárůst populace tohoto motýlka nedochází k časové koincidenci kvetení kukuřice a vývoje larev GREENPEACE vydává seznam evropských motýlů ohrožených endotoxinem v Bt-rostlinách snaha o zavádění Bt-rostlin s matrilineární dědičnosti
PG1
bourec morušový první transgenní motýl?
•
odsekvencovaný genom
•
díky člověku ztratil schopnost létat
•
hledání genetických příčin (porovnání s drosofilou a anopheles)
•
1874 genů odpovědných za produkci vlákem ze kterých se vyrábí hedvábí
24
Snímek 47 PG14
Monarch butterfly galuszka; 25/03/2006
Snímek 48 PG1
Samička klade 300-500 vajíček, ta jsou nejprve žlutá a později tmavnou. Housenky, které se z nich líhnou, se živí výhradně listím moruše bílé nebo černé ( Morus alba, M. nigra ), jedná se tedy o tzv. monofágní hmyz. Vývoj housenek trvá asi 35 dnů a má pět instarů (vývojových stadií, z nichž každé je zakončeno svlékáním). Za tuto dobu housenka vyroste na 25 - 30násobek své délky a hmotnost zvýší sedm- až devěttisíckrát. Plně vyvinutá, dorostlá housenka se začne kuklit. Z párových slinných žláz vylučuje tekutinu, která na vzduchu tuhne, čímž vzniká tenké hedvábné vlákno. Jím se opřádá tak dlouho, až vytvoří pevný pružný zámotek - kokon. Ten je svrchu ještě opředen jemnými vlákénky, tzv. bourovinou. Petr Galuszka; 20/03/2007
15/03/2010
PG8
PG2
rezistence ke hmyzím škůdcům
transgeny rostlinného původu inhibitory trávicích enzymů (amylas a proteas) hmyzu, lektiny (proteiny vážící sacharidy), chitinasy, syntéza alkaloidů INHIBITORY PROTEAS sójový inhibitor serinových proteas inhibitor trypsin proteas z vigny inhibitor proteas z rajčete INHIBITORY AMYLAS amylasový inhibitor z fazole LEKTINY (účinné proti mšicím) lektin sněženky GNA (Galantus nivalis aglutinin) lektin hrachu chitinasa z fazole
rezistence k háďátkům ročně způsobují ztráty až 77 miliard dolarů napadají především brambory brambory, řepu, řepu rajčata existují přirozené proteiny způsobující rezistenci v těchto plodinách již dlouhodobě se šlechtí brambory s vysokou rezistenci genetickým mapováním byly nalezeny geny způsobující rezistenci použity jako transgeny v GMO
stírají se rozdíly mezi přirozenou a umělou rezistenci (GMO pouze urychlilo klasické šlechtění)
25
Snímek 49 PG8
GNA - nebyla na krysách prokázána toxicita, až na podivnou studii Arpada Pusczaye ze Skotska, mediální vlna, navíc brambory se vaří a lektin se varem ničí galuszka; 19/03/2006
PG2
lektin - bilkovina vážicí se na glykosylované povrchy buněk Petr Galuszka; 20/03/2007
15/03/2010
virové a bakteriální nemoci kukuřice Varieta
WI MD NB
Seneca White Knight Silver Dollar Silver Queen Hybrid Silverado Snowbelle Snow White Spring Snow Stardust Summer Flavor #81W Summer Sweet 7101W Summer Sweet 8101W Sweet Ice Sweet Magic
R
SB SM SW BW C
x x
x
x
x x x
x x
x x x x x x x
x x x x x x x
rezistence různých variet kukuřice
x
MD = maize dwarf mosaic virus NB = corn leaf blight R = rust SB = so. corn leaf blight SM = smut SW = Stewart’s wilt BW = bacterial wilt C = cold
rezistence k virům hlavním způsobem rezistence je exprese genu pro plášťový protein daného viru
1986 – prvníí transgenní t í rostliny tli ttabáku bák rezistentní i t t í vůči ůči TMV ((existuje i t j ffaktor, kt který rozbalí virus a aktivuje ho, tento faktor se při infekci vychytá plášťovým proteinem produkovaným rostlinou. Korelace: čím větší exprese tím vyšší rezistence byly nalezeny i jiné původní geny způsobující rezistenci, ty byly mapovány a použity jako transgeny proti RNA virům se využívá protismyslná RNA strategie
26
15/03/2010
PG9
papája na Havaji papaya ringspot virus (PRV) ovlivňoval úrodu na Havaji od roku 92 do roku 96 klesla produkce díky viru o 40% 1996 první transgenní papája overexprimující plášťový protein pod 35S promotorem připravená biolistickou metodou od roku 1998 nárůst produkce
PG15
rizika TRANSKAPSIDACE transgenní rostlina napadená jiným virem, sestavování pseudovirionů, hmyzem přeneseny do rostliny, která nebyla vůči původnímu viru senzitivní k tomuto jevu dochází přirozeně, virové populace již přirozeně vyčerpaly všechny možnosti pozitivních mutací
REKOMBINACE virový genom se může rekombinovat s transgenní mRNA virového původu ů d a dát vznik ik viru i novému é bylo již prokázáno, ale nikdy zatím nevznikl infekční virus (schopnost přenosu z buňky do buňky)
27
Snímek 53 PG9
u nás se začíná zavádět odrůda transgenní slivoně Stanley s expresí obalového proteinu viru šarky galuszka; 19/03/2006
Snímek 54 PG15
To assess the risks associated with recombination involving viral sequences in transgenic plants, we have constructed two hybrids between tobacco mosaic tobamovirus (TMV) and cucumber mosaic cucumovirus (CMV).These hybrid viruses have been used to assess risks associated with recombination and transcapsidation. In Nicotiana tabacum, both viruses could infect the inoculated leaf and move cell-to-cell, but neither virus could move systemically. In N. benthamiana, T/CMV-0 did not show systemic symptoms and moved systemically very poorly. In the same host, T/CMV-1 gave a systemic infection, in which the leaves showed mosaic symptoms, although the kinetics of infection suggested that the route of systemic invasion was not via the vasculature. Since only encapsidated RNAs can be transmitted by the aphid vectors of CMV, these data demonstrate that RNAs of heterologous viruses will only be encapsidated efficiently if the RNAs are similar in size to the CMV RNAs. Thus, these data indicate that transgenic plants expressing CMV CP, at levels orders of magnitude lower than observed here for T/CMV-1, do not pose a risk of transcapsidation and transmission of heterologous viral genomes. These data also demonstrate that recombinant viruses formed between TMV and the CMV CP gene are debilitated for long-distance movement via the vascular system. Thus, recombinant viruses formed between the CMV CP gene and most other viral genomes are unlikely to survive in nature. The issue of whether transgenic plants expressing the coat protein (CP) gene(s) of a virus are likely to be sources of genetic material for recombination with unrelated viruses, generating unique, and by inference, more virulent viruses has been of concern to a number of critics and some researchers in the field . While transcapsidation occurs with some closely related plant viruses, it occurs rarely, Recombination has been observed to occur among plant viruses and also between a plant virus and similar viral sequences expressed from a transgene, under strong or moderate selection pressure However, this is not the main cause of concern, which is whether an unrelated virus could obtain viral sequences from a transgene and alter its pathogenicity, host range, or method of transmission; i.e., virus-vector interactions Thus, transgenic plants are being examined for recombination between viral transgenes and various viruses to see if such recombinant viruses will form and whether the recombinant viruses display any selective advantage and/or altered phenotype. Although many plants are infected by several plant viruses at one time, there is no evidence for new viruses having been formed recently by recombination between two viruses that are taxonomically different galuszka; 25/03/2006
15/03/2010
PG16
další využívané transgeny ZMĚNA OBSAHU ROSTL.OLEJů – řepka olejka, sója, len a slunečnice biosyntéza y olejů j v rostlinách dvě části 1)) v chloroplastech p 2)) na ER (p (prekurzor k.palmitová) roční produkce 60 miliónů tun ročně cíle transgenoze: změna poměru jednotlivých mastných kyselin ve prospěch nasycených využití: potravinářství (zvýšení nutriční hodnoty) kosmetický průmysl mazadla bionafta (metylestery mastných kyselin) mazadla, hlavní transgeny: lauroyl-ACP-tiolesterasa (z krysy) –vznik kratších uhlíkatých řetězců 1-acylglycerol-3-fosfátacetyltransferasa - opak
high laurate canola 1996 – Brassica B i napus transformována t f á acyl-ACP-tiolesterasou pod specifickým promotorem s cílením do semen zvýšený obsah k.laurové na úkor olejové a linoleové myristová palmitová olejová linolová linoleová laurová další
4% 3% 31% 11% 7% 38% 6%
0.02% původně využití: výroba mýdel a šampónů výroba čokolády výroba rostlinných sýrů light smetana
28
Snímek 55 PG16
přirozeně v řepce 90% mastných kyselin s 16 a více uhlíky, laurová 12 nasycených galuszka; 26/03/2006
15/03/2010
PG17
další využívané transgeny ZMĚNA OBSAHU ZÁSOBNÍCH PROTEINů – obiloviny a luštěniny A)) zvýšení ý syntézy y y nedostatkových ý AK bakteriální mutovaný gen pro DIHYDROPIKOLINÁT SYNTASU a ASPARTÁT KINASU, které nemají zpětnou inhibici nadbytkem produktu (Lys) transgenní rostliny 100x vyšší obsah lyzinu a methioninu ten se ale nezabudovává v tak velké míře do zásobních proteinů. B) transgenoze genu pro zásobní protein zein i -28% 28% methioninu thi i 2S2S -albumin z paraořechů – 18% methioninu
aspartát kinasa dihydropikolinát syntasa
29
Snímek 57 PG17
hlavně jako krmné směsi pro živočichy, větší výživná hodnota vysoké procento esenciálních AK, které jsou důležité pro správný a rychlý vývoj živočichů galuszka; 26/03/2006
15/03/2010
GENOVÉ UMLČOVÁNÍ (gene silencing)
genové umlčování TGS (transcriptional gene silencing) nedochází k transkripci transgenu může jí předcházet transkripce promotorové sekvence a následná inhibice promoteru komplementárním duplexem RNA-DNA nebo častěji metylace promotorové sekvence
PTGS (post-transcriptional gene silencing) založena na specifické degradaci mRNA
30
15/03/2010
TGS a PTGS read-through t transcription i ti
DNA-DNA pairing
methylation chromatin remodelling
RNA-DNA pairing
RNA-RNA pairing
RNA degradation
methyltransferases chromatin remodelling factors
dsRNA
SYNTÉZA PROTEINU 3’ přirozený promoter
A
T
G
C
5’ Gen (dsDNA)
5’
T
A
C
G
3’ transkripce
jednořetězcová mRNA Ribosome
translace
exprese genu
protein
31
15/03/2010
obecný princip PTGS
TEORIE PROTISMYSLNÉ RNA A
3’ přirozený promoter
5’
T
T
A
G
C
C
5’
gen (dsDNA)
3’
G
transkripce
jednořetězcová mRNA
Ribosom
žádná translace
mRNA řetězec h b idi j a stává hybridizuje á á se duplexem dsRNA gen (dsDNA)
A
T
žádná exprese genu G
C
mnoho kopií
5’
5’ transkripce silný promoter
T
A
C
G
3’
transgen
= žádný protein GEN JE UMLČEN
32
15/03/2010
poprvé pozorováno 1990 u transgenní petúnie
vědci se pokoušeli ztmavit květy petúnie overexpresí genu pro chalkonát syntasu (enzym produkující černý antokyanin) pod silným virálním promotorem. Transgen interferoval s vlastním genem pro tento enzym a docházelo k jeho vzájemnému umlčování.
prpl
prpl
RNA interference (RNAi)
Science, prosinec 2002
33
15/03/2010
PRINCIP RNAi hairpin RNA
Virus dsRNA
Transgene RNA
dsRNA Cleavage of dsRNA by dicer-like enzyme
siRNA
p
(short interfering RNAs, 21-24 nt long)
systém funguje v cytoplasmě a zřejmě existuje jako rezistence vyvinutá proti RNA virům
OH
p
p p
HO OH
p p
HO
siRNA/protein complex
OH p
HO
p
OH p
HO
siRNA is unwound, single-stranded RNA formed p RISC complex
(RNA-induced silencing complex) sequence-specific target recognition
mRNA target
OH
p
HO
(DICER contains dsRNA cleavage activity, helicase and dsRNA binding activity) RNase III like protein
p
p
OH
RISC se automaticky generuje v rostlině v přítomnosti siRNA imunitní odpověď na úrovni NK
OH
continued on next slide mRNA degradation
34
15/03/2010
Single-stranded siRNAs can also be used as primers to make more dsRNA by host RNA polymerase
RNA dependentní RNA polymerasa
New dsRNA formed from target mRNA
p
OH
Dicer (as in previous slide) p
OH
p
OH
p
HO p HO
p p
HO OH p
HO
Etc….
OH p
Model was modified from Roth et al., (2004) Virus Research 102: 97-108
význam ý RNAi STUDIUM FUNKCE GENů • knockknock-out nebo inhibice funkce genu • přežije organismus organismus?? • jaké pozorujeme fenotypové změny? změny?
TERAPEUTICKÉ VYUŽITÍ • léčba rakoviny (viz. genová terapie) PG20
dvě strategie: a) KLASICKÁ – PCR s dvěma typy primerů a postupné klonování (vektor pHANNIBAL pHANNIBAL) b) REKOMBINANTNÍ – jedno PCR a klonování s následnou rekombinací (BP klonasa, vektor pHELLSGATE pHELLSGATE)
35
Snímek 69 PG20
2004 první testy na lidech, degenerativní poškození sítnice, zmožení cév, praskání, způsobeno nadměrnou expresí určitého růstového faktoru 2005 degerativní onemocnění mozku SGA1, exprese toxinu v buňkách, který je zodpovědný za rozpad neuronů galuszka; 26/03/2006
15/03/2010
další využívané transgeny ODDÁLENÍ DOZRÁVÁNÍ PLODů – rajčata zrání plodů rajčat (i ostatních) je způsobováno hlavně degradaci pektinu (polysacharid, polymer kys D-galakturonové) kys. D galakturonové) v buněčné stěně plodů při zrání se aktivuje polygalakturonasa která rozkládá pektin 1994 transgenní odrůda lilku rajčete FlavrSavr s knock-outovanou polygalakturonázou (na 10%) transgen produkuje protismyslnou RNA zvýšena trvanlivost rajčat po sklizni o 2 týdny větši rezistence vůči houbovým a bakteriálním chorobám transgenic + ethylene control
transgenic
další využívané transgeny ODDÁLENÍ SENESCENSE - karafiát, brokolice, rajče ETHYLÉN - rostlinný hormon aktivující senescenci klíčový enzym v biosyntéze ethylenuethylenu 1-aminocyklopropan aminocyklopropan-1-karboxyloxidasa transgeny produkující protismyslnou RNA prodloužení životnosti řezaných květin plody začnou zrát až v prostředí etylénu PROBLÉM: při transportu takovýchto transgenních rostlin nebo plodů docházelo ke styku s výfukovými plyny, které iniciovaly senescenci v současnosti se vytvářejí odrůdy, které budou mít zablokovány přímo etylenový receptor (gen Etr1-1) Etr1 1) model petúnie - životnost květů prodloužena o 8 dní
36
15/03/2010
biosyntéza ethylénu
další využívané transgeny MODRÁ RůŽE
2004 vědci z firmy FLORIGENE (Calgene Pacific) pracovali na vývoji transgenní modré růže po několik let. Nakonec použili jako transgen gen pro flavonoid 3', 5'- hydroxylasu z petúnie pod specifickým promotorem s cílením do květů a transformovali čínskou čajovou růži (Rosa x hybrida). Transgen způsobil syntézu modrého flavonoidu delfinidinu.
U
37
15/03/2010
transgen
PG21
další využívané transgeny pylová sterilita
HETEROZE – jev kdy se zemědělci snaží zvyšovat úrodu pěstováním rostlin v heterozygotním stavu, vyšlechtěná odrůda (homozygotní, hybridní linie) se zkříží s původní. heterozní osivo musí být tudíž získáno z pylově sterilních rostlin (jednodomých). Pylově sterilní rostliny usnadní produkci heterozního osiva. aby se tyto rostliny mohli ale klasicky rozmnožovat, musí mít partner křížení gen který obnovuje fertilitu. PG22 řepka olejka – systém genu pro barnasu (extracelulární RNasa z Bacillus amyloliquefaciens) a jejího inhibitoru barstar d rostlin do r tli (I) byl b l gen pro r b barnasu r vložen l ž pod d specifickým ifi ký promotorem r t r s cílením íl í do tapeta (součást pylového váčku) + transgen pro rezistenci k herbicidu
(pylově sterilní linie) do rostlin (II) byl pod stejným promotorem vložen gen pro barstar (i samosprášení) křížením těchto rostlin vzniká heterozní osivo, které se vždy v další generaci selektuje herbicidem pro něž mají rezistenci pouze rostliny nesoucí gen pro pylovou sterilitu (potlačení homozygotů z linie II)
38
Snímek 76 PG21
hybridní odrudy jsou u některých zemědělských plodin a většiny zeleniny nejpoužívanější. Zvýšení produkční schopnosti F1 generace a vitality proti rodičům pro přípravu heterozního osiva se většinou používá chemických látek způsobující pylovou sterilitu u samosprašných rostlin cytoplasmatická pylová sterilita, sporofytická inkompatibilita atd.... galuszka; 27/03/2006
PG22
obě linie jsou vysazeny současně na pole sklizeň heterozního osiva samozřejmě příměs homozygotů původních u fertilní linie při výsevu heterozního osiva aplikace herbicidu, přeživají pouze heterozygoti galuszka; 27/03/2006
15/03/2010
další využívané transgeny zlatá rýže
největší evropský projekt GMO – ovlivněná celá metabolická dráha
geranylgeranyl pyrofosfát fytoen
fytoensyntasa
fytoendesaturasa
fytoendesaturasa normální zrna rýže
ζ-karoten ζ-karoten desaturasa lyk ly kopen lykopenlykopen - β-cyklasa
b-karoten
zrná rýže s β-karotenem
endogenní endogenní lidské geny Vitamin A
projekt - zlatá rýže
• • •
rýže je schopná syntetizovat β-karoten jen v zelených částech v obilkách je posledním meziproduktem geranylgeranylpyrofosfát do genomu rýže vneseny pod specifickým glutinovým promotorem s cílením do endospermu tři geny: fytoendesaturasa z baktérie Erwinia fytoensyntasa z narcisu lykopenlykopen - β-cyklasa •
• •
β-karoten (provitamín A) nejsou obratlovci schopni syntetizovat, ale potřebují ho pro syntézu retinalu (součást pigmentu rhodopsinu) a k.retinové (reguluje morfogenezi) avitaminóza způsobuje dětskou slepotu, snižování imunity a je příčinou asi půl milionové dětské úmrtnosti především v rozvojových zemích jihovýchodní Asie silné námitky antibiotechnologických aktivistů – není třeba, jsou tabletky - může dojít k předávkování atd.
39
15/03/2010
PG24
další využívané transgeny
bezkofeinová káva
7-metylxantin NN-metyltransferasa a theobromin NN-metyltransferasa JAPONSKO 2003 exprese genů inhibována metodou RNAi druh Cofea canephora transformován Agrobaktériem transformované rostliny stejné jako wild type
Cofea canephora se pěstuje na Madagaskaru a má 2x větší obsah kofeinu než nejrozšířenější Cofea
arabica v mladých listech: ↓ theobromin 30 30-80% ↓ kofein 50 50-70%
transgenní rostliny tolerantní vůči stresu VODNÍ STRES –
při nedostatku vody (i zasolení) se zvyšuje osmotický tlak buněk, dochází k poklesu fotosyntézy a fotoredukci kyslíku za vzniku aktivních kyslíkových radikálů → poškození
a) nadprodukce osmoprotektivních látek glycinbetain – transgen cholindehydrogenasa z E.coli (tabák, brambor) prolin – transgen semialdehyddehydrogenasa k. glutamové z vigny manitol – transgen manitol manitol-1-fosfátdehydrogenasa fruktany – chimerický transgen fruktozyltransferasa z Bacillus subtilis a vakuolární signální sekvence z karboxypeptidasy ze Saccharomyces
b) ovlivnění signální dráhy pro dehydratační stres u Arabidopsis thaliana byla objevena signální dráha společná pro stres dehydratací a chladem současně bylo zjištěno, že geny reagující na tyto stresy mají ve svých promoterech konzervovanou sekvenci TACCGACAT tzv. DRE (dehydratation responsive element). Byl nalezen transkripční faktor aktivující tuto sekvenci DREB1A, a jeho gen použit jako transgen.
+ transgenní rostliny daleko odolnější k suchu, mrazu zasolení - zpomalení růstu (může se použít specifický promotor indukovatelný stresem)
40
Snímek 79 PG24
příprava bezkofeinové kávy - , buď extrakce chloroformem - karcinogen, vymražování tekutym CO2 značně náročná finančně galuszka; 27/03/2006
15/03/2010
transgenní rostliny tolerantní vůči stresu STRES CHLADEM –
významná je korelace mezi citlivosti k chladu a množstvím nenasycených mastných kyselin v membránách. vnesení transgenu které indukují tvorbu cis-dvojných vazeb v nasycených mastných kyselinách se zvýší rezistence k chladu (gen pro ω-6-desaturasu z Arabidopsis do tabáku, 1996).
BIOTICKÝ STRES –
jako transgeny byly použity geny pro chitinasy a beta beta-1,31,3-glukanasy glukanasy, které zvyšovaly resistenci vůči širokému spektru houbových patogenů, tím že rozkládaly jejich buněčnou stěnu byly zkoušeny i PR PR-proteiny, proteiny fungují ale ne samostatně, pouze v různých kombinacích
kyselina salicylová
signál hypersenzitivní reakce na napadení patogenem
jako transgeny geny pro enzymy přeměňující chorismát na k.salicylovou až 1000x vyšší obsah k.salycilové, nezměnil fenotyp rostlin (tabák) a vyvolal silnou rezistentní reakci proti širokému spektru patogenů (viry,baktérie i houby)
transgenní rostliny tolerantní vůči stresu FYTOREMEDIACE –
odstraňování těžkých kovů z půdy pomocí transgenních rostlin schopných lépe akumulovat těžké kovy. savčí nebo kvasničný transgen pro metalotionein přenesení genů redukující rtuťnaté soli z baktérií do rostlin, odčerpávání těchto solí z půdy, přeměna na rtuť a její následné odpařování do atmosféry.
savčí gen pro cytochrom P450 2E1, jaterní enzym, schopný odbourávat db á t TCE (trichloretylen, (t i hl t l hlavní polutant podzemní vody), byl exprimován v rostlinách Arabidopsisu, které byly následně schopny ho odbourávat.
41
15/03/2010
molekulární farmářství rostlinné – jedlé vakcíny jako transgeny se používají oslabené toxiny původců mnohých chorob stimulace mukózního imunitního systému v epitelu trávícího traktu (účinná imunizace) velice levné a efektivní značné uplatnění v rozvojových zemích, pojídáním čerstvých plodů se získá imunita vůči nemocem, které v těchto zemích způsobují milióny úmrtí. vše ve formě testů v rostlinách tabáku a bramboru – zatím úspěšné zubní kaz – protein spaA ze Streptococcus mutans hepatitida B – povrchový antigen HBsAg viru cholera – termolabilní enterotoxin B z Vibrio cholerae 1 g brambor vyrobí 30µg tohoto toxinu brambory se uvaří a toxin denaturuje testy na myši prokázaly vysokou účinnost a neškodnost
1997 poprvé testováno na člověku
hlavní snaha vědců je produkce těchto vakcín v plodinách rozšířených ve třetím světě jako je banánovník
molekulární farmářství
plantibodies
v rostlinách připravené živočišné protilátky nebo části protilátek v rostlinách lze produkovat i monoklonální protilátky protilátky jsou vylučovány do mezibuněčného prostoru mohou sloužit přímo v rostlině (jako (jako ochrana proti patogenům) patogenům) nebo mohou být extrahovány a použity v diagnostice či medicíně výrazně se sníží náklady a čas na tvorbu protilátek (hybridomové buňky)
42
15/03/2010
plantibodies • hlavní problém – rozdíly v NN-glykosylaci proteinů (protilátek) u živočichů a rostlin • plantibodies mají jinak glykosylovanou strukturu a po aplikaci do zvířete vyvolávají nechtěnou imunitní odpověď • řešení: společně s geny pro Ab je do rostliny vnesen gen pro lidskou β-1,41,4galaktosyltransferasu – rostlina pak produkovala „polidštěné protilátky“ • jako transgen stačí vložit pouze malou variabilní oblast tzv. Fv domény z lehkého a těžkého řetězce spojenou krátkým peptidem
scFv – single chain variable fragment
non non--hodgkinský lymfom – rakovina lymfatických uzlin (B (B--lymfocytů) nádorové buňky produkují specifické protilátky (zachycené na svém povrchu, liší se od zdravých) tabák infikován TMV s vloženou části genu pro scFV myši tabák produkuje scFv nádorových buněk
43
15/03/2010
tabák produkuje funkční antigen, který po aplikaci myši produkuje protilátky proti nádorovým buňkám imunitní odpověď nevznikla na mezidruhovou odlišnost, produkt rostliny – odlišná glykosylace, špatně ustřižený signální peptid 80% myší přežilo antigen vytvořen během 6 týdnů velice jednoduchá izolace – RYCHLE A LEVNĚ léčba (vakcína) dělaná pacientovi přímo na míru
v současné době klinicky testované plantibodies antigen
rostlina
typ rekomb. Protilátky
aplikace
povrchový antigen Streptokoka
tabák
sekreční IgA CaroRx™
terapeutická povrchová aplikace
Herpes simplex virus
sója, rýže
IgG
terapeutická povrchová aplikace
sperma
kukuřice
IgG
antikoncepce ve formě gelu
non-Hodginský nonlymfom
tabák
scFv
personalizovaná vakcína
virus vztekliny
tabák
IgG
terapeutická intravenosně
CEA - cancer embryonic antigen
tabák, rýže, pšenice, rajče
scFv, diabodies, chimerické protilátky
terapeutická diagnostická
Stoger et al., Recent progress in plantibody technology, Curr. Pharm Design 11, 2005
44
15/03/2010
molekulární farmářství biodegradovatelné plasty některé bakterie jsou schopny uchovávat uhlík a energii ve formě osmoticky inertních polymerů (polyester k. hydroxymaselné PHB) tyto jsou pak v přírodě rychle degradovatelné tři geny z baktérií byly vloženy do rostlin Arabidopsis 3-ketotiolasa NADH--dep NADH dep.. acetoacetylacetoacetyl-CoA CoA--reduktasa PHB--polymerasa PHB syntéza PHB navazuje na syntézu mastných kyselin, jejíž část probíhá bíhá v chloroplastech hl l t h pokud byly tyto geny vloženy do jaderného genomu pod 35S 35S promotorem docházelo k nadměrné produkci polyhydroxybutyrátu v listech (PHB tvořil 0.14% 14% sušiny) pokud byly produkty transgenů cíleny pomocí signálních peptidů do chloroplastů zvýšila se produkce až 100 100x x
45
15/03/2010
molekulární farmářství
biodegradovatelné plasty
A bid Arabidopsis i slouží l ží jako j k modelová d l á rostlina tli předpokládá se že, tento model bude přenesen do nějaké rostliny, která produkuje velké hlízy nebo semena a není konzumována ani člověkem ani zvířaty (skočec Ricinus communis communis)) transgenní g řepka p vyprodukuje yp j až 10 g PHB na rostlinu fa MONSANTO zatím tento projekt pozastavila, jelikož to stále ještě není ekonomicky výhodné (výroba plastů z fosilních zdrojů je daleko levnější)
PG10
GMO schválené pro komerční využívaní a polní pokusy na území ČR • GM virus vakcína proti Aujeszkého chorobě (fa Vermie Veterinär Chemie) • GM virus vakcína proti vzteklině (fa Rhone-Merieux) • Streptococcus termophilus (fa Valio, testování residuí antibiotik v mléce) • tabák tolerantní k herbicidu bromoxynilu (fa SEITA) • řepka olejka tolerantní k herbicidu glufosinátu pro krmiva (fa Plant Genetic Systems) • řepka olejka tolerantní k herbicidu glufosinátu pro pěstování (AgrEvo) • sója tolerantní k herbicidu glyfozátu (Monsanto) • čekanka částečně tolerantní k herbicidu glufosinátu s pylovou sterilitou (fa Bejo-Zaden) • • • •
kukuřice s rezistenci vůči hmyzu (Bt-endotoxin) a toleranci k glufosinátu (Ciba-Geigy a Novartis) kukuřice rezistentní vůči hmyzu (Bt-endotoxin) (Monsanto) k k ři ttolerantní kukuřice l t í vůči ůči h herbicidu bi id glufosinátu l f i át (A (AgrEvo) E ) kukuřice tolerantní k herbicidu glyfozátu (Monsanto)
• karafiáty se změněnou barvou květu (Florigene) • karafiáty s prodlouženou trvanlivostí (Florigene) • slivoň s obalovým proteinem viru šarky PPV • brambor s pozměněným metabolismem sacharidů (redukce amylosy ve prospěch amylopektinu ve škrobu, BASF) • len setý s genem pro hygromycin (testování křižitelnosti s wt druhy lna vyskytujícího se na území ČR)
Evropa a GMO: 2005 - Rumunsko, Španělsko, Francie, Německo, Portugalsko a ČR
46
Snímek 92 PG10
GM viry se používají např. do návnad pro lišky v lese galuszka; 19/03/2006
