MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE
Vliv restrikčně-modifikačních systémů na rezistenci kmenů Staphylococcus aureus k polyvalentním bakteriofágům Diplomová práce
Bc. Markéta Štreitová
VEDOUCÍ PRÁCE: prof. RNDr. Jiří Doškař, CSc.
BRNO 2013
Bibliografický záznam
Autor: Bc. Markéta Štreitová Přířodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Název práce: Vliv restrikčně-modifikačních systémů na rezistenci kmenů Staphylococcus aureus k polyvalentním bakteriofágům Studijní program: Experimentální biologie Studijní obor, směr: Speciální biologie, Mikrobiologie a molekulární biotechnologie Vedoucí práce: prof. RNDr. Jiří Doškař, CSc. Akademický rok: 2012/2013 Počet stran: 72 Klíčová slova: Staphylococcus aureus; bakteriofágy; polyvalentní bakteriofágy; fágová terapie; rezistence; restrikčně-modifikační systémy; RM testy; Sau1.
Bibliographic Entry
Author: Bc. Markéta Štreitová Faculty of Science, Masaryk University Department of experimental biology Title of Thesis: Influence of Restriction-Modification Systems on Resistance of Staphylococcus aureus Strains to Polyvalent Bacteriophages Degree Programme: Experimental Biology Field and Specialization of Study: Special Biology, Microbiology and Molecular Biotechnology Supervisor: prof. RNDr. Jiří Doškař, CSc. Akademic Year: 2012/2013 Number of Pages: 72 Keywords: Staphylococcus aureus; bacteriophages; polyvalent bacteriophages; phage therapy; resistance; restriction-modification systems; RM tests; Sau1.
Abstrakt Staphylococcus aureus je oportunním patogenem, často tvořícím součást mikroflóry člověka. Určité, zejména toxigenní kmeny, mohou způsobovat velmi závažná onemocnění nebo pooperační komplikace v důsledku kontaminace operačních ran. Počet kmenů S. aureus rezistentních k antibiotikům roste a jednou z alternativ antibiotické léčby je použití bakteriofágů. Polyvalentní stafylofágy jsou účinné až proti 95% S. aureus, včetně MRSA. Zbývajících 5% kmenů však může způsobovat komplikace v léčbě. Obecně jsou za hlavní příčinu rezistence S. aureus k bakteriofágům považovány restrikčně-modifikační systémy. Vliv R-M systémů typu II je dle výzkumů zanedbatelný, proto se tato práce zaměřila na nově objevený R-M systém typu I – Sau1, kódovaný chromozomálními geny S. aureus. Tento R-M systém brání horizontálnímu přenosu DNA mezi liniemi S. aureus, proto byl testování podroben soubor klinických izolátů MRSA zařazených do odlišných klonálních linií. Izoláty byly testovány na citlivost k polyvalentním bakteriofágům a pomocí PCR byla u vybraných izolátů určena specifita Sau1. Následně byla provedena izolace variant fága Φ812, které byly schopny množení na necitlivých kmenech. Nejednalo se však o modifikované fágy, ale fágové mutanty. Fág tedy překonal jiný mechanismus rezistence, než je klasický R-M systém. Výsledky této práce prokazují, že R-M systém Sau1 nemá vliv na rezistenci S. aureus k polyvalentním bakteriofágům.
Abstract As an opportunistic pathogene, Staphylococcus aureus is often a part of the natural human microflora. Some strains, ecpecially the toxin-producing ones, can cause very serious diseaseas or post-operative complications in consequence of surgical wounds contamination. Due to an increase in number of antibiotic-resistant strains, there is a tendency to turn to an alternative treatment method using bacteriophages. Although 95% of S. aureus strains (including MRSA) are sensitive to polyvalent staphylophages, the remaining 5% could lead to complications in treatment. Generally, restriction-modification systems are considered to be a main cause of resistance to bacteriophages. The impact of type II R-M systems is insignificant according to earlier research. Thus this work has focused on a recently discovered type I R-M system Sau1, encoded by chromosomal genes of S. aureus.This R-M system acts as a barrier of horizontal gene transfer between S. aureus lineages. Therefore we tested well-chracterized clinical MRSA isolates classified into different clonal lineages. In these isolates their sensitivity to polyvalent phages as well as their Sau1 specifity were tested. Subsequently, variants of phage Φ812 capable of growing on resistant S. aureus strains were isolated. It was found that these were mutated phages not just modified ones which means that they overcame a different resistance mechanism than a classical R-M system. Thus this work proves no impact of R-M system Sau1 on a resistance of S. aureus to polyvalent bacteriophages.
Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala prof. RNDr. Jiřímu Doškařovi, CSc. za četné konzultace, připomínky k textu, podněty ke studiu a zamyšlení, za jeho cenný čas a trpělivost. Velký dík patří také celému kolektivu LMDM ÚEB za vlídný přístup a příjemné a podnětné prostředí, které pro práci v laboratoři vytvořili. Jmenovitě děkuji Mgr. Davidu Bednářovi, Mgr. Janě Rájové (Kahánkové), PhD., Mgr. Lucii Kuntové, Mgr. Ivaně Mašlaňové (Nepejchalové), PhD. a zejména Mgr. Marianu Vargovi a Daně Kadaňkové za metodickou pomoc a trpělivost, doc. RNDr. Romanu Pantůčkovi PhD. za cenné rady a Bc. Petře Formanové za spolupráci a konzultace. Dále děkuji Mgr. Lucii Poppové a Mgr. Miroslavu Londýnovi za korekce textu.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracovala samostatně za využití uvedených zdrojů.
Brno, 15. května 2013
Markéta Štreitová …….………………………..
Seznam zkratek AMK= aminokyselina ATB = antibiotika ATP = kyselina adenosintrifosforečná, zdroj energie pro metabolické procesy v buňce bp = base-pair – pár bází, jednotka délky deoxyribonukleové kyseliny BS = buněčná stěna CA-MRSA = Community-aquired methicillin resistant S. aureus – MRSA kmeny s původem v komunitě, tzn. mimo nemocniční prostředí. CC = clonal cluster – klonální linie. Určuje míru příbuznosti mezi jednotlivými klony/kmeny daného druhu. K zařazení do CC slouží metoda MLST. DNA = deoxyribonukleová kyselina, nositelka dědičné informace dsDNA = dvouvláknová deoxyribonukleová kyselina EOP = effectivity of plating – efektivita tvorby plak, nazývaná jako „efektivita výsevu“ HA-MRSA = hospital-aquired methicillin resistant S. aureus – MRSA nozokomiálního (tzn. nemocničního) původu LMDM ÚEB = Laboratoř molekulární diagnostiky mikroorganismů, Ústav experimentální biologie MLST = multilocus sequence typing – typizační metoda založená na sekvenaci a následném srovnání alelických profilů sedmi lokusů tzv. housekeeping (udržujících) genů. MRSA = methicillin-resistant Staphylococcus aureus – S. aureus obsahující gen mecA, díky kterému
je
rezistentní
k meticilinu
(derivátu
penicilinu
odolnému
vůči
širokospektrým betalaktamázám) NK = nukleová kyselina PCR = polymerase chain reaction – polymerázová řetězová reakce; metoda amplifikace DNA s využitím enzymu polymerázy PFGE = pulsed field gel electrophoresis, pulzní gelová elektroforéza PFU = plaque-forming unit – jednotka udávající počet fágových částic schopných tvořit plaky. Jednotka titru fága, udává se v přepočtu na objem, nejčastěji ml.
Obsah 1 Úvod ...................................................................................................................................... 12 1.1 Staphylococcus aureus .................................................................................................. 13 1.1.1 Obecná charakteristika .......................................................................................... 13 1.1.2 Genom ................................................................................................................... 15 1.1.3 Faktory virulence a toxiny .................................................................................... 15 1.1.4 Patogenní působení na člověka ............................................................................. 16 1.1.5 Terapie stafylokokových infekcí........................................................................... 16 1.1.6 Epidemiologie ....................................................................................................... 17 1.2 Bakteriofágy ................................................................................................................. 19 1.2.1 Fágy specifické pro rod Staphylococcus ............................................................... 20 Podoviridae .................................................................................................................... 21 Siphoviridae ................................................................................................................... 21 Myoviridae ..................................................................................................................... 21 1.3 Vzájemné interakce bakterií a fágů ........................................................................... 24 1.3.1 Mechanismy rezistence bakterií k fágům ............................................................. 24 1.4 Restrikčně – modifikační systémy .............................................................................. 26 1.4.1 RM systémy typu I ................................................................................................ 27 1.4.2 RM systémy typu II .............................................................................................. 27 1.4.3 RM systémy typu III ............................................................................................. 27 1.4.4 RM systémy typu IV ............................................................................................. 28 1.4.5 R-M systémy S. aureus ......................................................................................... 28 Sau1....................................................................................................................... 29 Sau3AI a Sau96I ................................................................................................... 31 Sau42I ................................................................................................................... 31 SauUSI .................................................................................................................. 31 2 Cíle práce ............................................................................................................................. 33 3 Materiál a metody ............................................................................................................... 34 3.1 Staphylococcus aureus subsp. aureus ............................................................................ 34 3.2 Bakteriofágy................................................................................................................... 35 3.2 Kultivační média ............................................................................................................ 36 3.3 Roztoky a chemikálie ..................................................................................................... 36 3.4 Ostatní materiál .............................................................................................................. 36 Materiál pro izolaci DNA .............................................................................................. 36 Materiál pro PCR ........................................................................................................... 37
Materiál pro elektroforézu ............................................................................................. 37 3.5 Laboratorní přístroje................................................................................................... 37 3.6 Kultivační metody ........................................................................................................ 37 3.6.1 Příprava fágového lyzátu ...................................................................................... 37 3.6.2 Stanovení titru fágového lyzátu ............................................................................ 38 3.6.4 Testy citlivosti bakterie k fágům – kapková metoda ............................................ 38 3.6.3 Příprava modifikovaných fágů .............................................................................. 40 3.7 Izolace DNA .................................................................................................................. 41 3.7.1 Izolace pomocí kitu ............................................................................................... 42 3.7.2 Izolace přípravou hrubého buněčného lyzátu ....................................................... 42 3.8 Polymerázová řetězová reakce (PCR) ........................................................................ 43 3.8.1 Určení séroskupin profágů .................................................................................... 43 3.8.2 Určení integráz profágů ........................................................................................ 44 3.8.3 RM testy ................................................................................................................ 44 3.9 Gelová elektroforéza .................................................................................................... 46 4 Výsledky ............................................................................................................................... 47 4.1 Testy citlivosti S. aureus k polyvalentním fágům ......................................................... 47 4.2 RM testy ......................................................................................................................... 50 4.3 Příprava variant fága schopných růstu na necitlivých kmenech S. aureus .................... 51 4.4 Testování citlivosti lyzogenů s definovanými profágy .................................................. 53 4.5 Potvrzení přítomnosti profága Φ53 ................................................................................ 55 5 Diskuze ................................................................................................................................. 56 5.1 Testy citlivosti S. aureus k polyvalentním fágům ......................................................... 56 5.2 RM testy a vliv Sau1 ...................................................................................................... 57 5.3 Izolace variant fága schopných růstu na necitlivých kmenech S. aureus ...................... 59 5.4 Vliv lyzogenie na citlivost S. aureus k polyvalentním fágům ....................................... 60 5.5 Detekce fága Φ53 v kmeni NCTC 8511 ........................................................................ 61 5.6 Překonání R-M systémů polyvalentními fágy ............................................................... 62 5.7 Příčiny rezistence S. aureus k polyvalentním bakteriofágům ........................................ 63 5.8 Srovnání genomů citlivého a necitlivého kmene S. aureus ........................................... 64 6 Závěr..................................................................................................................................... 66 7 Seznam literatury ................................................................................................................ 67 7. 1 Internetové zdroje ....................................................................................................... 72 7. 1. 1 Zdroje obrázků........................................................................................................ 72
1 Úvod Při pohledu na koupající se zástupy v řece Ganze nejednoho z nás napadne, jak je možné, že jsou lidé zdraví. Voda barvy bílé kávy, v níž se mísí splašky a zbytky rozkládajících se těl přece nemůže být neškodná. Lidé jí dokonce přičítají zázračné ozdravující účinky. Říkáme sice „čistota půl zdraví, špína zdraví celé“, ale v tomto případě přecejen někteří z nás zakroutí hlavou. Byla to právě voda z této posvátné řeky, v níž byl poprvé pozorován fenomén samovolného projasnění bakteriální kultury Vibrio cholerae, původce cholery. Toto projasnění značilo lyzi bakterií způsobenou něčím, co bylo o pár let později nezávisle na tomto pozorování a nezávisle na sobě popsáno Frederickem Twortem a Félixem d’Hérellem a druhým jmenovaným nazváno viry bakterií – bakteriofágy (doslovně „požírači bakterií“). V dnešní době, kdy selekce mikrobů rezistentních k antibiotikům nabírá nečekané obrátky a stále častěji se tak objevují infekce neléčitelné dostupnými prostředky, se zdají být bakteriofágy možnou spásou. Přesto má o jejich existenci povědomí málokdo. V Gruzii je sice koupíte bez problémů a v polské Wroclavi vám v rámci experimentální léčby na vaši infekci vyberou nejúčinnějšího zástupce z jejich řad, (nejen) naše zákony a medicína jsou k nim však skeptické a k dostání u nás zatím byl a brzy opět bude jen antistafylokokový preparát na doporučení imunologa. A to přesto, že mnoha lidem specifické fágové preparáty zachránily končetinu nebo dokonce život. Proč se bakteriofágy častěji nevyužívají k léčbě bakteriálních infekcí i na západ od Gruzie je předmětem dohadů a literatura nám nabízí různá vysvětlení jako je nástup antibiotik ve 40. letech 20. stol., špatná znalost biologie fágů v začátcích jejich používání nebo velmi přísné požadavky systému schvalování léčiv a farmaceutické lobby. Na této problematice je zajímavé, že nejen náš zdravotnický systém se fágům brání. Velmi schopně se dokáží bránit samotné bakterie. Prakticky v každé fázi napadení fágem nastoupí obranný mechanismus, kterému fág musí čelit. Nejúspěšnější z fágů se přesto umí přenést přes tyto nástrahy a zachovávají si široké spektrum hostitelů. Dokáží napadnout a úspěšně zahubit většinu kmenů daného druhu bakterie a díky tomu si zasloužily přízvisko „polyvalentní“ a hrají důležitou roli ve fágové terapii. V této práci se zaměřím na enzymy schopné uvnitř bakteriální buňky rozpoznat a degradovat cizorodou DNA a tím zabránit postupující infekci fágem, která by jinak končila lyzí bakterie a uvolněním až stovky aktivních fágových částic do okolí. Jedná se o takzvané restrikčněmodifikační systémy. Vliv konkrétního z nich, nedávno objeveného u Staphylococcus aureus a nazvaného Sau1, na obranu tohoto druhu proti virulentním stafylofágům, bude rozebrán v praktické části této diplomové práce. 12
1.1 Staphylococcus aureus 1.1.1 Obecná charakteristika Staphylococcus (z řec. staphylē =hrozen a kókkos = zrnko) byl poprvé popsán roku 1880, poté co byl skotským chirurgem Alexandrem Ogstonem izolován zhnisu z otevřené rány kolene. Roku 1884 Friedrich J. Rosenbach rozlišil stafylokoky do dvou druhů: S. aureus („zlatý“) a S. albus („bílý“, dnes známý jako S. epidermidis) Bergey a kol. 2001.. Podle výsledků srovnávací analýzy 16S rDNA jsou stafylokoky blízkými příbuznými grampozitivních bakterií s nízkým procentuálním obsahem G+C v DNA: bacilů, enterokoků, streptokoků, laktobacilů a listerií (Sedláček 2007). Přesné zařazení S. aureus je uvedeno v Tab. 1. V současné době rozlišujeme dva poddruhy S. aureus: S. aureus subsp. aureus a S. aureus subsp. anaerobius, což je mikroanaerobní až anaerobní bakterie. Zlatý stafylokok patří mezi kataláza-pozitivní stafylokoky (má pozitivní test na vázanou i volnou koagulázu), zatímco stafylokoky příbuzné S. epidermidis jsou nazývány jako koaguláza-negativní (Bergey a kol. 2001). Tab. 1: Taxonomické zařazení S. aureus (NCBI). Doména: Bacteria Kmen: Firmicutes Třída: Bacilli Řád: Bacillales Čeleď: Staphylococcaceae Rod: Staphylococcus Druh: Staphylococcus aureus Zlatý stafylokok je téměř všudypřítomný – najdeme jej jako komenzála na kůži člověka (asi třetina lidí je bezpříznakovými nosiči) a teplokrevných zvířat, v prostředí i na potravinách. U člověka je nečastěji přítomen v nosu, nosohltanu, v podpaží a v okolí pohlavních orgánů (Votava 2003). Je to grampozititivně se barvící nepohyblivý kok o velikosti buňky asi 0,5-1 µm. Vyskytuje se jednotlivě, ve dvojicích, čtveřicích, krátkých řetízcích a typicky v útvarech připomínajících hrozny, což je způsobeno dělením buněk ve více rovinách. Buněčná stěna je složena z teichoové kyseliny a peptidoglykanu typu A3 (obsahuje aminokyselinu L-lysin). Většinou netvoří kapsulu, případně jen v omezené míře. Tvoří větší lesklé vystouplé kolonie (větší než 5 mm, menší u kmenů tvořících kapsulu) s celistvým okrajem. Většina kmenů produkuje nažloutlý až oranžový pigment. Na krevním agaru je patrná β-hemolýza (tedy úplná hemolýza) způsobená paradoxně α-hemolyzinem (Bergey a kol. 2001). 13
Obr. 1: Buňky S. aureus na snímku ze skenovacího elektronového mikroskopu. Obr. 2: Kultura S. aureus ve světelném mikroskopu, Gramovo barvení. Obr. 3: Morfologie kolonií na masopeptonovém agaru, 48hod kultura. Obr. 4: β-hemolýza viditelná na krevním agaru (menší kolonie – S. agalactiae). Zdroje: viz kapitola 7.1.1. Z hlediska metabolismu se jedná o fakultativně anaerobního mikroba, roste rychleji a hojněji v přítomnosti kyslíku (výjimkou je poddruh anaerobius). Je kataláza pozitivní (odlišení od streptokoků a enterokoků) a oxidáza negativní (rod Micrococcus a komplex S. sciuri jsou naopak oxidáza pozitivní). Roste na médiu s 10% obsahem NaCl, nejlépe při teplotě 30-37 °C. Lytický účiněk má na buňky S. aureus pouze lyzostafin (mikrokoky jsou k němu inertní), lysozym je neúčinný. Od mikrokoků, které jsou také přítomny na kůži savců a vykazují pigmentaci, se odlišuje také citlivostí k furazolidonu a rezistencí k bacitracinu (odlišení také od S. pyogenes), dále schopností anaerobně štěpit glukózu a aerobně gylcerol. Častá je citlivost k antimikrobiálním látkám jako je fenol a jeho deriváty, salicyalinidy a karbanilidy, halogeny (chlor, jód) a jejich deriváty. Od ostatních druhů klinicky významných stafylokoků se rozlišuje zejména na základě jeho produkce vázané koagulázy (tzv. clumping faktoru), která se detekuje pomocí latexového aglutinačního testu (Bergey a kol. 2001, Sedláček 2007). 14
1.1.2 Genom Staphylococcus aureus obsahuje kruhový chromozom o velikosti asi 2,9 Mpb, s obsahem G+C 33% (NCBI). Celková velikost genomu se může měnit v závislosti na přítomnosti mobilních genetických elementů, které zvyšují jeho plasticitu. Mezi mobilní genetické elementy přítomné u S. aureus patří např. plasmidy, profágy, introny, transpozony a ostrovy patogenity. K jejich přenosu
může
docházet
konjugací, transdukcí
prostřednictvím
transdukujícího fága a v laboratorním prostředí transformací. Baba a kol. (2008) uvádějí, že nejvýznamnější roli v evoluci S. aureus hrají právě profágy spolu s ostrovy patogenity. Přenosem virulentních faktorů a genů rezistence k antibiotikům totiž pomáhají S. aureus odolávat selekčnímu tlaku prostředí. 1.1.3 Faktory virulence a toxiny Faktory virulence mohou být přítomny u všech kmenů (peptidoglykan, vázaná koaguláza, apod.) nebo jen u některých (β-laktamáza). Podobné je to s toxiny – zatímco např. enterotoxin je údajně přítomen u téměř 50% stafylokoků, Panton-Valentinův leukocidin (PVL), toxin syndromu toxického šoku (TSST) nebo exfoliatin jsou spíše vzácnější. Toxiny, které jsou zároveň superantigeny, mají schopnost nespecifické aktivace lymfocytů a mohou tak vyvolat nadměrnou imunitní reakci organismu vedoucí k závažným stavům až smrti pacienta. Geny pro tyto toxiny, konkrétně PVL, TSST a enterotoxin, se nacházejí na chromozomu S. aureus na ostrovech patogenity (Staphylococcus aureus pathogenicity islands, SaPI) a mohou být přenášeny určitými bakteriofágy (Chen a Novick 2009). Přehled základních faktorů virulence a toxinů S. aureus nabízí Tab. 2 a Tab. 3. Tab. 2: Základní faktory virulence S. aureus (Votava 2003, Votava 2010, UniProt). Faktor virulence
Gen, umístění
Účinky
Následek
Protein A
spa, chromozom
Vazba Fc fragmentu imunoglobulinů
Znemožnění opsonizace/ fagocytózy
Vázaná koaguláza
clfA, clfB, chromozom
Shlukovací faktor, zprostředkování vazby na fibrinogen a keratinizované epitelie
Volná koaguláza
coa, chromozom
Tvorba fibrinu po reakci s krev. plasmou
Stafylokináza (fibrinolyzin)
sak, chromozom
Štěpení fibrinu
Průnik tkáněmi
Hyaluronidáza
hysA,chromozom
Štěpení mezibuněčného tmelu
Průnik tkáněmi
β-laktamáza (penicilináza)
blaZ, plasmid
Štěpení β-laktamového kruhu
Inaktivace βlaktamových ATB, rezistence
Shlukování stafylokokových buněk Ohraničení ložiska infekce (tvorba abscesu)
15
Tab. 3: Toxiny S. aureus (Votava 2003, Votava 2010, UniProt). Toxin
Gen, umístění
Účinky
Následek Poškození tkání, nekrózy
Cytolyziny: α – δ hemolyzin
hly (hla) – hld chromozom
α –hemolyzin: tvorba pórů v CM buněk
PantonValentinův leukocidin
lukF, lukS, chromozom (ostrov patogenity)
Tvorba póru v CM neutrofilů a makrofágů, superatigen
Nekrotické pneumonie
TSST-1
tst, chromozom (ostrov patogenity)
Poškození endotelu kapilár, superantigen
Syndrom toxického šoku
Enterotoxin A
entA (sea), chromozom
Narušení rovnováhy Cl- v lumen střeva, superantigen
Zvracení, průjem, TSS
Exfoliatin
eta, chromozom etb, plasmid
Narušení adheze mezi keratinocyty
Syndrom opařené kůže
1.1.4 Patogenní působení na člověka Zlatý stafylokok nejčastěji způsobuje hnisavá onemocnění kůže a kožních adnex (tzv. pyodermie), např. u malých dětí ve formě povrchových puchýřků (impetigo), ve formě zánětů mléčné žlázy (mastitid) u kojících žen nebo nežitu (furunculus). Často dochází k infekcím povrchových zranění, pooperačních ran a popálenin, kde jsou přítomna cizí tělesa. Z rány se může dostat do krevního řečiště a způsobit až septické stavy. Dále může být příčinou endokarditid (vegetace na srdečních chlopních), osteomyelitid (záněty kostní dřeně). V respiračním traktu způsobuje záněty vedlejších nosních dutin (sinusitidy) a sekundární pneumonie a bronchopneumonie navazující na chřipkové virózy. Mezi nejzávažnější onemocnění vyvolaná jeho toxiny patří stafylokokový syndrom opařené kůže (SSSS) objevující se vzácně u novorozenců a způsobený kmeny produkujícími exfoliatin nebo syndrom toxického šoku (TSS) způsobený přítomností toxigenního kmene v ráně nebo menstruačním tamponu (produkce TSST-1 nebo enterotoxinu). Častá je alimentární otrava termostabilním enterotoxinem (ze sekané, bramborového salátu, zmrzliny,…). Nejzávažnějšími onemocněními bývají nekrotizující hemoragické pneumonie způsobené kmeny produkujícími Panton-Valentinův leukocicin – PVL (Votava 2003), které mohou končit i u původně zdravého jedince velmi rychle a fatálně (Beneš a kol. 2010). 1.1.5 Terapie stafylokokových infekcí Stafylokokové infekce se nejčastěji léčí makrolidy nebo penicilinovými ATB odolnými k β-laktamáze (oxacilin, meticilin), případně jinými s přídavkem inhibitorů β-laktamázy. Dalšími léky volby jsou některé cefalosporiny, linkosamidy (klindamycin), léky poslední volby glykosamidy (vankomycin, teikoplanin). Citlivost k antibiotikům je nutné testovat kvůli výskytu multirezistetních kmenů (Lékařský slovník on-line). U nekrotizujících pneumonií je lékem první volby linezolid (Beneš a kol. 2010). 16
V současné době se stále častěji objevují kmeny rezistentní k antibiotikům: β-laktamovým – tzv. MRSA (methicillin-resistant S. aureus), makrolidovým – tzv. ERSA (erythromycinresistant) i glykopeptidovým, konkrétně k vankomycinu – tzv. VRSA (vancomycin-resistant), tetracyklinovám TRSA (tetracycline-resistant S. aureus), přičemž se tyto typy rezistence mohou kombinovat. Podle WHO končilo v době před nástupem antibiotik 90% stafylokokových infekcí smrtí. S přihlédnutím k frekvenci (i banálních) chirurgických zákroků v současné době, výskytu toxigenních kmenů MRSA napadajících i zdravé jedince a dále např. rizika velmi snadné kontaminace hrozící pacientům s popáleninami, je téma časté rezistence stafylokoků k antibiotikům závažným problémem. 1.1.6 Epidemiologie V současnosti jsou nejvíce sledovanými izoláty rezistentní k ATB. Izoláty rezistentní k meticilinu se rozlišují na HA-MRSA (hospital-aquired, nozokomiálního původu) a CAMRSA (community-aquired, původem z komunity) a LA-MRSA (livestock-associated MRSA) a EMRSA (epidemické MRSA). Nosičství některého z rezistentních kmenů může vést ke komplikacím v léčbě, např. po chirurgických zákrocích (von Eiff a kol. 2001). Proto byly zavedeny typizační metody dovolující sledovat šíření rezistence mezi izoláty a zabránit jeho postupu. U těchto izolátů se často provádí typizace SCCmec (staphylococcal casette chromosome mec stafylokokové chromozomální kazety mec), nesoucí gen mecA, který kóduje mutantní formu cílového proteinu β-laktamových antibiotik – PBP2a (penicillin-binding protein 2a). Ten postrádá vazebné místo pro β-laktamová antibiotika a způsobuje tedy rezistenci ke všem ATB z této skupiny, včetně meticilinu, na nějž nepůsobí širokospektré β-laktamázy produkované některými kmeny S. aureus (Deurenberg a kol. 2007). S. aureus se dále rozděluje do klonálních linií (CC – clonal cluster), které sdružují vývojově příbuzné klony. Standartní typizační metodou je MLST (multiple locus sequence typing), Ta je založená na sekvenaci a následném srovnání alelických profilů sedmi lokusů konzervativních, pro život bakterie nepostradatelných tzv. housekeeping (udržujících) genů kódujících: karbamát kinázu (arcC), šikimát-dehydrogenázu (aroE), glycerol kinázu (glpF), guanylát kinázu (gmk), fosfát acetyltransferázu (pta), triózfosfát izomerázu (tpi) a acetyl-koenzym A acetyltransferázu (yqiL), jak uvádějí Enright a kol. (2000). Referenční metodou je pulzní gelová elektroforéza (PFGE).
17
Typizační metoda dovolující zařazení izolátů až do klonů se nazývá spa typizace. Je zaměřena na jediný lokus ve stafylokokovém proteinu A, který je povrchovým proteinem buněčné stěny. Rozlišovací schopnost této metody se pohybuje mezi PFGE a MLST (Deurenberg a kol. 2007).
18
1.2 Bakteriofágy Bakteriofágy (zkráceně fágy), viry bakterií, byly objeveny dvěma badateli nezávisle na sobě. Roku 1915 Frederickem Twortem a roku 1917 Félixem d’Hérellem. Druhý jmenovaný jim nejen dal tento název, ale zavedl také léčbu bakteriálních infekcí člověka i hospodářských zvířat na bázi fágových preparátů. Jeho odkazem je Eliavův ústav v gruzínském Tbilisi, který založil spolu s Giorgim Eliavou roku 1923, a jenž se věnuje výrobě antibakteriálních preparátů na bázi fágových lyzátů dodnes. Fágy můžeme rozdělit na základě jejich životního cyklu na mírné (temperované) a virulentní (lytické). Mírné fágy se po injekci své DNA do bakteriální buňky mohou začlenit do jejího chromozomu a šířit se dále v populaci vertikálním přenosem. Za specifických podmínek (v laboratorních podmínkách indukcí UV zářením nebo mitomycinem C), se z jejího genomu vyčlení, replikují a dokončí životní cyklus lyzí hostitele a uvolněním nových fágových částic do okolí. Virulentní fágy se množí ihned po napadení hostitele a úspěšná infekce tedy vždy končí jeho lyzí. Množení fágů, při němž může z jedné infikované buňky vzniknout až stovka funkčních fágových částic, je nazýváno multiplikace. Odhaduje se, že v biosféře je přítomna populace fágů čítající přibližně 1030 fágových částic (Chibani-Chennoufi a kol. 2004), z toho v eutrofních vodách asi 108 částic/ml (Bergh a kol. 1989) a v půdě např. v blízkosti kořenů na polích cukrové třtiny 107 částic/g (Ashelford a kol. 2003). Prakticky všude, kde jsou přítomny bakterie, najdeme i fágy. Např. na lidské kůži, v ústní dutině i ve střevě. Při výzkumu na 600 zdravých dospělých byly u 34% z nich identifikovány kolifágy, u 1% ve vysokém množství (Furuse 1987). V minulosti hrály fágy důležitou roli při výzkumu na poli molekulární biologie (klonování), díky schopnosti některých fágů transdukce, tj. horizontálního přenosu bakteriálních genů ve fágových částicích (týká se tzv. transdukujících fágů). Tento proces je velmi důležitý zejména v evoluci bakterií, protože jsou často přenášeny geny kódující faktory virulence nebo jiné geny, zvýhodňující bakterii v daném prostředí. Dále se využívaly pro tzv. fagotypizaci, tzn. rozlišování příbuzných bakteriálních kmenů na základě jejich reakce na sadu specifických fágů. Dodnes se používá např. u salmonel. Fágy jsou také užívány k fágové terapii (např. Gruzie, Polsko), přičemž zájem o ni stále stoupá i v „západním světě“. Dalšími možnostmi využití fágů je mikrobiální dekontaminace potravin nebo detekce Listerie monocytogenes v potravinách. Příkladem významného negativního působení specifických fágů jsou zejména fágové infekce např. mlékárenských kultur např. Lactococcus lactis. Dalším významným negativem fágů je již zmiňovaný přenos genů pro toxiny nebo jiné virulentní faktory, týká se však jen určitých fágů, které jsou schopny transdukce.
19
Fágy se navzájem liší specifitou k hostiteli. Některé jsou schopny infikovat pouze určité kmeny daného druhu, hostitelské spektrum jiných fágů může zasahovat i za hranice druhu. Fágy s širokým rozmezím hostitele jsou pak nazývány jako polyvalentní. Při experimentu s polyvalentními fágy Φ812 a ΦSk311, který publikovali Pantůček a kol. (1998), byly tyto fágy množeny na svých pomnožovacích kmenech (tj. S. aureus 812 resp. S. carnosus TM300) i na pomnožovacím kmeni druhého fága. Na základě jednostupňových růstových křivek těchto fágů bylo zjištěno, že přestože byl fág Sk311 izolován z druhu S. carnosus, infekce S. aureus 812 byla o jeden řád produktivnější (přesněji o 20 fágových částic) než infekce fágem Φ812, který byl z tohoto druhu izolován. Fág ΦSk311 se na tomto kmeni dokonce multiplikoval efektivněji, než na svém pomnožovacím kmeni TM300. Kombinace polyvalentních fágů nebo jejich mutant, které rozšiřují rozmezí hostitele těchto fágů pak může pokrýt velmi široké spektrum bakteriálních kmenů: Z 92 sbírkových kmenů S. aureus, 590 klinických izolátů a 100 bovinních izolátů testovaných k fágu Φ812 a jeho mutantám v rozmezí hostitele, vykazovalo rezistenci jen 5% testovaných kmenů. Polyvalentní fág Φ812 a jemu příbuzné fágy jsou schopny infikovat také množství kmenů různých druhů koaguláza-negativních stafylokoků (Pantůček a kol. 1998). Polyvalence je dle Chennoufi a kol. (2004) důsledkem závislosti úspěšného množení bakteriofága na titru dané bakterie. Např. u fága T4 je potřeba nejméně 104 bakterií E. coli /ml, aby byly nové fágové částice schopny infikovat dalšího hostitele a pokračovat tak v lytickém cyklu (Wiggins a Alexander 1985). Rozšířené hostitelské spektrum tedy zvyšuje množství potenciálních hostitelů a umožňuje tak přežití fágů v prostředí, kde je zastoupeno více příbuzných druhů nebo kmenů bakterií, ale žádný z nich nepřevažuje natolik, aby sám o sobě dostačoval pro úspěšné množení fágových generací. Téměř specialistou je v tomto ohledu kolifág Mu (mutátor), jehož rekombináza dokáže změnit orientaci jednoho z genů, které jsou zodpovědné za rozpoznávací specifitu fágového receptoru. Výsledkem je fág se dvěma různými bičíkovými receptory a rozšířeným hostitelským spektrem (Scholl a kol. 2001) 1.2.1 Fágy specifické pro rod Staphylococcus Fágy schopné multiplikace na stafylokocích jsou také nazývány stafylofágy. Všechny patří do jediného řádu Caudovirales, v rámci něj pak do čeledí Podoviridae, Siphoviridae a Myoviridae. Jedná se o neobalené viry s genetickou informací ve formě dsDNA, zabalenou do proteinového kapsidu ve tvaru ikosaedru. Je známo více než 215 stafylokokových fágů (Lobocka a kol. 2012), kteří se dělí do 11 sérologických skupin: A, B, C, D, E, F, G, H, J, K a L). 20
Podoviridae Do této čeledi jsou řazeny fágy s malým genomem (16–18 kb) a krátkým, nekontraktilním bičíkem. Jsou mezi nimi i obligátně virulentní fágy. Hostitelské spektrum těchto fágů je široké, ale omezuje se na koaguláza-negativní stafylokoky. Proto příliš nebývají součástí sbírek bakteriofágů využitelných pro fágovou terapii (Lobocka a kol. 2012). Siphoviridae Jedná se o fágy se středně velkým genomem a dlouhým, nekontraktilním bičíkem. Stafylofágy z této čeledi jsou mírnými fágy, některé mají schopnost transdukce. V minulosti byly hojně využívány pro fagotypizaci ve formě tzv. mezinárodní typizační řady (International phage typing set – IPTS, také zvané International basic set – IBS). Obsah G+C v jejich DNA se pohybuje mezi 29-38%, dle fágů, jejichž genom byl zatím sekvenován (Kwan a kol. 2005). Podle povrchových proteinů kapsidu se stafylofágy této čeledi rozdělují do sérologických skupin, mezi nejvíce studované patří fágy ze skupin: A, B (Ba, Bb, Bc, Bd), C, F (Fa, Fb), L. Dříve byly tyto skupiny zjišťovány na základě reakce se sérem, tu později nahradila multiplex PCR zacílená na geny kódující tzv. modul pro sbalování a pro hlavičku a bičík fágů. Podle srovnání sérologických skupin A, B a F analýzou RFLP vykazují fágy v rámci serologických skupin A (Φ77) a F (Φ47) určitou homologii (55 – 80%), zatímco skupina B (Φ85, Φ53) je velmi různorodá: Podobnost fragmentů vzniklých štěpením profágových genomů restrikční endonukleázou HindIII se pohybuje zhruba mezi 5 – 53% (Doškař a kol. 2000). Dle této analýzy jsou si nejvíce vzájemně příbuzné skupiny F a Bc (10% homologie), mezi ostatními skupinami je vzájemná homologie jen 5%. Kvůli značné heterogenitě čeledi Siphoviridae se dnes řada autorů přiklání k jejich klasifikaci na základě integráz, enzymů, které zajišťují specifickou integraci do tzv. attB míst bakteriálního chromozomu. U stafylofágů bylo těchto integráz popsáno 10 (Sa1Sa9 a Sa12). Zatím nejpřesnější metodou na identifikaci mírných stafylofágů je kombinace multiplex PCR zacílených na jednotlivé moduly fágového genomu (Kahánková a kol. 2010), které jsou detekovány na chromozomu hostitelského kmene profága. Myoviridae Zástupce této čeledi charakterizuje kontraktilní bičík a velký genom. Polyvalentní fágy sérologické skupiny D z této čeledi charakterizuje nejširší hostitelské spektrum a jsou také nejlépe prostudovány. Jak bylo zmíněno výše, jejich hostitelské spektrum může obsahovat kmeny z různých druhů koaguláza-pozitivních i koaguláza-negativních stafylokoků. Z fágů se sekvenovaným genomem zde patří: ΦK, ΦG1, ΦTwort, ΦSb-1, ΦISP, ΦA5-W, ΦStaph1N, 21
Φfi200W, ΦP4W, Φ676Z, ΦA3R, ΦMSA6, ΦSA11, ΦGH15, ΦRomulus, ΦRemus, u Φ812 byly sekvenovány jen fragmmenty DNA (Vandersteegen a kol. 2013). A) ΦTwort, ΦK, ΦG1 Obsah C+G v genomu těchto fágů je mezi 30-31%. Fág Twort byl vůbec prvním popsaným bakteriofágem, jméno získal po svém objeviteli Fredericku Twortovi. Jeho genom obsahuje 130,7 kb (genom ΦK 127,4 kb a ΦG1 138,7 kb) . Tyto velmi efektivní polyvalentní virulentní fágy se mezi sebou liší zejména obsahem a lokalizací intronů. U ΦTwort byl navíc detekován gen kódující intein (tzv. proteinový intron), což napovídá o proměnlivosti v rámci genomu. Srovnáním genomových sekvencí stafylofágů bylo zjištěno, že jsou jejich genomy velmi proměnlivé a vykazují znaky mosaicismu (podobně jako prokaryotické genomy), což může souviset s výměnou genů mezi fágy navzájem (která zatím nebyla experimentálně dokázána). Příkladem je srovnání segmentu genů zodpovědných za replikaci DNA u velmi příbuzných fágů ΦK a ΦG1: Obsahuje delece a inzerce v různých mistech a otevřené čtecí rámce charakteristické jen pro jednoho z nich a postrádající homologie se známými geny fágů a bakterií (Kwan a kol. 2005). Strukturální modul fága K navíc vykazuje vysokou homologii se strukturálním modulem listeriového fága – A511. Může to být následek mezidruhového horizontálního přenosu (O’Flaherty a kol. 2004). Virulentní fágy navíc běžně přicházejí uvnitř bakteriálních hostitelů do kontaktu s mírnými fágy, proto zde zajisté může dojít k výměnám genů nebo jejich částí. B) Φ812 Tento polyvalentní fág je také řazen do rodu Twort a je velmi blízce příbuzný třem výše zmíněným fágům. Stejně jako jeho propagační (pomnožovací) kmen SA 812, byl tento fág získán od Dr. Pillicha z Biofyzikálního ústavu v Brně a nyní je součástí sbírky LMDM ÚEB. Doškař (1989) prokázal, že na něj nepůsobí R-M systémy typu II a zatím není známo, jeký mechanismus způsobuje rezistenci S. aureus k tomuto fágu. V 70. letech byly izolovány první spontánní mutanty tohoto fága (Rosypal a Rosypalová 1972), následné izolace spontánních mutant vedly k rozšíření hostitelského spektra tohoto fága až na 95% ze 782 testovaných kmenů a izolátů S. aureus. Výše zmíněný mosaicismus fágových genomů dokazuje analýza genomů některých fágových mutant. Vyskytují se zde delece, inzerce a změny cílových míst některých komerčně užívaných restrikčních enzymů – přestavby genomu, zisk i ztráta těchto míst (Pantůček a kol. 1998). U některých mutant byl detekován intron v genu recA, který pravděpodobně kóduje rekombinázu a mohl by tedy ovlivňovat mimo jiné schopnost reparace DNA (Kašpárek a kol. 2007). Mutace v tomto genu tedy mohou vést k dalším změnám 22
v genomu. Velká plasticita genomu fágům dovoluje přizpůsobit se bariérám rezistence jejich hostitelů. Obr. 5: Izolace mutant fága 812
v rozmezí
hostitele
(Rosypal a Rosypalová 1972, upraveno). Oranžově kmeny S. aureus, na nichž byla daná mutanta izolována.
C) ΦRomulus a ΦRemus Jsou zatím posledními objevenými polyvalentními fágy. Sekvenace jejich genomů prokázala jejich příbuznost s fágy ΦK, ΦG1, ΦTwort, ΦISP a dvěma listeriovými fágy A511 a P100. Liší se od nich distribucí intronů a přítomností dalších mobilních genetických elementů. Rozdíly proti fágům z rodu Twort jsou dle autorů dostačující, aby byl pro tyto fágy zaveden nový druh (Vandersteegen a kol. 2013). Hostitelské obou fágů spektrum bylo testováno na 90 izolátech S. aureus, 9 S. haemolyticus a 1 S. epidermidis. Výsledkem byla přibližně 70% citlivost ke každému z fágů. Tyto fágy také prokázaly schopnost degradace biofilmu kmene S. aureus PS47 a mohly by tedy najít uplatnění ve fágové terapii (Vandersteegen a kol. 2013).
23
1.3 Vzájemné interakce bakterií a fágů Vzájemná rovnováha mezi populacemi bakterií a bakteriofágů je velmi důležitá pro rovnováhu ekosystémů, v nichž se vyskytují. Bakterie jsou na jednu stranu „kolonizovány“ mírnými fágy, v jejichž zájmu je začlenit se do genomu bakterie a ve formě profága se vertikálně šířit z generace na generaci. V podmínkách vystavení hostitelské buňky stresu (např. určitým chemickým látkám, zvýšené teplotě, ale nejčastěji přímé expozici UV záření) se uvolnit z její DNA a dokončit lytický cyklus, v případě vláknitých fágů z čeledi Inoviridae bakterii opustit bez jejího usmrcení. Pro virulentního fága je podstatná schopnost infekce hostitele, multiplikace a uvolnění až stovky fágových částic do okolního prostředí, aby se zvýšila pravděpodobnost infekce dalších hostitelů, kteří mohou být od toho původního často vzdáleni. Mezi bakteriemi a fágy a zároveň mezi virulentními a mírnými fágy tak vzniká vzájemná konkurence udržující rovnováhu v druhovém složení bakteriální populace. 1.3.1 Mechanismy rezistence bakterií k fágům Pro bakteriální druhy v rámci populace je důležitá schopnost bránit se infekci fágem, aby mohla konkurovat jiným bakteriálním populacím v daném prostředí. Rezistence k fágům se může velmi lišit i v rámci jediného kmene. U streptomycet bylo pozorováno, že dozrálá, k fágům rezistentní mycelia jsou schopna chránit klíčící spóry (které jsou náchylnější k infekci fágem) tím, že na sebe ve velkém množství adsorbují specifické fágy, napadající tento druh půdní bakterie (Burroughs a kol. 2000). Před infekcí virulentním fágem může bakterii chránit také profág, s čímž souvisí produkce imunitního represoru bránící infekci příbuzným fágem (který by mohl původního profága „vytlačit“ z místa, kde je integrován v DNA. Dále může profág způsobit lyzogenní konverzi (změnu fenotypu po začlenění mírného fága), která může pozměnit stavbu buněčné stěny hostitele a bránit tak adsorpci nejen jiných fágů (Jonasson a kol. 1969), ale také fágového potomstva, které by se mohlo vázat na zbytky buněčné stěny po lyzi bakterie (Labrie a kol. 2010). Proteiny, kterými disponují profágy, aby zabránily superinfekci jiným fágem, se souhrnně nazývají Sie (superinfection exclusion) systémy. Jak bylo zmíněno výše, rezistence bakterií k fágům je důsledkem interakce mezi bakterií a fágem nebo mezi fágy navzájem. Tyto mechanismy byly nejlépe prostudovány u E. coli, poznatky z výzkumů na jiných bakteriálních druzích však rozšiřují představu o možnostech obrany bakterií proti fágům. U S. aureus tyto mechanismy zatím nebyly podrobeny detailnějšímu zkoumání. Za hlavní příčinu rezistence S. aureus k fágům jsou považovány R-M systémy (Doškař 1989, Kelly a kol. 2011), v menší míře pak profágy (Rosypal a Horáková 1968).
24
Některé ze zatím popsaných příčin rezistence bakterií k virulentním fágům jsou popsány v Tab. 4. Různé mechanismy nastupují v různém stádiu fágového lytického cyklu, proto není vyloučeno, že mohou bakterie disponovat více mechanismy zároveň. Tab. 4: Příklady mechanismů rezistence bakterií proti virulentním fágům a reakce fágů. Jmenováni jsou jen zástupci bakterií, daný mechanismus může být prokázán u více druhů. U CRISPR-Cas systému přesný mechanismus zatím znám, může se jednat o RNA interferenci. Fáze lytického cyklu
Adsorpce fága
Injekce DNA
Transkripce a replikace DNA
Maturace fágových částic
Obrana bakterie
Molekulární podstata
Reakce fága
Prokázáno u bakterie
Tvorba kapsuly
Hyaluronan
Produkce hyaluronidázy
Streptococcus 1 spp.
Protein A
Neznámá
S. aureus
Vazba mikrocinu na fágový receptor
Neznámá
E. coli
Neznámá
Streptococcus 4 thermophilus
Maskování fágového receptoru Produkce kompetitivních inhibitorů Zábrana injekce DNA R-M systémy CRISPR-Cas systém Abortivní systémy
Lipoprotein v BS kódovaný profágem Enzymy rozpoznávající a štěpící cizorodou DNA Specifická imunita na základě získané části fágové NK Např. signálními proteiny řízený únik ATP → smrt buňky
Glukosylace hydroxymetylovaných bází Antirestrikční proteiny
E. coli
2
3
5
Bodová mutace/delece v rozpoznávacím místě
S. thermophilus
Mutace v transkripčním faktoru ovlivňujícím RNA polymerázu hostitele
E. coli
6
7
Reference: 1) Benchetrit a kol. 1977, 2) Nordström a Forsgren 1974, 3) Destoumieux-Garzon a kol. 2005, 4) Sun a kol. 2006, 5) Labrie a kol. 2010, Rifat a kol. 2008, 6) Mojica a kol. 2009, 7) Molineux 1991.
25
1.4 Restrikčně – modifikační systémy Byly to právě bakteriofágy, díky kterým byly v 50. letech minulého století objeveny restrikčněmodifikační (zkráceně R-M systémy). V té době si mikrobiologové všimli, že rozmezí hostitele bakteriofága je ovlivněno kmenem, na kterém je fág pomnožen (Murray 2000). V šedesátých letech pak bylo zjištěno, že tento „otisk“, který si fág nese z posledního kmene, na němž byl pomnožen, je specifickou modifikací DNA. Ta se změní po replikaci na jiném kmeni a chrání fágovou DNA před restrikční endonukleázou (enzymem štěpícím fosfodiesterové vazby DNA), která rozeznává stejnou cílovou sekvenci, jako DNA metyláza (enzym katalyzující přenos metylové skupiny na specifickou bázi rozpoznávacího místa daného R-M systému), kterou byl fág modifikován (Smith a kol. 1972). Jako první byly popsány R-M systémy u E. coli K-12 a E. coli B , u nichž se také podařilo purifikovat jejich enzymy (Meselson a Yuan 1968). Protože však patří mezi R-M systémy typu I, které štěpí DNA na nespecifické fragmenty, nemohly být prakticky využity (Murray 2000). Díky objevu R-M systémů typu II, jejichž restrikční endonukleázy štěpí DNA jen ve specifických místech, je dnes molekulární biologie taková, jakou ji známe. Využití těchto enzymů umožnilo zavedení nových metod od analýzy délky restrikčních fragmentů (RFLP) až po genetické inženýrství. Biologickou funkcí R-M systémů je ochrana bakteriální buňky před vstupem cizorodé DNA, která by ji mohla poškodit (např. fágová DNA) nebo zbytečně zatížit její replikační aparát a snížit tak její životaschopnost. Některé R-M systémy mohou být kódovány mírnými fágy, jejich hostitel je tak chráněn před superinfekcí virulentním fágem, která by ohrozila i existenci profága (Dempsey a kol. 2005). Jednotlivé R-M systémy mají jména podle rodového (první písmeno) a druhového jména (2 písmena) bakterie, z níž byly izolovány, dále kmene a případně je doplněna římská číslice, která odlišuje jednotlivé R-M systémy izolované ze stejného kmene (Murray 2000). Např. EcoR124II je R-M systém izolovaný z druhu Escherichia coli, kmene R124 a byl u něj izolován jako II.v pořadí. Rozdělení R-M systémů je založeno na jejich stavbě a kofaktorové náročnosti, dále zde hraje roli povaha jejich rozpoznávací sekvence a umístění místa štěpení vzhledem k této sekvenci (Murray 2000). Všeobecně uznávaným je dělení R-M systémů do tří typů: I, II a III, v rámci kterých se dále mohou dělit na subtypy (u R-M systémů typu II) nebo tzv. rodiny (u RM systémů typu I). Dále je uváděn také typ IV. Do něj se řadí metyldependentní endonukleázy, které netvoří dvojici s konkrétní metylázou a nedají se tedy považovat za restrikčněmodifikační systém v pravém slova smyslu. .
26
1.4.1 RM systémy typu I Tyto R-M systémy jsou charakteristické zejména svou stavbou – u všech R-M systémů typu I se jedná o jediný protein složený z více podjednotek: většinou dvou podjednotek hsdM a jedné podjednotky hsdS k nimž jsou navázány dvě podjednotky hsdR. Geny kódující hsdM a hsdS se částečně překrývají. Za metyltransferázovou aktivitu zodpovědná část koplexu složená z podjednotek hsdM a hsdS (M2S1). Endonukleázový komplex zodpovědný za restrikci DNA, je tvořen metyltransferázovým komplexem s navázanými restrikčními podjednotkami (R2M2S1). Po nalezení rozpoznávací sekvence a hydrolýze ATP dochází k translokaci DNA tímto proteinem dokud nedojde ke kolizi s dalším endonukleázovým komplexem popřípadě s jiným proteinem. Následně je zahájena restrikce DNA na zcela náhodném místě (Murray 2000, Roberts a kol. 2003) Obr. 6: Metylázový komplex R-M systému typu I EcoKI s navázanou DNA (oranžově).
Modře
podjednotka
hsdS,
rozpoznávací zeleně
dimer
metylační podjednotky hsdM, růžově kofaktor S–adenosylmethionin. Atomový model podle elektronové mikroskopie. Upraveno v programu Pymol. (RCSB PDB, ID: 2Y7H, Kennaway a kol. 2009)
1.4.2 RM systémy typu II Skládají se ze samostatných enzymů Mod a Res kódovaných samostatnými geny. Jsou typické tím, že štěpí DNA ve specifických místech, často blízko rozpoznávací sekvence nebo přímo v ní. Většina metyltransferáz R-M systémů tohoto typu rozeznává jen jedinou sekvenci, některé však rozpoznávají sekvencí více. Často vyžadují Mg2+ ionty jako kofaktor. (Murray 2000, Roberts a kol. 2003) 1.4.3 RM systémy typu III Zde jsou sice podjednotky Mod a Res kódovány oddělenými geny, pro endonukleázovou aktivitu je však zapotřebí obou. Podjednotka Mod může fungovat samostatně, výsledkem její aktivity je hemimetylace DNA. Aby mohlo být zahájeno štěpení DNA, musí enzym interagovat
se
dvěma
opačně
orientovanými,
nepalindromatickými
rozpoznávacími 27
sekvencemi. Samotnému štěpení pak předchází ATP-dependentní translokace DNA, jako u endonukleáz R-M systémů I. typu. Štěpení probíhá v určité vzdálenosti od obou kopií rozpoznávacího místa. (Murray 2000, Roberts a kol. 2003) 1.4.4 RM systémy typu IV Tyto R-M systémy jsou sice složeny ze dvou proteinů, oba se však podílejí na štěpení modifikované DNA (tzn. metylovaných, hydroxymetylovaných i glukosyl-hydroxymetylovaných bází). Jejich rozpoznávací sekvence většinou nejsou známy. U R-M systému EcoKMcrBC jsou rozpoznávacími místy dva dinukleotidy (puriny následované metylovaným cytosinem) a ke štěpení dochází asi 30 bp od jednoho z těchto míst. (Murray 2000, Roberts a kol. 2003) 1.4.5 R-M systémy S. aureus V databázi REBASE je k 5. 5. 2013 vloženo celkem 323 akronymů různých restrikčněmodifikačních systémů S. aureus. Většinou se jedná o putativní R-M systémy získané analýzou sekvencí S. aureus a jejich porovnáním se sekvencemi už popsaných, biochemicky charakterizovaných R-M systémů z databáze. Je zde celkem 470 enzymů a domnělých enzymů R-M systémů S. aureus typu I, II, III i IV. Tyto enzymy byly izolovány z celkem různých 70 kmenů S. aureus. Přesto byly dostatečně prostudovány, popsány a publikovány jen některé R-M systémy S. aureus. V databázi jich najdeme celkem 31 (k 5. 5. 2013; viz Tab. 5). Chybí zde R-M systém Sau1 (v databázi nebyl autory jeho objevu umístěn a nejspíše je zde anotován pod jinými názvy dle kmene izolace).
28
Tab. 5: Biochemicky charakterizované R-M systémy S. aureus přítomné v databázi REBASE k 5. 5. 2013 (Roberts a kol. 2007). Typ (subtyp) I II S II E,P II P
II P II P
II P II P II P II P II G,H IV
IV
Název
Rozpoznávací sekvence
Štěpená sekvence
Vloženo
SauS2I Sau12I Sau3AI, SauMI
neznámá GGTCTC GATC
náhodná neznámá
1998 1988 1976, 1989
SauCI, SauDI, SauEI, SauFI, SauGI,Sau6782I, Sau15I Sau96I
GATC
neznámá
GGNCC
G GNCC
1978
GGNCC
neznámá
1989,1990, 1998, 2004
GGTACC CCTNAGG CTYRAG
neznámá neznámá neznámá
1988 1991 2004
CCWGG neznámá SCNGS
neznámá neznámá štěpení 218 bp po směru rozpoznávací sekvence neznámá
1990 1997 2011
SauBI, Sau2I, Sau5I, Sau13I, Sau14I, Sau17I, Sau557I,Sau32I, Sau33I Sau10I SauHI Sau90I, Sau93I, Sau96I,Sau98I Sau16I Sau42I SauUSI
SauNewI
SCNGS
↓
GATC
↓
1977, 1985, 1990
2011
Sau1 Informace o tomto R-M systému poprvé publikovali Waldron a Lindsay roku 2006. Ve své práci jej označili za hlavní mechanismus, který brání přenosu DNA (včetně genů kódujících virulentní faktory a rezistenci k ATB) jak mezi jinými druhy a S. aureus, tak mezi klonálními liniemi S. aureus. Tento závěr by vysvětloval zatím nízký počet VRSA (tedy S. aureus, které byly schopny přijmout gen rezistence k vankomycinu, vanA, od enterokoků) a nezdary při snaze studovat klinické kmeny pomocí metod založených na jejich genetické manipulaci. Dále by objasňoval, proč byl gen zodpovídající za rezistenci k meticilinu (mecA) detekován jen u 6 z 10 hlavních klonálních linií S. aureus (CC1, CC5, CC8, CC22, CC30 a CC45). Autory k tomuto závěru vedly pokusy s velmi rozšířeným kmenem S. aureus využívaným zejména pro transformaci DNA elektroporací: RN4220. Tento kmen velmi ochotně přijímá cizorodou DNA v porovnání s jinými laboratorními kmeny S. aureus. Srovnáním (v té době 9 dostupných) sekvenovaných genomů S. aureus vyšlo najevo, že všechny obsahují R-M systém typu I vykazující vysoký stupeň homologie. Sekvenací genů kódujících podjednotky tohoto R-M 29
sytému nazvaného Sau1 bylo zjištěno, že kmen RN4220 obsahuje mutaci v genu pro restrikční podjednotku (sau1hsdR). Po komplementaci tohoto genu jeho funkční alelou, byla znemožněna transformace i konjugace plasmidové DNA původem z E. coli do tohoto kmene, což prokazuje roli Sau1 v horizontálním přenosu genů. Také mírný bakteriofág pomnožený na kmeni jedné klonální linie nebyl schopný transdukce DNA do kmene jiné klonální linie s funkční restrikční podjednotkou. R-M systém Sau1 je kódován celkem pěti geny nesenými na chromozomu: genem pro restrikční podjednotku (sau1hsdR) a dvěma kopiemi genů pro modifikační podjednotku (sau1hsdM1 a sau1hsdM2) a podjednotku specifity (sau1hsdS1 a sau1hsdS2), které se nacházejí odděleně na stabilních genomických ostrovech nazývaných GIα a Giβ (Waldron a Lindsay 2006) nebo νSaα a νSaβ (Tsuru a kol. 2006), geny kódující hsdS byly objeveny u jednoho ze sekvenovaných kmenů i na ostrově patogenity etd (Tsuru a kol. 2006). Díky tomuto podjednotkovému složení nepatří Sau1 do žádné z dosud stanovených tříd R-M systémů typu I tzn. IA – IE (Waldron a Lindsay 2006). Pomocí mikročipu s PCR sondami, které odpovídaly variabilním oblastem TRD1 a TRD2 z obou genů kódujících hsdS (sau1hsdS1 a sau1hsdS2) bylo zjištěno, že se kombinace genů pro sekvenční specifitu velmi liší mezi testovanými izoláty. V souboru čítajícím 161 komunitních S. aureus, byly izoláty rozdělené do 10 hlavních linií S. aureus a izoláty z minoritních linií. Bylo zde detekováno 5 typů TRD1 a 9 typů TRD2, přičemž se izoláty lišily v jejich kombinaci. Odlišnost mezi izoláty odpovídala příslušnosti k jedné z 10 hlavních klonálních linií S. aureus (CC1, CC5, CC8, CC12, CC15, CC22, CC25, CC30, CC45 a CC51).
Obr. 7: Variabilita mezi podjednotkami hsdS R-M systému Sau1 u kmenů S. aureus. ST = sekvenční typ dle MLST, PrCR = proximální konzervativní region, TRD = doména rozpoznávající cílovou sekvenci, CCR = centrální konzervativní region, DCR = distální konzervativní region. Čísla označují typ podjednotky hsdS. Převzato z Tsuru a kol. 2006, upraveno dle Waldron a Lindsay 2006. 30
Sau3AI a Sau96I Jedná se o první objevené R-M systémy S. aureus. Většina ostatních R-M systémů S. aureus typu II je od jednoho z nich odvozena (mají stejnou rozpoznávací sekvenci). Bylo zjištěno, že polyvalentní fágy jsou inertní vůči jejich působení (Doškař 1989), protože postrádají cílovou sekvenci R-M systému typu Sau3AI ve svém genomu (Pantůček a kol. 1998, REBASE, GenBank) a pro Sau96I obsahují jen jednu rozpoznávací sekvenci (Szilák a kol. 1990), čímž značně snižují efektivitu tohoto R-M systému (Murray 2000). Sau3AI není u kmenů S. aureus příliš častý a nejspíše je kódován na mobilním genetickém elementu (Waldron a Lindsay 2006). Sau42I Tento R-M systém je také řazen mezi R-M systémy typu II. Vykazuje 60% identitu s R-M systémem BcgI druhu Bacillus coagulans. Je nesen profágem Φ42 a proto není u kmenů S. aureus příliš častý. Lyzogenní konverze hostitele pak díky přítomnosti tohoto R-M systému brání superinfekci jiným fágem (Dempsey a kol. 2005). SauUSI Corvaglia a kol. (2010) popsali nový R-M systém na základě pokusů o přenos DNA E. coli do kmenů S. aureus s inaktivovaným R-M systémem Sau1 (mutací v hsdR). Sekvenční homologie podjednotky zodpovědné za restrikci DNA naznačovala příbuznost s R-M systémy typu I nebo III. Pro potvrzení, že se nejedná o jiný R-M systém typu I byly za použití targetronu (zacíleného intronu) poškozeny obě hsdS podjednotky přítomné ve vybraném kmeni WT SA564. Enzym byl schopen restrikce DNA i bez přítomnosti těchto podjednotek, autoři tedy R-M systém nazvali „podobným typu III“ (type III-like). O rok později publikovala hlavní autorka (tentokrát na druhém místě) s novým kolektivem výsledky navazující práce - u kmene USA300 prokázali, že se jedná o R-M systém typu IV na základě preferovaného substrátu - plasmidů obsahujících modifikovaný cytosin (přesněji 5-hydroxymetylcytosin). R-M systém nazvaný SauUSI je podle autorů konzervovaným R-M systémem typu IV bránící transformaci cizorodou DNA, což by vysvětlovalo, proč jsou stafylokoky nevhodnými adepty pro přenos DNA touto cestou, který se daří jen u mála kmenů (Xu a kol. 2011). Monk a kol. (2012) tento závěr potvrdili: Plasmidy z mutantního kmene E. coli s deficiencí cytozin-metyltransferázy bylo možné přenést do klinických izolátů S. aureus. Díky chybějící metylaci je SauUSI cílového kmene nemohl rozpoznat a proto nebyly jeho restriktázou naštěpeny. Zároveň bylo u kmene USA300 na modelu bakteriémie myši prokázáno, že ztráta restrikční schopnosti (typu I a typu IV) nemá vliv na virulenci kmene USA300. Cílená 31
inaktivace SauUSI (příp. ortologního genu McrR u S. epidermidis) by tedy mohla vést ke snadnější konstrukci stafylokokových mutant a tím k rozšíření možností studia klinických izolátů S. aureus a S. epidermidis (Monk a kol. 2012). Zdá se tedy, že jsou klinické kmeny S. aureus obdařeny více než jedinou bariérou horizontálního přenosu genů. V případě, že dojde k mutacím v jednom R-M systému, může zůstat druhý funkční a restrikční bariéra je u daného kmene zachována.
32
2 Cíle práce Cílem mé diplomové práce bylo zjistit, zda rezistenci kmenů S. aureus k polyvalentním bakteriofágům ovlivňuje působení R-M systémů těchto kmenů. Vzhledem k tomu, že vliv R-M systémů typu II na polyvalentní bakteirofágy není považován za významný, zaměřila jsem se na nedávno popsaný R-M systém typu I - Sau1. Tento R-M systém se liší sekvenční specifitou rozpoznávací podjednotky (hsdS) mezi jednotlivými klonálními liniemi MRSA a hraje úlohu v horizontálním přenosu genů mezi nimi. Mohl by proto ovlivňovat i citlivost kmenů k polyvalentním bakteriofágům. Cílem mé práce tedy bylo ověřit tento předpoklad na souboru dobře charakterizovaných klinických izolátů MRSA zařazených do klonálních linií. Mezi dílčí kroky mé práce patřilo: 1. Stanovení citlivosti vybraných kmenů S. aureus k sadě polyvalentních bakteriofágů. 2. Ověření přítomnosti R-M systému Sau1 (odpovídající specifitou CC kmene) pomocí PCR zacílené na geny jeho rozpoznávací podjednotky hsdS u vybraných kmenů. 3. Stanovení korelace mezi citlivostí kmenů S. aureus k polyvalentním fágům a specifitou jejich R-M systému. 4.
Izolace variant fága Φ812 schopných růst na necitlivých kmenech S. aureus a stanovení vlastností těchto fágů.
33
3 Materiál a metody 3.1 Staphylococcus aureus subsp. aureus V této práci byly použity pouze kmeny S. aureus subsp. aureus. Kontrolním kmenem byl SA 812 (CC30), propagační kmen Φ812. Hlavní testovanou skupinou byly detailně charakterizované izoláty CA-MRSA a HA-MRSA z nemocnic ČR z let 2000 – 2008, které jsou ve sbírce LMDM (podrobné informace o kmenech v Tab 6). Uvedeny jsou také sérologické skupiny a integrázy profágů (profágový profil). Do testů citlivosti byl zařazen i sekvenovaný kmen Mu50 (CC5) a propagační kmen preparátu Stafal, 1137 (CC30). Dále byly testovány sbírkové kmeny LMDM ÚEB s definovanými profágy a jejich varianty bez těchto profágů (viz Tab. 7). Určité sbírkové kmeny byly použity jako kontroly PCR. Tab. 6: Charakteristika testovaných izolátů MRSA. Původ: BB = Brno-Bohunice, ČB = České Budějovice, KV = Karlovy Vary, Par = Pardubice, PH = Praha Homolka, PM = Praha-Motol. Rezistence k ATB: A = ampicilin, Cip = ciprofloxacin, Cli = klindamycin, Cmp = chloramfenikol, Cot = kotrimoxazol, E = erytromycin, G = gentamycin, O = oxacilin, Rif = rifampicin, T = tetracyklin). Izolát
Původ
Rok
Rezistence k ATB
MRSA
CC
SCCmec
Profágový profil
E29
BB
2002
O, A
HA
1
IV
Sa2 Sa3/A Fa
E26
BB
2001
O, E, Cli, Cip,A
HA
5
II
E28 E39 E46
BB BB BB
2002 2002 2002
HA HA HA
5 5 5
I I I
E61 04/787 06/768 08/628 08/794 E14
BB Opava Kladno Par Kladno BB
2003 2004 2006 2008 2008 2000
HA CA CA CA CA HA
5 5 5 5 5 8
I IV V II IV IIIA
Sa3 Sa6/B Fa Sa2 Sa3/A Fa Sa2/A Fa Sa2 Sa3/A Fa Sa1 Sa3/B Fa Sa3/Fa
E43
BB
2002
HA
8
IA
Sa3 Sa6 Sa7/B Fa
E48 E53
BB BB
2002 2002
HA HA
8 8
IV IA
Sa2 Sa3/A Fa Sa3 Sa6 Sa7/B Fa
EP17
BB
2001
HA
8
IIIA
Sa3 Sa7/Fa Fb
05/832 06/477 08/019 08/629 08/220 08/192 EP5
Praha 8 Hořovice Plzeň Třinec ČB PM BB
2005 2006 2008 2008 2008 2008 2001
CA CA CA CA CA CA HA
8 8 8 8 22 30 45
IV IV IV IV IV IV IV
06/622 07/910 06/1001
PH PM Praha 8
2006 2007 2006
O, E, Cli, Cip, G, A O, E, Cli, Cip, G, A O, E, Cli, Cip, G, A, T O, E, Cli, Cip, G, A O, E, Cli, Cmp, A O, A O, E, Cli, Cip,A O, E, Cip,A O, E, Cli, Rif, Cip, G, A, T O, E, Cli, Rif, Cip, G, A, T O, E, T O, E, Cli, Rif, Cip, G, A, T O, E, Cli, Rif, Cip, G, A, T O, E, Cip, A O, E, Cip, A O, E, Cip, A O, E, Cip, A O, A, Cot O, A O, E, Cli, Cip, G, Cmp O, E, Cli, Cip, A, T O, A, T O, A
Sa1 Sa3 Sa5 Sa6/A B Fa Sa3 Sa6/B Fa Sa3 Sa6/B Fa Sa3 Sa6/B Fa
CA CA CA
80 80
IV IV V
Sa2 Sa3/A Fa Sa2 Sa3/B Sa2 Sa3/A Fa Sa2 Sa3/A Fa Sa1 Sa2 Sa3/B Fa Fb Sa2/A Sa2 Sa3 Sa5 Sa6 Sa7/A B Fa Sa2 Sa3/Fb Sa2 Sa3/A B Fb Sa1 Sa2 Sa3/A B Fa
ST8 8
34
Tab. 7: Sbírkové kmeny s definovanými profágy / referenční kmeny. Profágy uměle vnesené do daného kmene jsou uvedeny v závorce se znaménkem +. Referenční kmen ISP 8
Lyzogeny s Φ53 ISP 8 (53+)
Lyzogeny s Φ47 ISP 8 (47+) ISP 8 (47+, 11+)
NCTC 8511 PS 47 PS 54 PS 83A
ISP 8 (53+, 77+) ISP 8 (53+, M+) ISP 8 (53+, M+, 77+) NCTC 8511 (53+) PS 47 (53+) PS 54 (53+) PS 83A (53+)
Lyzogeny s Φ85 ISP 8 (85+)
NCTC 8511 (85+)
Kontrolní kmeny pro PCR detekci sérologických skupin profágů: 1039, 1039 (96+), PS 47 (53+), PS 47 (77+) Kontrolní kmeny pro PCR detekci integráz profágů: 1039, 1039 (77+), 1039 (53+), 1039 (96+)
3.2 Bakteriofágy Pro testování citlivosti daných kmenů S. aureus byl využit virulentní polyvalentní stafylofág Φ812 a jeho mutanty v rozmezí hostitele: Φ812a, Φ812b, Φ812i, Φ812p, F1 a K1. Z fágů příbuzných fágu 812 se jednalo o Φ131 a ΦSk311 (izolován z S. carnosus). Jmenované fágy jsou součástí sbírky LMDM a jejich hostitelské spektrum zahrnuje kmeny koagulázapozitivních i koaguláza-negativních stafylokoků (Pantůček a kol., 1998). Propagační kmeny, titry a šarže použitých fágových lyzátů jsou uvedeny v Tab. 8. Tab. 8: Charakteristika použitých fágových lyzátů. Bakteriofág Φ812 Φ812a
Propagační kmen SA 812 SA 812
Titr lyzátu (PFU/ml)
Šarže lyzátu
10
13. 11. 2009
2 × 10
9
2. 6. 2008
9
30. 5. 2008
1 × 10
Φ812b
SA 812
2 × 10
Φ812i
SA 812
2 × 109
2. 6. 2008
SA 812
1 × 10
9
5. 9. 2008
2 × 10
9
9/2008
4 × 10
9
25. 9. 2008
9
25. 9. 2008 29. 5. 2008
Φ812p ΦF1 ΦK1
SA 812 SA 812
Φ131
S. aureus 6409
6 × 10
ΦSk311
S. carnosus TM300
7 × 108
35
3.2 Kultivační média Masopeptonový agar 1,5% (MPA):
Masopeptonový agar 0,7% (MPA):
Nutrient broth (Oxoid) ..................... 13 g
Nutrient broth (Oxoid) ..................... 13 g
Yeast extract (Oxoid) ....................... 3 g
Yeast extract (Oxoid) ....................... 3 g
Pepton (Imuna) ................................. 5 g
Pepton (Imuna) ................................. 5 g
Agar (Oxoid) .................................... 15 g
Agar (Oxoid) .................................... 7 g
destilovaná voda .............................. 1000 ml
destilovaná voda ...........................1000 ml
pH upraveno 10M NaOH na hnotu 7,2
pH upraveno 10M NaOH na hnotu 7,2
Masopeptonový bujón (MPB):
Hogness modified freezing medium (HMFM):
Nutrient broth (Oxoid) ..................... 13 g
3,6mM K2HPO4 ............................0,164 g
Yeast extract (Oxoid) ....................... 3 g
1,3mM KH2PO4 .............................0,035 g
Pepton (Imuna) ................................. 5 g
2,0mM citrát sodný ....................... 0,118 g
destilovaná voda .............................. 1000 ml
1,0mM MgSO4.7H2O ................... 0,049 g
pH upraveno 10M NaOH na hnotu 7,2
4,4% (v/v) glycerol ..........................8,8 ml voda doplněna do objemu 200 ml
3.3 Roztoky a chemikálie Ethidium bromid (Sigma) – zásobní roztok 10 mg/ml, pracovní roztok o koncentraci 1 μg/ml Roztok CaCl2 (0,02M) 50× koncentrovaný TAE pufr
3.4 Ostatní materiál Materiál pro izolaci DNA High Pure PCR Preparation Kit for Genomic DNA (Roche Diagnostics) PBS (8 g NaCl + 0,2 g KCl + 1,95 g Na2HPO4·2H2O + 0,24 g KH2PO4 + 800 ml H2O; pH upraveno na 7,4; doplněno do 1 l) Promývací roztok na PCR (30ml 5M NaCl + 300 ml 0,5M EDTA + 10 ml 1M Tris Cl pH 7,5 + H2O doplněna do 1 l) Lyzostafin 0,5 mg/ml (Genmedics) Proteináza K 20 mg/ml (Roche Diagnostics)
36
Materiál pro PCR 10× koncentrovaný pufr pro PCR s 15mM MgCl2 (NEB; Apronex) Nukleotidy dATP, dGTP, dTTP, dCTP v zásobních koncentracích 2 mM (Roche Diagnostics) Roztok MgCl2 v zásobní koncentraci 50 mM (NEB) Taq DNA polymeráza (NEB; Apronex)
Materiál pro elektroforézu agaróza na přípravu gelu pro elektroforézu (Lachema, SERVA) 100bp DNA ladder (NEB) – velikost fragmentů 100 bp – 1517 bp Nanášecí pufr (0,15 g bromfenolové modři, 24 g sacharózy v 30 ml vody; voda doplněna do 60 ml)
3.5 Laboratorní přístroje Centrifugy: BR 4 (Jouan), Mikro 220R (Schoeller) Digitální fotodokumentační systém EDAS 290 (Kodak) Proudový zdroj pro elektroforézu:
Power PAC 300 (BioRad) EC 105 (Thermo Electron Corporation)
Biohazard box Steril-Antares (Schoeller) Nanodrop + software (Thermo Scientific) Termocykler T-gradient (Biometra)
3.6 Kultivační metody 3.6.1 Příprava fágového lyzátu 1. 10 ml MPB ve 100 ml kultivační baňce bylo zaočkováno propagačním kmenem a kultivováno přes noc v termostatu při 37 °C (inokulum). 2. 25 ml MPB bylo inokulováno 1 ml noční kultury a inkubováno za intenzivní aerace asi 3 hodiny při 37 °C do OD 600 = 0,5. 3. K rostoucí kultuře byla přidána 1/10 objemu 0,02M CaCl2 a 2,5 ml (1/10 objemu) fágového lyzátu. Směs bakterií a fágů byla inkubována za intenzivní aerace 2 až 3 hod při 37 °C dokud nenastala úplná lyze, případně byla ponechána dolyzovat ve tmě při 15 °C do druhého dne. 4. Získaný lyzát byl zcentrifugován 30 minut při 6000 ot. 37
a. U lyzátů, které byly určeny na dlouhobé skladování, byl supernatant přefiltrován přes bakteriologický filtr (0,45 µm; Millipore Millex). 5. U každého lyzátu byl stanoven titr běžnou metodou dvouvrstevného agaru (tj. výsevem přes 0,7% agar) – viz níže. 6. Filtrovaný fágový lyzát byl skladován v lednici při teplotě 4 °C.
3.6.2 Stanovení titru fágového lyzátu Metoda vychází z ověřeného předpokladu, že z jedné životaschopné fágové částice vznikne jedna plaka. Cílem je tedy naředit fágový lyzát tak, aby na plotně vyrostly oddělené, nepřekrývající se plaky. Výsledek se uvádí ve formě PFU/ml (plaque-forming units). A) Stanovení titru fágového lyzátu plotnovou metodou Slouží také jako plotnová metoda testování citlivosti bakterie k fágu. 1. Fágový lyzát byl naředěn na 10-3 až -7 (dle očekávaného výsledku) desítkovou řadou do sterilních Eppendorfových zkumavek. 2. Do skleněné Wassermanovy zkumavky s vytemperovaným 0,7% MPA na 45 °C bylo rychle přidáno 100 l 18ti hodinové bakt. kultury, 250 l CaCl2 (0,02M) a 100 l lyzátu v daném ředění. Výsev byl proveden na tři misky od každého ředění. 3. Misky byly po ztuhnutí agaru otočeny dnem vzhůru a kultivovány 18h / 37 °C. 4. Titr byl vypočten z misek obsahujících 20-200 plak. Výpočet titru (PFU/ml): počet kolonií/plak × obrácená hnota ředění × 10 B) Stanovení orientačního titru fágového lyzátu kapkovou metodou Titr lze orientačně stanovit při testech citlivosti bakterie k fágu (viz níže). Výpočet titru (PFU/ml): počet kolonií/plak × obrácená hnota ředění × 100
3.6.4 Testy citlivosti bakterie k fágům – kapková metoda Pro zjištění citlivosti byl použit fág v ředění 10-1 až 10-8 v prvních sadách testů. Dále byla ředění omezena na 10-2 až 10-5. 1. Petriho miska s 1,5% MPA byla převrstvena 2,5 ml 0,7% MPA se 100 l 18ti hodinové bakteriální kultury a 250 l CaCl2 (0,02 M). 2. Po utuhnutí kapeme kapky po 10 l jednotlivého ředění fága (ředění viz výše). 3. Po zaschnutí kapek kultivace otočených misek 18 h / 37 °C. 38
Výsledné zóny a plaky fágů byly vyhodnocovány jak je uvedeno v Tab. 9. Klasický vzhled jasné nebo matné zóny byl pozorován jen u malé části izolátů S. aureus. Jasná zóna značí produktivní infekci na daném izolátu/kmeni. Matné zóny jsou znakem lyze zvenčí (bez produkce fágových částic) a vyskytují se u necitlivých izolátů nebo u izolátů citlivých – při velmi vysokém titru fága, v nižších titrech jsou viditelné plaky. U matných plak nedochází k lyzi všech bakteriálních buněk. Možné jsou však i kombinace těchto projevů. Proto jsem přešla k detailnímu hodnocení plak a zón lyze, které více napoví o reakci daného izolátu/kmene na fága. Na matný okraj jasných zón a jasný okraj matných, který se vyskytoval na některých kmenech, není brán zřetel, stejně jako na výskyt rezistentních kolonií S. aureus uvnitř zóny lyze při vysokých titrech fága, případně fágových mutant tvořících jednotlivé jasné plaky v matné zóně při titru fága nad 107 (přičemž v nižších titrech plaky přítomny nebyly). Na základě vzhledu plak/zón a jejich výskytu při určitém titru fága byla stanovena citlivost izolátu (viz tabulky s výsledky testů citlivosti v kapitole 4). Označení citlivosti v Tab. 9 je tedy orientační a výsledné hodnocení vždy záleželo na celkovém vzhledu zón a plak na dané bakteriální kultuře. Tab. 9: Hodnocení zón a plak v testech citlivosti S. aureus k fágům. Vzhled zóny/plak
Hodnocení
Bez reakce
–
Obrys kapky
Vzhled zóny/plak
Hodnocení
Jasno- matné plaky +/++
–
Jasno(-matná) zóna +/++
Matná zóna +
Jasné plaky ++
Matné plaky +/++
Jasná zóna ++
39
3.6.3 Příprava modifikovaných fágů Naším záměrem bylo získat fágy modifikované R-M systémem necitlivého izolátu S. aureus. Překonání R-M systému (tzn. izolace modifikovaného fága) by pak potvrdilo jeho roli při rezistenci k fágu u daného izolátu. A) V tekutém médiu Metoda byla inspirována experimenty, které provedli Kelly a kol. (2011) při přípravě fágového koktejlu fága K a přizpůsobena protokolu naší laboratoře. 1. Podle výše uvedeného protokolu byly připraveny fágové lyzáty Φ812 na původně necitlivých kmenech S. aureus, současně byl připraven lyzát na kontrolním kmeni SA 812. 2. Po centrifugaci a filtraci/opatrném odlití části supernatantu (do kónické zkumavky) byl nově připravený lyzát použit k přípravě dalšího lyzátu. Takto byl fág celkem čtyřikrát pasážován na necitlivém kmeni. 3. Získaný lyzát byl vyset na propagační kmen lyzátu (původně necitlivý kmen) a kontrolní kmen SA 812. Vysety byly i předchozí pasáže pro průkaz vymizení původního fága 812 a pomnožení nově multiplikovaných variant fága (viz Testy citlivost bakterie k fágům). B) Na plotnách 1. Necitlivý izolát S. aureus byl vyset spolu s Φ812 a 0,02M CaCl2 na plotny MPA metodou 0,7% agaru (soft agaru) – viz níže. Fág byl použit v zásobní koncentraci a v ředění 10-1, pro každý izolát a každou koncentraci ve třech opakováních. Jako pozitivní kontrola byl použit kmen SA 812 s Φ812 v ředění 10-1 a jako negativní kontrola stejný kmen bez fága. 2. Plaky narostlé na bakteriální kultuře byly odpíchnuty sterilní špičkou s odstřiženým koncem, resuspendovány v 500 µl MPB a centrifugovány 3 min/12000 ot. 3. Supernatant byl vykapán na mateřský kmen a na kontrolní SA 812 (viz Testy citlivosti bakterie k fágům). Varianty fága schopné růst na původně necitlivém kmeni byly použity při testování citlivosti souboru klinických kmenů. C) Ověření modifikace získaných fágů plotnovou metodou Pomnožením fága na původně necitlivém kmeni můžeme získat modifikovanou variantu daného fága nebo jeho mutanta, který překonal jiný mechanismus rezistence, než je restrikční bariéra. Zpětným pasážováním získaných variant fága tedy zjistíme, zda došlo k modifikaci nebo mutaci. Modifikované fágy by měly nově nabytou modifikaci ztratit a daný kmen by k nim měl být znovu necitlivý. U mutant by nemělo 40
dojít ke změněhostitelského spektra. Z důvodu časové nenáročnosti byla využita plotnová metoda množení fága. 1. Fág byl vyset na plotny s SA 812 dle protokolu pro stanovení titru fága (viz níže) ve dvou opakováních a kutivován 18h/37 °C. 2. Plotna byla přelita 3 ml MPB. 3. Po 5min inkubaci při pokojové teplotě byly plaky smyty opatrným pohybem hokejky, spolu s MPB odsáty do kónické zkumavky a centrifugovány 1 min/5000 ot. 4. Výsledný supernatant byl opatrně přelit a znovu pasážován na SA 812 (bod 1. – 3.). 5. Po třech pasážích byly provedeny testy citlivosti souboru klinických kmenů a porovnány s předchozími výsledky s Φ812 a jeho variantami po pasáži na necitlivém kmeni. U všech získaných variant fága Φ812 byl určen titr na kmeni SA 812 i izolátu E48 a vypočítána hodnota EOP (effectivity of plating – efektivita tvorby plak) podle práce, kterou publikovali Rosypal a Rosypalová (1972): EOP = a/b a = titr na kmeni, u nějž byla stanovována citlivost k fágu (PFU/ml) b = titr na pomnožovacím kmeni (PFU/ml). V této práci byly za b pro lepší přehlednost výsledků dosazeny hodnoty referenčního kmene SA 812 bez ohledu na to, jestli na něm byl daný fág pomnožen. Předpokladem bylo, že modifikovaná varianta izolovaná na kmeni E48 na něm bude efektivněji tvořit plaky než na SA812 a naopak varianta modifikovaná na SA 812 bude mít vyšší hodnotu právě na tomto kmeni. Mezi sebou by se pak fágy pomnožené na stejném kmeni neměly výrazně lišit ve schopnosti tvorby plak.
3.7 Izolace DNA Cílem izolace bylo získat chromozomovou DNA S. aureus v kvalitě vhodné pro PCR. Poté, co izolací kitem nebyla vždy DNA v dostatečné kvalitě pro RM testy, byla DNA izolována metodou hrubého buněčného lyzátu. DNA izolovaná kitem může být skladována až 2 roky, zatímco hrubé lyzáty mají dostatečnou stabilitu jen v řádech týdnů. DNA však může být poškozena i opakovaným rozmražováním.
41
3.7.1 Izolace pomocí kitu K izolaci byl použit High Pure PCR Preparation Kit for Genomic DNA (Roche). 1. 5 až 7 ml kultury (podle hustoty zákalu) narostlé za 18 h při 37 °C v MPB bylo přeneseno do centrifugační zkumavky a zcentrifugováno 12 min při 4500 otáčkách. 2. Po slití supernatantu byl pelet promyt ve 4 ml sterilního promývacího roztoku na PCR. Po centrifugaci byl tento krok opakován, pro dokonalé odstranění média a eliminaci možných inhibitorů PCR. Následovala opět centrifugace 12 min při 4500 otáčkách. 3. Supernatant byl opatrně odpipetován a pelet byl rozsuspendován v 280 µl PBS, poté přenesen do sterilní Eppendorfovy zkumavky, kde k němu bylo přidáno 20 µl lyzostafinu. Směs byla inkubována 1 h/37 °C. Pokud nedošlo k dostatečné lyzi buněk, byly přidány 2 µl lyzostafinu a po 20 min byla lyze opět zkontrolována. 4. K lyzátu bylo přidáno 300 µl pufru č. 2 a 50 µl proteinázy K, směs byla inkubována 10 min při 72 °C. 5. Do vychladlé směsi bylo přidáno 150 µl izopropanolu, směs byla promíchána opatrným otočením zkumavky (5 až 6×) a opatrně přenesena na kolonku se sběrnou zkumavkou, která je součástí balení kitu. Kolonka byla centrifugována 1 min při 10000 otáčkách. Pokud nedošlo k vysušení peletu, byla centrifugace prodloužena a otáčky navýšeny max. na 14000. 6. Supernatant zachycený ve sběrné zkumavce byl slit a na kolonku byla přidáno 500 µl pufru č. 4a. Opět následovala centrifugace 1min/10000 ot. Pokud v předchozím kroku proběhla nestandardně, byly otáčky i čas navýšeny i nyní. 7. Po slití supernatantu bylo na kolonku přidáno 500 µl pufru č. 4 a centrifugováno jako v předchozích krocích. Krok byl 2× zopakován a kolonka byla stočena ještě jednou naprázdno pro odstranění zbytkového ethanolu. 8. Kolonka byla vložena do sterilní, řádně označené Eppendorfovy zkumavky a po přidání elučního pufru (pufr č. 5) předehřátého na 70 °C centrifugována 1 min/8000 ot. 9. Po změření koncentrace DNA na Nanodropu byla DNA skladována v mrazáku při –20 °C.
3.7.2 Izolace přípravou hrubého buněčného lyzátu 1. 500 µl MPB bylo zaočkováno 1 kličkou nebo 1 µl kultury a inkubováno při 37 °C/ 24 h. 2. Narostlá kultura byla zcentrifugována 3 min/12000 ot. 3. Po odsátí supernatantu byl pelet promyt v 1 ml sterilní deionizované vody, centrifugován. 42
4. Opět promytí v 1 ml deionizované vody. 5. Inkubace 20 min/80 °C 6. Suspenze byla centrifugována 1 min/14 000 ot. a po změření koncentrace na Nanodropu skladována při 20°C v mrazáku. Po rozmražení byla izolovaná DNA před použitím vždy stočena 1 min/12000 ot. Podle koncentrace byla většinou použita neředěná DNA v objemu 3 µl/PCR reakci.
3.8 Polymerázová řetězová reakce (PCR) PCR zavedená r. 1983 Kary Mullisem umožnila rychlé pomnožení dlouhých i krátkých úseků DNA pomocí enzymu DNA polymerázy, primerů (oček, více či méně specificky navázaných na DNA, na která polymeráza nasedá) a deoxynukleotidů. Opakováním fází denaturace, nasednutí primerů a prodloužení DNA řetězce roste exponenciálně počet kopií DNA ve vzorku, což umožňuje její zviditelnění např. na agarózovém gelu (popř. fluorescenčně v reálném čase při real-time PCR). Při tzv. simplex PCR je v roztoku přítomen jeden pár primerů, při multiplex PCR je párů více. Pravidlem však je, že spolu primery nesmí vzájemně reagovat a tvořit sekundární struktury.
3.8.1 Určení séroskupin profágů Zúžená sada multiplex použitá v této reakci umožňuje určení sérologických skupin A, B, Fa a Fb profágů S. aureus. Jako kontrola vzorku je přítomen pár primerů SAU1 a SAU2, specifických pouze pro S. aureus. Tab. 10: Protokol PCR pro určení základních sérologických skupin profágů S. aureus. Reagencie
Zásobní koncentrace
Deionizovaná voda Pufr pro PCR s MgCl MgCl dNTP Primery: SGA1, SGA2 SGB1, SGB2 SGF3, SGF4 SGF5, SGF6 SAU1, SAU2 Taq-polymeráza NEB Templátová DNA Výsledný objem v reakci: 25
Výsledná koncentrace
Objem na reakci ( l)
1,5 mM 1,5 mM 250 M
2,55 2,5 0,75 2,5
15 mM 50 mM 2 mM 100 M 100 M 100 M 100 M 100 M 5U
6 4,8 8 4 4
M+6 M M + 4,8 M M +8 M M+4 M M+4 M 1U 100× ředěná
1,5 + 1,5 1,2 + 1,2 2+2 1+1 1+1 0,3 3
l
43
Program PCR: Krok č. 1 2 3 4 5 6
Teplota 94°C 94°C 58°C 70°C 70°C 4°C
Doba trvání 5 min 1 min 1 min 30 s 1 min 30 s 5 min pauza
29 ×
3.8.2 Určení integráz profágů Z důvodu výskytu integrázy typu Sa8 pouze u bovinních kmenů, byly do PCR reakce zařazeny jen primery pro geny integráz Sa1, Sa2, Sa3, Sa5, Sa6, Sa7 a Sa9. Tab. 11: Protokol PCR pro určení vybraných integráz profágů S. aureus. Reagencie
Zásobní koncentrace
Deionizovaná voda Pufr pro PCR s MgCl 15 mM MgCl 50 mM dNTP 2 mM Primery: Sa1F, Sa1R 100 M Sa2F, Sa2R 100 M Sa3F, Sa3R 10 M Sa5F, Sa5R 10 M Sa6F, Sa6R 10 M Sa7F, Sa7R 10 M Sa9F, Sa9R 10 M Taq-polymeráza 5U NEB Templátová DNA Výsledný objem v reakci: 25 l
Výsledná koncentrace
Objem na reakci ( l)
1,5 mM 1,5 mM 250 M
1,35 2,5 0,75 3,1
1 M+1 M 1 M+1 M 0,8 M + 0,8 0,6 M + 0,6 0,4 M + 0,4 0,4 M + 0,4 0,4 M + 0,4 1U
0,25 + 0,25 0,25 + 0,25 2+2 1,5 + 1,5 1+1 1+1 1+1 0,3
100× ředěná
M M M M M
3
Program PCR: Krok č. 1 2 3 4 5 6
Teplota 94°C 94°C 55°C 72°C 72°C 4°C
Doba trvání 5 min 30 s 30 s 45 s 4 min pauza
30 ×
3.8.3 RM testy RM testy byly původně navrženy pro rychlé a relativně levné (v porovnání s MLST) rozlišení základních klonálních linií MRSA pro epidemiologické účely (Cockfield a kol. 2007). Jsou zacíleny na dva geny rozpoznávací podjednotky hsdS R-M systému Sau1: sau1hsdS1 a sau1hsdS2, které vykazují vysokou konzervovanost v rámci klonálních linií 44
(CC), ale mezi jednotlivými liniemi se liší. Dosud byly publikovány práce týkající se jejich využití pro velmi přesný záchyt MRSA klonální linie 398 přenosné z dobytka na člověka (Stegger a kol. 2011) a screening převažujících klonů MRSA v Brazílii, kde byly využity i jiné molekulární markery a PFGE (Beltrame a kol. 2012).
Obr. 8: Místa nasednutí primerů na cílové geny (Cockfield a kol. 2007)
Tab. 12: Primery pro RM testy podle Cockfield a kol. 2007. Název
Sekvence
AF
AGGGTTTGAAGGCGAATGGG
AR30
CAACAGAATAATTTTTTAGTTC
AR22
TCAGAGCTCAACAATGATGC
AR45
GGAGCATTATCTGGTGTTTTCC
AR1
GGGTTGCTCCTTGCATCATA
BF
CCCAAAGGTGGAAGTGAAAA
BR8
CCAGTTGCACCATAGTAAGGGTA
BR5
TCGTCCGACTTTTGAAGATTG
Tab. 13: Protokol PCR pro RM testy. Reagencie
Zásobní koncentrace
Deionizovaná voda Pufr pro PCR s MgCl dNTP Primery: RM test 1: AF AR 30, AR 22 RM test 2: AF AR 45, AR 1 RM test 3: BF BR 8, BR 5 Taq-polymeráza NEB/ Apronex Templátová DNA Výsledný objem v reakci: 25
Výsledná koncentrace
Objem na reakci ( l)
15 mM 2 mM
1,5 mM 250 M
12,95 2,5 2,5
100 M 100 M 100 M 100 M 100 M 100 M 5U
0,5 M 0,5 M 0,5 M 0,5 M 0,5 M 0,5 M 1U
1,25 1,25 + 1,25 1,25 1,25 + 1,25 1,25 1,25 + 1,25 0,3 3
l
Program PCR: Dle Cockfield a kol. (2007)
45
3.9 Gelová elektroforéza Elektroforéza v agarózovém gelu byla využita ke zviditelnění PCR produktů výše specifikovaných reakcí. K přípravě agarózového gelu byl použit 1× koncentrovaný TAE pufr připravený z 50× koncentrovaného roztoku (1960 ml destilované vody + 40 ml 50× TAE). Sloužil také jako elektrolyt v elektroforetické vaničce. Pro analýzu produktů pro určení profágových séroskupin a integráz byl použit 1,8% agarózový gel, pro RM testy 1,5%. Podle parametrů použité vaničky se napětí pohybovalo mezi 75 a 92 V. Poté byl gel obarven v lázni s ethidium bromidem (20 min) a vyfocen pod UV zářením pomocí digitálního fotodokumentačního systému EDAS 290.
3.10 Založení zásobní konzervy s bakteriální kulturou v HMFM 1. Ve sterilních podmínkách bylo do mikrozkumavky se šroubovacím víčkem napipetováno 200 – 500 l sterilníhohMFM uchovávaného v lednici. 2. V HMFM ve zkumavce byla resuspendována 1 platinová klička (cca 3 mm3) 24h kultury narostlé na misce. 3. Důkladné resuspendování bylo provedeno pomocí vortexu. Zkumavky byly poté ihned umístěny do mrazáku (70 °C).
46
4 Výsledky 4.1 Testy citlivosti S. aureus k polyvalentním fágům Pro testování izolátů S. aureus k polyvalentním fágům byli nejprve vybráni zástupci klinických izolátů MRSA z různých klonálních linií, lišící se genotypovými vlastnostmi (typem SCCmec, obsahem profágů, citlivostí k antibiotikům). Tyto kmeny byly testovány k polyvalentním fágům: Φ812, Φ812a, Φ812b, Φ812i, Φ812p, ΦK1, ΦF1, Φ131 a ΦSk311. První výsledky naznačovaly, že se profily citlivosti vybraných izolátů k fágům velmi liší i v rámci CC (Tab. 14). V CC8 byly u pěti testovaných kmenů zjištěny čtyři různé profily citlivosti, dva z kmenů CC8 navíc patří ke stejnému klonu (spa typ 030) a oba projevily resistenci k daným pěti fágům. U CC5 se však zdálo, že jsou všichni zástupci citliví k polyvalentním fágům. V původním souboru však byly zařazeny jen tři kmeny. Podrobnější výsledky jsou zpracovány v Tab. 16. Mezi jeden z dalších kroků tedy patřilo i testování více zástupců z CC5 i CC8 (Tab. 17). Zde se prokázalo, že je CC8 velmi heterogenní skupinou, z hlediska citlivosti k vybraným fágům (Φ812, Φ812a, Φ812b, Φ812i, ΦK1, ΦF1). Výsledkem testování bylo 5 různých profilů citlivosti u devíti kmenů. V CC5 se mezi deseti kmeny projevily jen 3 různé profily citlivosti (viz Tab. 15). Tab. 14: Profily citlivosti klinických izolátů k devíti polyvalentním fágům. Citlivost S. aureus značena +, necitlivost –. Názvy izolátů jsou nahrazeny označením příslušného CC. Profil 1 2 3 4 5 6 7 8
CC 5, 30 30, ST88 8 8 8, 45 1 22 8, 80
Φ812 + + + + + + -
Φ812a + + + + -
Φ812b + + + + -
Φ812i + + + + + + -
Φ812p + + + -
ΦF1 + + + -
ΦK1 + + + + -
Φ131 + + + + -
ΦSk311 + -
Tab. 15: Profily citlivosti rozšířeného souboru izolátů z CC5 a CC8 k šesti polyvalentním fágům. Citlivost značena +, necitlivost –. Názvy izolátů nahrazeny označením příslušného CC. Profil 1, 2 3 4 5 8
CC 5, 8 5, 8 8 8 5, 8
Φ812 + + + -
Φ812a + + + -
Φ812b + + + -
Φ812i + + + + -
ΦF1 + + -
ΦK1 + + + -
47
Tab.16: Výsledky testů citlivosti klinických izolátů MRSA k devíti polyvalentním fágům. Polyvalentní fágy S. aureus
CC
Φ812
Φ812a
Φ812b
Φ812i
Φ812p
ΦK1
ΦF1
Φ131
ΦSk311
SA 812
30
++
++
++
++
++
++
++
++
++
E29
1
++(m)
-
-
+m
++m
-
-
-
-
E26
5
++
++
+
++
++m
++
++(m)
++
++
08/794
5
++
++
++(m)
++
++
++
++
++
++
E39
5
++(m)
++(m)
++
++jm
++m
++
++
++
++
05/832
8
++(m)
++(m)
++(m)
++(m)
-
++
-
+
-
E53
8
++
-
+m
++
-
-
-
++
-
E48
8
-
++(m)
-
++
-
++
++
-
-
E14
8
-
-
-
-
-
-
-
-
-
EP17
8
-
-
-
-
-
-
-
-
-
08/220
22
++(m)
-
-
-
-
-
-
-
-
08/192
30
++
++(m)
++(m)
++
++m
++
+
++
-
EP5
45
-
++
-
++
-mp
++
++
-
-
06/622
80
-
-
-
-
-
-
-
-
-
06/1001
ST88
++
++
++
++
++
++
++
++
-
Legenda: ++ citlivý izolát (jasné plaky i při titru fága103 a nižším) + středně citlivý (jasné plaky při titru fága nad 104) necitlivý izolát (zcela beze změny nebo matná zóna při titru fága 106 a/nebo vyšším)
++(m) ++jm ++m - mp
citlivý izolát (matná zóna při vysokém titru fága 105 a vyšším, dále jasné plaky středně citlivý (jasnomatné plaky nebo jasné zóny při titru fága 105 a vyšším a matné plaky při nižším titru fága) středně citlivý (matné plaky při titru fága 103 a nižším) necitlivý izolát (jasné plaky v matné zóně jen při vysokém titru, tj. 106 a vyšším fága) 48
Tab.17: Výsledky testů citlivosti klinických izolátů MRSA z CC5 a CC8 ke zúžené sadě fágů. Polyvalentní fágy
Polyvalentní fágy
S. aureus
CC
Φ812
Φ812a
Φ812b
Φ812i
ΦF1
ΦK1
S. aureus
CC
Φ812
Φ812a
Φ812b
Φ812i
ΦF1
ΦK1
SA 812
30
++
++
++
++
++
++
SA 812
30
++
++
++
++
++
++
Mu50
5
-
-
-
-
-
-
E14
8
-
-
-
-
-
-
04/787
5
-
-
-
-
-
-
EP17
8
-
-
-
-
-
-
08/794
5
++
++
++(m)
++
++
++
E53
8
++
-
+m
++
-
-
06/768
5
+m
+m
+m
+m
-
+m
E43
8
++
- mp
++jm
++
- mp
- mp
08/628
5
+m
++m
+m
++m
++
+
E48
8
-
++(m)
-
++
++
++
E46
5
++jm
++jm
++jm
++
++jm
++
05/832
8
++(m)
++(m)
++(m)
++(m)
-
++
E28
5
++
++
++jm
++
++jm
++jm
06/477
8
++
++
++m
++m)
++(m)
++(m)
E61
5
++jm
++jm
++jm
++jm
++jm
++
08/019
8
++(m)
++
++
++
++
++jm
E39
5
++(m)
++(m)
++
++(jm)
++
++
08/629
8
++
++(m)
++m
++
++(m)
++(m)
E26
5
++
++
+
++
++(m)
++
Legenda: ++ citlivý izolát (jasné plaky při titru fága 103 a nižším) + středně citlivý (jasné plaky při titru fága nad 104) necitlivý izolát (zcela beze změny nebo matná zóna při titru fága 106 a/nebo vyšším)
++(m) ++jm ++m - mp
středně citlivý izolát (matná zóna při titru fága 105 a vyšším,dále jasné plaky) středně citlivý (jasnomatné plaky nebo jasné zóny při titru fága 105 a vyšším a matné plaky při nižším titru fága) středně citlivý (matné plaky při titru fága 103 a nižším) necitlivý izolát (jasné plaky v matné zóně jen při vysokém titru fága, tj. 106 a vyšším)
49
4.2 RM testy Pro RM testy byli z výše vybraných klinických izolátů vybráni zátupci jednotlivých CC, aby mohly být určeny kontroly reakcí. Metoda RM testů totiž v naší laboratoři nebyla zavedena. Poté byly otestovány kmeny z CC5 a CC8 a následně ostatní klinické kmeny, u nichž byly provedeny testy citlivosti k fágům. Byl připojen i izolát 07/910 (CC80), který byl testován na citlivost k fágům v LMDM ÚEB (úplná rezistence ke všem fágům ze zúžené sady). Cockfield a kol. (2007) publikovali očekávané výsledky RM testů spolu s metodikou a PCR protokolem, výsledky byly tedy interpretovány na základě této publikace (Tab. 18). Z výsledků vyplynulo, že u CC8 odpovídá sekvenční specifita podjednotky hsdS R-M systému Sau1 tomuto CC. Stejně tomu bylo i u většiny ostatních izolátů s výjimkou izolátu EP5 (CC45), jehož specifita Sau1 odpovídala CC8. Tento výsledek byl i po dvojnásobném opakování RM testů (a nové izolaci DNA) stejný.
Tab. 18: Očekávané velikosti produktů pro daná CC v jednotlivých RM testech (podle Cockfield a kol., 2007; upraveno. CC
test1
test2
test3
30
203 bp
-
-
22
990 bp
-
-
Nejistá je interpretace izolátu 08/628 (CC5), u nějž byl
45
-
722 bp
-
přítomen očekávaný produkt 1071 bp, ale navzdory
1
-
1037 bp
680 bp
opakování PCR a izolace DNA i nespecifický produkt
8
-
-
680 bp
o velikosti 680 bp, což odpovídá CC1 nebo CC8.
5
-
-
1071 bp
80
?
?
?
Sbírkový lyzogenní kmen NCTC 8511 (53+) spolu
s referenčním kmenem NCTC 8511 byly dle RM testů zařazeny do CC8. U těchto kmenů nebyla provedena typizace pomocí MLST, proto výsledek RM testů nemůže být ověřen. Pro tuto práci je však důležitým výsledkem, že byla oběma variantám téhož kmene přiřazena stejná specifita hsdS Sau1. U izolátů z CC80 nebyl výsledek RM testů zatím publikován. Se základní sadou primerů byl získán v RM testu 1 jedinečný produkt o velikosti přesahující 1517 bp (tj. velikost nejdelšího fragmentu 100bp markeru) a to u obou testovaných kmenů patřících do CC80, přestože u jednoho z nich se jednalo pouze o velmi nízké množství produktu (na hranici detekce). Podařilo se získat kvalitní kontroly RM testů pro CC1 (E29), CC5 (Mu50), CC8 (jakýkoli z výše uvedených izolátů), CC22 (08/220), CC30 (SA 812) a pravděpodobně i CC80 (07/910) viz Obr. 9. RM testy bylo prověřeno celkem 29 kmenů/izolátů.
50
Obr. 9: Příklad agarózového gelu s výsledkem RM testů 1 až 3 (zleva). Viditelné produkty typické pro (zleva): CC22 (990 bp), CC30 (203 bp), CC80 (>1517 bp), CC1 (1037 bp), CC5 (1071 bp) a CC8 nebo CC1 dle výsledku RM testu 2 (680 bp). Invertováno.
4.3 Příprava variant fága schopných růstu na necitlivých kmenech S. aureus K přípravě fágových variant byl vybrán Φ812 a jako pomnožovací kmeny Mu50, E14 (necitlivé ke všem fágům) a izolát E48 (citlivý k Φ812a, Φ812i, ΦK1 a ΦF1). Byla využita plotnová metoda i metoda několikanásobného pasážování přípravou fágových lyzátů. Plotnovou metodou byly získány dvě plaky fága Φ812 schopného růst na necitlivém kmeni E48. Metodou přípravy lyzátů jsme získali čtyři pasáže od každého ze tří necitlivých kmenů a kontrolního SA 812. U všech pasáží byly provedeny testy citlivosti k lyzátu kapkovou metodou v ředěních 10-1 až 10-3. Lyzáty získané z kmene Mu50 a izolátu E14 neprojevovaly schopnost růstu na pomnožovacím kmeni, na kontrolním SA 812 bylo viditelné vyředění Φ812, z nějž byly lyzáty založeny, už ve druhé pasáži (plaky přítomny pouze v 1. pasáži). Schopnost lyze se však projevila u fága na kmeni E48. Celkem jsme tedy získali 3 vzorky fága pomnožené na původně necitlivém izolátu E48. Byly označeny Φm812_1, Φm812_2 a Φm812_3 (zkráceně čísly 1–3). K těmto vzorkům byla testována citlivost u 19ti klinických kmenů (Tab. 19). Změna citlivosti se projevila jen u izolátů E29, 08/220 (necitlivé k vzorkům 1 a 3) E48, EP5 (citlivost ke všem třem vzorkům), E53 a E43 (necitivost ke všem 3 vzorkům). Dalším krokem byla zpětná pasáž získaných tří vzorků fága přes původní pomnožovací kmen SA 812. Cílem byla modifikace, po níž by se citlivost kmenů měla vrátit do původního stavu. Fágy byly tentokrát pasážovány plotnovou metodou, ve dvou opakováních. Po třetí pasáži k nim byla určena citlivost u výše zmíněných klinických kmenů (vzorky byly označeny Φm812_1‘, Φm812_2‘ a Φm812_3‘, zkráceně 1‘– 3‘). 51
Po pasáži přes kmen SA 812 došlo ke změně citlivosti jen u izolátu E29 – stal se citlivým ke vzorkům 1 a 3. Podrobnější výsledky citlivosti včetně její míry jsou popsány v Tab. 19, titry získaných variant fága Φ812 a hodnoty účinnosti výsevu (tzn. efektivity tvorby plak) ve srovnání pomnožovacích kmenů SA 812 a E48 v Tab. 20. Tab. 19: Změna citlivosti k fágu 812 po jeho pasáži přes na necitlivý izolát E48 a po jeho další pasáži přes původní pomnožovací kmen SA 812 (u modifikovaných fágů očekáván po zpětné pasáži stejný profil citlivosti jako u Φ812). Fágy izolované z izolátu E48
Fágy po pasáži přes SA 812
S. aureus
CC
Φ812
m812_1
m812_2
m812_3
m812_1‘
m812_2‘
m812_3‘
SA 812
30
++
++
++
++
++
++j(m)
++
08/192
30
++
++j-m
++
++
++jm
++j(m)
++
E29
1
++m
-m
++m
-m
+m
+m
+m
Mu50
5
-m
-m
-m
-m
-m
-
-
E26
5
++
++(m)
++j(m)
++jm
++
++j(m)
++(m)
08/794
5
++
++m
++jm
++m
++j-m
+j(m)
+j-m
E39
5
++m
++jm
++jm
++jm
++jm
++jm
++(j)m
08/019
8
++(m)
++jm
++jm
++m
++j(m)
++j(m)
+m
08/629
8
++
++m
++jm
++m
++
++jm
+m
05/832
8
++m
++(m)
++
++jm
++j(m)
++j(m)
++j(m)
E53
8
++
-m
-m
-m
-m
-
-
E43
8
++
-o
-m
-m
-m
-
-
E48
8
-m
++jm
++j(m)
++
++j(m)
++
++j(m)
E14
8
-m
-o
-o
-
-o
-
-
EP17
8
-m
-m
-m
-m
-o
-
-
08/220
22
++m
-m
++m
-m
-m
+jm
-
EP5
45
-m
++j(m)
++jm
+j(m)
++
+
++
06/622
80
-m
-m
-m
-m
-m
-
-
07/910
80
-
-m
-m
-m
-o
-
-
Legenda: ++ citlivý izolát (jasné plaky při titru fága 103 a nižším) + středně citlivý (jasné plaky při titru fága nad 104) necitlivý izolát (zcela beze změny nebo matná zóna při titru fága 106 a/nebo vyšším) ++(m) ++m ++jm +m -m -o
citlivý izolát (matná zóna při vysokém titru fága, dále jasné plaky středně citlivý (matné plaky při titru fága 103 a nižším) středně citlivý (jasnomatné plaky nebo jasné zóny při titru fága 105 a vyšším, matné plaky při nižším), j(m) – jasná zóna s náznakem matu středně citlivý (matné plaky při titru fága nad 104) necitlivý izolát (matná zóna při titru fága 106 a vyšším) necitlivý izolát (obrys kapky při titru fága 106 a vyšším)
52
Tab 20: Titr modifikovaných fágů a jejich efektivita množení (EOP) na S. aureus SA 812 a E48. Fág
Titr na SA 812 (PFU/ml)
Titr na E48 (PFU/ml)
EOP na SA 812
EOP na E48
Φm812_1
8× 109
9 × 109
1,000
1,125
Φm812_1‘
2,1 × 1010
2,2 × 1010
1,000
0,954
Φm812_2
6,6 × 1010
1,9 × 1010
1,000
0,288
1,000
0,011
1,000
3,750
1,000
1,000
Φm812_2‘ Φm812_3 Φm812_3‘
9 × 10
8
4 × 10
9
1,5 × 10
3 × 10
8
8
1 × 10 3 × 10
7 10
4.4 Testování citlivosti lyzogenů s definovanými profágy Protože byl u těchto kmenů znám obsah profágů (charakterizován sérologickou skupinou a integrázovým typem), následovaly testy citlivosti, které měly objasnit vliv profágů S. aureus na citlivost k polyvalentním fágům. Jako kontrola byly vybrány lyzogeny ze sbírky LMDM ÚEB s definovanými profágy a jejich referenční kmeny jako kontroly změny fenotypu u lyzogenů. Výsledkem bylo potvrzení faktu, že profág Φ53 způsobuje rezistenci hostitele k Φ812 a Φ812b, zatímco citlivost k Φ812a a 812i je nezměněna (Rosypal a Horáková 1968; Rosypal a Rosypalová 1972). Citlivé jsou lyzogeny nadále i k mutantám ΦF1 a ΦK1. Stejný vliv na fenotyp hostitele však měl i profág Φ47 (viz Tab.21).
53
Tab.21: Výsledky testů citlivosti definovaných lyzogenů ke zúžené sadě fágů. Profágy uměle vnesené do daných kmenů jsou vypsány v závorce za názvem kmene. Výzamné profágy zvýrazněny ve sloupci vlevo. Polyvalentní fágy Φ812a
Φ812i
ΦK1
ΦF1
Φ812
Φ812b
SA 812
++
++
++
++
++
++
ISP 8
++
++
++
++
++m
++
PS 47
+m
++
++
++
++m
-
NCTC 8511
++
++m
++(m)
++(m)
++
++m
PS 54
++
++
++m
++
++m
++
PS 83A
++
++
++
++
-
-
ISP 8 (53+)
+m
++
+
+
-
-
PS 47 (53+)
++
++m
++
++
-
-
++m
+m
++m
++m
-
-
++
++
++
++
-
-
++(m)
++m
++(m)
++(m)
-
-
ISP 8 (53+, 77+)
++
++
++
++
-
-
ISP 8 (53+, M+)
++m
++m
++m
+m
-
-
ISP 8 (53+, M+, 77+)
+m
+m
++m
+m
-
-
ISP 8 (47+)
++
++
++(m)
++
-
-
ISP 8 (47+, 11+)
++
++
++
++
-
-
NCTC 8511 (85+)
+
+m
+m
++
+
++m
ISP 8 (85+)
++
++
++m
++m
++m
++m
S. aureus KONTROLA REFERENČNÍ KMENY
Φ53
NCTC 8511 (53+) PS 54 (53+) PS 83A (53+)
Φ47 Φ47, Φ11 Φ85
Legenda: ++ citlivý izolát (jasné plaky i při titru fága 103 a nižším) + středně citlivý (jasné plaky při titru fága 104 a vyšším) necitlivý izolát (zcela beze změny nebo matná zóna při titru fága 106 a/nebo vyšším) ++(m) ++m
citlivý izolát (matná zóna při titru fága 105 a vyšším, dále jasné plaky) středně citlivý (matné plaky při titru fága 103 a nižším)
54
4.5 Potvrzení přítomnosti profága Φ53 Z testovaných lyzogenů ze sbírky byl vybrán kmen NCTC 8511 (53+), u kterého bylo pomocí PCR zacílené na geny určující sérologické skupiny a fágové integrázy ověřeno, zda je zde opravdu daný profág začleněn. Jako kontrola byla využita varianta stejného kmene, v níž profág Φ53 není přítomen. Negativní kontrolou byl pro obě reakce bezprofágový kmen 1039. Obr. 10: Výsledek PCR na detekci sérologických skupin (vlevo) a integráz profágů (vpravo) u kmenů NCTC 8511 a NCTC 8511 (53+). SAU je vnitřní kontrola specifická pro S. aureus. Šipky označují produkty potvrzující přítomnost Φ53: Gen pro sérologickou skupinu B a gen pro integrázu Sa7. Invertováno.
55
5 Diskuze 5.1 Testy citlivosti S. aureus k polyvalentním fágům Testování citlivosti klinických izolátů MRSA k polyvalentním fágům ukázalo již v první fázi velké rozdíly v citlivosti k Φ812 a z něj odvozených fágů, stejně jako k příbuznému fágu Φ131 nebo k fágu ΦSk311. Citlivost se velmi liší i v rámci izolátů téže klonální linie, a naopak některé kmeny z různých klonálních linií mají stejný profil citlivosti, což odporuje výchozímu předpokladu, podle kterého by se měla citlivost k fágům lišit mezi klonálními liniemi navzájem. Pokud bychom 15 testovaných kmenů (včetně kontrolního SA 812) rozdělili podle profilů citlivosti k devíti vybraným fágům, získali bychom 8 různých profilů, které by se také daly označit jako lytické skupiny (viz Tab. 14 a Tab. 15). Kmeny z CC8 by se objevovaly ve čtyřech skupinách, z CC30 ve dvou. Izoláty, které nebyly testovány ke všem devíti fágům, nejsou do tohoto shrnutí zařazeny. U dvou izolátů majících profil citlivosti zde označený číslem 5, bylo podezření, že obsahují profága Φ53 (integráza 7/sérosk. B). Jeden z těchto kmenů (E48), však geny pro integrázu a séroskupinu typickou pro Φ53 neobsahuje. Druhý z izolátů (EP5) pak obsahuje jak gen pro int7, tak pro séroskupinu B. Přesnějším testováním genů pro profágové moduly bylo určeno, že obsahuje profága Φ47 nebo Φ12 (Formanová 2013). Adsorpční testy (LMDM ÚEB, nepublikováno) prokázaly, že profág Φ53 nebrání adsorpci fága Φ812. Na S. aureus NCTC 8511 (53+) bylo po 20 min nadsorbováno 100% částic fága Φ812, ke kterému je tento kmen necitlivý (fág K1, k němuž je citlivý, se adsorboval se stejnou úspěšností). Další zajímavou skupinou jsou izoláty citlivé ke všem fágům (včetně fága Sk311 z koagulázanegativního druhu Staphylococcus carnosus). Jedním z takto citlivých kmenů je i pomnožovací kmen fága Φ812 a všech jeho mutant: SA 812. U těchto kmenů se zdá, jako by nepůsobila mezidruhová bariéra, bránící přenosu genů. S velkou pravděpodobností se jedná o restrikčnědeficientní kmeny. Tuto domněnku potvrzuje i testování citlivosti k variantám fága Φ812 po pomnožení na izolátu E48 a následně opět na SA 812 (při pokusu o izolaci modifikovaných fágů). Izoláty s profilem 1 jsou citlivé ke všem variantám fága Φ812.(profil 8). Pravým opakem je pak skupina zcela necitlivá ke všem fágům. U vybraných izolátů se nepodařila ani izolace spontánních mutant, které by na nich byly schopny množení, fágy tedy nejsou schopny překonat tuto bariéru rezistence mutací ani modifikací DNA. Adsorpční testy provedené v LMDM ÚEB roku 2012 (nepublikováno) ukázaly, že jsou fágy schopné adsorpce na některé zcela rezistentní kmeny (např. E14 a Mu50), přestože nejsou schopny dokončit infekční cyklus. U kmene Mu50 se projevila snížená adsorpce (50% fágových částic po 20 min) u fága Φ812, v případě fága ΦK1 se naadsorbovalo více než 90% fágových částic. 56
Mutanty v rozmezí hostitele byly pomnoženy na stejném kmeni (SA 812) a jsou tedy modifikovány stejným R-M systémem, v případě defektu metyltransferázy u SA 812 modifikaci CC30 postrádají. Jejich vlastnosti na úrovni modifikace DNA jsou tedy shodné. Přesto je citlivost k nim i v rámci jednoho CC velmi různorodá, jak potvrdily výsledky testování izolátů z CC5 a CC8, což odporuje výchozímu předpokladu vlivu R-M systému typu I na rezistenci k fágům. Pro potvrzení závěru, že Sau1 nemá zásadní vliv na rezistenci testovaných kmenů k polyvalentním fágům, bylo třeba ověřit, zda specifita hsdS Sau1 skutečně odpovídá CC testovaných izolátů a jak dalece ovlivňuje přítomnost určitých profágů profil citlivosti S. aureus.
5.2 RM testy a vliv Sau1 Na základě testů citlivosti byl vyvozen závěr, že Sau1 nejspíše nemá vliv na citlivost S. aureus k polyvalentním stafylofágům. Pro potvrzení tohoto závěru však bylo třeba ověřit, zda v kmenech daného CC je specifita rozpoznávací podjednotky (hsdS) Sau1 shodná, typická pro příslušné CC. U převážné většiny kmenů se tuto shodu podařilo potvrdit, jednoznačný výsledek přineslo zejména testování izolátů z CC8, tedy nejheterogennější skupiny z hlediska fenotypu citlivosti. Závěr byl tedy potvrzen – Sau1 není rozhodujícím mechanismem určujícím necitlivost k polyvalentním fágům. RM testy mohou být použity pro orientační zařazení izolátu do CC. V hsdS může docházet ke změnám, které mohou ovlivnit výsledek testů, přestože na sekvenční typ MLST nemají vliv (tato typizační metoda je zaměřena na tzv. housekeeping neboli provozní geny, které jsou velmi konzervativní). Xu a kol (2011) stejně jako Monk a kol (2012) prokázali, že zásadní úlohu v zamezení horizontálnho přenosu genů u S. aureus nehraje R-M systém typu I, ale typu IV, který je schopen štěpit modifikovanou DNA. Mohl by tedy mít vliv i na rezistenci k virulentním fágům. V Tab. 22 jsou výsledky RM testů porovnány s testy citlivosti a profágovým profilem, který byl u některých kmenů upřesněn díky detekci dalších profágových modulů Petrou Formanovou (2013). Jednotlivé profágy od sebe odlišuje právě různá kombinace typů modulů. Příslušnost testovaných kmenů k CC ani specifita Sau1, která vyjma izolátu EP5 odpovídá CC, nemají vliv na profil citlivosti izolátů k bakteriofágům. Profágový profil citlivých kmenů E26 a NCTC 8511 se zdá být do určité míry podobný, pravděpodobně obsahují stejné profágy. U zcela necitlivých kmenů se profily profágů liší na úrovni antirepresoru. Izoláty, u nichž nejsou určeny všechny profágové moduly, nelze objektivně posoudit z hlediska přítomnosti stejných profágů, i v rámci jednoho amidázového typu se totiž profágy velmi liší.
57
Tab. 22: Srovnání výsledků RM testů (specifita Sau1) s testy citlivosti a detekcí profágových modulů # – specifická velikost produktu, ale zatím nebyla pro dané CC publikována. * – moduly testované Petrou Formanovou (Formanová 2013), N = detekce neprovedena.. S. aureus
CC
Sau1
SA 812
30
CC30
Sérol. sk. N
E26
5
CC5
A, B, Fa
NCTC 8511
N
CC8
A, B, Fa
Sa2 Sa3 Sa6
E29
1
CC1
A, Fa
Sa2 Sa3
E48
8
CC8
A, Fa
NCTC 8511 (53+)
N
CC8
A, B, Fa
EP5
45
CC8
A, B, Fa
E43
8
CC8
B, Fa
Sa2, Sa3 Sa2 Sa3 Sa6 Sa7 Sa2 Sa3 Sa5 Sa6 Sa7 Sa3 Sa6 Sa7
E53
8
CC8
B, Fa
E14
8
CC8
EP17
8
CC8 #
06/622
80
CC80
07/910
80
CC80#
Integráza
Antirepresor*
Amidázy*
dUTPáza*
Φ812
Φ812a
Φ812b
Φ812i
ΦF1
ΦK1
N Sa1 Sa3 Sa5 Sa6
N ant1d, ant4a, ant4b ant1d,ant4a, ant4b .N
N ami1, ami2, ami3, ami4
N
+
+
+
+
+
+
dUTP1, 2
+
+
+
+
+
+
ami2, ami3
dUTP1, 2, 3
+
+
+
+
+
+
ami3
N
+
-
-
+
-
-
N
ami3
N
-
+
-
+
+
+
N
N
N
-
+
-
+
+
+
ant1b, ant4b
ami3, ami2
N
-
+
-
+
+
+
N
ami1, ami3
N
+
-
+
+
-
-
Sa3 Sa6 Sa7
N
ami1, ami3
N
+
-
+
+
-
-
Fa
Sa3
ant4b
ami3
dUTP3
-
-
-
-
-
-
Fa, Fb
Sa3 Sa7
ant1e, ant4a
ami3
N
-
-
-
-
-
-
Fb
Sa2 Sa3
ant1a
N
-
-
-
-
-
-
A, B, Fb
Sa2 Sa3
ant1a
ami3 ami1, ami2, ami3
N
-
-
-
-
-
-
58
5.3 Izolace variant fága schopných růstu na necitlivých kmenech S. aureus Z citlivosti kmenů E48 (CC8) a EP5 (CC45) je patrné, že fág Φ812 musel pasážemi přes kmeny E48 a SA 812 projít také jinou změnou, než je pouhá modifikace DNA. Po pomnožení Φ812 na necitlivém izolátu E48 byly oba kmeny (SA 812 i E48) citlivé ke všem variantám modifikovaného fága 812 (m812_1, m812_2, m812_3) a tato vlastnost zůstala zachována i po pasáži přes SA 812. Pokud by byly fágy modifikací, získanou růstem na izolátu E48, chráněny před R-M systémem Sau1, trojnásobnou pasáží přes SA 812 by ztratily původní modifikaci a kmeny E48 a EP5 by k nim byly opět necitlivé. Pokud by jedinou změnou po pasáži přes izolát E48 byla modifikace DNA, vedlo by to u testovaných izolátů ke stejné reakci na všechny 3 izolované varianty fága. Kmeny E29 (CC1) a 08/220 (CC22) však prokázaly rezistenci i citlivost v závislosti na vzorku modifikovaného fága.. Hodnoty účinnosti výsevu (EOP) se mezi jednotlivými Φm812 velmi lišily. Největší rozdíl se projevil mezi Φm812_2 (trojnásobně nižší na E48 než na SA 812) a Φm812_2‘ (byla stonásobně nižší na E48 než na propagačním kmeni SA 812). Nízká výtěžnost tohoto fága na kmeni E48 byla nezávislá na pomnožovacím kmeni. Varianty Φm812_1 a Φm812_1‘ vykazovaly jen malý rozdíl v efektivitě tvorby plak ve srovnání kmenů E48 a SA 812. Varianta Φm812_3‘ vykázala trojnásobně nižší schopnost tvorby plak na SA 812 ve srovnání s Φm812_3, tvorba plak však u ní byla ekvivalentní na kmenech obou CC. Z výsledků těchto testů citlivosti tedy vyplývá, že se podařilo izolovat 3 různé spontánní mutanty Φ812, které v tomto případě rozšířily hostitelské spektrum fága o 2 další kmeny (EP5 a E48). U těchto fágových mutant mohlo dojít k modifikaci R-M systémem Sau1 na kmeni E48, tato modifikace však neměla vliv na schopnost fága infikovat izoláty s jinou specifitou Sau1 (tedy izoláty z CC1, CC5 a CC22) a účinně se na nich multiplikovat. Zajímavé je srovnání tohoto závěru s výsledky izolace restrikčně-deficientních mutant (dále r–) kmenů původně necitlivých k fágu 812 a jeho mutantám v rozmezí hostitele i k fágům mezinárodní typizační řady (IPTS), dříve používané k fagotypizaci S. aureus (Doškař a Rosypal 1986). Tato práce prokázala, že po mutagenezi nitrosoguanidinem byly původně necitlivé kmeny přístupné infekci všemi testovanými fágy, staly se tedy citlivými. Původně citlivé kmeny zároveň zůstaly citlivými. Zajímavá je také rezistence k fágům IPTS, která je (vyjma r+ kmenů citlivých k mutantám Φ812 s nejširším rozmezím hostitele) velmi vysoká a po mutagenezi se ve většině případů nemění, což naznačuje zachování lyzogenní imunity (tedy i přítomných profágů). Vliv případné změny nebo ztráty fágových receptorů byl vyloučen adsorpčními testy (Doškař a Rosypal 1986). Ty sice prokázaly schopnost fága zachytit se na buněčné stěně bakterie, ale samy o sobě nejsou důkazem, že následně může dojít k injekci DNA. Možnost vlivu profágů byla v práci vyloučena na základě indukce profágů z necitlivých kmenů S. aureus. Získané lyzáty následně 59
nebyly schopné lyzovat r– mutanty, což potvrzuje, že jsou v r– mutantách nejspíše stále přítomny původní profágy a je zde zachována lyzogenní imunita. Autoři tedy shrnuli výsledky jako vliv „nezávislého R-M systému specifického pro fága 812“ (Doškař a Rosypal 1986). Práce Petry Formanové (2013) však přinesla poznatek, že úplná rezistence k virulentním fágům může souviset s přítomností určitého profága v genomu rezistentního kmene S. aureus. Z rezistentního izolátu E14 se jí podařilo indukovat profága séroskupiny Fa (integráza Sa3, antirepresor typu 4b a amidáza typu 3), který byl následnou lyzogenizací vnesen do bezprofágového kmene 1039, původně citlivého ke všem testovaným polyvalentním fágům (Φ812, Φ812a, Φ812b, Φ812i, ΦK1 a ΦF1). Úspěšnou lyzogenizací mírným fágem se tento kmen stal necitlivým k této sadě virulentních fágů. Tento výsledek nejenže potvrdil význam určitých profágů v rezistenci hostitelského kmene k virulentním fágům. Také vysvětlil, proč se u kmene E14 nepodařilo ani vícenásobnou pasáží v tekutém médiu (tzn. při velmi vysokém titru bakterie i velkém množství přítomných fágových částic), izolovat modifikovaného nebo mutatního fága schopného pomnožení na tomto izolátu. Podobný mechanismus rezistence by mohl být přítomen i u kmene Mu50. Zároveň přináší metodu, která umožňuje zjistit, zda profág hraje roli v rezistenci daného kmene k polyvalentním fágům a tím vyloučit ostatní možné příčiny. Přesto mechanismus, kterým v tomto případě dochází k zábránění úspěšné infekce virulentním fágem, zatím není znám. Snížená adsorpce fága však může být vyloučena, protože se u fágů Φ812 a ΦK1 pohybovala na izolátu E14 kolem 90% (LMDM ÚEB, nepublikováno).
5.4 Vliv lyzogenie na citlivost S. aureus k polyvalentním fágům Sbírkové kmeny lyzogenizované fágem Φ53 prokázaly změnu fenotypu citlivosti k fágu Φ812 a 812b, výchozí kmeny těchto lyzogenů byly k těmto fágům citlivé, což poukazuje na vliv profága na rezistenci hostitele k virulentním fágům. V tomto případě je však rezistence překonatelná mutací a dá se tedy obejít použitím mutant v rozmezí hostitele. Stejný fenotyp citlivosti se projevil i u kmenů se začleněným fágem Φ47. Výsledky tedy naznačují, že fágy Φ47 a Φ53 využívají podobný mechanismus obrany proti superinfekci hostitele jiným fágem. Rosypal a Horáková (1968) objevili, že po začlenění fága 53 do genomu S. aureus, ztrácí tato bakterie citlivost k polyvalentnímu fágu 812. Později byly z kmenů obsahujících profága Φ53 izolovány spontánní mutanty 812a a 812k, z linie fága 812a pak byly na dvou různých kmenech S. aureus izolovány mutanty 812e a 812i. Právě jmenované mutanty 812a, 812i a 812k prokázaly v následných testech citlivosti laboratorních i klinických kmenů nejširší rozmezí hostitele, zároveň jsou schopny lyze kmene se začleněným fágem 53. Tyto vlastnosti dokazují, že mutace získaná pro překonání jednoho mechanismu rezistence se nemusí vytratit po pasáži přes jiný kmen, kde fág získá mutaci jinou, která mu pomáhá překonat rezistenci tohoto kmene. Zároveň může charakteristika propagačních kmenů pomoci zjistit, jaký mechanismus rezistence je fág nucen 60
překonat. (Fág 812e, přestože patří do stejné linie jako Φ812i, byl izolován z kmene HS1160 s jiným složením buněčné stěny a fenotypem podobným spíše koaguláza-negativním stafylokokům, na tzv. Kormanově koaguláza-negativním S. aureus, což nejspíše vedlo ke snížení jeho rozmezí hostitele.) Formanová (2013) se ve své diplomové práci zabývala vlivem profágů na rezistenci S. aureus k polyvalentním fágům a jedním ze závěrů je, že profágy Φ47, Φ53 a Φ12 mají stejný vliv na profil citlivosti hostitele k mutantám Φ812. U všech tří profágů byl zjištěn gen kódující neznámý protein, který nejspíše s tímto fenotypem souvisí. Zajímavostí je zde vzájemná nepříbuznost profágů Φ53 a Φ47 (Doškař a kol. 2000, Kwan a kol. 2005) a Φ12 a Φ53 (Kahánková a kol. 2010). Na základě přesnější identifikace profágů pomocí PCR zacílené na jednotlivé moduly genomu profágů bylo zjištěno, že izolát EP5 obsahuje profága 47 Φ12 (Formanová 2013). U izolátu se stejným profilem citlivosti, E48, nebyla provedena detekce všech modulů. Podle dosud detekovaných typů modulů (viz Tab. 22) je však zřejmé, že se nejedná o lyzogena fága Φ53 ani Φ47 (Kahánková a kol. 2010, Formanová 2013). Zajímavým detailem týkajícím se objevu R-M systému Sau1 je fakt, že kmen S. aureus RN4220 (běžně používaný pro genetické manipulace a díky nemuž byl tento R-M systém popsán) neobsahuje profágy. Je uměle připravenou mutantou jiného kmene (8325-4), který je laboratorní bezprofágovou variantou klinického kmene PS47, také nazývaného 8325 (Waldron a Lindsay 2006). Při experimentu, kdy byl kmen RN4220 úspěšně lyzován mírným fágem, byl jediným způsobem, kterým mohlo dojít k zabránění infekce fágem a příjmu cizorodé DNA, právě R-M systém. Obecný vliv Sau1 na příjem cizorodé DNA potvrzuje fakt, že ani bezprofágová varianta kmene PS47 (s funkčním Sau1) není schopná přijmout plasmidovou DNA E. coli, modifikovaná DNA S. aureus se však transdukcí přenáší mezi bezprofágovými kmeny stejného klonu RN4220 a 8325-4. Přenos do výchozího lyzogena (obsahujícího 3 profágy) však nebyl testován (Waldron a Lindsay 2006). Samotné fágy však mohou kódovat R-M systém, jako například mírný stafylofág Φ42. Po lyzogenní konverzi následkem začlenění tohoto fága do genomu, se hostitelská bakterie stává necitlivou ke všem fágům mezinárodní typizační řady (Dempsey a kol. 2005).
5.5 Detekce fága Φ53 v kmeni NCTC 8511 Z výsledku amplifikace genů pro fágové integrázy a sbalovací modul, hlavičku a bičík, který určuje fágovou sérologickou skupinu (Obr. 10) je patrné, že u NCTC 8511 s profágem Φ53 (Sa7/B) i bez něj, jsou v genomu přítomny i další profágy s integrázami Sa2, Sa3 a Sa6, patřící do sérologických skupin A a Fa. U varianty bez profága Φ53 je zachována sérologická skupina B (do které může patřit i jiný ze začleněných profágů), ale integráza 7 zde chybí. V kmeni NCTC 8511 tedy profág Φ53 není přítomen, zatímco v kmeni NCTC 8511 (53+) se jej podařilo prokázat. 61
5.6 Překonání R-M systémů polyvalentními fágy Problémy s přenosem cizorodé DNA (např. transformací) do klinických kmenů jasně ukazují, že určité R-M systémy těchto kmenů musejí být funkční a hrají roli v přenosu mobilních genetických elementů. V tom případě musejí fágy disponovat účinným mechanismem, který jim je umožňuje překonat. Pokud polyvalentní stafylofágy postrádají rozpoznávací sekvence pro většinu R-M systémů typu II (Pantůček a kol. 1998, REBASE, GenBank), nabízí se otázka, zda tomu tak není i pro rozpoznávací sekvence R-M systému typu I. V současné době však nejsou tyto sekvence známy. Polyvalentní fágy ale nejspíše disponují mechanismem, kterým jsou schopny tyto R-M systémy „obejít“. Tomu nasvědčuje, že fág 812 spolu s jeho mutantami v rozmezí hostitele a příbuznými fágy 131, Sk311 a U16 mohou infikovat až 95% ze 782 testovaných sbírkových kultur a klinických kmenů S. aureus (Pantůček a kol. 1998). R-M systémy jsou pro virulentního polyvalentního fága překonatelnou bariérou díky určité pravděpodobnosti výskytu restrikčně-deficientních mutant schopných modifikace DNA (r m+), které fág může infikovat, pomnožit se na nich a jeho potomstvo s modifikovanou DNA je schopno napadnout ostatní, restrikce schopné (r+ m+) klony daného kmene (Murray 2000). Přitom „ochota“ metyláz přijmout jako substrát nemodifikovanou fágovou DNA se mezi rodinami R-M systému typu I může lišit. Zatímco rodina IA (EcoKI) metyluje takovouto DNA velmi neochotně, rm+ mutanty s metylázovým kompexem rodiny IC (EcoR124I, EcoR124II) je tento substrát modifikován velmi dobře (Murray 2000). Není také vyloučeno, že klinické kmeny díky zvýšenému selekčnímu tlaku nastřádaly mutace i v genech pro R-M systém Sau1 a mohou tedy být restrikčně deficientní. Sau1 je totiž díky své relativně složité stavbě velmi citlivý k určitým bodovým mutacím, které však nutně nemusí vést ke snížené životnosti restrikčně deficientního kmene – právě naopak. V prostředí, kde je velmi výhodné získávat nové geny pro rezistenci k ATB, se zdá tato vlastnost výhodnou. V praktické části této práce byla navíc převážná většina kmenů MRSA, u jedné klonální linie se navíc vyskytovaly různé typy kazet SCCmec, stejně jako různé profily rezistence k ATB, i rozdílné množství profágů přítomných v jejich genomu, což by mohlo značit zvýšenou schopnost příjmu cizorodé DNA. U R-M systémů typu I je mutace vedoucí k defektu endonukleázové aktivity velmi pravděpodobná díky podjednotkové stavbě komplexu. Dostačující je přitom jednobodová mutace (způsobující např. substituci nukleotidu a s tím související záměnu AMK) na podjednotce hsdS v místě, které se podílí na vzájemné interakci s hsdR (O’Neill a kol. 1998, Weiserova a Firman 1998). Metylační komplex však ztráta této interakce nemusí vždy ovlivnit (O’Neill a kol. 1998, Weiserova a Firman 1998). Tyto mutace se týkají zejména okrajů konzervovaných a variabilních
62
regionů podjednotky hsdS (Murray 2000). Vyšší je však pravděpodobnost mutace na úrovni interakce celého komplexu s DNA, vedoucí ke vzniku rm mutant (O’Neill a kol. 1998). Jedním z popsaných mechanismů, kterým jsou fágy schopny aktivně překonat R-M systém typu I, je exprese proteinu vázajícího a inhibujícího tento R-M systém, která následuje ihned po injekci DNA do hostitele. Bandyopadhyay a kol. (1985) popsali takto působící protein Ocr u kolifága T7. Dalším způsobem, jak zabránit štěpení DNA R-M systémem typu I je injekce DNA spolu s proteinem, který přechodně brání restrikci (Iida a kol. 1987). Současnou obranou proti R-M systému typu I a III je tzv. Ocr-like protein kolifága T3, který je schopen také štěpit kofaktor potřebný pro endonukleázovou aktivitu těchto R-M systémů: Sadenosyl methionin (Studier a Movva 1976). Zda jsou stafylofágy schopny podobných způsobů překonání R-M systémů hostitele, zatím nebylo zjištěno. Dalším R-M systémem, který může mít vliv na úspěšné přijetí fágové DNA hostitelem, je R-M systém typu IV, který štěpí DNA, pokud je rozpoznávací sekvence metylována. I proti tomuto mechanismu jsou však fágy schopny se bránit – glukosylací hydroxymetylovaných bází, což bylo prokázáno u fágů E. coli. Pokud je bakterie přesto schopna rozpoznat glukosylovanou DNA, mohou se fágy bránit pomocí tzv. vnitřního proteinu I (IPI), který brání štěpení glykosylované DNA (Rifat a kol. 2008). U stafylofágů zatím nebyla glukosylace DNA ani přítomnost proteinů bránících štěpení endonukleázami studována a samotný R-M systém typu IV byl u S. aureus popsán teprve nedávno (Xu a kol. 2011).
5.7 Příčiny rezistence S. aureus k polyvalentním bakteriofágům Kelly a kol. (2011) se v rámci vývoje fágového koktejlu na bázi polyvalentního stafylofága K zabývali příčinami rezistence S. aureus k tomuto fágu. Ze 180 testovaných kmenů projevilo rezistenci k fágu 29 kmenů (16,1%). U 13,3% kmenů byl údajně příčinou R-M systém (vyvozeno z úspěšné izolace „modifikovaných“ fágů z necitlivých kmenů). U kmenů, kde takováto izolace nebyla možná, byly provedeny adsorpční testy. U 1,7% kmenů byla jako příčina rezistence určena snížená adsorpce fága na povrch bakterie, u ostatních kmenů (1,1%) nebyla příčina rezistence zjištěna. Považovat však fágy izolované na necitlivém kmeni za modifikované, je chybným závěrem, který
nerozlišuje
adaptaci
polyvalentního
fága
(tedy
modifikaci
jeho
DNA)
se
spontánními genomovými přestavbami a mutacemi (u mutant v rozmezí hostitele), které mohou také rozšířit hostitelské spektrum fága (Rosypal a Rosypalová 1972; Pantůček a kol. 1998). Fágové mutanty mají navíc schopnost překonat bariéry rezistence dané např. přítomností profága v genomu rezistentního S. aureus (Rosypal a Rosypalová 1970; Formanová 2013), což bylo potvrzeno i v této práci výsledky testů citlivosti definovaných lyzogenů k fágu 812 a jeho 63
mutantám. Ve výše zmíněné práci autoři neberou v potaz přítomnost profágů v genomu testovaných kmenů. V naší laboratoři se zatím nepodařilo zjistit, že by u některého z klinických izolátů nebo sbírkových kmenů (vyjma uměle delyzogenizovaných kmenů) profágy zcela chyběly. Z existenčního hlediska je pro profága zcela nepřípustná superinfekce hostitele virulentním fágem, který profágu znemožní vertikální šíření v populaci hostitele, což by opodstatňovalo snahu profága bránit se i této formě superinfekce. Z testů adsorpce, které proběhly roku 2012 v laboratoři LMDM ÚEB (nepublikováno) je zřejmé, že se schopnost navázat se na povrch bakterie může v určité míře mezi fágy lišit, liší se však i mezi standardním fágem a jeho mutantami. Samotná adsorpce fága nestačí k infekci bakterie, pokud fág není schopen injekce DNA. Jak publikovali Sun a kol. (2006), bakterie druhu Streptococcus thermophilus mohou mít na svém povrchu lipoprotein kódovaný profágem, který brání injekci DNA fága, přestože samotná adsorpce proběhne úspěšně. Tento mechanismus patří mezi tzv. sie (superinfection exclusion) mechanismy – tzn. mechanismy bránící superinfekci a je tedy dán vzájemnou interakcí mezi profágem a virulentním fágem. U S. aureus zatím podobný mechanismus nebyl popsán, jeho existence je však vzhledem k rozmanitosti mírných fágů tohoto druhu velmi pravděpodobná. Vysvětloval by úplnou rezistenci některých izolátů S. aureus, na něž fágové částice adsorbují dobře např. E14 a (v případě fága ΦK1) Mu50 (LMDM ÚEB, nepublikováno).
5.8 Srovnání genomů citlivého a necitlivého kmene S. aureus V LMDM ÚEB bylo v rámci rozsáhlejšího testování sbírkových kmenů a klinických izolátů S. aureus otestováno 100 kmenů, mezi nimi také soubor sekvenovaných kmenů. Z nich příbuzné Mu50 a N315, oba z CC5 vykazovaly zcela rozdílnou citlivost k fágům – Mu50 je zcela necitlivý, zatímco N315 zcela citlivý (nepublikováno). Srovnáním genomů těchto dvou kmenů se zabýval např. Ohta a kol. (2004). Dospěli k závěru, že navzdory velké příbuznosti těchto kmenů, vykazují velké rozdíly v genomu na úrovni některých metabolických drah a regulaci transkripce (AMK substituce příslušných genech), také v rezistenci k ATB (N315 je genotypově MRSA, fenotypově je však senzitivní k meticilinu, Mu50 je VRSA) a stavbě buněčné stěny (Mu50 má silnější buněčnou stěnu). Právě silnější buněčná stěna stejně jako některé jiné fenotypové charakteristiky (např. metabolismus mastných kyselin) zdánlivě souvisejí s přítomností genu vanA a jeho regulátorů (zejména vraR) u kmene Mu50, jak ukázal jeho přenos do kmene Mu3 (Kuroda a kol. 2000) Po srovnání sekvencí podjednotek Sau1 těchto dvou kmenů (psi-BLAST) zjistíme, že se tyto dva kmeny liší pouze jedinou AMK v podjednotce hsdM a taktéž záměnou jedné AMK v jedné z podjednotek HdsS. Zda mají mutace těchto reziduí zásadní vliv na funkci enzymu, by pomohl 64
osvětlit strukturní model endonukleázového komplexu Sau1 popřípadě již studované bodové mutace. Pro tento R-M systém však proteinová struktura zatím nebyla vyřešena, dostupný je pouze model sestavený podle výsledků mikroskopie atomárních sil (AFM) R-M systému EcoKI, který patří do rodiny IC R-M systémů typu I (RCSB PDB), vliv mutací konkrétních reziduí zatím také nebyl studován (UniProt). Zmiňované kmeny se však liší i obsahem profágů. Ve kmeni N315 je začleněn profág ΦN315, zatím co kmen Mu50 obsahuje profágy dva: ΦMu50A a ΦMu50B (Kuroda a kol. 2001), které jsou zcela rozdílné. ΦN315 je však z hlediska modulových typů blízký ΦMu50A – liší se jen v typu dUTPázy (Kahánková a kol. 2010). Pro další studium rezistence S. aureus k polyvalentním fágům bude třeba prozkoumat mechanismy, jakými mutanty v rozmezí hostitele překonávají obranné mechanismy bakterie a objasnit mechanismy úplné rezistence S. aureus k polyvalentním fágům, která by mohla působit problémy zejména v případech, ve kterých by díky úplné rezistenci S. aureus k antibiotikům byly fágy lékem poslední volby. Je přitom možné využít údajů z databází s výsledky genomových projektů. Ke 3. 5. 2013 byla osekvenována DNA 41 kmenů S. aureus (NCBI). Bylo by možné hledat korelaci mezi rozdíly v genomu příbuzných kmenů S.aureus a jejich citlivostí k fágům, případně podrobit podrobnému studiu genomy fágových mutant.
65
6 Závěr Celkem 45 kmenů a izolátů S. aureus ze sedmi různých CC (mezi nimi i 25 klinických izolátů MRSA) bylo otestováno na citlivost k vybraným virulentním polyvalentním fágům. U 29 z nich byla pomocí PCR stanovena sekvenční specifita rozpoznávací podjednotky R-M systému Sau1, která u naprosté většiny souhlasí s příslušností ke klonální linii. Srovnáním výsledků z těchto dvou testů vyplývá, že R-M systém Sau1 nemá zásadní vliv na rezistenci S. aureus k polyvalentním bakteriofágům. Nepřímým důkazem je izolace variant fága Φ812 na necitlivých MRSA izolátech E14 a E48 a sekvenovaném, taktéž necitlivém kmeni Mu50. Pouze z kmene E48 se podařilo získat 3 různé varianty fága 812. Jedná se však o mutanty, nikoli modifikované fágy, což dokázalo vzájemné srovnání citlivosti souboru kmenů k těmto variantám fága 812. Mechanismus rezistence, který byl překonán, tedy nebyl R-M systém typu I. Polyvalentní bakteriofágy postrádají cílové sekvence pro některé z R-M systémů S. aureus typu II (GenBank, REBASE). Cílové sekvence pro R-M systémy typu I (včetně Sau1) zatím nejsou známy, proto je možné, že jsou tyto fágy proti účinkům endonukleázového komplexu Sau1 také chráněny absencí cílových sekvencí jeho variant, případně mají jiné ochranné mechanismy. Dle výsledků testů citlivosti sbírkových lyzogenních kmenů (LMDM ÚEB) s definovanými profágy k polyvalentním bakteriofágům se zdá, že nezanedbatelný vliv na rezistenci má právě interakce mezi profágem a virulentním bakteriofágem. Tuto domněnku potvrdila diplomová práce Petry Formanové (2013). Zároveň se podařilo zavést na pracovišti LMDM ÚEB metodu RM testů pro určení specifity hsdS Sau1 a orientační zařazení MRSA do klonální linie, kde byly určeny kontroly pro šest klonálních linií MRSA (CC1, CC5, CC8, CC22, CC30 a CC80). Na problematiku rezistence bakterií k polyvalentním bakteriofágům je třeba pohlížet komplexně a z různých úhlů, u jednoho kmene může být přítomno více mechanismů rezistence a zároveň samotné polyvalentní fágy podléhají relativně rychlé evoluci, která souvisí s vysokou efektivitou, rychlostí jejich multiplikace a náchylností ke genomovým přestavbám. Ukazuje se však, že u S. aureus hrají v rezistenci k polyvalentním fágům velmi důležitou roli profágy.
66
7 Seznam literatury Ashefold K. E., Day M. J., Fry J. C. (2003): Elevated abundance of bacteriophage infecting bacteria in soil. Appl. Environ. Microbiol. 69: 285–289. Baba, T., Bae, T., Schneewind, O., Takeuchi, F. and Hiramatsu, K. (2008): Genome sequence of Staphylococcus aureus strain newman and comparative analysis of staphylococcal genomes: Polymorphism and evolution of two major pathogenicity islands. J Bacteriol 190: 300-310. Bandyopadhyay, P. K., Studier, F. W., Hamilton, D. L. and Yuan, R. (1985): Inhibition of the type I restriction-modification enzymes EcoB and EcoK by the gene O.3 protein of bacteriophage T7. Journal of Molecular Biology 182: 567-578. Beltrame, C. O., Botelho, A. M. N., Silva-Carvalho, M. C., Souza, R. R., Bonelli, R. R., Ramundo, M. S., Guimares, M. A., Coelho, L. R. and Figueiredo, A. M. S. (2012): Restriction modification (RM): tests associated to additional molecular markers for screening prevalent MRSA clones in Brazil. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 31: 2011-2016. Beneš J., Myslivec O., Laštíková J., Gabrielová A., Petráš P., Pantůček R. (2010): Septický šok při fatálně probíhající stafylokokové pneumonii: význam Pantonova-Valentinova leukocidinu - kazuistika. Anesteziologie a intenzivní medicína, Praha: ČLS J.E. Purkyně. 6: 337–341 Benchetrit L. C., Gray E. D., Wannamaker L. W. (1977): Hyaluronidase activity of bacteriophages of group A streptococci. Infect. Immun. 15: 527–532 Bergey, D. H., Boone, D. R., Garrity, G. M., Castenholz, R. W., Brenner, D. J., Krieg, N. R. and Staley, J. T. (2001): Bergeys Manual of Systematic Bacteriology: The Firmicutes. SpringerVerlag New York. 430 s. Bergh O., Borsheim K. Y., Bratbak G., Heldal M. (1989): High abundance of viruses found in aquatic environments. Nature 340: 467–468. Burroughs N. J., Marsh P., Wellington E. M. (2000): Mathematical analysis of growth and interaction dynamics of streptomycetes and a bacteriophage in soil. Appl. Environ. Microbiol. 66: 3868–3877. Chen, J. and Novick, R. P. (2009): Phage-Mediated Intergeneric Transfer of Toxin Genes. Science 323: 139-141. Chibani-Chennoufi, S., Bruttin, A., Dillmann, M. L. and Brussow, H. (2004): Phage-host interaction: an ecological perspective. J Bacteriol 186: 3677-3686. Cockfield, J. D., Pathak, S., Edgeworth, J. D. and Lindsay, J. A. (2007): Rapid determination of hospital-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. Journal of Medical Microbiology 56: 614-619. Corvaglia, A. R., Francois, P., Hernandez, D., Perron, K., Linder, P. and Schrenzel, J. (2010): A type III-like restriction endonuclease functions as a major barrier to horizontal gene transfer in clinical Staphylococcus aureus strains. PNAS 107: 11954-11958. Dempsey, R. M., Carroll, D., Kong, H. M., Higgins, L., Keane, C. T. and Coleman, D. C. (2005): Sau421, a Bcgl-like restriction-modification system encoded by the Staphylococcus aureus quadruple-converting phage phi 42. Microbiology-Sgm 151, 1301-1311. 67
Destoumieux-Garzón D., Duquesne S., Peduzzi J., Goulard C., Desmadril M., Letellier L., Rebuffat S., Boulanger P. (2005): The iron-siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11-Pro16 beta-hairpin region in the recognition mechanism. Biochem J. 389: 869–876. Deurenberg, R. H., Vink, C., Kalenic, S., Friedrich, A. W., Bruggeman, C. A. and Stobberingh, E. E. (2007): The molecular evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clinical Microbiology and Infection 13: 222-235. Doškař J. (1989): Characteristics of restriction-modification system of the polyvalent phage 812 in strains of Staphylococcus aureus. Publ. Fac. Sci. Univ. J. E. Purkyně, Brno, 10: 391–401. Doškař, J., Pallová, P., Pantůček, R., Rosypal, S., Růžičková, V., Pantůčková, P., Kailerová, J., Kleparnik, K., Malá, Z. and Boček, P. (2000): Genomic relatedness of Staphylococcus aureus phages of the International Typing Set and detection of serogroup A, B, and F prophages in lysogenic strains. Canadian Journal of Microbiology 46: 1066-1076. Doškař J., Rosypal S. (1986): Restriction-deficient mutants of the Staphylococcus aureus strains resistant to the polyvalent phage 812. Publ. Fac. Sci. Univ. J. E. Purkyně, Brno,7: 337–346. Enright, M. C., Day, N. P. J., Davies, C. E., Peacock, S. J. and Spratt, B. G. (2000): Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology 38: 1008-1015. Formanová P. (2013): Vliv lyzogenie na citlivost kmenů Staphylococcus aureus k polyvalentním fágům. Diplomová práce, Masarykova univerzita, Brno, 77 s. Furuse K. (1987): Distribution of coliphages in the general environment: general considerations. In: Goyal S. M., Gerba C., Bitton G. (eds.), Phage ecology, 87–124, John Wiley & Sons, New York, N.Y. Iida, S., Streiff, M. B., Bickle, T. A. and Arber, W. (1987): 2 DNA antirestriction systems of bacteriophage P1, darA and darB – characterization of darA-phages. Virology 157: 156-166. Jonasson J., Rutberg L., Young F. E (1969): Lysogenic conversion in Bacillus amyloliquefaciens H affecting viral adsorption. J. Virol. 4: 309–310. Kahánková, J., Pantůček, R., Goerke, C., Růžičková, V., Holochová, P. and Doškař, J. (2010): Multilocus PCR typing strategy for differentiation of Staphylococcus aureus siphoviruses reflecting their modular genome structure. Environmental Microbiology 12: 2527-2538. Kašpárek, P., Pantůček, R., Kahánková, J., Růžičková, V. and Doškař, J. (2007): Genome Rearrangements in host-range mutants of the polyvalent staphylococcal bacteriophage 812. Folia Microbiologica 52: 331-338. Kelly, D., McAuliffe, O., OMahony, J. and Coffey, A. (2011): Development of a broad-hostrange phage cocktail for biocontrol. Bioengineere 2: 31-37. Kennaway C. K., Obarska-Kosinska A., White J. H., Tuszynska I., Cooper L. P:, Bujnicki J. M., Trinick J., Dryden D. T. F. (2009): The structure of EcoKI type I metyltransferase with a DNA mimic antirestriction protein. Nucleic Acids Res.: 37: 762–770
68
Kuroda, M., Kuwahara-Arai, K. and Hiramatsu, K. (2000): Identification of the up- and downregulated genes in vancomycin-resistant Staphylococcus aureus strains Mu3 and Mu50 by cDNA differential hybridization method. Biochemical and Biophysical Research Communications 269: 485-490. Kuroda, M., Ohta, T., Uchiyama, I., Baba, T., Yuzawa, H., Kobayashi, I., Cui, L. Z., Oguchi, A., Aoki, K., Nagai, Y., Lian, J. Q., Ito, T., Kanamori, M., Matsumaru, H., Maruyama, A., Murakami, H., Hosoyama, A., Mizutani-Ui, Y., Takahashi, N. K., Sawano, T., Inoue, R., Kaito, C., Sekimizu, K., Hirakawa, H., Kuhara, S., Goto, S., Yabuzaki, J., Kanehisa, M., Yamashita, A., Oshima, K., Furuya, K., Yoshino, C., Shiba, T., Hattori, M., Ogasawara, N., Hayashi, H. and Hiramatsu, K. (2001): Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet 357: 1225-1240. Kwan, T., Liu, J., DuBow, M., Gros, P. and Pelletier, J. (2005): The complete genomes and proteomes of 27 Staphylococcus aureus bacteriophages. PNAS 102: 5174-5179. Labrie S. J., Samson J. E., Moineau S. (2010): Bacteriophage resistance mechanisms. Nat. Rev. Microbiol. 8: 317–327. Lobocka, M., Hejnowicz, M. S., Dabrowski, K., Gozdek, A., Kosakowski, J., Witkowska, M., Ulatowska, M. I., Weber-Dabrowska, B., Kwiatek, M., Parasion, S., Gawor, J., Kosowska, H. and Glowacka, A. (2012): Genomics of Staphylococcal Twort-like Phages - Potential Therapeutics of the Post-Antibiotic Era. Advances in Virus Research 83: 143-216. Meselson, M., Yuan, R. (1968): DNA restriction enzyme from E. coli. Nature 217: 1110-1114. Mojica F. J. M., Diez-Villasenor C., Garcia-Martinez J., Almendros C. (2009): Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence systém. Microbiology 155: 733–740. Molineaux I. J. (1991): Host-parasite interactions: recent developments in the genetics of abortive phage infections. New Biol. 3: 230–236. Monk, I. R., Shah, I. M., Xu, M., Tan, M. W. and Foster, T. J. (2012): Transforming the Untransformable: Application of Direct Transformation To Manipulate Genetically Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. mBio, 3:00277-11. Murray, N. E. (2000): Type I restriction systems: Sophisticated molecular machines (a legacy of Bertani and Weigle). Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64: 412-434. Nordström K., Forsgren A. (1974): Effect of a protein A on adsorption of bacteriophages to Staphylococcus aureus. J. Virol. 14: 198–202. O‘Flaherty, S., Coffey, A., Edwards, R., Meaney, W., Fitzgerald, G. F. and Ross, R. P. (2004): Genome of staphylococcal phage K: a new lineage of Myoviridae infecting gram-positive bacteria with a low G+C content. J Bacteriol. 186: 2862-2871. O‘Neill, M., Dryden, D. T. F. and Murray, N. E. (1998): Localization of a protein-DNA interface by random mutagenesis. Embo Journal 17: 7118-7127. Ohta, T., Hirakawa, H., Morikawa, K., Maruyama, A., Inose, Y., Yamashita, A., Oshima, K., Kuroda, M., Hattori, M., Hiramatsu, K., Kuhara, S. and Hayashi, H. (2004): Nucleotide substitutions in Staphylococcus aureus strains Mu50, Mu3, and N315. DNA Research, 11: 51-56. 69
Pantůček, R., Rosypalová, A., Doškař, J., Kailerová, J., Růžičková, V., Borecka, P., Snopková, S., Horvath, R., Götz, F. and Rosypal, S. (1998): The polyvalent staphylococcal phage phi 812: Its host-range mutants and related phages. Virology 246: 241-252. Rifat D., Wright N. T., Varney K. M., Weber D. J., Black L. W. (2008): Restriction endonuclease inhibitor IPI* of bacteriophage T4: a novel structure for a dedicated target. J. Mol. Biol. 375: 720–734. Roberts, R. J., Belfort, M., Bestor, T., Bhagwat, A. S., Bickle, T. A., Bitinaite, J., Blumenthal, R. M., Degtyarev, S. K., Dryden, D. T. F., Dybvig, K., Firman, K., Gromová, E. S., Gumport, R. I., Halford, S. E., Hattman, S., Heitman, J., Hornby, D. P., Janulaitis, A., Jeltsch, A., Josephsen, J., Kiss, A., Klaenhammer, T. R., Kobayashi, I., Kong, H. M., Kruger, D. H., Lacks, S., Marinus, M. G., Miyahara, M., Morgan, R. D., Murray, N. E., Nagaraja, V., Piekarowicz, A., Pingoud, A., Raleigh, E., Rao, D. N., Reich, N., Repin, V. E., Selker, E. U., Shaw, P. C., Stein, D. C., Stoddard, B. L., Szybalski, W., Trautner, T. A., Van Etten, J. L., Vitor, J. M. B., Wilson, G. G. and Xu, S. Y. (2003): A nomenclature for restriction enzymes, DNA metyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucl. Acids Res. 31: 1805-1812. Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J. and Macelis, D. (2007): REBASE - enzymes and genes for DNA restriction and modification. Nucl. Acids Res. 35: 269-270. Rosypal S., Horáková D. (1968): The loss of sensitivity of Staphylococcus aureus NCTC8511 to the polyvalent virulent phage 812 following lysogenisation with phage 53. Publ. Fac. Sci. Univ. J. E. Purkyně, Brno, 496: 313–326. Rosypal S., Rosypalová A. (1972): Host-range of the polyvalent staphylophage 812 and its hostrange mutants. Publ. Fac. Sci. Univ. J. E. Purkyně, Brno, 2: 105–118. Sedláček, I. (2007): Taxonomie prokaryot. Masarykova univerzita. 270 s. Scholl D., Rogers S., Adhya S., Merril C. R. (2001): Bacteriophage K1-5 encodes two different tail fiber proteins, allowing it to infect and replicate on both K1 and K5 strains of Escherichia coli. J. Virol. 75: 2509–2515. Smith, J. D., Arber, W. and Kuhnlein, U. (1972): Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. XIV. The role of nucleotide metylation in in vivo B-specific modification. J Mol Biol 63: 1-8. Stegger, M., Lindsay, J. A., Moodley, A., Skov, R., Broens, E. M. and Guardabassi, L. (2011): Rapid PCR Detection of Staphylococcus aureus Clonal Complex 398 by Targeting the RestrictionModification System Carrying sau1-hsdS1. J Clin Microbiol 49: 732-734. Studier, F. W. and Movva, N. R. (1976): SAMase gene of bacteriophage T3 is responsible for overcoming host restriction. J Virol. 19: 136-145. Sun X., Göhler A., Heller K. J., Neve H. (2006): The ltp gene of temperate Streptococcus thermophilus phage TP-J34 confers superinfection exclusion to Streptococcus thermophilus and Lactococcus lactis. Virology 350: 146–157. Szilák L., Venetianer P., Kiss A. (1990): Cloning and nucleotide sequence of the genes coding for the Sau96I restriction and modification enzymes. Nucl.Acids Res. 18: 4659–4664.
70
Tsuru, T., Kawai, M., Mizutani-Ui, Y., Uchiyama, I. and Kobayashi, I. (2006): Evolution of paralogous genes: Reconstruction of genome rearrangements through comparison of multiple genomes within Staphylococcus aureus. Molecular Biology and Evolution 23: 1269-1285. Vandersteegen, K., Kropinski, A. M., Nash, J. H. E., Noben, J. P., Hermans, K. and Lavigne, R. (2013): Romulus and Remus, two phage isolates representing a distinct clade within the Twortlikevirus genus, display suitable properties for phage therapy applications. J Virol 87: 32373247. von Eiff, C., Becker, K., Machka, K., Stammer, H., Peters, G. and Study, G. (2001): Nasal carriage as a source of Staphylococcus aureus bacteremia. New England Journal of Medicine 344: 11-16. Votava, M. (2003): Lékařská mikrobiologie speciální, Neptun. 495 s. Votava, M. (2010): Lékařská mikrobiologie - vyšetřovací metody, Neptun. 495 s. Waldron, D. E. and Lindsay, J. A. (2006): Sau1: A novel lineage-specific type I restrictionmodification system that blocks horizontal gene transfer into Staphylococcus aureus and between S. aureus isolates of different lineages. J Bacteriol. 188: 5578-5585. Weiserová, M. and Firman, K. (1998): Isolation of a non-classical mutant of the DNA recognition subunit of the type I restriction endonuclease R.EcoR124I. Biological Chemistry. 379: 585-589. Wiggins B. A., Alexander M. (1985): Minimum bacterial density for bacteriophage replication: implications for significance of bacteriophages in natural ecosystems. Appl. Environ. Microbiol. 49: 69–114. Xu, S. Y., Corvaglia, A. R., Chan, S. H., Zheng, Y. and Linder, P. (2011): A type IV modification-dependent restriction enzyme SauUSI from Staphylococcus aureus subsp aureus USA300. Nucl. Acids Res. 39: 5597-5610.
71
7. 1 Internetové zdroje GenBank – genetická sekvenční databáze. Dostupná z URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ (cit. 2. 5. 2013) Lékařský slovník on-line: Staphylococcus aureus. Dostupný z URL: http://lekarske.slovniky.cz/pojem/staphylococcus-aureus (cit. 10. 3. 2013) NCBI – National center for biotechnology information. Databáze Genome. Přístupná z URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/154 (cit. 5. 3. 2013) Psi-BLAST – nástroj pro srovnání proteinových sekvencí. Dostupný z URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome RCSB PDB – strukturní databáze proteinů a nukleových kyselin. Dostupná z URL: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do REBASE – databáze restrikčních enzymů. Dostupná z URL: http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html (cit. 5. 5. 2013) UniProt – proteinová databáze. Dostupná z URL: http://www.uniprot.org (cit. 22. 3. 2013) WHO – Světová zdravotnická organizace: Bacterial infections: Staphylococcal infection. Dostupné z URL: http://www.who.int/vaccine_research/diseases/soa_bacterial/en/index2.html (cit. 20. 2. 2013)
7. 1. 1 Zdroje obrázků Obr. 1: http://www.sicurezzaalimentare.it/sicurezza-alimentare/PublishingImages/Staphylococcusaureus.jpg Obr. 2: http://www.vscht.cz/obsah/fakulty/fpbt/ostatni/miniatlas/staph-au.htm Obr. 3: http://www.vscht.cz/obsah/fakulty/fpbt/ostatni/miniatlas/staph-au.htm Obr. 4: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/69/Beta_hemolysis_on_blood_agar.jpg
72
