MIKROBIOLOGIE Veškeré testy jsou prováděny s těmito bakteriálními kmeny: Gramnegativní tyčinkovitá bakterie ESCHERICHIA COLI – bakteriální kmen dle ATCC 9637 (CCM 2024). Grampozitivní kokovitá bakterie STAPHYLOCOCCUS AUREUS – bakteriální kmen dle ATCC 1260 (CCM 888). Oba bakteriální kmeny jsou referenční kultury mikroorganismů (dle ALE-G18, ČSNI), zakoupené z České sbírky mikroorganismů Masarykovy univerzity v Brně. Inkubace byla provedena na sterilním krevním agaru (Columbia agar) – zakoupeno od firmy BIO-RAD.
ÚKOL Č.1: Test je prováděn dle ČSN EN ISO 20645 – Plošné textilie – zjišťování antibakteriální aktivity – zkouška šíření agarovou destičkou.
MATERIÁL: 4 Petriho misky (obsahující krevní agar), bakteriální kultury naředěné na koncentraci 108/ml bakteriální suspenze (dostanete již připravené), vysterilizovaný agar, testovaný materiál (textilie).
POSTUP: při práci používejte vždy sterilní rukavice a roušku, dodržujte základní pravidla bezpečnosti práce v mikrobiologické laboratoři – viz školení bezpečnosti práce
1. Byl připraven výživný agar pro testované bakterie (viz norma). 2. Agar byl autoklávován při 121°C po dobu 15 minut (pH = 7,2, při 20°C). 3. Agar byl ochlazen na teplotu 45°C. 4. Do ochlazeného agaru o objemu 150 ml naočkujte 1ml bakteriální inokula (108/ml). 5. Takto připravený agar důkladně promíchejte a v objemu cca 5 ml nalijte do Petriho misek na krevní agar (spodní vrstva). 6. Takto připravené agarové misky k testům použijte za 1 hodinu po nalití a utuhnutí agaru. 7. Do každé z misek položte vzorek tkaniny (2x2 cm). 8. Misky inkubujte v termostatu o teplotě 37°C po dobu 20 hodin. 1
9. Po vyjmutí z termostatu změřte a vyhodnoťte halo zóny (dle tabulky – viz norma), výsledky fotograficky zdokumentujte. Výsledky testů jsou dle výše uvedené normy hodnoceny následovně:
Inhibiční zóna (mm): A. >1 mm až inhibiční zóna do 1 mm – DOBRÝ ANTIBAKTERIÁLNÍ EFEKT B. 0 mm – LIMIT ANTIBAKTERIÁLNÍ ÚČINNOSTI (bez inhibiční zóny, pouze omezené kolonie, růst téměř zcela potlačen), neboť stejně dobře 0 růst uvádí hranice účinnosti C. 0 mm – NEDOSTATEČNÝ EFEKT
Příklad výsledku s velmi dobrým inhibičním efektem
2
ÚKOL Č.2: K testování je používána metoda AATCC Method 147 – An American Standard 1993
POSTUP TESTOVÁNÍ:
1. Na Petriho misku s krevním agarem (Columbia agar) naneste pět pruhů bakteriálního inokula ( E. coli a Staphylococcus aureus) o koncentraci 105v 1 ml bakteriálního inokula. 2. Testované vzorky (tkaniny) o rozměru 50x25 mm umístěte napříč těchto pruhů tak, aby byl zajištěn kontakt s povrchem agaru 3. Vzorky umístěte do termostatu a inkubujte 24 hodin při teplotě 37 °C. 4. Pro výpočet průměrné šířky zóny tlumení růstu bakterií podél testovaného vzorku z jedné strany použijte následující vzorec: W = (T – D) /2 5. Výsledky vyfotografujte a vyhodnoťte dle normy. Legenda: W – šířka čisté zóny tlumení růstu bakterií v mm T – celkový rozměr testovaného vzorku a čisté zóny tlumení růstu bakterií v mm D – rozměr testovaného vzorku v mm
Příklad výsledku s velkou halozónou – velice dobrý antibakteriální efekt.
3
ÚKOL Č.3: K testování je používána metoda AATCC Method 100 – An American Standard 1993
POSTUP TESTOVÁNÍ: 1. Vzorky (tkaniny) o rozměrech 18x18 mm sterilizujte ve sterilizátoru 20 minut při teplotě 90 °C. 2. Vysterilizované vzorky umístěte do sterilních kontejnerů a zaočkujte bakteriálním inokulem v koncentraci 105/ml v objemu 0,1 ml bakteriálního inokula. Kontejnery umístěte do termostatu a kultivujte při teplotě 36,5 °C po dobu 24 hodin. 3. Po 24 hodinách kultivace do kontejnerů přidejte 10 ml fyziologického roztoku, čímž se upraví ředění bakterií na 103/ml. 4. Kontejnery protřepejte (vortexujte) po dobu 5 minut. 5. Z každého kontejneru dále odeberte 1 ml bakteriologického média, které vyočkujte na Petriho misku s krevním agarem. 6. Misky umístěte do termostatu a inkubujte po dobu 24 hodin při teplotě 36,5 °C. 7. Výsledky vyfotografujte a zhodnoťte dle normy – určete % inhibice dle počtu nově obnovených bakteriálních kolonií.
Příklad – nově obnovené bakteriální kolonie po 24 hodinové inkubaci.
4
HISTOLOGIE Příprava bločků pro histologické řezy: Postup přípravy bločků (odebrání tkáně, fixování a zalití tkáně do parafínu) bude tématem teoretické přednášky.
Příprava řezů Postup přípravy řezů na rotačním mikrotomu včetně bezpečnosti práce bude vysvětlen a demonstrován vyučujícím.
ÚKOL: Upevněte přidělený parafinový bloček s živočišnou tkání do mikrotomu a proveďte několik řezů (maximální tloušťka řezů by neměla přesáhnout 10 mikrometrů) Vyberte nejtenčí řez a preparační jehlou ho přeneste do kapky vody na podložním skle (podložní sklo musí být předem vyčištěné a potřené adhezivním materiálem: nejlépe se hodí směs vaječného bílku s destilovanou vodou v poměru 1:1 – poté zamíchat a přefiltrovat). Podložní sklo přeneste na chladící desku, která je vytemperovaná na teplotu 45 C. Pomocí preparační jehly řez opatrně natáhněte a parafín vlivem teploty nechte rozvinout a řez napnout. Sklo sejměte a zbylou vodu opatrně slijte. Preparát nechte usušit při laboratorní teplotě.
Odparafínování řezů
Je připravena tzv. odparafínovací řada. Jedná se o řadu kyvet. V každá kyvetě preparát ponechejte 5 minut. Principem tohoto kroku je odstranění parafínu a příprava řezů k barvení. Protože jsou barvící média rozpuštěná ve vodě, je nutné převádět připravené řezy systémem látky nepolární k polární.
5
ODPARAFÍNOVACÍ ŘADA:
Xylen I. – xylen II. – xylen III. – ethanol 96% - ethanol 96% - ethanol 70% destilovaná voda
Barvení řezů
Barvíme nejprve v 1.hematoxylinu – 3 – 10 minut, opláchnout – diferencovat v 2.okyseleném ethanolu (na 50 ml ethanolu 2-3 kapky konc.HCl) – diferenciace se projeví únikem namodralé barvy, oddiferencovaný preparát ponoříme do roztoku (3. voda z vodovodu 50 ml + 2-3 kapky 4% roztoku NaOH) Cytoplasma buněk je prakticky bezbarvá, jsou pouze intenzivně zbarvené chromatinové struktury. Preparát nakonec vložíme na 3 – 5 minut do roztoku 4. eosinu (0,5% vodný roztok), opláchneme vodou a odvodňujeme.
Odvodnění řezů
Odvodňovací řada slouží k převedení řezu od polárního rozpouštědla k nepolárnímu, aby mohlo dojít k vytvoření prostředí pro uzavírací médium a k tvorbě trvalého preparátu.
ODVODŇOVACÍ ŘADA:
Etanol 80% (1-3 minuty) – etanol 96% (1 – 3 minuty) – etanol 100% (5 minut) – xylen I. (5 minut) – xylen II. (5 minut)
Uzavření řezů do média
Na vyčištěné krycí sklo kápneme kapku uzavíratelného média (například kanadského balzámu, který má vynikající lom světla), přikryjeme jím obarvený řez a necháme zaschnout. Délka zasychání je závislá na druhu uzavíratelného média. U kanadského balzámu se jedná o 5-10 dnů, u syntetických médií je doba zasychání kratší.
6
ÚKOLY:
Na dalším cvičení zhotovený preparát prohlédněte pod mikroskopem a porovnejte se standardním (ukázkovým) preparátem, který Vám rozdá vyučující. V preparátu se zaměřte na studium buněčných struktur a způsob obarvení preparátu.
7
