UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOLIK BIJI PINANG (Areca catechu L.) TERHADAP Staphylococcus aureus ATCC® 25923 DAN Pseudomonas aeruginosa ATCC® 2785 ANTIBACTERIAL ACTIVITY TEST OF ARECA SEED ( Areca catechu L.) ETHANOLIC EXTRACT AGAINST Staphylococcus aureus ATCC® 25923 AND Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853 Nony Puspawati Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Setia Budi Jl. Let.Jen. Sutoyo, Mojosongo, Surakarta 57127 ABSTRAK Biji pinang (Areca catechu L.) merupakan salah satu alternatif baru yang digunakan masyarakat sebagai obat tradisional, biasanya untuk mengobati kudisan, bidul dan eksema. Penelitian ini bertujuan, untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak etanolik biji pinang terhadap Staphylococcus aureus ATCC® 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853, dan untuk mengetahui apakah ada perbedaan aktivitas antibakteri ekstrak etanolik biji pinang terhadap Staphylococcus aureus ATCC ® 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853. Ekstrak biji pinang (Areca catechu L.) diperoleh dari ekstraksi secara maserasi dengan menggunakan pelarut etanol 70%. Metode yang digunakan adalah metode dilusi (pengenceran tabung). Untuk melihat Konsentrasi Bunuh Minimum setiap tabung diinokulasikan pada media selektif, Vogel Jhonson Agar untuk Staphylococcus aureus dan Pseudomonas Selektif Agar untuk Pseudomonas aeruginosa. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini adalah ekstrak etanolik dari biji pinang (Areca catechu L.) mempunyai aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus ATCC ® 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853. Konsentrasi Bunuh Minimum untuk Staphylococcus aureus ATCC® 25923 adalah 1,57% dan untuk Pseudomonas aeruginosa ATCC ® 27853 adalah 25%. Hasil uji statistik menunjukkan bahwa ekstrak etanolik biji pinang mempunyai aktivitas antibakteri lebih efektif terhadap Staphylococcus aureus ATCC ® 25923 daripada Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853. Kata kunci: antibakteri, pinang, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ABSTRACT Areca seed (Areca catechu L.) is one of new alternatives used as traditional medicine, usually to treat scabies, ulcer and eczema. The experiment was aimed to know the antibacterial activity of areca seed ethanolic extract against Staphylococcus aureus ATCC ® 25923 and Pseudomonas aeruginosa ATCC ® 27853, and to find out whether there was a difference of antibacterial activity of areca seed ethanolic extract against Staphylococcus aureus ATCC® 25923 and Pseudomonas aeruginosa ATCC ® 27853. Areca seed (Areca catechu L.) extract was obtained by maceration extract using ethanol 70% as solvent. The method used was dilution method (tubes dilution). To know the Minimal Killing Concentration, each tube was inoculated in selective media, Vogel Jhonson Agar for Staphylococcus aureus and Pseudomonas Selective Agar for Pseudomonas aeruginosa. The result of the experiment was that areca seed (Areca catechu L.) ethanolic extract had antibacterial activity against Staphylococcus aureus ATCC ® 25923 and Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853. The Minimal Killing Concentration (MKC) of Staphylococcus aureus ATCC® 25923 was 1.57% and the MKC of Pseudomonas aeruginosa ATCC ® 27853 was 25%. The result of statistical test showed that areca seed (Areca catechu L.) ethanolic extract had antibacterial activity more effective against Staphylococcus aureus ATCC® 25923 than Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853. Key words: antibacterial, areca seed, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
PENDAHULUAN Indonesia kaya akan sumber bahan obat alam dan obat tradisional yang telah digunakan oleh sebagian besar rakyat Indonesia secara turun menurun mempunyai kelebihan antara lain tidak ada efek samping yang ditimbulkan seperti yang sering terjadi pada pengobatan kimiawi, bahan bakunya dapat ditanam di pekarangan sendiri dan dapat diramu sendiri (Thomas 2004). Obat tradisional ialah obat yang berasal dari bahan tumbuhtumbuhan, hewan, mineral, atau sediaan galeniknya atau campuran dari bahan-bahan tersebut yang belum mempunyai data klinis dan dipergunakan dalam usaha pengobatan berdasarkan pengalaman. Indonesia dikenal dengan keanekaragaman floranya yang berkhasiat dan berpotensi untuk dikembangkan sebagai tanaman obat. Salah satu dari tanaman tersebut adalah pinang (Areca catechu L.) yang sejak jaman dahulu digunakan sebagai obat untuk menguatkan gigi (digunakan bersama daun sirih dan kapur), biji pinang juga digunakan oleh masyarakat sebagai obat cacing, untuk obat luka, obat batuk, dan peluruh haid. Penyakit infeksi bakteri kulit cukup banyak ditemukan di Indonesia, yang merupakan negara tropis beriklim panas dan lembab, apalagi bila kebersihan juga kurang sempurna, sehingga dapat dipahami bahwa pertumbuhan bakteri sangat mudah terjadi dan dapat menimbulkan penyakit yang serius pada manusia. Luka bernanah timbul karena luka yang terinfeksi ringan oleh bakteri pembentuk nanah seperti Staphylococcus dan Pseudomonas. Infeksi untuk jenis Staphylococcus aureus yang terutama menimbulkan penyakit pada manusia, karena dapat menimbulkan sapurasi, membentuk abses, berbagai infeksi piogenik, dan bahkan septikemia yang fatal. Staphylococcus aureus yang patogen dapat menyebabkan hemolisis darah, mengkoagulasi plasma, serta menghasilkan berbagai enzim dan toksin ekstraseluler. Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif yang merupakan anggota flora normal kulit, selaput lendir, saluran pernafasan, dan saluran cerna. Staphylococcus aureus tumbuh dengan mudah di berbagai medium dan aktif secara metabolik, melakukan fermentasi karbohidrat dan menghasilkan pigmen yang bervariasi dari putih hingga kuning tua (Jawetz et al. 2007). Bakteri Pseudomonas aeruginosa merupakan kelompok patogen manusia yang besar, bersifat invasif dan toksigenik, menyebabkan infeksi pada pasien dengan daya tahan tubuh yang abnormal, dan merupakan patogen nosokomial yang penting. Pseudomonas aeruginosa menyebabkan infeksi pada luka dan luka bakar, menimbulkan pus hijau kebiruan, meningitis bila masuk bersama pungsi lumbal dan infeksi saluran kemih bila masuk bersama kateter dan instrumen lain atau dalam larutan untuk irigasi. Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri gram negatif, yang berbentuk batang, motil dan bersifat aerob (Jawetz et al. 2007). Secara tradisional, biji pinang digunakan dalam ramuan untuk mengobati sakit diare berdarah, kudisan, hidung berdarah, sakit gigi, bidul, eksema, sariawan, menguatkan gigi (digunakan bersama daun sirih dan kapur), juga sebagai penyembuh penyakit cacingan, obat sakit kulit, disentri, batu ginjal, menghindari penyakit gigi dan menambah vitalitas seksual (Anonim 2000). Bagian dari tanaman pinang (Areca catechu L.) yang dapat dimanfaatkan adalah biji karena mempunyai kandungan alkaloid, seperti arekolin, arekolidine, arekain, guvakolin, guvasine, dan isoguvasine, tanin terkondensasi, tanin terhidrolisis, flavon, senyawa fenolik, asam galat, getah, lignin, minyak menguap dan tidak menguap, serta garam. Pada tanaman pinang (Areca catechu L.) yang mengandung flavonoid yaitu terletak di biji (Syamsuhidayat & Hutapea 1991). Flavonoid mencakup banyak pigmen yang paling umum dan terdapat pada seluruh dunia tumbuhan, serta berkhasiat sebagai penghambat bakteri (Robinson 1995). Tanin selain digunakan untuk proses penyamakan, dapat juga digunakan untuk perlindungan karena mempunyai daya antiseptik. Tanin digunakan juga untuk pengobatan luka bakar dengan cara mempresipitasikan protein karena ada daya antibakterinya (Anonim 2008). Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah dilusi, karena dapat menentukan secara kuantitatif konsentrasi terkecil suatu obat yang dapat menghambat pertumbuhan
bakteri. Metode ini berdasarkan pengamatan kekeruhan larutan. Prinsipnya adalah penghambatan pertumbuhan kuman dalam pembenihan cair oleh suatu obat yang dicampurkan kedalam pembenihan. Pembenihan yang dipakai secara optimum dan tidak menetralkan obat yang digunakan (Bonang dan Koeswardono 1982). Penelitian ini bertujuan Pertama, untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik biji pinang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri. Kedua, untuk mengetahui KHM dan KBM dari ekstrak etanolik biji pinang (Areca catechu L.) yang dapat memberikan efek antibakteri. Ketiga, untuk mengetahui apakah ada perbedaan aktivitas antibakteri ekstrak etanolik biji pinang (Areca catechu L.) terhadap Staphylococcus aureus ATCC® 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853. METODE PENELITIAN Bahan Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji pinang (Areca catechu L.) yang dipetik secara acak dengan ciri-ciri buah berwarna hijau, yang diambil di daerah Solo, Jawa Tengah. Bakteri yang digunakan adalah bakteri Staphylococcus aureus ATCC® 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853 yang diperoleh dari laboratorium Mikrobiologi Universitas Setia Budi Surakarta. Medium yang digunakan dalam adalah medium Vogel Johnson Agar (VJA), Pseudomonas Selektif Agar (PSA), Brain Heart Infusion (BHI), Sulfida Indol Motilitas (SIM), Kligler Iron Agar (KIA), Lysin Iron Agar (LIA), dan citrate. Bahan kimia yang digunakan dalam adalah etanol 70%, aquadest steril, reagen ehrlich, reagen H2SO4 3%, HCL 2N, FeCL3 5%, FeCL3 b/v, H2O2 3%, serbuk Mg, alkohol, amil alkohol. Identifikasi tanaman Biji pinang berbentuk kerucut dengan serabut halus sebagai penutup, irisan biji seperti marmer, coklat tua dengan bintik-bintik keputihan. Buah pinang berwarna kekuningan bila masak dengan panjang 4-5 dan lebarnya 2,5-3 cm (Heyne 1987). Identifikasi tanaman dilakukan di laboratarium morfologi dan sistematik tumbuhan Fakultas Farmasi Universitas Setia Budi. Pembuatan serbuk simplisia Biji pinang dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran yang masih menempel, dikeringkan dalam alat pengering (oven) pada suhu 40 ºC selama 48 jam, setelah kering dibuat serbuk dan diayak dengan ayakan nomer 40, kemudian dilakukan perhitungan prosentase bobot kering terhadap bobot basah. Pembuatan ekstrak etanolik serbuk biji pinang Serbuk biji pinang ditimbang sebanyak 100 gram dimasukkan dalam botol coklat diisi dengan pelarut etanol 70% sebanyak 750 ml, kemudian direndam 5-6 hari. Ekstrak yang diperoleh kemudian dipekatkan dalam evaporator hingga volume 30 ml (Anief 1989). Identifikasi kandungan kimia hasil maserasi biji pinang Flavonoid. Ekstrak dilarutkan dalam 1-2 ml metanol panas 50% (v/v), kemudian ke dalam larutan ditambahkan serbuk magnesium dan 2 ml larutan alkohol : asam klorida (1:1) dan pelarut amil alkohol. Campuran larutan ini dikocok kuat-kuat, kemudian dibiarkan memisah. Reaksi positif ditandai dengan adanya warna merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol (Robinson 1995). Alkaloid. Ekstrak ditambah dengan sedikit larutan HCl 2%, kemudian panaskan lalu ditambahkan larutan Mayer terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning dan dengan Bouchardat terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam, maka ada kemungkinan terdapat alkaloid (Depkes 1987).
Tanin. Ekstrak ditambah tiga tetes FeCl3, warna akan berubah menjadi biru kehitaman atau hijau kehitaman (Depkes 1987). Pembuatan suspensi bakteri uji Bakteri uji dari biakan murni diambil beberapa mata ose dan ditanam pada media BHI (Brain Heart Infucion) cair. Kekeruhannya disesuaikan dengan kekeruhan modifikasi Brown II yang dianggap setara dengan 758 juta sel bakteri per ml. Kemudian diinkubasi pada suhu 370 C selama 24 jam. Identifikasi bakteri Staphylococcus aureus ATCC® 25923 Suspensi bakteri Staphylococcus aureus, diisolasikan pada media Vogel Johnson Agar dan ditambahkan kalium tellurit 1%, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Hasil pengujian ditunjukkan dengan warna koloni hitam dan medium berwarna kuning. Kemudian dilakukan pengujian biokimia, yaitu tes koagulase dan katalase. Identifikasi bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853 Suspensi bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853 diinokulasikan pada media Psedomonas Selective Agar dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ᴼC. Penampakan membentuk koloni bulat halus dengan pigmen kehijauan. Kemudian dilakukan pengujian biokimia, pada media KIA, SIM, LIA, Citrat. Pengujian efek antibakteri Metode ini dilakukan dengan memasukkan bahan uji ke dalam masing-masing tabung reaksi kecuali tabung nomor 10 sebagai kontrol positif. Masing-masing tabung reaksi tersebut mempunyai beberapa seri konsentrasi bahan uji yang berbeda dengan menambahkan bahan pengencer. Suspensi bakteri dalam medium BHI dimasukan ke dalam masing-masing tabung uji kecuali tabung 1 sebagai kontrol negatif. Seluruh tabung diinkubasi pada suhu kamar selama 24-28 jam, lalu diamati kekeruhannya. Menentukan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) yaitu batas terendah tabung media yang jernih atau yang memberikan hasil negatif (-). Kemudian menentukan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) dengan cara tabung media yang jernih diinokulasikan pada media selektif untuk masing-masing bakteri uji. Kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 24-48 jam. Mengamati ada tidaknya koloni yang tumbuh pada permukaan media lempeng. KBM ditunjukkan oleh konsentrasi terendah pada media Vogel Jhonson Agar (VJA) dan Pseudomonas Selektif Agar (PSA) yang tidak menunjukkan koloni bakteri yang tumbuh. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil penelitian mengenai kandungan kimia dalam ekstrak etanolik biji pinang menunjukkan bahwa ekstrak etanolik biji pinang mengandung alkaloid, tanin dan flavonoid. Kandungan bahan aktif tersebut yang memiliki aktivitas sebagai antibakteri adalah tanin karena tanin dapat mendenaturasi protein yang terdapat pada dinding sel sehingga bakteri dapat dihambat, sedangkan flavonoid memiliki aktivitas dalam menghambat enzim-enzim bakteri (Robinson 1995). Hasil identifikasi bakteri Staphylococcus aureus Identifikasi Staphylococcus aureus yang diinokulasikan pada medium Vogel Jhonson Agar yang sudah ditambah kalium tellurit 1% setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ᴼC berdasarkan pengamatan koloni yang dihasilkan berwarna hitam dan warna medium di sekitarnya menghasilkan warna kuning (Jawetz et al. 2007).
Koloni berwarna hitam
Media berwarna kuning
Gambar 1. Staphylococcus aureus dalam medium VJA. Hasil ini dikarenakan Staphylococcus aureus mereduksi tellurit menjadi metalik tellurit dan manitol diubah dalam suasana asam menjadi berwarna kuning (Jawetz et al. 2007) Uji katalase untuk Staphylococcus aureus memberikan hasil positif yang ditunjukkan dengan adanya gelembung-gelembung udara sebab Staphylococcus aureus mempunyai enzim katalase yang dapat menguraikan H2O2 3% menjadi air dan oksigen. Uji koagulase hasilnya positif ditunjukkan dengan terdapat gumpalan plasma yang tidak terlepas dan tetap melekat pada dinding tabung jika tabung tes dibalik, hal ini disebabkan karena adanya enzim koagulase yang dapat mengumpalkan plasma. Koagulase berikatan dengan protrombin, bersama-sama keduanya menjadi aktif secara enzimatik dan menginisiasi polimerisasi fibrin. Hasil identifikasi bakteri Pseudomonas aeruginosa. Bakteri uji Pseudomonas aeruginosa diinokulasikan pada medium Pseudomonas Selektif Agar, tumbuh dengan koloni bulat halus dengan membentuk pigmen yng berwarna kehijauan (Jawezt et al. 2007).
Gambar 2. Pseudomonas aeruginosa pada medium PSA Tabel 1. Hasil identifikasi bakteri uji Pseudomonas aeruginosa secara biokimia Media
Hasil
KIA SIM LIA Citrat
K/KS--+ K/KS+
Pustaka (Banirupa 1994) K/KS--+ K/KS+
Pengujian dengan media KIA , memberikan hasil K/KS-, hal ini menunjukkan bahwa bakteri tidak memfermentasi glukosa dan laktosa, S- artinya uji H2S negatif ditunjukkan tidak adanya pembentukan warna hitam pada media KIA. Pengujian dengan SIM memberikan hasil - - +, artinya uji H2S negatif ditandai dengan tidak adanya pembentukan warna hitam pada media SIM, pada penambahan 5 tetes reagen Erlich A dan B permukaan media tidak berwarna merah ini berarti uji indol negatif, uji motilitasnya positif, ditunjukan dengan adanya penyebaran pertumbuhan bakteri di media SIM. Pengujian dengan media LIA memberikan hasil K/KS-, hal ini menunjukan bahwa bakteri tidak mendeaminasi lisin, S- artinya uji H2S negatif ditunjukan dengan tidak adanya warna hitam pada media LIA. Pengujian pada media citrat memberikan hasil positif yang ditandai warna biru pada media citrat. Hal ini menunjukkan bahwa Pseudomonas aeruginosa menggunakan citrat sebagai sumber karbon (Banirupa 1994). Hasil pengujian aktivitas anti bakteri Tabel 2. Hasil inokulasi sediaan ekstrak etanolik biji pinang terhadap bakteri Staphylococcua aureus ATCC® 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853
No tabung 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Konsentrasi (%) Kontrol negatif 50 25 12,5 6,25 3,13 1,57 0,79 0,40 Kontrol positif
Inokulasi Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa I II III I II III + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Keterangan : (-) : Tidak ada pertumbuhan bakteri (+) : Ada pertumbuhan bakteri Tabung 1 : Kontrol negatif, berisi ekstrak etanolik biji pinang Tabung 10 : Kontrol positif, berisi suspensi bakteri
Gambar 3. Hasil uji dilusi ekstrak etanolik biji pinang dalam media VJA dan etanolik biji pinang dalam media PSA
Hasil uji ekstrak etanolik biji pinang (Areca catechu L.) terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC® 25923 dan bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853 dapat dilihat pada table. Dalam penelitian ini KHM tidak dapat diamati, karena larutan uji berwarna keruh, sehingga hanya dapat ditentukan KBM. Pada penelitian ini menunjukkan bahwa KBM untuk Staphylococcus aureus adalah 1,57% dan untuk Pseudomonas aeruginosa adalah 25%. Ekstrak etanolik biji pinang dapat menghambat dan membunuh bakteri karena di dalamnya terkandung senyawa kimia yang berfungsi sebagai antibakteri yaitu seperti alkaloid, flavon dan tanin. Tanin dapat mendenaturasi protein yang terdapat pada dinding sel sehingga bakteri dapat dihambat, dan flavonoid yang memiliki aktivitas dalam menghambat enzim-enzim bakteri. Mekanisme kerja antibakteri dalam menghambat dan membunuh bakteri yaitu dengan menghambat sintesis dinding sel, menganggu metabolit sel bakteri, mengganggu keutuhan membran sel bakteri, menghambat sintesis protein sel bakteri dan menghambat atau merusak asam nukleat sel bakteri. Konsentrasi bunuh minimum untuk bakteri Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa memberikan hasil yang berbeda. Hal ini disebabkan Staphylococcus aureus merupakan Gram positif yang hanya mengandung peptidoglikan, sedangkan bakteri Pseudomonas aeruginosa merupakan Gram negative dimana dinding selnya selain peptidoglikan yang tipis, juga mengandung lipopolisakarida, yang relative lebih sulit untuk dirusak oleh senyawa-senyawa kimia. KESIMPULAN Kesimpulan dalam penelitian ini adalah: Pertama, ekstrak etanolik biji pinang dapat menghambat dan membunuh bakteri Staphylococcus aureus ATCC® 25923 dan bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853. Kedua, Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) untuk bakteri Staphylococcus aureus adalah 1,57% dan untuk bakteri Pseudomonas aeruginosa adalah 25%. Ketiga, bakteri Staphylococcus aureus ATCC® 25923 lebih rentan terhadap senyawa-senyawa yang terdapat didalam biji pinang daripada Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853. DAFTAR PUSTAKA Anief, M., 1993, Ilmu Meracik Obat, Gajah Mada University Press, Yogyakarta, 168-169 Anonim. 2000, Pinang. http:/id.wikipedia.org/wiki/Pinang [29 April 2008]. Anonim . 2008, Ekstrak Etanolik Biji Pinang/Majalah Farmasi Indonesia [6 Mei 2008]. Bonang G, Koeswardono ES. 1982. Mikrobiologi Kedokteran Untuk Laboratorium & Klinik. Universitas Katolik Indonesia. Atma jaya. hlm 77, 190-191. [Departemen Kesehatan RI]. 1989. Materi Medika Indonesia. Jilid V. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. hlm 55-58, 538-539. Heyne K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid I. Jakarta: Yayasan Sarana Wana Jaya. hlm 460-465. Jawetz. E, Melnick. J.L, Adelberg. E.A. 2007. Medical Microbiology. 23 th Ed. Elferia NR, penerjemah; Jakarta. hal 170, 225-228, 266-270 Robinson T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung: ITB Press. hlm 71- 72, 157, 191 – 192, 208. Syamsuhidayat SS, Hutapea JR. 1991. Inventaris Tanaman Obat Indonesia. Volume I. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan. Jakarta. hlm 64-65.
