VII. UJI EKSPRESI GEN TcAP1 (APETALA1 KAKAO) PADA TANAMAN MODEL
Abstrak Pada berbagai spesies termasuk kakao, gen AP1 (APETALA1) diketahui sebagai gen penanda pembungaan yang mengendalikan terbentuknya jaringan sepal dan petal. Pengujian ekspresi fenotipe TcAP1 dilakukan dengan transgenesis konstruk konstitutif 35S-TcAP1 menggunakan teknik leaf disk eksplan daun tembakau dan mediasi Agrobacterium tumefaciens. Pengujian PCR spesifik TcAP1 menunjukkan bahwa teknik tersebut cukup efektif dalam mengintroduksikan konstruk 35S-TcAP1 ke dalam sel tanaman tembakau. RT-PCR dari daun planlet tembakau transgenik membuktikan bahwa level ekspresi TcAP1 tersebut bervariasi. Perbedaan tingkat ekspresi TcAP1 ini memberikan pengaruh yang sebanding terhadap perkembangan morfologis planlet tembakau in vitro. Kultur yang mengekspresikan TcAP1 pada level sedang mampu beregenerasi menjadi planlet sempurna dan membentuk bunga lebih cepat. Kata kunci : sepal, petal, transgenik, in vitro, Agrobacterium tumefaciens.
Pendahuluan APETALA1 adalah gen penyandi faktor transkripsi yang dengan atau tanpa gen pembungaan lainnya, berperan dalam transisi perkembangan vegetatif ke pembungaan (Pelaz et al. 2001; Pena et al. 2001; Putterill et al. 2004). Homolog gen APETALA1 telah berhasil diklon dari organ bunga kakao. Pendekatan bioinformatika yang dikombinasikan dengan beberapa teknik biologi molekuler terbukti dapat digunakan untuk mengisolasi gen pembungaan kakao full-length APETALA1. Pendekatan kloning gen relatif lebih sederhana daripada cara yang umumnya digunakan, misalnya melalui penapisan (screening) pustaka cDNA. Dengan primer heterologous yang dirancang berdasarkan sekuen homolog gen APETALA1 dari berbagai spesies yang dapat diakses dari bank gen (genebank) melalui situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov atau http://www.ebi.uk, cDNA homolog APETALA1 dapat disintesis dari RNA total bunga kakao dan diamplifikasi dengan teknik RT-PCR.
106 DNA amplikon hasil RT-PCR tersebut terbukti merupakan homolog APETALA1. Setelah diklon dengan vektor-T, sekuen keseluruhan dari DNA hasil PCR tersebut (sekitar 900 pb), dapat ditentukan dengan primer universal M13. Analisis BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) menunjukkan bahwa sekuen cDNA tersebut memiliki tingkat homologi yang tinggi dengan gen APETALA1 dari berbagai spesies. Untuk
lebih
memastikan
identitas
dan
fungsinya,
homolog
gen
APETALA1 dari kakao tersebut (TcAP1), perlu dilakukan pengujian ekspresi dan pengaruhnya terhadap perkembangan organ reproduktif tanaman. Pengujian semacam ini biasanya dilakukan menggunakan tanaman model Arabidopsis (Chaidamsari 2005). Namun karena menumbuhkan tanaman Arabidopsis di daerah atau lingkungan tropis sangat sulit, sebagai alternatif dalam pengujian tersebut maka digunakan eksplan tanaman tembakau in vitro. Dengan teknik transformasi standar leaf disk, konstruk ekspresi gen TcAP1 diintroduksikan ke dalam sel tanaman model tembakau melalui Agrobacterium tumefaciens. Kultur eksplan setelah inokulasi terdiri atas seleksi pada media padat yang mengandung dua antibiotika penyeleksi dan anti Agrobacterium, yang dilanjutkan regenerasi pada media yang sama dengan satu antibiotika penyeleksi atau tanpa antibiotika. Pengamatan terhadap perkembangan eksplan menunjukkan bahwa eksplan transgenik yang membawa konstruk TcAP1 secara morfologi berbeda dengan eksplan kontrol nontransgenik. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji ekspresi gen APETALA1 kakao (TcAP1) pada tanaman model, yaitu eksplan tembakau in vitro.
107 Bahan dan Metode
Bahan Tanaman Bahan tanaman yang digunakan adalah eksplan tembakau in vitro, yang ditumbuhkan di Ruang Kultur Jaringan, Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia di Bogor.
Modifikasi dan Transformasi Genetik Konstruk ekspresi gen TcAP1 pada tanaman dibuat dengan meligasikan promoter konstitutif 35S CaMV di ujung 5’ dan terminator Nos di ujung 3’ dari gen tersebut. DNA untuk ligasi ini sebelumnya dipotong dengan enzim endonuklease restriksi
yang
sesuai.
Untuk
keperluan
transformasi,
konstruk
tersebut
diposisikan di antara right border (RB) dan left border (LB) dari vektor transformasi biner. Recombinant vector transformasi yang diperoleh dimasukkan ke dalam sel Agrobacterium tumefaciens galur AGL0 kompeten dengan cara elektroforasi (Chaidamsari 2005). Untuk menyeleksi dan konfirmasi Agrobacterium yang positif membawa konstruk ekspresi TcAP1, dilakukan PCR koloni dengan primer spesifik TcAP1 terhadap beberapa koloni bakteri yang tumbuh pada media seleksi. Transformasi genetik TcAP1 ke dalam sel tanaman model dilakukan dengan teknik cakram daun (leaf disk) yang dimodifikasi dari Sain et al. (1994), sebagaimana juga diuraikan dalam Santoso et al. (2000). Agrobacterium yang membawa konstruk 35S-TcAP1 ditumbuhkan dalam media cair LB yang mengandung kanamisin 50 ppm selama 24-48 jam pada suhu 28 oC dengan pengocokan 150 rpm dalam keadaan gelap. Setelah diencerkan 100-1.000
108 kalinya dengan media yang sama, Agrobacterium tersebut dikulturkan kembali selama sekitar 3 jam. Potongan-potongan eksplan daun tembakau, ukuran cakram diameter 0.5-1.0 cm diinkubasi selama 15 menit dengan 1/10 volume kultur cair Agrobacterium tersebut. Ko-kultivasi pada media MS padat yang mengandung acetosyringon 100 ppm dilakukan selama 2 hari. Setelah itu dilakukan seleksi pada media MS padat yang mengandung antibiotika timentin 100 ppm atau cefotaxime 500 ppm dan 50-100 ppm kanamisin.
Kultur Jaringan Kultur jaringan untuk regenerasi planlet tembakau dilakukan metode standar melalui organogenesis. Potongan eksplan daun steril dikulturkan pada media MS padat yang mengandung BAP 0.5 ppm (Murashige dan Skoog 1962). Kultur diinkubasi pada suhu 26-28 oC dengan program penyinaran 16 jam per hari. Subkultur ke media segar dilakukan setiap 4-6 minggu sekali. Kultur eksplan transgenik dilakukan dengan metode dan kondisi yang sama dengan nontransgenik kecuali komposisi media. Untuk seleksi dan kultur eksplan transgenik, ke dalam media tumbuhnya ditambahkan antibiotika penyeleksi yang sesuai, yaitu kanamisin 50 ppm.
Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR dilakukan untuk mengetahui apakah planlet transgenik yang diregenerasikan dari eksplan yang telah diinokulasi dengan Agrobacterium pembawa konstruk 35S-TcAP1 masih tetap membawa gen target. Campuran pereaksi PCR mengadung DNA template sebanyak 1-10 ng, keempat dNTP masing-masing 0.2 µM, sepasang primer DNA spesifik TcAP1 masing-masing sebanyak 20-100 nM dan DNA Taq polymerase 1 - 2.5 Unit. Reaksi dilakukan
109 dengan volume 25-50 µl, dengan program PCR sebagai berikut : denaturation pada suhu 94 oC selama 30 detik, annealing pada suhu 50 oC selama 30 detik, extension pada suhu 72 oC selama 2 menit, dengan pengulangan sebanyak 35 siklus. Hasil PCR diperiksa menggunakan gel agarose dengan konsentrasi 0.7 - 1% yang telah diberi ethidium bromida (Sambrook et al. 1989).
Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) Analisis RT-PCR dilakukan dalam satu rangkaian percobaan yang terdiri atas preparasi mini RNA total, sintesis first strand cDNA dan PCR menggunakan utas tunggal cDNA sebagai template. RNA total dipreparasi dari daun tembakau menggunakan Kit RNeasy dari QIAGEN. Untuk proses ini digunakan 100 mg sampel daun tembakau dari kultur in vitro. Kualitas dan kuantitas RNA total yang diperoleh ditentukan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 230, 260 dan 280 nm, dan dengan elektroforesis gel agarose. Sintesis first strand cDNA dilakukan dengan Kit dari Invitrogen. Reaksi berlangsung dengan volume 50 µl pada suhu 42 oC selama 50 menit dengan RNA total sebanyak 1 µg. Tahapan lainnya dilakukan sebagaimana diuraikan dalam Instruction Manual yang diberikan bersama dengan kit. Sebanyak 1 ml hasil sintesis first strand cDNA digunakan sebagai template dalam reaksi PCR. Reaksi PCR dilakukan dengan kondisi dan cara sebagaimana diuraikan di atas. Primer yang digunakan dirancang dari sekuen TcAP1 dengan ukuran amplikon sekitar 400 pb.
110 Hasil dan Pembahasan Pengalaman sebelumnya membuktikan bahwa metode transformasi genetik tanaman sebagaimana diuraikan dalam Bahan dan Metode, memiliki efektivitas yang baik pada tanaman tembakau. Pada percobaan ini, sekali lagi transfer DNA ke dalam sel tanaman tembakau telah dapat dibuktikan. Hasil pengujian PCR spesifik TcAP1 menggunakan template DNA genomik dari plantlet tembakau transgenik, memberikan amplikon DNA dengan ukuran sesuai dengan jarak kedua primer spesifik yang digunakan. Adapun ketebalan amplikon tersebut bervariasi dan secara umum tidak setebal kontrol positifnya yaitu plasmid rekombinan yang membawa konstruk 35S-TcAP1 (Gambar 26).
1
2
3
4
5
6
7
8
Gambar 26 Pengujian PCR spesifik TcAP1 terhadap DNA genomik planlet tembakau. Lini 1 = DNA marker, lini 2 = DNA tembakau nontransgenik, lini 3 = DNA plasmid rekombinan, dan lini 4-8 = DNA tembakau yang membawa konstruk 35S-TcAP1.
Variasi intensitas amplikon tersebut kemungkinan terkait dengan kualitas ataupun kuantitas DNA template. Kemungkinan masih adanya kontaminan yang dapat menghambat reaksi PCR menyebabkan amplifikasi tidak berlangsung optimal. Kemungkinan lainnya adalah di dalam larutan DNA template, terutama yang berasal dari tanaman tembakau mungkin terdapat kontaminan RNA dalam jumlah yang bervariasi. Dengan demikian planlet tembakau transgenik yang mengekspresikan RNA TcAP1 memberikan amplikon yang lebih banyak daripada yang ekspresinya lemah. Apapun kemungkinannya, data ini jelas menunjukkan
111 bahwa dengan cara transformasi sebagaimana diuraikan dalam Bahan dan Metode, konstruk TcAP1 telah masuk ke dalam sel tanaman tembakau dan tetap stabil hingga jaringan daun tembakau beregenerasi menjadi planlet. Setelah konstruk 35S-TcAP1 terbukti masuk ke dalam genom tembakau, pemeriksaan selanjutnya adalah menguji apakah gen tersebut terekspresi di dalam sistem inang yang baru. Pengujian ini bisa dilakukan di tingkat molekuler, morfologis, atau kombinasinya. Ekspresi gen TcAP1 dalam sel tanaman tembakau diharapkan dapat menghasilkan protein faktor transkripsi yang aktif sehingga memberikan pengaruh positif terhadap perkembangan morfologis dari planlet yang mengekspresikannya. Pada Arabidopsis, aktivitas AP1 dalam mempengaruhi perkembangan tanaman terjadi melalui proses prenilisasi (Yalovsky et al. 2000). Hasil pengamatan perkembangan tembakau transgenik pada saat 2-3 bulan setelah transformasi disajikan pada Gambar 27. Dengan adanya transgen TcAP1, paling tidak terdapat dua fenotipe morfologis yang nyata beda penampakannya. Pertama adalah planlet transgenik yang memiliki daun terbelah (Gambar 27, panel B). Tipe yang kedua memiliki struktur seperti kuncup bunga yang bergerombol (Gambar 27, panel C). Kenampakan fenotipe yang bervariasi ini kemungkinan terkait dengan level ekspresi transgen TcAP1. Hal semacam ini terjadi pula pada ekspresi ektopik AGAMOUS pada tanaman model Arabidopsis thaliana (Kitahara et al. 2004; Chaidamsari et al. 2006). Pada planlet tembakau yang memiliki daun terbelah kemungkinan mengekspresikan TcAP1 pada level yang sedang, atau hanya sekedar memberikan dampak perubahan morfologis yang sedang saja. Sementara
pada
kultur
transgenik
yang
menghasilkan
struktur
seperti
gerombolan kuncup bunga, kemungkinan karena ekspresi yang tinggi dari TcAP1.
112
A
B
C
Gambar 27 Morfologi kultur planlet tembakau setelah transformasi genetik. Panel A, B, C masing-masing adalah planlet kontrol non-transgenik, transgenik dengan helai daun terbelah (perubahan ringan), dan struktur mirip kuncup bunga yang bergerombol (perubahan berat).
Sebagaimana disebutkan bahwa gen pembungaan AP1 menginduksi ekspresi gen LEAFY (Putterill et al. 2004). Over ekspresi TcAP1 menyebabkan ekspresi NtLFY terinduksi yang pada akhirnya memberikan perkembangan morfologis yang unik tersebut. Sementara itu, pecobaan ekspresi ektopik dari gen AtLFY mampu menginduksi terbentuknya struktur seperti bunga pada kultur eksplan in vitro (Wagner et al. 2004). Gen LEAFY yang merupakan pengendali transisi dari perkembangan vegetatif ke pembungaan juga menginduksi gen AP1 (Wagner et al. 1999). Terjadinya saling induksi inilah yang mungkin menjadi pemicu terbentuknya struktur mirip bunga meskipun dalam kultur in vitro.
113 Untuk membuktikan bahwa perubahan morfologis tersebut terkait dengan tingkat ekspresi transgen TcAP1, dilakukan pengujian RT-PCR menggunakan primer spesifik TcAP1 terhadap transkrip masing-masing planlet tersebut. Hasil pengujian ekspresi (Gambar 28) mengindikasikan bahwa terdapat hubungan yang positif antara tingkat perubahan morfologis planlet transgenik dengan tingkat ekspresi transgen TcAP1. Pada tembakau non-transgenik, tidak diperoleh pita DNA hasil RT-PCR. Sementara itu pada planlet transgenik dan kontrol positif, PCR menggunakan template rekombinan 35S-TcAP1, diperoleh hasil RT-PCR yang relatif kuat. Adanya diferensiasi intensitas pita DNA hasil PCR diduga kuat terkait dengan perbedaan level transkrip gen target, TcAP1. Dalam beberapa hal, RT-PCR termasuk cara yang mudah untuk menguji tingkat ekspresi gen yang telah diketahui sekuen nukleotidanya, misalnya gen TcAG (Chaidamsari et al. 2006) dan gen LEC2 Arabidopsis (Stone et al. 2001).
400 pb 349 pb 1 Gambar 28
2
3
4
5
6
7
8
Hasil RT-PCR spesifik TcAP1 terhadap RNA total daun planlet tembakau. Lini 1 = DNA marker, lini 2 = kontrol negatif tembakau non-transgenik, dan lini 8 = kontrol positif rekombinan 35S-TcAP1. Lini 3-7 = ekspresi TcAP1 pada tembakau transgenik individual yang menampakkan perubahan morfologis, dimana dari kiri ke kanan ekspresinya semakin kuat.
Berfungsinya TcAP1 di dalam sistem interaksi dan ekspresi pada tembakau, dapat dijelaskan secara empiris maupun melalui analisis kemiripan sekuen gen pembungaan antar spesies tanaman. Sebagai salah satu gen MADS-box, AP1 dari berbagai spesies tanaman memiliki tingkat kemiripan
114 sekuen yang tinggi, termasuk antara TcAP1 dengan NtAP1. Secara empiris, fungsionalitas ini dapat dikaitkan dengan ekspresi transgen di dalam inang yang baru. Ekspresi gen pembungaan AP1 dan LEAFY dari Arabidopsis pada tanaman jeruk yang secara kekerabatan cukup jauh, telah memberikan pengaruh terhadap perkembangan bunganya (Pena et al. 2001). Tanaman jeruk memiliki masa TBM (juvenile) yang panjang. Organ reproduktifnya tidak terbentuk hingga tanaman berumur 6-20 tahun, tergantung spesiesnya. Konstruksi konstitutif dari gen AtLFY atau AtAP1, yang merupakan penginduksi pembungaan pada Arabidopsis, telah ditransformasikan dan diekspresikan pada kecambah jeruk. Tanaman jeruk transgenik tersebut menghasilkan bunga fertile dan buah dini pada tahun pertama. Selanjutnya, ekspresi AP1 tersebut sama efisiennya dengan LFY dalam menginisiasi bunga dan tidak mengakibatkan abnormalitas pada perkembangannya. Tanaman jeruk transgenik tersebut juga tetap berbunga pada tahun-tahun berikutnya, dan respon pembungaannya dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Selain itu, bibit dari biji yang berasal dari tanaman transgenik memiliki masa TBM yang sangat pendek, membuktikan bahwa fenotipe yang terekspresi tersebut merupakan sifat yang stabil dan menurun. Hasil tersebut dapat membuka peluang baru dalam pemuliaan tanaman, terutama pada tanaman tahunan (Pena et al. 2001). Perkembangan in vitro selanjutnya dari planlet tembakau transgenik menegaskan bahwa TcAP1 mempercepat pembungaan pada planlet uji tersebut. Pada subkultur yang ke dua atau pada umur planlet sekitar 3.5 bulan, pada ujung planlet telah terbentuk kuncup bunga tembakau (Gambar 29). Pembungaan dini ini terjadi pada planlet yang daunnya nampak sedikit terbelah atau yang mengekspresikan TcAP1 pada level yang sedang. Sementara itu, pada kultur transgenik yang mengekspresikan TcAP1 pada level yang tinggi belum terjadi perubahan pertumbuhan lanjutan.
115
A
B
Gambar 29 Planlet tembakau in vitro pada umur 3.5 bulan. Panel A adalah tembakau kontrol non-transgenik, dan panel B adalah tembakau transgenik 35S-TcAP1.
Dalam keadaan dan cara subkultur yang baku, pembungaan tembakau in vitro hampir tidak pernah terjadi. Berdasarkan hasil tersebut dan laporan Pena et al. (2001), dapat dikatakan bahwa interaksi antara faktor transkripsi AP1 dengan faktor atau protein pembungaan terkait lainnya, memiliki spesifisitas yang relatif luas. Dimana AP1 dari spesies kecil seperti Arabidopsis ternyata dapat berfungsi menginduksi pembungaan pada spesies tanaman tahunan seperti jeruk, demikian pula sebaliknya AP1 dari spesies tanaman tahunan kakao dapat berfungsi pada spesies yang lebih kecil seperti tembakau.
Kesimpulan Transformasi eksplan daun tembakau dengan konstruk 35S-TcAP1 melalui Agrobacterium tumefaciens, memberikan tingkat ekspresi TcAP1 dan perubahan morfologis yang bervariasi. Pada planlet tembakau transgenik, ekspresi TcAP1 pada level yang sedang telah mampu menginduksi pembungaan secara in vitro.
