Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 1. Mikrofluidní bioaplikace

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy

Mikrofluidní bioaplikace

Strana 1


Mikrofluidní aplikace pro bioanalýzu • Transport, dávkování, promíchávání a adresování vzorků, pufrů a dalších elektrolytů. • Homogenní a heterogenní biologické interakce typu ligand-receptor. • Separace biologických molekul. • Detekce a kvantifikace biologických složek. • Zařízení integrující některé nebo všechny předešlé kroky.

Strana 2


Typická zařízení pro mikrofluidní bioaplikace • Kapilární/mikrokanálkové elektroforetické a isoelektrické fokusační systémy. • Dielektroforetické a elektroosmotické třídiče a koncentrátory. • Mikrokanálkové struktury pro řízený elektrokinetický transport vzorků. • Mikrofluidní čipy pro proteinovou analýzu s různým stupněm integrace. • Vysoce integrované mikrofluidní čipy pro analýzu DNA/RNA. • Mikrofluidní PCR systémy. • Kontinuálně pracující biosenzory. • Průtokové cytometry

Strana 3


Strana 4

PCR – polymerázová řetězová reakce • Metoda používaná ke zmnožení molekuly DNA ze vzorku • Ke zmnožení je dostačující jedna kopie DNA molekuly, z toho plyne citlivost metody na kontaminaci vzorku biologickým materiálem • Metoda je založena na řízeném střídání teplotních cyklů, kdy dochází ke zmnožování DNA rychlostí 2n, kde n je počet teplotních cyklů • Cykly se skládají z následujících kroků – denaturace dvojšroubovice DNA při 92-95°C – hybridizace primeru na specifické místo ssDNA 62°C – syntéza komplementárního řetězce termofilní DNA polymerázou 68-80°C • Řízení teplotního režimu je klíčovým problémem PCR metody • V mikrofluidice je kvalitní řízení teplotního režimu umožněno vysokým poměrem teplosměnné plochy vůči reakčnímu objemu • Aplikace: selektivní výběr DNA, zesílení a kvantifikace, diagnostika nemocí


Strana 5

Mikrofluidní čip pro dynamickou PCR V dynamickém uspořádání protéká roztok obsahující vzorek DNA, primery, báze a DNA polymerázu opakovaně různými teplotními zónami. Amplifikace molekul DNA (cca 30 cyklů) trvá obvykle kolem 30 minut. Transport reakční směsi je obvykle proveden elektroosmoticky.


Strana 6

Dynamická PCR v zařízení se segmentovaným tokem

V každé červené kapce probíhá amplifikace DNA. Jednotlivé kapky jsou odděleny olejovou fází. Kapky proudí v mikrokanálech v různých teplotních zónách – dochází k amplifikaci. Jedná se o kontinuální sériové uspořádání PCR. IMM Mainz.


Přednáška #12

Strana 7

Digital PCR

https://www.thermofisher.com/cz/en/home/life-science/pcr/digital-pcr.html

- Quantification (0, 1) - Real time PCR - (1) non-specific fluorescent dyes that intercalate with any double-stranded DNA, and (2) sequence-specific DNA probes consisting of oligonucleotides that are labelled with a fluorescent reporter which permits detection only after hybridization of the probe with its complementary sequence


Strana 8

Mikrofluidní čip pro stacionární PCR Ve stacionárním uspořádání je vzorek a ostatní komponenty umístěn v mikrofluidní komoře. Pomocí topných tělísek je měněna okolní teplota v požadovaných cyklech. Běžně je dosahováno rychlosti změn teploty okolo 30 °C s-1. Toto uspořádání je typické pro klasické PCR systémy, kde je ovšem dosahováno mnohem pomalejších změn teploty. Mikrofluidní čipy jsou náchylnější na kontaminaci DNA kvůli vysoké vzájemné afinitě používaných konstrukčních materiálů a biologických molekul.


Strana 9

Příklady komerčních PCR čipů Stacionární PCR

Dynamická PCR

Tradiční PCR

http://www.scientificdealers.com/product/PCR-Machine/26

http://www.directindustry.com/prod/eppendorf/product-22548-1479501.html


Strana 10

Elektroforéza • Separační metoda založená na různé pohyblivosti iontů ve vloženém elektrickém poli. • Obvykle jsou separovány velké molekuly biologického původu – fragmenty DNA, proteiny atd. • K separaci dochází, pokud molekuly nesou odlišný efektivní elektrický náboj nebo se liší jejich molekulové hmotnosti. Nárůst molekulové hmotnosti koreluje s poklesem difúzního koeficientu složky. • Separace je obvykle prováděna na stacionárním médiu (vrstvě gelu) nebo v mikrokapiláře/mikrokanálku s axiálně vloženým stejnosměrným elektrickým napětím • Molekuly s odlišnou pohyblivostí se rozdělí do separovaných zón. • Velikost a poloha zón vypovídají o kvantitativním a kvalitativním složení separované směsi. • K elektroforetickému systému je připojen detektor.


Strana 11

Princip kapilární elektroforézy v mikrofluidních systémech Odpadní rezervoár

W Rezervoár mobilní fáze - pufru

Odpadní rezervoár

Směr toku separovaných částic

B

Detektor Separační kanál Dávkování vzorku

S Rezervoár vzorku

Zdroj stejnosměrného elektrického napětí

W


Strana 12

Využití elektroforézy – elektroforetické kapilární pole Radiální matice separačních kanálků

96 kanálové mikrozařízení určené pro elektroforetickou separaci molekul DNA. Zařízení je opatřeno fluorescenčním detektorem. Separační kanál má průměr 200 mm. Kanálky dávkovacích zařízení mají šíři 110 mm a hloubku 50 mm. Délka separačních kanálů je 33 mm.

Dávkovací zařízení


Strana 13

Využití elektroforézy – automatizované 96-kapilárové zařízení pro separaci DNA

Zdroj vysokého napětí 96 jamkové destička se vzorky DNA

Separační kapiláry

Fluorescenční detektor


Přednáška #12

Strana 14

Lidský genom obsahuje cca 3 bilióny bází - přibližně 25000 genů - Human genome project: completed in 2003 (trval 13 let, stál okolo - $2,7 bilionů - náročný) - Nyní orientace na zlepšení forenzních technik a ke zlepšení lidských podmínek (predikce zdravotních rizik, personalized medicine, jak gen ovlivňuje kódovaný protein a jeho funkčnost)

NIH (National Institute of Health) = cena sekvenování jednoho genomu okolo 1000USD Místo, kde může mikrofluidika významě pomoci


Přednáška #12

Sekvenování DNA: Sangerova metoda

http://www.techcouncil.org/the-sanger-dna-sequencing-methods-1

Strana 15


Strana 16

384-kanálová kapilární zařízení pro sekvenování DNA Zařízení slouží k detekci různě velkých fragmentů DNA vzniklých syntézou komplementárního řetězce DNA při sekvenování. Každá báze je označena specifickou značkou (jednou ze čtyř), jejíž přítomnost je možno detekovat pomocí laserem indukované fluorescence. Z pořadí detekovaných zón a barvy lze určit sekvenci bazí.


Strana 17

Příklad komerčních sekvenovacích zařízení s integrovanou kapilární elektroforézou MegaBACE 4000 Capillary Array (jedno pole obsahuje 64 kapilár). Přístroj lze dále rozšířit.


Strana 18

Využití elektroforézy – příprava koncentrovaného analytu Polopropustná vrstva

DF

Zvýšení koncentrace vzorku

Schéma koncentrátoru

Přivedení vzorku

DF

Odvedení koncentrátu na separaci


Přednáška #12

Strana 19

Next generation sequencing technology Prepare Genomic DNA Sample

Complete amplification

Determine first base

Attach DNA to the surface

Image first base

Bridge amplication

Fragments become double stranded

Determine second base

Denature the doublestranded molecules

Image second base

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Sequencing over multiple chemistries

Align data

Přednáška #12

Strana 20


Strana 21

Isoelektrická fokusace Separační metoda využívající odlišnosti hodnoty isoelektrického bodu různých biomolekul. Isoelektrický bod odpovídá hodnotě pH, kdy daná molekula nese celkově nulový elektrický náboj. Pokud je hodnota pH nižší, biomolekula získává celkově kladný elektrický náboj. Pro hodnoty pH vyšší je náboj biomolekuly celkově záporný. Fokusační metoda je založena na faktu, že biologická molekula migruje v elektrickém poli pouze tehdy, pokud je její celkový elektrický náboj nenulový. Jestliže je molekula transportována do oblasti, kde hodnota pH je rovna isoelektrickému bodu, její migrace se zastaví. V tomto místě může být poté detekována. Obvykle je používáno sériové uspořádání (viz dále). Mikrofluidní systémy umožňují také paralelní uspořádání.


Strana 22

Isoelektrická fokusace Klasické sériové uspořádání s imobilizovaným gradientem pH

V klasickém uspořádání je vytvořen sendvič skládající se z gelových komůrek oddělených membránami. V každé komůrce je pomocí pufru nastavena určitá hodnota pH. Komůrky jsou řazeny v sérii tak, aby hodnota pH monotónně klesala nebo rostla. Na systém je vloženo elektrické pole a do některé komory je vložen vzorek obsahující biologické molekuly. Ty se poté migrují do komor, kde je hodnota pH blízká jejich isoelektrickému bodu.


Strana 23

Isoelektrická fokusace

Paralelní uspořádání komor s různou hodnotou pH

V paralelním uspořádání jsou komůrky s rozdílně nastavenými hodnotami pH odděleny nepropustnou přepážkou. V mikrofluidice je možno vytvořit velké pole komůrek s velmi malým charakteristickým rozměrem. Kolmo k tomuto komůrkovému poli je vložen gradient elektrického potenciálu a vzorek obsahující biologické molekuly je umístěn nad a/nebo pod komorami. Biomolekuly jsou poté separovány podle svého isoelektrického bodu v odpovídajících komůrkách. Uvedené řešení výrazně urychluje fokusaci vzhledem ke krátkým transportním vzdálenostem v laterálním směru. Je možno také využít automatických detektorů.


Přednáška #12

Strana 24

SDS-PAGE

Western blot

Nterminus antibody T

Sch

250 150 100 75 50 25 10

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 1. Mikrofluidní bioaplikace

Recommend Documents