Verkennend onderzoek naar de diversiteit en temporele stabiliteit van fecale microbiota bij cheeta s in gevangenschap

(Simpson et al, 2002)

Verkennend onderzoek naar de diversiteit en temporele stabiliteit van fecale microbiota bij cheeta’s in gevangenschap

Annelies TOURNY

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de Biochemie en de Biotechnologie Major in de Microbiële Biotechnologie Academiejaar 2012-2013

Promotor: prof. dr. Geert Huys Wetenschappelijk begeleider: Anne Becker Vakgroep Biochemie en Microbiologie Laboratorium voor Microbiologie & BCCM/LMG Bacteriën Collectie

Verkennend onderzoek naar de diversiteit en temporele stabiliteit van fecale microbiota bij cheeta’s in gevangenschap

Annelies TOURNY

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de Biochemie en de Biotechnologie Major in de Microbiële Biotechnologie Academiejaar 2012-2013

Promotor: prof. dr. Geert Huys Wetenschappelijk begeleider: Anne Becker Vakgroep Biochemie en Microbiologie Laboratorium voor Microbiologie & BCCM/LMG Bacteriën Collectie

DANKWOORD Het schrijven van deze masterproef zou niet mogelijk zijn geweest zonder de steun en hulp van enkele mensen. In dit dankwoord zou ik dan ook graag een aantal personen willen bedanken voor hun hulp, inzicht en motiverende woorden. Om te beginnen zou ik graag mijn promotor prof. dr Geert Huys willen bedanken voor het aanbieden van deze interessante topic als thesisonderwerp. Zijn uitvoerige feedback op onze uitgevoerde experimenten hebben zeker geholpen om deze masterproef tot een goed einde te brengen. Daarnaast zou ik ook graag mijn begeleidster, Anne Becker, willen bedanken. Ondanks haar eigen drukke agenda stond ze steeds klaar om mij te helpen wanneer nodig. Haar opbouwende kritiek en feedback hebben echt geholpen bij het schrijven van deze masterproef. Het grote enthousiasme dat Anne toont voor haar onderzoek, heeft ook bij mij de zin om te doctoreren verder weten aan te wakkeren. Dus hierbij: een dikke merci Anne en ik wens je nog veel succes bij het verdere verloop van je doctoraat! Ook zou ik via deze weg graag alle andere mensen van het Laboratorium voor Microbiologie en van de BCCM/LMG collectie willen bedanken. Zij zorgden de afgelopen maanden voor de gezellige en toffe sfeer op het labo en staken een helpende hand uit wanneer ik één nodig had. Om af te sluiten zou ik ook mijn familie en vrienden willen bedanken. Mama en papa, via deze weg wil ik jullie extra bedanken voor de kans die jullie mij vijf jaar geleden gegeven hebben om aan deze opleiding te beginnen. Zonder jullie onvoorwaardelijke steun en liefde zou het mij nooit gelukt zijn dit tot een goed eind te brengen. Ook mijn zusje verdient een bedankje voor het zorgen van heel wat leuke momenten tussen het schrijven door. Sofie en Lindsay, bedankt voor het creëren van vele onvergetelijke momenten de afgelopen vijf jaar. Ten laatste wil ik ook nog mijn vriend, Jurrich, bedanken voor zijn aanmoedigende woorden en steun de afgelopen maanden. Bedankt! Annelies

i

INHOUDSTAFEL Dankwoord .................................................................................................................................. i Inhoudstafel ............................................................................................................................... ii Lijst met afkortingen .................................................................................................................. v Samenvatting.............................................................................................................................vii Summary ..................................................................................................................................viii Deel 1: Inleiding .......................................................................................................................... 1 1.1.

De cheeta (Acinonyx jubatus) ...................................................................................... 1

1.1.1.

De katachtigen...................................................................................................... 1

1.1.2.

Bedreiging van de cheeta ..................................................................................... 1

1.1.3.

Het belang van conservatie .................................................................................. 2

1.2.

Intestinale microbiota ................................................................................................. 2

1.2.1.

Intestinaal ecosysteem van de mens ................................................................... 2

1.2.2.

De rol van microbiota in ziekte en gezondheid.................................................... 7

1.2.3.

Voedingsvezels ..................................................................................................... 9

1.2.4.

Intestinale microbiota bij katachtigen ............................................................... 10

1.3.

Technieken voor het bestuderen van microbiële diversiteit en functionaliteit ....... 12

1.3.1.

Cultuurafhankelijke methoden .......................................................................... 12

1.3.2.

Cultuuronafhankelijke methoden ...................................................................... 12

1.3.3.

Sequentie-gebaseerde technieken .................................................................... 13

1.3.4.

Fingerprint technieken ....................................................................................... 14

1.3.5.

Kwantitatieve methoden.................................................................................... 16

1.3.6.

Functioneel onderzoek ....................................................................................... 17

Deel 2: Doelstelling................................................................................................................... 19 2.1. Doctoraat Anne Becker ................................................................................................. 19 2.2. Doelstelling .................................................................................................................... 19 Deel 3: Resultaten .................................................................................................................... 21 3.1. Aanmaak clone libraries ................................................................................................ 21 3.2. DGGE fingerprinting ...................................................................................................... 21 3.2.1. V3-16S rRNA amplificatie ....................................................................................... 21 3.2.2. Link tussen fingerprints van fecale stalen en gemeenschappelijke OTU’s ............ 22 3.2.3. Link tussen fingerprints van fecale stalen en niet gemeenschappelijlke OTU’s .... 25 3.2.4. Identificatie van de banden ................................................................................... 25

ii

3.2.5. Tijdsreeks van cheeta’s uit Planckendael ............................................................... 28 3.2.6. OTU’s gelinkt aan de tijdsreeks .............................................................................. 30 3.2.7. Tijdsreeks van cheeta’s uit Zooparc Overloon ....................................................... 33 3.2.8. DGGE Troubleshooting ........................................................................................... 34 3.3. Bepalen van de Firmicutes/Bacteroidetes ratio ........................................................... 36 3.3.1. Spiking experiment ................................................................................................. 36 3.4. Absolute Kwantificatie van Clostridium cluster XI via RT-PCR ...................................... 37 3.4.1. Opstellen van de standaardcurve .......................................................................... 38 3.4.2. Kwantificatie van Clostridium cluster XI ................................................................. 40 3.4.3. Optimalisatie van de RT-PCR procedure ................................................................ 41 3.5. Absolute kwantificatie van Bifidobacterium spp. via RT-PCR ....................................... 41 Deel 4: Discussie ....................................................................................................................... 43 4.1. Diversiteit binnen het intestinale ecosysteem.............................................................. 43 4.2. Temporele stabiliteit ..................................................................................................... 46 4.3. Onderzoek naar core microbiota .................................................................................. 47 4.4. Conclusie ....................................................................................................................... 48 Deel 5: Materiaal en Methoden ............................................................................................... 49 5.1. Collectie van fecale stalen ............................................................................................. 49 5.2. Homogenisatie en Totale DNA Extractie ....................................................................... 49 5.3. V3-16S rRNA PCR amplificatie ....................................................................................... 50 5.4. DGGE analyse ................................................................................................................ 51 5.5. Spiking experiment ........................................................................................................ 52 5.6. Absolute kwantificatie Clostridium cluster XI via RT-PCR ............................................. 54 5.7. Absoltue kwantificatie Bifidobacterium spp. via RT-PCR .............................................. 55 5.8. Sequentie analyse ......................................................................................................... 56 Referenties ............................................................................................................................... 57 Addendum ................................................................................................................................ 66 Bijlage 1: Lijst met gebruikte fecale stalen in deze studie ................................................... 66 Bijlage 2: Tabel gemeenschappelijke & niet-gemeenschappelijke OTU’s ........................... 68 Bijlage 3: Samenstelling gebruikte media ............................................................................ 70 Bijlage 4: Originele DGGE fingerprint van de tijdsreeks voor B1 en B2 ............................... 71 Bijlage 5: Spiking experiment (zoom) ................................................................................... 72 Bijlage 6: Totale DNA extractie uit fecale stalen .................................................................. 73

iii

Bijlage 7: PCR van 16S rRNA genen voor DGGE analyse ...................................................... 76 Bijlage 8: Denaturerende Gradiënt Gelelektroforese (DGGE) ............................................. 78 Bijlage 9 : Band extractie en Sequentie PCR ........................................................................ 83 Bijlage 10: QIAEX II®Gel Extraction Kit ................................................................................. 87 Bijlage 11: Qubit® dsDNA BR Assay Kits ............................................................................... 88 Bijlage 12: Protocol voor absolute kwantificatie via RT-PCR ............................................... 89

iv

LIJST MET AFKORTINGEN API test

Analytical profile index test

AMP

Antimicrobiële peptiden

APS

Ammonium persulfaat

ARISA

Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis

B.

Bacteroides

BKL

Bandklasse

BSA

Bovine Serum Albumin

Bp

Baseparen

EtBr

EthidiumBromide

C.

Clostridium

CFU

Colony Forming Units

CL

Clone libraries

DNA

Desoxynucleïnezuur

DGGE

Denaturerende gradiënt gelelektroforese

GF

Germ Free

GI-stelsel

Gastro-Intestinaal stelsel

FCS

Fecale conditie score

FISH

Fluorescente in situ hybridisatie

FOS

Fructo-oligosacchariden

IUCN

International Union for Conservation of Nature

LPS

Lipopolysaccharide

OTU

Operationele taxonomische unit

MP

Meetpunt

PCR

Polymerase chain reaction

RCM

Reinforced Clostridial Medium

RDP

Ribosomal database project

RIS

Ribosomale intergenische spacer

RNA

Ribonucleïnezuur

rpm

Rotaties per minuut

rRNA

ribosomal RNA

RT-PCR

Real-Time PCR

SIP

Stable Isotope Probing

v

TE-buffer

Tris-EDTA buffer

TEMED

N, N, N’, N’-Tetramethylethyleendiamine

TGGE

Temperatuur gradient gelelektroforese

T-RFLP

Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism

TTGE

Temporele temperatuur gradient gelelektroforse

UPGMA

Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean

V3-regio

Variabele regio 3 van het 16S rRNA gen

vi

SAMENVATTING Anno 2013 staat de cheeta (Acinonyx jubatus) als ‘kwetsbaar’ vermeld op de Rode Lijst der bedreigde diersoorten. Hierdoor worden populaties in gevangenschap belangrijk voor de conservatie van de soort. Verschillende factoren inherent verbonden aan een leven in gevangenschap kunnen de gezondheid van een wild dier beïnvloeden. Eén van die factoren is de voeding. Het dieet heeft een invloed op de intestinale microbiota die op zich een belangrijke rol speelt in de (intestinale) gezondheid. Een gebrek aan kennis over de diversiteit en stabiliteit van het intestinale ecosysteem van cheeta’s in gevangenschap verhindert momenteel een gericht nutritioneel sturen van de intestinale gezondheid. Gedurende deze masterproef werd geprobeerd om een initiële kennis te verwerven over de diversiteit en dynamiek van de fecale microbiota van twee cheeta’s in gevangenschap. Om dit doel te bereiken werden clone libraries gelinkt aan DGGE fingerprints van fecale stalen en werden een aantal groepen gekwantificeerd via real-time PCR. Uit de resultaten blijkt dat de fecale microbiota van cheeta’s in gevangenschap gedomineerd wordt door Firmicutes, gevolgd door Actinobacteria, Proteobacteria en Fusobacteria. Binnen het fylum Firmicutes zijn Clostridium cluster I, XI en XIVa het meest vertegenwoordigd. Uit DGGE analyse blijkt dat deze Clostridium clusters stabiel blijven over een tijdspanne van twee jaar terwijl subdominante groepen zoals o.a. lactobacillen en enterococcen een temporele variatie vertonen. In de analyse van de clone libraries en DGGE fingerprints werden geen leden van het fylum Bacteroidetes en het genus Bifidobacterium gedetecteerd. Om deze resultaten te bevestigen werd een real-time PCR uitgevoerd met groep-specifieke primers, waaruit blijkt dat Bacteroidetes slechts in zeer lage aantallen aanwezig zijn en het genus Bifidobacterium inderdaad afwezig lijkt te zijn of thans onder de detectielimiet van de techniek valt. Ten laatste werden fecale stalen afkomstig van drie cheeta’s uit Nederland aan de studie toegevoegd om een eerste kijk te hebben op de mogelijke ‘core microbiota’. Hieruit bleek dat de Clostridium clusters XI en XIVa in alle stalen van alle vijf de cheeta’s voorkwamen. Om echter een beter beeld te krijgen over de core microbiota is het belangrijk om meer stalen van verschillende cheeta’s in de studie op te nemen. Uit de studie kan besloten worden dat de predominante groepen (Clostridium clusters I, XI en XIVa) stabiel blijven doorheen de tijd. Subdominante groepen zoals lactobacillen en enterococcen vertonen echter temporele variatie. Het fylum Bacteroidetes is slechts in een lage hoeveelheid aanwezig en Bifidobacterium spp. blijken volledig afwezig te zijn in de fecale microbiota van cheeta’s. Tenslotte lijkt het erop dat Clostridium clusters XI en XIVa behoren tot de core microbiota van cheeta’s in gevangenschap.

vii

SUMMARY Anno 2013 the cheetah (Acinonyx jubatus) is listed as vulnerable on the Red List of threatened species. Therefore, cheetah populations in captivity gain importance in the conservation of their kind. Various factors inherent to a life in captivity can influence the health of a wild animal. One of those factors is the feed management. The diet influences the intestinal microbiota which plays a key role in the (intestinal) health. A lack of knowledge about diversity and stability of the intestinal ecosystem of cheetahs in captivity currently prevents a focused nutritional control of the intestinal health. The goal of this thesis was to gain an initial insight into the diversity and dynamics of the fecal microbiota of two captive cheetahs. To reach this goal, clone libraries were linked to DGGE profiles of fecal samples and some bacterial groups were quantified using real-timePCR. From the results was concluded that the fecal microbiota of captive cheetahs is dominated by Firmicutes followed by a minority of Actinobacteria, Proteobacteria and Fusobacteria. Within the phylum Firmicutes, the Clostridium clusters I, XI and XIVa are the most abundant groups. DGGE analysis shows that the Clostridium clusters are relatively stable over a two year period and that subdominant groups such as Lactobacilli and Enterococci exhibit a temporal variation. Surprisingly, the phylum Bacteroidetes and the genus Bifidobacterium were not detected in the clone libraries and DGGE fingerprints. Additional real-time PCR analyses reveal only marginal to low levels of Bacteroidetes whereas Bifidobacterium remains under the detection limit. Fecal samples of three cheetahs from the Netherlands were included in the study to get an idea about the core microbiota of cheetahs. The Clostridium clusters XI en XIVa were found in the microbiota of all five cheetahs. Additional samples of different cheetahs are needed to support the first results about the fecal core microbiota of cheetahs in captivity. In conclusion, DGGE analysis shows that the predominant groups (Clostridium clusters) remain stable through time. However, subdominant groups such as Lactobacilli and Enterococci exhibit temporal variations. The phylum Bacteroidetes is only present in low amounts whereas Bifidobacterium spp. remain absent in the fecal microbiota of the captive cheetahs included in this study. Finally, it seems that Clostridium cluster XI and XIVa are part of the core microbiota of cheetahs in captivity.

viii

Inleiding DEEL 1: INLEIDING 1.1.

DE CHEETA (ACINONYX JUBATUS)

1.1.1. DE KATACHTIGEN De katachtigen behoren tot de familie Felidae die verder is opgedeeld in de subfamilies Pantherinae, die de ‘grote katten’ zoals de leeuwen, tijgers en luipaarden bevat, en de Felinae, waartoe onder andere de lynx, cheeta en huiskat behoren (Wilson & Reeder, 2005). Momenteel worden er binnen de katachtigen 18 genera en 36 species onderscheiden (Etnyre et al, 2011). De katachtigen komen overal ter wereld voor met uitzondering van Australië, Antarctica en de meeste eilanden. Sommige katachtigen, zoals de huiskat, zijn er geïntroduceerd door de mens (Macdonald et al, 2010). De katachtigen behoren tot de orde Carnivora, wat wil zeggen dat ze zowel morfologisch als metabolisch zijn aangepast aan de consumptie van vlees (Morris, 1994). Het zijn gespecialiseerde jagers die hun prooi vangen, doden en uiteindelijk opeten. Anno 2013 heeft elk genus binnen de katachtigen minstens één soort op de Rode Lijst van Bedreigde Diersoorten staan. Deze lijst is opgesteld door de International Union for Conservation of Nature (IUCN). Op deze lijst wordt ook de cheeta als kwetsbaar vermeld (Durant et al, 2008). 1.1.2. BEDREIGING VAN DE CHEETA De cheeta, ook gekend als het jachtluipaard, is het snelste landdier ter wereld (Fig. 1). Binnen het genus Acinonyx is de cheeta het enige overblijvende species. De habitat van vrijlevende cheeta’s beperkt zich momenteel tot enkele gebieden in Azië en Afrika, waarbij het grootste aantal in de savannes van Namibië worden waargenomen (Macdonald et al, 2010). Cheeta’s, en heel wat andere katachtigen, ondervinden in de natuur problemen wat hun aantal doorheen de Figuur 1: Acinonyx jubatus. fotograaf: Chris Jones; The Big Cats initiative by National Geographic. jaren sterk gereduceerd heeft. Een eerste probleem waarmee vrijlevende cheeta’s te maken krijgen is inter-specifieke competitie. Ze delen hun habitat, en ook hun prooi, met o.a. leeuwen en luipaarden die de cheeta frequent verjagen. Ook gebeurt het dat andere carnivoren welpen van cheeta’s aanvallen om zo toekomstige competitie te vermijden (Macdonald et al, 2010). Naast natuurlijke vijanden speelt ook de mens een belangrijke rol in de bedreiging van vrijlevende cheeta’s. Er wordt immers nog steeds jacht gemaakt op deze dieren, al dan niet door boeren die hun vee proberen te beschermen (Marker, 2002). Tevens komen ze steeds meer in contact met huisdieren die mogelijks drager zijn van virussen (Brown et al, 1993; Munson et al, 2004). De mens heeft ook een indirecte invloed op de densiteit van cheeta’s door jacht te maken op dezelfde prooi als deze

1

Inleiding van de cheeta. De grootste bedreiging is echter het verlies van hun natuurlijke habitat (bijvoorbeeld door conversie van habitat naar landbouwgrond) (Harrison & Bruna, 1999). Verlies aan habitat is onvermijdelijk gelinkt aan het verdwijnen van prooi, wat een bedreiging is voor alle katachtigen (Schneider, 2001). Ten slotte speelt bij de cheeta ook een genetische factor een rol in zijn bedreiging. Er wordt bij deze dieren namelijk een verlies aan heterozygositeit opgemerkt dat toe te wijzen is aan een ‘bottleneck’ 10000 jaar geleden (Menotti-Raymond & O'Brien, 1993; Nowell & Jackson, 1996). De lage genetische variëteit veroorzaakt een verlaagde reproductie (Wildt et al, 1983) en zorgt voor een hoge prevalentie van infectieziekten (Munson et al, 2005; O'Brien S et al, 1983). De problemen gelinkt aan deze lage heterozygositeit worden echter vooral opgemerkt bij dieren in gevangenschap (Merola, 2002). 1.1.3. HET BELANG VAN CONSERVATIE Door de jaren heen is de lijst aan bedreigde diersoorten alleen maar toegenomen. Conservatie van deze soorten, met bijzondere aandacht voor populaties in gevangenschap, is dan ook een belangrijk en levensnoodzakelijk concept om de biodiversiteit in stand te houden. Reproductiestoornissen en suboptimale gezondheid bij cheeta’s in gevangenschap werden reeds in verband gebracht met chronische stress (Terio et al, 2004). Stress zou bijdragen tot een zwakkere gezondheid en heeft een negatief effect op de voortplanting. Een tweede factor die eveneens een grote invloed heeft op de gezondheid, groei en reproductie van cheeta’s is de voeding (Bechert et al, 2002). Dit zowel rechtstreeks door het voorzien van nutriënten voor de gastheer als onrechtstreeks door het intestinale ecosysteem te beïnvloeden. Bij het houden van wilde dieren in gevangenschap is het belangrijk een optimale gezondheid na te streven. Dit kan enerzijds door hun omgeving, in de mate van het mogelijke, aan te passen aan hun natuurlijke habitat en op die manier stress te verminderen (Kazarov, 2008). Anderzijds trachten dierenverzorgers een gebalanceerde voeding aan de dieren te geven. Onderzoek naar de samenstelling en functionaliteit van de intestinale microbiota van cheeta’s kan leiden tot een gerichte nutritionele sturing, wat de gezondheid van het dier positief kan beïnvloeden. Gedurende deze masterproef zal de focus gelegd worden op het onderzoek naar de diversiteit van het intestinale ecosysteem van de cheeta.

1.2.

INTESTINALE MICROBIOTA

Onderzoek naar het intestinale ecosysteem is de laatste jaren enorm toegenomen. De interesse ligt vooral bij de humane intestinale microbiota. Het is dus niet verwonderlijk dat het merendeel van alle kennis over dit ecosysteem verworven is uit onderzoek op de mens. 1.2.1. INTESTINAAL ECOSYSTEEM VAN DE MENS Dieren leven in nauw contact samen met micro-organismen. Wanneer gekeken wordt naar het menselijk lichaam dan ziet men dat deze gekoloniseerd wordt door een groot aantal bacteriën, virussen en unicellulaire eukaryoten (bv. fungi) (Sekirov et al, 2010). Het aandeel van de intestinale micro-organismen die in mutualisme samenleven met hun gastheer wordt de intestinale microbiota genoemd. Er wordt gesproken van mutualisme omdat beide partijen door de interactie een voordeel verwerven (Neish, 2009). Onderzoek focusseert zich

2

Inleiding vooral op de diversiteit en functionaliteit van de aanwezige bacteriën. Er is minder geweten over de rol die andere micro-organismen, zoals protozoa en virussen, spelen in het lichaam. Er wordt geschat dat er ongeveer 1014 bacteriële cellen aanwezig zijn in het menselijk lichaam. Eén persoon bevat dus meer bacteriële cellen dan dat hij menselijke cellen bevat (Bäckhed et al, 2005). Distributie Micro-organismen worden teruggevonden op elke plaats in en op het lichaam dat blootgesteld is aan de omgeving zoals de huid, longen en genitaal stelsel (Chiller et al, 2001; Verstraelen, 2008). De plaats in het lichaam van de gastheer die echter het sterkst gekoloniseerd wordt, is het gastro-intestinaal stelsel (GI-stelsel). Kolonisatie van het GIstelsel begint reeds vanaf de geboorte door o.a. bacteriën afkomstig van de moeder (meer info zie sectie ontwikkeling). Later wordt het GI-stelsel voornamelijk blootgesteld aan bacteriën door het innemen van voedsel (Leser & Molbak, 2009). Het GI-stelsel is onderverdeeld in verschillende regio’s beginnend bij de mond en eindigend bij de anus. Deze regio’s omvatten de mondholte, de keel, de slokdarm, de maag, de dunne darm (duodenum, jejunum en ileum), de dikke darm (colon en cecum) en het rectum. De diversiteit en de concentratie van de aanwezige bacteriën kan sterk verschillen tussen de verschillende regio’s (Fig. 2A) (Frank et al, 2007; Hayashi et al, 2005). De belangrijkste functie van het GIstelsel is de vertering en absorptie van voedselcomponenten. Tijdens de vertering wordt voedsel afgebroken tot nutriënten die opgenomen kunnen worden door de gastheer (Zoetendal et al, 2004). De voornaamste substraten voor micro-organismen groeiend in het colon zijn de polysacchariden, oligosacchariden, eiwitten en peptiden die niet enzymatisch verteerd worden in de dunne darm. Ook producten geproduceerd door de gastheer zelf, zoals mucines en secreties van de pancreas, worden door de bacteriën als substraat gebruikt (Macfarlane et al, 1998). Door de aanwezigheid van de vele substraten, de lange retentietijd en de hogere pH (Leser & Molbak, 2009) heeft het colon het meest complexe en dynamische microbiële ecosysteem binnen zijn gastheer, waarbij het aantal bacteriële cellen 1011-1012 bedraagt (Hamer et al, 2012). Het voorkomen van bepaalde bacteriën varieert niet enkel tussen de verschillende regio’s. Binnen een regio hebben sommige bacteriën een voorkeur voor het intestinale lumen, terwijl andere de mucus laag prefereren (Fig. 2B). De mucus laag en het onderliggende epitheel worden niet gekoloniseerd door mogelijke pathogenen zoals Bacteroides spp. en Clostridium difficile. Deze bacteriën worden echter wel teruggevonden in het lumen (Swidsinski et al, 2005). Een verschillende manier van staalname is dus vereist om de microbiota binnen de verschillende regio’s te onderzoeken. Fecale stalen geven eerder een zicht op de microbiota aanwezig in het lumen van het colon, terwijl gerichte biopsiën een idee geven over de diversiteit aanwezig in de mucosa en meer proximale regio’s (Eckburg et al, 2005; Inglis et al, 2012).

3

Inleiding

Figuur 2: Ruimtelijke verdeling van de microbiële samenstelling doorheen de GIT (Sekirov et al, 2010). A: Toont het verschil in concentratie en diversiteit overheen de lengte van de GIT. B: variaties gezien in de doorsnede van het colon.

Diversiteit en stabiliteit Het intestinale ecosysteem is een van de meest complexe ecosystemen. Het merendeel van de intestinale microbiota zijn strikte anaëroben, maar in mindere mate worden ook facultatieve anaëroben en aëroben teruggevonden. Tot nu toe zijn er 50 fyla en meer dan 400 species beschreven. Van dit totale aantal behoort 99% tot slechts 30 à 40 species (Sekirov et al, 2010; Vanhoutte et al, 2006b). De predominante fyla die in zo goed als alle zoogdieren teruggevonden worden, zijn Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Fusobacteria, Verrucomicrobia en Proteobacteria. De meest voorkomende genera zijn Bacteroides, Eubacterium, Clostridium, Ruminococcus, Peptococcus, Bifidobacterium en Fusobacterium (Suau et al, 1999). De bacteriële samenstelling van het intestinale ecosysteem kan sterk verschillend zijn tussen diersoorten waarbij Firmicutes en Bacteroidetes het sterkst vertegenwoordigd zijn (Eckburg et al, 2005; Ley et al, 2008a). Binnen een species wordt bij elk individu een uniek intestinaal ecosysteem waargenomen (Minamoto et al, 2012), waarbij de predominante intestinale microbiota (>5%) relatief stabiel zijn doorheen de tijd (Fig. 3a). Een sterke temporele variatie wordt waargenomen bij analyse van subdominante groepen (<1%), zoals Lactobacillus, met groepspecifieke primers (Fig. 3b) (Vanhoutte et al, 2006b).

4

Inleiding

Figuur 3: Clustering van DGGE fingerprints van 4 individuen (B-E) bekomen door (a) amplificatie van de V3 regio met universele primers en (b) lac primers specifiek voor Lactobacillus (Vanhoutte et al, 2006b). (a) toont aan dat elk individu een unieke microbiota heeft en dat de predominante microbiota relatief stabiel is doorheen de tijd. (b) toont aan dat de diversiteit binnen de subdominante groep Lactobacillus kan variëren doorheen de tijd. De verschillende stalen 1-4 werden verzameld in een tijdsinterval van 6 weken. Staal 5 werd genomen 3 maanden na het onderzoek.

Er zijn verschillende factoren die de intestinale microbiota beïnvloeden en dus zorgen voor een unieke samenstelling per individu (Dethlefsen et al, 2006). Een eerste factor die een rol speelt is de genetische achtergrond van de gastheer. Zo zijn genen gerelateerd met de immuniteit erg polymorf. Het kan voorkomen dat een mutatie in deze genen de immunotolerantie ten opzichte van sommige bacteriële groepen wordt uitschakelt en het immuunsysteem deze groepen zal aanvallen. Dit kan leiden tot auto-immune ziektes zoals de ziekte van Crohn (MacDonald & Monteleone, 2005). Anderzijds wordt er ook een verschil in microbiële samenstelling waargenomen bij identieke tweelingen. Dit toont aan dat het genotype van de gastheer het intestinale ecosysteem kan beïnvloeden maar dat ook omgevingsfactoren een rol kunnen spelen op de microbiota (Dethlefsen et al, 2006). Ten tweede gaat ook de microbiota zelf een rol spelen in zijn diversiteit door onderlinge microbiële interacties aan te gaan. Aanwezigheid van bepaalde bacteriën kan zorgen voor inhibitie van andere bacteriën door productie van toxische metabolieten en antimicrobiële componenten of door in competitie te gaan voor substraten (Fons, 2000). Ze kunnen echter ook groei van andere bacteriën stimuleren door de productie van groeihormonen of door het produceren van producten die andere bacteriën als substraat kunnen gebruiken (= ‘cross-feeding’) (Flint et al, 2007). Het innemen van antibiotica kan eveneens grote gevolgen hebben op de samenstelling van de microbiota (Jernberg et al, 2007). Tenslotte heeft het ook het dieet een effect op een aantal genera (Dethlefsen et al, 2006). Het toevoegen van extra componenten aan het dieet kan de abundantie van specifieke bacteriën verhogen. Een voorbeeld hiervan is de invloed die inuline heeft op de concentratie van Bifidobacterium (Roberfroid et al, 1998). De microbiota verandert ook naargelang de leeftijd van de gastheer. Ouderdom zorgt voor een verminderde werking van de smaak- en reuk zintuigen en kan

5

Inleiding moeilijkheden bij het kauwen veroorzaken. Dit zorgt ervoor dat de gastheer minder zin heeft in voedsel en minder gebalanceerd zal eten (Tiihonen et al, 2010). Ook fysiologische veranderingen in het lichaam zoals motoriek van de darm en secretie van maagsappen kunnen een shift veroorzaken in de samenstelling van de microbiota (Hopkins et al, 2002). Ontwikkeling Gedurende de zwangerschap is de foetus steriel en de eerste blootstelling aan bacteriën gebeurt tijdens de geboorte. Volwassenen hebben een volledig ontwikkeld immuunsysteem dat het merendeel van de bacteriën die o.m. binnenkomen via het voedsel zal vernietigen waardoor de darm niet door deze bacteriën gekoloniseerd wordt. Hierdoor blijft het intestinale ecosysteem stabiel (Morelli, 2008). Bij pasgeboren baby’s is het immuunsysteem echter nog niet volledig ontwikkeld. Bacteriën komen gemakkelijker de darm binnen en gaan deze koloniseren. De samenstelling van de initiële intestinale microbiota van het kind hangt af van de manier van geboorte. Microbiota van natuurlijk geboren kinderen tonen sterke gelijkenissen met de vaginale microbiota van de moeder (Mändar & Mikelsaar, 1996), terwijl de microbiota van kinderen geboren via een keizersnede eerder bacteriën afkomstig uit de ziekenhuisomgeving bevat (Penders et al, 2006). Naast de manier van geboorte heeft ook de voeding van het kind een effect op de initiële kolonisatie. Bij baby’s die borstvoeding krijgen, wordt een beduidend hoger aantal Bifidobacterium spp. waargenomen dan bij baby’s die flesvoeding krijgen. De eerste kolonisten zijn facultatief anaërobe bacteriën en deze zijn vooral de eerste twee weken dominant aanwezig. De genera Staphylococcus, Streptococcus en leden uit de familie van de Enterobacteriaceae werden het meest geïsoleerd bij pasgeboren kinderen (Bezirtzoglou, 1997). Naarmate het zuurstofniveau daalt in het colon worden deze organismen vervangen door obligaat anaëroben zoals Bacteroides spp., Bifidobacterium spp. en Clostridium spp. die ook dominant aanwezig zijn in het volwassen intestinale ecosysteem. Het intestinale ecosysteem verandert sterk doorheen het eerste levensjaar. Daarna wordt langzaam aan een relatief stabiel en uniek intestinaal ecosysteem gevormd (Fig. 4). Een alternatieve hypothese stelt dat de microbiota alsnog verandert doorheen de kindertijd (Dethlefsen et al, 2006).

Figuur 4: Vorming van het intestinale ecosysteem doorheen de tijd en factoren die de diversiteit beïnvloeden (Sekirov et al, 2010).

6

Inleiding 1.2.2. DE ROL VAN MICROBIOTA IN ZIEKTE EN GEZONDHEID Normobiose De term normobiose beschrijft de microbiële samenstelling zoals ze teruggevonden wordt in de darm van een gezond persoon. Bij normobiose is er een functionele en metabolische balans tussen de saccharolytische en proteolytische bacteriën. Deze balans wordt ook wel homeostase genoemd (Roberfroid et al, 2010). Een microbiota in homeostase heeft vele functies in het lichaam en is dus van groot belang voor zijn gastheer. Ten eerste heeft de microbiota een beschermende functie. Ze voorzien enerzijds de darm van een fysieke barrière zodat pathogenen zich niet kunnen vasthechten. Anderzijds gaan ze bacteriocines produceren (Riley & Wertz, 2002) en stimuleren ze de gastheer om antimicrobiële componenten aan te maken (Sekirov et al, 2010). De gastheer maakt antimicrobiële peptiden (AMP) aan, zoals o.a. defensines, om de samenstelling en concentratie van de intestinale microbiota te bepalen (Salzman et al, 2007). Bacteriën zelf kunnen productie van bepaalde AMP’s stimuleren door het aanmaken van metabolieten zoals korte keten vetzuren. Op deze manier kunnen ze groei van pathogenen verhinderen (Kida et al, 2006; Schauber et al, 2003). Het microbiële ecosysteem beïnvloedt ook de ontwikkeling van het immuunsysteem, zowel het lokale als het systemische. Het hele GI-kanaal komt in contact met potentiële pathogenen, via het voedsel en de omgeving, en met de residentiële (niet-schadelijke) bacteriën. Het immuunsysteem moet dus twee belangrijke functies uitoefenen ter hoogte van het GI-kanaal. Het moet enerzijds tolerant zijn voor de koloniserende bacteriën zodat er geen overdreven of chronische inflammatie plaatsvindt. Anderzijds moet het immuunsysteem in staat zijn de microbiota te reguleren zodat sterke groei en translocatie naar andere lichaamsregio’s verhinderd wordt (Sekirov et al, 2010). De immuuncellen van de gastheer worden door een barrière gescheiden van de microbiota. Deze barrière is de mucus laag die aan de luminale kant sterk gekoloniseerd wordt maar zo goed als geen bacteriën bevat aan de epitheliale zijde van deze laag. Een tweede strategie is het inperken van de proinflammatoire potentiaal van de aanwezige bacteriën. Lipopolysachhariden (LPS) worden teruggevonden op het membraan van de gramnegatieve bacteriën. LPS is dus één van de meest voorkomende antigenen binnen het intestinaal ecosysteem en is in staat om een sterk immuun antwoord op te wekken (Beutler & Rietschel, 2003). Door defosforylatie van de LPS endotoxine componenent wordt de toxische potentiaal verminderd (Bates et al, 2007). Enkel door sterke groei van gramnegatieve bacteriën zal een immuunrespons optreden. Ten slotte kan de gastheer een overdreven immuunrespons vermijden door zijn immuuncellen en antilichamen tolerant te maken voor de residentiële micro-organismen (Sekirov et al, 2010). Een derde belangrijke functie uitgeoefend door het intestinale ecosysteem is het aanmaken van metabolieten die geabsorbeerd worden door de gastheer. Elk organisme heeft nood aan een dagelijkse dosis energie en een aantal essentiële nutriënten. Beiden worden uit de voeding opgenomen. Het is bewezen dat muismodellen zonder intestinale microbiota (GFmuizen = germ-free mice) meer voedsel moeten innemen om hun lichaamsgewicht te behouden (Sekirov et al, 2010). Dit toont aan dat de intestinale microbiota in staat is om extra energie voor de gastheer uit het voedsel te halen. De enzymatisch onverteerbare fractie van het voedsel, zoals vezels en oligofructosacchariden, worden door de bacteriën gebruikt als substraten voor fermentatie. Bij het fermentatieproces worden door de

7

Inleiding saccharolytische bacteriën korte keten vetzuren geproduceerd. Dit zijn o.a. acetaat, propionaat en butyraat, waarbij vooral de laatste bijzonder gunstig is voor de gastheer. Butyraat is de belangrijkste vorm van energie voor de colonocyten (= epitheliale cellen van het colon). Het is ook aangetoond dat butyraat een anti-inflammatoire en anti-carcinogene werking heeft (Barcenilla et al, 2000; Meijer et al, 2010). Zowel colonkanker als inflammatoire darmaandoeningen zijn geassocieerd met verlaagde concentraties butyraat. De voornaamste butyraat producerende bacteriën zijn Bacteroidetes en leden van de Clostridium cluster IV en XIVa (Barcenilla et al, 2000). Andere bacteriën zoals Lactobacillus spp. en Bifidobacterium spp. (Rastall, 2004) zijn in staat om butyraat productie onrechtstreeks te bevorderen. Dit gebeurt doordat deze bacteriën lactaat gaan produceren dat als substraat gebruikt wordt door sommige butyraat producerende bacteriën (De Vuyst & Leroy, 2011). Andere metabole reacties waarbij microbiota betrokken zijn, zijn de productie van vitamines (K en B12) en de afbraak van de toxische metaboliet oxalaat die aanwezig is in vele plantaardige stoffen (Montalto et al, 2009). Oxalobacter formigenes is één van de belangrijkste bacteriën die zorgt voor afbraak van oxalaat. Afwezigheid van deze bacteriën verhoogt het risico op nierstenen. Dysbiose De term dysbiose verwijst naar een verstoring van de microbiële balans in het intestinale ecosysteem. Dysbiose houdt meestal een stijging in van het aantal proteolytische bacteriën en een daling van het aantal saccharolytische. Proteolytische bacteriën (o.a. Clostridium spp.) (Vester et al, 2008a) verkiezen eiwitten als substraten voor fermentatie en produceren hierbij ammonium, fenol en indol. De gevormde metabolieten zijn in hoge concentratie toxisch voor de gastheer en kunnen colonkanker en chronische darmaandoeningen, zoals de ziekte van Crohn, veroorzaken. Een dysbiose van de intestinale microbiota kan bijgevolg een groot aantal gastro-intestinale complicaties met zich meebrengen (Fig. 5) (Round & Mazmanian, 2009).

Figuur 5: De rol die de microbiota uitoefent op de (intestinale) gezondheid van de gastheer (Flint et al, 2012). Microbiota voeren een groot aantal functies uit in de darm, hier aangeduid in het geel, en spelen een rol in het in stand houden van de intestinale gezondheid. Dysbiose van de microbiota kan leiden tot allerlei ziekten.

8

Inleiding Vele factoren kunnen deze shift in samenstelling veroorzaken, waarbij antibiotica, psychologische en fysieke stress, radiatie en veranderingen in het dieet de meest voorkomende zijn (Myers, 2004). Langdurig gebruik van antibiotica kan bacteriën aanwezig in het intestinale ecosysteem afdoden. Hierdoor komt plaats vrij voor andere bacteriën om het colon te koloniseren of voor residentiële bacteriën om overmatig te groeien. Een voorbeeld hiervan is de massale uitgroei van Clostridium difficile die voor antibiotica geassocieerde diarree kan zorgen (McFarland, 1999). Pro- en prebiotica Het al dan niet aanwezig zijn van species uit Clostridium cluster XIVa, Lactobacillus spp. Bifidobacterium spp., Clostridium difficile speelt een grote rol op de gezondheid. Het is dus aangewezen om groei van bacteriën die positieve effecten hebben op de gezondheid, door bv. aanmaak van butyraat, te stimuleren. Dit wordt gedaan door aan de voeding pro- of prebiotica toe te voegen (Roberfroid et al, 2010). Probiotica zijn levende micro-organismen, meestal Bifidobacterium spp. of Lactobacillus spp., die een gezondheidsbevorderend effect hebben wanneer ze in een voldoende hoeveelheid worden toegevoegd. Daarentegen zijn prebiotica stoffen die niet verteerbaar zijn door de gastheer (bv. fructo-oligosacchariden (FOS) en inuline) en daardoor groei van bepaalde bacteriën gaat stimuleren (Gibson, 1999). Er wordt gesproken van synbiotica wanneer zowel probiotica als prebiotica tegelijkertijd worden toegevoegd (Vanhoutte et al, 2006a). 1.2.3. VOEDINGSVEZELS Zoals reeds in sectie 1.2.2. vermeld vormen voedingsvezels de belangrijkste substraten voor intestinale bacteriën. Voedingsvezels kunnen ingedeeld worden in plantaardige en dierlijke vezels. De functie en karakteristieke eigenschappen van vezels wordt voornamelijk bestudeerd via plantaardige vezels. Plantaardige vezels zijn complexe polymeren die worden teruggevonden in de celwand van plantencellen en die niet gehydroliseerd worden door enzymen in de dunne darm (Kimmel et al, 2000; Theander et al, 1994), bv. de non-zetmeel polysacchariden (cellulose, hemicellulose en pectine) en lignine. Vezels worden gekarakteriseerd op basis van hun chemische structuur, fermentatiesnelheid, viscositeit, waterhoudende capaciteit en oplosbaarheid (Guillon & Champ, 2000; Hesta et al, 2006). De belangrijkste functies van voedingsvezels zijn het beïnvloeden van de microbiële diversiteit door dienst te doen als substraat, het verlengen van de transittijd en het bepalen van de feces consistentie door water te absorberen. De vezels zijn globaal in te delen in de wateroplosbare en wateronoplosbare vezels (Kimmel et al, 2000). Wateroplosbare vezels (pectine, FOS) zijn deze die door bacteriën gemakkelijk en vrij snel gefermenteerd kunnen worden met vorming van korte keten vetzuren en gassen (Cummings et al, 1987; Fahey et al, 2004). Wateronoplosbare vezels (cellulose, lignine) worden in mindere mate ook door bacteriën gefermenteerd. Aangezien plantenvezels grotendeels zijn opgebouwd uit complexe carbohydraten worden deze vooral gefermenteerd door de saccharolytische bacteriën (bv. Bacteroides spp.) (Bolam & Sonnenburg, 2011; Chassard et al, 2007; Dongowski et al, 2000; Martens et al, 2009). Plantenvezels zijn echter afwezig in het natuurlijk dieet van de carnivoren. Het is dus aannemelijk dat de intestinale microbiota van carnivoren voornamelijk onverteerde delen zoals bot, kraakbeen, huid, haar en veren als substraat gaat gebruiken. Deze structuren zijn

9

Inleiding rijk in collageen en andere (glyco)proteïnen (Plantinga et al, 2011). Collageen is opgebouwd uit proteïnen waardoor vooral proteolytische bacteriën deze substraten gebruiken. De gevormde producten na fermentatie zijn opnieuw korte keten vetzuren, maar ook vertakte korte keten vetzuren en schadelijke producten zoals ammonium, indol en fenol (Williams et al, 2001). 1.2.4. INTESTINALE MICROBIOTA BIJ KATACHTIGEN Het bestuderen van voeding, vertering en intestinale microbiota bij cheeta’s is niet evident en brengt een aantal praktische problemen met zich mee. Datacollectie in (wilde) populaties is niet eenvoudig en er zijn zelden voldoende dieren beschikbaar voor het uitvoeren van nutritionele proeven met voldoende statistische power. Daarom worden de meeste studies die een idee moeten geven over de intestinale microbiota van cheeta’s, of andere Felidae, uitgevoerd op de huiskat. Extrapolatie van kat naar cheeta is echter niet vanzelfsprekend gezien de nutritionele en omgevingsgebonden verschillen tussen beide species (Bell et al, 2010; Vester et al, 2010). Het intestinale ecosysteem van de huiskat (en andere katachtigen) De katachtigen zijn strikte carnivoren, wat wil zeggen dat ze gedurende hun evolutie zijn aangepast aan de consumptie van dierlijk materiaal. Dierlijk weefsel bevat een groot percentage proteïnen, gemiddelde hoeveelheden aan vet en zo goed als geen carbohydraten (Zoran, 2002). Katachtigen zijn daardoor metabolisch aangepast aan de vertering van proteïnen. Dit wil zeggen dat ze voornamelijk proteïnen i.p.v. carbohydraten gebruiken in structurele, functionele en energie genererende processen (Morris, 1994). Het consumeren van een proteïnerijk dieet heeft ook een weerslag op de samenstelling van het intestinale ecosysteem. Het consumeren van een proteïnerijk dieet heeft ook een weerslag op de samenstelling van het intestinale ecosysteem. Zo werd bij de huiskat na het voederen van een proteïnerijk dieet een daling van E. coli, Bifidobacterium spp. en Lactobacillus spp. vastgesteld (Lubbs et al, 2009; Vester et al, 2009). Het fylum Firmicutes wordt in katten en andere katachtigen gedomineerd door de Clostridium clusters I, XI en XIVa. Waarvan cluster XI de meest abundante is (Fig. 6) (Ritchie et al, 2010; Suchodolski et al, 2008). Er wordt in de huiskat, en ook in andere katachtigen, dus een shift waargenomen van saccharolytische bacteriële groepen (Bifidobacterium spp.) naar proteolytische bacteriële species (Clostridium spp.). De abundantie van Clostridium populaties in het intestinale ecosysteem reflecteert het dieet type van katten (Ritchie et al, 2010). Katachtigen kunnen een aantal essentiële nutriënten, zoals sommige aminozuren, vitamines en mineralen niet zelf produceren. Afwezigheden of tekorten aan deze nutriënten kunnen leiden tot een hele reeks aandoeningen (Zoran, 2002). Al deze nutriënten komen echter voor in dierlijke weefsels. Carnivoren die zich voeden met natuurlijke prooien krijgen hierdoor alle essentiële nutriënten ter beschikking. Dieren in gevangenschap worden echter meestal geen karkassen gevoederd maar commercieel verwerkt voedsel of rauw vlees. Wanneer dieren in gevangenschap een dergelijk dieet krijgen is het belangrijk dat alle essentiële nutriënten extra worden toegevoegd. Dieren die op een commercieel dieet staan krijgen ook substantieel minder dierlijke vezels afkomstig van haar, huid en botten (collageen) binnen. Lage concentraties aan vezels in het dieet kunnen dus de ontwikkeling en functionele diversiteit van hun intestinale

10

Inleiding microbiota beïnvloeden, met mogelijks nefaste gevolgen voor hun gezondheid (Depauw et al, 2011).

Figuur 6: Abundantie van de belangrijkste bacteriële orders aanwezig in feces van katachtigen (a) en abundantie van de verschillende Clostridium clusters binnen de orde Clostridiales (b) (Ritchie et al, 2010).

Intestinale microbiota van cheeta’s Op dit moment is er in de literatuur nog niet veel geweten over het intestinale ecosysteem van de cheeta. Ley et al. (2008a) hebben in hun onderzoek de intestinale microbiële samenstelling bestudeerd van heel wat zoogdieren, zowel omnivoren, carnivoren als herbivoren. Uit hun studie hebben ze geconcludeerd dat het ecosysteem van de meeste dieren gedomineerd werd door twee fyla, de Firmicutes en de Bacteroidetes. Bij de cheeta’s werd eveneens een sterke abundantie van de Firmicutes waargenomen, maar zo goed als geen Bacteroidetes. In de feces van katten (Handl et al, 2011), evenals bij andere katachtigen (Ley et al, 2008a), werden wel Bacteroidetes teruggevonden. Deze waarnemingen zouden kunnen verklaard worden door het verschil in dieet tussen de huiskat en de cheeta. Huiskatten krijgen namelijk een commercieel dieet gevoederd, dat plantaardige carbohydraten bevat (Zoran, 2002). Er kan dus gediscussieerd worden over het strikte carnivoor statuut van de huiskat. De resultaten uit het onderzoek van Ley et al. werden bevestigd in het doctoraatsonderzoek van A. Becker. Eveneens werd in haar doctoraatsonderzoek twee clone libraries geconstrueerd met DNA van twee cheeta’s, B1 en B2. Een deel van de klonen werd gesequeneerd zodat reeds een eerste idee werd verkregen over de diversiteit van het ecosysteem en de abundantie van sommige bacteriële groepen (Becker, 2013).

11

Inleiding 1.3.

TECHNIEKEN VOOR HET BESTUDEREN VAN MICROBIËLE DIVERSITEIT EN FUNCTIONALITEIT

1.3.1. CULTUURAFHANKELIJKE METHODEN Een tiental jaar geleden werd de samenstelling van microbiële ecosystemen vooral bestudeerd door gebruik te maken van cultuurafhankelijke methoden. Hierbij worden bacteriën in cultuur gebracht op één of meerdere media. Niet-selectieve media worden gebruikt om het totale aantal bacteriën te schatten, terwijl selectieve media worden gebruikt om specifieke genera of species op te kweken, rekening houdend met hun vereiste groeicondities (O'Sullivan, 2000). Na groei van de kolonies op het medium is het nodig om de identiteit van het genus of species na te gaan door verdere karakterisering m.b.v. een aantal morfologische en biochemische testen. De morfologische en biochemische eigenschappen van vele species staan o.a. beschreven in Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Sneath et al, 1986). Morfologische karakterisering gebeurt doorgaans via microscopische analyse. Bij biochemische karakterisering wordt o.m. gebruik gemaakt van commerciële identificatietesten zoals de API test. Deze testen zijn echter gelimiteerd in het onderscheiden van verschillende bacteriële groepen (Temmerman et al, 2004), en bijkomende moleculaire methoden, zoals 16S rRNA sequentie analyse, zijn doorgaans nodig om een meer betrouwbare identificatie te verkrijgen. Het gebruik van cultuurafhankelijke methoden voor de studie van complexe ecosystemen, en meer specifiek ecosystemen die strikte anaëroben bevatten, kent sterke beperkingen. Voor de intestinale microbiota wordt geschat dat 80% van de aanwezige bacteriën niet in cultuur gebracht kan worden onder standaard laboratorium condities (Eckburg et al, 2005). Bovendien is het in cultuur brengen van bacteriën arbeidsintensief en tijdsrovend (Blaut et al, 2002). Momenteel wordt meer en meer gekozen voor analyses via cultuuronafhankelijke methoden. Toch blijft het kweken van bacteriën erg belangrijk, en soms zelfs noodzakelijk, voor sommige biotechnologische toepassingen. Om dieper in te gaan op de samenstelling van complexe ecosystemen, wordt de voorkeur echter gegeven aan moleculaire technieken. 1.3.2. CULTUURONAFHANKELIJKE METHODEN Het grote voordeel van cultuuronafhankelijke ofwel moleculaire methoden is dat een volledig beeld van de gemeenschap bekomen wordt zonder de vereiste van een cultivatiestap. Bij studies naar het intestinale ecosysteem wordt DNA van het volledige ecosysteem geëxtraheerd en onderworpen aan verdere analyses. Moleculaire methoden die dikwijls gebruikt worden voor onderzoek naar diversiteit van intestinale microbiota zijn fingerprinting methodes, clone libraries, fluorescente in situ hybridisatie (FISH), real-time (RT) PCR, DNA microarrays, sequenering, stable isotope probing (SIP) en metagenomics (Fig. 7) (Inglis et al, 2012).

12

Inleiding

Figuur 7: Kwalitatieve en kwantitatieve eigenschappen van de verschillende moleculaire technieken.

Vele van deze technieken gebruiken het 16S ribosomaal RNA (rRNA) gen als een merker voor genetische diversiteit. Een gen kan gebruikt worden als fylogenetische merker wanneer het (I) universeel voorkomt, (II) voldoende variabel is zodat differentiatie tot op species niveau mogelijk is, (III) voldoende geconserveerd is zodat het DNA geamplificeerd kan worden met universele primers en (IV) het slechts één kopij heeft in het genoom. Het 16S rRNA gen voldoet aan de eerste drie voorwaarden (Rossello-Mora & Amann, 2001). Andere voordelen van het 16S rRNA is dat er reeds vele sequenties beschikbaar zijn in databases (bv. Ribosomaal database project (RDP), GreenGenes en SILVA) (Cole et al, 2009) en dat het gen niet lateraal transfereerbaar is. Het 16S rRNA gen is 1500 basenparen lang en bevat zowel sterk geconserveerde als 9 hypervariabele regio’s. Meestal wordt ervoor gekozen om de variabele regio’s V3 of V6-V8 te amplificeren omdat deze de grootste sequentievariatie bevatten tussen verschillende species (Yu & Morrison, 2004a). Eén van de problemen bij het gebruik van het 16S rRNA gen als fylogenetische merker is dat het organisme meerdere kopijen van het gen kan bevatten. Dit uit zich in het multi-operon effect en kan bij bepaalde analyses voor interpretatie moeilijkheden zorgen. Om dit probleem te vermijden kan gekozen worden voor het rpoB (β-subunit van het RNA polymerase) of het cpn60 (eiwit behorend tot de chaperonine familie) gen als alternatief (Adékambi et al, 2009; Desai et al, 2009). Gebruik van het 16S rRNA gen is niet gunstig wanneer nauw verwante groepen bestudeerd worden. De ribosomale genen zijn namelijk te geconserveerd tussen nauw verwante species (Rossello-Mora & Amann, 2001). 1.3.3. SEQUENTIE-GEBASEERDE TECHNIEKEN Een bacterieel species wordt beschreven op basis van zijn fenotypische eigenschappen en zijn fylogenetische positie. Wanneer een organisme echter enkel op basis van een moleculair kenmerk beschreven wordt, zoals een bepaalde DNA sequentie, wordt eerder verwezen naar een phylotype of een operationele taxonomische unit (OTU) (Eckburg et al, 2005; Inglis et al, 2012). Bacteriën behoren tot eenzelfde OTU wanneer hun sequentie ≥97% (species niveau) identiek is. Wanneer meer informatie gewenst is over het aantal aanwezige genera of families binnen een ecosysteem wordt de grens respectievelijk op 95% en 90% sequentiegelijkenis gelegd (Peterson et al, 2008). De twee meest gebruikte sequentie-

13

Inleiding gebaseerde methoden zijn het opbouwen van clone libraries en het direct sequeneren van een target gen. Clone libraries Bij het construeren van clone libraries wordt een universeel gen of een deel ervan geamplificeerd, geïnsereerd in een vector en tenslotte gekloneerd in een competente stam. Het grote voordeel van deze techniek is dat elke getransformeerde stam slechts één insert bevat, wat wil zeggen dat ze het gen bevatten van slechts één individu aanwezig in het ecosysteem. Na de kloneringstap wordt de insert geamplificeerd met primers die complementair zijn met de flankerende regio’s van de insert. Sequenering gebeurt vooral via de Sanger methode. Het grootste nadeel van deze methode is de hoge kost en werklast (Inglis et al, 2012). Directe sequenering Om de werklast van het opstellen van clone libraries en de hoge kost van sanger sequenering te omzeilen wordt ook vaak gebruik gemaakt van ‘next generation sequencing’ methoden. Momenteel zijn er verschillende methoden in gebruik, waaronder SOLiD, Illumina, 454 pyrosequencing en Ion Torrent (Glenn, 2011; Mardis, 2008). Door gebruik te maken van deze methoden wordt het target gen onmiddellijk gesequeneerd zonder voorafgaande kloneringstap. Een minpuntje bij het gebruik van ‘next generation sequencing’ is het bekomen van reads van maximum 450 bp. Korte reads kunnen niet dezelfde taxonomische resolutie bekomen als sequenering van het volledige gen (Inglis et al, 2012). Een groter nadeel is de uitgebreide data-analyse die deze methode vereist (Sekirov et al, 2010). 1.3.4. FINGERPRINT TECHNIEKEN Sequentie technieken worden weliswaar steeds goedkoper maar leveren een gigantische hoeveelheid data op dat soms moeilijk te interpreteren is wanneer er nog maar weinig gekend is over het onderzochte ecosysteem. Zeker bij aanvang van nieuwe studies, of bij studies met een groot aantal stalen, wordt vaak gekozen voor DNA fingerprinting. DNA fingerprinting technieken genereren een DNA profiel van een ecosysteem dat een initieel idee geeft over de predominant aanwezige microbiële diversiteit in dat ecosysteem. Frequent gebruikte fingerprinting methoden zijn terminaal restrictie fragment lengte polymorfisme (T-RFLP), ARISA en denaturerende gradiënt gelelektroforese (DGGE). Terminaal Restrictie Fragment Lengte Polymorfisme Bij T-RFLP wordt het volledige 16S rRNA geamplificeerd, waarbij gebruik wordt gemaakt van 5’ fluorescent gelabelde primers. Profielen worden bekomen door het geamplificeerde 16S rRNA product te knippen met één of meerdere restrictie-enzymen. Naargelang verschillen in de 16S rRNA sequentie zullen de fragmenten verschillen in lengte. Deze fragmenten worden gescheiden via capillaire elektroforese en enkel de terminale fragmenten worden door een fluorescentie detector gedetecteerd (Liu et al, 1997). Er wordt een elektroferogram bekomen dat wordt vergeleken met dat van andere microbiële ecosystemen (Inglis et al, 2012). Deze techniek helpt onderzoekers inzicht te krijgen in de diversiteit en relatieve abundantie van genera en species binnen een ecosysteem. De identiteit van de aanwezige bacteriën is via deze techniek echter niet te achterhalen. De identiteit van een bepaalde piek

14

Inleiding in het elektroferogram kan wel achterhaald worden door te vergelijken met een clone library. Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (ARISA) ARISA is een techniek waarbij de ribosomale intergenische spacer (RIS) regio tussen de 16S en 23S genen wordt geamplificeerd. Deze techniek werd oorspronkelijk RISA genoemd, waarbij de scheiding van niet-gelabelde PCR amplicons op poly-acrylamide gels gebeurde (Fisher & Triplett, 1999). Bij ARISA wordt het 5’ uiteinde van één van de primers fluorescent gelabeld. De fragmenten worden gescheiden op lengte van de RIS via een geautomatiseerd elektroforese systeem die de fluorescente DNA fragmenten zal detecteren (Fisher & Triplett, 1999; Or & Gophna, 2011). Aangezien de intergenische spacer voorkomt in alle bacteriële genomen en het sterk verschillend is in lengte (150-1500 bp), is het een goede merker die discriminatie tussen bacteriële species, en soms zelf stammen, toelaat (Kovacs et al, 2010). Denaturerende Gradiënt Gelelektroforese (DGGE) In tegenstelling tot T-RFLP en ARISA kunnen via DGGE amplicons gescheiden worden op basis van DNA sequentie i.p.v. op grootte. DGGE wordt ook eerder uitgevoerd op kleinere amplicons zoals de V3 of V6-V8 regio van het 16S rRNA gen. Amplicons voor DGGE analyse worden gegenereerd door een regio van het 16S rRNA te amplificeren met primers waarbij aan het 5’ uiteinde van één primer een GC-klem wordt bevestigd (Muyzer, 1999). De amplicons worden op een gel gebracht die een stijgende denaturerende gradiënt bevat. Meestal is dit een polyacrylamidegel met een stijgende gradiënt van de denaturerende agentia formamide en ureum. Gedurende de elektroforese zullen de dubbelstrengige amplicons smelten. Wanneer de amplicons hun smeltpunt in de gradiënt bereiken wordt een vorkstructuur gevormd. Deze structuur is te wijten aan de toegevoegde GC-klem, die volledige denaturatie van de strengen verhindert zodat het DNA niet van de gel kan lopen. Hoe hoger het GC-gehalte van het DNA, hoe sterker twee strengen gebonden zijn waardoor de amplicons pas denatureren bij een hogere concentratie aan denaturerend agens en dus verder in de gel zullen migreren t.o.v. amplicons met een laag GC-gehalte (Muyzer, 1999). Het aantal en de intensiteit van de bandjes op de gel geven respectievelijk een idee over de diversiteit (= ‘richness’) en abundantie (= ‘eveness’). Net zoals bij T-RFLP en ARISA kan je via DGGE de identiteit van de aanwezige species en genera niet achterhalen. Daarvoor zijn bijkomende analyses nodig zoals band positie analyse (door te vergelijken met clone library) of sequentie analyse van de geëxtraheerde banden. Deze techniek wordt daarom vooral gebruikt voor vergelijkende doeleinden (Sekirov et al, 2010). Temperatuur gradiënt gelelektroforese (TGGE) en temporele temperatuur gradiënt temperatuur gradiënt gelelektroforese (TTGE) zijn net zoals DGGE sequentie afhankelijke fingerprint methodes. Het grote verschil is dat bij deze methoden gebruik gemaakt wordt van een temperatuurgradiënt i.p.v. een denaturerende gradiënt (Inglis et al, 2012).

15

Inleiding Voor- en nadelen van fingerprint technieken Fingerprinting is een vrij goedkope en snelle techniek om de diversiteit en dynamiek van microbiële ecosystemen te bestuderen. Gebruik van deze technieken laat echter niet toe om de verschillende leden aanwezig in het ecosysteem te identificeren. Identificatie vereist verdere analyses zoals het vergelijken van de fingerprint met bandenpatronen van referentiestammen of fylogenetisch gekarakteriseerde klonen (Inglis et al, 2012; Liang et al, 2008; Sekirov et al, 2010). Bij het analyseren van de bekomen bandenpatronen stelt ieder bandje idealiter één species voor. In de praktijk komen echter co-migrerende banden voor. Dit zijn fragmenten, afkomstig van verschillende species, die zich op dezelfde plaats in de gel positioneren. Dit fenomeen zorgt voor een onderschatting van de microbiële diversiteit (Kisand & Wikner, 2003). Om dit te vermijden kan in het geval van DGGE gekozen worden voor een nauwere gradiënt. In het geval van T-RFLP kan gebruik gemaakt worden van meerdere restrictieenzymen. Op deze manier creëer je in beide gevallen een grotere en meer complexe dataset. Het kan ook voorkomen dat één species meerdere banden vertoont op de gel. Dit is te wijten aan het multi-operon effect, en zorgt voor een overschatting van de microbiële diversiteit (Satokari et al, 2001). Fingerprinting methoden zijn eveneens methoden die een PCR amplificatie stap vereisen. Tijdens de PCR kan preferentiële amplificatie van bepaalde DNA fragmenten optreden, waardoor de abundantie van bepaalde leden binnen het ecosysteem niet representatief is. Naast deze preferentiële amplificatie hebben de technieken een vrij hoge detectielimiet (± 106 Colony Forming Units (CFU)/ml). Deze twee beperkingen zorgen ervoor dat subdominante groepen (<1%) moeilijk of niet te detecteren zijn (Inglis et al, 2012). 1.3.5. KWANTITATIEVE METHODEN Naast het bestuderen van de diversiteit binnen een microbieel ecosysteem kan het ook interessant zijn om predominante groepen of functioneel belangrijke groepen te kwantificeren. Wanneer de exacte hoeveelheid van een bepaalde groep gekend is binnen een intestinaal ecosysteem dat zich in homeostase bevindt, kan bepaald worden of een stijging/reductie van deze groep een rol speelt in bepaalde intestinale aandoeningen (dysbiose). Real-Time PCR RT-PCR is een cultuuronafhankelijke techniek die ons toelaat om DNA en RNA te detecteren en deze tegelijkertijd te kwantificeren. RT-PCR wordt gebruikt om het totale aantal bacteriën of specifieke groepen te kwantificeren. Dit gebeurt door aan de stalen universele of groepspecifieke primers toe te voegen. Naast o.m. primers wordt ook een fluorescent label aan de template toegevoegd (TaqMan of SYBR Green) (Inglis et al, 2012). Naarmate er meer DNA geamplificeerd wordt, zal een sterker fluorescent signaal gemeten worden. De PCR reactie doorloopt 20 tot 40 cycli, waarna gekeken wordt in welke cyclus (cq) de fluorescentie drempel (ct) wordt overschreden. Hoe kleiner cq, hoe meer template er in het oorspronkelijke staal aanwezig was. Deze techniek heeft een lagere detectielimiet (± 104 CFU/ml) dan fingerprint technieken, en is in staat om subdominante groepen te kwantificeren (Inglis et al, 2012).

16

Inleiding Via RT-PCR is het mogelijk om een absolute of een relatieve kwantificatie analyse uit te voeren (Pfaffl, 2001). Een relatieve kwantificatie vergelijkt de concentraties van twee target genen of van twee bacteriële groepen. Het uiteindelijke resultaat zal een verhouding zijn van de gemeten fluorescente waardes. Wanneer het echter interessant is om de absolute concentratie van bepaalde groepen te kennen, wordt gebruik gemaakt van absolute kwantificatie (Livak & Schmittgen, 2001). Voor deze analyses is het noodzakelijk om vooraf een standaardcurve (= verdunningsreeks van een referentiestam waarvan de concentratie gekend is) te maken. Het punt waar het staal en de standaardcurve elkaar snijden wordt gebruikt om de concentratie van het DNA te berekenen (Chen et al, 2005). RT-PCR is een erg accurate, gevoelige en reproduceerbare techniek. De specificiteit van de techniek is afhankelijk van de gebruikte primers. De primers die in deze techniek gebruikt worden zijn ontwikkeld om specifieke taxonomische groepen te detecteren. Het is met deze techniek dus niet mogelijk om nieuwe species te identificeren (Sekirov et al, 2010). Een nadeel van de techniek is de hoge kost (Ding & Cantor, 2004). Fluorescente in situ hybridisatie FISH is een non-PCR techniek, ontwikkeld voor de in situ identificatie van microbiële cellen. De techniek maakt gebruik van fluorescent gelabelde probes die kunnen binden met complementaire DNA sequenties. Het FISH protocol omvat vier stappen: fixatie en permeabilisatie van de cellen, hybridisatie van de probe, ongebonden probe wegwassen en detectie (Moter & Göbel, 2000). Detectie en kwantificatie van de gelabelde cellen gebeurt met een confocale laser scanning microscoop of via flow cytometrie (Bottari et al, 2006). Het is een snelle, specifieke techniek die kwantificatie van cellen, behorende tot specifieke taxa, toelaat. Gebruik van deze techniek laat eveneens toe inzicht te verwerven in de ruimtelijke verdeling van specifieke species binnen een ecosysteem (Moter & Göbel, 2000). Meerdere probes kunnen tegelijk gebruikt worden. Hierbij moet echter wel rekening gehouden worden dat hun spectra niet overlappen. De nadelen van FISH zijn, net zoals bij RT-PCR, dat de target sequentie gekend moet zijn. Het is via deze methode dan ook niet mogelijk nieuwe species te identificeren (Inglis et al, 2012). Als conclusie geldt dat elke techniek zijn sterktes en zwaktes heeft. Wanneer de diversiteit van een ecosysteem bestudeerd wordt is het verstandig om meerdere technieken te gebruiken om een volledig mogelijk beeld te krijgen (Vandamme et al, 1996). 1.3.6. FUNCTIONEEL ONDERZOEK Het achterhalen van de samenstelling van het intestinale ecosysteem leert ons slechts in beperkte mate iets over de functie van de aanwezige bacteriën. Een idee hebben over de functie van de aanwezige bacteriën kan bijvoorbeeld toelaten om de groei van bacteriën, die gunstig zijn voor de gastheer, te stimuleren door o.a. nutritionele sturing. Voor functioneel onderzoek worden vooral de “omics” methoden gebruikt maar sinds kort maakt ook SIP een sterke opkomst.

17

Inleiding Metagenomics Metagenomics is een techniek waarbij de volledige genomen van alle bacteriën aanwezig in het onderzochte ecosysteem worden gesequeneerd. Het sequeneren gebeurt via shotgun sequenering, waarbij de genomen worden gefragmenteerd en gesequeneerd. De reads (= gesequeneerd fragment) worden geassembleerd tot contigs en overlappende contigs vormen uiteindelijk het hele genoom. Vooraleer het genoom kan worden geassembleerd via overlappende contigs moet een bepaalde ‘coverage’ worden bekomen (Venter et al, 2004). De coverage is een verhouding tussen de gemiddelde lengte, het aantal reads en de grootte van het volledige genoom. Hoe meer een bepaalde nucleotide gerepresentateerd wordt in de reads, hoe zekerder het is dat het nucleotide op die plaats in het genoom zal voorkomen. De coverage zegt dus iets over de abundantie van het species in het ecosysteem. Bij subdominante groepen is de coverage meestal niet hoog genoeg, wat leidt tot het verkrijgen van een onvolledig genoom (Gill et al, 2006). Aan de hand van de verkregen sequentie informatie kan achterhaald worden welke genen er allemaal aanwezig zijn in het genoom. Het achterhalen van alle aanwezige genen binnen de genomen vertelt iets over de functionele mogelijkheden die de bacteriën kunnen uitoefenen binnen het ecosysteem. Metaproteomics, metabolomics en metatranscriptomics zijn eveneens technieken om informatie te bekomen over de functie die verschillende bacteriën mogelijks kunnen uitoefenen. De technieken bestuderen respectievelijk de aanwezigheid en abundantie van de eiwitten, metabolieten en mRNA moleculen (Sekirov et al, 2010). Stable isotope probing (SIP) SIP is een relatief nieuwe techniek die gebruikt wordt om bacteriën, die in staat zijn om specifieke substraten te metaboliseren, binnen bepaalde ecosystemen te identificeren. Bij gebruik van deze methode worden bacteriën gegroeid op substraten verrijkt met het stabiele isotoop 13C. Enkel micro-organismen uit het ecosysteem die in staat zijn om de substraten te metaboliseren, zullen 13C incorporeren in cellulaire moleculen waaronder ook DNA en RNA. Na DNA extractie kan het 13C-gelabeld DNA gescheiden worden van het ongelabeld DNA (12C) via densiteit-gradiënt centrifugatie. Aangezien 13C zwaarder is dan 12C zullen deze nucleotiden zich meer onderaan de gradiënt bevinden (Dumont & Murrell, 2005; Radajewski et al, 2000). Op die manier wordt DNA van de functioneel actieve species gescheiden van het DNA van de inactieve species. Elk DNA bandje kan uit de centrifuge tube verwijderd worden en kan op vele manieren verder worden geanalyseerd (sequenetieanalyse, DGGE analyse, aanmaak van clone libraries, enz.). Als stabiele isotoop wordt meestal 13C gekozen en als biomerker meestal DNA, aangezien deze molecule de beste fylogenetische informatie geeft. Voor beiden zijn echter alternatieven mogelijk (Maier et al, 2009; Neufeld et al, 2007).

18

Doelstelling DEEL 2: DOELSTELLING 2.1. DOCTORAAT ANNE BECKER In het Laboratorium voor Dierenvoeding (Vakgroep DI07, Faculteit Diergeneeskunde, UGent) werd eerder aangetoond dat de productie van potentieel gunstige en toxische metabolieten in cheeta’s afhankelijk is van het type dieet. De onverteerbare fractie van het dieet dat als substraat dient voor de intestinale microbiota speelt dus ook in carnivoren, en de cheeta in het bijzonder, een belangrijke rol in het behoud van de intestinale gezondheid (Depauw et al, 2011). Het onderwerp van deze masterproef kadert in het doctoraatsonderzoek van Anne Becker dat voorgenoemd nutritioneel onderzoek wil koppelen aan microbiologische inzichten. In het Laboratorium voor Microbiologie (Vakgroep WE10, Faculteit Wetenschappen, UGent) heeft zij reeds protocollen geoptimaliseerd voor de analyse van fecale stalen en ‘clone libraries’ opgebouwd. Het beoogde doel is uiteindelijk de link tussen een gevarieerd dieet en intestinaal metabolisme te achterhalen via karakterisering van de dynamiek en diversiteit van de fecale microbiota van cheeta’s in gevangenschap. Uiteindelijk kan met de verworven kennis het dieet aangepast worden om intestinale gezondheid te maximaliseren en bijgevolg de soort in gevangenschap te behouden.

2.2. DOELSTELLING Gedurende deze masterproef wordt verder gewerkt op de resultaten bekomen uit het onderzoek van A. Becker. De masterproef wordt globaal onderverdeeld in vier luiken: 

 



Onderzoek naar de diversiteit door het linken van klonen uit de clone libraries CL-B1 en CL-B2 aan specifieke bandposities binnen een DGGE fingerprint van de fecale stalen. Onderzoek naar de temporele stabiliteit door een tijdsreeks van fecale stalen, afkomstig van twee dieren uit België en drie uit Nederland, te analyseren met DGGE. Bepalen van de Firmicutes/Bacteroidetes ratio en nagaan of de afwezigheid van Bacteroidetes in de clone libraries mogelijks te wijten is aan de gebruikte DNA extractie methode. Kwantificatie van specifieke bacteriële taxa via RT-PCR.

Figuur 8 geeft een overzicht weer van de experimentele set-up.

19

Doelstelling

Figuur 8: Overzicht van het praktisch werk uitgevoerd gedurende de masterproef. Na homogenisatie en DNA extractie van de fecale stalen wordt het verkregen DNA onderworpen aan een DGGE analyse en worden functioneel belangrijke groepen gekwantificeerd via RT-PCR.

20

Resultaten DEEL 3: RESULTATEN 3.1. AANMAAK CLONE LIBRARIES Anne Becker heeft gedurende haar doctoraatsproject twee clone libraries (CL) geconstrueerd voor cheeta’s B1 en B2. CL-B1 is opgebouwd uit 352 klonen en CL-B2 uit 350 klonen. Het DNA gebruikt voor het opstellen van beide clone libraries was afkomstig uit respectievelijk de stalen B1-PL-M-T3 en B2-PL-M-T3 (zie bijlage 1 voor een lijst van alle gebruikte fecale stalen in deze masterproef). Uit dit DNA werd het 16S rRNA gen geamplificeerd, waarna de volledige 16S rRNA fragmenten in competente E. coli cellen werden gekloneerd. Uit de gevormde klonen werd een deel van het 16S rRNA gen geamplificeerd met de BKL1 primer waarna het amplicon gesequeneerd werd. Sequenties die ≥97% sequentie similariteit vertoonden, werden gegroepeerd in één OTU. Uiteindelijk werden er 48 OTU’s gedefinieerd waarvan er 18 gemeenschappelijk zijn voor beide cheeta’s, 11 uniek voor cheeta B1 en 19 uniek voor cheeta B2. Bijlage 2 geeft per dier aan uit hoeveel klonen elke OTU werd gedefinieerd. Om te controleren of de clone libraries de diversiteit wel voldoende weergeven werd een rarefaction curve opgesteld. Van elke OTU werd een representatieve kloon geselecteerd samen met de fylogenetisch nauwst verwante typestam uit de RDP databank. De resultaten tonen aan dat Firmicutes het meest abundante fylum is in beide clone libraries gevolgd door Actinobacteria, Proteobacteria en Fusobacteria. In deze studie werden, net zoals in de studie van Ley et al. (2008a) geen Bacteroidetes terug gevonden. Binnen beide clone libraries ontbrak eveneens het genus Bifidobacterium binnen het fylum Actinobacteria.

3.2. DGGE FINGERPRINTING DGGE analyses werden uitgevoerd op (1) DNA geëxtraheerd uit fecale stalen van de cheeta’s B1 en B2 en (2) minstens één representatieve kloon uit elke OTU gedefinieerd uit de clone libraries CL-B1 en CL-B2. Klonen werden geselecteerd op basis van de sequentiekwaliteit. 3.2.1. V3-16S rRNA AMPLIFICATIE De hypervariabele V3 regio van het 16S rRNA gen werd geamplificeerd en vervolgens gecontroleerd op een 1% agarose gel (Fig. 9). Enkel stalen die een bandje toonden ter hoogte van het 200 bp bandje van de SmartLadder, werden op DGGE gel geladen. De blanco gaf geen signaal wat erop wijst dat de PCR reactie goed verlopen is.

21

Resultaten

Figuur 9: Visualisatie van 20 V3-16SrRNA amplicons na kleuring in SybrSafe op een 1% agarose controlegel. Lanen 1-10 bevatten amplicons geamplificeerd uit het DNA van fecaal staal B1-PL-M-T3 en lanen 11-20 amplicons geamplificeerd uit het DNA van staal B2-PL-M-T3. SL =SmartLadder; NC = Negatieve controle.

3.2.2. LINK TUSSEN FINGERPRINTS VAN FECALE STALEN EN GEMEENSCHAPPELIJKE OTU’S In een eerste experiment werd geprobeerd om de 18 gemeenschappelijke OTU’s, beschreven in voorafgaand werk van A. Becker, te linken aan de DGGE fingerprints van de fecale stalen van cheeta’s B1 en B2 verzameld op tijdstip T3. Dit werd gedaan om een idee te krijgen over de identiteit van de banden aanwezig in de fingerprints. Het linken van OTU’s aan banden gebeurde door het uitvoeren van een bandklasse analyse op de genormaliseerde fingerprints. Het verkregen resultaat is te zien in figuur 10 en de verschillende bandklassen zijn beschreven in tabel 1. Uit de DGGE fingerprints blijkt dat de klonen die dezelfde OTU vertegenwoordigen op dezelfde positie in de gel terug te vinden zijn. Enkel de klonen 505 en 116, die OTU 10 vertegenwoordigen, kwamen op verschillende posities in de gel te zitten. Dit is mogelijks te wijten aan de kortere sequentie van kloon 505 waardoor deze een lager GC-gehalte bevat dan kloon 116. Na analyse van de OTU’s 1, 2, 30, 31 en 45 op DGGE gel werd telkens een dubbele band waargenomen.

22

Resultaten

Figuur 10: Fingerprints van de fecale stalen en OTU’s onderverdeeld in verschillende bandklassen. De bandklassen met gelinkte OTU’s zijn eveneens terug te vinden in tabel 1. Bandklasse 51.5 bevat OTU9, aangeduid in het geel, maar is niet vertegenwoordigd banden in de fecale stalen.

Het fecale staal afkomstig van cheeta B1 wordt onderverdeeld in 12 bandklassen, voor cheeta B2 bedraagt dit aantal 14. Van de 18 gemeenschappelijke OTU’s werden er 16 gelinkt aan de fecale profielen. De twee overige OTU’s (17 en 18), behorende tot de Actinobacteria, vertoonden geen bandje meer op de genormaliseerde gel. De 16 OTU’s die hier geanalyseerd werden, zijn gedefinieerd uit klonen teruggevonden in beide clone libraries. Bij het bekijken van de profielen worden de banden behorende tot de bandklassen 48.3, 53.2, 74.8-76, 76-77.5 slechts in fingerprints van één dier waargenomen. Bandklasse 51.5, waarin de band van OTU9 valt, bevat geen band in de fingerprints van de fecale stalen. Wanneer gekeken wordt naar de intensiteit van sommige banden, behorende tot dezelfde bandklasse, wordt een sterk verschil waargenomen tussen de twee dieren (bv bandklasse 38.7). Deze waarnemingen zijn overeenstemmend met de data uit de clone libraries (bijlage 2).

23

Resultaten Tabel 1: De verschillende bandklassen bekomen na bandklasse analyse op fingerprints van de fecale stalen en OTU’s. De bandklassen zijn terug te vinden in figuur 10.

Band klasse

Gelinkte OTU’s Gemeenschappelijk

Niet-gemeenschappelijk

18.0 32.9

OTU27

Band intensiteita

Dichtst gerelateerde orde/familieb

Dichtst gerelateerde cluster/typestamb

B1

B2

+

-

onbekend

onbekend

+

-

Streptococcaceae

Lactococcus piscium CCUG 32732T

38.7

OTU10, OTU15

OTU25, OTU41

+++

+

Lactobacillales

43.1

OTU16

OTU31

++

+

Lactobacillales

48.3

OTU11

OTU33, OTU45

-

++

Fusobacteriaceae

50.1

OTU10, OTU13

OTU21, OTU26, OTU45

+++

++

Clostridiales

Clostridium cluster XIVa

51.5

OTU9

-

-

Clostridiales

Clostridium glycyrrhizinilyticum ZM35T

53.2

OTU6

+++

-

Peptococcaceae

Desulfonispora thiosulfatigenes DSM 11270T

54.3

OTU7, OTU12

OTU19, OTU38, OUT48

+++

++

Clostridiales

Clostridium cluster XIVa

57.6

OTU8, OTU14

OTU22

+

+

Clostridiales

Clostridium Cluster XIVa

67.2-67.8

OTU2

OTU40

+

++

Clostridiales

Clostridium perfingens ATCC 13124T

74.8-76

OTU5

OTU36

-

+

Clostridiales

Clostridium cluster XI

76-77.5

OTU1

OTU30, OTU31, OTU37

-

+

Clostridiales

Clostridium cluster I

OTU3, OTU4

OTU38, OTU39, OTU47

+++

+++

Clostridiales

Clostridium cluster XI

80.8 a

band intensiteiten (numerieke waarde bekomen na het uitvoeren van de bandklasse analyse): + = zwakke intensiteit (1-25); ++ = gemiddelde intensiteit (25-75); +++ = Sterke intensiteit (≥75); - = afwezigheid bandje b voor verschillende OTU’s die ± tot dezelfde groep behoren werd de orde en de cluster genoteerd. Voor een alleenstaande OTU’s de familie en de dichtst gerelateerde typestam

24

Resultaten

3.2.3. LINK TUSSEN FINGERPRINTS GEMEENSCHAPPELIJLKE OTU’S

VAN

FECALE

STALEN

EN

NIET

Voor het vervolledigen van de studie en omdat er nog een aantal banden op de fingerprints van de fecale stalen niet gelinkt werden aan een OTU, werd opnieuw een bandklasse analyse uitgevoerd maar deze keer werden ook de niet-gemeenschappelijke OTU’s in de analyse opgenomen. De verkregen resultaten toonden dat het merendeel van de banden die nietgemeenschappelijke OTU’s vertegenwoordigen, zich in de reeds beschreven bandklassen bevonden. De resultaten worden getoond in tabel 1. De niet gemeenschappelijke OTU’s 20, 24, 27, 29, 34 en 42 vormden nieuwe bandklassen. Van deze zes OTU’s kon enkel OTU27 gelinkt worden aan een band aanwezig in de fingerprint van cheeta B1. OTU43 en 44 vertoonden net zoals OTU17 en 18 een hoge sequentie similariteit met de Actinobacteria en werden na normalisatie niet meer teruggevonden op de fingerprints. Ook OTU28 die fylogenetisch gelinkt is met Eubacterium cylindroides werd na normalisatie niet meer op de gel teruggevonden. De band die OTU28 vertegenwoordigde bevond zich te hoog op de gel. Uiteindelijk kon elke band aanwezig op de fingerprints van de fecale stalen gelinkt worden aan één of meerdere OTU’s met uitzondering van één duidelijke band die teruggevonden wordt in de bandklasse 18.0 op de fingerprint van B1. 3.2.4. IDENTIFICATIE VAN DE BANDEN Een band op de fingerprints van de fecale stalen die slechts met één OTU in een bandklasse wordt gelinkt, zal na sequentie analyse mogelijks een hoge sequentie similariteit vertonen met de dichtst gerelateerde typestam van deze OTU. De banden in bandklasse 32.9, waaronder OTU27, zullen dus na sequentie analyse waarschijnlijk een hit geven met Lactococcus piscium CCUG 32732T of andere nauwe verwanten van dit species. Banden van fingerprints, die met meerdere OTU’s in dezelfde bandklasse linken, zijn moeilijker te identificeren. In deze masterproef werd de focus gelegd op de drie bandklassen die zowel in B1 als B2 voorkomen en elk gecorreleerd worden met meerdere OTU’s. De bandklassen 50.1 en 54.3 bevatten samen 10 OTU’s waarvan er zeven een hoge sequentie similariteit vertonen met typespecies uit Clostridium cluster XIVa. De drie andere OTU’s (26, 38 en 45) zijn fylogenetisch gelinkt met Lactobacillus animalis NBRC 15882T, species uit Clostridium cluster XI en Fusobacterium mortiferum ATCC 25557T. De vijf OTU’s gelinkt aan bandklasse 80.8 vertonen allen een hoge sequentie similariteit met species uit Clostridium cluster XI.

25

Resultaten

Figuur 11: Visualisatie van de bandklassen 50.1 en 54.3 op een 45-55% gradiënt (links) en de bandklasse 80.8 op een 50-60% gradiënt (rechts). Bij het werken op een nauwere gradiënt gaan de OTU’s 21, 35, 26 en 45 zich niet meer op dezelfde hoogte bevinden. Voor banklasse 80.8 blijven alle OTU’s op dezelfde hoogte in de gel ondanks het werken met nauwere gradiënten. M= fecale merker; BKL= Bandklasse

Figuur 11 geeft een DGGE gel weer waar de OTU’s die tot de Clostridium clusters behoren gescheiden worden op een sterkere gradiënt. De figuur toont aan dat OTU 35 uit bandklasse 50.1 en OTU 21, 26 en 45 uit bandklasse 54.3 op een 45-55% gradiënt zich niet meer op dezelfde positie in de gel bevinden als de andere OTU’s van deze bandklasse. De OTU’s uit bandklasse 80.8 migreren allen tot op gelijke hoogte in de gel, zelfs op een 50-60% gradiënt. Op de nauwere gradiënten wordt ook splitsing van een aantal banden in de fingerprints van de fecale stalen waargenomen. Om de identiteit van de banden te checken werden een aantal banden onderworpen aan een sequentie analyse. De resultaten zijn terug te vinden in tabel 2.

26

Resultaten Tabel 2: Resultaten na sequentie analyse van bandjes geknipt uit DGGE gel.

OTU/ staal

Consensus

OTU3

151 bp

OTU38 OTU47 OTU7a

Geen consensus

149 bp 149 bp /

Dichtste gerelateerde typestam

Sim. (%)b

ID fylogenetische boom

Clostridium hiranonis TO-931T

100%

Clostridium hiranonis TO-931T

Eubacterium tenue DSM 20695

T

100%

T

Sim. (%)c 100%

Eubacterium tenue ATCC 25553

T

100%

T

F: 76 bp

Eubacterium tenue DSM 20695 Clostridium saccharolyticum WM1T

100% 55,79%

Eubacterium tenue ATCC 25553 Ruminococcus gnavus ATCC 29149T

100% 40%

R: 100 bp

Ruminococcus gauvreauii CCRI-16110T

100%

Ruminococcus gnavus ATCC 29149T

100%

100%

T

T

OTU19

150 bp

Ruminococcus gauvreauii CCRI-16110

OTU35

155 bp

Clostridium saccharobutylicum P262T

94,08%

OTU48 B2 (BKL 54.3) B1 (BKL 50.1)a OTU13a

157 bp 149 bp / /

OTU21 OTU26 OTU45a

152 bp 165 bp /

Ruminococcus gauvreauii CCRI-16110T Ruminococcus gauvreauii CCRI-16110T Blautia hansenii DSM 20583T Oceanispaera sediminis TW92T Blautia hansenii DSM20583T Clostridium jejuense HY-35-12T Lactobacillus apodemi ASB1T Fusobacterium nucleatum ATCC 49256T Fusobacterium russii ATCC 25533T

100% 100% 98,75% 53,64% 100% 98,68% 100% 100% 97,06%

R:85 bp F: 55 bp R: 111 bp

F: 28 bp R: 68 bp

Ruminococcus gnavus ATCC 29149 Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans SW512T /d /d /d Blautia glucerasea HFTH-1T Blautia glucerasea HFTH-1T Clostridium bolteae DSM 15670T Lactobacillus animalis NBRC 15882T Fusobacterium mortiferum ATCC 25557T Fusobacterium mortiferum ATCC 25557T

a

99,39% 94,08%

46,30% 98,18% 97,36% 100% 100% 93,93%

Bij het assembleren van de sequenties bekomen uit deze bandjes kon geen consensussequentie worden opgebouwd. F= forward en R= Reverse sequentie werden apart geBlast tegen EZtaxon database. b Heeft de similariteit weer tussen de sequentie en de eerste hit met EZtaxon database. c Heeft de similariteit weer tussen de sequentie en de typespecies gelinkt aan de OTU in de fylogenetische boom. d OTU 48 gaf geen duidelijke hit met een typestam in de fylogenetische boom en de twee banden uit de fingerprints waren niet opgenomen in het maken van de boom.

27

Resultaten Sequentie analyse van de banden corresponderend met OTU3, 38 en 47 vertonen 100% sequentie similariteit met de 16S rRNA sequenties van respectievelijk C. hiranonis en E. tenue. Deze bevindingen zijn overeenkomstig met de dichtst gerelateerde species waarmee de OTU’s samenclusteren in de fylogenetische boom. De sequenties van de drie OTU’s vertonen ook ≥ 98% sequentie similariteit met andere species uit Clostridium cluster XI zoals C. bifermentans, C. difficile, C. ghonii, C. irregulare, C. glycolicum en C. sordelli. Dit toont aan dat de verschillende species behorende tot Clostridium cluster XI niet veel sequentie variatie bevatten. Dit verklaart waarom de banden zich zullen positioneren op dezelfde hoogte in de gel. Bij OTU21, 26, 35 en 45 werd reeds enige variatie gezien qua positionering op de gel bij een 45-55% gradiënt. OTU’s 26, 35 en 45 clusterden niet samen met Clostridium cluster XIVa in de boom. De eerste match die hun sequenties opleverden bij het BLASTEN tegen de EZtaxon database waren respectievelijk L. apodemi, C. saccharobutylicum en F. nucleatum. Bij het doorlopen van de lijst met mogelijke matchen, worden ook de typespecies L. animalis, H. saccharovorans en F. mortiferum met een even grote sequentie similariteit teruggevonden. Clostridium cluster XIVa is opgedeeld in twee kleinere clusters, de Blautia species enerzijds en de Ruminococcus species anderzijds. OTU13 en 21 uit bandklasse 50.1 vertoonden de hoogste sequentie similariteit met de Blautia species terwijl OTU7 en 19 de hoogste similariteit vertoonden met Ruminococcus species. Er werd eveneens DNA geëxtraheerd uit vijf banden afkomstig uit de fingerprints van de fecale stalen. De bekomen sequenties van drie banden waren echter van onvoldoende kwaliteit om een consensussequentie te creëren. De forward en reversed sequentie waren eveneens te kort om apart te BLASTEN tegen de EZtaxon database. De slechte kwaliteit van deze sequenties is mogelijks te wijten aan de onzuiverheid van de oorspronkelijke band. Twee sequenties, uit de bandjes van bandklasse 50.1 en 54.3, gaven wel een goed resultaat. Zij gaven respectievelijk een hit met Blautia hansenii en Ruminococcus gauvreauii. Deze resultaten zijn consistent met de sequentie analyse van de banden afkomstig van de OTU’s die tot diezelfde bandklasse behoren. 3.2.5. TIJDSREEKS VAN CHEETA’S UIT PLANCKENDAEL Over een periode van 28 maanden werden om de twee maanden fecale stalen verzameld van zowel cheeta B1 als cheeta B2. Niet elke staalname was even succesvol, waardoor fecale stalen ontbreken van B1 op tijdstippen T9 en T12 en van B2 op T2 en T10. De twaalf stalen van beide dieren werden op DGGE gel geplaatst. De originele fingerprints zijn terug te vinden in bijlage 4. De fingerprints van de tijdsreeks werden geclusterd via de Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA) gebaseerd op de Pearson correlatie coëfficiënt (= gebaseerd op de curve, niet op de banden) (Fig. 12). Na clustering van de tijdsreeks van cheeta B1 (Fig. 12) wordt gezien dat deze globaal verdeeld is in twee kleinere clusters. Het aantal banden geeft een idee over de microbiële diversiteit (= ‘richness’) in de fecale stalen terwijl de intensiteit iets zegt over de abundantie (= ‘evenness’) van de aanwezige bacteriën. De fingerprints van cheeta B1 hebben doorheen de tijd gemiddeld 10 à 11 banden. Eveneens werd ook gekeken naar de similariteit percentages tussen de verschillende profielen. Alle waarden uit de similariteitmatrix (= matrix waarbij de profielen paarsgewijs met elkaar vergeleken worden), opgebouwd via de Pearson correlatie coëfficiënt en de UPGMA methode, werden uitgezet in een box plot (Fig.

28

Resultaten 13). 50% van de percentages uit deze matrix hadden een waarde tussen 77,5% en 97,05%. Het bandenpatroon blijft voor beide dieren doorheen de tijd vrij stabiel. In de tijdsreeks van cheeta B2 clusteren tijdstippen T4 en T10 duidelijk apart. Fingerprints van cheeta B2 bevatten gemiddeld 11 à 12 bandjes doorheen de tijd. Dit is iets meer dan in cheeta B1. Uit de similariteitmatrix wordt besloten dat 75% van de profielen een similariteit percentage heeft tussen de 96,21% en 78,09%.

Figuur 12: Clustering van DGGE profielen van de tijdsreeks van cheeta B1 en cheeta B2 (35-70% gradiënt). DGGE analyse werd uitgevoerd op V3-16S rRNA amplicons. De clustering werd gemaakt op basis van de Pearson correlatie coëfficiënt en de UPGMA methode. De stalen T1-T14 werden verzameld over een periode van 2 jaar (interval van 2 maanden). Banden 1 en 2 zijn een voorbeeld van respectievelijk een temporeel variabele band en een constant aanwezig band.

29

Resultaten

Boxplot: % similariteit tussen de profielen van de tijdsreeks 100 90

Percentage similariteit

96,21

97,05

80 70

87,27

89,86 85,31

77,5

78,09

66,24

60,58

60

51,23

50 40 30 B1

B2

Figuur 13: Boxplot die het percentage similariteit tussen de profielen van de tijdsreeks van B1, B2 en beide dieren weergeeft. De boxplot werd opgesteld a.d.h.v. de waarden uit de similarteitsmatrix (= matrix waarbij de profielen paarsgewijs met elkaar worden vergeleken).

Wanneer één grote cluster van beide tijdsreeksen wordt gevormd, ontstaat er geen dier specifieke clustering (data niet weergegeven). Hieruit wordt afgeleid dat het intestinale ecosysteem van de beide dieren uit Planckendael vrij gelijkaardig is. Bij het analyseren van de temporele stabiliteit (Fig. 12) worden onmiddellijk enkele banden waargenomen die doorheen de tijdsreeks stabiel aanwezig zijn. Eén van deze voorbeelden zijn de banden aangeduid in figuur 12 met nummer twee. Door de OTU’s te linken aan de fingerprints van de fecale stalen genomen op tijdstip drie, werd achterhaald dat deze band species van Clostridium cluster XI voorstelt. Naast continue aanwezige banden werden ook een aantal banden teruggevonden die variëren doorheen de tijd. Een voorbeeld hiervan zijn de banden in figuur 12 aangeduid met nummer 1. Deze banden linken met OTU’s die een hoge sequentiegelijkenis vertonen met species uit de orde Lactobacillales. 3.2.6. OTU’S GELINKT AAN DE TIJDSREEKS Onderzoek naar het veranderen van de diversiteit doorheen de tijd werd uitgevoerd door de OTU’s deze keer te linken aan de fingerprints verkregen uit beide tijdsreeksen. Er werd opnieuw een bandklasse analyse uitgevoerd. De eerder gevonden bandklassen werden opnieuw teruggevonden samen met een aantal nieuwe. De resultaten zijn terug te vinden in tabel 3.

30

Resultaten Tabel 3: De verschillende bandklassen bekomen na bandklasse analyse op de tijdsreeks.

Band klasse

Gelinkte OTU’s Gemeenschappelijk

% fingerprints positief voor deze bandklassea

Niet-gemeenschappelijk

B1

B2

Dichtst gerelateerde orde/familieb

Dichtst gerelateerde cluster/typestamb

80.8

OTU3, OTU4

OTU38, OTU39, OTU47

100

100

Clostridiales

Clostridium cluster XI

50.1

OTU10, OTU13

OTU21, OTU26, OTU45

100

100

Clostridiales

Clostridium cluster XIVa

54.3

OTU7, OTU12

OTU19, OTU38, OUT48

92

100

Clostridiales

Clostridium cluster XIVa

18.0

/

100

67

onbekend

onbekend Clostridium perfingens ATCC 13124T

67.2-67.8

OTU2

OTU40

83

92

Clostridiales

38.7

OTU10, OTU15

OTU25, OTU41

83

67

Lactobacillales

43.1

OTU16

OTU23

83

75

Lactobacillales

76-77.5

OTU1

OTU30, OTU31, OTU37

25

58

Clostridiales

Clostridium cluster I

53.2

OTU6

50

25

Peptococcaceae

Desulfonispora thiosulfatigenes DSM 11270T

57.6

OTU8, OTU14

OTU22

50

0

Clostridiales

Clostridium cluster XIVa

32.9

OTU27

42

17

Streptococcaceae

Lactococcus piscium CCUG 32732T

46.6

OTU20

42

25

Ruminococcaceae

Ruminococcus torques ATCC27756T

OTU33, OTU45

25

42

Fusobacteriaceae

OTU24

33

25

Enterococcaceae

Enterococcus hirae DSM 20160T

41.5

33

25

onbekend

onbekend

45.4

0

33

onbekend

onbekend

OTU36

8

25

Clostridiales

Clostridium cluster XI

OTU32, OTU46

0

17

Clostridiales

Clostridium colicanis DSM 13634T

OTU34

8

8

Clostridiaceae

Clostridium fallax ATCC 19400T

48.3

OTU11

36.1

74.8-76 64.8 71

OTU5

a

Bandklassen zijn gerangschikt volgens frequentie van voorkomen in de fingerprints van B1 en B2 voor verschillende OTU’s die ± tot dezelfde groep behoren werd de orde en de cluster genoteerd. Voor een alleenstaande OTU’s de familie en de dichtst gerelateerde typestam b

31

Resultaten De OTU’s 20, 24, 32, 34 en 46 die niet gelinkt konden worden aan de fingerprints van de fecale stalen van B1 en B2 verzameld op T3, kunnen nu minstens aan één van de fingerprints uit de tijdsreeks gelinkt worden. De OTU’s 9, 28, 29, 42 vormen bandklassen waartoe geen banden behoren in de fingerprints van de tijdsreeks. Van de 19 gevormde bandklassen zijn er zeven bandklassen die in ≥66% van de fingerprints van de tijdsreeks B1 of B2 een band tonen. De drie bandklassen die de banden met de sterkste intensiteit bevatten, zijn opnieuw 50.1, 54.3 en 80.8 die Clostridium cluster XIVa en cluster XI vertegenwoordigen. Ook OTU2 uit bandklasse 67.2-67.8 kan gelinkt worden aan het merendeel van de fingerprints uit de tijdsreeksen, al hebben deze banden een lagere intensiteit. OTU2 toont een hoge sequentie similariteit met Clostridium perfringens. De bandklassen 38.7 en 43.1 bevatten eveneens banden voorkomend in het merendeel van de fingerprints van de tijdsreeks. Deze banden linken samen met een aantal OTU’s fylogenetisch gelinkt aan de orde Lactobacillales. Desondanks hun voorkomen in vele fingerprints varieert de intensiteit sterk tussen de verschillende tijdstippen van zowel B1 als B2. Beide bandklassen zijn eveneens in meer fingerprints van B1 terug te vinden en hebben een sterkere intensiteit. Bandklasse 38.7 bevat vijf banden met een numerieke intensiteit >100. Vier van deze banden waren afkomstig uit fingerprints van cheeta B1 waarbij het dier prooi i.p.v. vlees gevoederd kreeg op het moment van staalname. Deze resultaten werden echter niet gevonden voor cheeta B2. Ook werd bandklasse 18 teruggevonden in alle B1 fingerprints en in acht B2 fingerprints. Aangezien dit bandje hoog in de gel gepositioneerd is, kan het mogelijks een artefact zijn. De zeven quasi continue aanwezige bandklassen bij zowel cheeta B1 als B2 worden getoond in figuur 14.

Figuur 14: DGGE fingerprints van de tijdsreeksen B1 en B2 (35-70% gradiënt). De aangeduide bandklassen komen minstens in 66% van de profielen van B1 of B2 voor. Banden uit deze bandklassen zijn stabiel doorheen de tijd.

32

Resultaten Twee andere potentieel interessante banden aanwezig in de tijdsreeks zijn deze uit bandklasse 53.2 (gelinkt aan OTU6) en 57.6 (gelinkt aan OTU8, 14 en 22). Deze twee bandklassen komen voor in de helft van de fingerprints afkomstig van B1 en in respectievelijk drie en geen van de fingerprints van B2. Ook de intensiteit van de banden is veel sterker in B1. Ten laatste werden in de tijdsreeks meer bandklassen geobserveerd dan wanneer enkel het staal verzameld op T3 werd geanalyseerd. Het fecaal profiel van B2 op T4 zorgt voor heel wat meer nieuwe bandklassen maar deze worden niet in rekening gebracht aangezien het dier op dit moment mogelijks ziek was. De nieuwe bandklasse 41.50 wordt in 25% van de tijdsreeks van beide dieren teruggevonden. De bandklasse 45.4 enkel in stalen van B2. 3.2.7. TIJDSREEKS VAN CHEETA’S UIT ZOOPARC OVERLOON De sterk gelijkaardige profielen van cheeta B1 en B2 worden vergeleken met de profielen van drie dieren uit Zooparc Overloon: NL9, NL10 en NL11. Voor cheeta NL9, NL10 en NL11 werden respectievelijk 4, 5 en 6 fecale stalen geanalyseerd. Het resultaat is weergegeven in figuur 15. Ook bij de dieren uit Nederland wordt geen dierspecifieke clustering vastgesteld.

Figuur 15: DGGE fingerprints van fecale stalen verzameld van drie dieren uit Nederland (35-70% gradiënt). De drie aangeduide bandklassen komen voor in elk profiel net zoals bij de dieren uit België.

33

Resultaten De fingerprints van cheeta NL9 bevatten gemiddeld 17 à 18 bandjes per profiel, voor cheeta’s NL10 en NL11 bedraagt dit gemiddelde respectievelijk 15 à 16 en 17 à 18 bandjes. Banden in bandklassen 50.1, 54.3 en 80.8, aangeduid op figuur 15, zijn net zoals in de Belgische dieren in elke fingerprint terug te vinden. Bandklasse analyse van de profielen van NL9, NL10 en NL11 geeft twee nieuwe bandklassen in vergelijking met de analyse van B1 en B2, waarbij in deze bandklassen een band wordt teruggevonden in 50% van de fingerprints. De bandklassen 32.9 en 38.7 die linken met OTU’s die hoge sequentie similariteit tonen met de Lactobacillales, worden niet teruggevonden in de fecale stalen van de dieren uit Nederland. Ook de bandklasse 43.1 fylogenetisch gelinkt met Lactobacillales komt minder voor doorheen de tijd. Bandklasse 67.3-67.8 correleert met OTU2 (C. perfringens) en wordt teruggevonden in quasi alle fingerprints van cheeta’s B1 en B2 maar slechts in 40% van de fingerprints van de Nederlandse dieren. Bij de dieren uit Nederland ligt de gemiddelde intensiteit van de band lager. Banden gelinkt met OTU 20 en 24 komen in de tijdsreeksen van Nederland meer voor. Tabel 4 geeft de gemeenschappelijke bandklassen weer tussen de dieren van Planckendael en Zooparc Overloon. De meeste van deze overige bandklassen bevatten banden die doorheen de tijd variëren. 3.2.8. DGGE TROUBLESHOOTING Bij de eerste visualisaties van de OTU’s op DGGE gel werden dikke banden waargenomen. Het was moeilijk te achterhalen of zo’n band uit één of meerdere banden bestond. Eveneens verliep de onderverdeling in bandklassen door deze dikte moeilijker. Om dit probleem te verhelpen werd ervoor gekozen om slechts 5 µl i.p.v. 25 µl op de gel te laden. In een volgende stap werd geprobeerd om een verdunningsreeks van twee OTU’s op gel te plaatsen, om zo de meest gunstige verdunning te achterhalen. Uiteindelijk werd er voor alle OTU’s een 1/500 verdunning gebruikt. Bij de visualisatie van de gels werd een probleem opgemerkt bij de fecale merker. De bandjes van de merker die zich onderaan de gel bevinden werden niet meer op de juiste afstand van elkaar gescheiden waardoor de gel bij normalisatie in Bionumerics sterk uitgerokken werd. Dit probleem werd opgelost door de 100% denaturerende oplossing sneller te vernieuwen. Eenmaal dit was opgelost werd op sommige gels gezien dat de bovenste bandjes van de fecale merker niet voldoende dissociëren, wat voor een gelijkaardig probleem zorgde bij de verwerking. De oorzaak hiervan lag bij de pomp. Bij het aanzetten van de pomp begon het mengen van de twee gradiënten niet onmiddellijk wat zorgde voor een verkeerde opbouw van de gradiënt.

34

Resultaten Tabel 4: Gemeenschappelijke bandklassen tussen de dieren van Planckendael en Zooparc Overloon.

Band klasse

Gelinkte OTU’s Gemeenschappelijk

80.8 50.1 54.3 18.0 67.2-67.8 43.1 36.1 46.6 76-77.5 48.3 53.2 74.8-76 41.5 64.8 57.6 71

OTU3, OTU4 OTU10, OTU13 OTU7, OTU12 / OTU2 OTU16

OTU1 OTU11 OTU6 OTU5

OTU8, OTU14

Niet-gemeenschappelijk OTU38, OTU39, OTU47 OTU21, OTU26, OTU45 OTU19, OTU38, OUT48 OTU40 OTU23 OTU24 OTU20 OTU30, OTU31, OTU37 OTU33, OTU45 OTU36 OTU32, OTU46 OTU22 OTU34

% fingerprints positief voor deze bandklassea PL

OV

100 100 95.8 83.3 87.5 75 29.1 33.3 41.6 33.3 37.5 16.6 29.1 8.3 25 8.3

100 100 80 86.6 40 46.6 60 60 46.6 46.6 20 33.3 26.6 26.6 20 6

Dichtst gerelateerde orde/familieb

Clostridiales Clostridiales Clostridiales onbekend Clostridiales Lactobacillales Enterococcaceae Ruminococcaceae Clostridiales Fusobacteriaceae Peptococcaceae Clostridiales onbekend Clostridiales Clostridiales Clostridiaceae

Dichtst gerelateerde cluster/typestamb

Clostridium cluster XI Clostridium cluster XIVa Clostridium cluster XIVa onbekend Clostridium perfingens ATCC 13124T Enterococcus hirae DSM 20160T Ruminococcus torques ATCC27756T Clostridium cluster I Desulfonispora thiosulfatigenes DSM 11270T Clostridium cluster XI onbekend Clostridium colicanis DSM 13634T Clostridium cluster XIVa Clostridium fallax ATCC 19400T

a

Bandklassen zijn gerangschikt volgens frequentie van voorkomen in de fingerprints van de dieren van Planckendael (PL) en de dieren van Zooparc Overloon (OV). Er werden 24 stalen geanalyseerd voor PL en 15 voor OV. b Voor verschillende OTU’s die ± tot dezelfde groep behoren werd de orde en de cluster genoteerd. Voor een alleenstaande OTU’s de familie en de dichtst gerelateerde typestam

35

Resultaten 3.3. BEPALEN VAN DE FIRMICUTES/BACTEROIDETES RATIO De ratio Firmicutes/Bacteroidetes bedraagt voor de fecale stalen van B1 gemiddeld 1/0,005 (± 0,05) en voor B2 gemiddeld 1/0,007 (± 0,05). Doorheen de tijd blijft deze ratio voor zowel B1 als B2 relatief constant. 3.3.1. SPIKING EXPERIMENT Ley et al (2008a) onderzocht de samenstelling van het intestinale ecosysteem in heel wat zoogdieren. Uit de studie werd geconcludeerd dat het intestinale ecosysteem bij de mens en het merendeel van de andere zoogdieren gedomineerd wordt door de groepen Firmicutes en Bacteroidetes. Bij strikte carnivoren, zoals de cheeta en de ijsbeer, werd eveneens een sterke abundantie van Firmicutes waargenomen maar Bacteroidetes populaties waren minimaal. Door het bepalen van de Firmicutes/Bacteroidetes ratio werd ook in deze masterproef aangetoond dat het aandeel Bacteroidetes in het intestinale ecosysteem bijzonder laag ligt. Een verklaring voor de lage aantallen Bacteroidetes in de fecale stalen ligt mogelijks aan het gebruikte DNA extractie protocol. Het kan immers dat het gebruikte DNA extractie protocol niet efficiënt is voor DNA extractie van Bacteroidetes. Om dit na te gaan werd een spiking experiment uitgevoerd. Fecale stalen afkomstig van cheeta B1 en B2 gespiked met een gekende hoeveelheid Bacteroides species (tabel 5), waarna DNA geëxtraheerd werd via het gebruikelijke Pitcher protocol. Tabel 5: fecale stalen met mengsel Bacteroides spp.

B1 (0% spiking) B1 (1% spiking) B1 (10% spiking) B1 (50% spiking) B2 (0% spiking) B2 (1% spiking) B2 (10% spiking) B2 (50% spiking) Bacteroidetes mengsel (100% spiking)

Fecaal staal (CFU/100 µl) 7 x 106 7 x 106 7 x 106 7 x 106 1.8 x 107 1.8 x 107 1.8 x 107 1.8 x 107 -

Bacteroides mengsel (CFU/100 µl) 5.40 x 104 5.40 x 105 5.40 x 106 5.40 x 105 5.40 x 106 5.40 x 107 5.40 x 108

Het Bacteroides mengsel bestaat uit de species B. fragilis, B. uniformis en B. distasonis 100 µl van het fecale staal werd telkens gespiked met 100 µl gewenste verdunning aan Bacteroides mengsel.

De fecale stammen B1 (7 x 107 CFU/ml) en B2 (1.8 x 108) werden gespiked met 0%, 1%, 10% en 50% van het Bacteroides mengsel (5.4 x 109 CFU/ml). Bacteroidetes en Firmicutes uit deze DNA oplossingen en het pure Bacteroides mengsel werden relatief gekwantificeerd via RTPCR. een relatieve RT-PCR uitgevoerd. Voor het bepalen van de relatieve hoeveelheid t.o.v. elkaar werd de 2-ΔΔCT methode gebruikt (Livak & Schmittgen, 2001). De verkregen resultaten worden weergegeven in figuur 16. Het niet gespiked B1 staal werd als referentiepunt

36

Resultaten genomen. De kwantificatie van de verschillende stalen werden dus vergeleken met het niet gespiked B1.

RT-PCR: spiking experiment 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Firmicutes Bacteroidetes

Figuur 16: Relatieve kwantificatie van Bacteroidetes & Firmicutes in fecale stalen gespiked met een Bacteroides mengsel. Relatieve kwantificatie gebeurde t.o.v. het aandeel Firmicutes in B1PL-M-T3. Bact all = puur Bacteriodetes mengsel

Er worden opnieuw quasi geen Bacteroidetes teruggevonden in de oorspronkelijke fecale stalen. Bij het staal B2 met 1% spiking wordt een laag signaal aan Bacteroidetes waargenomen (ingezoomde versie van de figuur, zie bijlage 5). De stalen B1 met 50% spiking en B2 met 10% spiking bevatten beiden 106 CFU/ml, dit stemt overeen met de waarnemingen in de figuur. Wanneer gespiked wordt met 107 CFU/ml Bacteroidetes wordt het signaal opnieuw hoger. Deze observaties tonen aan dat de afwezigheid van Bacteroidetes in het staal niet te wijten is aan de DNA extractie. We kunnen dus besluiten dat er minder dan 104 CFU/ml Bacteroidetes in de fecale stalen aanwezig zijn.

3.4. ABSOLUTE KWANTIFICATIE VAN CLOSTRIDIUM CLUSTER XI VIA RT-PCR Clostridium cluster XI is sterk vertegenwoordigd in het intestinale ecosysteem van carnivoren (Ritchie et al, 2010). Dit werd ook bij de cheeta’s B1 en B2 waargenomen na aanmaak van de clone libraries en na DGGE analyse. Daarom werd ervoor gekozen om deze groep absoluut te kwantificeren via RT-PCR. Alvorens de cluster te kwantificeren moest eerst een standaardcurve worden opgesteld. Dit gebeurde aan de hand van twee pure reinculturen: C. difficile LMG21717 en C. bifermentans LMG 3029.

37

Resultaten 3.4.1. OPSTELLEN VAN DE STANDAARDCURVE Alvorens een standaardcurve werd opgesteld, werd eerst het kiemgetal van beide Clostridium species bepaald. Het kiemgetal bedroeg 1.7 x 109 CFU/ml voor C. bifermentans en 4.7 x 108 CFU/ml voor C. difficile. DNA van de beide species werd samengevoegd en een verdunningsreeks werd gemaakt. Uiteindelijk werden 8 meetpunten (MP) verkregen, met gekende concentratie (Tabel 6), waarvan een standaardcurve werd opgesteld. De resultaten zijn terug te vinden in figuur 17. Tabel 6: Gebruikte meetpunten voor het opstellen van de standaardcurve.

Meetpunt

Concentratie

Verdunning

MP1

1.450 x 107

/

MP2

1.450 x 106

1/10

MP3

1.450 x 105

1/100

MP4

1.450 x 10

4

1/1000

1.450 x 10

3

1/10000

MP6

1.450 x 10

2

1/100000

MP7

1.450 x 101

1/1000000

MP8

1.450 x 100

1/10000000

MP5

De meetpunten zijn gemaakt door een evenredige hoeveelheid DNA van C.difficle en C. bifermentans samen te voegen

Met de bekomen fluorescente waarden van de meetpunten 3 tot 7 kon een lineaire curve worden opgesteld waarbij alle meetpunten op de curve lagen. Meetpunt 1 en 2 bevatten te veel DNA waardoor PCR inhibitie optrad en meetpunt 8 gaf een te zwak signaal. Bij het analyseren van de smeltcurve werd een piek opgemerkt in de negatieve controle ter hoogte van 79.5°C. Deze piek wijst waarschijnlijk op het vormen van primer dimeren bij afwezigheid van template DNA.

38

Resultaten

Figuur 17: RT-PCR van een mengsel van C. difficile en C. bifermentans nodig voor het aanmaken van een standaardcurve. MP= meetpunt.

39

Resultaten 3.4.2. KWANTIFICATIE VAN CLOSTRIDIUM CLUSTER XI Na de aanmaak van de standaardcurve werd Clostridium cluster XI gekwantificeerd in een aantal fecale stalen van B1 en B2. Na afloop bleek dat het fluorescente signaal van de blanco de threshold overschreed t.h.v. cyclus 33. Het opkomen van de negatieve controle liep ongeveer gelijk met het opkomen van MP8 wat kwantificatie van de species uit Clostridium cluster XI onbetrouwbaar maakt. Bij het analyseren van de smeltcurves werd voor de negatieve controle een piek waargenomen ter hoogte van dezelfde temperatuur als de fecale stalen (Fig. 18). Dit toont aan dat de blanco dezelfde smelteigenschappen heeft als de amplicons in de fecale stalen. Deze waarnemingen werden ook in navolgende RT-PCR runs geobserveerd.

Figuur 18: Smeltcurve van MP3-7 en van fecale stalen van B1 en B2. De blanco toont een piek t.h.v. de meetpunten en de fecale stalen, wat wijst op aanwezigheid van DNA.

Om de grootte van de gevormde amplicons te controleren werd het PCR product uit het capillair gehaald en een gelelektroforese uitgevoerd. Figuur 19 toont duidelijk dat er amplicons (<200 bp) aanwezig zijn.

Figuur 19 RT-PCR producten gevisualiseerd op 1% agarosegel. Amplicons werden uit de capillairen gehaald en 5 µl amplicon werd op gel geplaatst. Laantje 1 bevat het PCR product gevormd in een Bifidobacterium staal en laantje 2 het PCR product gevormd in de Blanco. M= SmartLadder

40

Resultaten 3.4.3. OPTIMALISATIE VAN DE RT-PCR PROCEDURE Aangezien de primers CXI-F en CXI-R ook voor amplificatie zorgden in stalen met nontemplate DNA (Bifidobacterium breve), werd besloten de primers in silico te testen. De specificiteit van forward en reverse primer werden via de tool TestPrime 1.0 (SILVA) getest tegen de volledige SILVA databank. Wanneer één mismatch werd toegelaten, werden de primers vooral gematcht met de Firmicutes en specifiek met de families Clostridiaceae en Peptostreptococcaceae. Op species niveau binden de primers specifiek met o.a. C. difficile, C. bifermentans, C. hiranonis, C. sordelli, C. ghonni, C. bartlettii, C. glycolicum en E. tenue. Al deze species behoren tot d Clostridium cluster XI (Collins et al, 1994). Aangezien de primers specifiek zijn voor cluster XI en in silico niet binden met Bifidobacterium spp is er waarschijnlijk een contaminatie aanwezig in de non-template stalen waardoor amplificatie toch doorgaat. Om het gecontamineerde product uit de mix te isoleren, werden een aantal componenten uit de mix vervangen. Eerst werden nieuwe primers gebruikt, maar het signaal in de negatieve controle bleef hetzelfde. Vervolgens werd ook de SensiMix vervangen door de reserve mix uit de kit. Ook hier daalde het signaal niet. Ten laatste werden ook verschillende waters getest. Uiteindelijk werden de amplicons uit de capillairen gehaald en gesequeneerd met de CXI-F en CXI-R primers. Het opzuiveren van de amplicons uit gel leverde een hoeveelheid DNA op rond de 5 ng/µl. Door de lage concentraties aan DNA was de kwaliteit van de sequenties niet echt optimaal en kon geen consensussequentie worden gecreëerd. De bekomen forward en reverse sequenties van het amplicon uit de negatieve controle en Bifidobacterium staal werden apart geBLAST tegen de EZtaxon database. Alle geBLASTe sequenties gaven een 100% hit met C. bifermentans.

3.5. ABSOLUTE KWANTIFICATIE VAN BIFIDOBACTERIUM SPP. VIA RT-PCR Ook hier werd alvorens het kwantificeren van de Bifidobacteriaceae eerst een standaardcurve aangemaakt via een verdunningsreeks van Bifidobacterium breve LMG 13208. Na het uitvoeren van RT-PCR op de fecale stalen van B1 en B2 met groep-specifieke primers tegen Bifidobacteriaceae werd geen fluorescent signaal verkregen. Dit suggereert dat Bifidobacteriaceae mogelijks afwezig zijn of aanwezig zijn in een concentratie lager dan de detectielimiet van RT-PCR.

41

Resultaten

42

Discussie DEEL 4: DISCUSSIE Anno 2013 wordt de cheeta als kwetsbaar vermeld op de Rode Lijst van Bedreigde Diersoorten (Durant et al, 2008). Dit zorgt ervoor dat populaties in gevangenschap belangrijk worden bij de conservatie van hun soort. De gezondheid van dieren in gevangenschap is echter vaak suboptimaal (stress, gastro-intestinale aandoeningen, enz.). Eén van de factoren die de gezondheid positief kan beïnvloeden is de voeding (Bechert et al, 2002). Alvorens het dieet aan te passen is er echter nood aan kennis over het intestinale ecosysteem. Microorganismen die het gastro-intestinaal kanaal koloniseren, worden immers beïnvloed door de nutriënten in de voeding en vervullen een rol in de fermentatie van de enzymatisch onverteerbare fractie van het dieet. Daarbij worden metabolieten geproduceerd die de (intestinale) gezondheid van de gastheer kunnen bevorderen (Sekirov et al, 2010). Deze thesis situeert zich tegen die achtergrond en heeft als doel een eerste inzicht te verkrijgen in de diversiteit en temporele stabiliteit van het intestinale ecosysteem van twee cheeta’s B1 en B2. Achteraf werden ook nog stalen van drie cheeta’s uit Zooparc Overloon geanalyseerd om de core microbiota te onderzoeken.

4.1. DIVERSITEIT BINNEN HET INTESTINALE ECOSYSTEEM Onderzoek naar de diversiteit van het intestinale ecosysteem van zowel mens als dier is de laatste jaren sterk gestegen. Eenmaal meer geweten is over de diverse groepen en hun functie binnen een ‘gezond’ intestinaal ecosysteem, kan dit immers vergeleken worden met een ecosysteem in dysbiose (bv. bij gastro-intestinale aandoeningen). Eenmaal enig inzicht in de diversiteit is verkregen, is het ook eenvoudiger om te zien welke veranderingen het innemen van een ander type dieet of pro- en prebiotica hebben op de samenstelling van de intestinale microbiota. Bij onderzoek naar het intestinaal ecosysteem van de mens zijn er reeds 50 fyla beschreven (Sekirov et al, 2010), waarvan er slechts twee dominant zijn en samen ≥98% van de diversiteit vertegenwoordigen: de Bacteroidetes en de Firmicutes (Ley et al, 2008b). Ook de Proteobacteria, Verrucomicrobia, Actinobacteria en Fusobacteria worden frequent teruggevonden, maar dan in veel lagere hoeveelheden (Eckburg et al, 2005). Het bestuderen van de diversiteit van de humane intestinale microbiota gebeurt voornamelijk door sequentie analyse van het 16S rRNA gen via pyrosequenering of via clone libraries (Hayashi et al, 2002; Hold et al, 2002; Suau et al, 1999). Ook moleculaire fingerprinting technieken zoals T-RFLP en DGGE werden reeds succesvol gebruikt om een deel van deze diversiteit in kaart te brengen (Nagashima et al, 2003; Zoetendal et al, 1998). Eveneens werd de samenstelling van de intestinale microbiota bij heel wat dieren onder de loep genomen. Onderzoek bij honden (Middelbos et al, 2010), varkens (Leser et al, 2002), kippen (Zhu et al, 2002), grizzly beren (Schwab et al, 2009) en katten (Handl et al, 2011; Ritchie et al, 2010) stelde vast dat het ecosysteem gedomineerd wordt door Firmicutes, maar dat ook de Bacteroidetes een predominante groep vormen. In een studie bij katten werd op basis van clone libraries van het 16S rRNA gen vastgesteld dat 87.3% van de 133 gedefinieerde OTU’s behoorden tot de Firmicutes, 7.9% tot de Proteobacteria, 2.4% tot de Bacteroidetes, 2.3% tot de Actinobacteria en 0.2% tot de Fusobacteria (Ritchie et al, 2010). In ons onderzoek, waarbij fecale stalen van cheeta’s werden onderzocht, werd eveneens

43

Discussie vastgesteld dat Firmicutes het meest abundante fylum is, gevolgd door Actinobacteria, Proteobacteria en Fusobacteria. Deze vaststellingen gebeurden door de predominante diversiteit te visualiseren via de DGGE techniek, waarna specifieke bandposities of bandklassen uit de verkregen fingerprints gelinkt werden met reeds bestaande clone libraries. Alle banden uit deze fingerprints konden worden gelinkt aan één of meerdere OTU’s uit de clone libraries, maar omgekeerd werden niet alle OTU’s die een subdominante groep vertegenwoordigen altijd teruggevonden als bandklasse in de fingerprint. Dit komt mogelijks doordat de detectielimiet van clone libraries en DGGE wellicht verschillend is. DGGE heeft een detectielimiet van ca. 106 CFU/ml, waardoor de resulterende profielen enkel een beeld geven over de predominante groepen aanwezig in het staal. Ook banden die de Actinobacteria vertegenwoordigen, werden niet terug gevonden op de DGGE gel. Een mogelijke oorzaak hiervan is het hoge GC-gehalte van deze bacteriën waardoor ze niet gescheiden worden op een 35-70% gradiënt gel. Dit probleem is te verhelpen door te werken op een andere gradiënt. Aangezien de kat vaak als modelorganisme voor carnivoren wordt gebruikt (Bell et al, 2010) kon een enigszins gelijkaardige samenstelling van de intestinale microbiota worden verwacht bij cheeta’s. Geen van de gesequeneerde klonen uit de clone libraries CL-B1 en CL-B2 toont echter similariteit met species uit het fylum Bacteroidetes. Het fylum Bacteroidetes bevat species die behoren tot de belangrijkste producenten van korte keten vetzuren, waaronder het gezondheid stimulerende metaboliet butyraat dat door de intestinale colonocyten als energiebron wordt gebruikt (Kim & Milner, 2007; Thomas et al, 2011). De initiële resultaten over Bacteroidetes, bekomen uit de fingerprints en clone libraries, werden verder aangevuld met kwantitatieve gegevens bekomen via een gerichte qPCR waarbij de Firmicutes/Bacteroidetes ratio werd bepaald. De extreem lage concentratie aan Bacteroidetes bevestigt de bevindingen uit de clone libraries. Bij het bestuderen van de intestinale microbiota van huiskatten werden doorheen verschillende studies verschillende concentraties aan Bacteroidetes vastgesteld (Ritchie et al, 2010; Tun et al, 2012). In het onderzoek van Tun et al. bleek het fylum Bacteroidetes zelfs de meest dominante groep. Het verschil in resultaten tussen deze verschillende studies is mogelijks te wijten aan de gebruikte technieken. Zo zijn er verschillende mogelijkheden tot DNA extractie uit fecale stalen (Yu & Morrison, 2004b). In onze studie werd gekozen voor een combinatie van chemische en enzymatische DNA extractie (Pitcher et al, 2008) terwijl er in de studies van Tun et al. (2012) en Ritchie et al. (2010) gekozen werd voor een mechanische DNA extractie. De lage concentraties aan Bacteroidetes kunnen dus mogelijks te wijten zijn aan het gebruik van een inefficiënte extractiemethode. Om te achterhalen of de DNA extractiemethode aan de basis lag van de lage Bacteroidetes concentraties, werd een spiking experiment uitgevoerd. De resultaten van het spiking experiment tonen aan dat via de gebruikte DNA extractie een fluorescent signaal kan bekomen worden voor Bacteroidetes. Dit lijkt erop te wijzen dat de DNA extractiemethode niet de oorzaak is van de lage hoeveelheid Bacteroidetes in de fecale stalen. Onze resultaten werden verder ondersteund door data uit de studie van Ley et al (2008a), waar <1% van de bekomen 16S rRNA sequenties uit fecale stalen van twee cheeta’s fylogenetisch gelinkt werden aan Bacteroidetes. In diezelfde studie werd een gelijkaardige Firmicutes/Bacteroidetes ratio geobserveerd bij ijsberen. De afwezigheid van Bacteroidetes is mogelijks te wijten aan het feit dat zowel cheeta’s als ijsberen behoren tot de strikte

44

Discussie carnivoren en daardoor een proteïne rijk dieet hebben (Lubbs et al, 2009; Morris, 1994). Bacteroidetes fermenteren immers voornamelijk zetmeel, cellulose en pectine in de darm (Bolam & Sonnenburg, 2011; Chassard et al, 2007; Dongowski et al, 2000; Martens et al, 2009) en deze componenten zijn minder aanwezig in dierlijk weefsel. Het waargenomen verschil in Bacteroidetes met cheeta’s kan dus eventueel liggen aan het dieet dat de katten gevoederd kregen (Lubbs et al, 2009). Aangezien het dieet van de huiskat grotendeels bestaat uit droogvoeder waar dikwijls carbohydraten zijn aan toegevoegd (Zoran, 2002), kan dit mogelijks een verklaring zijn voor het verschil in aanwezige Bacteroidetes tussen de huiskat en de cheeta. Binnen het dominante fylum Firmicutes zijn voornamelijk de Clostridiales sterk vertegenwoordigd bij zowel de mens als bij de katachtigen. Bij de mens behoort 95% van de Firmicutes tot de Clostridiales (Eckburg et al, 2005), voor de katachtigen is dit 75% (Ritchie et al, 2010). Binnen de orde Clostridiales worden bij de mens heel wat butyraat producerende bacteriën teruggevonden, die allen behoren tot de Clostridium clusters IV, XIVa of XVI (Eckburg et al, 2005; Pryde et al, 2002). Bij de katachtigen behoren de meeste species tot Clostridium cluster XI gevolgd door cluster I en XIVa (Ritchie et al, 2010). De DGGE fingerprints van onze studie toonden vier intense banden in de profielen van zowel cheeta B1 als B2. Bij het linken met de clone libraries werd opgemerkt dat twee van deze banden linken met OTU’s die een hoge sequentie similariteit vertonen met typespecies behorende tot Clostridium cluster XIVa, de andere twee banden linken met de clusters I en XI. Resultaten bekomen in ons onderzoek zijn consistent met eerdere studies die deze groepen aantoonden in carnivoren via pyrosequenering of via clone libraries van het 16S rRNA gen (Handl et al, 2011; Ritchie et al, 2010; Suchodolski et al, 2008). De banden op de fingerprints werden telkens gelinkt aan meerdere OTU’s. Dit is op zich niet verwonderlijk gezien deze taxonomische clusters vele genera herbergen, die allen een gelijkaardige 16S rRNA sequentie hebben en dus ook een gelijkaardig GC-gehalte binnen dit gen (Collins et al, 1994). Sequentie analyse van de banden uit de fingerprints bevestigde de toewijzing van de vier meest intense banden aan Clostridium cluster I, XI en XIVa. In de opgestelde clone libraries behoren de meeste klonen tot Clostridium cluster XI, waarbij de meeste ≥99% sequentie similariteit vertonen met C. hiranonis. In het humane colon bestaat 9% van de Firmicutes uit species van Clostridium cluster XI (Wang et al, 2005), maar bij de katachtigen kan dit oplopen tot 34% (Ritchie et al, 2010). De meeste klonen uit de clone libraries behorende tot Clostridium cluster I zijn fylogenetisch nauw verwant met C. perfringens. C. perfingens maakt deel uit van de intestinale core microbiota bij veel gezonde individuen, maar kan in hoge aantallen ziekte, zoals antibiotica-geassocieerde diarree, veroorzaken (Tamboli et al, 2004). Ook bij cheeta’s worden ziektes veroorzaakt door C. perfringens (Citino, 1995). De dieren opgenomen in onze studie vertoonden echter geen klinische symptomen van ziektes. Clostridium cluster I en XI bevatten zowel saccharolytische als proteolytische bacteriën (Collins et al, 1994). Het innemen van een proteïne rijk dieet kan een shift van saccharolytische naar proteolytische bacteriën teweeg brengen, wat een stijging in toxische metabolieten tot gevolg kan hebben (Lubbs et al, 2009). Studies bij ijsberen (Glad et al, 2010), grizzly beren (Schwab et al, 2011) en honden (Zentek et al, 2003) hebben eveneens aangetoond dat een proteïne rijk dieet de concentraties aan bacteriële groepen uit Clostridium cluster XI en I doet stijgen. De onderzochte cheeta’s kregen vooral paardenvlees gevoederd, wat rijk is aan proteïnen. Eveneens werd aangetoond dat

45

Discussie katachtigen die paardenvlees gevoederd kregen een hogere hoeveelheid Clostridium perfringens bevatten dan katachtigen die rundvlees gevoederd krijgen (Vester et al, 2008b). De sterke aanwezigheid van Clostridium cluster I en XI is dus niet verwonderlijk. Ook Clostridium cluster XIVa was sterk aanwezig bij de onderzochte cheeta’s. Deze cluster vormt niet enkel bij de cheeta een belangrijke groep, maar ook bij de mens. Tot deze cluster behoren enkele belangrijke producenten van butyraat, dat een belangrijke energiebron is voor de colonocyten en anti-inflammatoire en anti-carcinogene eigenschappen heeft (Barcenilla et al, 2000; Meijer et al, 2010). Het is aangetoond dat Clostridium cluster XIVa aantallen dalen bij darmaandoeningen (Fava & Danese, 2011).

4.2. TEMPORELE STABILITEIT De temporele stabiliteit van het intestinale ecosysteem werd reeds bestudeerd bij mens (Vanhoutte et al, 2006b) als dier (Simpson et al, 2002) door gebruik te maken van fingerprinting technieken. De DGGE profielen van beide cheeta’s (B1 en B2) waren vrij gelijkaardig, waardoor geen dierspecifieke clustering werd opgemerkt. De drie dominante Clostridium clusters (I, XI en XIVa) werden in zo goed als alle profielen van de tijdsreeks teruggevonden. De banden die de Clostridium clusters XI en XIVa vertegenwoordigen behouden doorheen de tijd ongeveer dezelfde intensiteit. De intensiteit van de band die linkt met Clostridium cluster I fluctueert sterk. Uit deze studie kan worden geconcludeerd dat de predominante fecale microbiota bij cheeta B1 en B2 niet verandert over een tijdspanne van twee jaar. Er werd reeds aangetoond dat deze drie clusters de predominante groepen zijn binnen de Firmicutes in het intestinale ecosysteem van carnivoren (Ritchie et al, 2010; Schwab et al, 2011). Het is dus niet verwonderlijk dat het deze groepen zijn die continue aanwezig zijn doorheen de tijd. Zowel bij B1 als B2 kwamen twee banden terug in ≥8 van de 12 profielen die gecorreleerd worden met OTU’s die fylogenetisch toegewezen zijn aan species uit de orde Lactobacillales en de genera Lactobacillus en Enterococcus. De intensiteit van de bandjes fluctueert doorheen de tijdsreeks. Opvallend is dat de banden duidelijker aanwezig zijn in de fingerprints van B1, waarbij vijf profielen een hoge bandintensiteit vertonen. Aangezien deze groepen fluctueren doorheen de tijd, rijst de vraag of het dieet invloed zou kunnen hebben op aan- of afwezigheid van deze species. Cheeta B1 kreeg op vier van de 12 tijdstippen van staalname prooi (= karkas) gevoederd. De vijf profielen van B1 die de sterkste intensiteit tonen voor de banden gelinkt aan Lactobacillales zijn fingerprints van fecale stalen verzameld op het moment dat de dieren prooi gevoederd kregen. Uit de data van B2 kan dit echter niet worden afgeleid. De temporele variatie van Lactobacillus werd ook waargenomen in een humane studie (Vanhoutte et al, 2006b). Bij mensen is de fecale microbiota voor minder dan 1% opgebouwd uit Lactobacillus spp. (Sghir et al, 2000). Aangezien de groep subdominant aanwezig is bij mensen is deze nauwelijks te zien op de DGGE fingerprints wanneer het totale ecosysteem wordt gevisualiseerd. Lactobacillus is een interessante groep en wordt vaak verwerkt in gefermenteerd voedsel en probiotica omwille van zijn gezondheid promotend effect (Rastall, 2004). Het is echter aangetoond dat lactobacillen natuurlijke inwoners zijn van het intestinale ecosysteem van carnivoren, waarbij ze predominant zijn in carnivoren in tegenstelling tot omnivoren en herbivoren (Endo et al, 2010). Enterococcen

46

Discussie komen in lagere aantallen voor dan lactobacillen in het humane intestinale ecosysteem en worden eveneens gebruikt in probiotica (Vanhoutte et al, 2006b). Lactobacillen en enterococcen zijn potentieel interessante groepen, omwille van hun gezondheidsbevorderend effect. Ze zijn belangrijke producenten van lactaat, wat door andere lactaat consumerende bacteriën gebruikt wordt als substraat en leidt tot de productie van butyraat (De Vuyst & Leroy, 2011). Sinds ze bij mensen in lage concentraties aanwezig zijn, is het aangewezen om deze banden verder te analyseren via sequentie analyse. De fecale fingerprint van B2 op tijdstip 4 (T4) wijkt sterk af van de andere fingerprints binnen deze tijdsreeks. Dit komt mogelijks doordat het dier op dit moment van staalname ziek was. Zowel Bacteroidetes als Bifidobacterium spp. waren afwezig in de DGGE fingerprints van B1 en B2 als in de clone libraries CL-B1 en CL-B2 gecreëerd met DNA uit één fecaal staal. Dit kan enerzijds betekenen dat Bacteroidetes en Bifidobacterium spp. aanwezig kunnen zijn in hogere aantallen in stalen verzameld op een ander tijdstip. Anderzijds kan de afwezigheid ook wijzen op het falen van een gebruikte techniek op één van deze groepen. Kwantificatie van Bacteroidetes leverde in alle stalen lage aantallen op. Voor Bifidobacterium spp. werd er geen signaal gemeten. Er werden in de clone libraries van beide cheeta’s wel andere Actinobacteria teruggevonden (voornamelijk de familie Coriobacteriaceae). De afwezigheid van Bifidobacterium spp. in carnivoren en katachtigen is reeds bevestigd in een aantal studies (Endo et al, 2010; Handl et al, 2011; Ritchie et al, 2008). In één studie zijn ze er echter wél in geslaagd om Bifidobacterium spp. te detecteren in fecale stalen van katten via FISH analyse (Inness et al, 2007). Het zou kunnen dat de afwezigheid van Bifidobacterium spp. in onze fecale stalen te wijten is aan de gebruikte DNA extractie methode of aan een PCR bias. Een mogelijke oplossing is om ook hier een spiking experiment uit te voeren of een PCR met groep-specifieke primers i.p.v. met universele primers te optimaliseren. Bifidobacterium spp. zou ook minder voorkomen in het intestinale ecosysteem van dieren die voornamelijk een proteïne rijk dieet krijgen (Lubbs et al, 2009). De aanwezigheid van Bifidobacterium spp. in het intestinaal ecosysteem van huiskatten kan mogelijks toegeschreven worden aan de toevoeging van carbohydraten aan een commercieel kattevoeder (Zoran, 2002). Beide cheeta’s in deze studie kregen echter rauw vlees gevoederd gesupplementeerd met een vitaminen- en een mineralenmix. Kwantificatie van de Clostridium cluster XI verliep nogal problematisch. Door het opkomen van de negatieve controle gedurende dit experiment werden geen betrouwbare waarden verkregen. Het opkomen van de negatieve controle ligt mogelijks aan de aanwezigheid van een contaminatie in één van onze gebruikte producten. Deze vermoedens zijn er omdat na sequentie analyse van de negatieve controle een match wordt gevonden met C. bifermentans. Dit species werd gebruikt in het opstellen van de standaardcurve.

4.3. ONDERZOEK NAAR CORE MICROBIOTA In het laatste deel van deze masterproef werden fecale stalen verzameld op verschillende tijdstippen van drie cheeta’s uit een andere zoo, Zooparc Overloon (Nederland), tevens aan analyse onderworpen. Ook in deze drie tijdsreeksen werd opgemerkt dat de Clostridium clusters XI en XIVa net zoals bij de Belgische dieren stabiel aanwezig zijn in de tijd. De band die linkte met OTU2 en sequentie similariteit vertoonde met C. perfringens (cluster I) was

47

Discussie echter een fluctuerende groep bij de dieren uit Nederland en eerder een stabiele groep bij de dieren uit België. De oorzaak ligt mogelijks bij de voeding aangezien de concentratie C. perfringens correleert met de concentratie proteïnen in de voeding (Schwab et al, 2011). Ook de banden die linkten met de Lactobacillales in B1 en B2 werden niet terug gevonden bij de dieren uit Nederland. De dieren uit België krijgen vooral paardenvlees gevoederd, terwijl de dieren uit Nederland een gevarieerd dieet krijgen dat bestaat uit kip, konijn, rund en paardenvlees. De dieren uit Nederland kregen eveneens frequenter prooi gevoederd wat een hogere inname van dierlijke vezels tot gevolg heeft. Daar waar rundvlees leidt tot een hogere concentratie van geproduceerde korte keten vetzuren, zal paardenvlees leiden tot hogere fecale concentraties aan E. coli, C. perfringens en Lactobacillus (Vester et al, 2010). Het dendrogram van de profielen van de cheeta’s uit Nederland wijst opnieuw uit dat er geen dierspecifieke clustering is. Dit wijst erop dat dezelfde omgeving en dieet kunnen zorgen voor een gelijkaardig intestinaal ecosysteem in de dieren. Uit deze resultaten kunnen we besluiten dat Clostridium clusters XI en XIVa mogelijks tot de core microbiota behoren van de cheeta. De core microbiota is slechts onderzocht in vijf dieren. Om meer zekerheid hierover te verkrijgen dienen echter meer fecale stalen van een grotere populatie cheeta’s onderzocht worden.

4.4. CONCLUSIE Uit de data verkregen tijdens het uitvoeren van deze masterproef kunnen we besluiten dat het intestinale ecosysteem voornamelijk bestaat uit Firmicutes, waarbij Clostridium clusters I, XI en XIVa de predominante groepen zijn. Deze groepen zijn temporeel stabiel en worden teruggevonden in de intestinale microbiota van de vijf onderzochte cheeta’s, wat een indicatie kan zijn dat deze groepen behoren tot de intestinale core microbiota van cheeta’s. Het terugvinden van deze drie groepen is consistent met data verkregen uit studies op huiskatten en andere carnivoren. Naast deze drie stabiele groepen werden bij de vijf cheeta’s heel wat subdominante groepen waargenomen die fluctueren doorheen de tijd en waarvan de aan en afwezigheid mogelijks te wijten is aan het dieet. Eén van de meest interessantste groepen zijn Lactobacillales, die sterk aanwezig zijn in de helft van de fingerprints van B1. Dezelfde banden worden teruggevonden in B2 maar bij een veel lagere intensiteit en zijn afwezig bij de dieren uit Nederland. Drie groepen werden gekwantificeerd via RT-PCR. Voor Clostridium cluster XI werden geen resultaten bekomen door het nog niet op punt staan van de RT-PCR methode. Vertegenwoordigers van Bacteroidetes kwamen voor, maar in lage aantallen, terwijl Bifidobacterium afwezig was in de fecale stalen. De lage hoeveelheden Bacteroidetes en de afwezigheid van Bifidobacterium spp. in de fecale stalen is echter tegenstrijdig met resultaten bekomen uit studies bij de huiskat. Dit suggereert dat data bekomen uit studies op de huiskat niet altijd geëxtrapoleerd kunnen worden naar de cheeta. Om een beter idee te krijgen over de core microbiota is het aangewezen om een grotere populatie van cheeta’s in gevangenschap te bestuderen. Uiteindelijk zouden de bekomen resultaten kunnen bijdragen tot het optimaliseren van het dieet voor de cheeta’s waardoor hun (intestinale) gezondheid verbeterd kan worden.

48

Materiaal en Methoden DEEL 5: MATERIAAL EN METHODEN 5.1. COLLECTIE VAN FECALE STALEN Fecale stalen gebruikt in deze thesis werden verzameld van twee mannelijke cheeta’s (B1 en B2, °2001) uit Planckendael (België) over een periode van 28 maanden. De tijdsreeks was echter niet volledig voor beide dieren. Voor cheeta B1 ontbreken fecale stalen op tijdstip 9 en 12, voor B2 werden geen stalen verzameld op tijdstippen 2 en 10. De cheeta’s delen zowel het binnen als buitenverblijf. Ze krijgen dagelijks een stuk paardenvlees zonder bot (2kg/dag/dier) gesupplementeerd met een vitamine en mineralenmix (Carnicon®, Aveve, Leuven, België) en af en toe een ongesupplementeerd volledig konijn. Eveneens werd er gewerkt met fecale stalen verzameld van één vrouwelijke (NL11, °2005) en twee mannelijke (NL9, °2000 en NL10, °2002) cheeta’s. De mannetjes delen zowel het binnen als buitenverblijf maar zijn gescheiden van het vrouwtje. De dieren krijgen 1x per dag konijn, rundvlees, paardenvlees of kipfilet gevoederd. Er werden geen gezondheidsproblemen gerapporteerd en alle dieren kregen een profylactische behandeling voor interne parasieten (Horseminth®, Pfizer, Brussel, België). De fecale stalen van alle dieren werden onmiddellijk na defecatie gecollecteerd in plastic tubes, fecaal gescoord en op droogijs geplaatst. In het labo werden ze bewaard op -80°C tot verdere analyses.

5.2. HOMOGENISATIE EN TOTALE DNA EXTRACTIE Alvorens DNA te extraheren, werd 25 g van het ontdooide fecale staal gehomogeniseerd in 225 ml pepton fysiologisch water met behulp van een stomacher. De gehomogeniseerde oplossing werd door een Büchnerfilter gehaald om grote onzuiverheden zoals gras, haar en botten te verwijderen. Vervolgens werd het gehomogeniseerde staal gecentrifugeerd en geresuspendeerd in 5 ml 1x TE-buffer. Uiteindelijk werd de oplossing verdeeld in 1 ml aliquots en bewaard op -80°C. Als DNA extractie methode werd gekozen voor een gemodificeerde versie (zie bijlage 6) van het Pitcher protocol (Pitcher et al, 2008) dat reeds succesvol werd toegepast op fecale stalen (Joossens et al, 2011; Vanhoutte et al, 2006b). Het voordeel van de Pitcher extractie methode is dat het in staat is zowel DNA uit G+ en G- bacteriën te extraheren. De kwaliteit van het DNA is ook beter in vergelijking met bijvoorbeeld alkalische lyse. Het moleculair gewicht van het DNA werd gecontroleerd door het DNA en een SmartLadder (200-10000bp) op een 1% agarose gel te plaatsen en een gelelektroforese (75V, 45 min) uit te voeren. De bandjes werden gevisualiseerd onder blauw licht na kleuring met SYBRSafe. DNA kwaliteit en kwantiteit werden bepaald door een meting uit te voeren met de spectrofotometer op 234, 260 en 280 nm. In navolgende analyses werd verder gewerkt met een 1/10 verdunning van het DNA in 1x TE buffer. Het DNA wordt bewaard op -20°C.

49

Materiaal en Methoden 5.3. V3-16S rRNA PCR AMPLIFICATIE DGGE analyse wordt uitgevoerd op kleine DNA fragmenten. Daarom werd op de te analyseren stalen eerst een amplificatie PCR van de hypervariabele V3 regio van het 16S rRNA gen uitgevoerd, wat amplicons van 194bp opleverde (Yu & Morrison, 2004a). Amplificatie van de V3 regio gebeurde door gebruik te maken van de geconserveerde primers F+GC/F357 en R518 (Tabel 7) (Yu & Morrison, 2004b). De F357 primer bevat een GC klem van 40 bp aan het 5’ uiteinde van de primer. De aanwezigheid van een GC klem is noodzakelijk bij het scheiden van de amplicons op DGGE gels. Tabel 7: Primers gebruikt doorheen deze studie.

Experiment

Primer

Primer sequentie (5’-3’)

V3-16S rRNA amplificatie

F357 +GC

GC-klema CCTACGGGAGGCAGCAG ATTACCGCGGCTGCTGG ACTCCTACGGGAGGCAGCAG

Firmicutes/Bact eroidetes ratio

RT-PCR

a

R518 Eub338F Bact934F Bact1060R Firm934F Firm1060R CXI-F CXI-R g-Bifid-F f-Bifid-R

Annealing temperatuur 55

Alle Bacteriën

55 67.9

Alle Bacteriën Alle Bacteriën

60.4 66.5 63.9 66.5 55.7 59.6 65 65

Bacteroidetes Bacteroidetes Firmicutes Firmicutes C. cluster XI C. cluster XI Bifidobacterium spp. Bifidobacterium spp.

GGARCATGTGGTTTAATTCGATGAT AGCTGACGACAACCATGCAG GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGCA AGCTGACGACAACCATGCAC ACGCTACTTGAGGAGGA ACGCTACTTGAGGAGGA CTCCTGGAAACGGGTGG GGTGTTCTTCCCGATATCTACA

Target

GC-klem sequentie: CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGG

Amplificatiereacties werden uitgevoerd op het GeneAmp PCR systeem 9700 (Applied Biosystems, VSA) in 50 µl reacties. Elke reactiemix bevat 6 µl 10x PCR buffer, 2.5 µl 2mM dNTP’s, 2.5 µl 10 µg/ml bovine serum albumin (BSA), 2 µl van elke primer (5µM), 0.25 µl 5 U/µl AmpliTaq®, 1 µl 50 ng/µl template en 33.75 µl mQ water. Het PCR programma is terug te vinden in tabel 8. Een negatieve controle, die alle PCR componenten bevat met uitzondering van het template DNA, werd bij elke amplificatieronde ingesloten. Alvorens de amplicons via DGGE gel te analyseren, werd 5 µl van elk PCR product onderworpen aan een gelelektroforese (75 V, 45 min) op een 1% agarosegel om correcte amplificatie van de V3 regio na te gaan. Amplicons en de SmartLadder werden gevisualiseerd onder blauw licht na kleuring met SYBRSafe. Een meer gedetailleerd protocol van de V3-16S rRNA amplificatie is terug te vinden in bijlage 7.

50

Materiaal en Methoden Tabel 8: PCR programma gebruikt bij V3-16S rRNA amplificatie.

PCR programma*

30 cycli

Initiële denaturatie Denaturatie Annealing Elongatie Finale elongatie

Temperatuur (°C) 95 95 55 72 72

Tijd (s) 60 30 45 60 60

Alle reacties werden uitgevoerd op het GeneAmp PCR systeem 9700 (Applied Biosystems, VSA)

5.4. DGGE ANALYSE Protocol DGGE Een DGGE gel is een polyacrylamide gel, bestaande uit 8% acrylamide (Biozym, EC890) in 1x TE-buffer, die een stijgende denaturerende gradiënt bevat. De gradiënt in de gel werd verkregen door een 100% denaturerende acrylamide oplossing te mengen met een acrylamide oplossing die geen denaturerende agentia bevat. In deze masterproef werd standaard gebruik gemaakt van een 35-70% gradiëntgel om amplicons te scheiden. Wanneer echter een zoom nodig was op een bepaalde regio van de fingerprint werd gekozen voor een nauwere gradiënt. Na het bepalen van de juiste gradiënt werd aan de acrylamide oplossing APS en TEMED toegevoegd, nodig om de gel te polymeriseren. De laag en hoog denaturerende acrylamide oplossing werden gradueel gemengd met behulp van een pomp. De gels kregen dan minstens 2u de tijd om te polymeriseren, alvorens een nietdenaturerende stacking gel (± 5 ml) bovenop de scheidingsgel gepipetteerd werd. Na 30 min polymerisatie van de stacking gel werden de PCR amplicons geladen en werd een elektroforese uitgevoerd in 1x TAE buffer op 70V gedurende 16,5u bij een constante temperatuur van 60°C. DGGE gels werden achteraf gekleurd in een SYBRGold bad gedurende 45 min waarna bandjes gevisualiseerd werden onder UV licht. Een meer gedetailleerd protocol voor de aanmaak van een gel en het uitvoeren van de elektroforese is terug te vinden in bijlage 8. DGGE band extractie Bij het linken van de OTU’s aan de fingerprints werden enkele random gekozen bandjes uit de gel geëxtraheerd om de identiteit van de bandjes te achterhalen via sequentie analyse. Dit werd gedaan door de bandjes te visualiseren onder UV licht en met een pipet een stukje gel op te nemen. Het stukje gel werd overnacht opgelost in 40 µl 1x TE buffer bij 4°C. Eenmaal opgelost werd opnieuw een V3-16S rRNA PCR uitgevoerd met de primers F+GC/F357 en R518 en werden de amplicons terug op DGGE gel gescheiden om de zuiverheid van de bandjes te controleren. Na controle van de zuiverheid werd een reamplificatie van het bandje via het klassieke V3 PCR-programma uitgevoerd (tabel 7). Deze keer werden de primers F357 (zonder GC klem) en R518 gebruikt. Na amplificatie werd de grootte van de amplicons gecontroleerd via agarose gelelektroforese (zie sectie 5.2.). De intensiteit van het amplicon werd bepaald door het amplicon te vergelijken met de verschillende sterktes van de bandjes aanwezig in de SmartLadder. De intensiteit van het bandje bepaalt het elutievolume waarin amplicons later worden opgelost.

51

Materiaal en Methoden Voor sequentie PCR werden de amplicons eerst opgezuiverd door ze over te brengen in welletjes van een Macherey-Nagel plaat. De welletjes werden vacuüm getrokken waardoor resten van de PCR reactiemix werden weggezogen en de amplicons in de welletjes achterbleven. De amplicons werden gewassen met 100 µl MQ waarna de welletjes opnieuw vacuüm werden getrokken. Uiteindelijk werden de amplicons geresuspendeerd in het gewenste elutievolume en overgebracht in een nieuw eppendorfje. Kwantificatie van de amplicons gebeurde door 1 µl DNA te analyseren via de NanoDrop 2000 spectrofotometer (Thermo Scientific). Na de opkuis is het DNA klaar voor het ondergaan van een sequentie PCR (zie sectie 5.7.). Data analyse: Bandmatching Bij het laden van de PCR producten op een DGGE gel worden er eveneens drie referentie merkers opgeladen. Via deze merkers worden de gels genormaliseerd in het programma Bionumerics 5.10 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, België). Na normalisatie en aanduiden van de banden werd een dendrogram van de verschillende DGGE fingerprints gecreëerd. Het dendrogram werd opgesteld met de UPGMA methode gebaseerd op de DICE gelijkheidscoëfficiënt (gebaseerd op de bandjes) of de Pearson correlatiecoëfficiënt (gebaseerd op de curve). Het bepalen van de verschillende bandklassen werd eveneens uitgevoerd in Bionumerics. Bandklasse analyse werd uitgevoerd door de ‘bandmatching tool’ te gebruiken. Hierbij werd gekozen voor en optimalisatie van 0.5% en een positie tolerantie van 1%. De optimalisatie parameter wordt gebruikt om fingerprints ten opzichte van elkaar te positioneren, zodat zoveel mogelijk banden op dezelfde hoogte komen te staan. De positie tolerantie parameter geeft de afstand weer die bandjes op dezelfde hoogte in twee fingerprints mogen afwijken om toch tot dezelfde bandklasse te behoren.

5.5. SPIKING EXPERIMENT Biologisch materiaal Voor het uitvoeren van dit experiment werden twee fecale stalen, B1-PL-M-T3 en B2-PL-MT3, gespiked met een mengsel van Bacteroides species met gekende concentratie. Om de concentratie van het mengsel te achterhalen, werden drie Bacteroides species opgekweekt: Bacteroides fragilis R-25397, Bacteroides distasonis R-25406 en Bacteroides uniformis R25405 (BCCM/LMG collectie, Gent, België). De species werden gecultiveerd bij 37°C op ‘Reinforced Clostridial Medium’ (RCM) in een anaërobe kast. De culturen werden minimum 2x verjongd alvorens de species massief te enten. Na 24 u incubatie werden de kolonies geoogst en werd een verdunningsreeks (100-10-8) aangemaakt in pepton fysiologisch water die vervolgens uitgeplaat werd op RCM medium. Op dezelfde wijze werd ook een verdunningsreeks van de fecale stalen van de cheeta’s B1 en B2 uitgeplaat. De gevormde kolonies op de platen van de verdunningsreeks werden geteld na 24u (voor de fecale stalen) of na 48u (voor de reinculturen) om het aantal CFU/ml te bepalen. De drie Bacteroides species werden opnieuw uitgeplaat, 2x verjongd en uiteindelijk massief geënt. Een dense suspensie werd voor elk species aangemaakt in 2ml pepton fysiologisch water 24u na de massieve enting. Van elke celsuspensie werd 1 ml genomen waardoor uiteindelijk een 3 ml Bacteroides mengsel, met een concentratie van 5.4 x 109 CFU/ml, werd verkregen. Van dit

52

Materiaal en Methoden mengsel werd een verdunningsreeks gemaakt zodat aan de fecale stalen de gewenste hoeveelheid Bacteroides species kon worden toegevoegd. Op deze manier werden de fecale stalen B1-PL-M-T3 (7 x 107 CFU/ml) en B2-PL-M-T3 (1.8 x 108 CFU/ml) voor 1%, 10% en 50% gespiked met het Bacteroides mengsel. Uiteindelijk werd DNA geëxtraheerd via het gemodificeerde Pitcher protocol. Kwaliteitscontrole gebeurde via agarose gelelektroforese en OD-meting. Tabel 9 geeft de samenstelling van de gebruikte stalen weer. Tabel 9: Spiking fecale stalen met mengsel Bacteroides spp.

Fecaal staal (CFU/100 µl)

Bacteroides mengsel (CFU/100 µl)

7 x 10

6

-

B1 (1% spiking)

7 x 10

6

5.40 x 104

B1 (10% spiking)

7 x 106

5.40 x 105

B1 (50% spiking)

7 x 106

5.40 x 106

B2 (0% spiking)

1.8 x 107

-

B2 (1% spiking)

1.8 x 107

5.40 x 105

B2 (10% spiking)

1.8 x 107

5.40 x 106

B2 (50% spiking)

1.8 x 107

5.40 x 107

-

5.40 x 108

B1 (0% spiking)

Bacteroidetes mengsel (100% spiking)

100 µl van het fecale staal werd telkens gespiked met 100 µl gewenste verdunning van het Bacteroides mengsel.

Relatieve kwantificatie van Firmicutes en Bacteroidetes via RT-PCR Zowel het totale aantal bacteriën als het aandeel Firmicutes en Bacteroidetes in het DNA werd gekwantificeerd op Lightcycler 480II systeem (Roche) in 20 µl reacties. Kwantificatie van het totale aantal bacteriën aanwezig in de stalen gebeurde door gebruik te maken van de universele primers Eub338F en 518R. Firmicutes en Bacteroidetes werden respectievelijk gekwantificeerd via de groepspecifieke primers Firm 934F/Firm 1060R en Bact 934F/Bact 1060R (Tabel 7). De RT-PCR reactiemix bevat 10 µl 2x SensiMix SYBR NO-ROX, 0.3 µl forward primer, 0.3 µl reverse primer, 3 µl template en 6.4 µl mQ. Het gebruikte PCR programma is terug te vinden in tabel 10. Het berekenen van de relatieve hoeveelheid Firmicutes en Bacteroidetes gebeurde via de 2-ΔΔCT methode (Livak & Schmittgen, 2001). Tabel 10: PCR programma gebruikt bij de relatieve kwantificatie van Firmicutes en Bacteroidetes.

PCR programma:

45 cycli

Temperatuur (°C)

Tijd (s)

Initiële denaturatie

95

300

Denaturatie

95

10

Annealing

60

30

Elongatie

72

1

Smelt curve

95-70-95

0-30-0

53

Materiaal en Methoden 5.6. ABSOLUTE KWANTIFICATIE CLOSTRIDIUM CLUSTER XI VIA RT-PCR Biologisch materiaal Alvorens over te gaan tot de absolute kwantificatie van Clostridium cluster XI via RT-PCR werd eerst een standaardcurve opgesteld met de species Clostridium difficile LMG21717 en Clostridium bifermentans LMG 3029 (BCCM/LMG collectie, Gent, België). Na de reinculturen 3x te verjongen werd een massieve ent uitgevoerd (9 platen per species). Na 24u werd het materiaal van 6 platen geoogst en gesuspendeerd in 7 ml pepton fysiologisch water. DNA werd uit de cellen geëxtraheerd via het gemodificeerde Pitcher protocol (sectie 5.2) waarbij de tweede chloroform stap werd weggelaten. Van het verkregen DNA werd een verdunningsreeks gemaakt (100-10-7 = meetpunt (MP) 1-8). Deze meetpunten werden gebruikt om de standaardcurve op te stellen. Eenmaal de standaardcurve succesvol werd aangemaakt, werd Clostridium cluster XI gekwantificeerd in alle fecale stalen afkomstig van cheeta’s B1 en B2. RT-PCR Kwantitatieve amplificatie en detectie van het fluorescente signaal werd uitgevoerd op het Roche Light Cycler®Carousel-Based System (Roche Applied Science) in 20 µl reacties. De PCR reactiemix bevat 2 µl van elke primer (5µM), 4 µl SensiMix lite, 1.5 µl Enzyme mix, 0.1 µl SYBR green I solution, 2µl template en 8.1 µl mQ. De SensiMix, EnzymeMix en SYBR green zijn oplossingen uit de SensiMix Capillary Kit (Bioline). De primers CXI-F en CXI-R specifiek voor amplificatie van leden uit de Clostridium Cluster XI, werden gebruikt (Tabel 7) (Song et al, 2004). Het PCR programma is terug te vinden in tabel 11. SYBR green fluorescentie werd gemeten na elke amplificatieronde. Smeltcurve analyse werd uitgevoerd door de temperatuur traag van 70°C naar 95°C te doen stijgen, waarbij het fluorescente signaal continue gemeten werd. Een negatieve controle, die alle RT-PCR componenten bevat met uitzondering van het template DNA, werd bij elke run ingesloten. De standaardcurve werd opgesteld via 8 meetpunten bestaande uit een verdunningsreeks van een mengsel van de species Clostridium difficile LMG21717 en Clostridium bifermentans LMG 3029. De stalen werden telkens in triplicaat opgeladen waarbij de variatie tussen de stalen niet hoger mocht zijn dan 0.5 Ct. Voor een meer gedetailleerd protocol zie bijlage 12. Tabel 11: PCR programma gebruikt bij de absolute kwantificatie van C. cluster XI.

PCR programma:

45 cycli

Temperatuur (°C)

Tijd (s)

Initiële denaturatie

95

120

Denaturatie

95

20

Annealing

60

30

Elongatie

72

45

Smelt curve

95-70-95

0-30-0

54

Materiaal en Methoden Opzuiveren amplicons Na het uitvoeren van de RT-PCR op de negatieve controles of andere non-template stalen (bv. Bifidobacterium spp.), werd steeds een fluorescent signaal gemeten. Om de identiteit van de gevormde amplicons te achterhalen werd een sequentie analyse uitgevoerd. Hiervoor werden de capillairen gebroken en werden de amplicons overgebracht in een eppendorf. Van deze amplicons werd 5 µl gemengd met 2 µl loading dye (6x) en gecontroleerd op een 1 % agarosegel. De gel werd gekleurd in ethidiumbromide (EtBr) en bandjes werden gevisualiseerd onder UV licht, waarna ze werden uitgesneden met een scalpel. Het DNA werd uit de gel gehaald en opgezuiverd via de QIAXII® Gel Extraction Kit (Qiagen) (Bijlage 10). De geëxtraheerde amplicons werden gekwantificeerd via de Qubit® 2.0 Fluorometer (Invitrogen) door gebruik te maken van de Qubit® dsDNA BR assay Kit (Invitrogen) (Bijlage 11).

5.7. ABSOLTUE KWANTIFICATIE BIFIDOBACTERIUM SPP. VIA RT-PCR Biologisch materiaal Alvorens over te gaan tot de absolute kwantificatie van Bifidobacterium spp. via RT-PCR werd eerst een standaardcurve opgesteld met het species Bifidobacterium breve LMG 13208 (BCCM/LMG collectie, Gent, België). De standaardcurve werd op dezelfde manier opgesteld als beschreven in 5.6. RT-PCR Kwantificatie werd eveneens uitgevoerd op het Roche Light Cycler®Carousel-Based System door gebruik te maken van dezelfde mix als in 5.6. De primers gebruikt voor kwantificatie van Bifidobacteriaceae zijn g-Bifid-F en g-Bifid-R (tabel 7) (Matsuki et al, 2004). Het gebruikte PCR programma is terug te vinden in tabel 12. Een volledig protocol is terug te vinden in bijlage 12. Tabel 12: PCR programma gebruikt bij de absolute kwantificatie van Bifidobacteriaceae.

PCR programma:

45 cycli

Temperatuur (°C)

Tijd (s)

Initiële denaturatie

95

300

Denaturatie

95

0

Annealing

60

5

Elongatie

72

23

Smelt curve

95-70-95

0-30-0

55

Materiaal en Methoden 5.8. SEQUENTIE ANALYSE De stappen die hier worden uitgelegd werden toegepast op de gezuiverde amplicons afkomstig uit het DGGE en het RT-PCR experiment. Sequentie PCR De opgezuiverde amplicons werden onderworpen aan een 16S rRNA sequentie PCR door gebruik te maken van de ABI PRISM® BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit. De sequentie PCR werd uitgevoerd op het GeneAmp PCR Systeem 9700 (Applied Biosystems, VSA) in 10 µl reacties. De reactiemix bevat 1.857 µl 5x sequentie PCR buffer, 3 µl 4 µM primer, 0.286 µl Big Dye 3.1, 1.857 µl mQ en 3 µl amplicons. Voor het sequeneren van de amplicons afkomstig van de DGGE gels werden de primers F357 (zonder GC klem) en R518 gebruikt. De primers CXI-F en CXI-R werden gebruikt bij sequentie PCR van de amplicons afkomstig uit het RT-PCR (Tabel 7). Het gebruikte PCR programma wordt weergegeven in tabel 13. Tabel 13: PCR programma gebruikt bij 16S rRNA sequentie PCR.

PCR programma

30 cycli

Temperatuur (°C)

Tijd (s)

Denaturatie

96

15

Annealing

35

1

Elongatie

60

4

Opzuiveren van de sequentie reacties Alvorens de korte fragmenten te sequeneren via de PRISM® 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, VSA) werden de sequenties gezuiverd van sequentie PCR componenten (zouten, dNTP’s, niet geïncorporeerde BigDye,…) m.b.v. de BigDye® XTerminator™ Purification Kit. Een meer gedetailleerd protocol over de sequentie PCR en opzuivering is terug te vinden bijlage 9. Data analyse Assemblage van de sequenties, bekomen met forward en reverse primers, werd uitgevoerd in Bionumerics v5.10. Beide sequenties werden ingeladen en sequentieprofielen werden bekeken. De onduidelijke uiteinden van de sequenties werden verwijderd zodat deze niet in rekening gebracht worden bij het assembleren. Regio’s in de sequentie die niet bruikbaar zijn werden ook geïnactiveerd. Ten laatste werden eveneens de bindingsplaatsen voor de gebruikte primers uit de sequentie verwijderd, zodat deze niet tot de consensus sequentie zouden behoren na assemblage. De gekuiste sequenties van forward en reverse primer werden gealigneerd, waarbij de standaard parameters werden gebruikt, en een consensus sequentie werd gecreëerd. De verkregen sequentie werd geBLAST tegen de EZtaxon database en de RDP database om een idee te krijgen over de identiteit van de sequentie. Wanneer er geen consensus kon worden aangemaakt door de slechte kwaliteit van de sequenties, werd de forward en reverse sequentie apart geBLAST. .

56

Referenties

REFERENTIES Adékambi T, Drancourt M, Raoult D (2009) The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends in microbiology 17: 37-45 Bäckhed F, Ley RE, Sonnenburg JL, Peterson DA, Gordon JI (2005) Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science 307: 1915-1920 Barcenilla A, Pryde SE, Martin JC, Duncan SH, Stewart CS, Henderson C, Flint HJ (2000) Phylogenetic relationships of butyrate-producing bacteria from the human gut. Applied and environmental microbiology 66: 1654-1661 Bates JM, Akerlund J, Mittge E, Guillemin K (2007) Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota. Cell host & microbe 2: 371-382 Bechert U, Mortenson J, Dierenfeld ES, Cheeke P, Keller M, Holick M, Chen TC, Rogers Q (2002) Diet composition and blood values of captive cheetahs (Acinonyx jubatus) fed either supplemented meat or commercial food preparations. Journal of Zoo and Wildlife Medicine 33: 16-28 Becker A. (2013) Manuscript transmitted. Bell KM, Tucker LA, Thomas DG (2010) Spot the Difference: Using the domestic cat as a model for the nutritional management of captive cheetahs: Nottingham University Press. Beutler B, Rietschel ET (2003) Innate immune sensing and its roots: the story of endotoxin. Nature Reviews Immunology 3: 169-176 Bezirtzoglou E (1997) The intestinal microflora during the first weeks of life. Anaerobe 3: 173-177 Blaut M, Collins M, Welling G, Dore J, Van Loo J, De Vos W (2002) Molecular biological methods for studying the gut microbiota: the EU human gut flora project. British Journal of Nutrition 87: 203-212 Bolam DN, Sonnenburg JL (2011) Mechanistic insight into polysaccharide use within the intestinal microbiota. Gut Microbes 2: 86-90 Bottari B, Ercolini D, Gatti M, Neviani E (2006) Application of FISH technology for microbiological analysis: current state and prospects. Applied microbiology and biotechnology 73: 485-494 Brown EW, Olmsted RA, Martenson JS, O'Brien SJ (1993) Exposure to FIV and FIPV in wild and captive cheetahs. Zoo biology 12: 135-142 Chassard C, Goumy V, Leclerc M, Del'homme C, Bernalier‐Donadille A (2007) Characterization of the xylan‐degrading microbial community from human faeces. FEMS microbiology ecology 61: 121-131 Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR (2005) Real-time quantification of microRNAs by stem–loop RT–PCR. Nucleic acids research 33: e179-e179 Chiller K, Selkin BA, Murakawa GJ (2001) Skin microflora and bacterial infections of the skin. In Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings, Vol. 6, pp 170-174. Cole J, Wang Q, Cardenas E, Fish J, Chai B, Farris R, Kulam-Syed-Mohideen A, McGarrell D, Marsh T, Garrity G (2009) The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic acids research 37: D141-D145 Collins M, Lawson P, Willems A, Cordoba J, Fernandez-Garayzabal J, Garcia P, Cai J, Hippe H, Farrow J (1994) The phylogeny of the genus Clostridium: proposal of five new genera and eleven new species combinations. International journal of systematic bacteriology 44: 812-826

57

Referenties Cummings J, Pomare E, Branch W, Naylor C, Macfarlane G (1987) Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood. Gut 28: 1221-1227 De Vuyst L, Leroy F (2011) Cross-feeding between bifidobacteria and butyrate-producing colon bacteria explains bifdobacterial competitiveness, butyrate production, and gas production. International journal of food microbiology 149: 73-80 Depauw S, Hesta M, Whitehouse‐Tedd K, Vanhaecke L, Verbrugghe A, Janssens G (2011) Animal fibre: The forgotten nutrient in strict carnivores? First insights in the cheetah. Journal of animal physiology and animal nutrition Desai AR, Musil KM, Carr AP, Hill JE (2009) Characterization and quantification of feline fecal microbiota using cpn60 sequence-based methods and investigation of animal-to-animal variation in microbial population structure. Veterinary microbiology 137: 120-128 Dethlefsen L, Eckburg PB, Bik EM, Relman DA (2006) Assembly of the human intestinal microbiota. Trends in ecology & evolution 21: 517-523 Ding C, Cantor CR (2004) Quantitative analysis of nucleic acids-the last few years of progress. Journal of Biochemistry and Molecular Biology 37: 1-10 Dongowski G, Lorenz A, Anger H (2000) Degradation of pectins with different degrees of esterification by Bacteroides thetaiotaomicron isolated from human gut flora. Applied and environmental microbiology 66: 1321-1327 Dumont MG, Murrell JC (2005) Stable isotope probing—linking microbial identity to function. Nature Reviews Microbiology 3: 499-504 Durant S, Marker L, Purchase N, Belbachir F, Hunter L, Parker C, Breitenmoser-Würsten C, Sogbohossou E, Bauer H. (2008) Acinonyx jubatus. IUCN 2012. IUCN Red List of Threatened Species, Vol. 2012.2. Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, Purdom E, Dethlefsen L, Sargent M, Gill SR, Nelson KE, Relman DA (2005) Diversity of the human intestinal microbial flora. Science 308: 1635-1638 Endo A, Futagawa-Endo Y, Dicks LMT (2010) Diversity of Lactobacillus and Bifidobacterium in feces of herbivores, omnivores and carnivores. Anaerobe 16: 590-596 Etnyre E, Lande J, McKenna A. (2011) Felidae (on-line), Animal Diversity Web. Accessed March 10, 2013 at http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Felidae/. Fahey G, Flickinger E, Grieshop C, Swanson K (2004) The role of dietary fibre in companion animal nutrition. Dietary Fibre: bio-active carbohydrates Prebiotics in Controlled Drug Delivery 93 for food and feed: 295-328 Fava F, Danese S (2011) Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe? World journal of gastroenterology: WJG 17: 557 Fisher MM, Triplett EW (1999) Automated approach for ribosomal intergenic spacer analysis of microbial diversity and its application to freshwater bacterial communities. Applied and environmental microbiology 65: 4630-4636 Flint HJ, Duncan SH, Scott KP, Louis P (2007) Interactions and competition within the microbial community of the human colon: links between diet and health. Environmental microbiology 9: 1101-1111 Flint HJ, Scott KP, Louis P, Duncan SH (2012) The role of the gut microbiota in nutrition and health. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology Fons AG, Tuomo Karjalainen, Michel (2000) Mechanisms of colonisation and colonisation resistance of the digestive tract Part 2: Bacteria/bacteria interactions. Microbial Ecology in Health and Disease 12: 240-246

58

Referenties

Frank DN, St Amand AL, Feldman RA, Boedeker EC, Harpaz N, Pace NR (2007) Molecular-phylogenetic characterization of microbial community imbalances in human inflammatory bowel diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences 104: 13780-13785 Gibson GR (1999) Dietary modulation of the human gut microflora using the prebiotics oligofructose and inulin. The Journal of nutrition 129: 1438S-1441s Gill SR, Pop M, DeBoy RT, Eckburg PB, Turnbaugh PJ, Samuel BS, Gordon JI, Relman DA, Fraser-Liggett CM, Nelson KE (2006) Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science 312: 1355-1359 Glad T, Bernhardsen P, Nielsen K, Brusetti L, Andersen M, Aars J, Sundset M (2010) Bacterial diversity in faeces from polar bear (Ursus maritimus) in Arctic Svalbard. BMC microbiology 10: 10 Glenn TC (2011) Field guide to next‐generation DNA sequencers. Molecular Ecology Resources 11: 759-769 Guillon F, Champ M (2000) Structural and physical properties of dietary fibres, and consequences of processing on human physiology. Food Research International 33: 233-245 Hamer HM, De Preter V, Windey K, Verbeke K (2012) Functional analysis of colonic bacterial metabolism: relevant to health? American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology 302: G1-G9 Handl S, Dowd SE, Garcia‐Mazcorro JF, Steiner JM, Suchodolski JS (2011) Massive parallel 16S rRNA gene pyrosequencing reveals highly diverse fecal bacterial and fungal communities in healthy dogs and cats. FEMS microbiology ecology 76: 301-310 Harrison S, Bruna E (1999) Habitat fragmentation and large‐scale conservation: what do we know for sure? Ecography 22: 225-232 Hayashi H, Sakamoto M, Benno Y (2002) Phylogenetic analysis of the human gut microbiota using 16S rDNA clone libraries and strictly anaerobic culture-based methods. Microbiology and immunology 46: 535 Hayashi H, Takahashi R, Nishi T, Sakamoto M, Benno Y (2005) Molecular analysis of jejunal, ileal, caecal and rectosigmoidal human colonic microbiota using 16S rRNA gene libraries and terminal restriction fragment length polymorphism. Journal of medical Microbiology 54: 1093-1101 Hesta M, Debraekeleer J, Janssens G, De Wilde R, Landlow M (2006) Effects of prebiotics in dog and cat nutrition: a review. Trends in Dietary Carbohydrates Research: 179-219 Hold GL, Pryde SE, Russell VJ, Furrie E, Flint HJ (2002) Assessment of microbial diversity in human colonic samples by 16S rDNA sequence analysis. FEMS microbiology ecology 39: 33-39 Hopkins M, Sharp R, Macfarlane G (2002) Variation in human intestinal microbiota with age. Digestive and Liver Disease 34: S12-S18 Inglis GD, Thomas MC, Thomas DK, Kalmokoff ML, Brooks SPJ, Selinger LB (2012) Molecular Methods to Measure intestinal Bacteria: A Review. Journal of AOAC International 95 Inness V, McCartney A, Khoo C, Gross K, Gibson G (2007) Molecular characterisation of the gut microflora of healthy and inflammatory bowel disease cats using fluorescence in situ hybridisation with special reference to Desulfovibrio spp. Journal of animal physiology and animal nutrition 91: 48-53 Jernberg C, Löfmark S, Edlund C, Jansson JK (2007) Long-term ecological impacts of antibiotic administration on the human intestinal microbiota. The ISME journal 1: 56-66 Joossens M, Huys G, Van Steen K, Cnockaert M, Vermeire S, Rutgeerts P, Verbeke K, Vandamme P, De Preter V (2011) High‐throughput method for comparative analysis of denaturing gradient gel electrophoresis profiles

59

Referenties from human fecal samples reveals significant increases in two bifidobacterial species after inulin‐type prebiotic intake. FEMS microbiology ecology 75: 343-349 Kazarov E (2008) The Role of Zoos in Creating a Conservation Ethic in Visitors. Kida Y, Shimizu T, Kuwano K (2006) Sodium butyrate up-regulates cathelicidin gene expression via activator protein-1 and histone acetylation at the promoter region in a human lung epithelial cell line, EBC-1. Molecular immunology 43: 1972-1981 Kim YS, Milner JA (2007) Dietary modulation of colon cancer risk. The Journal of nutrition 137: 2576S-2579S Kimmel SE, Michel KE, Hess RS, Ward CR (2000) Effects of insoluble and soluble dietary fiber on glycemic control in dogs with naturally occurring insulin-dependent diabetes mellitus. Journal of the American Veterinary Medical Association 216: 1076-1081 Kisand V, Wikner J (2003) Limited resolution of 16S rDNA DGGE caused by melting properties and closely related DNA sequences. Journal of microbiological methods 54: 183-191 Kovacs A, Yacoby K, Gophna U (2010) A systematic assessment of automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA) as a tool for estimating bacterial richness. Research in microbiology 161: 192-197 Leser TD, Amenuvor JZ, Jensen TK, Lindecrona RH, Boye M, Møller K (2002) Culture-independent analysis of gut bacteria: the pig gastrointestinal tract microbiota revisited. Applied and environmental microbiology 68: 673690 Leser TD, Molbak L (2009) Better living through microbial action: the benefits of the mammalian gastrointestinal microbiota on the host. Environmental microbiology 11: 2194-2206 Ley RE, Hamady M, Lozupone C, Turnbaugh PJ, Ramey RR, Bircher JS, Schlegel ML, Tucker TA, Schrenzel MD, Knight R, Gordon JI (2008a) Evolution of mammals and their gut microbes. Science 320: 1647-1651 Ley RE, Lozupone CA, Hamady M, Knight R, Gordon JI (2008b) Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Reviews Microbiology 6: 776-788 Liang Z, Drijber RA, Lee DJ, Dwiekat IM, Harris SD, Wedin DA (2008) A DGGE-cloning method to characterize arbuscular mycorrhizal community structure in soil. Soil Biology and Biochemistry 40: 956-966 Liu W-T, Marsh TL, Cheng H, Forney LJ (1997) Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA. Applied and environmental microbiology 63: 4516-4522 Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and − ΔΔCT the 2 Method. methods 25: 402-408 Lubbs DC, Vester BM, Fastinger ND, Swanson KS (2009) Dietary protein concentration affects intestinal microbiota of adult cats: a study using DGGE and qPCR to evaluate differences in microbial populations in the feline gastrointestinal tract. Journal of animal physiology and animal nutrition 93: 113-121 Macdonald DW, Loveridge AJ, Nowell K (2010) Dramatis personae: an introduction to the wild felids. Biology and conservation of wild felids: 3-58 MacDonald TT, Monteleone G (2005) Immunity, inflammation, and allergy in the gut. Science 307: 1920-1925 Macfarlane G, Macfarlane S, Gibson G (1998) Validation of a three-stage compound continuous culture system for investigating the effect of retention time on the ecology and metabolism of bacteria in the human colon. Microbial ecology 35: 180-187

60

Referenties Maier RM, Pepper IL, Gerba CP (2009) Environmental Microbiology. second edn, Chapter 11: physiological methods, p 215. Mändar R, Mikelsaar M (1996) Transmission of mother’s microflora to the newborn at birth. Neonatology 69: 30-35 Mardis ER (2008) The impact of next-generation sequencing technology on genetics. Trends in genetics 24: 133 Marker LL (2002) Aspects of cheetah (Acinonyx jubatus) biology, ecology and conservation strategies on Namibian farmlands: University of Oxford Oxford. Martens EC, Koropatkin NM, Smith TJ, Gordon JI (2009) Complex glycan catabolism by the human gut microbiota: the Bacteroidetes Sus-like paradigm. Journal of Biological Chemistry 284: 24673-24677 Matsuki T, Watanabe K, Fujimoto J, Kado Y, Takada T, Matsumoto K, Tanaka R (2004) Quantitative PCR with 16S rRNA-gene-targeted species-specific primers for analysis of human intestinal bifidobacteria. Applied and environmental microbiology 70: 167-173 McFarland L (1999) Epidemiology, risk factors and treatments for antibiotic-associated diarrhea. Digestive Diseases 16: 292-307 Meijer K, de Vos P, Priebe MG (2010) Butyrate and other short-chain fatty acids as modulators of immunity: what relevance for health? Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care 13: 715-721 Menotti-Raymond M, O'Brien SJ (1993) Dating the genetic bottleneck of the African cheetah. Proceedings of the National Academy of Sciences 90: 3172-3176 Merola M (2002) A reassessment of homozygosity and the case for inbreeding depression in the cheetah, Acinonyx jubatus: implications for conservation. Conservation Biology 8: 961-971 Middelbos IS, Boler BMV, Qu A, White BA, Swanson KS, Fahey Jr GC (2010) Phylogenetic characterization of fecal microbial communities of dogs fed diets with or without supplemental dietary fiber using 454 pyrosequencing. PLoS One 5: e9768 Minamoto Y, Hooda S, Swanson KS, Suchodolski JS (2012) Feline gastrointestinal microbiota. Animal health research reviews / Conference of Research Workers in Animal Diseases 13: 64-77 Montalto M, D'Onofrio F, Gallo A, Cazzato A, Gasbarrini G (2009) Intestinal microbiota and its functions. Digestive and liver disease supplements 3: 30-34 Morelli L (2008) Postnatal development of intestinal microflora as influenced by infant nutrition. The Journal of nutrition 138: 1791S-1795S Morris JG (1994) Metabolic adaptations of carnivores in relation to diet. Nutrition in a Sustainable Environment 502-505 Moter A, Göbel UB (2000) Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. Journal of microbiological methods 41: 85-112 Munson L, Marker L, Dubovi E, Spencer JA, Evermann JF, O’Brien SJ (2004) Serosurvey of viral infections in freeranging Namibian cheetahs (Acinonyx jubatus). Journal of wildlife diseases 40: 23-31 Munson L, Terio KA, Worley M, Jago M, Bagot-Smith A, Marker L (2005) Extrinsic factors significantly affect patterns of disease in free-ranging and captive cheetah (Acinonyx jubatus) populations. Journal of wildlife diseases 41: 542-548 Muyzer G (1999) DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems. Current opinion in microbiology 2: 317-322

61

Referenties

Myers SP (2004) The causes of intestinal dysbiosis: a review. Altern Med Rev 9: 180-197 Nagashima K, Hisada T, Sato M, Mochizuki J (2003) Application of new primer-enzyme combinations to terminal restriction fragment length polymorphism profiling of bacterial populations in human feces. Applied and environmental microbiology 69: 1251-1262 Neish AS (2009) Microbes in gastrointestinal health and disease. Gastroenterology 136: 65-80 Neufeld JD, Dumont MG, Vohra J, Murrell JC (2007) Methodological considerations for the use of stable isotope probing in microbial ecology. Microbial ecology 53: 435-442 Nowell K, Jackson P (1996) Wild cats: status survey and conservation action plan: World Conservation Union. O'Brien S J, Wildt DE, Goldman D, Merril CR, Bush M (1983) The cheetah is depauperate in genetic variation. Science 221: 459-462 O'Sullivan DJ (2000) Methods for analysis of the intestinal microflora. Current issues in intestinal microbiology 1: 39-50 Or A, Gophna U (2011) Detection of Spatial and temporal influences on bacterial communities in an urban stream by Automated Ribosomal Intergenic Ribosomal Spacer Analysis. Microbes and Environments 26: 360366 Penders J, Thijs C, Vink C, Stelma FF, Snijders B, Kummeling I, van den Brandt PA, Stobberingh EE (2006) Factors influencing the composition of the intestinal microbiota in early infancy. Pediatrics 118: 511-521 Peterson DA, Frank DN, Pace NR, Gordon JI (2008) Metagenomic approaches for defining the pathogenesis of inflammatory bowel diseases. Cell host & microbe 3: 417-427 Pfaffl MW (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR. Nucleic acids research 29: e45-e45 Pitcher D, Saunders N, Owen R (2008) Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett Appl Microbiol 8: 151-156 Plantinga EA, Bosch G, Hendriks WH (2011) Estimation of the dietary nutrient profile of free-roaming feral cats: possible implications for nutrition of domestic cats. Br J Nutr 106: S35-S48 Pryde SE, Duncan SH, Hold GL, Stewart CS, Flint HJ (2002) The microbiology of butyrate formation in the human colon. FEMS microbiology letters 217: 133-139 Radajewski S, Ineson P, Parekh NR, Murrell JC (2000) Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature 403: 646-649 Rastall R (2004) Bacteria in the gut: friends and foes and how to alter the balance. The Journal of nutrition 134: 2022S-2026S Riley MA, Wertz JE (2002) Bacteriocin diversity: ecological and evolutionary perspectives. Biochimie 84: 357364 Ritchie LE, Burke KF, Garcia-Mazcorro JF, Steiner JM, Suchodolski JS (2010) Characterization of fecal microbiota in cats using universal 16S rRNA gene and group-specific primers for Lactobacillus and Bifidobacterium spp. Veterinary microbiology 144: 140-146 Ritchie LE, Steiner JM, Suchodolski JS (2008) Assessment of microbial diversity along the feline intestinal tract using 16S rRNA gene analysis. FEMS microbiology ecology 66: 590-598

62

Referenties Roberfroid M, Gibson GR, Hoyles L, McCartney AL, Rastall R, Rowland I, Wolvers D, Watztl B, Szajewska H, Stahl B (2010) Prebiotic effects: metabolic and health benefits. British Journal of Nutrition 104: S1-S63 Roberfroid MB, Van Loo JA, Gibson GR (1998) The bifidogenic nature of chicory inulin and its hydrolysis products. The Journal of nutrition 128: 11-19 Rossello-Mora R, Amann R (2001) The species concept for prokaryotes. FEMS microbiology reviews 25: 39-67 Round JL, Mazmanian SK (2009) The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nature Reviews Immunology 9: 313-323 Salzman NH, Underwood MA, Bevins CL (2007) Paneth cells, defensins, and the commensal microbiota: a hypothesis on intimate interplay at the intestinal mucosa. In Seminars in immunology, Vol. 19, pp 70-83. Satokari RM, Vaughan EE, Akkermans AD, Saarela M, de Vos WM (2001) Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus-specific PCR and denaturing gradient gel electrophoresis. Applied and environmental microbiology 67: 504-513 Schauber J, Svanholm C, Termen S, Iffland K, Menzel T, Scheppach W, Melcher R, Agerberth B, Lührs H, Gudmundsson G (2003) Expression of the cathelicidin LL-37 is modulated by short chain fatty acids in colonocytes: relevance of signalling pathways. Gut 52: 735-741 Schneider MF (2001) Habitat loss, fragmentation and predator impact: spatial implications for prey conservation. Journal of Applied Ecology 38: 720-735 Schwab C, Cristescu B, Boyce MS, Stenhouse GB, Gänzle M (2009) Bacterial populations and metabolites in the feces of free roaming and captive grizzly bears. Canadian journal of microbiology 55: 1335-1346 Schwab C, Cristescu B, Northrup JM, Stenhouse GB, Gänzle M (2011) Diet and Environment Shape Fecal Bacterial Microbiota Composition and Enteric Pathogen Load of Grizzly Bears. PLoS One 6: e27905 Sekirov I, Russell SL, Antunes LCM, Finlay BB (2010) Gut microbiota in health and disease. Physiological reviews 90: 859-904 Sghir A, Gramet G, Suau A, Rochet V, Pochart P, Dore J (2000) Quantification of bacterial groups within human fecal flora by oligonucleotide probe hybridization. Applied and environmental microbiology 66: 2263-2266 Simpson J, Martineau B, Jones W, Ballam J, Mackie R (2002) Characterization of fecal bacterial populations in canines: effects of age, breed and dietary fiber. Microbial ecology 44: 186-197 Sneath PH, Mair NS, Sharpe ME, Holt JG (1986) Bergey's manual of systematic bacteriology. Volume 2: Williams & Wilkins. Song Y, Liu C, Finegold SM (2004) Real-time PCR quantitation of clostridia in feces of autistic children. Applied and environmental microbiology 70: 6459-6465 Suau A, Bonnet R, Sutren M, Godon J, Gibson GR, Collins MD, Doré J (1999) Direct Analysis of Genes Encoding 16S rRNA from Complex Communities Reveal Many Novel Molecular Species within the Human Gut. Applied and environmental microbiology 65: 4799-4807 Suchodolski JS, Camacho J, Steiner JM (2008) Analysis of bacterial diversity in the canine duodenum, jejunum, ileum, and colon by comparative 16S rRNA gene analysis. FEMS microbiology ecology 66: 567-578 Swidsinski A, Loening-Baucke V, Lochs H, Hale LP (2005) Spatial organization of bacterial flora in normal and inflamed intestine: A fluorescence in situ hybridization study in mice. World J Gastroenterol 11: 1131-1140 Tamboli C, Neut C, Desreumaux P, Colombel J (2004) Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut 53: 1-4

63

Referenties Temmerman R, Huys G, Swings J (2004) Identification of lactic acid bacteria: culture-dependent and cultureindependent methods. Trends in Food Science & Technology 15: 348-359 Terio KA, Marker L, Munson L (2004) Evidence for chronic stress in captive but not free-ranging cheetahs (Acinonyx jubatus) based on adrenal morphology and function. Journal of wildlife diseases 40: 259-266 Theander O, Aman P, Westerlund E, Graham H (1994) Enzymatic/chemical analysis of dietary fiber. Journal of AOAC International 77: 703 Thomas F, Hehemann J-H, Rebuffet E, Czjzek M, Michel G (2011) Environmental and gut Bacteroidetes: the food connection. Frontiers in microbiology 2 Tiihonen K, Ouwehand AC, Rautonen N (2010) Human intestinal microbiota and healthy ageing. Ageing research reviews 9: 107 Tun HM, Brar MS, Khin N, Jun L, Hui RK-H, Dowd SE, Leung FC-C (2012) Gene-centric metagenomics analysis of feline intestinal microbiome using 454 junior pyrosequencing. Journal of microbiological methods 88: 369-376 Vandamme P, Pot B, Gillis M, De Vos P, Kersters K, Swings J (1996) Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiological reviews 60: 407-438 Vanhoutte T, De Preter V, De Brandt E, Verbeke K, Swings J, Huys G (2006a) Molecular monitoring of the fecal microbiota of healthy human subjects during administration of lactulose and Saccharomyces boulardii. Applied and environmental microbiology 72: 5990-5997 Vanhoutte T, Huys G, Brandt E, Swings J (2006b) Temporal stability analysis of the microbiota in human feces by denaturing gradient gel electrophoresis using universal and group‐specific 16S rRNA gene primers. FEMS microbiology ecology 48: 437-446 Venter JC, Remington K, Heidelberg JF, Halpern AL, Rusch D, Eisen JA, Wu D, Paulsen I, Nelson KE, Nelson W (2004) Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science 304: 66-74 Verstraelen H (2008) Cutting edge: the vaginal microflora and bacterial vaginosis. Verh K Acad Geneeskd Belg 70: 147-174 Vester BM, Beloshapka AN, Middelbos IS, Burke SL, Dikeman CL, Simmons LG, Swanson KS (2010) Evaluation of nutrient digestibility and fecal characteristics of exotic felids fed horse‐or beef‐based diets: use of the domestic cat as a model for exotic felids. Zoo biology 29: 432-448 Vester BM, Burke SL, Dikeman CL, Simmons LG, Swanson KS (2008a) Nutrient digestibility and fecal characteristics are different among captive exotic felids fed a beef-based raw diet. Zoo biology 27: 126-136 Vester BM, Dalsing BL, Middelbos IS, Apanavicius CJ, Lubbs DC, Swanson KS (2009) Faecal microbial populations of growing kittens fed high-or moderate-protein diets. Archives of Animal Nutrition 63: 254-265 Vester BM, Middelbos IS, Burke SL, Dikeman CL, Simmons LG, Swanson KS (2008b) Fecal Microbial Populations of Large Captive Exotic Felids and Domestic Cats Fed Beef- and Horse-Based Raw Diets. Proceedings of the National Academy of Sciences Wang M, Ahrné S, Jeppsson B, Molin G (2005) Comparison of bacterial diversity along the human intestinal tract by direct cloning and sequencing of 16S rRNA genes. FEMS microbiology ecology 54: 219-231 Wildt DE, Bush M, Howard J, O'Brien S, Meltzer D, Van Dyk A, Ebedes H, Brand D (1983) Unique seminal quality in the South African cheetah and a comparative evaluation in the domestic cat. Biology of Reproduction 29: 1019-1025 Williams BA, Verstegen MW, Tamminga S (2001) Fermentation in the large intestine of single-stomached animals and its relationship to animal health. Nutrition research reviews 14: 207

64

Referenties

Wilson DE, Reeder DM (2005) Mammal species of the world: a taxonomic and geographic reference, Vol. 2: Johns Hopkins University Press. Yu Z, Morrison M (2004a) Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for use in fingerprinting of microbial communities by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis. Applied and environmental microbiology 70: 4800-4806 Yu Z, Morrison M (2004b) Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples. Biotechniques 36: 808-813 Zentek J, Marquart B, Pietrzak T, Ballevre O, Rochat F (2003) Dietary effects on bifidobacteria and Clostridium perfringens in the canine intestinal tract. Journal of animal physiology and animal nutrition 87: 397-407 Zhu XY, Zhong T, Pandya Y, Joerger RD (2002) 16S rRNA-based analysis of microbiota from the cecum of broiler chickens. Applied and environmental microbiology 68: 124-137 Zoetendal EG, Akkermans AD, De Vos WM (1998) Temperature gradient gel electrophoresis analysis of 16S rRNA from human fecal samples reveals stable and host-specific communities of active bacteria. Applied and environmental microbiology 64: 3854-3859 Zoetendal EG, Cheng B, Koike S, Mackie RI (2004) Molecular microbial ecology of the gastrointestinal tract: from phylogeny to function. Curr Issues Intest Microbiol 5: 31-48 Zoran DL (2002) The carnivore connection to nutrition in cats. Journal of the American Veterinary Medical Association 221: 1559-1567

65

Addendum

ADDENDUM

BIJLAGE 1: LIJST MET GEBRUIKTE FECALE STALEN IN DEZE STUDIE a

Fecale Conditie Score (FCS)b

Datum DNA extractie

Prooi

3.5

3/5/2011

Prooi

3.5

3/5/2011

Rund

Vlees

3

16/05/2011

18/03/2011

Rund

Vlees

4

16/05/2011

Papole

18/03/2011

Rund

Vlees

3

16/05/2011

Planckendael

Poko

20/05/2011

Rund

Vlees

2.5

7/6/2011

Planckendael

Papole

20/05/2011

Rund

Vlees

3

7/6/2011

België

Planckendael

Poko

29/07/2011

Konijn

Prooi

3.5

1/9/2011

B2-PL-P-T5

België

Planckendael

Papole

29/07/2011

Konijn

Prooi

2

1/9/2011

B1-PL-M-T6

België

Planckendael

Poko

23/09/2011

Paard

Vlees

2 & 4 (mixed)

26/9/2011

B2-PL-P-T6

België

Planckendael

Papole

23/09/2011

Konijn

Prooi

3,5

26/9/2011

B1-PL-M-T7

België

Planckendael

Poko

25/11/2011

Paard

Vlees

3

17/2/2012

B2-PL-M-T7

België

Planckendael

Papole

25/11/2011

Paard

Vlees

4

17/2/2012

B1-PL-M-T8

België

Planckendael

Poko

20/01/2012

Paard

Vlees

3,5

17/2/2012

B2-PL-M-T8

België

Planckendael

Papole

20/01/2012

Paard

Vlees

3

17/2/2012

B2-PL-M-T9

België

Planckendael

Papole

6/04/2012

Paard

Vlees

4

19/04/2013

B1/B2-PL-M-T10

België

Planckendael

Onbekend

25/05/2012

Paard

Vlees

4

19/04/2013

B1-PL-M-T10

België

Planckendael

Poko

25/05/2012

Paard

Vlees

4

19/04/2013

B1-PL-M-T11

België

Planckendael

Poko

10/08/2012

Paard

Vlees

4

19/04/2013

B2-PL-M-T11

België

Planckendael

Papole

10/08/2012

Paard

Vlees

4.5

19/04/2013

B2-PL-M-T12

België

Planckendael

Papole

5/10/2012

Konijn

Prooi

4

19/04/2013

B1-PL-P-T13

België

Planckendael

Poko

11/01/2013

Konijn

Prooi

4

19/04/2013

Staalcode

Land

Park

Dier

Datum staalname

Dieet

Voedsel type

B1-PL-P-T1

België

Planckendael

Poko

29/10/2010

Konijn

B2-PL-P-T1

België

Planckendael

Papole

29/10/2010

Konijn

B1-PL-M-T2

België

Planckendael

Poko

14/01/2011

B1-PL-M-T3

België

Planckendael

Poko

B2-PL-M-T3

België

Planckendael

B1-PL-M-T4

België

B2-PL-M-T4

België

B1-PL-P-T5

66

Addendum

a

B1-PL-M-T14

België

Planckendael

Poko

8/03/2013

Paard

Vlees

3.5

11/04/2013

B2-PL-M-T14

België

Planckendael

Papole

8/03/2013

Paard

Vlees

3.5

11/04/2013

NL9-OV-P-T1

Nederland

ZP Overloon

Hakkari

25/05/2011

Konijn

Prooi

2.5

07/06/2011

NL10-OV-P-T1

Nederland

ZP Overloon

Lomai

25/05/2011

Konijn

Prooi

2

07/06/2011

NL11-OV-P-T1

Nederland

ZP Overloon

Xavannah

25/05/2011

Konijn

Prooi

2.5

07/06/2011

NL9-OV-M-T3

Nederland

ZP Overloon

Hakkari

14/10/2011

Konijn-Paard

Vlees

3.5

17/02/2012

NL10-OV-M-T3

Nederland

ZP Overloon

Lomai

14/10/2011

Konijn-Paard

Vlees

3

17/02/2012

NL11-OV-M-T3

Nederland

ZP Overloon

Xavannah

14/10/2011

Konijn-Paard

Vlees

3.5

17/02/2012

NL9-OV-P-T4

Nederland

ZP Overloon

Hakkari

16/12/2011

Konijn

Prooi

3

17/02/2012

NL10-OV-P-T4

Nederland

ZP Overloon

Lomai

16/12/2011

Konijn

Prooi

4

17/02/2012

NL11-OV-P-T4

Nederland

ZP Overloon

Xavannah

16/12/2011

Konijn

Prooi

2.5

17/02/2012

NL9-OV-M-T5

Nederland

ZP Overloon

Hakkari

11/02/2012

Paard-Kipfilet

Vlees

4.5

7/03/2012

NL10-OV-M-T5

Nederland

ZP Overloon

Lomai

11/02/2012

Paard-Kipfilet

Vlees

Vet & kip rest

7/03/2012

NL11-OV-M-T5

Nederland

ZP Overloon

Xavannah

11/02/2012

Paard-Kipfilet

Vlees

3

7/03/2013

NL10-OV-P-T11a

Nederland

ZP Overloon

Lomai

17/11/2012

Konijn

Prooi

2 & 3 (mixed

11/04/2013

NL11-OV-P-T11

Nederland

ZP Overloon

Xavannah

17/11/2013

Konijn

Prooi

2

11/04/2013

NL11-OV-P-T12

Nederland

ZP Overloon

Xavannah

2/02/2013

Konijn

Prooi

2.5

11/04/2013

Wanneer de dieren vlees gevoederd kregen was dit gesupplementeerd met een vitamine- en mineralenmix. Prooi is ongesupplementeerd.

b

FCS: Een score van 1-5, waarbij 1 vrij harde en droge feces voorstellen en 5 waterachtige feces zonder textuur

67

Addendum BIJLAGE 2: TABEL GEMEENSCHAPPELIJKE & NIET-GEMEENSCHAPPELIJKE OTU’S

OTU

Aantal klonen

Familie

Dichtst gerelateerde species

B1

B2

1

5

6

Clostridiaceae

Clostridium sardiniense

2

6

59

Clostridiaceae

Clostridium perfringens

3

48

138

Clostridiaceae

Clostridium hiranonis

4

6

6

Eubacteriaceae

Eubacterium tenue

5

1

14

Clostridiaceae

Clostridium glycolicum

6

33

1

Peptococcaceae

Desulfonispora thiosulfatigenes

7

69

20

Ruminococcaceae

Ruminococcus gnavus

8

7

7

Lachnospiraceae

Ruminococcus intestinalis

9

1

6

Clostridiaceae

Clostridium glycyrrhizinilyticum

10

36

19

Incertae Sedis Clostridiales

Blautia hansenii

11

2

2

Lachnospiraceae

Blautia coccoides

12

32

3

Incertae Sedis Clostridiales

Blautia glucerasea

13

29

8

Incertae Sedis Clostridiales

Blautia glucerasea

14

1

2

Enterobacteriaceae

Shigella flexneri

15

6

4

Lactobacillaceae

Lactobacillus sakei

16

2

2

Carnobacteriaceae

Clostridium divergens

17

6

13

Coriobacteriaceae

Collinsella stercoris

18

2

1

Coriobacteriaceae

Collinsella tanakaei

19

2

0

Lachnospiraceae

Ruminococcus intestinalis

20

4

0

Ruminococcaceae

Ruminococcus torques

21

1

0

Clostridiaceae

Clostridium boltae

22

1

0

Microbacteriaceae

Curtobacterium luteum.

23

4

0

Enterococcaceae

Enterococcus faecalis

24

1

0

Enterococcaceae

Enterococcus hirae

25

31

0

Enterococcaceae

Enterococcus cecorum

26

2

0

Lactobacillaceae

Lactobacillus animalis

27

8

0

Streptococcaceae

Lactococcus piscium

28

4

0

Erysipelotrichaceae

Eubacterium cylindroides

29

2

0

Coriobacteriaceae

Denitrobacterium detoxificans

30

0

1

Clostridiaceae

Clostridium sardiniense

31

0

3

Eubacteriaceae

Eubacterium multiforme

32

0

1

Clostridiaceae

Clostridium colicans

33

0

2

Clostridiaceae

Clostridium subterminale

68

Addendum 34

0

1

Clostridiaceae

Clostridium fallax

35

0

1

Ruminococcaceae

Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans

36

0

5

Peptostreptococcaceae

Peptostreptococcus anaerobius

37

0

3

Peptostreptococcaceae

Peptostreptococcus anaerobius

38

0

3

Clostridiaceae

Clostridium lituseburense

39

0

2

Clostridiaceae

Clostridium lituseburense

40

0

1

Lachnospiraceae

Cellulosilyticum ruminicola

41

0

1

Erysipelotrichaceae

Turicibacter sanguinis

42

0

2

Lactobacillaceae

Lactobacillus. mucosae

43

0

2

Coriobacteriaceae

Paraeggerthella hongkongensis

44

0

3

Coriobacteriaceae

Slackia faecicanis

45

0

4

Fusobacteriaceae

Clostridium rectum

46

0

1

Clostridiaceae

Clostridium perfingens

47

0

1

Clostridiaceae

Clostridium lituseburense

48

0

2

Lachnospiraceae

Coprococcus comes

OTU 1 t.e.m. 18 zijn gemeenschappelijk voor beide dieren, OTU19 t.e.m. 48 vormen de nietgemeenschappelijke OTU’s

69

Addendum BIJLAGE 3: SAMENSTELLING GEBRUIKTE MEDIA

Media

Materiaal

Hoeveelheid

Pepton fysiologisch water (1l)

NaCl (Merck reagens)

8,5 gram

Bacteriological peptone (Oxoid, LP0037)

1 gram

MQ

1 liter

RCM (Oxoid, CM0151)

52.5 gram

MQ water

1 liter

Reinforced Clostridium Medium (1l)

70

Addendum BIJLAGE 4: ORIGINELE DGGE FINGERPRINT VAN DE TIJDSREEKS VOOR B1 EN B2

Originele DGGE profielen van de tijdsreeks van de fecale stalen verzameld van cheeta’s B1 en B2. A. Een 3570% DGGE gel van de tijdsreeks van B1. Van het fecale staal T10 in het voorlaatste laantje is niet geweten van welk dier het afkomstig is. B. Een 35-70% DGGE gel van de tijdsreeks van B2. Bij het fecale staal T10 is niet geweten van welk dier het afkomstig is. M staat voor de fecale merker en T1,T2,… voor het tijdstip.

71

Addendum BIJLAGE 5: SPIKING EXPERIMENT (ZOOM)

RT-PCR: Spiking experiment (zoom) 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15

Firmicutes Bacteroidetes

0,1 0,05 0

In deze figuur werd nog eens extra ingezoomd op de Bacteroidetes. Daardoor is nu ook te zien dat in de originele stalen een laag signaal werd bekomen.

72

Addendum BIJLAGE 6: TOTALE DNA EXTRACTIE UIT FECALE STALEN I. Opslag van fecale stalen Aan de fecale stalen worden na collectie een fecale conditiescore toegekend en dan bewaard op droogijs. In het labo worden ze op -80°C bewaard tot verdere analyse. II. Homogenisatie van fecale stalen  Weeg van het fecale staal 25 gram af en voeg hieraan 225 ml pepton fysiologisch water toe.  Homogeniseer gedurende 30 sec op 230 rpm in een stomacher.  Breng de gehomogeniseerde oplossing op een Büchnerfilter  Breng 90 ml van het filtraat over in 2 buisjes (45 ml elk)  Centrifugeer 10 min op 10000 rpm  Giet het supernatans af en resuspendeer in 5 ml 1x TE buffer  Vortex tot opgelost en breng 7x 1 ml over naar epjes met blunt tip (aliquotatie) III. DNA extractie  Het gehomogeniseerde mengsel wordt gedurende 10 minuten gecentrifugeerd op 13000 rpm.  Na het verwijderen van het supernatans wordt de pellet geresuspendeerd in 150 µl enzymemix om de bacteriële celwand te degenereren. Per staal bestaat de enzymemix uit: 5 mg lysozyme poeder en 40 µl mutanolysine opgelost in 110 µl 1x TE buffer.  Incubeer op 37°C gedurende 40 minuten.  De cellen worden gelyseerd door 500 µl GES (Guanidium-thiocyanaat-EDTA) toe te voegen. De mix wordt voorzichtig geïnverteerd waarna het voor 10 minuten op ijs wordt geplaatst.  Om precipitatie van proteïnen te versterken wordt 250 µl ammoniumacetaat (7.5M) toegevoegd. De oplossing wordt voorzichtig geïnverteerd en voor 10 min op ijs geplaatst.  Om de geprecipiteerde proteïnen en ander celmateriaal van de nucleïnezuren te scheiden, wordt 500 µl chloroform/iso-amylalcohol (24/1) toegevoegd. De mix wordt hard geschud totdat een homogene 1-fase oplossing wordt verkregen. De oplossing wordt gedurende 20 min gecentrifugeerd op 10000 rpm.  Na de centrifuge stap wordt een 3-fase systeem verkregen. De bovenste fase (= waterige fase) bevat de nucleïnezuren, de interfase bevat de proteïne laag en de onderste fase het chloroform. Neem van de bovenste fase zo’n groot mogelijk volume, zonder de interfase te raken, en breng het over naar een nieuw epje. Voeg opnieuw 300 µl Chloroform/isoamylalcohol (24/1) toe. De oplossing wordt hard geschud en 20 minuten gecentrifugeerd op 10000 rpm.  Ongeveer 700 µl van de bovenste fase wordt overgebracht in een nieuw epje met blunt tips. 0.54 volumes ~400 µl ijskoude isopropanol wordt toegevoegd waarna de oplossing voorzichtig gemixt wordt door te inverteren.  De suspensie wordt gedurende 20 minuten gecentrifugeerd op 13000 rpm waarna het supernatans wordt verwijderd. De overgebleven pellet wordt 2x gewassen (met telkens 1 minuut centrifugatie en verwijderen van het supernatans ertussen) met 150 µl 70% ethanol om sporen isopropanol te verwijderen.

73

Addendum  

De verkregen pellet wordt aan de lucht gedroogd en opgelost in 150 µl TE-buffer (hangt af van de grootte van de pellet) De pellet kan gedurende 3 dagen oplossen bij 4°C

IV. RNase stap  5 µl RNase (2mg/ml) wordt per 100 µl DNA toegevoegd. Incubeer de stalen op 37°C gedurende 1,5 u V. Controle en opslag van het DNA  Check of het DNA is opgelost door voorzichtig op en neer te pipetteren. De stock oplossing wordt bewaard bij -20°C.  Bepaal de absorbantie van een 1/20 DNA verdunning (in 1x TE buffer) via een spectrofotometer bij 234nm, 260 nm en 280nm. Het DNA wordt als zuiver beschouwd waneer de verhouding A260/A280 tussen 1.8-2.2 ligt en de verhouding A234/A260 tussen de 0.5 en 0.8 ligt.  De werkoplossing wordt verkregen door een 1/10 verdunning te maken van de stock oplossing in 1x TE buffer. De werkoplossing wordt bewaard bij -20°C  Om DNA kwaliteit te checken, loop je 5 µl DNA + 2µl Loading dye op agarosegel (1% in 1x TBE, 75V, 45 min) VI. Materialen  Pepton fysiologisch water 1 g/l Bacteriologisch Pepton (Oxoid, LP0037) 8.5 g/l NaCl (Merck) Leng aan tot 1000 ml met mQ, autoclaveer en bewaar bij 4°C  TE buffer (pH 8.0) 1mM EDTA (pH 8.0) 10mM Tris-HCL Autoclaveer in 1 l flessen en markeer het volume niveau om achteraf te corrigeren voor verdampingsverliezen met mQ. Check de pH na autoclavering en bewaar bij 4°C. Kleine volumes buffer kunnen gestiriliseerd worden via microfiltratie.  EDTA (0.5 M; pH 8.0) 0.5 M (186.12 g/L) EDTA (MG 372.24) (Calbiochem, #324503) Voor bereiding van 500 ml, los 93.06 g EDTA op in 400 ml mQ en voeg 15-20 g NaOH toe om de pH op 8.0 te krijgen. Vul aan tot 500 ml met mQ. Autoclaveer in 1 L flessen en markeer het volume niveau om te corrigeren voor verdamping verlies met mQ. Check de pH na autoclavering en bewaar bij 4°C. Kleine volumes kunnen gesteriliseerd worden via microfiltratie.  Tris-HCl (1 M; pH 8.0) 1 M (157.6 g/l) Tris-HCL (MG 157) (Calbiochem, #648317, lab product code 2.8.12) Voor bereiding van 200 ml los je 31.5 g Tris op in 180 ml mQ en voeg je geconcentreerd NaOH toe om de pH naar 8.0 te brengen. Leng aan tot 200 ml. Autoclaveer in 500 ml flessen en markeer het volume niveau om later te corrigeren voor verlies door verdamping met steriel mQ. Check de pH na autoclaveren en bewaar bij 4°C. Kan ook via filter sterilisatie.

74

Addendum 

 

  

  





GES 600 g/l guanidiumthiocyanaat (Sigma, #G-6639) 200 ml/l 0.5 M EDTA (pH 8.0) 10 g/l sarkosyl Voor de bereiding van 500 ml los je 300 g guanidiumcyanaat en 100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) in 100 ml mQ. Kook om op te lossen (max 65°C) en voeg 5 g sarkosyl toe nadat de oplossing is afgekoeld. Leng aan tot 500 ml Filter steriliseer en sla op bij 4°C Ammoniumacetaat 578.1 g/L NH4OAc (MG 77.08) Autoclaveer en bewaar bij 4°C Chloroform/Isoamylalcohol (24:1) 192 ml chloroform (Merck) 8 ml isoamylalcohol (Merck) Bewaar bij 4°C Isopropanol 2-propanol (Merck) Bewaar bij -20°C Ethanol (70%) 350 ml 100% EtOH 150 ml mQ Ribonuclease A (RNase 2 mg/ml) RNase (Sigma, R6513-250mg) Los op in mQ in een concentratie van 2 mg/ml Bewaar bij -20°C Agarose Result™ LE agarose (BIOzym, #330100) 50x TAE (Bio-rad, 161-0773) 1x TAE = 0.04 M Tris-acetaat en 0.001 M EDTA Loading Buffer (6x) 4 g sucrose (Merck) 25 mg bromofenol blauw (Merck) 6 ml TE-buffer Los alle reagentia op en leng aan met mQ naar een volume van 10 ml. Maak aliquots van ongeveer 1 ml. Bewaar bij 4°C Lysozyme Van kippen eiwit (SERVA, #28262, 2.5 g) Voor elk staal moet 5 mg lysozyme opgelost worden in 150 µl TE-buffer Wordt opgeslagen bij 4°C Mutanolysine Mutanolysine (Sigma, M9901) Los op in mQ in een concentratie van 5000 U/ml

75

Addendum BIJLAGE 7: PCR VAN 16S RRNA GENEN VOOR DGGE ANALYSE I. PCR reactiemix Neem volgende opmerkingen in acht bij het opzetten van een PCR  Maak een tabel aan die duidelijk aangeeft welke primers en template er per PCR tube gebruikt worden  Gebruik filtertips en geautoclaveerd mQ water voor PCR doeleinden  Gebruik geen mQ water dat reeds geopend is  Houdt de PCR mastermix en individule producten op ijs  Vortex PCR reagens en DNA template na het ontdooien om deze te homogeniseren  Vortex de mastermix alvorens hem uit te verdelen over de PCR tubes  Vries de PCR producten onmiddellijk na het maken van de mastermix terug in.  sluit altijd een positieve en negatieve controle in Samenstelling van de PCR mastermix voor V3-16S rRNA PCR-DGGE Producten

Hoeveelheid voor 1 reactie (50 µl)

mQ water

33.75 µl

AmpliTaq PCR buffer (10x) incl. 15mM MgCl2

6 µl

dNTP’s (2mM elk)

2.5 µl

BSA (10 µg/ml)

2.5 µl

primer F+GC/F357 (5µM)

2 µl

Primer R518 (5µM)

2µl

AmpliTaq DNA polymerase (5 U/µl; Applied Biosystems)

0.25 µl

Template DNA (50 ng/µl)

1 µl

16S rRNA primers gebruikt voor PCR-DGGE Primer

Target

Primer sequentie

Product grootte

F+GC/F357

V3-16S rRNA

217 bp

R518

V3-16S rRNA

5’-GCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG GGGCACGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’



Aan een PCR tube wordt 49 µl PCR mastermix toegevoegd en 1 µl DNA template (50 ng/µl).

II. PCR temperatuur programma  Maak steeds gebruik van hetzelfde toestel, GeneAmp PCR system 9700 van Applied Biosystems, om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Programma Primer Set

Target

PCR programma

F+GC-F357/R518

V3-16S rRNA

1x 95°C (1 min); 30x 95°C (30 s) – 55°C (45 s) – 72°C (1 min); 72°C (7 min); 4°C (∞)

76

Addendum III. Agarose gelelektroforese  Aanmaak van de gel: 1.0%, 1x TBE o Weeg 1.5 gram agarose af in een 250 ml fles en voeg 150 ml 1x TBE toe o Verwarm de fles in een microgolfoven tot de oplossing kookt, schud voorzichtig en herkook tot volledig opgelost. o Giet de gel o Laat 30 minuten stollen o Plaats de gel in de elektroforese tank (bevat 1x TBE buffer) o Laadt de gel met de stalen die 5 µl PCR product en 1 µl loading dye (6x) bevatten. Voeg eveneens een SmartLadder in het eerste en laatste laantje van de gel.  De gel wordt gelopen voor 45 minuten bij 75V op kamertemperatuur  Kleur de gel gedurende ± 45 minuten in een SYBRsafe bad  Visualiseer onder blauw licht en neem een foto IV. Materialen  Agarose Result™LE agarose (BIOzym, #330050)  50x TAE 242 g Tris-base 57.1 ml Glacial acetic acid (Merck) 18.61 g Na2 EDTA of 100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) (Merck) Leng aan tot 1000 ml met mQ  GeneAmp® 10x PCR (Applied biosystems, #N8080006) Incl. 15 mM MgCl2 100 mM Tris-HCl, pH 8.3 (25°C) 500 mM KCl 0.01% Gelatine  AmpliTaq® DNA polymerase (Applied biosystems, #8080152) 12 x 250 units met Buffer I; 250 Units (5 U/µl)  Primers (Sigma)  Steriel mQ 1 ml aliquots in 2 ml Eppendorf Tubes Elke PCR mix wordt gemaakt met een ongeopend mQ tube  GeneAmp® dNTP Bevat 2mM van elke dNTP (Applied Biosystems, #N8080007) 300 µl van elke dNTP (10 mM) werd gemixt met 300 µl mQ. Maak aliquots van 750 µl per eppendorf tube  Loading dye (6x) Bereiding 10 ml: 4 g sucrose (Merck) 25 mg bromophenolblauw (Sigma) 6 ml 1x TE buffer Vul aan met TE buffer tot 10 ml  SmartLadder (Eurogentec) MW-1700-10 voor 1000 laantjes

77

Addendum BIJLAGE 8: DENATURERENDE GRADIËNT GELELEKTROFORESE (DGGE) I.        

Voorbereiden van de platen Was de platen met detergent (Alcanox) Spoel de platen af met mQ Spoel de platen met ethanol en droog deze af met een doekje (Kimwipes) Wrijf de spacers in met Silicon Grease en plaats ze op de plaat met het vet naar de buitenzijde Leg de kleine plaat op de grote plaat en breng de klemmen aan Plaats de constructie in de houder en maak de klemmen terug losser. Plaats de aligneringskaart tussen de platen en druk de klemmen samen. Hierdoor zullen de spacers goed geplaatst worden. Span de klemmen terug aan. Ga na of de spacers parallel zijn met de onderkant van de platen Plaats een parafilm over de onderkant en plaats de platen in de houder op de rubbers en zet ze vast

II. Gieten van de scheidingsgel  Spoel de pomp voor met mQ  Kleef de tube van de gradiënt vormer met plakband op de grote plaat (In het centrum, juist boven de ruimte tussen de platen)  Bereid de gewenste acrylamide oplossingen (2 oplossing waarvan er één een hoge hoeveelheid aan denaturerende agentia bevat en de andere een lage) door de correcte volumes van een 0 en een 100% oplossing te mengen. Let hierbij op dat bij het pipetteren van de 100% een film achterblijft in de pipet die volledig uitgepipetteerd moet worden.. % denaturerende oplossing 0 10 20 30 35 40 45 50 55 60 65 70 80 90 100

 

ml 0% oplossing 12.0 10.8 9.6 8.4 7.8 7.2 6.6 6.0 5.4 4.8 4.2 3.6 2.4 1.2 0

ml 100% oplossing 0 1.2 2.4 3.6 4.2 4.8 5.4 6.0 6.6 7.2 7.8 8.4 9.6 10.8 12.0

Voeg aan beide oplossingen 100 µl 10% (w/v) APS en 8 µl TEMED Giet de laag denaturerende oplossing in de linkerkamer en laat de klep tussen de twee kamers kort open zodat deze kan vullen met laag denaturerende oplossing. Pipetteer de vloeistof die in de tweede kamer gelopen is terug in de linkerkamer. Giet nu de sterk

78

Addendum

       

denaturerende oplossing in de rechterkamer van de gradiënt vormer met uitgang naar de pomp. Zorg dat de pomp afstaat bij het gieten. Zorg dat de gradiënt vormer op een roerder staat en een roervlo is toegevoegd aan de kamer waar de vloeistof de pomp verlaat. Zet de roerder aan (niet meer dan 300 rpm), en start tegelijkertijd de pomp en open de klep tussen de twee kamers. De pomp moet op een snelheid van 5 ml/sec staan Wanneer de kamers leeg zijn spoel ze dan onmiddellijk uit met mQ om alle restjes weg te wassen.poelen. Plaats ondertussen een klein laagje butanol op de gel om deze recht te maken Droog de kamers uit met papier Maak de oplossingen klaar voor de tweede gel te gieten en herhaal de volledige procedure Laat de gel polymeriseren voor minstens 2 uur

III. Gieten van de stacking gel  Verwijder het butanol en spoel met mQ. Droog de ruimte met absorberend papier  Plaats een kammetje tussen de platen  Neem 10 ml van de 0% acrylamide oplossing en voeg 100 µl 10% (w/v) APS en 8 µl TEMED toe  Giet 2 stacking gels door 5 ml van deze oplossing langs de kam tussen de platen te pipetteren  Laat de stacking gel 30 minuten polymeriseren IV. Voorbereiden van het Bio-Rad Dcode systeem  Het Dcode systeem (Biorad, Hercules, CA, VSA) wordt gevuld met 7 l running buffer (= 1x TAE)  Mix 140 ml 50x TAE met 6860 ml mQ  Zet het verwarmingselement aan en laat de buffer op de gewenste temperatuur komen (60°C) V. Het laden van de gel en starten van de elektroforese  Verwijder de kam uit de stacking gel  Neem 500 ml van de running buffer om de slotjes uit te spoelen m.b.v. een spuit  Neem de platen uit de casting stand en plaats ze in de bufferkamer (plaats hierbij de kleine plaat naar de bufferkamer)  Breng de bovenzijde van de klemmen op de ringen onder de bufferkamer  Duw beide klemmen gelijk naar de top van de bufferkamer zodat ze vastklikken  Wanneer de bufferkamer gevuld is met running buffer kunnen de PCR producten worden geladen. Hiervoor wordt 15 µl loading buffer (6x) toegevoegd aan 50 µl PCR product en van deze mix wordt meestal 25 µl geladen op de gel (in het geval van de klonen slechts 5 µl). Het laden van de gel gebeurt met een pipetman van 100 µl die past op speciale ladingstips met een hele smalle punt. Iedere 4-5 laantjes wordt een DGGE referentiemerker geladen, nodig voor normalisatie.  Plaats de bufferkamer in het Dcode systeem en vul de bufferkamer met 1x TAE  Zet het systeem aan, zowel de pomp als het verwarmingselement.

79

Addendum 

Start de elektroforese op 70 V gedurende 16.5 u pas wanneer de buffer een temperatuur van 59°C heeft bereikt

VI. Kleuren van de gel en visualisatie  Eenmaal de elektroforese voltooid is, schakel het Dcode systeem uit en wacht 15 s om het deksel te verwijderen  Neem de bufferkamer uit de tank en verwijder de platen uit de houder  Verwijder de klemmen en breng de platen naar het ethidiumbromide lokaal (zorg dat de platen geen gecontamineerd materiaal raken)  Verwijder een van de platen, verwijder de stacking gel en laat de gel voorzichtig vallen in SYBRGold bad. Breng de plaat terug naar buiten zonder deze te contamineren  Laat de gel kleuren gedurende een half uur  Na het kleuren breng je de gel voorzichtig op de plaat. Neem een foto onder het UV licht. Gebruik witte handschoenen bij het aanraken van de gel. Ecohandschoenen en paarse handschoenen laten vlekken na.  Bekomen profielen kunnen verwerkt worden via Bionumerics (Applied Maths, SintMartens-Latem, België) VII. Schoonmaak  Maak de kammen, klemmen en platen schoon met ethanol, alcanox en mQ  Verwijder de silicon grease van de spacers m.b.v. ethanol VIII. Materialen  Acrylamide solution Protogel 30% w/v acrylamide, 0.8% w/v bisacrylamide (37,5:1) Biozym (EC890) (1000 ml)  Formamide – 100% Sigma (100 ml)  Ureum Biozym (EC605) (1000 g)  TEMED Biozym (EC503) (25 ml)  APS Biozym (EC504) (25 g) 10% (w/v) APS solution in mQ Store at -20°C in aliquots of 1 ml  0.5 M EDTA (pH 8) 0.5 M (186.12 g/L) EDTA (MG 372.24) (Calbiochem, #324503) Voor bereiding van 500 ml, los 93.06 g EDTA op in 400 ml mQ en voeg 15-20 g NaOH toe om de pH op 8.0 te krijgen. Vul aan tot 500 ml met mQ. Autoclaveer in 1 L flessen en markeer het volume niveau om te corrigeren voor verdamping verlies met mQ. Check de pH na autoclavering en bewaar bij 4°C. Kleine volumes kunnen gesteriliseerd worden via microfiltratie.

80

Addendum 

 



  

50x TAE 242 g Tris-base 57.1 ml Glacial acetic acid (Merck) 18.61 g Na2EDTA of 100 ml 0.5 M Edta (pH 8.0) Autoclaveer en bewaar bij 4°C 1x TAE Running buffer 140 ml 50X TAE in 6860 ml mQ Denaturerende acrylamide oplossing (200ml) 54 ml 30% acrylamide oplossing (wordt een 8% acrylamide oplossing) 84 g ureum 80 ml 100% formamide 4 ml 50x TAE (wordt 1x TAE) Indien nodig, leng aan met mQ tot 200 ml 0% denaturerend acrylamide (200 ml) 4 ml 30% acrylamide oplossing 4 ml 50x TAE Leng aan met mQ tot 200 ml Water-verzadigd isobutanol 9.5 ml butanol in 100 ml mQ SYBR Gold oplossing 50 µl SYBR®Gold nucleic acid gel stain (Invitrogen, #S-11494) 500 ml 1x TAE DGGE referentie merker Target regio: V3-16S rRNA Primers: F+GC-F357/R518 Staal type: Humane feces Samenstelling:

Stam

Gram kleuring

LMG nummer

Bacteroides fragilis

Negatief

DSM 1396

Bacteroides thetaoitaomicron

Negatief

LMG 11262

Groei condities Cooked Meat Agar, 37°C, AA RCM, 37°C, AA

T

MRS of Columbia blood agar, 37°C, microaeroob (5% O2+10% CO2+85% N2)

T

MRS of Columbia blood agar, 37°C, microaeroob (5% O2+10% CO2+85% N2)

Enterococcus flavescens

Positief

LMG 13518

Enterococcus soliarius

Positief

LMG 12890

Leuconostoc fructosum

Positief

LMG 9498

T

MRS, 30°C, A

LMG 3287

T

RCM, 37°C, AA

LMG 1212

T

RCM, 37°C, AA

LMG 6400

T

MRS, 30°C, A

Clostridium oceanicum Clostridium butyricum Lactobacillus rhamnosus

Positief Positief Positief

T

M144, 37°C, AA

T

M144, 37°C, AA

T

M144, 37°C, AA

T

M144, 37°C, AA

Bifidobacterium longum

Positief

LMG 13197

Bifidobacterium bifidum

Positief

LMG 11041

Bifidobacterium lactis Bifidobacterium dentium A, aeroob; AA, anaeroob

Positief Positief

LMG 18314 LMG 11045

81

Addendum

     

Aanmaak: De stammen worden gecultiveerd zoals hierboven beschreven in de tabel De cellen worden geoogst met een plastic öse en geresuspendeerd in een 500 µl RS oplossing DNA wordt geëxtraheerd volgens de SOP-DNA-GN-1 of SOP-DNA-GP-2 Concentratie van het DNA wordt bepaald waarna het DNA wordt verdund tot een OD1 V3-16S rRNA PCR wordt uigevoerd zoals hierboven beschreven Na de PCR wordt 15 µl loading dye toegevoegd aan iedere PCR reactie en worden alle reacties samen gecombineerd in een eppendorf Patroon op gel:

82

Addendum BIJLAGE 9 : BAND EXTRACTIE EN SEQUENTIE PCR I.

DGGE Zorg ervoor dat uit te knippen banden ‘zuiver’ zijn op DGGE gel. Hiervoor kan een bandje uit 35-70% geknipt worden en meermaals opnieuw op gel gezet worden (met nauwere gradiënt) om een enkelvoudig bandje te bekomen. II. Band extractie Fotografeer de DGGE gel en print het resultaat. Duid hierop de te extraheren banden aan. 1. Plaats filtertip in het bandje en neem een deeltje op (onder UV licht) 2. Oplossen in epjes met 40 µl 1x TE buffer Als je onmiddellijk wil verder werken: epjes 10 min op 65°C warmen. Zoniet de epjes 1 nacht bij 4°C bewaren. Dit voor het oplossen van de gel die meekomt met de bandjes. III. V3-16S rRNA PCR Re-amplificeer de bandjes met het klassie V3-programma. Gebruik echter de primers F357 (zonder GC klem) en R-518 1. Mix: 1 reactie: 50µl Product 10x PCR buffer 1x BSA dNTP F357 (zonder GC klem): R518 mQ AmpliTaq polymerase Template DNA

Stock oplossing 10x

Eindconcentratie 1x

2 mM 5 µM 5 µM

0.1 mM 0.2 µM 0.2µM

5U/µl

6 µl 2.5 µl 2.5 µl 2 µl 2 µl 33.75 µl 0.25 µl 1 µl

2. Programma: 1x 1 min-95°C; 30x (30s-95°C, 45s-55°C, 1 min-72°C); 1x 7 min-72°C; 4°C … IV. Controle amplicons op agarosegel Controleer de grootte van de amplicons (verwacht 196 bp) op 1% agarosegel, na 45 min aan 75V in een 1x TBE bad. Breng hiervoor 5 µl staal + 2 µl Loading Dye op gel. Kleuring in SYBRsafe. Controleer met een kaart de sterkte van het amplicon en bepaal het elutievolume. Op de kaart staat bovenaan het PCR reactievolume (50 µl voor klassieke V3 PCR)

83

Addendum Opkuis en Elutie van amplicons (robot!) Breng het volledige volume (45 µl > want al 5 µl op gel gezet) over in de welletjes van een Machery-Nagel plaat. We werken hiervoor in verticale richting! Plaats de plaat op de robot, voor vacuüm te trekken (totdat welletjes droog zijn). Hierdoor worden resten van de PCR (behalve amplicons) verwijderd. Breng 100 µl mQ in de welletjes en plaats opnieuw op de robot voor vacuüm te trekken en op te kuisen. Breng vervolgens het gewenste elutievolume in de welletjes. Pipetteer op en neer en breng het geheel over in steriele epjes. Bewaar de epjes bij 4°C. V.

VI. Sequentie PCR Voer een 16S rRNA sequentie PCR uit. Maak hiervoor een mix aan met de forward primer als een mix voor de reverse primer. Elk staal wordt dus een keer met F (F357 zonder GC klem) en een keer met R (R518) op de sequentie PCR gestoken. 1. Mix: Product 5x sequentie PCR buffer Primer (4 µM) mQ Big Dye 3.1 Template DNA

1 reactie: 10 µl 1.857 µl 2 µl 1.857 µl 0.286 µl 3 µl

2. Programma: 30x (15s-96°C, 1s-35°C, 4min-60°C); 4°C… Mail na de sequentie PCR naar het Sequenator-Team om te vragen wanneer je de sequenties mag opkuisen. [email protected] VII. Opkuisen sequenties (in de trekkast!)  Vortex SAM (mag niet troebel zijn)  45 µl SAM/welletje van de Sequentie plaat (met elektrische pipet 20-200 µl)  Vortex X-term (continu, moet ‘lopend’ zijn)  10 µl X-term/welletje (met blunt tips) – vortex X-term tussendoor  20 µl PCR product/welletje (met 20 µl pipet, die op 15 µl staat)… en pipetteer op en neer  Niet zelf klevende folie over doen (best plaat wat tegen bench kloppen zodat X-term zakt)  30 min – 2000 rpm op de schudder  Centrifugeer: 3 min op 1000 rpm (programma 4 op de grote centrifuge van BCCM/LMG)  Folie verwijderen en septum plaatsen. Vervolgens plaat in de frigo van sequenator plaatsen  Sequeneer de amplicons op het PRISM® 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, VSA) toestel

84

Addendum VIII. Verwerking van de sequenties met Bionumerics v.5.1 De ABI sequenties worden ingeladen in Bionumerics. Aan de hand van de forward en reverse sequentie kan in de meeste gevallen een consensussequentie gevormd worden. Deze sequentie wordt geBlast tegen de EZtaxon database om een hit te krijgen met zijn nauwst verwante species. IX. Materialen  Agarose Result™LE agarose (BIOzym, #330050)  50x TAE 242 g Tris-base 57.1 ml Glacial acetic acid (Merck) 18.61 g Na2 EDTA of 100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) (Merck) Leng aan tot 1000 ml met mQ  GeneAmp® 10x PCR (Applied biosystems, #N8080006) Incl. 15 mM MgCl2 100 mM Tris-HCl, pH 8.3 (25°C) 500 mM KCl 0.01% Gelatine  AmpliTaq® DNA polymerase (Applied biosystems, #8080152) 12 x 250 units met Buffer I; 250 Units (5 U/µl)  Primers (Sigma)  Steriel mQ 1 ml aliquots in 2 ml Eppendorf Tubes Elke PCR mix wordt gemaakt met een ongeopend mQ tube  GeneAmp® dNTP Bevat 2mM van elke dNTP (Applied Biosystems, #N8080007) 300 µl van elke dNTP (10 mM) werd gemixt met 300 µl mQ. Maak aliquots van 750 µl per eppendorf tube  SmartLadder (Eurogentec) MW-1700-10 voor 1000 laantjes  Loading dye (6x) Bereiding 10 ml: 4 g sucrose (Merck) 25 mg bromophenolblauw (Sigma) 6 ml 1x TE buffer Vul aan met TE buffer tot 10 ml  TE buffer (pH 8.0) 1mM EDTA (pH 8.0) 10mM Tris-HCL Autoclaveer in 1 l flessen en markeer het volume niveau om achteraf te corrigeren voor verdampingsverliezen met mQ. Check de pH na autoclavering en bewaar bij 4°C. Kleine volumes buffer kunnen gestiriliseerd worden via microfiltratie.  ABI Prism®BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, VSA)  5X Sequentie PCR buffer Door life technologies geoptimaliseerd voor gecombineerd gebruik met BigDye Terminator v1.1 en V3.1 cycle sequencing kit.

85

Addendum



Samenstelling: Glycerol (10-30% weight) en Tris Base (1-10% weight) BigDye® XTerminator™ Purification kit (Applied Biosystems, USA) Bevat Big dye® Xterminator™ Solution: bewaar bij 2-8°C Bevat SAM™ Solution: bewaar bij 2-8°C

86

Addendum BIJLAGE 10: QIAEX II®GEL EXTRACTION KIT De QIAEXII Gel Extraction Kit kan bewaard worden op kamer temperatuur (15°C-25°C) gedurende 12 maanden. Nota’s vooraf  Dit protocol is voor het schoonmaken van DNA fragmenten van 40 bp tot 50 kb  De gele kleur van de buffer QX1 is een indicator van een pH ≤ 7.5  Voeg ethanol (96-100%) toe aan de PE buffer voor gebruik  Een hitte blok of warm water bad van 50°C is vereist  Alle centrifugatiestappen worden uitgevoerd op 17900 g (~13000 rpm) op kamertemperatuur  Voor zuivering van DNA afkomstig van polyacrylamide gels, zie handboek 1. Snij het DNA bandje uit de agarose gel met een steriele, scherpe scalpel. Gebruik een 1.5 ml eppendorfje voor het verwerken van 250 mg agarose per tube. 2. Weeg de gel af in een eppendorf. Voeg Buffer QX1 toe volgens de grootte van het fragment: 6 volumes voor < 100 bp; 3 volumes voor 100 bp – 4 kb; 3 volumes met 2 volumes water voor > 4 kb. Voeg 6 volumes buffer toe wanner gebruik gemaakt wordt > 2% of Metaphor agarose gels. (1 volume is het gewicht van het bandje in microliter). 3. Resuspendeer QIAX II door te vortexen gedurende 30 s. voeg QIAX II aan het staal en mix: Gebruik 10 µl QIAX II voor ≤ 2 µg DNA; 30 µl voor 2-10 µg DNA; en nog eens 30 µl per 10 µg extra DNA. ( gewicht te achterhalen door intensiteit bandje te vergelijken met SmartLadder). 4. Incubeer op 50°C voor 10 min om de agarose op te lossen en het DNA te binden. Mix om de 2 minuten door te vortexen om de QIAXII in oplossing te houden. Check de kleur van de oplossing. Wanneer de kleur niet langer geel is voeg je 10 µl 3M Natriumacetaat toe om de pH terug goed te krijgen. 5. Centrifugeer de stalen voor 30 s en verwijder voorzichtig het supernatans met een pipet. 6. Was de pellet met 500 µl Buffer QX1. Resuspendeer de pellet door te vortexen. Centrifugeer de stalen voor 30 s en verwijder voorzichtig al het supernatans met een pipet. Deze stap verwijdert resten van agarose. 7. Was de pellet 2x met 500 µl PE buffer. Resuspendeer de pellet door te vortexen. Centrifugeer de stalen voor 30 s en verwijder voorzichtig al het supernatans met een pipet. Deze stap verwijdert zout contaminanten. 8. Laat de pellet voor 10 à 15 minuten aan de lucht drogen. Als 30 µl QIAX II werd toegevoegd laat drogen voor 30 minuten. Ga niet vacuüm drogen. 9. Om het DNA te elueren, voeg 20 µl 10mM Tris Cml, pH8.5, TE buffer (10mM TrisCl, 1mM EDTA, pH 8.0), of water en resuspendeer de pellet door te vortexen. Incubeer volgens DNA fragment grootte: 5 min op kamer temperatuur (15-25°C) voor ≤ 4 kb; 5 min op 50°C voor 4-10 kb; of voor 10 min op 50°C voor > 10 kb. 10. Centrifugeer voor 30 s, en pipetteer het supernatans voorzichtig over in een nieuw epje. Het supernatans bevat nu het gezuiverd DNA.

87

Addendum BIJLAGE 11: QUBIT® dsDNA BR ASSAY KITS Dit is het protocol dat gebruikt wordt wanneer ook de standaarden, voor het kalibreren van de Qubit 2.0 fluorometer, nog moeten aangemaakt worden.  Gebruik 0.5 ml tubes voor de standaarden en de stalen. De Qubit dsDNA BR assay vereist twee standaarden Notie: gebruik enkel 0.5 ml tubes. Accepteerbare tubes zijn bijgevoegd in de Qubit® assay kit of Axygen® PCR-05-tubes  Label de tubes  Maak de Qubit werk oplossing aan door het Qubit® dsDNA BR reagens 1:200 te verdunnen in Qubit® dsDNA BR buffer. Gebruik een nieuwe plastic tube elke keer de Qubit® werk oplossing wordt aangemaakt.  Breng 190 µl werk oplossing in de tubes en voeg 10 µl van de standaarden toe.  Breng 195 µl werk oplossing in de tubes en voeg 5 µl van de te meten stalen toe  Mix alle stalen door te vortexen gedurende 2 à 3 sec. Vermijdt hierbij vorming bubbels  Incubeer alle tubes voor 2 min op kamertemperatuur  Op het scherm van de Qubit® 2.0 fluorometer, durk DNA, en selecteer dan dsDNA BROAD Range als assay type. Het scherm om de standaarden te meten verschijnt nu.  Selecteer run new Calibration op het scherm. Steek de tube met de eerste standaard in het toestel, sluit het deksel en druk op read. Doe hetzelfde voor de tweede standaard.  Na het kalibreren van de standaarden kunnen nu de stalen worden geanalyseerd

88

Addendum BIJLAGE 12: PROTOCOL VOOR ABSOLUTE KWANTIFICATIE VIA RT-PCR I. Voor het inzetten van de PCR  Oranje handschoenen aan: toestel aanzetten, controleer of blokje en carrousel niet op elkaar staan.  Handschoenen uit & computer aanleggen > inloggen > ProgramLightCycler3 Front Screen > RUN: stalen ingeven & parameters voor PCR instellen (DATA: data van vroeger oproepen).  Klik op RUN > OK en start self test II. Inzetten RT-PCR (flow)  Flow aanleggen: LAF > witte knop indrukken & lostlaten > light. Oranje handschoenen aandoen!  Ontsmetten met javel (Nahypochloriet)  PCR producten uit vriezer halen en ontdooien  Steek primer > primer > sensimix > SYBR Green > Enzym Mix verticaal in het koelelement.  Mix: spoel tips voor door op en neer te pipetteren. Begin met het grootste volume van de mix  Tik een beetje tegen de producten om deze te mengen (pas op voor schuimvorming bij de Enzym Mix)

Product Forward primer (5 µM) Reverse primer (5µM) SensiMix lite 50* SYBR Green Enzyme mix mQ Template DNA

1 reactie: 20µl 2 µl 2 µl 4 µl 0.4 µl 1.5 µl 8.1 µl 2 µl

groep Bifidobacterium spp.

Primers

Sequentie (5’-3’)

g-Bifid-F G-Bifid-R

CTCCTGGAAACGGGTGG GGTGTTCTTCCCGATATCTACA

Clostridium cluster XI

CXI-F

ACGCTACTTGAGGAGGA

55.7

CXI-R

ACGCTACTTGAGGAGGA

59.6

    

Annealing temperatuur (°C)

65 65

Verdeel de mix over de capillairen (verticale reeks in koelelement). Pipetteer onder een hoek van 45° in de hals van de capillairen. Tik tegen de stalen om deze te mengen, tips voorspelen en pipetteer dan in elk capillair 2 µl staal. Sluit een altijd een meetpunt in (ergens in het midden) Plaats met de pen de dopjes op de capillairen (lossen via de blauwe knop) Capillairen afdraaien op 0.7 rcf voor maximum 3 sec Verwijder je linkerhandschoen voor op de computer te werken, houd je rechter handschoen aan zodat je het toestel kan manipuleren

89

Addendum II. Werken met het RT-PCR toestel  Plaats de capillairen in de carrousel. Laat hierbij geen lege plaatsen (opletten bij plaats 27). Probeer de capillairen niet te breken.  Plaats de carrousel in het toestel, en sluit het.  Op de computer > open experiment file > kies juiste PCR programma  RUN: toestel klikt dicht  T° te volgen, bar plot (hoeveelheid), curve (blanco moet onder threshold blijven!),  Duurt ongeveer 45 min  Kuis ondertussen materiaal en flow op

PCR programma gebruikt bij absolute kwantificatie van Clostridium cluster XI

PCR programma:

45 cycli

Temperatuur (°C)

Tijd (s)

Initiële denaturatie

95

120

Denaturatie

95

20

Annealing

60

30

Elongatie

72

45

Smelt curve

95-70-95

0-30-0

PCR programma gebruikt bij absolute kwantificatie van Bifidobacteriaceae

PCR programma:

45 cycli

III.

  

Temperatuur (°C)

Tijd (s)

Initiële denaturatie

95

300

Denaturatie

95

0

Annealing

60

5

Elongatie

72

23

Smelt curve

95-70-95

0-30-0

Materialen Steriel mQ 2 ml aliquots in 5 ml tubes Primers Primer sequenties afhankelijk van de assay Bewaren bij -20°C SensiMix Capillary Kit (Bioline) Enzymemix Sensimix SYBR Green MgCl2

90