Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE.
Woord vooraf Eerst en vooral wil ik mijn familie en vrienden bedanken voor alle steun tijdens mijn studies en mijn stage. Ik grijp natuurlijk de kans om al mijn lectoren van de richting Biomedische laboratoriumtechnologie (Hogeschool West-Vlaanderen dep. Simon-Stevin) te danken voor al hun geduld en begrip tijdens mijn opleiding. En vooral Mevr. Demeyere en Mr. Quartier voor hun begeleiding voor en tijdens mijn stage en bij het maken van mijn eindwerk. Ik dank ook iedereen van het labo Protistologie en Aquatische ecologie (Universiteit Gent), vooral Ineke van Gremberghe, Sofie D’hondt, Tine Verstraete en AnnEline Debeer voor de begeleiding tijdens mijn stage en het maken van mijn eindwerk en voor alle tips en opmerkingen tijdens mijn stage. In bijzonder wil ik mijn zusje danken en veel succes wensen met haar eigen stage en eindwerk. Ik wens u veel leesplezier, Annelies
1
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE.
Samenvatting In het kader van het project B-Blooms2 worden er stalen uit het Donkmeer (Berlare) en de vijver in het Westveldpark (Sint-Amandsberg) onderzocht. Het is de bedoeling om de toxische cyanobacteriën en de verschillende genotypes van Microcystis en Planktothrix te identificeren die aanwezig zijn in stalen uit deze meren. Op de stalen gebeurt een DNA-extractie. Deze producten ondergaan een PCR (Polymerase chain reaction), een 16S-PCR of een ITS-PCR (Internal transcribed spacer), zodat er enkel stukjes DNA over blijven die even groot zijn. De PCRproducten worden via DGGE (Denaturerende Gradiënt Gel Elektroforese) geanalyseerd en zo worden alle fragmenten van verschillende cyanobacteriën en de verschillende genotypes gescheiden op basis van hun sequentieverschillen. De bandjes worden uitgeknipt en gesequeneerd. Op de DGGE-gels van de stalen uit de vijver in het Westveldpark zijn er veertien verschillende genotypes Microcystis terug te vinden in een jaar tijd. Na sequeneren van de bandjes zijn de volgende cyanobacteriën gevonden in het Donkmeer: Synechococcus en Anabaena of Aphanizomenon. In het voorjaar en tijdens de zomer zijn er ongeveer evenveel soorten cyanobacteriën terug te vinden, alleen zijn er in de zomer andere soorten. In het najaar zijn het er opmerkelijk minder. Er zijn zeven bandjes terug te vinden op de gels van Planktothrix, maar men moet rekening houden met de twee verschillende ITS-sequenties per stam. Acht verschillende bandjes zijn er over alle stalen terug te vinden. Het aantal genotypes in het najaar is hoger dan deze tijdens de zomer.
2
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE.
Lijst met afkortingen en symbolen Ampli Taq = DNA-polymerase APS = Ammoniumpersulfaat Bp = Basenparen BSA = Bovine Serum Albumine DGGE = Denaturatie Gradiënt Gel Eletroforese DNA = Deoxyribonucleïnezuur dNTP = Algemene term voor de vier deoxyribonucleotiden EDTA = Ethyleen-diamine-tetra-acetaat EtBr = Ethidiumbromide ELISA = Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay HPLC = High Performance Liquid Chromatography Hz = Hertz NaAc = Natriumacetaat ITS = Internal transcribed spacer ICBN = International Code of Botanical Nomenclature ICNB = International Code of Nomenclature of Bacteria PCR = Polymerase Chain Reaction pH = Uitdrukking voor de zuurtegraad rpm = Rounds per minute rRNA = Ribosomaal RNA S (eenheid) = Svedberg TAE = Tris-Acetaat-EDTA TE = Tris-EDTA TEMEd = N,N,N,N-tetramethylethyleendiamine UV = Ultra violet
3
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE.
Verklarende woordenlijst Actinomyces = Soort bacterie Adenylatie = Vorming van de poly-A-staart van mRNA Amplificeren = Repliceren Carotenoïden = Groep van gele tot rode pigmenten Chlorofyl a = Groene kleurstof die altijd aanwezig is in de chloroplasten Eutrofie = Goede voedingstoestand Fotoautotrofie = De mogelijkheid van een organisme om chemische energie op te slaan die aangemaakt is onder invloed van licht die als energiebron wordt gebruikt Fycobilisomen = Complexe structuren die proteïnen als pigmenten bevatten en zijn terug te vinden op de thylakoïden van het plasmamembraan Fycocyanine = Blauwe kleurstof Fycoerytrine = Roodbruine kleurstof Fylogenie = De beschrijving van hoe de ene groep organismen is ontstaan uit andere groepen Fytoplankton = Plankton dat afhankelijk is van licht om te leven Heterocyst = Gespecialiseerde stikstof-fixerende cel die door sommige filamenteuze cyanobacteriën wordt gevormd bij stikstoftekort Heterotrofie = Voedingstoffen die een organisme nodig heeft werd aangemaakt door een ander organisme Hormogonium = Korte, terminale draadstukjes die loskomen Microcystine = Toxines geproduceerd door Microcystis Motiliteit = vermogen om spontaan te bewegen Paralytisch = verlammend Protozoën = Eencellige, eukaryotische micro-organismen Thylakoïd = Membraan gebonden compartiment in chloroplasten en cyanobacteriën Trichome = Langwerpige haar-achtige structuur 4
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE.
Turgordruk = Druk van celinhoud op de celwand doordat de celwand zich niet kan uitzetten Zoetwater = Water met lage concentraties zout en andere stoffen
5
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE.
Lijst van tabellen en figuren
Figuur 1.1: Het Donkmeer .................................................................................. 14 Figuur 1.2: Het Westveldpark ............................................................................ 14 Figuur 2.1: Thylakoïd
Figuur 2.2: Fycobilisomen 17
Figuur 2.3: Bloei in rivier in het Westveldpark................................................. 18 Figuur 2.4: Gasvacuolen (Microcystis) ............................................................. 19 Figuur 2.5: structuur microcystine ................................................................... 23 Figuur 2.6: structuur nodularine ....................................................................... 24 Figuur 2.7: Structuur anatoxine-a
Figuur 2.8: Structuur homoanatoxine-a
................................................................................................................. 25 Figuur 2.9: Structuur Anatoxine-a(S) ................................................................ 25 Figuur 2.10: Structuur saxitoxine ..................................................................... 25 Figuur 2.12: Kolonie van Microcystis
Figuur 2.13: Microcystis
bloeien .................................................................................................... 30 Figuur 2.14: Illustratie 16S rDNA en rRNA ITS ................................................. 32 Figuur 2.15: microcystine synthetase (mcy) gencluster ................................. 33 Figuur 2.16: Planktothrix ................................................................................... 34 Figuur 2.17: Principe DGGE .............................................................................. 35 Figuur 3.1: Schema werking spectrofotometer ............................................... 54 Figuur 3.2: De gelkamer van de DGGE ............................................................. 55 Figuur 3.3: De gradiënt-houders ....................................................................... 56 Figuur 3.4: Opstelling DGGE gieten stacking gel ............................................ 57 Figuur 3.5: Het kernsysteem ............................................................................. 58 6
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE.
Figuur 3.6: De bufferbak DGGE ......................................................................... 58 Figuur 3.7: Benodigdheden DGGE ................................................................... 59 Figuur 4.1: Agarosegel cyanospecifieke PCR2 Donkmeer ............................. 65 Figuur 4.2: Agarosegel Microcystis-specifieke PCR2 Westveld .................... 66 Figuur 4.3: Agarosegel Planktothrix-specifieke PCR2 Donkmeer ................. 66 Figuur 4.4: DGGE-gel Donkmeer cyanospecifieke PCR ................................. 67 Figuur 4.5: DGGE-gel Westveld Microcystis-specifieke PCR ......................... 68 Figuur 4.6: gel ITS Westveld door D'hondt S.
Figuur 4.7: gel ITS
Westveld Verschuere A. ........................................................................ 69 Figuur 4.8: Gel Westveld M. viridis en M. aeruginosa ..................................... 71 Figuur 4.9: Gel Donkmeer + Planktothrix ......................................................... 72
7
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE.
Inhoudsopgave
1
Inleiding, situatieschets en probleemstelling
12
2
Literatuurstudie
15
2.1
CYANOBACTERIËN
15
2.1.1
INLEIDING
15
2.1.2
VOORKOMEN
15
2.1.3
FOTOSYNTHESE
16
2.1.4
STIKSTOFFIXATIE
17
2.1.5
OORZAKEN CYANOBACTERIËLE BLOEIEN (Figuur 2.3)
18
2.1.6
ECOLOGIE VAN BLOEIEN
21
2.1.7
CYANOBACTERIËLE TOXINES
23
2.1.8
GEVOLGEN
27
2.1.9
BESTRIJDING
29
2.1.10
MICROCYSTIS
30
2.1.11
POPULATIESTRUCTUUR VAN MICROCYSTIS VIA ITS-DGGE
31
2.1.12
PLANKTOTHRIX
34
2.2
DGGE
35
3
Materialen en methoden
38
3.1
DNA-extractie
38
3.1.1
Principe
38
3.1.2
Protocol Voorbereidend werk
38
3.1.3
Materiaal
40
3.2
Zuivering van geëxtraheerd DNA
41
3.2.1
Principe
41
3.2.2
Protocol
41
3.2.3
Materiaal
42
3.3
Polymerase Ketting Reactie
42 8
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE.
3.3.1
Principe
42
3.3.2
Protocol
45
3.3.3
Materialen
48
3.4
Zuivering van PCR-product
49
3.4.1
Principe
49
3.4.2
Protocol
50
3.4.3
Materiaal
50
3.5
Agarose-gelelektroforese
50
3.5.1
Principe
50
3.5.2
Protocol
51
3.5.3
Materiaal
53
3.6
Spectrofotometer
53
3.6.1
Inleiding
53
3.6.2
Principe
53
3.7
DGGE
54
3.7.1
Principe
54
3.7.2
Protocol
54
3.7.3
Materiaal
59
3.8
Uitgesneden banden
60
3.8.1
Protocol
60
3.9
Cycle sequencing
61
3.9.1
Principe
61
3.9.2
Protocol
61
3.9.3
Materiaal
62
3.10
Zuiveren van het cycle sequencing product
62
3.10.1
Principe
62
3.10.2
Protocol
62
3.10.3
Materiaal
63
Sequeneren
63
3.11
9
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE.
4
Resultaten
65
4.1
Algemeen
65
4.1.1
DNA-extractie
65
4.1.2
Zuivering geëxtraheerd DNA
65
4.1.3
PCR
65
4.1.4
Zuivering PCR-product
67
4.1.5
DGGE
67
4.1.6
Cycle sequencing
69
4.2
Westveld – Microcystis
69
4.2.1
Diversiteit
69
4.2.2
Temporele dynamiek
70
4.2.3
McyA en McyE gendetectie PCR
71
4.3
Donkmeer – cyanobacteriën
71
4.3.1
Diversiteit
71
4.3.2
Temporele dynamiek
73
4.3.3
McyA en McyE gendetectie PCR
73
4.4
Donkmeer – Planktothrix
73
4.4.1
Diversiteit
73
4.4.2
Temporele dynamiek
73
5
Conclusie
74
5.1
Westveld – Microcystis
74
5.2
Donkmeer – cyanobacteriën
74
5.3
Donkmeer - Planktothrix
74
Literatuurlijst
75
Bijlagen
78
Bijlage 1: Vorming van schuimende bloeien
79
Bijlage 2: Principe PCR-zuivering
80
Bijlage 3: Principe Cycle Sequencing
81
Bijlage 4: DGGE gels Westveld – Microcystis
85 10
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE.
Bijlage 5: DGGE gels Donkmeer – Cyanobacteriën
88
Bijlage 6: Gels ITS Westveld Sofie D’hondt
91
Bijlage 7: Grafiek tellingen M. viridis en M. aeruginosa door Jeroen van Wichelen. 94 Bijlage 8: Resultaten PCR mcyA en mcyE op de stalen van het Westveldpark.
95
Bijlage 9: Grafiek tellingen Anabaena, Aphanizomenon en Planktothrix door Maureen Fagot.
96
Bijlage 10: Resultaten PCR mcyA en mcyE op de stalen van het Donkmeer.
97
Bijlage 11: DGGE gels Donkmeer – Planktothrix Sofie D’hondt
98
Colofon
100
Voor akkoord verklaring
101
11
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
1
Inleiding, situatieschets en probleemstelling
Cyanobacteriënbloeien,
massa-ontwikkeling
van
cyanobacteriën
die
op
het
wateroppervlak drijven, zijn een terugkerend en een toenemend belangrijk fenomeen in zoetwateren wereldwijd de laatste decennia. De vorming van zo’n bloeien staan in verband met zuurstoftekort in wateren. (Chorus, 2001) De onaangename bloeien vormen een groot gevaar voor de menselijke en dierlijke gezondheid en bemoeilijken het gebruik van oppervlaktewater voor onder andere drinkwater, recreatie, irrigatie en vissen. Zo’n 25 tot 70% van deze bloeien zijn toxisch. (Sivonen, 1996) Cyanotoxines worden vooral in het water vrij gelaten tijdens het afsterven van de bloeien. Inname of contact met water die cyanobacteriële cellen of toxines bevatten, kunnen gezondheidsproblemen veroorzaken. (Bell en Codd, 1996; Carmichael et al., 2001; de Figueiredo et al., 2004; Dittman en Wiegang, 2006) Drie partners (UGent, ULg en FUNDP) begonnen het BELPSO project B-BLOOMS drie jaar geleden in betrekking tot het tekort aan kennis over de situatie in België. Er werd aangetoond dat de oppervlaktewateren in België ook geteisterd zijn door cyanobacteriële bloeien vooral in de zomer en herfst. 80% van deze bloeien bevatten taxa die de mogelijkheid bezitten om microcystines aan te maken. De behoefte om bloeien in België te controleren werd bevestigd in de scriptie van Willame et al. (2005) waar 35% van de geanalyseerde bloeistalen microcystines bevatten. In januari 2007 is het vervolgproject B-Blooms2 opgestart. Dit vierjarig voorstel streeft naar: - Betere kennis over cyanobacteriële bloeien in België - Verbeterde modellen voor voorspelling en vroege waarschuwing - Ontwikkeling van operatieve controlestructuren en –werktuigen - Voorstellen om de impact te verminderen.
12
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
Van een wetenschappelijk standpunt zal het onderzoeksprogramma zich richten tot: - Metingen van de voornaamste toxines aanwezig in bloeien en waterstalen door analytische methoden, ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) en massa spectrofotometrie - Het verzamelen van fysische, chemische, biologische en meteorologische data van enkele referentiewateren die plagen van toxische cyanobacteriële bloeien doormaken - Identificatie en studie van toxische cyanobacteriën aanwezig in Belgische stalen, op basis van moleculaire technieken op stalen en stammen, waaronder de genetische diversiteit en factoren die de toxiciteit bepalen - Ontwikkeling
en
testen
van
management
scenario’s
voor
controle
van
cyanobacteriële bloeien in een vijver - Ontwikkeling van statistisch voorspellende modellen voor een aantal stedelijke ponden Uit een praktisch en wetenschappelijk beleid zal B-BLOOMS: - Het netwerk van staalnemers aanvullen op basis van bestaande controleprogramma’s
van
oppervlaktewateren
of
van
samenwerking
met
gezondheidsautoriteiten of milieuorganisaties - De kennis over controlemethoden en analyse van bloeien uitwisselen die ontwikkeld worden voor de water- of gezondheidsautoriteiten en milieuorganisaties door het geven van cursussen in labo’s. - De communicatie met de autoriteiten en bevolking versterken, de waakzaamheid van het publiek verhogen, bijdragen tot toekomstige richtlijnen en risicobeoordeling en de controle en beheer verbeteren. Deze stage maakt onderdeel uit van het gedeelte “Identificatie en studie van toxische cyanobacteriën aanwezig in Belgische stalen, op basis van moleculaire technieken op stalen en stammen, waaronder de genetische diversiteit en factoren die de toxiciteit bepalen.”
13
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
De concrete doelstellingen van de stage zijn: - De
diversiteit
en
temporele
dynamiek
van
bloeivormende
cyanobacteriën
bestuderen in het recreatiemeer Donkmeer (Berlare-Overmere) (Figuur 1.1) - De diversiteit en temporele dynamiek van een Planktothrix populatie nagaan in het recreatiemeer Donkmeer (Berlare) - De diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis populatie nagaan in de vijver van het Westveldpark (St-Amandsberg-Gent) (Figuur 1.2)
Figuur 1.1: Het Donkmeer
Figuur 1.2: Vijver in het Westveldpark
14
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
2
Literatuurstudie
2.1 CYANOBACTERIËN 2.1.1 INLEIDING Deze
groep
micro-organismen
zijn
unicellulaire
of
multicellulaire
prokaryoten die chlorofyl bezitten en aan fotosynthese doen (Chorus I. en Bartram J. et al., 1999). Hun naam is afkomstig van hun typische kleur cyaan (blauw-groen) bekomen door de blauwe kleurstof fycocyanine, ze worden daarom ook vaak blauwalgen of blauwwieren genoemd (Wikipedia). 2.1.2 VOORKOMEN (Chorus J. en Bartram J. et al., 1999) Cyanobacteriën zijn vaak de eerste organismen die op kale gebieden van steen of bodem koloniseren. Hun aanpassingen aan de omgeving verhogen hun geschiktheid voor de onbeschutte landomgeving. De meeste habitatten van cyanobacteriën zijn mariene omgevingen en omgevingen waar geen andere microalgen kunnen overleven. Ze kunnen onvruchtbare gronden zoals vulkanische as, woestijnzand en stenen koloniseren. Een ander opmerkelijk kenmerk is het overleven van extreem hoge
en
lage
temperaturen.
Cyanobacteriën
zijn
bewoners
van
warmwaterbronnen, bergstromen, noord- en zuidpoolmeren, sneeuw en ijs. Ze zijn ook terug te vinden in een hele reeks watertypes, van zuurstofarme zones tot zuurstofrijke zones.
15
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
2.1.3 FOTOSYNTHESE (Chorus I. en Bartram J. et al.,1999) De meerderheid van de cyanobacteriën zijn aërobe fotoautotrofen. Fotosynthese is de methode die ze gebruiken om energie te maken. Enkel stikstof, koolstofdioxide, water en minerale elementen zijn nodig voor de groei in het licht door gebruik te maken van zonne-energie. Hierdoor wordt hun metabolische en biosynthetische mechanisme aangedreven. In hun natuurlijke omgeving kunnen sommige species overleven in volledige duisternis gedurende een lange periode. De fotosynthetische pigmenten van cyanobacteriën zijn terug te vinden in de thylakoïden (Figuur 2.1) die vrij in het cytoplasma dicht bij het celoppervlak terug te vinden zijn. De celkleuren verschillen van blauwgroen tot violetrood. Het groen van chlorofyl a is meestal gecamoufleerd door carotenoïden en andere bijkomende pigmenten. Met de bijkomende pigmenten kunnen ze de regio van het lichtspectrum gebruiken dat gelegen is tussen de absorptiepieken van chlorofyl a en de carotenoïden.
De
ononderbroken
fotosynthetische
groei,
in
de
aanwezigheid van zuurstof en water (hun elektrondonor voor de CO2 reductie), maakt het mogelijk om een groot gamma van ecologische gebieden te koloniseren. Kleuraanpassingen zijn grotendeels te wijten aan een verandering in de verhouding tussen fycocyanine en fycoerytrine in de fycobilisomen (Figuur 2.2). Zo kunnen cyanobacteriën de bijkomende pigmenten aanmaken die nodig zijn om licht zo efficiënt mogelijk te absorberen in een habitat.
16
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
Figuur 2.1: Thylakoïd
Figuur 2.2: Fycobilisomen
2.1.4 STIKSTOFFIXATIE (Chorus I. en Bartram J. et al.,1999) Dit is een fundamenteel metabolisch proces voor cyanobacteriën. Stikstof wordt onmiddellijk omgezet tot ammonium door middel van het enzym nitrogenase. Stikstoffixerende cyanobacteriën zijn algemeen verspreid over de filamenteuze, heterocyst vormende genera. Maar er zijn er ook die geen heterocysten vormen. Bloeien van deze species in zoetwater en mariene omgevingen zijn een wereldwijd fenomeen.
17
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
2.1.5 OORZAKEN CYANOBACTERIËLE BLOEIEN (Figuur 2.3) (Chorus I. en Bartram J. et al., 1999) Bloeien zijn te zien als dikke vlokken die drijven op het wateroppervlak. Ze ontstaan door massale ontwikkeling van cyanobacteriën bij ideale groeiomstandigheden.
Figuur 2.3: Bloei in rivier in het Westveldpark
2.1.5.1 Lichtintensiteit
Veel cyanobacteriën zijn gevoelig voor langdurige periodes van hoge lichtintensiteiten. Lange blootstellingen aan lichtintensiteiten van 320 µE/ms zijn dodelijk voor veel species. Cyanobacteriën groeien op hun maximale snelheid bij blootstelling met tussenpozen bij deze hoge lichtintensiteit. De bloeivormers blijken een hogere tolerantie te hebben voor hoge lichtintensiteiten. Ze worden gekenmerkt door hun gunstige energiebalans. Hun constante onderhoud is laag, ze hebben enkel een beetje energie nodig 18
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
om hun celfunctie en –structuur te behouden. Zo kunnen cyanobacteriën een relatief hogere groeisnelheid behouden wanneer de lichtintensiteiten laag zijn. De cyanobacteriën hebben daarom een competitief voordeel in meren die troebel zijn door dichte bloeien van ander fytoplankton. De mogelijkheid om te groeien bij lage lichtintensiteiten en om bepaalde specifieke lichtkwaliteiten op te nemen, maakt het hen mogelijk om te groeien in de schaduw van ander fytoplankton. 2.1.5.2 Gasvacuolen
Veel species van cyanobacteriën bezitten gasvacuolen (Figuur 2.4) die terug te vinden zijn in het cytoplasma. Deze celorganellen geven aan de cyanobacteriën een lagere densiteit dan water en een drijfvermogen. Gasvacuolen geven de species een ecologisch belangrijk mechanisme waardoor ze zich verticaal kunnen aanpassen qua positie in een waterkolom. Cyanobacteriën kunnen balanceren in verticale gradiënten van fysische en chemische factoren dankzij hun drijfvermogensysteem. Zo zoeken ze hun optimale plaatsje voor groei en om te overleven. Gasvacuolen komen meer van pas bij verminderd licht. Toenemende turgordruk (druk van de inhoud van een cel tegen de celwand door osmose) van cellen kan een vermindering van gasvacuolen veroorzaken en daardoor een verminderd drijfvermogen.
Figuur 2.4: Gasvacuolen (Microcystis)
19
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
2.1.5.3 Fosfor en stikstof
Buitensporige aanvoer van nutriënten wordt vaak gezien als een oorzaak van zoetwater cyanobacteriënbloeien. Hoewel nutriëntenverrijking bloeiformatie bevordert, zijn de nodige factoren complex. Deze kunnen een slechte waterstroom en een afwisseling van het ecosysteem van het meer zijn, zoals het terrein vrijmaken, landbouw en waterbeheer (Florida fish and wildlife conservation commission, 2008). Omdat cyanobacteriënbloeien ontwikkelen in eutrofisch water wordt aangenomen dat hoge stikstof- en fosforconcentraties nodig zijn, hoewel cyanobacteriënbloeien vaak voorkomen bij lage fosforconcentraties. De affiniteit van cyanobacteriën voor stikstof en fosfor is hoger dan deze voor veel andere fotosynthetische organismen. Als toevoeging hebben cyanobacteriën een aanzienlijke opslagcapaciteit voor fosfor. Ze kunnen genoeg fosfor opslaan om twee tot vier celdelingen te ondergaan, wat overeenkomt met een vier tot 32 maal grotere biomassa. 2.1.5.4 Populatiestabiliteit
Terwijl veel algen aangetast worden door allerlei dieren, gebeurt dit in een mindere mate bij cyanobacteriën. De impact van de aantasting door sommige gespecialiseerde protozoën is meestal niet aanzienlijk. Cyanobacteriën worden aangevallen door virussen, bacteriën en Actinomyces. Door de afbraak, dus een kleinere populatie, en hun regulatie van hun drijfvermogen voorkomt bezinking. Daardoor is het aantal cyanobacteriële populaties dat verloren gaat, laag. Hun lage groeisnelheid wordt gecompenseerd door het hoge aantal populaties eens ze gevormd zijn.
20
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
2.1.5.5 Temperatuur
Maximale groeisnelheden komen voor bij cyanobacteriën bij een temperatuur van 25°C. Deze optimale temperatuur is hoger dan die voor groene algen. Dit verklaart waarom cyanobacteriën bloeien vormen in water met een gematigde temperatuur en noordelijk water tijdens de zomer. 2.1.6 ECOLOGIE VAN BLOEIEN (Chorus I. en Bartram J. et al., 1999) Een aantal cyanobacteriën ontwikkelen een groot aantal kolonies van kokken of filamenten tijdens de vegetatieve periode. Deze zijn niet homogeen verdeeld over de waterkolom. Volgens de wet van Stokes is de sedimentatiesnelheid afhankelijk van het verschil in dichtheid tussen water en de cellen en de grootte van het deeltje (koloniegrootte). Het aantal fotosynthetiserende cellen in een kolonie aan het wateroppervlak is hoog en slaan grote hoeveelheden koolhydraten op. Deze koolhydraten zijn een zware ballast en zorgen ervoor dat er cellen zinken in een kolonie. Grote kolonies zinken sneller dan kleine of aparte cellen die nauwelijks verticale beweging in het water vertonen. Kolonies verlaten het eutrofisch gebied door zinking naar de dieper gelegen donkere waterlagen. Daar gebruiken ze hun opgeslagen koolhydraten tijdens de ademhaling en synthese van nieuwe gasvesikels. Dan worden ze terug drijvend en keren terug naar de eutrofische zone. De regulatie van het drijfvermogen maakt het de kolonies mogelijk om zich naar plaatsen met licht die optimaal zijn voor hun groei te verplaatsen. Overnacht kunnen alle kolonies drijvend zijn en sommige kunnen zich op het wateroppervlak opstapelen waar ze samen geblazen kunnen worden door de wind. Zo worden stabiele schuimen gevormd met de wind mee langs de kusten (Bijlage 1).
21
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
De fotosynthese gaat sneller dan de ademhaling in gematigde klimaten, wanneer de temperatuur daalt in de herfst. Zo wordt de hoeveelheid koolhydraten niet verbruikt en zinken de kolonies tot aan de bodem waar ze de winter doorbrengen met een geleidelijke daling van hun koolhydraten door ademhaling of fermentatie. Cellen die opstijgen van de bodem in de lente zijn unicellair en vormen zeer kleine kolonies. Microcystis species worden dan moeilijk herkend in stalen en worden enkel verdacht als de kolonies groeien in grootte tijdens de vroege zomer. Regulatie van het drijfvermogen kan een voordeel zijn in competitie met andere fytoplankton organismen. Maar dit type regulatie is enkel mogelijk in wateren met een kleine of ondiepe eutrofische zone in vergelijking met de diepte van de verticale migratie. Daarom worden bloeien van Microcystis species vooral teruggevonden in wateren dieper dan drie meter in gematigde klimaten. Maar ook in ondiepe meren, waar er geen verticale migratie mogelijk is, kunnen Microcystis species dominant voorkomen en bloeien vormen. Veel cyanobacteriën kunnen hoge lichtintensiteiten gedurende lange perioden niet overleven. Microcystis species zijn minder gevoelig door hun drijfvermogen. Dit maakt het hen mogelijk om de optimale lichtconditie te vinden voor hun groei. Dit betekent dat de aanwezigheid van Microcystis niet enkel beperkt is tot de eutrofische zone.
22
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
2.1.7 CYANOBACTERIËLE TOXINES (Chorus I. en Bartram J. et al., 1999) De cyanotoxines zijn een diverse groep van natuurlijke toxines. De meesten die geïdentificeerd zijn blijken vooral schadelijk te zijn voor landelijke zoogdieren ondanks het feit dat ze van aquatische oorsprong zijn. Cyanobacteriën maken een grote variëteit aan opmerkelijke metabolieten aan. Onderzoek wordt over het algemeen gefocust op de metabolieten die schadelijk zijn voor de mens en het vee. De alkaloïde toxines zijn een diverse groep in zowel hun chemische structuur als hun toxiciteit bij zoogdieren. Alkaloïden hebben meestal een matig moleculair gewicht (< 1 000 Da). Ze worden vooral door planten en sommige bacteriën gemaakt en zijn meestal toxisch. 2.1.7.1 Hepatotoxisch cyclische peptiden
De meest frequent gevonden cyanobacteriële toxines in bloeien uit zoetwater zijn de cyclische peptide toxines van de microcystine (Figuur 2.5) en nodularine (Figuur 2.6) familie. Volgens testen op muizen zouden de cyanobacteriële hepatotoxines de dood veroorzaken door leverbloeding binnen enkele uren na inname van een acute dosis.
Figuur 2.5: structuur microcystine
23
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
Figuur 2.6: structuur nodularine
Deze cyclische peptiden zijn relatief grote natuurlijke producten met een moleculair gewicht van 800 tot 1100 Da. Ze zijn wateroplosbaar en kunnen dus het lipidenmembraan van dieren, planten en bacteriecellen niet doordringen, behalve enkele die iets meer hydrofoob zijn. Daarom moeten ze in de cel opgenomen worden via membraantransporters om hun toxische effect te hebben. Dit beperkt het aantal doelwitorganen bij zoogdieren tot de lever. In waterige omgevingen blijven deze toxines meestal in de cyanobacteriële cellen en worden enkel vrijgesteld bij cellyse. Microcystines worden geproduceerd door bloeivormende species van Microcystis, Anabaena, Oscillatoria (Planktothrix) en Nostoc hibernicus. Nodularines worden enkel teruggevonden bij Nodularia spumigena en bij de spons Theonella. Van andere species moet nog aangetoond worden dat ze microcystines produceren. 2.1.7.2 Neurotoxische alkaloïden
Neurotoxische cyanobacteriën die voorkomen in grote hoeveelheden veroorzaken vergiftigingen bij dieren. Muizen sterven door ademhalingsstilstand bij testen na twee tot dertig minuten.
24
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
Er zijn drie families gekend bij de cyanobacteriële neurotoxines: •
Anatoxine-a (Figuur 2.7) en homoanatoxine-a (Figuur 2.8) (Ze hebben een zelfde effect als acetylcholine.),
Figuur 2.7: Structuur anatoxine-a
•
Figuur 2.8: Structuur homoanatoxine-a
Anatoxine-a(S) (Figuur 2.9) (Dit is een anticholinesterase.),
Figuur 2.9: Structuur Anatoxine-a(S)
•
Saxitoxine of schelpdier verlammend vergif (Figuur 2.10) (Remmen de neurologische signaaloverdracht door binding aan Na/K kanalen.).
Figuur 2.10: Structuur saxitoxine
25
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
• • • •
Anatoxine-a wordt teruggevonden bij Anabaena, Oscillatoria en Aphanizonmenon, Homoanatoxine-a bij Ascillatoria, Anatoxine-a(S) bij Anabaena Saxitoxines bij Aphanizomenon, Anabaena, Lyngbya en Cylindrospermapsis.
2.1.7.3 Cytotoxische alkaloiden
Het alkaloïde hepatotoxine cylindrospermopsine met zijn compleet ander mechanisme van toxiciteit heeft al veel gezondheidsproblemen veroorzaakt in drinkwatervoorzieningen in tropische en subtropische gebieden. Het is een cyclische alkaloïde met een moleculair gewicht van 415 Da. Ze worden aangemaakt door Cylindrospermopsis raciborskii, Umezakia natans en Aphanizomenon ovalisporum. In zijn oorspronkelijke vorm tast het de lever aan, maar worden ongezuiverde extracten van de C. raciborskii geïnjecteerd of oraal in genomen, dan kan dit de nieren, milt, zwezerikken en het hart bij muizen aantasten. 2.1.7.4 Dermatoxische alkaloïden
Cyanobacteriën zoals Lyngbya, Oscillatoria en Schizothrix kunnen toxines produceren die ernstige dermatitis veroorzaken als zwemmers in contact komen met deze filamenten. 2.1.7.5 Irriterende toxines – lipopolysacchariden
Lipopolysacchariden (LPS) worden vooral teruggevonden in het buitenste membraan van de celwand van Gram negatieve bacteriën waaronder cyanobacteriën. Daar vormen ze complexen met proteïnen en fosfolipiden. Ze zijn koorstverwekkend en toxisch.
26
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
2.1.7.6 Andere bioactieve bestanddelen
Cyanobacteriën maken ook andere bioactieve bestanddelen aan waarvan sommige van medisch belang zijn, zoals stoffen die toxisch zijn voor andere cyanobacteriën. Ze zouden een rijke bron van biomedisch belangrijke stoffen zijn. Ze maken antitumor, antivirale, antibiotische en antifungische bestanddelen aan. Er worden verscheidene nieuwe cyclische en lineaire peptiden en depsipeptiden (peptiden met een esterverbinding) uit cyanobacteriën getypeerd. Sommige zijn protease-inhibitoren, maar de biologische activiteit van de anderen is nog ongekend. Veel van de cyanobacteriële bioactieve bestanddelen bevatten structurele gelijkenissen met natuurlijke producten van ongewervelden. 2.1.8 GEVOLGEN (Chorus I. en Bartram J. et al.,1999) Cyanobacteriële vergiftiging van dieren kan via twee wegen gebeuren, door directe consumptie van cyanobacteriële cellen in water of indirect via inname van andere dieren die zich gevoed hebben met cyanobacteriën en geaccumuleerde toxines. 2.1.8.1 Effecten op waterbacteriën
De invloed van cyanobacteriële toxines op bacteriën is nog niet volledig begrepen. De meerderheid van de waterbacteriën kan men nog niet kweken. De onderzoeken met dergelijke zoogdierpathogenen of laboratoriumbacteriën mogen niet alomvattend beschouwd worden. Het is goed mogelijk dat cyanotoxines een invloed hebben op sommige species van waterbacteriën en andere niet.
27
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
2.1.8.2 Effecten op zoöplankton
Cyanobacteriën blijken een schadelijk effect te hebben op zoöplankton, maar het effect is verschillend tussen genera en species, en zelfs tussen klonen van individuele species. Er is een groot verschil tussen de reacties van zoöplankton species op toxische en zelfs niet-toxische cyanobacteriën. Het is hoogstwaarschijnlijk dat onder natuurlijke condities in wateren bepaalde species en stammen van zoöplankton aangetast kunnen worden door cyanotoxines terwijl anderen niet aangetast worden. 2.1.8.3 Diervergiftigingen
Een groot aantal zaken van diervergiftiging bewijzen de bezorgdheid van gezondheidsgevaren voor de mens die vrijgesteld worden aan cyanobacteriën. Naast de consumptie van cyanobacteriën in water, kan accumulatie in de voedselketen een bron van intoxicatie zijn. 2.1.8.4 Korte termijn effecten bij de mens
Het aantal aangegeven gevallen van gastro-intestinale en leveraantastende ziekten zijn allemaal afkomstig van de afbraak van cyanobacteriële bloeien of van lyse van een bloei door gebruik van kopersulfaat. Beide mechanismen leiden tot vrijstelling van cyanotoxines uit ontbindende cellen. In de menselijke populatie zijn er personen die een veel groter risico lopen voor verwondingen door cyanotoxines in vergelijking met de hele populatie. Voorbeelden hiervan zijn kinderen, mensen die al verwondingen hebben aan hun organen door cyanobacteriële toxines en personen met hepatitis, levercirrose, toxische leververwondingen van andere bronnen of nierschade. 28
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
2.1.8.5 Chronische effecten bij de mens
Naast acute toxiciteit kan er ook een lange termijn risico zijn. Korte blootstellingen aan toxines kunnen evolueren in een lange termijn verwonding. Chronische blootstelling aan lage hoeveelheden kan ongunstige gezondheidseffecten geven. Experimenten met proefdieren tonen aan dat er kans is op chronische lever aandoeningen en mogelijke bevorderde carcinogeen of tumor groei. 2.1.8.6 Verwondingen door recreatieve blootstelling
Er zijn herhaalde beschrijvingen van ongunstige gevolgen voor de gezondheid van zwemmers die vrijgesteld zijn aan cyanobacteriële bloeien. Zelfs het minste contact met cyanobacteriën in zwemwater kan huidirritatie veroorzaken en verhoogt de waarschijnlijkheid van gastro-intestinale symptomen. Individuele gevoeligheid voor cyanobacteriën verschilt enorm doordat er zowel een allergische reactie kan zijn als een directe respons op de toxines. De cyanobacteriële pigmenten kunnen ernstige allergische reacties veroorzaken bij gevoelige personen. Cyanobacteriën hebben kenmerken gemeen met algemene luchtallergenen. Rapporten tonen allergische respons tegen cyanobacteriën bij patiënten met naso-bronchiale allergieën. 2.1.9 BESTRIJDING Uit een onderzoek van TNO-MEP (TNO Milieu, Energie en Procesinnovatie) blijkt dat het gebruik van de driehoeksmossel zeer effectief is tegen deze bloeien. Ze zijn in staat om 35 L water te filteren per kg lichaamsgewicht. Zo worden nutriënten en de cyanobacteriën zelf uit het water gefilterd. Ook bij slecht weer zijn de bloeien opmerkelijk minder aanwezig (Wikipedia).
29
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
2.1.10 MICROCYSTIS (Florida fish and wildlife conservation commission, 2008)
Figuur 2.11: Kolonie van Microcystis
Figuur 2.12: Microcystis bloeien
Microcystis (Figuur 2.12) is een genus van cyanobacteriën. Het komt voor in zoetwater zoals in meren en stromen. Bij optimale condities vormen Microcystis bloeien (Figuur 2.13). Deze bloeien kunnen de waterkwaliteit beïnvloeden net zoals het welzijn van de mens en natuur. De bloeien kunnen onzichtbaar zijn of drijven op het wateroppervlak. Van de meer dan 50 geïdentificeerde geslachten zoetwater cyanobacterien zijn er gemiddeld een derde die toxines produceren. Microcystis is de meest voorkomende van de toxische cyanobacteriën en wordt geassocieerd met vergiftigingen bij mens, vee en vis. Regelmatig wordt er onderzoek gevoerd naar dit organisme en zijn toxines. Er bestaan zowel toxische als niet-toxische Microcystis stammen. De toxische stammen produceren het toxine microcystine. Hoewel de waarschijnlijkheid dat mensen aangetast worden door een Microcystisbloei laag is, kan een lichte huidirritatie voorkomen door contact en gastro-intestinaal ongemak kan voorkomen bij inname van een bloei. Gezondheidsproblemen kunnen bij dieren 30
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
voorkomen als ze chronisch vrijgesteld worden aan zoetwater met Microcystis er in aanwezig. Vee en huisdieren kunnen ook vergiftigd worden door het drinken van gecontamineerd water, vis en vogelsterfte werd gerapporteerd met in hun cadavers Microcystis aanwezig. 2.1.11 POPULATIESTRUCTUUR VAN MICROCYSTIS VIA ITS-DGGE (Janse, 2004) Een goede beoordeling van de gevaren van Microcystis bloeien vraagt snelle en betrouwbare methoden om microcystine te detecteren. Omgevingsfactoren kunnen de microcystine-productie beïnvloeden in Microcystis culturen met een factor van drie tot vier. Het vermogen voor microcystine-productie is genetisch bepaald. De beslissende factoren, die de toxiciteit van een bloei bepalen, zijn de verhouding microcystine-producerende en niet-microcystine-producerende genotypes en de hoeveelheden en de varianten van microcystine die geproduceerd wordt. De kennis op het gebied van de samenstelling en de dynamiek van microcystine-producerende en niet-producerende Microcystis stammen is zeer beperkt door een te kort aan gepaste identificatiemethoden. De traditionele typering, gebaseerd op morfologische kenmerken van Microcystis, is zeer moeilijk en het onderscheid dat kan gemaakt worden op het genusniveau is beperkt. Hiervoor zijn er twee redenen: ten eerste zijn er onzekerheden in de morfologische classificatie van Microcystis species en ten tweede zijn er in een bepaalde morfologie stammen die toxisch zijn terwijl de anderen niet-toxisch zijn. Studies kunnen de duidelijke verbanden tussen de morfologieën en microcystine dynamieken niet vinden (Kardinaal, 2007). Er kan zelfs een overgang zijn tussen morfologische kenmerken. Identificatiemoeilijkheden kunnen verklaren waarom de correlatie tussen morfologie en toxiciteit onbetrouwbaar is, wat de nadruk legt op de nood 31
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
voor identificatie onafhankelijk van morfologische kenmerken. Moleculaire biologische methoden zijn meer betrouwbaar voor de herkenning van Microcystis stammen en hun eigenschappen.
Korte situering Na de transcriptie verlaat het gevormde mRNA de kern en gaat naar een ribosoom aanwezig in het cytoplasma waar de translatie doorgaat. Daar wordt een eiwit gevormd. Per drie nucleotiden of een codon wordt er een tRNA met daaraan een aminozuur ingebouwd. De aminozuren vormen een eiwit, daar zorgt het rRNA voor. rRNA heeft de genetische informatie van DNA en kan werken als enzym.
Figuur 2.13: Illustratie 16S rDNA en rRNA ITS
De taxonomische ontknoping verkregen door 16S rRNA genen is insufficiënt om onderscheid te maken tussen nauw gerelateerde organismen. Hierdoor is het onderzoek sterk gefocust op de rRNA tussen het 16S en het 23S, het ‘Intergenic Transcribed Spacer’ (rRNA-ITS) (Figuur 2.14). De grotere graad van heterogeniteit van een sequentie en het aanzienlijk aantal gekende rRNA-ITS sequenties maken de rRNA-ITS zeer geschikt voor hoge-resolutie analyse van cyanobacteriën (Janse, 2003) .
32
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
Figuur 2.14: microcystine synthetase (mcy) gencluster
Tijdens een aantal onderzoeken heeft men zich toegespitst op de microcystine synthetase (mcy) gencluster (Figuur 2.15) voor de identificatie van toxische Microcystis stammen. Het verband tussen de gendetectie en de toxineproductie is een voordeel van deze aanpak ervan uitgaande dat niet-toxische stammen het gen niet bezitten. De detectie door PCR van het mcyB gen, het mcyA gen of het adenylatie domein in het microcystine synthetase gencluster vertoont een goede correlatie met de microcystine productie. PCR en DGGE (Denaturatie Gradiënt Gel Elektroforese) worden gebruikt op de ITS regio van het rRNA om de cyanobacteriële diversiteit te bestuderen met de nadruk op genotypes van het genus Microcystis. Deze methode heeft een hoge resolutie, maakt onderscheid volgens speciesniveau en blijkt nuttig te zijn in onderzoeken naar diversiteit van cyanobacteriële gemeenschappen. De classificatie wordt bevestigd door sequentieanalyse van het ITS-fragment. Microcystine-producerende en nietproducerende kolonies worden gescheiden in verschillende rRNA-ITS klassen (Kardinaal et al., 2007). DGGE wordt gebruikt om de genotypendiversiteit in stalen vast te stellen en de zuiverheid en zeldzaamheid van geïsoleerde stammen te beoordelen. De geïsoleerde stammen kunnen worden toegewezen aan hun natuurpopulatie op basis van hun DGGE profielen. De sequentie informatie van hun bandjes kan gebruikt worden bij de karakterisering van de aanwezige organismen (Janse, 2003) . 33
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
2.1.12 PLANKTOTHRIX (Janse I. en Kardinaal E. et al., 2005)
Figuur 2.15: Planktothrix
Veel zoetwater meren op hogere gebieden worden gedomineerd door filamenteuze cyanobacteriën van het genus Planktothrix (Figuur 2.16). Zij hebben een voorkeur voor weinig licht en kunnen lage temperaturen verdragen. De groen gepigmenteerde Planktothrix agardii overheerst vaak in hypertrofe ondiepe meren in Noord-Europa waar ze het hele jaar door terug te vinden zijn. De rood gepigmenteerde Planktothrix rubescens kan bloeien vormen in diepere warmere meren met gematigde nutriëntconcentraties. Zowel P. agardhii als P. rubescens zijn bekende microcystine producenten. De rol van P. agardhii bloeien in de menselijke gezondheid werd duidelijk na een ongeluk waarbij soldaten verschillende klachten hadden na blootstelling. Planktothrix cellen produceren ook dermatotoxische aplysiatoxines en neurotoxische anatoxine a en paralytische schelpdiergiffen. Microcystine concentraties in een meer staan in verband met cyanobacteriële populatiegrootte.
34
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
2.2 DGGE DGGE werd uitgevonden door Leonard Lerman toen hij professor was aan de State University of New York, Albany. DGGE scheidt PCR gevormde producten. Doordat ze een zelfde grootte hebben, is het dus onmogelijk deze te scheiden door middel van agarose gel elektroforese. Overal zou men een bandje hebben op dezelfde hoogte op de gel. DGGE voorkomt dit door de PCR-producten te scheiden op basis van sequentieverschillen en de verschillende denaturerende kenmerken van het DNA (Ecological and Environmental Sciences University of Toledo, 2004). Er zijn twee belangrijke punten: - De structuur van DNA verandert met de concentratie aan denaturant, - De structuurverandering beïnvloedt de beweging van DNA door de gel.
Figuur 2.16: Principe DGGE
Men begint met een dubbelstrengig DNA-molecule. Bij kamertemperatuur is de dubbelstrengige vorm vrij stabiel en beschouwt men de DNA-streng als twee strengen die dicht rond elkaar gewikkeld zijn, er zijn dus twee einden. DNA is een negatief geladen molecule die naar de positief geladen elektrode toe beweegt in een elektrisch veld. Een gel is een molecu35
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
lair netwerk met gaten die ongeveer dezelfde grootte hebben als de diameter van de DNA-streng. In aanwezigheid van het elektrisch veld zal het DNA zich door het netwerk bewegen. De snelheid van de migratie is afhankelijk van de grootte van de DNA-molecule. Als de concentratie aan denaturant stijgt, zullen de twee DNA-strengen uit elkaar gaan wat men smelten noemt. De twee strengen zullen gedeeltelijk uit elkaar gaan bij een intermediaire concentratie. Een stuk zal dus dubbelstrengig blijven terwijl het andere deel enkelstrengig is. Zo bekomt men een Y-vormige structuur met drie einden (Figuur 2.17). De beweeglijkheid van de DNAmolecule doorheen de gel daalt drastisch als gedeeltelijk gescheiden moleculen gevormd worden. De concentratie waarbij dit gebeurt, is afhankelijk van de sequentie (Wikipedia, 2008). Deze techniek maakt gebruik van het verschil in stabiliteit van GC paren (drie waterstofbruggen) ten opzichte van AT paren (twee waterstofbruggen). DNA-fragmenten rijker aan GC zijn meer stabiel en blijven dubbelstrengig tot er een hogere concentratie aan denaturant is bereikt. Dubbelstrengig DNA migreert beter door de gel terwijl gedenatureerde DNAmoleculen groter worden en vertragen of stoppen in de gel (Green J., 2005). De PCR-producten treffen tijdens een DGGE een alsmaar hogere concentratie aan chemisch denaturant wanneer ze door de gel bewegen. De zwakkere domeinen (AT) van de dubbelstrengige PCR-producten beginnen te denatureren bij een bepaalde grensconcentratie aan denaturant. Hierdoor daalt de migratiesnelheid. Verschillende DNA sequenties zullen denatureren bij verschillende denaturantconcentraties zodat er een bandenpatroon ontstaat. (Figuur 2.17) Iedere band op een verschillende hoogte staat theoretisch voor een andere bacteriële populatie in een ge-
36
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. literatuurstudie
meenschap (Ecological and Environmental Sciences University of Toledo, 2004). DGGE wordt vooral voor de karakterisering van populatiestructuur en dynamiek gebruikt. Deze methode is krachtig en kan snel een gemeenschapdiversiteit en samenstelling weergeven en verschuivingen in een populatie kunnen aangetoond worden. DGGE-analyse wordt ook op het medische vlak gebruikt om mutaties op te sporen (Green J., 2005).
37
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
3
Materialen en methoden
3.1 DNA-extractie 3.1.1 Principe Het is de bedoeling om het DNA vrij te maken uit de cellen. Dit gebeurt mechanisch door gebruik te maken van zirkoniumparels. Deze zorgen ervoor dat de celwanden breken door hard te schudden met behulp van een mini-beadbeater. Fenol, chloroform en isoamylalcohol zorgen ervoor dat het DNA geëxtraheerd wordt uit de gelyseerde cellen. Het DNA wordt hierna neergeslagen door middel van ethanol, glycerol en NaAc en opnieuw gesuspendeerd in 1x TE-buffer. 3.1.2 Protocol Voorbereidend werk 1. 2. 3. 4.
Staalname in poel, vijver of meer, Filtreer het staal over een filter, Bewaar de filter bij –20 °C, Vouw de filter op met behulp van met ethanol gesteriliseerde pincetten en bewaar in epjes van 1,5 mL. Nummer de epjes. Kleef etiketten op de epjes die informatie bevatten over het meer, het volume van het staal, de diepte van staalname en de datum waarop het staal genomen werd.
Protocol volgens Muyzer (Er wordt in de trekkast, met handschoenen en best op ijs gewerkt) 5. Voeg toe: • 0,5 g zirkonium beads, • 0,5 mL Tris/EDTA (1x TE, pH 8,0), • 0,5 mL gebufferde fenol (pH 7 tot 8, firma Roth) (Bij het pipetteren moet er op gelet worden dat de pipetpunt zich onder de olie bevindt.),
38
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
6. Schud het buisje 1 keer manueel en daarna 3 keer 1,25 minuten in een beadbeater met een frequentie van 30 Hz(De epjes tussendoor op ijs zetten), 7. Centrifugeer bij 10 000 rpm gedurende 5 minuten in een gekoelde centrifuge (4 °C), 8. Pipetteer de waterfase (bovenste) af naar een nieuw epje met een 200 µL pipet, let erop dat er geen fenol mee gepipetteerd wordt, 9. Voeg hierbij 0,5 mL PCl (gebufferde fenol:chloroform:isoamylalcohol = 25:24:1 v/v) en schud alles 1 maal, 10. Centrifugeer bij 10 000 rpm gedurende 5 minuten, 11. Herhaal stappen 8, 9 en 10, 12. Breng de waterfase over naar een nieuw epje van 1,5 mL (Alle tips, epjes en handschoenen gecontamineerd met fenol moeten apart weggegooid worden), 13. Voeg hieraan toe: • 50 µL 3 M NaAc pH ± 5, • 1 mL 96% ethanol (gestockeerd in de diepvriezer van –20 °C), • 2 µL glycogeen (gestockeerd in de diepvriezer van –20 °C, pipetteer op en neer), Schud alles 2x, 14. Incubeer vervolgens een nacht bij –20 °C, 15. Centrifugeer bij 13 000 rpm gedurende 30 minuten in een gekoelde centrifuge (4 °C), 16. Verwijder de bovenste fase door deze af te gieten (de DNA-pellet blijft achter in het epje), 17. Voeg 1 mL 70% ethanol toe, 18. Centrifugeer bij 13 000 rpm gedurende 5 minuten, 19. Verwijder bovenste fase (ethanol) door deze af te gieten, 20. Centrifugeer opnieuw bij 13 000 rpm gedurende 5 minuten, 21. Verwijder voorzichtig de ethanol met een pipet van 200 µL door de pipetpunt tegenover de pellet te plaatsen. Indien de pellet niet te zien is moet de tegenovergestelde zijde genomen worden als waar de pellet zou moeten zitten. Door de epjes tijdens het centrifugeren mooi recht te zetten kan je dat goed weten, 22. Laat de pellet staan om te drogen aan de lucht voor minstens 20 minuten, 23. Voeg 100 µL verwarmde 1x TE toe (55 °C, verwarmen in thermoblock) en los de DNA-pellet op door deze enkele keren traag op en neer te zuigen met de pipet, 39
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
24. Incubeer 20 minuten bij 55 °C om het DNA helemaal op te lossen, 25. Bewaar het ongezuiverde DNA bij –20 °C. 3.1.3 Materiaal • • • • • •
• •
• • • • •
• • • •
Pincetten, Bakje met ijs, Epjes (Eppendorf) en filtertips (merk: Greiner bio-one) vooraf overnacht steriliseren in een oven bij 120 °C, Micropipetten: merk Gilson, Alle oplossingen autoclaveren gedurende 20 minuten, Zirkoniumparels steriliseren in een oven bij 120 °C na ze eventueel gespoeld te hebben met 6 M HCl, eigenschappen zirkoniumparels: doorsnede 0,1 mm, firma Merck Eurolab, Cat nr. 5563201, Gebufferde fenol (pH 7-8), firma Roth, TE buffer 1x (pH 8,0): 10 mM TrisHCl (pH 7,6), 1 mM EDTA, 100x TE: 121 g TrisHCl, 200 mL 0,5 M EDTA (pH 8), mengen en aanlengen tot 1000 mL met milli-Q-water, 1x TE: 1 mL 100x TE aanlengen tot 100 mL met milli-Q-water, Fenol (pH 7-8): bewaren bij 4 °C, firma Roth, Cat nr. N0038.2, PCl = gebufferde fenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1): bewaren bij 4 °C – firma Roth, Cat nr. A156.1, 96% ethanol (bewaren bij –20 °C), 70% ethanol (bewaren bij –20 °C), 3 M NaAc (pH 5) 100 mL 3 M NaAc Æ 40,824 g in 100 mL milli-Q, pH op 5,0 brengen door vrij veel HCl toe te voegen, Glycogeen-oplossing: 20 mg/mL, firma Boehringer Mannheim, Cat nr. 90139, Ultracentrifuge: merk Eppendorf, Beadbeater: merk Retsch, Thermoblock: merk Techne.
40
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
3.2
Zuivering van geëxtraheerd DNA
3.2.1 Principe Het geëxtraheerde DNA wordt gezuiverd om alle humuszuren te verwijderen. Zo kan men een goede PCR uitvoeren. Men maakt gebruik van de vacuümzuiger en een kit. 3.2.2 Protocol 1. Bevestig de vacuümzuiger aan de waterstraalpomp, sluit alle kraantjes, behalve degene die gebruikt worden voor DNA-zuivering (er wordt best gewerkt met 10 stalen tegelijk), 2. Bevestig per staal een Wizard-minikolom en breng een verlengstuk aan, 3. Schud de Wizard DNA Clean-Up-vloeistof enkele malen krachtig zodat er geen kristallen meer te zien zijn, breng dan 1 mL vloeistof in het epje met DNA en schud eens, 4. Houd wel 10 µL DNA apart voor eventuele mislukkingen! 5. Pipetteer het voorgaande in het verlengstuk en laat het geheel vacuüm zuigen door de kraan van de waterstraalpomp aan te zetten, vergeet de dop er niet op te steken!!! 6. Als alles door de minikolom gezogen is, sluit dan het kraantje, 7. Voeg 2 mL 80% isopropanol toe met een pipet van 10 mL (5 staaltjes met 1 pipet, indien je de pipet boven de kolom houdt) om de minikolom te wassen en laat dit opnieuw vacuümzuigen, 8. Als alles door de minikolom gezogen is, laat het geheel dan nog 30 s vacuümzuigen, 9. Verwijder het verlengstuk en breng de minikolom (onderste) in een epje van 1,5 mL waarvan het deksel openstaat, 10. Centrifugeer de minikolom bij maximum snelheid gedurende 2 minuten om alle resten van isopropanol te verwijderen, 11. Breng de minikolom over naar een nieuw epje van 1,5 mL en voeg in het midden van de kolom 50 µL voorverwarmde TE-buffer (67,5 °C in thermoblock) toe, 12. Laat 1 minuut staan, 13. Centrifugeer de minikolom bij maximum snelheid gedurende 20 s om het DNA dat op de minikolom gebonden is te verwijderen,
41
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
14. Verwijder de minikolom en sluit het deksel van het epje, waarin het DNA zich nu bevindt. Benoem ook het epje gelijkmatig aan de verwijderde minikolom, 15. Bewaar het gezuiverde DNA bij –20 °C, 16. Kuis de pomp altijd uit aan het eind van de zuivering. Dit voorkomt kans op kristallisatie van de producten en verstopping van de kraantjes. 3.2.3 Materiaal •
Wizard®DNA Clean-Up System (PROMEGA) met vacuümzuiger.
3.3 Polymerase Ketting Reactie 3.3.1 Principe De polymerase kettingreactie (PCR) is een techniek die overal ter wereld wordt gebruikt in de moleculaire biologie. Het DNA wordt gebruikt als template voor replicatie tijdens de PCR. Wanneer het DNA gegenereerd is, komt een kettingreactie op gang waarbij het DNA exponentieel geamplificeerd wordt. Zo kan men van een paar stukjes DNA met verschillende lengte miljoenen DNA kopieën maken. Een groot deel van de PCR methoden doorlopen verschillende thermische cycli. Afwisselend wordt het PCR product opgewarmd en afgekoeld volgens een bepaalde serie van temperatuurverschillen. Deze verschillende stappen zijn nodig om de strengen van de helix fysiek te scheiden. Dit wordt ook wel het smelten van DNA genoemd. Door deze temperatuurverandering kan het DNA-polymerase het doelwit-DNA selectief amplificeren. De selectiviteit van een polymerase ketting reactie zit hem in het kiezen van de primers.
42
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
De nodige componenten voor een PCR zijn: •
• • • • •
DNA-polymerase: zorgt ervoor dat een stukje DNA wordt geamplificeerd en is hitte bestendig. AmpliTaq, een genetisch gemanipuleerde vorm van Taq-polymerase (een enzym afkomstig van de bacterie Thermus aquaticus) wordt gebruikt tijdens de stage. Het assembleert een nieuwe streng uit nucleotiden. Het maakt gebruik van enkelstrengig DNA als template en DNA oligonucleotiden voor de initiatie van de DNA-synthese, DNA template: bevat DNA regio die geamplificeerd moet worden, dNTPs of deoxyribonucleotidetrifosfaten: de bouwstenen die gebruikt worden om een complementaire streng te maken (dGTP, dATP, dTTP, dCTP), Buffer oplossing: zorgt voor een geschikte omgeving voor een optimale activiteit en stabiliteit van het DNA-polymerase, Primer(s): zijn complementair met het 5’ en/of het 3’ einde van de DNA-regio, BSA: zorgt voor een “relaxatie” van het DNA na denaturatie, zodat de streng niet opnieuw opvouwt en de primer beter kan binden.
Een PCR reactie bestaat meestal uit een 20 tot 35 herhaalde cycli. Iedere cyclus bestaat uit twee of drie temperatuurswisselingen. De meest gebruikte PCR bestaat uit drie temperatuursstappen. •
Initiële denaturatiestap: reactieproduct wordt verhit tot een temperatuur van 94 °C gedurende 5 minuten. Dit wordt enkel uitgevoerd als gebruik wordt gemaakt van een DNA-polymerase die een hitte activatie nodig heeft,
•
Denaturatie stap: deze stap is de eerste van een cyclus, de reactie wordt verwarmd tot 94 °C afhankelijk van de soort PCR. Hierdoor smelt het DNA door de waterstofbindingen te breken tussen complementaire basen van de DNA-strengen zodat er enkelstrengig DNA gevormd wordt,
•
Annealing stap: de temperatuur wordt verlaagd tot 55-65 °C zodat de primers aan het enkelstrengig DNA binden. Deze temperatuur ligt meestal 2 tot 3 °C lager dan de smelttemperatuur van de gebruikte primers. Stabiele DNA-waterstofbindingen worden enkel gevormd wanneer de sequentie van de primer complementair is met die van het DNA,
43
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
•
Elongatie stap: de temperatuur van deze stap is afhankelijk van het DNA-polymerase dat gebruikt wordt. Voor Taq-polymerase wordt meestel 72 °C gebruikt. Het polymerase bindt op het primer-template complex en zo kan de DNA synthese beginnen.Het DNA-polymerase maakt een nieuwe DNA-streng aan, complementair met de template van 5’ naar 3’ door dNTPs toe te voegen,
•
Einde van de elongatie: deze stap komt nadat alle cycli zijn gedaan en zorgt ervoor dat iedere streng volledig is,
•
Definitieve stop: de reactie-producten hebben een temperatuur van 15°C tot ze in diepvries of koelkast geplaatst worden.
3.3.1.1 De enkel-cyanospecifieke genestelde PCR (16S)
Hierbij voert men twee PCRs uit: 1. De eerste PCR wordt uitgevoerd met cyanospecifieke primers zodat enkel het DNA van cyanobacteriën. Het zijn 16S rRNA-genen (400 bp)die geamplificeerd worden uit de V3 en V4-regio. De cyanobacteriën hebben als 783ste base een A of T terwijl andere nietcyanobacteriën op deze plaats een G of C hebben. 2. Deze PCR zorgt ervoor dat het geamplificeerde DNA wordt ingekort. De primers die hierbij gebruikt worden zijn niet-cyanospecifiek. De gebruikte forward primer overlapt met de primer gebruikt tijdens de eerste PCR, maar heeft nog een GC-klem van 40 bp. Deze GC-klem zorgt ervoor dat het DNA een hogere smelttemperatuur heeft, wat nuttig is voor DGGE. Uiteindelijk bekomt men een geamplificeerd fragment van 140 bp dat enkel de V3-regio van het 16S rRNA bevat. 3.3.1.2 De bacterie-specifiek genestelde PCR (ITS)
Opnieuw worden er twee PCR’s uitgevoerd: 1. Bij de eerste reactie wordt gebruik gemaakt van de primers CH-MF of CN-PF en ULR. De primer CH-MF is een specifieke 16S rDNA primer voor Microcystis dat bindt aan het V7 regio, terwijl CN-PF gebruikt wordt bij Planktothrix. ULR is een universele 23S primer. 2. De primers die gebruikt worden voor de tweede PCR zijn GC-CSIF en ULR. GC-CSIF is een 16S rDNA specifieke primer met een GCklem die ervoor zorgt dat de smelttemperatuur van het geamplificeerde stuk stijgt. 44
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
Na de eerste PCR wordt het PCR-product telkens gezuiverd zodat de primer uit de eerste PCR niet met de primers uit de tweede PCR kan reageren. 3.3.2 Protocol 3.3.2.1 Eerste stap met cyanospecifieke primers (CYANO I)
1. Haal alle benodigdheden voor de PCR-cyano I uit de diepvriezer van – 20 °C, ontdooi buffer, dNTP’s, BSA, water en primers door niet op ijs te zetten en zet het Ampli Taq wel op ijs, 2. Vul het PCR-blad in: • titel, • datum, • namen van de stalen en een negatieve controle, • de hoeveelheden die nodig zijn om de PCR-mix te maken vermenigvuldigen met het aantal stalen + 1 (zodat er ruim voldoende mix is), 3. Neem een epje van 1,5mL en maak daarin de PCR-mix: • buffer: 5 µL, • dNTP’s: 5 µL, • Ampli Taq: 2,5 µL, • BSA: 2 µL, • forward primer: CYA F371: 5 µL, • reverse primer: CYA R783: 5 µL, • water: 24,5 µL, • template: 1 µL, 4. Vortex de mix zeer kort en centrifugeer 6 seconden, 5. Haal de stalen met DNA uit de diepvriezer van –20 °C en benoem nieuwe epjes van 0,2 mL (nummer staal en c1), zet deze in een bevroren epjeshouder uit de diepvriezer, 6. Doe 49 µL PCR-mix en 1 µL DNA in elk epje van 0,2 mL, maak ook een negatieve controle van 49 µL PCR-mix en 1 µL water, 7. Vortex zeer kort en centrifugeer 6 seconden, 8. Breng de epjes van 0,2 mL naar het PCR-toestel en bewaar de oorspronkelijke epjes van 1,5 mL en de PCR-benodigdheden terug bij – 20 °C, 45
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
9. Plaats de epjes in het PCR-toestel: zet geen stalen aan de randen en zet vier lege epjes in de hoeken zodat het geheel in evenwicht is, 10. Sluit het deksel met de schuifknop en draai dicht met de draaiknop, 11. Zet het PCR-toestel aan en zoek in de lijst met programma’s naar cyano I, druk op START, 12. Deze PCR duurt 1 uur en 25 minuten. Programma: • 5 minuten 94 °C, • 20 cycli (1minuut 94 °C, 1minuut 65 °C Æ 56 °C (-0,5 °C), 1 minuut 72 °C), • 10 minuten 72 °C, • 15 °C tot het einde. 3.3.2.2 Tweede stap met algemene primers (CYANO II)
Hier wordt het zelfde protocol gebruikt als bij de eerste stap mits enkele wijzigingen: -
Er worden twee andere primers gebruikt: F357-GC en R518 Men voegt bij de mix 23,5 mL water toe doordat men in ieder epje 2 µL template wordt toevoegt Programma is ook aangepast: • 5 minuten 94 °C, • 20 cycli (1 minuut 94 °C, 1 minuut 65 °C Æ 56°C (-0,5 °C), 1 minuut 72 °C), • 5 cycli (1 minuut 94 °C, 1 minuut 55 °C, 1 minuut 72 °C), • 30 minuten 72 °C, • 1 °C tot het einde.
46
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
3.3.2.3 ITS1
1. Haal alle benodigdheden voor de PCR-cyano I uit de diepvriezer van – 20°C, ontdooi buffer, dNTP’s, BSA, water en primers door niet op ijs te zetten en zet het Ampli Taq wel op ijs, 2. Vul het PCR-blad in: • titel, • datum, • namen van de stalen en een negatieve controle, • de hoeveelheden die nodig zijn om de PCR-mix te maken vermenigvuldigen met het aantal stalen + 1 (zodat er ruim voldoende mix is), 3. Neem een epje van 1,5 mL en maak daarin de PCR-mix: • buffer: 5 µL, • dNTP’s: 5 µL, • Ampli Taq: 2,5 µL, • BSA: 2 µL, • forward primer: CH-MF (Microcystis) of CN-PF (Planktothrix): 5 µL, • reverse primer: ULR: 5 µL, • water: 24,5 µL, • template: 1 µL, 4. Vortex de mix zeer kort en centrifugeer 6 seconden, 5. Haal de stalen met DNA uit de diepvriezer van –20 °C en benoem nieuwe epjes van 0,2 mL (nummer staal en c1), zet deze in een bevroren epjeshouder uit de diepvriezer, 6. Doe 49 µL PCR-mix en 1 µL DNA in elk epje van 0,2 mL, maak ook een negatieve controle van 49 µL PCR-mix en 1 µL water, 7. Vortex zeer kort en centrifugeer 6 seconden, 8. Breng de epjes van 0,2 mL naar het PCR-toestel en bewaar oorspronkelijke epjes van 1,5 mL en de PCR-benodigdheden terug bij –20 °C, 9. Plaats de epjes in het PCR-toestel: zet geen stalen aan de randen en zet vier lege epjes in de hoeken zodat het geheel in evenwicht is, 10. Sluit het deksel met de schuifknop en draai dicht met de draaiknop, 11. Zet het PCR-toestel aan en zoek in de lijst met programma’s naar ITS2BV, druk op START,
47
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
12. Deze PCR duurt 2 uren en 5 minuten. Programma: • 5 minuten 94 °C, • 20 cycli (1minuut 94 °C, 1minuut 65 °C Æ 52 °C (-0,5 °C), 1 minuut 72 °C), • 10 cycli (1 minuut 94 °C, 1 minuut 52 °C, 1 minuut 72 °C), • 30 minuten 72 °C, • 15 °C tot het einde. 3.3.2.4 ITS2
Hier wordt het zelfde protocol gebruikt als bij ITS1 maar er zijn enkele wijzigingen: -
Er wordt als forward primer GC-CSIF gebruikt, Men voegt bij de mix 23,5 mL water toe zodat men een eindvolume bekomt van 50 µL met de 2 µL template inbegrepen per staal Programma is ook aangepast: • 5 minuten 94 °C, • 30 cycli (1minuut 94 °C, 1minuut 65 °C, 1 minuut 72 °C), • 30 minuten 72 °C, • 15 °C tot het einde.
3.3.3 Materialen • • •
Ampli Taq® DNA Polymerase met 10x PCR-buffer, Applied Biosystems, Cat nr. N8080152, eindconcentratie in PCR-mix: 2,5 U GeneAmp® dNTP’s, 10 mM elk, Applied Biosystems, Cat nr. 8080007 Primers bekomen van Invitrogen Life Technologies: - CYA F371 (5’ CCT ACG GGA GGC AGC AGT GGG AAT TTT CCG 3’) - CYA R783 (5’ GAC TAC WGG GGT ATC TAA TCC CW 3’) - F357 GC (5’ CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG 3’) - R518 (5’ ATT ACC GCG GCT GCT GG 3’) - ULR (5’ CCT CTG TGT GCC TAG GTA TC 3’) - CH-MF (5’ AGC CAA GTC TGC CGT CAA ATC A 3’) - CN-PF (5’ GGA AGG TTC TTG GAT TGT CAA CCC 3’) - GC-CSIF (5’ G(T/C)C ACG CCC GAA GTC (G/A)TT AC 3’) 48
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
• • • • • •
10x PCR-buffer BSA, eindconcentratie in PCR-mix: 400 ng/µL HPLC-water Vortex-toestel: merk IKA Ultracentrifuge: merk Eppendorf PCR-toestel: merk Biometra
3.4 Zuivering van PCR-product 3.4.1 Principe De overblijvende primers van de eerste PCR kunnen samen met opgepikte DNA-restjes reageren met de tweede set primers in de tweede PCR, daarom moet het DNA na de eerste PCR gezuiverd worden. Dit gebeurt met de QIAquick PCR purification kit. Het QIAquick systeem combineert de eigenschap van spin-kolomtechnologie met de selectieve bindingseigenschap van een silica-gel membraan. Speciale buffers zorgen voor het efficiënt zuiveren van het DNA en de verwijdering van contaminanten. Het DNA adsorbeert op het silica-membraan in aanwezigheid van een hoge zoutconcentratie en pH ≤ 7,5, terwijl de contaminanten door de kolom passeren. Onzuiverheden worden dus efficiënt weggewassen en het gezuiverde DNA wordt geëlueerd met Tris-buffer of water onder basische omstandigheden (7,0 < pH < 8,5) en bij lage zoutconcentratie. (Bijlage 2) In de QIAquick purification kit worden verschillende buffers gebruikt: - buffer PBI zorgt voor de efficiënte binding van enkel- of dubbelstrengige PCR-producten van minimum 100 bp en verwijdering van primers tot 40 nucleotiden, - buffer PE bevat ethanol en wast de zouten weg. Resterende hoeveelheden van deze buffer worden verwijderd door te centrifugeren (voeg 96% ethanol toe aan deze buffer voor gebruik, zie etiket op flesje voor volume), 49
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
- buffer EB (elutie buffer) zorgt ervoor dat het DNA geëlueerd wordt. Voor een optimale opbrengst aan DNA wordt best 30 µL elutie buffer toegevoegd en 1 minuut gewacht. Het DNA is dan 1,7 keer meer geconcentreerd dan wanneer er geëlueerd wordt met 50 µL zonder incubatie. 3.4.2 Protocol 1. Voeg 5 volumes buffer PBI bij 1 volume PCR-staal in een 1,5 mL epje en meng door te vortexen, 2. Plaats de QIAquick spin kolom in het voorziene 2 mL epje, 3. Breng het PCR-staal in de QIAquick kolom en centrifugeer 45 seconden bij 13 000 rpm, 4. Verwijder de “flow-through” en plaats de QIAquick kolom terug in hetzelfde epje, 5. Breng 0,75 mL buffer PE in de QIAquick kolom en centrifugeer 45 seconden bij 13 000 rpm, 6. Verwijder de “flow-through” en plaats de QIAquick kolom terug in hetzelfde epje. Centrifugeer de kolom 1 minuut op maximale snelheid, 7. Plaats de QIAquick kolom in een nieuw 1,5 mL epje, 8. Om het DNA van de kolom te verwijderen, voeg 50 µL buffer EB (10 mM Tris Cl, pH 8,5) toe in het centrum van de QIAquick membraan, en centrifugeer 1 minuut op maximale snelheid, 9. Verwijder de QIAquick kolom. 3.4.3 Materiaal •
QIAquick-PCR-purification kit, Firma QIAGEN
3.5 Agarose-gelelektroforese 3.5.1 Principe Na een PCR wordt er gecontroleerd of er DNA aanwezig is van de juiste grootte. Agarose is een polysaccharide dat gewonnen wordt uit algen. Het is een copolymeer van 1,3-gekoppelde β-D-galactopyranose en 1,4gekoppelde 3,6-L-galactopyranose. De agarosegel is te vergelijken met een soort netwerk waar het DNA zich een weg door baant. De migratie van het DNA gebeurt onder invloed van een aangelegd spanningsveld. 50
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
Vermits het DNA negatief geladen is, zal het zich van de negatieve naar de positieve pool begeven met een snelheid die door het moleculair gewicht bepaald wordt. Hoe kleiner het fragment, hoe verder het in de gel zal migreren. Wanneer er dan ook een merker met gekende fragmentlengten wordt aangebracht, kan de grootte van het geamplificeerde DNA-fragment bepaald worden. De agarosegels worden voor de elektroforese in TAE-buffer en aan de stalen wordt een kleurstof toegevoegd als frontindicator. Men laat ook altijd een smartladder meelopen als merker om de grootte van het DNA fragment te kunnen achterhalen. Om het DNA in de agarose-gel te visualiseren, wordt het gekleurd met ethidiumbromide. Deze fluorescente kleurstof bindt dubbelstrengig DNA en RNA. De molecule intercaleert zich tussen de nucleotiden en zendt fluorescentielicht uit (λ = 590 nm) bij bestraling met UV-licht. Ook na DNA extractie wordt best gecontroleerd of er inderdaad DNA aanwezig is. Er is dan een smeer te zien wat aanduidt dat er fragmenten van allerlei lengten aanwezig zijn. 3.5.2 Protocol 1. Installeer eerst de drager waarin de agarose-gel wordt gegoten: klem de drager vast met het schuifje en breng de kam op de juiste plaats aan, controleer of het geheel waterpas is; zoniet regel bij met de draaiknopjes. (Controleer voordien eerst of het bakje wel schoon is, was het af indien niet), 2. Maak een agarose-gel aan (kwantificatie-gel: 1,66% agarose): weeg agarose-poeder af, breng alles in een erlenmeyer en voeg hierbij 1x TAE-buffer, 3. Plaats de erlenmeyer in de microgolfoven, zet deze op maximale capaciteit en stop enkele seconden nadat er voldoende bubbels te zien zijn. Neem de erlenmeyer uit de microgolfoven met een ovenwant en schud enkele malen totdat er geen agarose-vlokken meer te zien zijn. Plaats de erlenmeyer opnieuw in de microgolfoven op maximale capaciteit en stop wanneer er voldoende bubbels te zien zijn, 51
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
4. Giet de gel in een keer in de drager totdat er een 3 mm dik laagje te zien is, 5. Laat de gel 40 minuten staan, 6. Als de gel opgesteven is, haal dan voorzichtig de kam eruit en breng de gel met de drager naar het elektroforese-toestel en klem het vast, 7. Voeg TAE-buffer toe zodat er een laagje van enkele millimeters buffer boven de gel uitkomt, 8. Bereid de staaltjes voor op een stukje parafilm: maak eerst druppels van 2 µL kleurstof en voeg daarbij 5 µL gezuiverd DNA. Meng even door de parafilm zachtjes heen en weer te bewegen; de druppels plakken aan de parafilm en lopen niet uit, 9. Laden van de gel: pipetteer in ieder slotje een druppel van 7 µL (2 µL kleurstof en 5 µL gezuiverd DNA) van op de parafilm. Blijf deze procedure volgen voor alle staaltjes. De smartladder wordt altijd tussen de stalen geladen om de lengte van het geamplificeerde stuk DNA te kunnen bepalen, 10. Bevestig het deksel van het elektroforese-toestel wanneer alle staaltjes geladen zijn, breng de twee elektroden aan en sluit de stroom aan op 100 V voor bepaalde duur (afhankelijk van de grootte van de gel en de hoeveelheden buffer). 3.5.2.1 Foto nemen van de gel
1. Schakel de stroombron uit en neem de gel met drager uit de bufferbak, leg de gel in een bak met aluminiumpapier en was de drager af, 2. Breng de gel naar de ethidiumbromide-kamer, doe een beschermende laboschort en handschoenen aan en leg de gel in een bakje met EtBr zonder de vloeistof aan te raken. Doe de handschoenen uit vooraleer je de EtBr-kamer verlaat en raak niets aan met de blote hand. Laat de gel ongeveer 30 minuten in het bakje liggen, 3. Maak het oppervlak van de UV-lamp net met water, 4. Neem de gel met een schepje uit het bakje met EtBr en leg hem op de UV-lichtbak. Wrijf de bubbels uit de gel en sluit UV-kamer, 5. Open het programme ‘Quantity One’ waarvan een icoontje op het bureaublad terug te vinden is. Ga naar bestand ‘Gel doc’ en steek de UV-lamp aan, 6. Bij ‘Auto Expose’ wordt de gel automatisch maximaal belicht en kan men de belichting van de gel aanpassen met ‘manual expose’, als je de juiste belichting gevonden hebt kan je de foto opslaan en afdrukken, 52
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
7. Verwijder de gel en deponeer in de daarvoor voorziene vuilnisbakken, was de glasplaat af met papier en doe ook de handschoenen uit en deponeer in dezelfde vuilnisbak. 3.5.3 Materiaal • • • • • •
Agarose-poeder: Result LE agarose, Biozym, Cat nr. 330050 50x TAE = 242 g Tris base + 57 mL azijnzuur + 100 mL 0,5 M EDTA (pH 8) + milli-Q water tot het volume 1000 mL is. 0,5 M EDTA (pH 8): 186,1 g EDTA + 20 g NaOH-pellets + 800 mL milli-Q water, regel de pH met NaOH Kleurstof (loading dye): 0.25% bromofenolblauw, 0.25% xyleencyanol FF in een 40% sucroseoplossing Merker (smartladder = moleculair gewicht merker): Eurogentec, Cat. nr. MW-1700-10 Ethidiumbromide: 150 µL EtBr (10 mg/ml) + 1500 mL 1x TAE
3.6 Spectrofotometer 3.6.1 Inleiding Het is de bedoeling van het project om na te gaan welke en hoeveel cyanobacteriën of genotypes van Microcystis of Planktothrix er voorkomen in een staal. Bij een DGGE moet er evenveel DNA geladen worden in ieder slotje. Daarna kan men de intensiteit van de verschillende bandjes tussen de verschillende stalen met elkaar vergelijken. In ieder gezuiverd PCRproduct is er een andere hoeveelheid DNA aanwezig. De hoeveelheid wordt spectrofotometrisch bepaald. Daarna kan men de hoeveel gezuiverd PCR-product berekenen die gemengd moet worden met 10 µL loading dye om zo in ieder slotje een zelfde hoeveelheid DNA te laden. 3.6.2 Principe Bij fotospectrometrie wordt er een oplossing bestraald met licht. De hoeveelheid licht dat geabsorbeerd of doorgelaten wordt is recht evenredig met de concentratie van een oplossing. De lichtstraal gaat ook door een blanco-oplossing zonder de te meten stoffen. De waarde van de blanco53
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
oplossing wordt afgetrokken van de te meten staal en zo heeft men de waarde die overeenkomt met de concentratie aan gemeten stoffen. (Figuur 3.1)
Figuur 3.1: Schema werking spectrofotometer
3.7 DGGE 3.7.1 Principe DGGE scheidt PCR gevormde producten. Doordat ze een zelfde grootte (bp) hebben, is het dus onmogelijk deze te scheiden door middel van agarose-gel elektroforese. Overal is er een bandje op dezelfde hoogte op de gel te zien. DGGE voorkomt dit door de PCR-producten te scheiden op basis van sequentieverschillen en dus verschillende denaturerende kenmerken van het DNA (TOLEDO, 2004). 3.7.2 Protocol 1. Maak eerst stockoplossingen aan 2. Breng een magnetische roervlo in de 100%-oplossing en zet de magnetische roerder op 500 rpm. Laat 2 uur roeren tot alle kristallen verdwenen zijn. 54
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
3.7.2.1
De gelkamer
3. Haal de glasplaten uit de bak, 4. Ontsmet de platen met denaturol, 5. Leg twee platen opeen met de grootste aan de onderzijde en breng aan weerszijden, tussen de platen, spacers aan, (Figuur 3.2)
Figuur 3.2: De gelkamer van de DGGE
6. Breng twee klemmen aan om de glasplaten samen te houden, 7. Duw de klemmen naar elkaar toe en naar onder terwijl er een speciale kaart tussen de glasplaten is aangebracht, draai de platen vast en controleer of ze onderaan perfect gelijk zijn, verwijder de kaart, 8. Plaats het geheel op de rubberen onderlegger, belegd met parafilm, in de laadbak en draai vast, 3.7.2.2 De gradiënt-gel
9. Was de low en high-gradiënt houders (Figuur 3.3) en het slangetje door er milli-Q water door te pompen, droog daarna de low en high gradiënt-houders uit met tissue en zuig hun connectiegedeelte leeg, 10. Breng het einde van het slangetje met wat tape aan in het midden op de grootste plaat, waar die boven de andere plaat uitsteekt, zodat wat eruit vloeit tussen de beide platen terechtkomt. Zorg ervoor dat de tape goed vast zit,
55
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
Figuur 3.3: De gradiënt-houders
11. Zet de snelheid van de pomp klaar op 5 mL/min., 12. Bereid de low en high-gradiënt oplossingen en voeg 100 µg APS en 8 µL TEMED toe om te polymeriseren (doe dit in de trekkast), 13. Breng deze al roerend naar de opstelling en breng low gradiëntoplossing in de connectie, sluit deze en zuig terug op wat in de highgradiënt houder terecht is gekomen, 14. Vul beide houders met de oplossing, 15. Schakel de magnetische roerder aan op 300 rpm, zorg dat de magnetische roervlo die zich in de high-gradiënt houder bevindt, precies boven het midden zit, 16. Open de connectie en de druk tegelijkertijd de startknop van de pomp in, 17. Als er nog water in de slang zit, vang dit dan op met wat tissue. Was de bekers en droog ze uit, 18. Nadat de gradiënt gevormd is, verwijder het slangetje door wat waterverzadigde butanol aan te brengen op de tape zodat ze loskomt, breng ook een laagje butanol aan op de gradiënt om een egaal oppervlak te vormen na polymerisatie (vooral de hoekjes zijn belangrijk) 19. Was het geheel met milli-Q water en droog uit, 20. Zet alles klaar voor de tweede gradiënt gel en herbegin, 21. Laat de gels minimum 1 uur staan om te polymeriseren, 22. Verwarm de buffer in de elektroforese-unit voor tot 60 °C. 3.7.2.3 De stalen
23. Voeg het gewenste aantal PCR-product bij 10 µL kleurstof, vortex en centrifugeer. 56
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
3.7.2.4 De stacking-gel
24. Verwijder eerst de isobutanol en reinig het bovenste gedeelte van de gradiënt-gel met milli-Q water, droog af met filtreerpapier, 25. Plaats de kam tussen de platen (Figuur 3.4), 26. Stacking-gel voor twee gels: 10 mL acrylamide (0% denaturanten), 100 µL APS en 10 µL TEMED,
Figuur 3.4: Opstelling DGGE gieten stacking gel
27. Breng de stacking-gel aan tot net iets boven de kam, 28. Laat 20 minuten polymeriseren, 29. Haal de kam voorzichtig uit de stacking-gel: duw de kam voorzichtig naar voor zodat er lucht in de slotjes komt en deze niet dichtklappen als gevolg van het vacuümzuigen, 30. Spoel de slotjes met warme buffer (1x TAE) tot dat alle luchtbellen verdwenen zijn, 3.7.2.5 De gel-elektroforese
31. Klik de beide gels met de kleinste glasplaat naar binnen in het kernsysteem (Figuur 3.5) en breng buffer aan op de bovenzijde van de gels om te controleren op lekken. Indien er lekken zijn: maak los en klik opnieuw vast
57
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
Figuur 3.5: Het kernsysteem
32. Laad de stalen, de merkers (15 µL, aan de uiteinden en tussen de stalen) en loading dye (10 µL, aan de overige uiteinden) van rechts naar links, 33. Zet de elektroforese-unit af en wacht 1 minuut, 34. Vul de kamer met buffer tot het volledig onder staat, 35. Breng het kernsysteem in de bufferbak (Figuur 3.6) en zorg ervoor dat er voldoende buffer aanwezig is om de bovenste kamer te vullen, 36. Sluit de bufferbak, druk op start en zet de pomp en de verwarmer aan, 37. Controleer of het verwarmingselement werkt en zet de magnetische roerder aan, 38. Sluit elektroden aan en elektroforeer bij 75 V gedurende 960 minuten (16 h) met een stroomsterkte die varieert tussen 30 en 40 mA.
Figuur 3.6: De bufferbak DGGE
3.7.2.6 Kleuren van de gel en nemen van een foto
39. Schakel de stroom uit en haal het kernsysteem uit de buffer, 40. Klik de glasplaten uit de houder en verwijder de klemmen, 41. Zet het sybr gold bad klaar, 58
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
42. Verwijder voorzichtig de kleinste glasplaat en de spacers zodat de gel op de grootste glasplaat terecht komt, 43. Laat de gels zachtjes in het sybr gold bad vallen en laat 30 minuten liggen, 44. Maak de UV-lichtbak nat met water, leg de gel erop, spuit water op de gel, fotografeer en sla op in de computer (zie ook protocol agarosegelelektroforese), 45. De platen dienen gewassen te worden met alconox, gespoeld te worden met kraanwater, milli-Q water en denaturol. Droog ze af met tissue. 3.7.3 Materiaal
Figuur 3.7: Benodigdheden DGGE
• • • • •
• •
Acrylamide-oplossing-protogel 30% m/v – acrylamide 0,8% m/v – bisacryl (37:5:1) firma Biozym Cat nr. EC 890, Formamide 100%, firma Sigma Cat nr. F 9037, Ureum, firma Biozym Cat nr. EC 605, N, N, N, N-tetramethylethyleendiamine of TEMED, bewaren bij 4°C, firma Biozym Cat nr. EC 503, Ammoniumpersulfaat of APS, firma Biozym Cat nr. EC 504 Maak een 10% m/v oplossing in milli-Q water en bewaar aliquots van ongeveer 400 µL bij -20°C, 50x TAE: BIORAD, Waterverzadigde isobutanol, 59
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
• •
•
• •
1x TAE, Stocks van acrylamide: 100% denaturanten: 54 mL 30% acrylamide, 84 g ureum, 80 mL 100% formamide, 4 mL 50x TAE, aluminiumfolie rondwikkelen en laten roeren met roervlo totdat alles opgelost is, overbrengen in een maatkolf en aanlengen met milli-Q water tot 200 mL, afsluiten met parafilm, 0% denaturanten: 54 mL 30% acrylamide, 4 mL 50x TAE in maatkolf, aanlengen tot 200 mL met milli-Q water en afsluiten met parafilm, filtreer daarna deze stocks, 20 cm gradiënt-gel voor cyanobacteriën 33% denaturanten = 8,04 mL acrylamide 0% denaturanten, 3,96 mL acrylamide 100% denaturanten, 8 µL TEMED, 100 mL APS 45% denaturanten = 6,6 mL acrylamide 0% denaturanten, 5,4 mL acrylamide 100% denaturanten, 8 µL TEMED, 100 mL APS 35% denaturanten = 7,8 mL acrylamide 0% denaturanten, 4,2 mL acrylamide 100% denaturanten, 8 µL TEMED, 100 mL APS 60% denaturanten = 4,8 mL acrylamide 0% denaturanten, 7,2 mL acrylamide 100% denaturanten, 8 µL TEMED, 100 mL APS Buffer in elektroforese-unit: 140 mL 50x TAE aanvullen met milli-Q water tot 7 L Sybr gold: 50 µl Sybr gold + 500 mL 1x TAE
3.8 Uitgesneden banden 3.8.1 Protocol 1. Uitgesneden banden mengen met 30 µL TE-buffer, 2. Overnacht laten staan, 3. Uitvoeren van een PCR: 16S Æ cyano 2 PCR ITS Æ ITS-lang PCR = ITS 2 PCR maar ander programma Æ primers: ULR en GC-CSIF Æ programma: 5 minuten 94 °C 20 cycli (1 min 94 °C; 1 min 62 °C Æ 52 °C (-0,5); 1 min 72 °C) 15 cycli (1 min 94 °C; 1 min 52 °C; 1 min 72 °C) 30 min 72 °C 15 °C tot einde 4. Testen van het PCR product op 1% agarose 60
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
3.9 Cycle sequencing 3.9.1 Principe Hier maakt men gebruik van twee soorten nucleotiden, de dNTP’s en de ddNTP’s. Eerst maakt men een mix van DNA, het enzym polymerase, dNTP’s, ddNTP’s en de primer. Deze mix wordt verhit zodat het DNA denatureert en enkelstrengig wordt. Daarna wordt de temperatuur verlaagd zodat de primer kan binden op de strengen. De temperatuur wordt opnieuw langzaam verhoogd zodat het enzym polymerase kan binden. Het enzym bouwt daarna willekeurig dNTP’s of ddNTP’s in zodat er een complementaire streng gevormd wordt. Wanneer een dNTP wordt ingebouwd gaat de reactie verder, maar wanneer een ddNTP, die geen terminale OH-groep bezit, wordt ingebouwd stopt de synthese. Doordat de synthese van de complementaire streng telkens op een ander moment stopt bij de incorporatie van een ddNTP, heeft men op het einde stukken DNA van allerlei verschillende lengten. (Bijlage 3) Dit cycle sequencing product wordt achteraf gezuiverd. 3.9.2 Protocol 1. PCR van zuivere bandjes of staaltjes: 16S: PCR CYANO II, ITS: ITS 2 BV, 2. Controle van het PCR product op 1% agarose, 3. Enzymatische zuivering van de staaltjes met ExoI en CIAP, incubatie: 15 min bij 37 °C en 15 min bij 85 °C 4. Cycle sequencing reactie: 16S: primer: Stef1Tex productenmix: Buffer 5x: 1,8 µL (Applied Biosystems) Big Dye: 0,4 µL (Applied Biosystems) primer: 3 µL (Introgen) AD: aanvullen tot 10 µl template: te bepalen 61
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
(afhankelijk van de sterkte van de band) programma: seq-K: 1 min op 96 °C en dan 30 cycli: 10 sec op 96 °C 10 sec op 50 °C 1 min 15 op 60 °C 15 °C tot einde, ITS: primers: CSIF en ULR (groter stuk dan 16S) productenmix: (2 maal, een maal per primer) buffer 5x: 1,8 µL (Applied Biosystems) Big Dye: 0,4 µL (Applied Biosystems) primer: 3 µL (Invitrogen) AD: aanvullen tot 10 µl template: te quantificeren· programma = Seq K 3.9.3 Materiaal •
•
BigDye TMTerminator kit V3.1 van Applied Biosystems, BigDye zit in de vriezer gedurende de tijd dat de buffer in de koelkast is en mag niet bevroren zijn, Sequencing primer: Prokaryotische en Cyanobacteriën banden: Stef1 Tex (5’ GCGTTCTTCATCGTTGCGAG 3’), ITS banden cyanobacteriën: CSIF en ULR (bij lange sequenties zowel reverse als forward primer gebruiken),
3.10 Zuiveren van het cycle sequencing product 3.10.1 Principe Ieder cycle sequencing product moet gezuiverd worden om de overtollige dNTP’s en ddNTP’s samen met de primers te verwijderen. Zo interfereren ze niet tijdens de sequenering. 3.10.2 Protocol 1. Centrifugeer de staaltjes (6 sec),
62
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
2. Leg voor elk staaltje een epje klaar die 25 µL absolute EtOH (96% uit de diepvries) en 1 µL NaAc (pH 4,6) bevat en voeg daaraan 10 µL van het CS-product aan toe, 3. Vortex en zet 10 min op ijs, 4. Centrifugeer gedurende 25 min op 13 000 rpm, 5. Giet voorzichtig het supernatans weg (de overblijvende pellet is bijna niet te zien), 6. Voeg 250 µL 70% EtOH toe, 7. Vortex kort, 8. Centrifugeer gedurende 15 min op 13 000 rpm, 9. Zuig met een pipet zo droog mogelijk af en centrifugeer voor 6 sec, 10. Droog het pellet volledig in de vacuümcentrifuge gedurende 20-30 min, 11. Plaats de staaltjes op –20 °C tot het sequeneren start. 3.10.3 Materiaal • 96% Ethanol (uit de diepvries) • NaAc • 70% Ethanol (uit de diepvries) Voor het aanmaken van de 70% ethanol wordt best gebruik gemaakt van geautoclaveerd water 3M NaAc wordt aangemaakt pH5(pH wordt geregeld met azijnzuur).
3.11 Sequeneren Na de zuivering van het cycle sequencing product blijft enkel nog een pellet over met het DNA. Dit pellet wordt opnieuw opgelost in formamide. Er wordt daarna een potentiaalverschil aangelegd. Het DNA wordt in capillairen opgenomen en door een laser bestraald waardoor de labels van de ddNTP’s fluoresceren. De fluorescerende deeltjes passeren een fotogevoelige detector die de stralingen waarneemt. Deze worden dan omgezet in elektronische informatie en via de computer wordt er dan een elektroferogram gemaakt. Doordat ieder ddNTP een ander label heeft, hebben ze ook een andere fluorescerende straling. Hierdoor hoeft men ieder staal een maal te sequeneren. Op het 63
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Materialen en methoden
elektroferogram heeft iedere base een ander kleur (A = groen, C = blauw, G = zwart en T = rood).
64
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Resultaten
4
Resultaten
4.1
Algemeen
4.1.1 DNA-extractie Het DNA wordt uit de cellen geëxtraheerd en opgelost in warme TE-buffer. 4.1.2 Zuivering geëxtraheerd DNA Het geëxtraheerde materiaal wordt gezuiverd door middel van het Wizard(R) DNA Clean-Up systeem met de vacuümpomp zodat er geen contaminanten meer aanwezig zijn. 4.1.3 PCR 4.1.3.1 Cyanospecifieke genestelde PCR (16S)
Bij de eerste PCR die uitgevoerd wordt, gebruikt men cyanospecifieke primers. Enkel het DNA van cyanobacteriën ondergaat de PCR. Het geamplificeerde DNA is 400 bp lang. De tweede PCR gebeurt met algemene primers aangezien er enkel nog DNA is afkomstig van cyanobacteriën. Het eindproduct van deze PCR is 140 bp lang waarvan 40 bp een GC-klem is (Figuur 4.1).
Figuur 4.1: Agarosegel cyanospecifieke PCR2 Donkmeer
65
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Resultaten
4.1.3.2 Microcystis- en Planktothrix- specifieke genestelde PCR (ITS)
Er wordt een specifieke primer gebruikt voor de eerste PCR. CH-MF wordt gebruikt voor Microcystis (Figuur 4.2) en CN-PF voor Planktothrix (Figuur 4.3), de reverse primer is de algemene primer URL. Algemene primers worden dan weer gebruikt tijdens de tweede PCR.
Figuur 4.2: Agarosegel Microcystis-specifieke PCR2 Westveld
Figuur 4.3: Agarosegel Planktothrix-specifieke PCR2 Donkmeer
66
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Resultaten
4.1.4 Zuivering PCR-product Na iedere PCR wordt het PCR-product gezuiverd met de QIAquick PCR purification kit om contaminatie en interferentie te voorkomen bij de tweede PCR of tijdens de elektroforese. 4.1.5 DGGE DGGE scheidt de PCR-producten op basis van sequentie. Ieder bandje dat op een andere hoogte ligt, wordt tweemaal uitgesneden en de sequentie ervan wordt bepaald (Figuur 4.4 en 4.5) (Bijlage 4 en 5).
Figuur 4.4: DGGE-gel Donkmeer cyanospecifieke PCR
67
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Resultaten
Figuur 4.5: DGGE-gel Westveld Microcystis-specifieke PCR
Doordat de gels niet gestandaardiseerd genoeg gelopen zijn, heeft Sofie D’hondt de gels nog eens opnieuw gedaan en gebruik ik deze bij de verwerking van mijn resultaten (Bijlage 6). Een kleine vergelijking is hieronder te zien (Figuur 4.6 en 4.7):
68
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Resultaten
Figuur 4.6: gel ITS Westveld door D'hondt S.
Figuur 4.7: gel ITS Westveld Verschuere A.
Het is niet eenvoudig een DGGE-gel te gieten omdat eerst en vooral de gradiënt correct moet zijn. De kleinste stoot tijdens het gieten of tijdens het stollen kan ervoor zorgen dat de gradiënt van de gel verandert. Een veel gezien probleem tijdens de stage zijn de dubbele banden en smiling. 4.1.6 Cycle sequencing De sequentie wordt bepaald via cycle sequencing en daarna wordt alles geblast (ncbi) om na te gaan voor welke bacterie of genotype het bandje staat.
4.2
Westveld – Microcystis
4.2.1
Diversiteit Op de gels zijn er gemiddeld vijf bandjes aanwezig per staal, wat overeenkomt met het aantal genotypes Microcystis. Er zijn over alle stalen een veertiental verschillende bandjes te zien, wat overeenkomt met het aantal verschillende genotypes. Op deze van Sofie D’hondt zijn er gemiddeld acht bandjes te tellen per staal en zijn er eveneens veertien verschillende bandjes in totaal te tellen. 69
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Resultaten
Op aangelegde culturen werden twee soorten morfologieën onderscheiden, M. viridis en M. aeruginosa. De grafieken van de tellingen door Jeroen van Wichelen zijn terug te vinden in Bijlage 7.
4.2.2
Temporele dynamiek Het aantal bandjes in het voorjaar ligt hoger dan het aantal in de zomer en het najaar. Vanaf augustus en tijdens het najaar is het aantal bandjes een stuk minder. Er zijn een paar bandjes die het hele jaar door terug te vinden zijn en er is een bandje dat niet meer te zien is in de staaltjes genomen in oktober en november. Op de grafieken (Bijlage 7) is te zien dat M. aeruginosa het meest voorkomt in de lente, terwijl M. viridis in grote getallen aanwezig is in de stalen genomen in de zomer. Wanneer men de grafieken naast de gels legt en de temporele dynamiek van de twee herkende morfologieën vergelijkt met de gels, kan men zien dat de onderste band van de merker overeenkomt met M. aeruginosa en de middelste band met M. viridis (Figuur 4.8).
70
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Resultaten
Figuur 4.8: Gel Westveld M. viridis en M. aeruginosa
4.2.3
McyA en McyE gendetectie PCR Er werd een PCR uitgevoerd waarbij een eerste maal de mcyA primer werd gebruikt en een tweede maal de mcyE primer werd gebruikt. De aanwezigheid van het mcyA gen duidt aan dat er mogelijk toxische Microcystis en/of Planktothrix en/of Anabaena aanwezig is in het staal. Als er een bandje te zien is voor het mcyE gen, wil dit zeggen dat er toxische Microcystis aanwezig is. De resultaten zijn terug te vinden in Bijlage 8. Daaruit blijkt dat er in ieder staal Microcystis aanwezig is.
4.3
Donkmeer – cyanobacteriën
4.3.1
Diversiteit Het DNA uitgesneden uit de bandjes is afkomstig van vooral Planktothrix, Synechococcus en Anabaena of Aphanizomenon. Anabaena en Aphanizomenon zijn fylogenetisch niet te onderscheiden. Het zijn beide filamenteuze cyanobacteriën en Anabaena kan in symbiose leven met bepaalde 71
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Resultaten
planten. Ze komen voor in alle stalen. Synechococcus is een unicellulaire kok die vooral teruggevonden wordt in zoetwateren en is terug te vinden in alle stalen die genomen zijn. Planktothrix is filamenteus en heeft de voorkeur aan weinig licht en lage temperaturen. Er wordt vermoed dat de dikke band onderaan de gels Planktothrix zou kunnen zijn, maar er is nog geen resultaat dat dit bevestigt. Er zijn tellingen gebeurd van de cyanobacteriën, de resultaten zijn te bekijken in Bijlage 9. Als men de tellingen (door Maureen Fagot) vergelijkt met de intensiteit van de banden kan men bevestigen dat de onderste band Planktothrix kan zijn (Figuur 4.9). Hoe meer cellen er geteld worden, hoe intenser de band is. Anabaena en Aphanizomenon werden ook morfologisch onderscheiden maar onderzoek heeft aangetoond dat deze cyanobacteriën genetisch niet te onderscheiden zijn en eigenlijk tot een genus behoren (Gugger et al, 2002).
Figuur 4.9: Gel Donkmeer + Planktothrix
72
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Resultaten
4.3.2
Temporele dynamiek Er zijn opmerkelijk minder banden te zien bij de stalen die genomen zijn in het najaar in vergelijking met de zomer en het voorjaar. De stalen genomen in november hebben meer banden dan deze genomen in september en oktober. Het aantal banden in de stalen uit het voorjaar en tijdens de zomer zijn ongeveer hetzelfde, maar in het voorjaar zijn het andere banden in vergelijking met de zomer. Er zijn banden te zien in de stalen genomen tijdens het najaar op de zelfde hoogte als in stalen uit het voorjaar.
4.3.3
McyA en McyE gendetectie PCR Er werd eveneens een PCR uitgevoerd met de mcyA en de mcyE primer. De resultaten zijn terug te vinden in Bijlage 10. Minder stalen bevatten het mcyE gen in vergelijking met het mcyA gen.
4.4
Donkmeer – Planktothrix
4.4.1
Diversiteit Op de agarosegel zijn er twee bandjes te zien bij ieder staal (Figuur 4.3). Dit wil zeggen dat er twee verschillende ITS-sequenties aanwezig zijn, een korte en een lange. De lange sequentie is bovenaan de DGGE-gels terug te vinden. Studie van individuale stammen heeft aangetoond dat de verschillende bandjes afkomstig kunnen zijn van eenzelfde stam. Dit wordt intragenomische variatie genoemd. De eerste gel met de stalen genomen in het voorjaar is niet goed gelopen en wordt niet meegeteld. Er zijn gemiddeld zeven banden te tellen per staal en er zijn acht verschillende banden te zien op alle gels (Bijlage 11).
4.4.2
Temporele dynamiek Het aantal genotypes in het najaar ligt iets hoger dan deze tijdens de zomer. De genotypes in het najaar zijn allemaal terug te vinden in de zomer.
73
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE. Conclusie
5
Conclusie
5.1
Westveld – Microcystis Er zijn gemiddeld acht genotypes terug te vinden in de stalen en veertien verschillende genotypes in het totaal. Het aantal genotypes dat in het voorjaar voorkomt is hoger dan tijdens de zomer of het najaar. Bepaalde genotypes komen het hele jaar voor. Een hoge temporele dynamiek en diversiteit van Microcystis werd ook gevonden door Kardinaal et al., 2007.
5.2
Donkmeer – cyanobacteriën De bandjes die uitgesneden zijn, zijn vooral Synechococcus en Anabaena of Aphanizomenon. Het aantal verschillende cyanobacteriën in het najaar is kleiner dan deze terug te vinden in het voorjaar en zomer. Het aantal cyanobacteriën in de zomer en het voorjaar is ongeveer gelijk, maar het zijn andere cyanobacteriën.
5.3
Donkmeer - Planktothrix Gemiddeld zijn er zeven bandjes per staal aanwezig. Men moet wel rekening houden met het feit dat er twee ITS-sequenties zijn per genotype. Er zijn acht verschillende banden over alle stalen terug te vinden. Het aantal genotypes in het najaar ligt iets hoger dan deze tijdens de zomer. De genotypes in het najaar zijn allemaal terug te vinden in de zomer. We kunnen besluiten dat de temporele dynamiek en diversiteit van Planktothrix lager was dan van Microcystis in onze studie.
74
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE.
Literatuurlijst Literatuur -
-
-
-
-
-
Chorus I., Bartram J.(1999), Toxic Cyanobacteria in water: a guide to their public health consequences, monitoring and management [Pdf]. London en New York: Routledge Debeer A., Onderzoek naar de diversiteit en samenstelling van bacteriële gemeenschappen en populatiestructuur van Microcystis bloeien, 2006-2007 D’Hondt J., Onderzoek naar cyanobacteriële gemeenschappen in poelen en dammen in Ethiopië, 2006-2007 Gugger M. (2002), Phylogenetic comparison of the cyanobacterial genera Anabaena and Aphanizomenon. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52, 1867-1880 Janse, I. (2003). High-resolution differentiation of cyanobacteria by using rRNA-internal transcribed spacer denaturing gradient gel electrophoresis. Applied and environmental microbiology, 11, 6634-6643 Janse, I. (2004). Toxic and non-toxic Microcystis colonies in natural populations can be differentiated on the basis of rRNA gene internal transcribed spacer diversity. Applied and environmental microbiology, 7, 3979-3987 Janse I., Kardinaal W.(2005). Contrasting microcystin production and cyanobacterial population dynamics in two Planktothrix-dominated freshwater lakes. Environmental microbiology, 11, 1-11 Kardinaal W.(2007). Microcystis genotype succession in relation to microcystin concentrations in freshwater lakes. Aquatic microbial ecology, 48, 1-12 van Gremberghe I., Studie naar het voorkomen en de samenstelling van cyanobacteriënbloeien in Belgische oppervlaktewateren, 2003-2005 Zwart, G. (2005). Molecular characterization of cyanobacterial diversity in a shallow eutrophic lake. Environmental microbiology, 7, 365-377
Internet -
-
-
-
Babylon [WWW] URL: http://www.babylon.com gezien d.d. 03 maart 2008 Biology animation library: Cycle sequencing [WWW] URL: http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/cycseq.html gezien d.d. 18/04/2008 Cary 5000 UV-Vis-NIR Spectrophotometer [WWW] URL: http://www.gmi-inc.com/Categories/cary5000.htm gezien d.d. 24/04/2008 Cyanophyta [WWW] URL: http://users.ugent.be/~fleliaer/pracalg/kan1/micro/cyano/cyano.html gezien d.d. 22/04/2008 75
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) [WWW] URL: http://www.microbe.com/dgge_how.html gezien d.d. 15 april 2008 Green J., Don’t panic, a guide to DGGE [WWW], 28/12/2005 URL: http://ddgehelp.blogspot.com/2005/11/dgge-guide.html gezien d.d. 17 maart 2008 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) [Pdf], Laboratory for Microbial Ecology Department of Earth, Ecological and Environmental Sciences University of Toledo, 12/2004 URL: http://www.eeescience.utoledo.edu/Faculty/Sigler/RESEARCH/Protocols/D GGE/DGGE.pdf gezien d.d. 17 maart 2008 Meeks J., Welcome to the Meeks Lab Home Page [WWW] URL: http://microbiology.ucdavis.edu/meeks/ gezien d.d. 22/04/2008 Microcystis in the environment and its health effects [WWW], Florida fish and wildlife conservation commission URL: http://www.floridamarine.org/features/print_article.asp?id=25259 gezien d.d. 23 februari 2008 MinElute PCR Purification Kit [WWW] URL: http://www1.qiagen.com/Products/DnaCleanup/GelPcrSiCleanupSystems/M inElutePCRPurificationKit.aspx?ShowInfo=1 gezien d.d. 15 april 2008 Muylaert K., Algemene introductie tot de algen en cyanobacteria [Pdf], 2008 URL: http://bio.kuleuven.be/sys/eduweb/9.ppt gezien d.d. 22/04/2008 PCR product profiles [WWW] URL: http://www.promega.com/applications/pcr/featuresandbenefits/Wizard_SV_ Gel_PCR_Clean-Up_System.htm gezien d.d. 15 april 2008 Ribosomal DNA [WWW] URL: http://images.google.be/imgres?imgurl=http://content.answers.com/main/co ntent/wp/en-commons/thumb/d/d5/400pxEucaryot_rdna.png&imgrefurl=http://www.answers.com/topic/ribosomaldna&h=106&w=397&sz=17&hl=nl&start=4&um=1&tbnid=E5WtuYO0Kt4WR M:&tbnh=33&tbnw=124&prev=/images%3Fq%3DInternal%2Btranscribed% 2Bspacer%2B%26um%3D1%26hl%3Dnl%26sa%3DN gezien d.d. 15 april 2008 Susan Mbedi, Martin Welker, Jutta Fastner, Claudia Wiedner, Variability of the microcystin synthetase gene cluster in the genus Planktothrix (Oscillatoriales, Cyanobacteria) [Pdf], 2005 76
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE.
-
-
-
-
-
URL: http://www.blackwellsynergy.com/doi/pdf/10.1016/j.femsle.2005.03.020 gezien d.d. 15 april 2008 Swings ir. J., Biology of Microorganisms [Pdf], 2000 URL: http://users.ugent.be/~jswings/Micro_1/Micro1-les4ed10.pdf gezien d.d. 15 april 2008 VVV Donkmeer [WWW] URL: http://www.berlare.be/vvvdonkmeer/home.htm gezien d.d. 15 april 2008 Welke Technieken? [WWW], 2004 URL: http://www.ftns.wau.nl/micr/milieumicrobiologie/technieken/Technieken.htm gezien d.d. 15 april 2008 Wikipedia [WWW] URL: http://www.wikipedia.org gezien d.d. 03 maart 2008 Zwart, G. and Bok, J., Protocol DGGE [Pdf], 2002 URL: http://bio.kuleuven.be/eco/bioman/publications/ProtocolDGGE_bacteria&protists.pdf gezien d.d. 15 april 2008
77
Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE.
Bijlagen
Bijlage 1: Vorming van schuimende bloeien
Bijlage 2: Principe PCR zuivering
Bijlage 3: Principe Cycle Sequencing
Bijlage 4: DGGE gels Westveld – Microcystis
Bijlage 5: DGGE gels Donkmeer – Cyanobacteriën
Bijlage 6: Gels ITS Westveld Sofie D’hondt
Bijlage 7: Grafiek tellingen M. viridis en M. aeruginosa door Jeroen van Wichelen.
Bijlage 8: Resultaten PCR mcyA en mcyE op de stalen van het Westveldpark.
Bijlage 9: Grafiek tellingen Anabaena, Aphanizomenon en Planktothrix door Maureen Fagot.
Bijlage 10: Resultaten PCR mcyA en mcyE op de stalen van het Donkmeer.
Bijlage 11: DGGE gels Donkmeer – Planktothrix Sofie D’hondt
78
Bijlage 1: Vorming van schuimende bloeien
79
Bijlage 2: Principe PCR-zuivering
80
Bijlage 3: Principe Cycle Sequencing
81
82
83
84
Bijlage 4: DGGE gels Westveld – Microcystis
-
Gel WP01-10
-
Gel WP11-20
85
-
Gel WP21-31
-
Gel WP 32-42
86
-
Gel WP43-53
87
Bijlage 5: DGGE gels Donkmeer – Cyanobacteriën
-
Gel DM01-11
88
-
Gel DM12-22
-
Gel DM23-34
89
-
Gel DM35-45
90
Bijlage 6: Gels ITS Westveld Sofie D’hondt
-
Gel WP01-11:
-
Gel WP12-22:
91
-
Gel WP23-33:
-
Gel WP34-44:
92
-
Gel WP45-53,A,B:
93
Bijlage 7: Grafiek tellingen M. viridis en M. aeruginosa door Jeroen van Wichelen.
94
Bijlage 8: Resultaten PCR mcyA en mcyE op de stalen van het Westveldpark.
Staal
mcyA
mcyE
Staal
mcyA
mcyE
Staal
mcyA
mcyE
WP01
+
+
WP19
+
+
WP37
+
+
WP02
+
+
WP20
+
+
WP38
+
+
WP03
+
+
WP21
+
+
WP39
+
+
WP04
+
+
WP22
+
+
WP40
+
+
WP05
+
+
WP23
+
+
WP41
+
+
WP06
+
+
WP24
+
+
WP42
+
+
WP07
+
+
WP25
+
+
WP43
+
+
WP08
-
+
WP26
+
+
WP44
+
+
WP09
+
+
WP27
+
+
WP45
+
+
WP10
+
+
WP28
-
+
WP46
+
+
WP11
+
+
WP29
+
+
WP47
+
+
WP12
+
+
WP30
+
+
WP48
-
+
WP13
+
+
WP31
+
+
WP49
+
+
WP14
+
+
WP32
+
+
WP50
+
+
WP15
+
+
WP33
+
+
WP51
+
+
WP16
+
+
WP34
+
+
WP52
+
+
WP17
+
+
WP35
+
+
WP53
+
+
WP18
+
+
WP36
+
+
95
Bijlage 9: Grafiek tellingen Anabaena, Aphanizomenon en Planktothrix door Maureen Fagot.
96
Bijlage 10: Resultaten PCR mcyA en mcyE op de stalen van het Donkmeer.
Staal
mcyA
mcyE
Staal
mcyA
mcyE
Staal
mcyA
mcyE
DM 01
-
-
DM 16
+
+
DM 31
+
+
DM 02
-
-
DM 17
+
+
DM 32
+
+
DM 03
+
+
DM 18
+
-
DM 33
+
+
DM 04
+
-
DM 19
+
-
DM 34
+
+
DM 05
+
-
DM 20
+
+
DM 35
+
+
DM 06
+
-
DM 21
+
-
DM 36
+
+
DM 07
+
+
DM 22
+
+
DM 37
+
+
DM 08
+
-
DM 23
+
+
DM 38
+
+
DM 09
+
+
DM 24
+
+
DM 39
+
+
DM 10
+
+
DM 25
+
+
DM 40
+
-
DM 11
+
-
DM 26
+
+
DM 41
+
+
DM 12
+
+
DM 27
+
-
DM 42
+
-
DM 13
+
+
DM 28
+
+
DM 43
+
-
DM 14
+
-
DM 29
+
+
DM 44
+
+
DM 15
+
-
DM 30
+
+
DM 45
+
-
97
Bijlage 11: DGGE gels Donkmeer – Planktothrix Sofie D’hondt
-
Gel DM 12-22
98
-
Gel DM 23-33
-
Gel DM 34-45
99
Colofon Microsoft Corporation, Adobe Reader 7.0 Microsoft Corporation, Internet Explorer Microsoft Corporation, Office Professional Plus 2007 Î Word Î Excel Î Powerpoint Î Picture Manager Microsoft Corporation, Paint Microsoft Corporation, Windows XP, Home Edition, versie 2002 Windows Firefox Quantity One®
100
Voor akkoord verklaring
Sofie D’hondt
Katleen van der Gucht
Stagementor
Stagegever
Mieke Demeyere promotor
101