Vergelijking van twee verschillende cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo s

Vergelijking van twee verschillende cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s

Woord vooraf

In het laatste jaar van onze opleiding is een stageperiode van vijftien weken voorzien waarvan zeven weken eindwerkstage. Voor mijn eindwerkstage kwam ik in het AZ St Jan in Brugge terecht waar ik in het centrum voor reproductieve geneeskunde (CRG labo) een vergelijkende studie zou maken tussen twee verschillende cryopreservatiemethodes.

Graag wil ik biologe-embyologe Valerie Standaert bedanken voor de goede begeleiding gedurende deze zeven weken alsook voor de informatie die zij tot mijn beschikking stelde om mijn eindwerk te maken. Ik wil ook mijn dank betuigen aan de andere personeelsleden van het CRG labo die mij gedurende deze zeven weken begeleid hebben.

Dr. Sc. Nicole Kelner die mijn begeleidster was gedurende deze zeven weken wil ik ook bedanken voor de goede opvolging.

1


Samenvatting

Cryopreservatie is een techniek waarmee onder andere embryo’s gedurende lange tijd kunnen bewaard worden in vloeibare stikstof. Er bestaan verschillende cryopreservatiemethodes die elk gebruik maken van andere cryoprotectanten en/of een ander invriesprogramma. In het AZ St Jan Brugge worden momenteel dimethylsulfoxide-sucrose (DMSOsucrose) als cryoprotectanten gebruikt met een aangepast invriesprogramma. Het DMSOsucrose wordt in het labo zelf aangemaakt en dit is arbeidsintensief. Daarom wil men overschakelen naar een andere methode die commercieel beschikbaar is. In het theoretisch deel wordt uitgelegd wat in vitro fertillisatie en cryopreservatie inhouden. In het deel resultaten wordt een vergelijking gemaakt tussen twee cryopreservatiemethodes, namelijk tussen DMSO-sucrose en een methode van vitrolife die gebruik maakt van propaandiol (PROH) en sucrose. De twee methoden worden op drie vlakken met elkaar vergeleken. Op vlak van: overleving, evolutie en evolutie tot blastocyst stadium. DMSO-sucrose scoort op twee van de drie vlakken significant beter dan de methode van vitrolife. Alvorens een wijziging van methode plaatsvindt moeten er aanpassingen in het vitrolife protocol doorgevoerd worden.

2


Lijst met afkortingen en symbolen

2PN

:

twee pronucleï of voorkernen (voorloper van een kern)

DMSO

:

dimethylsulfoxide

EBSS

:

Earle’s balanced salt solution

EFS

:

embryo freezing solution

ETS

:

embryo thawing solution

ET

:

embryo transfer

FRET

:

frozen embryo transfer

HCG

:

humaan chorion gonadotrofine

Hepes

:

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

HES

:

hepes gebufferde Earle’s medium met HSA

HSA

:

humaan serum albumine

ICM

:

inner cell mass

ICSI

:

intracytoplasmatische spermacel injectie

IVF

:

in vitro fertilisatie

IUI

:

intra-uteriene inseminatie

LAF

:

laminaire flow

ml

:

milliliter

mm

:

millimeter

OPU

:

Oöcyt pick-up, eicelpunctie

PBS

:

phosphate buffered saline

PROH

:

propaandiol

Sec

:

seconden 3


T

:

temperatuur

TE

:

trofectoderm

4


Verklarende woordenlijst

Blastocoel

: ook klievingsholte genoemd, is een holte die centraal gelegen is in de blastocyst

Blastocyst

: is een embryonaal ontwikkelingsstadium, gevormd op dag 5 of dag 6 van de embryonale ontwikkeling waarbij de blastocoel is gevormd die de ICM bevat en omgeven is door het trofectoderm

Blastomeer

: een delingscel van het embryo

Bull’s eye structuur

: ontstaat door samentrekking van het cytoplasma

Cumuluscomplex

: steun- en voedingscellen die de eicel omgeven

Ectoderm

: kiemlaag die de huid en het zenuwstelsel vormt

Endoderm

: kiemlaag die het bloed, het skelet, de spieren, het bindweefsel en de nieren vormt

Endometrium

: baarmoederslijmvlies, dit wordt tijdens de menstruatie afgestoten tijdens de zwangerschap menstrueert de vrouw niet waardoor het embryo zich in het endometrium kan innestelen

Eutectisch punt

: de temperatuur waarbij een mengsel van stoffen zal smelten of stollen

5


Glad endoplasmatisch reticulum : is een onderdeel van de cel die instaat voor het vervoer van stoffen vanuit het ruw ER, het oplsaan van calcium ionen, de synthese van lipiden en fosfolipiden en detoxificatie.

Meerkernigheid

: er zijn meerdere kernen aanwezig in één blastomeer, dit wordt als abnormaal beschouwd, tenzij de kernen even groot zij, dit wijst er dan op dat de cel in deling is

Mesoderm

: kiemlaag die het spijsverteringsstelsel en de inwendige organen vormt

Morula

: embryonaal ontwikkelingsstadium op dag vier en is het resultaat van de elkaar snel opvolgende klievingsdelingen, zo ontstaat er een bolvormige tros van kleine bolvormige blastomeren,

Oöcyt

: synoniem voor eicel

Poollichaam

: een kern die uitgestoten wordt tijdens de meiotische delingen bij de vorming van de eicel

Trofectoderm

: het geheel van cellen die zorgen voor extra-embryonale structuren zoals de placenta, het zorgt eveneens voor de uitwisseling van voedingsstoffen en afvalproducten

Zona pellucida

: een membraan opgebouwd uit glycoproteïnen die het plasmamembraan van de eicel omgeeft. Eenmaal één zaadcel door de zona pellucida geraakt zal deze in normale omstandigheden ondoordringbaar worden voor andere zaadcellen.

6


Lijst van tabellen en figuren

Tabel 2.1: Eigenschappen van DMSO en PROH (5)......................................................... 20 Tabel 3.1: Gebruikte materialen ........................................................................................ 32 Tabel 3.2: Gebruikte reagentia .......................................................................................... 33 Tabel 3.3: Gebruikte toestellen .......................................................................................... 33 Tabel 3.4: Invriesoplossingen DMSO-sucrose protocol..................................................... 38 Tabel 3.5: Dooioplossingen DMSO-sucrose protocol ........................................................ 39 Tabel 4.1: Resultaten DMSO-sucrose ............................................................................... 47 Tabel 4.2: Resultaten PROH ............................................................................................. 48

Figuur 2.1: De uitvoering van een ICSI ............................................................................. 15 Figuur 2.2: De cyclus bij een kunstmatige bevruchting .................................................... 16 Figuur 2.3: Links een achtcellig embryo op dag drie, rechts een blastocyst op dag vijf .... 18 Figuur 2.4: Een invriesstrootje ........................................................................................... 22 Figuur 2.5: Een laborante die een seeding uitvoert .......................................................... 23 Figuur 2.6: Een isotone oplossing ..................................................................................... 24 Figuur 2.7: Normaal embryo met 2PN, abnormaal meerkernig embryo met 3PN ........... 27 Figuur 2.8: Fragmentatie ................................................................................................... 28 Figuur 2.9: Gradaties bij fragmentatie ............................................................................... 29 Figuur 2.10: Links een hatching blastocyst, Rechts een hatched blastocyst ................... 30 Figuur 2.11 : Blastocyst ..................................................................................................... 31 Figuur 3.1 : ID rods, ID jackets en een invriesstrootje ....................................................... 33 Figuur 3.2 : De inversiemicroscoop Nikon Eclipse TE2000U............................................34 7


Figuur 3.3 : De stereomicroscoop Nikon SMZ 1000..........................................................34 Figuur 3.4 : De cryogene tank............................................................................................35 Figuur 4.1: Overlevingspercentage bij de DMSO-Sucrose methode ................................. 47 Figuur 4.2: Overlevingspercentage PROH methode ......................................................... 49

8


Inhoudsopgave

Woord vooraf ..................................................................................................................... 1 Samenvatting ..................................................................................................................... 2 Lijst met afkortingen en symbolen .................................................................................. 3 Verklarende woordenlijst .................................................................................................. 5 Lijst van tabellen en figuren ............................................................................................. 7 Inhoudsopgave .................................................................................................................. 9 1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling ................................................. 12

2

Literatuurstudie ................................................................................................. 14

2.1

Doelstelling .......................................................................................................... 14

2.2

In Vitro Fertilisatie ................................................................................................ 14

2.3

Cryopreservatie algemeen ................................................................................... 19

2.3.1

Wat is cryopreservatie? ....................................................................................... 19

2.3.2

Principe ................................................................................................................ 19

2.3.3

Cryoprotectanten ................................................................................................. 20

2.4

Traag Invriezen .................................................................................................... 21

2.4.1

Dehydratatie ........................................................................................................ 21

2.4.2

Seeding................................................................................................................ 22

2.5

Vitrificatie ............................................................................................................. 24

2.6

Ontdooien ............................................................................................................ 25

2.6.1

Rehydratatie ........................................................................................................ 25

2.7

Evaluatie en embryodeling .................................................................................. 26

2.7.1

Dag 0 (bij ICSI, niet bij IVF) ................................................................................. 26

2.7.2

Dag 1 ................................................................................................................... 26

2.7.3

Dag 2 ................................................................................................................... 28

2.7.4

Dag 3 ................................................................................................................... 29

2.7.5

Dag 4 (morula stadium) ....................................................................................... 29

2.7.6

Dag 5 – 6 ............................................................................................................. 30 9


3

Materiaal en methode ........................................................................................ 32

3.1

Gebruikte materialen, reagentia en toestellen ..................................................... 32

3.1.1

Invriesstrootjes , ID jacket en ID rod .................................................................... 34

3.1.2

Microscopen ........................................................................................................ 35

3.1.3

De cryogene tank ................................................................................................. 36

3.2

Het DMSO-sucrose protocol ................................................................................ 37

3.2.1

Samenstelling EBSS ............................................................................................ 37

3.2.2

Bereiding van EBSS-stockoplossing ................................................................... 37

3.2.3

Bereiding van HES .............................................................................................. 37

3.2.4

Bereiding van de sucrose-oplossing (1M) ........................................................... 37

3.2.5

Invriesstockoplossing (0,1M sucrose) .................................................................. 38

3.2.6

Dooistockoplossing (0,2M sucrose) ..................................................................... 38

3.2.7

Bereiding van ontdooi – en invriesmedia ............................................................. 38

3.2.8

Werkwijze invriezen ............................................................................................. 40

3.2.9

Werkwijze ontdooien ............................................................................................ 41

3.2.10

Programma invriestoestel.................................................................................... 42

3.3

Het protocol van vitrolife ...................................................................................... 42

3.3.1

Gebruikte media .................................................................................................. 42

3.3.2

Werkwijze invriezen ............................................................................................. 42

3.3.3

Werkwijze ontdooien ............................................................................................ 43

3.3.4

Programma invriestoestel .................................................................................... 44

3.4

Methode ............................................................................................................... 45

4

Resultaten .......................................................................................................... 46

4.1

Leerproces ........................................................................................................... 46

4.2

Resultaat.............................................................................................................. 46

4.2.1

DMSO-Sucrose .................................................................................................... 47

4.3

PROH .................................................................................................................. 48

4.4

Zijn er significante verschillen tussen beide methoden? ..................................... 49

4.4.1

significantie naar 100% overleving toe ................................................................ 50

4.4.2

significantie naar evolutie toe .............................................................................. 51

4.4.3

significantie naar evolutie tot blastocyst toe ........................................................ 52 10


5

Discussie en Conclusie ..................................................................................... 53

Literatuurlijst .................................................................................................................... 54 Bijlagen ............................................................................................................................. 57 Bijlage 1 – Human Blastocyst Vitrification Protocol ........................................................... 58 Bijlage 2 – delingschema van een embryo ........................................................................ 60 Bijlage 3 – Verschillende stadia bij compactatie ............................................................... 63 Voor akkoord verklaring ................................................................................................. 64

11

Vergelijking van twee verschillende cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s Literatuurstudie

1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling

Koppels met een bestaande kinderwens kunnen vroeg of laat geconfronteerd worden met een harde realiteit, op natuurlijke wijze kinderen krijgen is niet altijd mogelijk zonder hulp van buitenaf. Ook alleenstaande vrouwen of homoseksuele (lesbische) koppels met een bestaande kinderwens kunnen de hulp van een fertiliteitscentrum inroepen. Indien een vrouw niet spontaan zwanger wordt zal ze na verloop van tijd de hulp van een fertiliteitsarts inroepen. De arts zal in eerste plaats nagaan of de vrouw ooit al zwanger is geweest en hoe lang het koppel al een kinderwens heeft. Als de vrouw nog nooit spontaan zwanger is geweest en de kinderwens al meer dan één jaar duurt, worden zowel bij de man als bij de vrouw verschillende onderzoeken gedaan, bijvoorbeeld : het nagaan van de functionaliteit van de eileiders of onderzoek naar de vruchtbaarheid van het sperma van de man. Afhankelijk van de resultaten van de verschillende onderzoeken wordt in overleg tussen de fertiliteitsarts en het koppel een adequate behandeling voorgeschreven.

In vitro betekent letterlijk ‘in glas’, wat in dit geval wil zeggen dat de bevruchting buiten het lichaam van de vrouw gebeurt. Er zijn verschillende manieren om een koppel te helpen hun bestaande kinderwens te vervullen. Tijdens een IVF behandeling wordt de vrouw hormonaal gestimuleerd zodat meerdere eicellen samen tot rijping worden gebracht. De eicellen van de vrouw worden na de afname bevrucht met zaadcellen van de partner of donor, zo worden embryo’s gevormd. Deze embryo’s worden beoordeeld volgens verschillende morfologische criteria die een beeld geven over de ‘kwaliteit’ van het embryo. Als de kwaliteit voldoende is worden er één of meer embryo’s teruggeplaatst in de baarmoeder van de vrouw. De overtallige embryo’s van voldoende kwaliteit kunnen ingevroren worden. Later kunnen ze opnieuw ontdooid worden en eventueel teruggeplaatst worden als ze de procedure overleven.

Tijdens de invries- en dooiprocedure kunnen embryo’s beschadigd worden, om dit te voorkomen zullen invriesbeschermende stoffen of cryoprotectanten gebruikt worden. Momenteel gebruikt het labo CRG in het AZ St.-Jan AV dimethylsulfoxide (DMSO) met su12


crose. Deze cryoprotectanten lopen op in concentratie, men spreekt daarom van een invriesreeks. De invriesreeks met DMSO-sucrose wordt in het labo zelf aangemaakt, dit is zeer arbeidsintensief. Belangrijk naar accreditering van het labo toe, is dat van alle gebruikte reagentia alles, zoals lotnummers, gekend moet zijn, ook dit is moeilijk en vraagt veel tijd en energie. Het zou gemakkelijker en nuttig zijn om over te schakelen op een commercieel beschikbaar medium dat met de nodige garanties en certificaten geleverd wordt. Onder andere Vitrolife en Cook bieden zo’n kit aan die gebruik maakt van propaandiol en sucrose als cryoprotectanten.

Vooraleer de overschakeling naar een andere methode en cryoprotectanten kan gebeuren moet deze eerst gevalideerd worden. Dit wil zeggen dat de nieuwe methode minstens even goed of liefst nog beter moet zijn dan de gebruikte methode. Zo moet er ondermeer een vergelijkende studie gebeuren naar overleving en evolutie toe. Onder overleving verstaat men de kwaliteit van het embryo na het ontdooien, evolutie is het al dan niet doordelen van een embryo na een ontdooiprocedure. De methode van Vitrolife zal vergeleken worden met de bestaande methode van ‘home-made’ DMSO-sucrose. Voor het onderzoek zullen embryo’s gebruikt worden die niet in aanmerking komen om teruggeplaatst te worden, zoals embryo’s met een minder goede kwaliteit, embryo’s met meerkernige blastomeren of embryo’s met een afwijkend bevruchtingspatroon. Deze embryo’s worden verdeeld tussen de twee verschillende methodes (Vitrolife en DMSO-sucrose) . Na invriezen zullen ze ontdooid worden en zal overleving en evolutie nagegaan worden.

13


2

Literatuurstudie

2.1

Doelstelling

Het doel is over te stappen van de huidige methode met dimethylsulfoxide-sucrose (DMSO) naar een andere methode die commercieel beschikbaar is. Deze gebruikt propaandiol en sucrose als cryoprotectanten en ook een ander invriesprogramma.

2.2

In Vitro Fertilisatie

Koppels die om verschillende redenen hun kinderwens niet in vervulling zien gaan, nemen vaak hun toevlucht tot IVF. Als verminderde vruchtbaarheid vastgesteld wordt bij de man en/of bij de vrouw, voorbeeld slechte kwaliteit van het sperma, problemen met de eicellen, of als er geen directe oorzaak kan gevonden worden, kan IVF een oplossing bieden om deze wens toch te vervullen.

Er zijn verschillende manieren die een koppel zullen helpen om hun kinderwens te vervullen : - IUI : staat voor intra-uteriene inseminatie, bij deze techniek zal opgewerkt en gecapaciteerd sperma van de partner in de baarmoeder van de vrouw gebracht worden. - IVF : In een cultuurschaal wordt een cumulus complex met eicel samen gebracht met zaadcellen. Op die manier gebeurt de bevruchting nog min of meer via natuurlijke selectie, maar buiten het lichaam van de vrouw. - ICSI (zie figuur 2.1) : staat voor intracytoplasmatische sperma injectie. Bij een ICSI zal men één zaadcel rechtstreeks in de eicel injecteren. ICSI gebeurt als het sperma van mindere kwaliteit is of wanneer een voorgaande IVF gefaald heeft.

14


Figuur 2.1: De uitvoering van een ICSI, met rechts de naald die de spermacel zal injecteren, en links de houder die de eicel op zijn plaats houdt (13)

Bij een IUI zal afhankelijk van de cyclus al dan niet een hormoonstimulatie gegeven worden. Het doel is één tot maximum drie follikels tot rijping te laten komen. Vlak voor de eisprong zal humaan chorion gonadotrofine (HCG) gegeven worden, 36 uur later vindt de eisprong plaats. De dag zelf wordt een gecapaciteerd spermastaal van de man via een inseminatie katheter ingebracht in de baarmoeder van de vrouw.

Bij de start van de IVF/ICSI behandeling zal de vrouw eerst een hormoonstimulatie ondergaan, dit zorgt dat er meerdere eicellen tegelijk kunnen rijpen in het ovarium. De rijping gebeurt in kleine blaasjes die follikels heten en wordt nagegaan via oestradiol bepaling en echografie. Voor de follikelaspiratie of punctie krijgt de vrouw een inspuiting met HCG. Dit hormoon zorgt voor de verdere uitrijping van de eicellen. De follikels worden 34 tot 36 uur na toediening van het HCG aangeprikt en leeggezogen met behulp van een dubbel lumen naald. Het aanprikken van de follikels is de oöcyt pick up (OPU) en gebeurt onder echografische begeleiding. Het verkregen follikelvocht zal in het labo onderzocht worden op de 15


aanwezigheid van eicellen, de verkregen eicellen worden dan direct in cultuurmedium geplaatst. (zie figuur 2.2: de cyclus bij een kunstmatige bevruchting)

Figuur 2.2: De cyclus bij een kunstmatige bevruchting (14)

Op de dag van de OPU moet de man een spermastaal naar het labo brengen. Als de man op deze dag niet aanwezig kan zijn om een spermastaaltje af te geven, kunnen zijn zaadcellen voor de start van de behandeling ingevroren worden en terug ontdooid worden op de dag van de OPU. De eicellen worden dan via IVF of ICSI bevrucht. Als het gaat om een IVF behandeling zal het cumuluscomplex niet van de eicellen verwijdert worden omdat het complex nodig is voor de binding van de zaadcel(len). Bij een ICSI behandeling zullen de cumuluscomplexen met de eicellen behandeld worden met een enzym, hyaluronidase. Dit enzym zorgt ervoor dat de cumuluscellen loskomen van de eicel, de eicellen komen vrij en kunnen op hun rijpheid beoordeeld worden. Daarna vindt de bevruchting (injectie) plaats. Zestien tot twintig uur na de bevruchting wordt geëvalueerd om de correct bevruchte eicellen te scheiden van alle andere, alleen de correct bevruchte eicellen worden verder opgevolgd. Alle culturen, van eicellen of embryo’s, gebeuren in de incubator, die het milieu van de baarmoeder en de eileider zo goed mogelijk nabootst. De atmosfeer 16


in de incubator bestaat uit 6% CO2 en 5% O2 bij 37°C. De embryo’s worden dagelijks geevalueerd en na ten vroegste twee tot maximaal zes dagen kunnen de geschikte embryo(‘s) teruggeplaatst worden in de baarmoeder, dit proces heet de embryo transfer (ET).

Als een embryo vijf dagen oud is spreekt men van een blastocyst, als er gewacht wordt tot dag vijf of zes om het embryo terug te plaatsen kan een andere selectie gebeuren dan op dag twee of drie. Dit is te verklaren door de genoomovergang die normaal optreedt op dag drie. Tijdens de eerste drie dagen deelt het embryo deels via het genoom van zijn vader maar hoofdzakelijk via dat van zijn moeder, op dag drie moet het eigen genoom geactiveerd zijn. Ongeveer 50% van de embryo’s zullen deze genoomovergang niet maken en stoppen met delen, door te wachten tot dag vijf of zes kan een embryo teruggeplaatst worden die deze genoomovergang wel maakt. Aan de andere kant moet er ook rekening gehouden worden met het feit dat een embryo buiten het lichaam van de moeder nooit in ideale omstandigheden zit, dus snelle terugplaatsing op dag twee of drie heeft ook zijn voordelen, het embryo zit namelijk sneller terug in zijn natuurlijke omgeving. Verschillende studies tonen aan dat geen van beide methoden voordeel heeft op de ander, een zwakker embryo zal bijvoorbeeld in niet ideale omstandigheden de genoomovergang niet maken maar misschien wel in de baarmoeder. Eén of meerdere embryo’s mogen teruggeplaatst worden. Dit is via de wet vastgelegd door het Koninklijk Besluit van 4 juni 2003 en dit om de kans op meerlingen te verkleinen. Het maximum aantal teruggeplaatste embryo’s varieert volgens de leeftijd en het aantal pogingen. De terugplaatsing gebeurt door middel van een katheter, allereerst word het embryo samen met wat cultuurmedium geaspireerd, vervolgens wordt de katheter langs de cervix hoog in de uterus gebracht en zal de dokter het embryo in de uterus spuiten. De ganse procedure duurt zo’n tien tot twintig minuten en wordt zonder verdoving uitgevoerd.

Na de terugplaatsing zullen op verschillende tijdstippen bloedafnames gebeuren, waarvan de eerste zeven dagen na de OPU. Als de oestrogenen te laag staan zal dan nog eens HCG bijgegeven worden. De tweede bloedafname gebeurt veertien dagen na de OPU, is bij de eerste bloedafname geen HCG gegeven, zullen deze resultaten bevestigen of er zwangerschap is of niet. Wordt er wel HCG gegeven bij de eerste afname, zal eenentwin17


tig dagen na de OPU nog een derde bloedafname gebeuren om te bevestigen of er zwangerschap is of niet. Overtallige embryo’s van voldoende kwaliteit kunnen na de transfer ingevroren worden om eventueel later te ontdooien en als ze de procedure overleven terug te plaatsen, dit heet de ‘frozen embryo transfer’ (FRET). (8,10)

Figuur 2.3: Links een achtcellig embryo op dag drie, rechts een blastocyst op dag vijf (15)

18


2.3 2.3.1

Cryopreservatie algemeen Wat is cryopreservatie?

Cryopreservatie betekent bewaren door invriezen, bij deze techniek worden cellen, weefsels of organen ingevroren zodat ze op een later tijdstip ontdooid kunnen worden om eventueel opnieuw te gebruiken. In dit geval gaat het om humane delingsembryo’s die meestal bij temperaturen van -196°C (de temperatuur van vloeibaar stikstof) worden bewaard. (7) 2.3.2

Principe

Bij cryopreservatie daalt het metabolisme van de cellen door temperatuursverlaging tot er geen biochemische reacties meer kunnen gebeuren. Een embryo bevat veel water en dat moet eerst via osmose verwijderd worden. Er worden daarvoor bepaalde stoffen (cryoprotectanten) gebruikt. Het water vormt tijdens het invriesproces ijskristallen die de embryonale structuren kunnen breken. In de praktijk zal ongeveer een helft van de delingsembryo’s het proces van invriezen en ontdooien goed doorstaan.(9) Verschillende stappen van een cryopreservatieprocedure : - evaluatie van overtallige embryo’s - invriezen - ontdooien - evaluatie na ontdooien - transfer als er overleving is (FRET), (overleving is het aantal intacte blastomeren na het ontdooien gedeeld door het aantal intacte blastomeren voor het invriezen)

19


2.3.3

Cryoprotectanten

Cryoprotectanten beschermen de cellen die ingevroren worden doordat ze een isotoon milieu in stand houden, ze remmen de bevriezing zodat deze niet te snel gebeurt en ze verminderen de oplosbaarheid van potentieel toxische of genotoxische opgeloste stoffen. Er zijn twee soorten cryoprotectanten, permeabele – en niet permeabele stoffen. De permeabele stoffen zijn klein genoeg om doorheen het celmembraan van het embryo te dringen en nemen de plaats in van water. De niet permeabele stoffen zijn te groot om doorheen het celmembraan te dringen en blijven buiten de cel waar ze zorgen voor een hypertoon extracellulair milieu waardoor de wateruitstroom van het embryo wordt bevordert. Trehalose en sucrose zijn voorbeelden van niet permeabele cryoprotectanten. Propyleen glycol, glycerol, PROH en DMSO zijn voorbeelden van permeabele cryoprotectanten. (6) (tabel 2.1 geeft een overzicht van de eigenschappen van DMSO en PROH)

Naam

Dimethylsulfoxide

1,2-Propaandiol

Molecuul formule

C2H6SO

C3H8O2

Molecuul massa

78,13g/mol

76,11g/mol

Kookpunt

189°C

187°C

Smeltpunt

18,5°C

-60°C

Structuur formule

Tabel 2.1: Eigenschappen van DMSO en PROH (5)

20


2.4

Traag Invriezen

Ieder celtype heeft een andere afkoelsnelheid, deze is gelimiteerd door de snelheid waarmee het water doorheen de celmembraan passeert. Deze is afhankelijk van : - de bouw en permeabiliteit van het celmembraan (waterdoorlaatbaarheid membraan, doorlaatbaarheid voor cryoprotectanten, soort membraaneiwitten) - de oppervlaktevolume ratio van de cel (hoe groter deze ratio hoe sneller een cel zal dehydrateren, kleine cellen hebben een groot oppervlak in vergelijking met hun volume) - de temperatuur (hoe hoger de T, hoe beter de permeabiliteit van de celmembraan dus hoe groter de dehydratatiesnelheid) - het osmotisch druk verschil tussen de twee kanten van het membraan Belangrijk bij het traag invriezen is het gebruik van cryoprotectanten, deze zorgen echter voor een verlaging van het vriespunt met 2-3°C waardoor er een groter risico op intracellulaire kristalvorming ontstaat, daardoor is de uitvoering van een ‘seeding’ (zie 2.4.2) zeer belangrijk. (6) 2.4.1

Dehydratatie

Dehydratatie betekent in dit geval het uitdrogen van het embryo, cryoprotectanten zijn hiervoor verantwoordelijk. In de praktijk worden cryoprotectanten gebruikt in concentraties van ongeveer 0,75M tot en met 1,5M. De concentratie van de gebruikte cryoprotectanten in het medium is hoger dan in het embryo (hypertoon milieu). Het embryo zal osmotisch reageren en zal water verliezen. De permeabele cryoprotectant (DMSO of PROH) dringt door de celwand van het embryo en neemt de plaats van water in. Sucrose is te groot en kan niet in de cel binnendringen. De snelheid waarmee het embryo water verliest is echter hoger dan de snelheid waarmee de cryoprotectant het embryo binnendringt, het embryo zal hierdoor tijdelijk krimpen. Dit wordt verholpen door een invriesreeks met oplopende concentratie aan cryoprotectant te gebruiken, het embryo krijgt dan tijd om zijn oorspronkelijk celvolume te behouden. Verschillende cryoprotectanten samen zorgen ervoor dat het embryo zo weinig mogelijk water bevat en dus ook de kans op intracellulaire kristalvorming kleiner wordt.(3,5) 21


Als het embryo in de laatste invriesoplossing (1,5M) zit en zijn oorspronkelijk celvolume terug heeft wordt het opgezogen in een invriesstrootje. De strootjes (rietjes) die gebruikt worden om in te vriezen zijn CBS-rietjes (Cryo Bio System), het zijn ‘high security straws’ die dichtgelast kunnen worden om zo virale contaminatie van de ene naar de andere patiënt te verhinderen. De manier van laden wordt op onderstaande tekening (figuur 2.4) getoond, medium – lucht – medium met embryo – lucht – medium – lucht. Deze strootjes worden vervolgens dichtgebrand in het lasapparaat en in het invriestoestel geladen. Het invriesprogramma dat doorlopen wordt is afhankelijk van de gebruikte cryoprotectanten, in elk programma zal rond –6°C tot –7°C een ‘seeding’ moeten uitgevoerd worden. Na volledig doorlopen van het programma worden de rietjes uit het invriestoestel gehaald en blijven ze bewaard in vloeibare stikstof.

Figuur 2.4: Een invriesstrootje, A stelt het stukje voor dat dichtgebrand wordt door het lasapparaat, B is de plug, C is lucht, D is medium, E is het medium met het embryo

2.4.2

Seeding

‘Seeding’ is een belangrijke stap in het invriesproces, in deze stap worden ijskristallen geïnduceerd in het extracellulair milieu van het embryo. In een isotoon medium vindt ijskristalvorming normaal plaats tussen -5°C en -15°C, spontane ijsvorming zal in de praktijk slechts optreden rond -10°C. Om ijskristalvorming tussen -5°C en -10°C te induceren is een inductor nodig, men spreekt van een zogenaamde ‘ent’, een ijzeren staaf, schaar of pincet kan daarvoor gebruikt worden. De ijzeren ‘ent’ wordt eerst in vloeibare stikstof geplaatst en vervolgens tegen het medium gehouden die het embryo omgeeft. Belangrijk hierbij is dat het embryo niet rechtstreeks door de ‘ent’ wordt aangeraakt omdat het hierdoor kan beschadigd worden. In de praktijk gebeurt de ‘seeding’ meestal wanneer het invriestoestel een temperatuur van -6°C tot -7°C bereikt heeft. 22


Bij een automatische ‘seeding’ zorgt het toestel zelf voor de ‘seeding’, bij een manuele ‘seeding’ moet de laborant even de rietjes uit het toestel halen of het toestel open doen en de afgekoelde ent ertegen houden.(3)

Figuur 2.5: Een laborante die een seeding uitvoert (15)

Het doel van ‘seeden’ is kristallisatie gecontroleerd induceren, door ‘seeden’ treedt er kristalvorming op in het extracellulair milieu. Het embryo komt in een hypertoon milieu terecht en verliest opnieuw water doordat het embryo water verliest verkleint de kans op intracellulaire kristalvorming. Het ‘seeden’ is vooral belangrijk wanneer cryoprotectanten worden gebruikt, deze hebben een vriespuntverlagende werking waardoor een spontane kristallisatie of ijskristalvorming in het extracellulaire milieu mogelijk pas op een zeer lage temperatuur optreed. Op die manier kan de cel niet tijdig reageren op de plots sterk stijgende osmolariteit in het extracellulaire milieu. Als gevolg hiervan zal de cel het concentratieverschil compenseren door zelf te bevriezen wat schadelijk is voor het embryo. De stijging van de osmolariteit is te verklaren doordat opgeloste stoffen zoals cryoprotectanten slechts zullen mee invriezen bij temperaturen tussen -20°C en -30°C dit noemt men het eutectisch punt (zie figuur 2.6). Voordat dit punt bereikt wordt zal het water reeds aan het bevriezen zijn waardoor de cryoprotectanten steeds dichter bijeen in het niet bevroren water komen te liggen en bijgevolg zal de osmolariteit stijgen.(3,6) 23


Figuur 2.6: Hoe meer de temperatuur daalt in een isotone oplossing, hoe meer water zal kristalliseren en hoe groter de concentratie aan cryoprotectant bijgevolg zal worden (6 gewijzigd)

2.5

Vitrificatie

Bij vitrificatie wordt zeer snel ingevroren en is geen dure invriesapparatuur vereist. Bij deze methode wordt de eicel of het embryo in een sterk hyperosmotisch medium geplaatst met een concentratie cryoprotectant van 8 tot 10M waardoor een zeer snelle dehydratatie optreedt. Daarna wordt de cel direct overgebracht naar vloeibare stikstof, dit ganse proces duurt slechts enkele minuten. Doordat de cel bij deze methode zo snel wordt afgekoeld, hebben de water moleculen de tijd niet om te kristalliseren. In plaats van ijskristallen wordt er een glasachtige structuur gevormd. Het woord vitrificatie is dan ook afkomstig van het Latijnse woord ‘vitrum’ wat glas betekent. Vitrificatie geeft goede resultaten maar heeft ook nadelen, zo kan slechts één tot maximum twee embryo’s per keer ingevroren worden terwijl bij de trage invriesmethode er meer dan twee embryo’s tegelijk kunnen ingevroren worden. Eén van de redenen waarom vitrificatie het traag invriezen niet vervangen heeft wordt duidelijk wanneer meerdere embryo’s moeten ingevroren worden, de manuele arbeid tijdens de invriesprocedure bij het traag invriezen moet slechts één keer doorlopen worden wat ongeveer 30min duurt, terwijl het vitrificatieproces embryo na embryo moet herhaald worden en uiteindelijk meer tijd in beslag zal nemen. Het invriezen van slechts 24


één tot twee embryo’s tegelijk heeft ook voordelen, als minder embryo’s tegelijk (van één of verschillende patiënten) ingevroren worden zal ook de kans op eventuele fouten veel minder groot worden.(3,8)

2.6

Ontdooien

In vele gevallen ontstaat schade aan het embryo tijdens het ontdooien en niet tijdens het invriezen, om dit te voorkomen wordt de ontdooisnelheid aangepast aan de invriessnelheid. Tijdens het ontdooien kan al blijken of het embryo degeneratief is of niet. Degeneratief wil zeggen dat de cellen (blastomeren) van het embryo kapot zijn gesprongen, de cellen hebben ook geen duidelijke contouren meer. Een traag ingevroren embryo moet theoretisch traag ontdooid worden, in de praktijk blijkt dit niet helemaal te kloppen zo kan een traag ingevroren embryo zonder problemen vlug ontdooid worden. Eén van de oorzaken van schade tijdens het ontdooien is de vorming van gasbellen tijdens het invriezen. Tijdens het ontdooien kunnen deze gasbellen dan in korte tijd uitgroeien tot zeer grote intracellulaire vacuolen, deze vacuolen kunnen opblazen en zo de zona pellucida beschadigen. Tijdens het ontdooien moeten de cryoprotectanten terug uitgewisseld worden voor water, dit proces heet rehydratatie. 2.6.1

Rehydratatie

Het principe van rehydratatie is omgekeerd aan dat van dehydratatie. Waar tijdens het dehydrateren met oplopende concentraties cryoprotectant gewerkt wordt, zal de concentratie aan cryoprotectant nu lager zijn. Het gevolg hiervan is dat de concentratie van de cryoprotectant hoger zal zijn in het embryo dan in het omgevende medium. Het embryo bevindt zich nu in een hypotoon milieu en zal water beginnen opnemen en permeabele cryoprotectant verliezen, de cryoprotectant wordt met andere woorden uitgewisseld voor het water. Als er te weinig cryoprotectant in het ontdooimedium aanwezig is zal het embryo te veel water opnemen waardoor het zal opzwellen en uiteindelijk zal lyseren, om dit te voorkomen wordt een aflopende reeks van ontdooimedia gebruikt.(3)

25


2.7

Evaluatie en embryodeling

Tijdens de evaluatie worden de embryo’s beoordeeld volgens een reeks criteria die afhankelijk zijn van het stadium van het embryo. Deze criteria zijn gebaseerd op de morfologische kenmerken van het embryo, het morfologisch beste embryo zal worden teruggeplaatst. De embryo’s worden elke dag gedurende maximaal 5 tot 6 dagen geëvalueerd. Vanaf dag twee kunnen geschikte embryo’s teruggeplaatst worden. 2.7.1

Dag 0 (bij ICSI, niet bij IVF)

De dag waarop de bevruchting zal gebeuren wordt er gekeken of de eicellen één poollichaam hebben, met andere woorden of ze rijp zijn om te injecteren. Er wordt onder meer ook gekeken naar volgende eigenschappen: - De aanwezigheid van een glad endoplasmatisch reticulum - Amorfe eicellen - Is er sprake van vacuolisatie - De aanwezigheid van een bull’s eye structuur - Eventuele afwijkingen aan de zona pellicuda 2.7.2

Dag 1

Zestien tot twintig uur na de fertilisatie wordt gekeken of er bevruchting is. De embryo’s hebben nu twee pronucleï (2PN) en twee poollichamen (zie figuur 2.7). Daarnaast zal ook gekeken worden naar : - De grootte van de kern(en), zijn ze gelijk van grootte of niet? - De ligging van het kernmateriaal : polair, verspreid of asynchroon (zie bijlage 2) - Terugtrekking van het cytoplasma - De aanwezigheid van vacuolen Alles wat afwijkt wordt als abnormaal beschouwd, alleen de correct bevruchte eicellen zullen geselecteerd worden en overgezet worden in een nieuw cultuurplaatje.

26


Na 24 uur wordt een tweede evaluatie uitgevoerd, kijkend naar een eventuele doordeling van het embryo, belangrijk tijdens deze evaluatie is de aan – of afwezigheid van de kernen: - als een embryo niet gedeeld is en de kernen nog zichtbaar zijn wil dit zeggen dat het embryo een vertraagd delingsschema heeft - als het embryo niet gedeeld is en de kernen niet zichtbaar zijn is dit een teken dat de deling is begonnen - een embryo die reeds gedeeld is, heeft een normaal delingsschema. Bij terugplaatsing zal in de mate van het mogelijke rekening gehouden worden met deze delingsschema’s. (zie Bijlage 2: delingschema van een embryo)

Figuur 2.7: Links een normaal embryo met 2PN, rechts een abnormaal meerkernig embryo met 3PN (16,15)

27


2.7.3

Dag 2

Op deze dag wordt gekeken hoeveel blastomeren het embryo bevat. Het embryo moet dan twee tot viercellig zijn. Er wordt gekeken naar volgende criteria: - aantal blastomeren: tweecellig: de blastomeren hebben

bij voorkeur een gelijke grootte, ze zijn im-

mers van één en dezelfde cel afkomstig driecellig: met bij voorkeur één grote en twee kleine blastomeren, één grote die dus nog niet is doorgedeeld en twee kleinere afkomstig van een grotere die wel al is doorgedeeld viercellig: met bij voorkeur vier gelijke blastomeren vijfcellig: met bij voorkeur drie grote en twee kleinere blastomeren (zie bijlage voor figuren) - grootte van de blastomeren - meerkernigheid van de blastomeren - fragmentatie van het embryo (zie figuur 2.8 en 2.9)

Figuur 2.8: Fragmentatie (15)

28


Figuur 2.9: Gradaties bij fragmentatie waarbij : A geen fragmentatie, B < 20%, C > 20% maar < 50%, D > 50% fragmentatie

2.7.4

Dag 3

Op deze dag worden de zes tot achtcellige embryo’s opgespoord, die dan verder geëvalueerd worden. - aantal blastomeren: zescellig: met bij voorkeur twee grote en vier kleinere blastomeren, de vier kleine zijn afkomstig van twee grote die al zijn doorgedeeld zevencellig: met bij voorkeur één grote en zes kleinere blastomeren achtcellig: met bij voorkeur acht gelijke blastomeren - grootte van de blastomeren - meerkernigheid - fragmentatie 2.7.5

Dag 4 (morula stadium)

In dit stadium wordt gekeken of compactie aanwezig is. Bij compactie zullen de blastomeren niet meer als aparte cellen zichtbaar zijn met de stereomicroscoop. Er zijn verschillende gradaties bij compactatie weergegeven met een nummer van één tot en met vier (zie bijlage 3). Waarbij: 1: staat voor volledige compactie 2: staat voor onvolledige compactie 3: voor regionale compactie 4: voor fusie 29


2.7.6

Dag 5 – 6

In dit stadium zou er sprake moeten zijn van een blastocyst, de beoordeling van dit stadium gebeurt volgens het Gardner scoring system. De blastocyst bestaat uit een soort holte (blastocoel), rond deze blastocoel bevindt zich een buitenste laag cellen die het trofectoderm (TE) noemt, in de holte zelf zitten een aantal cellen de zogenaamde ‘inner cell mass’ (ICM). Het TE maakt geen deel uit van het eigenlijke embryo, deze cellen ontwikkelen zich tot de placenta en andere ondersteunende weefsels. Uit de ICM ontstaan de drie kiembladen, ectoderm, mesoderm en endoderm die zullen uitgroeien tot specifieke lichaamsweefsels. (zie figuur 2.11: blastocyst) 1) Early blastocyst: de blastocoel neemt minder dan de helft van het volume van het embryo in 2) Blastocyst: de blastocoel neemt de helft of meer in van het volume van het embryo 3) Full blastocyst: de blastocoel neemt het volledige volume van het embryo in 4) Expanding blastocyst: het volume van de blastocoel is nu groter dan het volume van het eerdere embryo 5) Hatching blastocyst: het trofectoderm begint doorheen de zona te breken 6) Hatched blastocys: de blastocyst heeft de zona volledig verlaten

Figuur 2.10: Links een hatching blastocyst, Rechts een hatched blastocyst (15,17)

30


Eveneens wordt er gekeken naar de ‘Inner cell mass’ deze krijgt ook een score namelijk A, B of C. Waarbij: A) dicht opeen, veel cellen B) minder dicht opeen, enkele cellen C) zeer weinig cellen Tenslotte wordt er ook gekeken naar het trofectoderm, deze krijgt eveneens een score gaande van A tot en met C. Waarbij: A) Vele cellen die een samenhangend epitheel vormen B) Enkele cellen die een los epitheel vormen C) Zeer weinig cellen

Figuur 2.11 : Blastocyst (18)

31

Vergelijking van twee verschillende cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s Materiaal en methode

3 3.1

Materiaal en methode Gebruikte materialen, reagentia en toestellen

Zie tabel 3.1 voor de gebruikte materialen, tabel 3.2 voor de gebruikte reagentia en tabel 3.3 voor de gebruikte toestellen. Materiaal

Lotnummer

Merk

Cultuurfles 50mL

6075802

Falcon

Cultuurfles 100mL

6171032

Falcon

Cultuurschaal 35 x 10mm

7093174

Falcon

Cultuurschaal 60 x 15mm

6227020

Falcon

Denudeer pipet

700588

Swemed

Embryo straw (rietje)

CBS4948

Cryo bio system

Filter

21527

Pall corporation

Gegradueerde pipet 1mL

6314239

Falcon


7094718

Falcon


6357466

Falcon

ID jacket blauw

CBS4605

Cryo bio system

ID jacket geel

CBS4773

Cryo bio system

ID jacket oranje

CBS3733

Cryo bio system

CF43862, CF42991 ID rods

CF43825, CF43862

Cryo bio system

CF43188, CF42991 naalden

070322

BD

Pipet tips

7196C0

Thermo Scientific

Spuit 1mL

0711031

Terumo

Spuit 10mL

0612014

BD

Tabel 3.1: Gebruikte materialen

32


Reagentia

Lotnummer

Merk

1,2-Propaandiol invriesoplossingen

008045

Vitrolife

1,2-Propaandiol dooioplossingen

007968

Vitrolife

BLAST medium

501265

Vitrolife

DMSO (15M)

056K01731

Sigma

(zie 3.2.1 en 3.2.2)

6MB0038

BioWhittaker

Humaan Serum Albumine (HSA) (20%)

06C21C

Apotheek C.A.F.-D.C.F.

Olie (minerale)

930570379

Irvine Scientific

Sucrose

044K0044

Sigma

HAS (HES) (zie 3.2.3)

/

/

Dooistockoplossing (zie 3.2.6)

/

/

Invriesstockoplossing (zie 3.2.3)

/

/

Earle’s balanced salt solution (EBSS)

hepes gebufferde Earle’s medium met

Tabel 3.2: Gebruikte reagentia

Toestel

Merk

Model

Analytische balans

Mettler

AE160

Cryogene tank

Air Liquide

Arpege 140

Drukvat

Air liquide

TP60

Etikettenprinter

Labxpert

Brady

Incubator

Heraeus

Thermo Kendro Series 6000

Inversiemicroscoop

Nikon

EclipseTE2000-U

Invriestoestel

Planer

Kryo10 serie II

Koelkast

Dometic

ML305C

Laminaire flow

De Bock & Vermeulen

Bioflow

Laminaire flow

Heraeus

Heraguard

Lasapparaat

Cryo bio system

Soudeuse paillettes

Microscoop

Nikon

SMZ1000

Pipetautomaat

Falcon

Express

Verwarmplaat microscoop

Tokai Hit

Thermo plate

Tabel 3.3: Gebruikte toestellen

33


3.1.1

Invriesstrootjes , ID jacket en ID rod

Figuur 3.1 : ID rods, ID jackets en een invriesstrootje (19)

Rechts : het invriesstrootje waarin het embryo geladen wordt. Links : de ID rods en ID jackets die gebruikt worden voor de identificatie van een embryo, elk invriesstrootje krijgt een combinatie van een gekleurde ID rod en gekleurde ID jacket en wordt vervolgens in een gekleurde visotube geplaatst. De visotube en de ID jacket worden ook voorzien van een sticker met patiëntengegevens die door de etikettenprinter wordt afgedrukt.

34


3.1.2

Microscopen

Inversiemicroscoop: Een inversiemicroscoop is anders gebouwd dan een conventionele microscoop. De bron en de koeler bevinden zich boven het object, de lenzen onder het object. Ze zijn aal om levende organismen, cellen of weefsels te bekijken. Een nadeel is wel de hoge kostprijs. In het Centrum voor Reproductieve geneeskunde (CRG) labo wordt hij gebruikt voor de evaluatie van de embryo’s

Figuur 3.2 : De inversiemicroscoop

Figuur 3.3 : De stereomicro-

Nikon Eclipse TE2000-U (20)

scoop Nikon SMZ1000 (20)

Stereomicroscoop: Een stereomicroscoop is een microscoop met twee objectieven en twee oculairen, één van beiden voor elk oog. Hierdoor krijgt de gebruiker een beeld waarin diepte wordt gezien. Ze worden gebruikt om kleine organismen te bestuderen en om eventuele manipulaties te verrichten. In het CRG labo worden ze gebruikt voor manipulaties zoals het overzetten van embryo’s van één medium naar een ander.(11)

35


3.1.3

De cryogene tank

De tank zelf is goed geïsoleerd zodat de temperatuur in het vat niet zou stijgen. De canisters bevatten de invriesstrootjes, voor het laden van de strootjes worden de canisters even doorheen de opening van het bewaarvat getrokken, de canisters worden dan teruggeplaatst in het bewaarvat waar ze ondergedompeld worden in vloeibare stikstof.

Figuur 3.4: De cryogene tank

36


3.2 3.2.1

Het DMSO-sucrose protocol Samenstelling EBSS

Deze gebalanceerde zoutoplossing bevat alle ionen essentieel voor de levensnoodzakelijke processen van eukaryote cellen (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, PO43- en Cl-). De zoutoplossing is aangevuld met fenolrood, NaHCO3 en glucose. 3.2.2

Bereiding van EBSS-stockoplossing

• Weeg op een balans 1,19g hepes af. • De bereiding van de oplossing wordt uitgevoerd in de horizontale laminaire flow (LAF) werkbank. • Los de hepes op in 10mL EBSS. • Filter (0,2-0,8µm) deze oplossing in de cultuurfles. • De oplossing is 3 weken houdbaar bij 4°C. 3.2.3

Bereiding van HES

• De bereiding van de oplossing wordt uitgevoerd in de horizontale LAF werkbank. • Trek met behulp van een naald en spuit 20mL HSA (20%) op en spuit deze in een cultuurfles van 100mL. • Leng aan tot 100mL met de EBSS stockoplossing. • Sluit de cultuurfles af en meng. • De oplossing is 2 maanden houdbaar bij 4°C 3.2.4

Bereiding van de sucrose-oplossing (1M)

• Weeg op een balans 13,7g sucrose af en giet over in een cultuurfles. • De bereiding van de oplossing wordt uitgevoerd in de horizontale LAF werkbank. • Pipetteer 40mL EBSS-stockoplossing in de cultuurfles • Sluit de cultuurfles af en meng. 37


• Trek met behulp van een naald en spuit de sucrose-oplossing op en filtreer in een nieuwe cultuurfles. • De oplossing is 2 maanden houdbaar bij 4°C. 3.2.5

Invriesstockoplossing (0,1M sucrose)

• De bereiding van de oplossing wordt uitgevoerd in de horizontale LAF werkbank. • Pipetteer 45mL HES in een cultuurfles. • Pipetteer hierbij 5mL sucrose-oplossing (1M). • Sluit de cultuurfles en meng. • De oplossing is 2 maanden houdbaar bij 4°C. 3.2.6

Dooistockoplossing (0,2M sucrose)

• De bereiding van de oplossing wordt uitgevoerd in de horizontale LAF werkbank. • Pipetteer 40mL HES in een cultuurfles. • Pipetteer hierbij 10mL sucrose-oplossing. • Sluit de cultuurfles en meng. • De oplossing is 2 maanden houdbaar bij 4°C. 3.2.7

Bereiding van ontdooi – en invriesmedia

a) Invriesoplossingen (1 week houdbaar) Oplossing

Concentratie

DMSO (15M)

Invriesstockoplossing

HES (buffer)

F2

F3

1,5M DMSO +

1mL

9mL

/

/

0,09M sucrose F2

1,5M DMSO

1mL

/

9mL

/

F1

0,75M DMSO

/

/

3mL

3mL

HES

/

/

/

3mL

/

Tabel 3.4: Invriesoplossingen DMSO-sucrose protocol

38


Werkwijze: • De bereiding van de DMSO-sucrose invriesreeks gebeurt minimum één uur voor de invriesprocedure en wordt uitgevoerd in de horizontale laminair flow werkbank. • De DMSO-sucrose invriesreeks is samengesteld uit drie DMSO-sucrose invriesoplosingen : ‘Freeze’ 1, F2 en F3, die elk in een centrifugeerbuis worden aangemaakt • Voor het maken van F2 wordt F3 gefiltreerd om te steriliseren. Voor het maken van F1 wordt F2 gefiltreerd. Met behulp van een naald en spuit worden F3 en F2 opgetrokken, er wordt een microfilter op de spuiten geplaatst en de oplossingen worden gefiltreerd in een nieuwe centrifugeerbuis.

b) Dooioplossingen (1week houdbaar) Oplossing

Concentratie

DMSO (15M) Dooistock

T1

T3

HES

T1

1,5M DMSO

1mL

9mL

/

/

/

T2

1,0M DMSO

/

2mL

3mL

/

/

T3

0,75M DMSO

/

3mL

3mL

/

/

T4

0,375M DMSO

/

2mL

/

2mL

/

Dooistock

/

/

3mL

/

/

/

HES

/

/

/

/

/

3mL

Tabel 3.5: Dooioplossingen DMSO-sucrose protocol

Werkwijze: • De bereiding van de DMSO-sucrose dooireeks gebeurt in de horizontale laminair flow werkbank. • De DMSO-sucrose dooireeks is samengesteld uit 4 DMSO-sucrose dooioplossingen : ‘Thaw’ 1, T2, T3, T4, die elk in een centrifugeerbuis worden aangemaakt. • Voor het maken van T2 en T3 wordt T1 gefiltreerd om te steriliseren. Trek met behulp van een naald en spuit T1 op. Plaats een microfilter op de spuit en filtreer T1 in een nieuwe centrifugeerbuis. 39


3.2.8

Werkwijze invriezen

1) Evalueer de embryo’s die moeten ingevroren worden 2) Print stickers af met de initialen van de patiënt met behulp van het Brady toestel 3) Kies een combinatie van visotubes, ID jackets en ID rods en leg deze klaar 4) Zet het invriesapparaat aan en selecteer het DMSO-sucrose programma 5) Leg klaar: - Invriesreeks (HES, F1, F2, F3), 20min op voorhand uit koelkast halen - Spuit van 1,0mL - Tussenstukje voor de spuit - Invriesstrootjes - Vier cultuurplaatjes die genummerd worden en waarop de initialen van de patiënt en het medium genoteerd worden - Denudeerpipet + houder - Pipet van 150µL + pipettips 5) Leg de verwarmplaat van de microscoop af 6) Leg de embryo’s eerst 5min in 150µL HES 7) Leg ze daarna 10min in 150µL F1 8) Controleer tijdens die 10min of het invriesapparaat klaar staat, het invriesapparaat maakt een auditief signaal wanneer hij de juiste temperatuur heeft 9) Leg de embryo’s daarna 10min in 150µL F2 10) Daarna 10min in 300µL F3, tijdens deze 10min worden de embryo’s geladen in het invriesstrootje voorzien van ID jacket en ID rod, de uiteinden toe gebrand in het lasapparaat en uiteindelijk in het invriesapparaat geladen 11) Het invriesprogramma loopt, het invriesapparaat zal een auditief signaal maken wanneer de seeding moet uitgevoerd worden 12) Als het invriesprogramma is afgelopen geeft het invriestoestel opnieuw een auditief signaal. Haal de invriesstrootjes uit het toestel en stop ze onmiddellijk in vloeibare stikstof, daarna worden de strootjes in de juiste houder in de cryogene tank ge stopt. 40


3.2.9

Werkwijze ontdooien

1) Leg klaar: - Dooireeks (T1, T2, T3, T4, dooistock, HES), 20minuten op voorhand klaarleggen - Zes plaatjes genummerd - Cultuurplaatje in de incubator klaarzetten, genummerd - Schaar - Spuit van 1,0mL - Gesteriliseerd tussenstukje voor de spuit - Pipet van 150µL + pipettips - Denudeerpipet + houder 2) Leg de verwarmplaat van de microscoop af 3) Haal de rietjes uit de cryogene tank en laat ze 30sec opwarmen op kamer temperatuur rol ze vervolgens 30sec over een verwarmplaat (37°C) 4) Ontsmet de rietjes alvorens ze open te knippen 5) Knip de rietjes open en doe de inhoud in een 150µL T1 voor 5min 6) Lokaliseer de embryo’s 7) Leg ze na 5min in 150µL T2 8) Na opnieuw 5min in 150µL T3 9) Daarna 5min in 150µL T4 10) 5min in 150µL dooistock 11) +/- 5min in 150µL HES 12) Plaats de embryo’s in het cultuurplaatje die klaarstaat in de incubator 13) Evalueer de embryo’s op overleving

41


3.2.10 Programma invriestoestel 1) Start temperatuur: 0°C 2) De temperatuur daalt van 0°C tot aan -6,5°C aan een snelheid van -1°C/min 3) Bij -6,5°C is er een plateau (wachttijd) van 300seconden 4) Tijdens het plateau gebeurt de manuele seeding 5) De temperatuur daalt van -6,5°C tot aan -40°C aan een snelheid van -0,3°C/min 6) De temperatuur daalt van -40°C tot aan -80°C aan een snelheid van -3°C/min (1) 7) Als het invriesprogramma is doorlopen geeft het invriestoestel een auditief signaal, haal dan de invriesstrootjes uit het toestel en plaats ze eerst in vloeibare stikstof en dan op de juiste plaats in de canisters die zich in de cryogene tank bevinden.

3.3 3.3.1

Het protocol van vitrolife Gebruikte media

De kit van vitrolife maakt gebruik van PROH in plaats van DMSO, er wordt eveneens gebruik gemaakt van sucrose. a) Invriesoplossingen (freeze-kit1) 10mL cryo-PBS, PBS met 25g/mL HSA 10mL embryo freezing solution 1 (EFS 1), 1,5M propaandiol 10mL embryo freezing solution 2 (EFS 2), 1,5M propaandiol en 1,0M sucrose b) Dooioplossingen (thaw-kit1) 10mL embryo thawing solution 1 (ETS 1), 1M 1,2-PROH + 0,2M sucrose 10mL embryo thawing solution 2 (ETS 2), 0,5M 1,2-PROH + 0,2M sucrose 10mL embryo thawing solution 3 (ETS 3), 0,2M sucrose 10mL cryo-PBS 3.3.2

Werkwijze invriezen

1) Evalueer de embryo’s die moeten ingevroren worden 2) Print stickers af met de initialen 3) Kies een combinatie van visotubes, ID jackets en ID rods en leg ze klaar 42


4) Leg de verwarmplaat van de microscoop af 5) Leg het invriesapparaat aan en kies het PROH-sucrose programma 6) Leg klaar: - Freeze-kit 1 (cryo-PBS, EFS1, EFS2), 30min op voorhand uit koelkast halen - Spuit van 1,0mL en gesteriliseerd tussenstukje - Drie cultuurplaatjes die genummerd worden en waarop de initialen van de patiënt en het medium genoteerd worden - Denudeerpipet + houder - Pipet van 150µL + pipettips

7) Plaats de embryo’s eerst 2-5min in 150µL cryo-PBS 8) Daarna minimum 10min in EFS1, niet langer dan 20min 9) Daarna 10min in 300µL F3, tijdens deze 10min worden de embryo’s geladen in het invriesstrootje voorzien van ID jacket en ID rod, de uiteinden toe gebrand in het lasapparaat en uiteindelijk in het invriesapparaat geladen 10) Het invriesapparaat zal een auditief signaal maken wanneer de seeding moet uitgevoerd worden 11) Wanneer het invriesprogramma is afgelopen maakt het invriestoestel opnieuw een auditief signaal. Haal de invriesstrootjes uit het toestel en steek ze in de cryogene tank en in de juiste visotube 3.3.3

Werkwijze ontdooien

1) Leg klaar: - Dooireeks (ETS1, ETS2, ETS3, cryo-PBS), 20minuten op voorhand klaar leggen - Vier plaatjes genummerd - Cultuurplaatje in de incubator klaarzetten, genummerd - Schaar - Spuit van 1,0mL - Tussenstukje voor de spuit 43


- Pipet van 150µL + pipettips - Denudeerpipet + houder

2) Leg de verwarmplaat van de microscoop af 3) Maak een cultuurplaatje en plaats deze 24 uur op voorhand in de incubator 4) Haal de rietjes uit de cryogene tank en laat ze 30sec opwarmen op kamer temperatuur rol ze vervolgens 30sec over een warmplaat van 30°C 5) Ontsmet de rietjes alvorens ze open te knippen 6) Knip de rietjes open en doe de inhoud in een 150µL ETS1 voor 5min 7) Daarna 5min in 150µL ETS2 8) Dan 5-10min in 150µL ETS3 9) Dan 6min in cryo-PBS op kamertemperatuur 10) Daarna 6min in cryo-PBS op 37°C 11) Zet de embryo’s over in het cultuurplaatje die klaar sta at in de incubarot 12) Evalueer op overleving

3.3.4

Programma invriestoestel

1) Start temperatuur: 20°C 2) De temperatuur daalt van 20°C tot aan -7°C met een snelheid van -2°C/min 3) Een plateau van 600sec bij -7°C 4) Tijdens het plateau zal na 120sec de ‘seeding’ uitgevoerd worden 5) De temperatuur daalt van -7°C tot aan -30°C met een snelheid van -0,3°C/min 6) De temperatuur daalt van -30°C tot aan -80°C met een snelheid van -10°C/min (2) 7) Als het invriesprogramma is doorlopen geeft het invriestoestel een auditief signaal, haal dan de invriesstrootjes uit het toestel en plaats ze eerst in vloeibare stikstof en dan op de juiste plaats in de canisters die zich in de cryogene tank bevinden

44


3.4

Methode

Humane embryo’s worden beoordeeld naargelang hun kwaliteit, de meest geschikte worden teruggeplaatst. De overtallige embryo’s van goede kwaliteit kunnen worden ingevroren om ze te bewaren. De embryo’s die niet voldoen om te bewaren, zoals embryo’s met een abnormale bevruchting, meerkernigheid of een te snelle of trage deling, kunnen gebruikt worden om het protocol van DMSO met dat van PROH te vergelijken, na verkregen instemming van de patiënt. De embryo’s worden geëvalueerd, ingevroren via het DMSO of PROH protocol, ontdooid via het overeenstemmende protocol en tenslotte wordt de overleving nagegaan. De embryo’s worden ingevroren op dag drie, terug ontdooid en geëvalueerd om te zien of er overleving is. Na de evaluatie worden ze in de incubator nog drie dagen in cultuur gehouden en gedurende die drie dagen elke dag geëvalueerd om te kijken of er enige evolutie is. De overleving is het aantal intacte blastomeren van het embryo voor invriezen gedeeld door het aantal intacte blastomeren na ontdooien, maal honderd. Evolutie betekent dat het embryo na ontdooien terug verder deelt.

45

Vergelijking van twee verschillende cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s Resultaten

4 4.1

Resultaten Leerproces

Tijdens de eerste week waren de resultaten slecht. De embryo’s waren op het moment van ontdooien allemaal degeneratief. Zowel tijdens het invriezen als tijdens ontdooien kunnen dan ook verschillende zaken misgaan. De seeding bijvoorbeeld is zeer belangrijk en dient correct uitgevoerd te worden, zo mag de seeding niet op het embryo zelf gebeuren en worden de invriesstrootjes tijdens het seeden het best horizontaal gehouden. De oorzaak van de slechte resultaten lag ergens anders, de invriesstrootjes werden na het invriezen uit het invriestoestel gehaald op een schaaltje gelegd en in het invriesvat geplaatst. Gedurende de korte periode dat de invriesstrootjes op het schaaltje lagen hadden ze dus de tijd om traag op te warmen waardoor er terug een osmolariteitsverschil ontstond. Het medium rond het embryo begon namelijk terug te ontdooien waardoor het embryo in een hypotoon milieu terecht kwam en terug water begon op te nemen, het hypotone milieu ontstaat doordat de cryoprotectant zich opnieuw kan verspreiden in het medium en de concentratie bijgevolg daalt. Wanneer het dan in de cryogene tank werd geplaatst ontstonden intracellulaire ijskristallen waardoor het embryo degeneratief werd. De embryo’s moeten dus direct nadat ze uit het invriestoestel zijn gehaald in een beker vloeibare stikstof worden geplaatst. Vanuit deze beker worden ze dan in de cryogene tank geplaatst en zo hebben ze de tijd niet om terug op te warmen.

4.2

Resultaat

Van de ingevroren embryo’s word de overleving bekeken om zo een vergelijking te kunnen maken tussen het DMSO en PROH protocol. De embryo’s werden na het ontdooien geëvalueerd op het aantal intacte blastomeren.

46


4.2.1

DMSO-Sucrose

embryo nr. overleving (%)

evolutie


evolutie

1

56

nee

10

29

nee

2

100

early blastocyst

11

100

ja

3

100

ja

12

100

ja

4

80

nee

13

100

early blastocyst

5

100

ja

14

100

early blastocyst

6

100

ja

15

degeneratief

/

7

100

ja

16

100

early blastocyst

8

100

ja

17

100

Ja

9

83

ja

18

75

ja

Tabel 4.1: Resultaten DMSO-sucrose

Overleving:

100 90

Percentage (%)

80 70 60 50 40 30 20 10 0 100% intact

50-99%

<50%

Intactheid

Figuur 4.1: Overlevingspercentage bij de DMSO-Sucrose methode

47


66,67% (12/18) van de embryo’s is na ontdooien 100% intact. 22,22% % (4/18) van de embryo’s is na ontdooien <100% maar >50% intact. 11,11 % (2/18) van de embryo’s is na ontdooien <50% intact.

Evolutie: Bij 82% (14/17) van de ontdooide embryo’s is er evolutie, het degeneratief embryo wordt niet meegeteld omdat hier toch geen evolutie meer mogelijk is. Van die 82% zal 29% (4/14) evolueren tot in het blastocyst stadium waarbij de evolutie op dag 6 niet verder zal zijn dan een early blastocyst.

4.3

PROH


evolutie

Embryo nr.

overleving (%)

evolutie

1

100

expanded blastocyst

12

100

expanded blastocyst

2

71

nee

13

100

nee

3

86

expanded blastocyst

14

67

degeneratief

4

75

nee

15

100

expanded blastocyst

5

86

nee

16

56

nee

6

60

early blastocyst

17

100

nee

7

78

full blastocyst

18

44

ja

8

60

nee

19

57

nee

9

67

nee

20

70

nee

10

57

nee

21

50

nee

11

67

nee

22

100

ja

Tabel 4.2: Resultaten PROH

48


Overleving:

100 90

Percentage (%)

80 70 60 50 40 30 20 10 0 100% intact

50-99%

<50%

Intactheid

Figuur 4.2: Overlevingspercentage PROH methode

27,27% (6/22) van de embryo’s is na ontdooien 100% intact. 68,18% (15/22) van de embryo’s is na ontdooien <100% maar >50% intact. 4,55% (1/22) van de embryo’s is na ontdooien <50% intact. Evolutie: Bij 36,36% (8/22) van de ontdooide embryo’s is er evolutie. Van die 36,36% zal 75% (6/8) evolueren tot in het blastocyst stadium waarbij de evolutie op dag 6 varieert van een early tot een expanded blastocyst.

4.4

Zijn er significante verschillen tussen beide methoden?

Er zijn dus enkele opmerkelijke verschillen tussen beide methoden namelijk: - naar 100% overleving toe - naar evolutie toe - naar evolutie tot blastocyst toe

49


Via statistiek zal aangetoond worden of er sprake is van een significant verschil, de gebruikte methode is de Chi-kwadraatverdeling. 4.4.1

significantie naar 100% overleving toe

Data: Observed: 100% overleving PROH DMSO Totaal

ja 6 12 18

nee 16 6 22

Totaal 22 18 40

ja 9,9 8,1 18

nee 12,1 9,9 22

Totaal 22 18 40

Expected: 100% overleving PROH DMSO Totaal

Berekeningen: 1. Hypothesen

:

H0: er is geen significant verschil tussen beide methoden naar 100% overleving toe H1: er is wel een significant verschil tussen beide methoden naar 100% overleving toe 2. Gegevens : Kans: 0,05 Vrijheidsgraden: 1 3. Berekeningen: Via de chi.toets wordt een p-waarde bekomen van 0,0127 4. Besluit De p-waarde is kleiner dan de vooropgestelde waarde van 0,05, de nulhypothese wordt verworpen. Er kan besloten worden met een zekerheid van 95% dat er een significant verschil is tussen beide methoden naar 100% overleving toe.

50


4.4.2

significantie naar evolutie toe

Data: Observed: evolutie PROH DMSO Totaal

ja 8 14 22

nee 14 3 17

Totaal 22 17 39

ja 12,41 9,59 22

nee 9,59 7,41 17

Totaal 22,00 17,00 39,00

Expected: evolutie PROH DMSO Totaal

Berekeningen: 1. Hypothesen H0: er is geen significant verschil tussen beide methoden naar evolutie toe H1: er is wel een significant verschil tussen beide methoden naar evolutie toe 2. Gegevens : Kans: 0,01 Vrijheidsgraden: 1 3. Berekeningen Via de chi.toets wordt een p-waarde bekopen van 0,0041 4. Besluit De p-waarde is kleiner dan de vooropgestelde waarde van 0,01, de nulhypothese wordt verworpen. Er kan besloten worden met een zekerheid van 99% dat er een significant verschil is tussen beide methoden op vlak van evolutie.

51


4.4.3

significantie naar evolutie tot blastocyst toe

Data: Observed: blastocyst PROH DMSO Totaal

ja 6 4 10

nee 2 10 12

Totaal 8 14 22

ja 3,64 6,36 10,00

nee 4,36 7,64 12,00

Totaal 8,00 14,00 22,00

Expected: blastocyst PROH DMSO Totaal

De geobserveerde waarden zijn allemaal kleiner of gelijk aan tien, in dit geval is het beter om de Fisher-exact test te gebruiken om een nauwkeurigere analyse te bekomen. Berekeningen: 1. Hypothesen H0: er is geen significant verschil tussen beide methoden naar evolutie tot blastocyst toe H1: er is wel een significant verschil tussen beide methoden naar evolutie tot blastocyst toe 2. Gegevens: Kans: 0,05 Vrijheidsgraden: 1 3. Berekeningen: Via de Fisher-exact test wordt een p-waarde bekomen van 0,0743 4. Besluit De p-waarde is groter dan de vooropgestelde waarde van 0,05, de nulhypothese wordt aanvaard.Er kan besloten worden met een zekerheid van 95% dat er geen significant verschil is tussen beide methoden op vlak van evolutie tot blastocyst toe. 52

Vergelijking van twee verschillende cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s Discussie en Conclusie

5

Discussie en Conclusie

In de beginfase van het project waren er problemen met de overleving van de embryo’s, ze waren bij beide methoden allemaal degeneratief en dit kon niet want het huidige protocol geeft in de dagelijkse praktijk goede resultaten. Met de hulp in het labo is de fout ontdekt en is die ook opgelost. Bij de methode van DMSO-sucrose heeft 66,67% van de embryo’s na ontdooien een intactheid van 100%, 22,22% heeft een intactheid van <100% maar >50% en 11,11% heeft een intactheid van <50%. Indien het degeneratief embryo niet meegeteld wordt is er bij 82% van de ontdooide embryo’s evolutie, 29% van deze embryo’s zal verder evolueren tot een blastocyst. Bij de methode van PROH heeft 27,27% van de embryo’s na ontdooien een intactheid van 100%, 68,18% heeft een intactheid van <100% maar >50% en 4,55% heeft een intactheid van <50%. Bij de ontdooide embryo’s is er bij 36,36% evolutie, 75% van deze embryo’s zal verder evolueren tot een blastocyst. Op het eerste zicht zijn er opmerkelijke verschillen tussen beide methoden die in het deel resultaten statistisch gestaafd worden. Er is met een zekerheid van 95% een verschil tussen beide methoden naar 100% overleving toe, de methode van DMSO-sucrose scoort hier opmerkelijk beter. Met een zekerheid van 99% is er een verschil tussen beide methoden naar evolutie toe, ook hier scoort de methode van DMSO-sucrose opmerkelijk beter. Tenslotte is er met een zekerheid van 95% geen verschil tussen beide methoden op vlak van evolutie tot blastocyst maar het gaat wel in de richting van significantie, door de beperktheid van mijn steekproef op dit vlak, kan er geen significantie aangetoond worden. Er kan besloten worden dat de huidige methode van DMSO-sucrose op twee van de drie onderzochte vlakken beter scoort dan het commerciële PROH protocol. Voor een eventuele overschakeling naar een ander protocol kan gebeuren moeten er aanpassingen doorgevoerd worden in het PROH protocol van vitrolife zodat het tenminste even goede resultaten oplevert als het DMSO-sucrose protocol.

53


Literatuurlijst

Gebruikte protocols : 1) Protocol DMSO-sucrose, AZ St-Jan Brugge CRG labo Gekregen op 11-02-08 2) Protocol propaandiol, opgesteld door Vitrolife op basis van de werkwijze van Testart Gekregen op 11-02-08 Boeken en dergelijke : 3) Wetzels, A.M.M (1993-1994), IVF lab, laboratoriumaspecten van in-vitro-fertilisatie, Cryopreservatie theorie, Organon Nederland 4) Naaktgeboren N. (1993-1994), IVF lab, laboratoriumaspecten van in-vitro fertilisatie, Cryopreservatie praktijk, Organon Nederland 5) Dhondt J. (2005), Vergelijkende studie van twee invriesprotocols voor humane meercellige delingsembryo’s, Dhondt J. eindwerk ingediend tot het behalen van de graad: professionele Bachelor in de Biomedische Laboratoriumtechnologie (Farma ceutische en Biologische laboratoriumtechnologie) aan de Hogeschool Gent 6) Trounson A. David K. Gardner (2000), Handbook of In Vitro Fertilization, Informa Healthcare Sites : 7) Ferti magazine ( ?), Alles wat je wilt weten als een zwangerschap uitblijft [www], Ferti magazine URL : http://www.fertimagazine.nl/behandeling Gezien op 17-02-08 8) Sydney IVF (2008), Sydney IVF [www], Sydney IVF limited URL : http://www.sydneyivf.com Gezien op : 17-02-08 9) Mozley E. S.(2003), A Test of Different Cryopreservation Methods on Members of the Nowakoskiella Clade [www], Botany 54


URL : http://www.botany.uga.edu/chytrid/CryopreservationMethods/index.htm Gezien op : 20-02-08 10) Georgia reproductive specialists (2005), Georgia reproductive specialists [www], IVF.com Atlanta URL : http://www.ivf.com Gezien op 22-02-08 11) Microscopy UK (1995), Microscopy UK [www], Microscopy UK URL : http://www.microscopy-uk.org.uk Gezien op 03-03-08

Figuren : 12) Auteur : anoniem (1991), Het year of the ICSI [www] , VUB-CRGUZ Brussel URL : [ http://www.brusselsivf.be/default_historiek.aspx?ref=AIAAAJ&lang=EN ] Gezien op : 17-02-08 13) Devroey P. (2007), Welkom bij het centrum voor reproductieve geneeskunde [www], UZ-Brussel. URL : [ http://www.brusselsivf.be ] Gezien op : 17-02-08 14) Advanced fertility center of chicago (1996), Advanced fertility center of chicago [www], Advanced fertility center of Chicago. URL : [ www.advancedfertility.com/blastocystimages.htm ] Gezien op : 18-02-08 15) Malpani A. (2001), How to have a baby : overcoming infertility [www], Internet Health Resources URL : [ http://www.infertilitybooks.com/onlinebooks/malpani/index.html ] Gezien op : 25-02-08

55


16) Auteur : anoniem (2006), assisted hatching [www], Bhopal Test Tube Baby Centre URL : [ http://www.ivf.net.in/ivf&icsi/assited.html ] Gezien op : 5-03-08 17) KU Medical Center, stem cell research [www], KU Medical Center URL : [ http://www.kumc.edu/stemcell/images.html ] Gezien op : 10-03-08 18) Cryo Bio System (2002), High securityhydrophobic plugged embryo straws [www], Cryo Bio System URL : [ http://www.cryobiosystem-imv.com/PMA/prodcry2_pma.asp ] Gezien op : 5-03-08 19) Nikon (2008), Products and support [www], Niko URL : [ http://www.nikon.com/products/instruments/index.htm ]

56


Bijlagen

Bijlage 1 – Human Blastocyst Vitrification Protocol Bijlage 2 – delingschema van een embryo Bijlage 3 – Verschillende stadia bij compactatie

57


Bijlage 1 – Human Blastocyst Vitrification Protocol

Human Blastocyst Vitrification Protocol Vitrification Place 0,5-1mL of each of the following media into separate Wells of a NUNC 4-well plate and warm to 37°C

Holding Medium Blastocyst Equilibration Medium Blastocyst Vitrification Medium Blastocyst

All manipulations of the blastocysts are carried out on the heated stage (37°C) of a microscope. Cryovials are held on the cryo-canes submerged in liquid Nitrogen. Collapse the blastocoel by inserting an ICSI needle or by using a laser beam. Transfer the blastocysts from culture into the Holding Medium for at least 5min but a maximum of 20min. Move an appropriate number of blastocysts into the Equilibration Medium. The blastocysts remain in this solution for 2min. The blastocysts will tend to float to the surface, if so, collect them and replace them to the bottom of the dish. While waiting for the 2min to expire, make a 20µL droplet of the Vitrification Medium on a non-toxic surface, preferably a culture dish. Making a small droplet of the Vitrification Medium enables easy loading into the VitroloopTM. (The 20µL droplet can only be used once). When 30sec remain, attach the VitroloopTM to the magnetic wand and dip the VitroloopTM into the Vitrification Medium. When 10sec remain, begin collecting the blastocysts. Transfer the blastocysts in a minimal volume of Equilibration Medium to avoid dilution of the droplet.

58


Transfer the blastocysts into the 20µL droplet of the Vitrification Medium for 45sec. Mix the blastocysts within the Vitrification Medium with the pipette. When 5-10sec remain, collect the blastocysts and place them onto the VitroloopTM. Immediately plunge the VitroloopTM into the cryovial filled with nitrogen

Warming Place 0,5-1mL of each of the following media into separate wells of a NUNC 4-well plate and warm to 37°C. Warming Medium 1 Blastocyst Warming Medium 2 Blastocyst Warming Medium 3 Blastocyst All manipulations of the blastocysts are carried out on the heated stage (37°C) of a microscope. Remove the VitroloopTM from the vial at low temperature (LN2) 1.Remove the VitroloopTM from the vial al mow temperature (LN2). 2.Place the VitroloopTM quickly into Warming Medium 1. Only submerge the nylon loop 3.Allow the blastocysts to fall from the loop and sink to the bottom. Leave for 2min. 4.Transfer the blastocysts into Warming Medium 2 for 3min. 5.Transfer the blastocysts into Warming Medium 3 for 5-10min. 6.Rinse the blastocysts in culture medium several times and continue culture according to laboratory practice. Vitrolife recommends using G-2TM or EmbryoGlue for this procedure. 59


Bijlage 2 – delingschema van een embryo

Dag 1 : 2PN + 2 poollichamen

embryo met 2 polaire kernen en 2 poollichamen

embryo met 2 poollichamen en 2 kernen met verspreid kernmateriaal

embryo met 2 poollichamen en 2 asynchrone kernen, asynchrone kernen krijgen minder punten bij de scoring wanneer een geschikt embryo gekozen wordt voor de transfer zullen polaire kernen en kernen met verspreid kernmateriaal voorrang krijgen

60


Dag 2 : twee tot vier cellig embryo Rechts staan de normale embryo’s, alles wat van dit beeld afwijkt wordt als abnormaal Beschouwt, links staat telkens een voorbeeld van een abnormaal embryo

Goed : 2 cellig met

Fout : 2 cellig

gelijke blastomeren

met ongelijke blastomeren

Goed : 3 cellig met

Fout : 3 cellig

1 grote en 2 kleine

met 2 grote

blastomeren

en 1 kleine blastomeer

Goed : 4 gelijke

Fout : 4 ongel-

blastomeren

ijke blastomeren

61


Dag 3 : zes tot acht cellig stadium

Goed : 5 cellig, met 3 grote en 2 kleine blasomeren. de 2 kleine blastomeren zijn afkomstig van 1 grotere die is doorgedeeld

Goed : 6 cellig, met 2 grote blastomeren die nog niet zijn doorgedeeld, en 4 kleinere blastomeren

Goed : 7 cellig, met 1 grote blastomeer die nog niet is doorgedeeld en 6 kleinere blastomeren

Goed : 8 cellig, met 8 gelijke blastomeren

62


Bijlage 3 – Verschillende stadia bij compactatie

A : Volledige compactatie B : Onvolledige compactatie C : Regionale compactatie D : Fusie

63


Voor akkoord verklaring

Naam Familienaam Stagementor : Valerie Standaert

Naam Familienaam Stagebegeleider : Nicole Kellner

64


65

66

67

68

Vergelijking van twee verschillende cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo s

Recommend Documents