A CIRKULÁRIS DIKROIZMUS /CD/ ÉS KOMBINÁLT CD/UV SPEKTROSZKÓPIA FELHASZNÁLÁSI LEHETŐSÉGEI A KÉMIAI ANALÍZISBEN
DR. HORVÁTH PÉTER
SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERÉSZI KÉMIAI INTÉZET BUDAPEST 2000
1
TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK .............................................................................................. 2 ÖSSZEFOGLALÓ ................................................................................................... 5 1.
BEVEZETÉS ......................................................................................... 7
2.
CÉLKITŰZÉSEK .................................................................................. 10
3.
IRODALMI HÁTTÉR .............................................................................. 11
3.1.
KÉMIAI EGYENSÚLYOK ....................................................................... 11
3.2.
A KIROPTIKAI MÓDSZEREK ANALITIKAI ALKALMAZÁSAI.......................... 12
3.2.1
GYÓGYSZERKÖNYVI MINŐSÉGBIZTOSÍTÁS ............................................ 12
3.2.2
OPTIKAILAG AKTÍV ANYAGOK KÖZVETLEN MEGHATÁROZÁSA ................. 13
3.2.3
OPTIKAILAG AKTÍV ANYAGOK SZÁRMAZÉKKÉPZÉSEN ALAPULÓ MEGHATÁROZÁSA .............................................................................. 14
3.2.4.
AZ INDUKÁLT OPTIKAI AKTIVITÁS MÉRÉSÉNEK LEHETŐSÉGEI ................. 15
3.2.5
KIROPTIKAI DETEKTÁLÁS AZ ELVÁLASZTÁSTECHNIKÁBAN ..................... 16
3.2.6.
ENANTIOMEREK MEGHATÁROZÁSA ELVÁLASZTÁSTECHNIKA ALKALMAZÁSA NÉLKÜL ............................................................................................. 19
4.
MÓDSZEREK ...................................................................................... 20
4.1
KIROPTIKAI MÓDSZEREK ..................................................................... 20
4.1.1
AZ OPTIKAI AKTIVITÁS ALAPFOGALMAINAK ÁTTEKINTÉSE ..................... 20
4.1.2
A KIROPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA MÓDSZEREI ....................................... 22
4.1.3
ELMÉLETI ALAPOK ............................................................................. 22
2
4.1.4
AZ UV-VIS , A CD ÉS AZ ORD SPEKTROSZKÓPIA ÖSSZEHASONLÍTÁSA 24
4.2
A NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA /HPLC/ ÉS A KIROPTIKAI DETEKTÁLÁS .................................................................... 26
4.2.1.1
CSÚCSHOMOGENITÁS VIZSGÁLATÁRA ALKALMAZOTT MÓDSZEREK ......... 26
4.2.1.2
A SZIMULTÁN KETTŐS CD/UV DETEKTÁLÁS ELVE ÉS ALKALMAZÁSÁNAK FELTÉTELEI A CSÚCSHOMOGENITÁS VIZSGÁLATÁBAN............................ 28
4.2.2.1
ÁTFEDŐ KROMATOGRÁFIÁS CSÚCSOK DEKONVOLUCIÓJA...................... 30
4.2.2.2
CSÚCSFELBONTÁS ELVÉNEK LEÍRÁSA A SZIMULTÁN KETTŐS CD/UV DETEKTÁLÁST KÖVETŐ HÁNYADOSKÉPZÉS ALAPJÁN............................. 32
5.
EREDMÉNYEK .................................................................................... 36
5.1
A MÉRÉSEKHEZ HASZNÁLT MŰSZEREK, VEGYSZEREK ÉS MÉRÉSI KÖRÜLMÉNYEK LEÍRÁSA ..................................................................... 36
5.1.1
MŰSZEREK ........................................................................................ 36
5.1.1.1
KIROPTIKAI MÉRŐMŰSZER .................................................................. 36
5.1.1.2
KROMATOGRÁFIÁS MÉRŐRENDSZER .................................................... 37
5.1.1.3
KIEGÉSZÍTŐ MÉRÉSTECHNIKÁK ........................................................... 37
5.1.2
VEGYSZEREK, REAGENSEK, OLDÓSZEREK .......................................... 38
5.2
ENANTIOMERTISZTASÁG MEGHATÁROZÁSA .......................................... 41
5.2.1
ENANTIOMER TISZTASÁG MEGHATÁROZÁSA SZIMULTÁN KETTŐS SPEKTROSZKÓPIA ALKALMAZÁSÁVAL .................................................. 41
5.2.1.1
ELŐVIZSGÁLATOK .............................................................................. 41
5.2.1.2
ENANTIOMERTISZTASÁG KÖZVETLEN MEGHATÁROZÁSA A DISZIMMETRIA FAKTOR ALKALMAZÁSÁVAL................................................................. 47
5.3
A CD ÉS A SZIMULTÁN KETTŐS CD/UV DETEKTÁLÁS FELHASZNÁLÁSI LEHETŐSÉGEI A NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁBAN.
5.3.1
54
KROMATOGRÁFIÁS CSÚCSHOMOGENITÁS MEGHATÁROZÁSA A SZIMULTÁN KETTŐS CD/UV DETEKTÁLÁS SEGÍTSÉGÉVEL ...................................... 55
3
5.3.2
KROMATOGRÁFIÁS CSÚCSHOMOGENITÁS VIZSGÁLATA NAGYSEBESSÉGŰ CD SPEKTRUMFELVÉTELEK ALAPJÁN.................................................. 62
5.3.3
KROMATOGRÁFIÁS CSÚCSFELBONTÁS A SZIMULTÁN KETTŐS CD/UV DETEKTÁLÁS SEGÍTSÉGÉVEL ............................................................... 69
6.
MEGBESZÉLÉS .................................................................................. 76
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ...................................................................................... 78 IRODALOMJEGYZÉK ............................................................................................ 79
4
ÖSSZEFOGLALÓ A CIRKULÁRIS DIKROIZMUS /CD/ ÉS KOMBINÁLT CD/UV SPEKTROSZKÓPIA FELHASZNÁLÁSI LEHETŐSÉGEI A KÉMIAI ANALÍZISBEN
Írta: Horváth Péter Témavezető: Gergely András, a kémiai tudományok kandidátusa Budapest, Semmelweis Egyetem Doktori Iskola,2000 Program: A gyógyszerészeti tudományok korszerű kutatási irányai A kiroptikai spektroszkópia dinamikusan fejlődő területe a kiroptikai analízis. Korábban ezt a módszert elsődlegesen molekulák szerkezetének meghatározására alkalmazták, azonban napjainkban egyre nő az igény elsősorban
a
gyógyszeripar
meghatározására.
Az
részéről-
az
elválasztástechnikai
enantiomer eljárások
tisztaság
egyre
precíz
gyakrabban
alkalmazzák a kiroptikai detektálást, amely módszer egyik legfontosabb előnye, hogy királis anyagok szelektív mérését teszi lehetővé, továbbá az, hogy segítségével az enantiomer arány az izomerek elválasztása nélkül is meghatározható. Célkitűzéseink között szerepelt, hogy -a technikai feltételek megteremtése után-
új
módszerek
kifejlesztésével
a
kiroptikai
spektroszkópia
gyógyszeranalitikai lehetőségeire felhívjuk a figyelmet. Legfontosabb
eredményeink
közé
soroljuk,
hogy
Magyarországon
elsőként, de nemzetközi viszonylatban is az elsők közt oldottuk meg a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia /HPLC/ és a cirkuláris dikroizmus /CD/ spektroszkópia, mint detektálási eljárás összekapcsolását. Fentiek alkalmazható
eredményeként csúcshomogenitás
az
elválasztástechnikában
vizsgáló
módszer
általánosan
kidolgozására
nyílt
lehetőség, amely a szimultán kettős CD/UV detektáláson és az azt követő hányadosképzésén alapuló vizsgáló eljárás. A módszer továbbfejlesztésével átfedő kromatográfiás csúcsok dekonvolúcióját is sikerült elvégezni. Szintén a csúcshomogenitás ellenőrzésére alkalmas a CD-spektrumok nagy sebességgel történő regisztrálása, amely eljárás a látszólag homogén kromatográfiás csúcsok esetében is jól alkalmazható. A fentiek mellett számot adok a CD spektroszkópia közvetlen alkalmazási lehetőségeiről is, mint például kémiai egyensúlyok vizsgálatáról és egy új elven alapuló, enantiomer tisztaság meghatározásra alkalmas módszerről is. 5
METHOD DEVELOPMENTS AND APPLICATIONS OF CICULAR DICHROISM AND SIMULTANEOUS DUAL CD/UV SPECTROSCOPY IN ANALYTICAL CHEMISTRY Péter Horváth Semmelweis University, Department of Pharmaceutical Chemistry Tutor: András Gergely C.Sc. Semmelweis University, School of Ph.D. Studies Programme: Recent trends in pharmaceutical sciences Circular dichroism (CD) is one of the few sensitive indicators of molecular configuration. CD spectroscopy has therefore long been used for structure elucidation. Recent trends show, however, an enormous progress of CD spectroscopy in analytical chemistry, either as an independent method, or as a detector in hyphenated separation techniques. Its uses became especially widespread in pharmaceutical analyses, since enantiomeric purity is a crucial criterion of drug quality. Objectives of the present Ph.D. work included fundamental research in CD and related methodologies, but also, its applications in pharmaceutical analysis. A technical prerequisite of our research work was the instrumental hyphenation of separation and chiroptical detection techniques, which has been achieved by the combination of high performance liquid chromatographic and circular dichroism spectroscopic devices. Our home-built apparatus was the first HPLC-CD instrument in Hungary. Its uses allowed the elaboration of a new method for the determination of peak homogeneity, which applies simultaneous, dual CD/UV detection, and a subsequent ratio-formation. An improved version of this method resulted in the deconvolution of overlapping chromatographic peaks. Another type of peak homogeneity control method was elaborated by rapid, on-line recording of CD spectra in the progress of elution, in order to analyse apparently homogeneous peaks. Circular dichroism has also been applied to quantitate enantiomeric purity in composite samples without any separation of the analytes, and also, to determine equilibrium constants of protonating chiral compounds.
6
1.
BEVEZETÉS A bennünket körülvevő világ számos titkot rejt, amelyekre keressük a
megoldást, de tudományos megalapozottsággal még nem tudunk minden kérdésre válaszolni. Az egyik ilyen filozofikus nagy kérdés az élet keletkezése a földön. Mikor és hogyan keletkeztek az első önreprodukcióra képes molekulák vagy molekuláris halmazok? Miért pont azok a molekulák voltak azok, melyek építőköveivé váltak a mai létformák őseinek? Vagy lehet, hogy azok a biomolekulák, amelyek ma az élet építőkövei, egy szelekció végeredményeinek tekinthetők? Mindenesetre érdekes, hogy az élő szervezeteket felépítő szerves molekulákban aminosavaknál majdnem kizárólagos az L-aminosavak és cukrok esetében a D-cukrok jelenléte. Ha ezeknek a molekuláknak és tükörképi párjaiknak a képződési energiáit tekintjük, akkor azt kell tapasztalnunk, hogy azok gyakorlatilag azonosak, vagy csak olyan kicsi közöttük a különbség, hogy azt a mai technikával még nem tudjuk megmérni. A biológiai homokiralitás eredetére számos teóriát állítottak fel, azonban tudományos megalapozottsággal és minden kétséget kizáróan választ egyik elmélet sem tud nyújtani [1,2,3]. Az emberi szervezet egy magas fokon szervezett királis objektum, a benne lezajló biokémiai folyamatok nagyfokú sztereospecifitással bírnak. Amennyiben ezeket a folyamatokat befolyásolni kívánjuk, úgy tekintettel kell lenni a biológiai homokiralitásra. Ez leegyszerűsítve azt jelenti, hogy a gyógyszeres terápiával megcélzott receptor számára a megfelelő konfigurációjú és konformációjú komplementer molekulát kell a szervezetbe bejuttatni. Ha nem a megfelelő „kulcsot” használjuk a megfelelő „zárhoz”, annak számos következménye lehet. Ezen következmények közül a legkevésbé káros, ha a biológiai/terápiás hatást hordozó izomer (eutomer) mellett előforduló másik izomer (disztomer) gyengébb hatást vált ki. Farmakológiai szempontból kevésbé jó, de elfogadható megoldás az is, ha a disztomer hatástalan. Ilyenkor a szervezet méregtelenítő funkcióit ugyan feleslegesen terheljük, de legalább más káros mellékhatás nem jelentkezik. Legkevésbé kívánatos, ha a disztomer valamilyen toxikus
7
mellékhatásért felelős. Ennek egyik legjelentősebb és legnagyobb vihart kavaró példája a Contergan /thalidomid/ botrány volt [4-5]. Egy alapvetően jó, előnyös hatásokkal
rendelkező
szedato-hipnotikus
vegyület
az
R-(+)-thalidomid
enantiomerpárja az S-(-)-thalidomid teratogén hatásúnak bizonyult, aminek következtében súlyos rendellenességgel jöttek világra azok a csecsemők, akiknek
az
gyógyszerrel
édesanyját
a
kezelték.
Ez
gyógyszergyártással
terhesség folyamán a
foglalkozó
tragikus
eset
szakemberek
thalidomidot a
tartalmazó
gyógyszerkutatással,
figyelmét
a
kiralitással
kapcsolatos kérdésekre irányította. Napjainkban a Contergan per eredményeként egyre inkább tendencia, hogy az eddig racém gyógyszermolekulák közül csak a hatásos, homokirális komponens (eutomer) kerüljön forgalomba. Természetesen ma még gazdasági megfontolások is szerepet játszanak abban, hogy egy racém keverékből kihagyható-e a disztomer, de a jövőben elsődlegesen a farmakológiai evidenciáknak kell érvényesülniük. Az Európai Közösség az elmúlt öt évben számos ajánlást fogadott el ebben a kérdéskörben. A legfontosabb ezek közül, hogy királis molekulák esetében mind a két izomerrel el kell végezni a fiziko-kémiai, farmakológiai és toxikológiai vizsgálatokat. További, a kutatás költségvetését terhelő vizsgálatsor elvégzése szükséges a szterokémiai stabilitással kapcsolatban [6], amely kiterjed mind az in vitro és az in vivo vizsgálatokra is. Nyomon kell követni a farmakon sorsát az előállítás, a formulálás, a biohasznosíthatósági és farmakológiai vizsgálatok során. A sztereokémiai stabilitás vizsgálat tehát ki kell hogy terjedjen a molekula inverziós és racemizációs tulajdonságainak a vizsgálatára is, ellentétben az akirális molekulákkal, ahol erre a típusú vizsgálatra nincs szükség. A helyzet hasonló a generikus készítményekkel is. Az irányelvek szerint a királis hatóanyagot tartalmazó készítményeknél ugyanazokat a gyártási és ellenőrzési standardokat kell alkalmazni, mint azt az eredeti molekulánál. Mindez talán még kézenfekvőbb, ha figyelembe vesszük azt, hogy az egyik legnagyobb gyógyszer adatbázisban [7] szereplő mintegy 6000 vegyület közül több, mint 50% a királis molekula. Ugyanakkor egy másik felmérés szerint
8
[8] a 100 legnagyobb mennyiségben forgalmazott gyógyszer 20%-a olyan, mely szintetikus eredetű és rendelkezik királis szénatommal. A 20 molekula közül azonban jelenleg még csak három, a naproxen, a methyldopa és phenylephrin az, amelyeket egyes (single) enantiomerként forgalmaznak. A fentiek tükrében úgy vélem, könnyen belátható a kiralitással kapcsolatos kutatások jelentősége, valamint az ilyen jellegű vizsgálatok fontossága. További érv a terület fontossága mellett az a tény is, hogy napjaink modern gyógyszerkutatása is egyre több figyelmet szentel a potenciális új hatóanyagok tervezése során a molekulák 3 dimenziós vizsgálatának, a korábban
alkalmazott
2
dimenziós
modellekkel
szemben.
Ebben
a
megközelítésben a konformáció és a konfiguráció együttes értelmezése minőségileg új szemléletet eredményez. Minél több betegség esetében ismerjük a biokémiai hátteret és minél több betegség esetében ismerjük a gyógyszerek támadáspontját jelentő receptorok szerkezetét, annál könnyebben lehet a receptor kötőhelyére illeszkedő molekulát tervezni, vagy értelmezhetővé válik az enantiomerek és a diasztereomerek esetében a hatás különbözősége.
9
2.
CÉLKITŰZÉSEK
A bevezetőben talán sikerült rámutatnom azokra a tényekre, melyek indokolják a kiroptikai analizis létjogosultságát, jelentőségét és korszerű voltát. Céljaink között olyan új elvek és módszerek kidolgozása szerepelt, melyek előrevihetik a kiroptikai analízissel kapcsolatos kutatásokat. 1992-93-ban, amikor két sikeres pályázat (OTKA Műszerpályázat valamint FEFA II) eredményeként, az akkor még csak két főből ( Dr. Gergely András és Dr. Horváth Péter ) álló kutatócsoport megalakította a Gyógyszerészi Kémiai Intézet keretén belül működő kiroptikai munkacsoportot, még nem volt igazán kialakult képünk arról, hogy az új műszer, a Jasco J-720 Spectropolarimeter milyen
kitűnő
mérési
felhasználtunk, hogy
lehetőségekkel
rendelkezik.
Minden
alkalmat
tudományos kapcsolatokat építsünk ki, kutatási
együttműködésekben vegyünk részt és korábbi munkáink során szerzett tapasztalatainkat kamatoztassuk, ötleteinket egy világszínvonalú készülék segítségével valósítsuk meg. Hamarosan
láthatóvá
vált,
hogy
a
kiroptikai
analízis
egyik
legdinamikusabban fejlődő területe a kiroptika detektálás és még számos lehetőség kínálkozik a CD detektálás előnyeinek a kihasználására. Akkoriban kereskedelmi forgalomban lévő dikrográfot nem, csak ORD készüléket használtak kromatográfiás elválasztást követő kiroptikai detektálásra, de annak hátrányai – a kisfokú érzékenység, vagy inkább érzéketlenség és a szelektivitás hiánya- miatt csak igen kisszámú publikáció látott napvilágot. A CD készülékekben alkalmazott technikai fejlesztések és a két módszer /CD-ORD/ elvi különbözőségéből adódó, a CD spektroszkópia javára megmutatkozó előnyök
inspiráltak
nagyhatékonyságú
arra,
hogy
jelentős
folyadékkromatográfia
erőfeszítéseket és
a
tegyünk
a
CD-spektroszkópia
összekapcsolására. Jelen értekezésben ezen erőfeszítések eredményeiről szeretnék számot adni, kiegészítve a fenti alapkutatással összefüggő, a gyógyszeranalitikában előnyösen használható közvetlen CD spektroszkópiás módszerekkel
10
3.
IRODALMI HÁTTÉR
3.1.
KÉMIAI EGYENSÚLYOK A
kiroptikai
spektroszkópia
(CD
és
ORD)
felhasználása
kémiai
egyensúlyok tanulmányozására csak szórványosan fordul elő az irodalomban, aminek számos oka van. Elsőként említendő, hogy a kiroptikai készülékek igen drágák, és ez a tény elterjedésüket nagymértékben gátolja. Másodsorban a módszer korlátja a vizsgálható molekulák köre. Mivel kiroptikai berendezésről van szó, magától értetődik, hogy a vizsgált egyensúlyban résztvevő anyagok közül legalább az egyiknek királis anyagnak kell lennie. A módszer előnyeként feltétlenül megemlítendő, hogy abban az esetben, amikor csak az egyik komponens optikailag aktív, nagymértékű szelektivitás érhető el a kiroptikai módszerekkel, mivel csak a királis komponens fiziko-kémiai tulajdonságaiban beálló és a kiroptikai tulajdonságokra hatással lévő effektusok okoznak a mért jelben változást. A kiroptikai spektroszkópia használata során a mért jel intenzitása és a mérendő anyag koncentrációja közötti összefüggés analóg a fényelnyelés és a koncentráció közötti összefüggéssel, így ez utóbbira alkalmazható elvek érvényesek a kiroptika módszerekre is [9]. Protonálódási
állandók
meghatározására
az
abszorpciós
spektrofotometria mintájára mind az ORD, mind pedig a CD spektroszkópia előnyösen alkalmazható. Katzin és Gulyás [10] valamint Beck és munkatársai [11] polarimetriás módszerrel a borkősav savi disszociációs egyensúlyait határozták meg. A CD spektroszkópia szelektivitása és érzékenysége számos előnyt jelenthet, ennek ellenére csak szórványosan fordul elő használata protonálódási egyensúlyok vizsgálatában [12,13] Szarvas és Tibély az almasav molibdát-komplexeit vizsgálta [14]. Mannit és szorbit hidrogénhidas anion-komplexeinek stabilitási állandóinak [15]* valamint
borát-
meghatározására
molibdát-komplexeinek is
alkalmazták
a
[16]
stabilitási
polarimetriát.
Purdie
állandóinak efedrin
és
pszeudoefedrin enantiomer-tisztaságának meghatározására alkalmazta a réz-
11
borkősav és a réz-efedrin illetve réz–pszeudoefedrin komplexek közti stabilitás különbségen alapuló ligandumcserés eljárást [17]. A biokémiai folyamatok között alapvető tejsav oxidációt végző laktát dehidrogenáz enzim laktát kötőhelyén kialakuló, az arginin guanidinó és a laktát karboxilát-csoportja között létrejövő kölcsönhatást modellező laktát-guanidinium asszociáció egyensúlyi állandóit szintén polarimetriás módszerrel határozták meg [18]*. Kirkwood a 2hidroxi-bután rotációs egyensúlyait [19], míg Noszál az almasav rotamikrospeciációját tanulmányozta[20]*. 3.2.
A KIROPTIKAI MÓDSZEREK ANALITIKAI ALKALMAZÁSAI
3.2.1
GYÓGYSZERKÖNYVI MINŐSÉGBIZTOSÍTÁS Mind a külföldi, így az európai [21], mind pedig a hazai gyógyszerkönyvek
[22] királis anyagok esetében gyakran előirják az optikai tisztaság vizsgálatát. Az optikai forgatóképesség használatos hosszú évtizedek óta az optikai tisztaság vizsgálatára, amely mérés egyben az anyag tisztaságának is fokmérője egyben. A mérést általában a NaD-vonalán elvégezve, a bemérési koncentráció és a leolvasott forgatási érték ismeretében kiszámolható a fajlagos forgatóképesség. A gyógyszerkönyvek megadják az elfogadhatóság alsó és felső
határát,
az
ezek
közé
eső
értéket
elfogadhatónak
tekintik.
A
forgatóképesség mérése azonban nem tekinthető szelektívnek, mert az oldatban jelenlévő összes anyag (ami magában foglalja a szennyezésként jelenlévő anyagokat is) együttes forgatási értékét méri, ezért csak az összes többi,
a
cikkelyben
szereplő
tisztaságvizsgáló
módszerrel
együttesen
értékelhető. Sokkal informatívabb lenne a CD spektrumon alapuló optikai tisztaságvizsgálat, azonban ez a CD készülékek igen magas ára miatt ma még általánosan nem kivitelezhető, bár az Európai Gyógyszerkönyvben már hivatalos fiziko-kémiai vizsgálati módszer a CD spektroszkópia. Hasonló a helyzet a vegyszerkatalógusokkal illetve egy új szintetikus vegyület jellemzése esetén is. A jelenlegi, NaD-vonalra vonatkoztatott forgatási értékek helyett az abszorpciós- vagy infravörös spektroszkópia mintájára az anyag jellemző Cotton-hatás görbéjének maximum helyein mérhető intenzitás
12
értékeit kellene megadni, ami nem csak az anyag tisztaságára, hanem kémiai szerkezetére is adna némi utalást.
3.2.2
OPTIKAILAG AKTÍV ANYAGOK KÖZVETLEN MEGHATÁROZÁSA A CD spektroszkópia alapelvét tekintve (lásd 23.old.), mindazok a
méréstechnikák alkalmazhatók, amelyek az abszorpciós spektrofotometriában, természetesen azzal a megkötéssel, hogy alkalmazhatósági köre csak az optikailag aktív anyagokra terjed ki. Ennek megfelelően, ahol a mért jel és a koncentráció
között
lineáris
összefüggés
áll
fenn,
ott
mennyiségi
meghatározásra alkalmas a módszer. Különösen gyakori területe a CD spektroszkópia alkalmazásának a szteroid analitika. Gergely összefoglaló munkájában [23] részletes képet ad a szteroidok körében elvégzett vizsgálatokról. A CD spektroszkópia kábítószeranalitikai célokra történő általános felhasználására tesznek javaslatot Purdie és mtsai [24-29]. Tetrahidrokannabinol és kannabinol egymás mellett meghatározható, a két hatóanyag arányából a drog földrajzi származási helyére is következtetni lehet [25]. Lizergsav dietilamid /LSD/ kvantitatív meghatározását lehetett szelektíven elvégezni elkobzott mintákból, a segédanyagok szeparálása nélkül [26]. Morfinvázas alkaloidok körében, azok meglehetősen előnyös kiroptikai tulajdonságai miatt a módszer szintén jól használható [27]. Az egyik leggyakrabban alkalmazott „kemény drog”, a heroin szelektíven határozható meg a hígítására használt egyéb anyagok mellett [28]. Ópium extraktumban és pantoponban különböző ópium alkaloidok együttes jelenléte esetén is szelektíven meghatározható a morfin, a kodein, a tebain és a noszkapin [29]. Palma
és
munkatársai
spektropolarimetriás összehasonlították
kodein
meghatározását az
Amerikai
és
kokain
írták
le
Gyógyszerkönyv
tartamú [30].
tabletták
Módszerüket
(USP-XXII)
azonos
cikkelyeivel és azt találták, hogy a pontosság tekintetében ugyan azonos teljesítőképességű a módszerük, de a kiroptikai eljárás gyorsabb és specifikusabb.
13
Az antibiotikumok, köszönhetően természetes eredetüknek, gyakorlatilag mind királis molekulák. Ezt felhasználva számos antibiotikum, mint pl. tetraciklinek [31] és β-laktám származékok [32] meghatározására lehetett felhasználni a CD spektroszkópiát. Gortazar és mtsai vizelet mintákból határoztak meg sikeresen ampicillint, cephalexint és cephoxitint [33].
3.2.3
OPTIKAILAG AKTÍV ANYAGOK SZÁRMAZÉKKÉPZÉSEN ALAPULÓ MEGHATÁROZÁSA
Az élő szervezetekben leggyakrabban előforduló biomolekulák, mint pl. cukrok, aminosavak többnyire nem rendelkeznek olyan kromofór csoporttal, amelyek lehetővé tenné ezen molekulák közvetlen CD spektroszkópiás meghatározását. Szükség lehet továbbá olyan esetekben is származékképzési reakcióra, amikor a molekula CD és UV jelének hányadosa, az anizotrópia faktor nagyon kis érték. A származékképzési reakciókat olyankor érdemes tehát végrehajtani, ha a kidolgozott eljárás az alább felsorolt előnyök közül legalább egyet kiaknáz: 1.)
a kromofór csoport bevitele új, optikailag aktív elnyelési sávot eredményez,
2.)
szelektív hullámhosszon történő mérést tesz lehetővé,
3.)
növeli a meghatározás érzékenységét.
Fenti előnyöket jól mutatja egy, kutatócsoportunk által javasolt eljárás, amely a Sanger reagens (2.4-dinitrofluorbenzol /DNFB/) alkalmazásán alapul. Segítségével
fenil-alkil-amin
tipusú
meghatározását [34] végeztük el.
gyógyszer-
és
kábítószer-molekulák
A Sanger reagenst több, mint ötven éve
primer és szekunder aminok, /pl.: aminosavak/ meghatározására használják. Egyik általános felhasználási területe a kromatográfia, ahol a fentebb említett vegyületek kromatográfiás UV-detektálhatóságának javítására alkalmazzák [35]. A másik felhasználási terület a spektrofotometria, amikor nagy moláris abszorpciós koefficiensű származék képzése és ezen keresztül a kvantitatív mérés kivitelezése a cél [36].
14
A Sanger reagens alaninamiddal módosított változata a Marfey reagens (1-fluor-2,4-dinitrofenil-5-L-alaninamid), amely királis származékképzőként nem csak
a
kiroptikai
tulajdonságok
javítására,
hanem
enantiomerek
elválasztásának szándéka esetén diasztereomerpár-képző reagensként is alkalmazható. [37] 3.2.4.
AZ INDUKÁLT OPTIKAI AKTIVITÁS MÉRÉSÉNEK LEHETŐSÉGEI
Az indukált optikai aktivitás mérésén alapuló közvetlen analitikai mérések száma igen csekély, aminek oka, hogy ezeknél a módszereknél mindig található egyszerűbb, szelektívebb vagy érzékenyebb eljárás. Az indukált optikai aktivitás mérésének két olyan területe van mégis, amely mindenképpen említést érdemel. Az egyik felhasználási terület az optikai izomerek kromatográfiás elválasztása ciklodextrinnel képzett zárványkomplexeik alapján. A zárványkomplexek eltérő stabilitása lehetőséget ad kromatográfiás elválasztásukra. A ciklodextrin belső üregében a nagyobb stabilitással kötődő részecske több időt tölt el, mint a kevéssé kötődő. Ezen zárványkomplexek vándorlási tulajdonságai viszont különböznek a nem zárványként vándorló molekuláétól. Ez igaz az állófázishoz kötött és a mozgófázisban oldott ciklodextrinek esetében is. Akirális komponensek kötődésének jellemzésére is felhasználható az indukált optikai aktivitás mérése [38]. Kellően nagy stabilitás különbség vagy az üreg belsejének szerkezetét módosító származékképzők révén létrejövő sztérikus gátlás esetén királis molekulák felismerésére is alkalmasak lehetnek a ciklodextrin-származékok [39]. Királis anyagok inkorporálódása során az eredeti CD spektrum gyökeres megváltozása figyelhető meg pl. L-cocain és βciklodextrin illetve retinolsav és β-ciklodextrin kölcsönhatásakor [40,41]. A másik érdekes terület a fehérjék és gyógyszermolekulák kötödésének vizsgálata. A CD spektroszkópia alkalmas oldatfázisban lévő fehérjék rendezett szerkezeti elemeinek (β-kanyar, α-hélix, β-redőzött réteg) vizsgálatára illetve a fehérje spektrumából következtetni lehet egyes szerkezeti elemek százalékos mennyiségére [42]. A humán szérum albumin (HSA) esetében nem csak becsülni lehet ezen rendezett szerkezeti elemek mennyiségét a fehérjén belül,
15
hanem pontosan lokalizálni is lehet őket. A fehérjének ugyanis ismert a teljes aminosav szekvenciája, másodlagos és harmadlagos szerkezete [43,44] valamint legjellemzőbb kötőhelyei is. A tiszta fehérje CD spektruma a gyógyszermolekula kötődése után megváltozik. A spektrum változása jó indikátora a vendég-molekula kötődésének, sőt a kötődés helyére is következtetni lehet. CD spektroszkópiás módszerrel tanulmányozták a HSA benzodiazepin-kötő helyét [45], a szulfadimetoxin és fő metabolitjainak [46] valamint kinolon-karbonsavak kötő helyeit [47]. Ascoli és mtsai különböző gyógyszermolekulák sztereospecifikus és kompetitív kötődési tulajdonságait tanulmányozták differencia CD spektroszkópiás vizsgálattal HSA esetében [48]. 3.2.5
KIROPTIKAI DETEKTÁLÁS AZ ELVÁLASZTÁSTECHNIKÁBAN Az elválasztástechnikai módszereket (GC, HPLC, TLC, CE) széles körben
alkalmazzák mind a rutin vizsgálatokban mind pedig a kutatás-fejlesztés során. A bevezetőben említett okok miatt a legdinamikusabban fejlődő ágazat a királis anyagok elválasztásával foglalkozó terület és ezen belül is az enantiomerekkel foglalkozó közlemények nagy száma érdemel figyelmet. Jól mutatja a fejlődés ütemét az 1. ábra. Enantiomerekkel kapcsolatos közlemények száma (db/év) 800
Enantiomer
730
'Enantiomer' and 'Separation'
757
744
722 650
585
600
568
508 438
400 303 221
200 131
0
32 5
29 10
34 5
33 6
37 11
51 12
65
81
200
211
151
98
1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000
1.
ábra.
Enantiomerekkel illetve enantiomerek elválasztásával kapcsolatos közlemények száma az SCI. alapján
16
Az ábrán látható adatok nem abszolút számokat tükröznek, mivel csak azokat az irodalmi hivatkozásokat tudtam figyelembe venni, amelyeket a Science Citation Index (SCI) referál. A keresés során kulcsszóként elsőként csak az „enantiomer”, majd az „enantiomer AND separation” kombináció szerepelt. Az 1998-as évre kapott értékeket túl alacsonynak tartottam (57 és 13) ezért a statisztikából kihagytam. A 2000. évre beírt adat becsült adat. A 2000 október 22.-i dátummal frissített adatbázis 631-es enantiomer találata és a 253-as kombinációs keresés eredménye alapján becsültem meg az éves mennyiséget. A grafikonból jól látszik, hogy az enantiomerekkel kapcsolatos cikkek száma ugrásszerűen nőtt meg 1991-ben, de azóta is növekvő tendenciát mutat. Az enantiomerek elválasztásával kapcsolatos cikkek száma szintén növekedést mutat, de ez a növekedés sokkal egyenletesebb, mint az enantiomerekkel kapcsolatos összes publikáció mennyisége. Az utolsó másfél évben (1999-2000 június)
megjelent
összesen
370
enantiomer
elválasztással
foglalkozó
tudományos közlemény 48%-a (177) kapilláris elektroforézist (CE), 44%-a (163) nagyhatékonyságú folyadék kromatográfiát (HPLC) és a maradék 8% egyéb technikát alkalmaz. Tovább szűkítve a kört a HPLC-s technikára, összesen 3 közlemény jelent meg, amelyekben CD detektort alkalmaztak [49,50,51] és két alkalommal használtak egyéb optikai aktivitáson alapuló detektort. A
közeljövőben
várhatóan
tovább
fog
emelkedni
a
királis
CE
használatának aránya a HPLC-vel szemben, viszont a technikai lehetőségekből adódóan a CE/kiroptikai detektálás kombináció kivitelezése –kereskedelemben is hozzáférhető műszerek esetében – jelenleg még nem megoldott. Szintén növekedés várható a HPLC-CD technikát alkalmazó eljárásokkal kapcsolatos publikációk számában, amelyet alátámaszt az a tény, hogy 1998ban jelent meg az első, kimondottan CD-detektorként forgalmazott berendezés [52].
Megjelenéséig
csak
„házilag
barkácsolt”
illetve
a
kereskedelmi
forgalomban kapható spektropolariméterek átalakítása tette lehetővé ilyen irányú felhasználásukat. Gergely összefoglaló munkájában [53] áttekintő képet ad a kiroptikai detektorokról (OR és CD), azok felhasználási és alkalmazási lehetőségeikről. A CD detektálás előnyeit és hátrányait ismerteti részletesen Zukowski [54]. A
17
módszer legnagyobb előnye a szelektivitás. Akirális molekulák nem zavarnak, és így elvileg az eluens megválasztásában sincsenek korlátok.1. Előnyös, hogy elégtelen elválasztás esetén az akirális komponensek nem zavarják a meghatározást. Enantiomerek elválasztásánál pedig a szelektivitás egyedülálló, mivel
ellentétes
előjelű
kromatográfiás
csúcsokat
ill.
spektrumokat
detektálhatunk. Hátrányként sorolható fel, hogy az érzékenység nem mindig kielégítő, továbbá elsősorban az alacsonyabb hullámhosszaknál történő detektálások esetén a jel/zaj viszony intenzívebben romlik mint az UV detektorok esetében. A kiroptikai detektálás speciális esete az a módszer, amikor a kiroptikai detektort egy másik detektorral sorbakötve vagy szimultán használják. Ilyenkor a kiroptikai detektor a királis komponensek, -többnyire enantiomerek arányát méri-, míg az akirális detektor a minta összmennyiségéről ad felvilágosítást. E téren Mannschreck és mtsai [55 a-d] valamint Bertucci és mtsai [56 a-c] fektették le az alapokat, elsősorban enantiomer tisztaság vizsgálatra alkalmas HPLC-CD/UV eljárást kidolgozva, másodsorban az elválasztás során történő CD-spektrum
regisztrálás
terén
volt
úttörő
jellegű
munkájuk.
Fentiek
ismeretében sikerült az elveket általánosítani valamint a módszer alkalmazási területét lényegesen bővíteni és mind az on-line CD spektrum regisztrálás terén [57]* mind pedig a kettős detektálás témakörében új eredményeket elérni [58,59]*. Enantiomerek elválasztásának és az elválasztás nyomon követésének egyik speciális esete, -ahol a kettős detektálás előnyösen alkalmazható-, amikor olyan molekulák izomerjeit kell elválasztani, ahol a királis szénatom konfigurációja mellett a helikális kiralitásnak is döntő szerepe van, ráadásul a két módosulat (P, M) egymásba át is alakulhat. Ha az átalakulás sebessége és a kromatográfiás elválasztás időskálája azonos nagyságrendbe esik, úgy lehetőség van az egyes speciesek jellemzésére, azonban az elúció sorrendjének megállapításához szükség van az elválasztás során az egyes 1
Az eluenssel kapcsolatban azonban feltétlenül meg kell jegyezni, hogy a túl nagy abszorpció a
disszimetria faktort előnytelenül befolyásolja valamint alulról korlátozza a detektálás hullámhosszát és rontja a jel/zaj arányt.
18
csúcsokból felvett spektrumok vizsgálatára is. A racém keverékként forgalomba kerülő Tofizopám esetében a kromatografálás közben felvett on-line CD és UV spektrumok
alapján
lehetőség
volt
az
egyes
izomerek
spektrumának
rögzítésére és a négy izomer elúciós sorrendjének a megállapítására is [60]. 3.2.6.
ENANTIOMEREK MEGHATÁROZÁSA ELVÁLASZTÁSTECHNIKA ALKALMAZÁSA NÉLKÜL
Enantiomerek egymás mellett történő meghatározásának kétségkívül leggyakrabban alkalmazott módszere az, ha az enantiomerpárokat egymástól valamilyen szeparációs technika segítségével elválasztják. Ez vagy királis állófázison történő elválasztást jelent, vagy az elválasztás során az eluensben valamilyen királis segédanyagot oldanak és az on-line képződő diaszereomerek különböző tulajdonságai alapján válnak el az enantiomerek. Ilyenkor már nincs szükség királis állófázisra sem. A harmadik lehetőség az, amikor valamilyen diasztereomerpár-képző reagenssel előzetesen diasztereomerré alakítják az enantiomereket, majd szintén akirális körülmények között történik meg az elválasztás. Elválasztástechnika alkalmazása esetén azonban nincs feltétlenül szükség kiroptikai detektálásra, legfeljebb az elúció sorrendjét nem lehet a regisztrált kromatogramból közvetlenül megadni. A szakirodalomban leggyakrabban alkalmazott, nem syeparáción alapuló módszer az enantiomer arány meghatározására az HNMR spektroszkópia [61]. Királis shift reagenseket alkalmazva a képződő diasztereomer komplexekben különböző kémiai eltolódással jelennek meg bizonyos protonok jelei az egyik illetve a másik diasztereomer komplexben [62,63] Ladányi és mtsai termoanalitikai eljárást dolgoztak ki selegilin enantiomer összetételének vizsgálatára [64]. Purdie réz(II)-tartarát tartalmú komplexek segítségével vizsgálta efedrin és pszeudoefedrin enantiomerek tisztaságát [17]. A kromatográfiában alkalmazott kettős CD/UV detektálás alapelvét felhasználva a két jel hányadosán alapuló enantiomer arány meghatározására szolgáló
általunk
kidolgozott
módszerünkről
fejezetében írok részletesen.
19
[65]*
e
dolgozat
későbbi
4.
MÓDSZEREK
4.1 KIROPTIKAI MÓDSZEREK 4.1.1
AZ OPTIKAI AKTIVITÁS ALAPFOGALMAINAK ÁTTEKINTÉSE Az optikai aktivitás jelenségét kvarckristályok optikai vizsgálata során
1811-ben Arago fedezte fel, aki megállapította azt is, hogy a kristályrács felbomlásával az optikai aktivitás megszűnik. Nem sokkal később Biot (1815) a borkősav oldatában is felfedezte ezt a jelenséget. A következő nagy lépést Pasteur tette meg, amikor szőlősavból jobbra és balra forgató borkősavat izolált. Feltételezése szerint a különbségeket a molekulák térszerkezetére lehetett visszavezetni és egyben arra is magyarázatot adott, hogy oldatfázisban miért mérhető optikai aktivitás. Az idő és a tudomány Pasteurt igazolta. A szerkezetvizsgáló módszerek fejlődésével manapság már igen nagyméretű és bonyolult molekulák (pl. fehérjék) térszerkezetét is fel lehet deríteni. Egy molekula térszerkezetét két alapvető izoméria, a konfigurációs és a konformációs izoméria határozza meg. A konfiguráció az egy atomhoz közvetlenül kapcsolódó atomok vagy atomcsoportok relatív helyzetét írja. le. Azonos konstitúciójú, de különböző konfigurációjú molekulák egymásba csak kémiai kötés/ek/ felszakításával alakíthatók át. A konfiguráció leírására elsőként az Emil Fischer által javasolt D és L megkülönböztetést használták. Fischer a cukrok konfigurációját kémiailag a jobbra forgató és általa D-vel jelzett glicerinaldehidre vezette vissza. Centrális kiralitás esetén a centrális atomhoz kapcsolódó szubsztituensek sorrendjének leírására napjainkban a Cahn-Ingold-Prelog konvenció alapján történik és attól függően, hogy a körüljárási irány az óramutató járásával megegyező, vagy ellentétes, annak függvényében az R (rectus=jobb) vagy S (sinister=S) jelölést alkalmazzuk. A konformáció az egymáshoz közvetlenül nem kapcsolódó atomok vagy atomcsoportok egymáshoz viszonyított relatív helyzetét írja le. Az egyszeres kötések mentén történő rotáció során az egyes rotamerek különböző energiájú állapotokat képviselnek, ennek megfelelően energetikailag kedvezőbb energiaminimumok és kedvezőtlenebb energiamaximumok
20
jellemzik
az egyes
konformációkat. A konformerek energiatartalmuktól függően eltérő populációval rendelkeznek
egymásba
átalakulhatnak,
így
konformációs
egyensúlyok
jöhetnek létre. A rotáció időskálája meglehetősen kicsi, így a legtöbb fizikokémiai vizsgáló módszerrel csak az egyensúlyi állapotot tudjuk vizsgálni. Meglehetősen nagy, mintegy 25 kcal/mol energiagát szükséges ahhoz, hogy két konformert el lehessen választani egymástól, azaz a molekulának ekkora energiával kell rendelkeznie, hogy egyik stabil konformációból egy másik stabil konformációba billenjen át. Fentiek alapján a térszerkezet leírásakor a konfiguráció, a konformáció és a molekula dinamikáját együttesen kell szemlélni. A centrális kiralitás mellet (amely a molekulák kiralitásának hordozója az esetek túlnyomó többségében) feltétlenül meg kell említeni az axiális, a planáris és a helikális kiralitás lehetőségét is [66]. Gyógyszer és biomolekulák kiroptikai vizsgálata során elsősorban a centrális és a helikális kiralitásnak van nagy jelentősége. Amennyiben egy molekula esetében csak egy királis centrum van, akkor konfigurációját tekintve ennek a molekulának csak egy konfigurációs izomerje lehet. A két molekula egymásnak tükörképi párja és egymásnak enantiomerjei. Több királis centrum (n) esetén 2n sztereoizomer építhető fel, azonban ezek közül csak a tükörképi molekulák enantiomer párok, a többi izomer egymással diasztereomer viszonyban áll. A diasztereomer vegyületek fizikai-kémiai tulajdonságai eltérőek /pl. oldódási vagy megoszlási tulajdonságaik különbözőek, így kromatográfiásan egymástól akirális körülmények között is elválaszthatók/, az enantiomer párok esetében a legtöbb fiziko-kémiai tulajdonságban nincs különbség, közvetlenül csak királis kromatográfiával szeparálhatók. Kiroptikai módszerekkel azonban az enantiomerek megkülönböztethetőek és meghatározhatók.
21
4.1.2
A KIROPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA MÓDSZEREI A kiroptikai spektroszkópia tárgykörébe két alapvető spektroszkópiás
módszer tartozik: 1.)
Az optikai rotációs diszperzió (ORD) és
2.)
A cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia.
E két alapmódszer mellett számos, napjainkban még analitikai célra kevéssé használt eljárás, mint pl. a lineáris dikroizmus /LD/, a külső mágneses tér által indukált optikai aktivitás mérésére alkalmas magnetooptikai eljárások /MORD, MCD/, a folyadékkristályok által indukált cirkuláris dikroizmus /LCICD/, a fluoreszcenciás
emissziós
CD
/FDCD/
és
a
cirkulárisan
polarizált
lumineszcencia /CPL/ említhető. 4.1.3 ELMÉLETI ALAPOK Az abszorpciós spektrofotometriában használatos fénysugár összetevői között nem találunk kitüntetett rezgési síkot. A kiroptikai spektroszkópiában azonban ebből a heterogén rezgési sík halmazból kiszűrik azokat a komponenseket, melyeknek rezgési síkja eltér egy meghatározott síktól és csak az egy engedélyezett síkban rezgő komponens halad át a szűrőn, amelyet lineárisan polarizált fénysugárnak neveznek. A lineárisan polarizált fénysugár két egymással ellentétes, cirkulárisan polarizált komponensre bontható fel (más szemszögből nézve azok eredőjének is tekinthető). A cirkulárisan polarizált fénykomponensek bal vagy jobb csavarmenetnek megfelelően mozognak. A helikális és az előre mutató elmozdulás egy időben történik meg és rezgési amplitúdója állandó. Akirális közegen áthaladva mindkét komponens azonos mértékben abszorbeálódik, a rezgési sík változatlan marad, csak a rezgés amplitúdója csökken az abszorpció következtében. Abban az esetben azonban, amikor a polarizált fény királis közegen halad keresztül, a két komponens törésmutatója /nj és nb/ -ezzel összefüggésben a közegben való haladás sebessége- valamint abszorpciója is különböző lesz. Az abszorpció különbségből adódóan a két fénysugár eredő vektora egy ellipiszist fog leírni, a fáziseltolódásból adódóan pedig ennek az ellipszisnek a
22
nagytengelye α fokkal el fog hajolni. Ez az α érték az elforgatás szögét (forgatóképesség) adja meg egy adott hullámhossznál. Az egyes anyagokra jellemző forgatási értéket a fajlagos vagy a moláris forgatóképességgel szokás megadni. A fajlagos forgatás [10-1fok cm2 g-1] (1) és moláris forgatás [10 fok cm2 mol-1] (2) a következő egyenletekkel adható meg:
[α] Tλ =
α l×c
(1.)
ahol ’l’ a rétegvastagság [dm], c pedig a koncentráció [g ml-1] T [ α]λ M [Φ] = T λ
(2.)
100
A forgatóképesség változását a hullámhossz függvényében ábrázolva ORD spektrumot kapunk. Az ellipszis kis- és nagytengelye által bezárt szög arcus tangense az ellipticitás ( Θ ). A moláris ellipticitást [Θ] a 3. képlet fejezi ki.
[Θ]Tλ =
Θ×M = 3300 × ∆ε l × c × 100
(3.)
ahol ∆ε a moláris cirkuláris dikroizmus. [ 1 × mol-1 ×cm-1]. Az ellipticitás változása a hullámhossz függvényében a CD spektrumot eredményezi. A harmadik egyenletben szereplő ∆ε tag egyben a diszimmetria faktor (g) megadásánál is fontos. A diszimmetria faktor a molekula moláris cirkuláris dikroizmusának és moláris abszorbanciájának a hányadosa. (4.) Az ellipticitás annál előnyösebben mérhető, minél magasabb a g-érték az adott hullámhossznál.
g=
∆ε ε
23
(4.)
4.1.4 AZ UV-VIS , A CD ÉS AZ ORD SPEKTROSZKÓPIA ÖSSZEHASONLÍTÁSA
Mindhárom módszer hullámhossz-tartománya ugyanaz. Az UV spektrum nagy
intenzitású
sávokat,
széles
burkológörbéket ad. Míg az UV-VIS
εj
spektrumok a molekulában előforduló kromofór
csoportok
esetenként
minőségére
elhelyezkedésére
és
jellem-
εb
zőek, a CD spektrumok a kromofórok térbeli
elrendeződéséről,
molekulák
vagyis
térszerkezetéről
a
adnak
nj
felvilágosítást. A CD spektrum esetén a jobbra (εj) és a balra (εb) cirkulárisan polarizált
fény
különbségét
abszorbanciájának detektáljuk,
ebből
nb
∆ε≈ (ε b-ε j)=∆ε ∆ε≈CD
következően a CD sávok lehetnek pozitív
vagy
negatív
előjelűek.
A
spektrum előjele a molekula kiralitásától függ. A sáv intenzitásának maximuma ugyanannál
a
hullámhossznál
jelentkezik,
mint
az
UV-VIS
(n j-n b)≈α
spektrumban. Az elektrongerjesztéses spektrumok átfedő sávjai itt jobban elkülönülnek, élesebbek és a rezgési finomszerkezet
is
jobban
2. ábra.: CD, UV és ORD görbék összefüggései
meg-
figyelhető. A CD és az ORD spektrum egymásba átszámítható, az egyik a másik ismeretében megszerkeszthető. Az átszámítást a Krönig-Kramers egyenlettel lehet megoldani. Az ORD spektrum egy maximummal és egy minimummal
rendelkező
görbe
királisan
perturbált
kromofór
csoportot
tartalmazó molekula esetén. Elvileg kétszer annyi maximumot és minimumot tartalmaz, mint egy CD spektrum, ezek azonban a valóságban gyakran összeolvadnak, ezért nehezebben értelmezhetők, mint a CD spektrumok. Az 24
ORD görbe inflexiós pontja megegyezik a λmax értékével. A görbe elnevezése a nagyobb hullámhosszú Cotton hatás előjele szerint történik. Az ORD görbe csak a jelváltás hullámhosszán egyenlő nullával, így kiértékelése nehéz, több komponens esetén bonyolult spektrumot eredményez. A CD spektrum előnye, hogy az ellipticitás gyakran nulla, így kiértékelése egyszerűbb. Az ORD spektrum akkor előnyös, amikor a vizsgált molekulának a távoli UV tartományban (λ<180 nm) van elnyelése. Ebben a tartományban már nem lehet rutinszerűen
mérni,
viszont
ezeknek
a
sávoknak
hatása
magasabb
hullámhosszaknál is érvényesül, ellentétben a CD-vel, ahol csak az abszorpciós sáv hullámhossz tartományában van ellipticitás. A fentebb elmondottakat az 1. táblázatban foglalom össze. 1. táblázat: Az ORD és CD spektroszkópia legfontosabb tulajdonságainak összehasonlítása ORD
CD
Van
Nincs
Mit mérünk?
Háttér vagy vázhatás okozta optikai rotáció
Királis vagy királisan perturbált kromofórok okozta ellipticitás
Alkalmazási tartomány
Abszorpciós sávokon kívül (is)
Csak az abszorpciós sáv
Van
Többnyire nincs
Nincs
Van
Háttér vagy vázhatás
Kromofór sávok között átfedés Szelektív mérési hullámhossz
A CD spektrumok fölvételére a dikrográf, míg az ORD spektrum mérésére a spektropolariméter szolgál, bár az utóbbi időben a dikrográf helyett is spektropolariméter elnevezés használatos mind az irodalomban, mind pedig a műszergyártó cégek kiadványaiban. A Jasco cég által gyártott dikrográfot – amilyennel a disszertációs munkám során én is dolgoztam- a gyártó cég is spektropolariméter megnevezéssel illeti, ezért dolgozatomban a továbbiakban a spektopolariméter elnevezést használom.
25
4.2 A NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA /HPLC/ ÉS A KIROPTIKAI DETEKTÁLÁS
A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia működési elvével, elméleti hátterével és általános felhasználási lehetőségeivel jelen dolgozatban nem kívánok foglalkozni, mivel napjainkra minden fontos információ könnyen hozzáférhető tankönyvekből, szakkönyvekből és tudományos folyóiratokból. Napjainkban a jelentős műszergyártók (Hawlett Packard, Merck stb.) és kromatográfiás kiegészítőket (pl.: oszlopok, állófázisok stb.) forgalmazó cégek is
külön
kézikönyveket
jelentetnek
meg
egy-egy
analitikai
célfaladat
kivitelezéséhez szükséges információk minél könnyebb áttekintéséhez. A nyilvánvaló reklám mellett ezek a kézikönyvek számos, jól használható információval és tanáccsal segítik munkánkat. A legjelentősebb kromatográfiás szakfolyóiratok mellett az analitikai profilú folyóiratok is nagy számban közölnek kromatográfiás meghatározásokat, új eljárásokat és műszerfejlesztésről szóló cikkeket. Jelen fejezetben a többkomponensű elválasztások esetében gyakran előforduló részleges elválasztások felismerésével, átfedő kromatográfiás csúcsok
felbontásával
/dekonvolució/
és
a
csúcshomogenitás
meghatározásával kívánok részletesen foglalkozni. 4.2.1.1
CSÚCSHOMOGENITÁS VIZSGÁLATÁRA ALKALMAZOTT MÓDSZEREK
A kromatográfiás csúcshomogenitás vizsgálata napjaink analitikájának nagyon fontos területe, amelyet az e témával foglalkozó közlemények magas száma is alátámaszt. Gyakran előfordul, hogy egymástól megfelelően el nem választható anyagok esetében a kromatográfiás csúcs nem mutat észrevehető torzulást. Gyakori, hogy két igen közeli retenciós idővel eluálódó komponens hasonló intenzitású csúcsa olvad össze megfelelőnek látszó szimmetriájú csúccsá vagy a retenciós idők teljes azonossága esetén valóban egyetlen csúcs jelentkezik. Több ízben előfordul, hogy közeli retenciós idők esetében a viszonylag kis koncentrációban lévő anyag jelenlétét nem lehet felismerni a kromatogramon.
26
További problémát jelenthet, ha az egyik komponens nagy feleslegben van a másikhoz képest és a minor komponens detektorjele kisintenzitású. Ilyenkor viszonylag tömény oldatokat kell alkalmazni, aminek eredménye a ’leadinges’ vagy ’tailinges’ csúcs. Fentiek miatt magasabb igényű kromatográfiás munka megköveteli a csúcs homogenitásának vizsgálatát. Ennek legelterjedtebb - ma már klasszikusnak számító - módszere az un. hányados módszer, amikor két megfelelően kiválasztott hullámhosszon megmért abszorpció arányát vizsgálják az idő függvényében. Homogén csúcsok esetében csúcs teljes hosszában konstans értéket kapunk. [67 a-e]. A
diódasoros
detektorok
elterjedésével
tetszés
szerinti
számú
abszorbancia érték folyamatos regisztrálása is megoldható, így a két hullámhosszon történő detektálásnál érzékenyebb és több információt nyújtó matematikai megoldások születtek csúcshomogenitás vizsgálatára. [68 a-l]. A
spektrumszupressziós
technikát
is
megfelelő
érzékenységgel
alkalmazták a csúcshomogenitás ellenőrzésére[69 a-c]. A kiroptikai detektorok illetve a szimultán kettős kiroptikai/abszorpciós detektorok
hasonló
homogenitásának
elven
képesek
ellenőrzésére,
mint
átfedő a
kromatográfiás
diódasoros
csúcsok
UV-detektorok.
A
nagysebességű spektrumfelvétel a kromatográfiás csúcs környezetében a komponensek teljes spektrális analízisét teszi lehetővé [57]*, részleteiről az „Eredmények” és a „Megbeszélés” fejezetben lesz szó. A CD/UV kettős detektálás sok tekintetben hasonlít a két hullámhosszú UV-detektáláshoz, azonban az előbbihez képest számos előnye van. Két eltérő fiziko-kémiai módszerrel történő detektálás esetében nagyobb annak a statisztikai valószínűsége, hogy két hasonló szerkezetű, tehát kromatográfiásan hasonló tulajdonságokkal rendelkező és ezért nem, vagy csak részlegesen elváló
anyag
esetében
különbséget
lehet
találni
a
fiziko-kémiai
paraméterekben. Ez elvileg bármilyen két detektortípus kombinálására érvényes, mi a lehetőségeinkből adódóan a CD/UV detektálást alkalmaztuk az elvek gyakorlati megvalósításakor. [58]*
27
4.2.1.2
A
SZIMULTÁN KETTŐS
CD/UV
DETEKTÁLÁS ELVE ÉS ALKALMAZÁSÁNAK
FELTÉTELEI A CSÚCSHOMOGENITÁS VIZSGÁLATÁBAN
Elválasztástechnikai műveletek során gyakran előfordul, hogy az eluálódó anyagok mindegyikét nem tudjuk tökéletesen elválasztani, az anyagok csúcsai átfedik egymást. Ilyen esetekben fontos tudni, hogy melyik az a tartomány, amely tisztán tartalmazza az egyes komponenseket és a kromatogram melyik része az, ahol az elválasztás elégtelenségéből adódóan egynél több komponenstől származik a detektorjel. Kémiailag nagy hasonlóságot mutató anyagok esetében a fizikai-kémiai (pl. spektroszkópiás és kromatográfiás) tulajdonságok is általában nagy hasonlóságot mutatnak. Amennyiben a kétféle detektorjel a koncentrációval egyenes arányban változik, úgy felírható a következő két összefüggés: SA=A×C és SB=B×C
(4., 5.)
ahol SA az A típusú detektorjel (signal), SB a B típusú detektorjel, A és B az anyagra jellemző intrinsic mérőszám (pl. ε a spektrofotemetria esetén) és C a minta koncentrációja. A kétféle jelet elosztva egymással jutunk a (6) összefüggéshez: G=
SA SB
=
A ×C B×C
(6.)
A 6. egyenletből következik, hogy az így kapott hányados, -mivel a koncentrációkkal egyszerűsíteni lehet- gyakorlatilag csak A és B értékektől (amelyek az anyagra jellemző intrinsic paraméterek) függ, és a koncentrációtól független, az anyagra jellemző konstans érték lesz. Egynemű minta esetén az időtengellyel párhuzamosan fut , eltérése a kromatogram alapvonalától fenti konstans értékkel egyenlő abban a tartományban, ahol a detektor az anyagot érzékeli. Minimális a valószínűsége annak, hogy két anyag esetében ‘A’ és ‘B’ minden hullámhossznál megegyezzen, ezért a kapott hányados különböző anyagok esetében más és más lesz. Fenti elv alkalmas lehet bizonyos körülmények között az anyag azonosítására is.
28
Két vagy több komponens esetében az egymást részlegesen átfedő csúcsoknál az átfedés helyén a két el nem váló komponens detektor-jeleinek arányát fogja mutatni a „hányados kromatogram” a tiszta anyagra jellemző vízszintes
szélsőértékek
között
(3.ábra).
8
S1 tR2
Kiroptikai előnyt
detektáláskor
jelent,
hogy
további
az
előjel
függvényében a kapott hányados negatív
értéket
módszer
elvileg
detektor
esetén
is
felvehet.
bármilyen
4
0
A két
-4 0
alkalmazható,
gyakorlatban azonban akkor van
5
kétféle detektálási módszer közel azonos érzékenységű. Ha ez a nem
teljesül
úgy
10
TIME 2
S1/S2 S3/S1 S3/S2
lehetőség felhasználására, ha a
feltétel
S2 S3
t R1
1
0
-1
előfordulhat az az eset, hogy SA>0 míg
SB=0
(azaz
a
B
detektor még nem érzékeli az anyagot). Ebben az esetben a hányados-képzés
0
típusú
matematikai
szempontból értelmetlen (osztás
5
10
TIME
3. ábra.: Különböző típusú detektorokból származó modellezet detektorjelek (S1, S2, S3) /fent/ és a belőlük képezhető hányadosok /lent/
zéróval). Gyakorlati szempontból a problémát az jelentheti, hogy az alapvonal viszonylag nagy frekvenciájú, de kis intenzitású jelsorozatnak tekinthető /zaj/ és a két különböző tipusú zajból képzett hányados igen nagy abszolút értékű hányadosokat szolgáltathat. Ez a tényező elsődlegesen az eredmények prezentációját
zavarhatja,
eliminálására
több
megoldás
adódik.
Legkézenfekvőbb, ha a hányados képzést ténylegesen csak a kromatográfiás csúcs/ok/ közvetlen környezetében végezzük el. Matematikai módszerekkel (pl.:Fourier-analízis) szintén eliminálható a zaj, ehhez azonban többnyire nagyon drága célszoftver szükséges. A zaj csökkentésére a simítást végző algoritmusok nem használhatók, mivel ezek az egymást követő mérési adatok
29
átlagolásán alapulnak. Abban az esetben, ha a zaj és a hasznos jel azonos nagyságrendbe esik, és a csúcs maximumának közelében a hasznos jelet valamilyen nagyobb intenzitású zaj torzítja, úgy a tényleges retenciós idő az átlagolás
következtében
elcsúszhat.
Így,
-a
két
detektálási
módszer
különbözőségéből adódóan- a simított görbéken a retenciós maximumok nem lesznek szinkronban és a hányados kromatogramon a torzított retenciós időnek köszönhetően nem fogjuk megkapni a várt lineáris szakaszt. További problémát jelenthet a gyakorlati munka során, ha az alapvonal -számos tényező eredményeként- nem követi az y=0 konstans függvényt, hanem az idő függvényében változik, valamint az is, ha a t=0 időpontban a detektorjel abszolút intenzitása nagyobb mint ’0’. Ebben az esetben a kromatogram intenzitás értékeit egy lineáris függvénnyel úgy kell korrigálni, hogy az alapvonal az y=0 értéknél legyen. Ha az alapvonal nem lineáris függvény szerint változik, a probléma akkor sem megoldhatatlan, általában valamilyen egyszerűbb polinom függvénnyel a korrekció megoldható. Az alapvonal korrekciója nélkül nem kapható az alapvonallal párhuzamosan futó hányados kromatogram. E megállapítás igazolására két, az irodalomban fellelhető példa szolgál [70,71]. Mindkét közlemény kiroptikai detektáláson és a hányadosképzési
elven
alapuló
enantiomertisztaság
meghatározással
foglalkozik, azonban az eredmények illusztrálására szolgáló egyes ábrákon jól látható a hányados kromatogram torzulása.
4.2.2.1
ÁTFEDŐ KROMATOGRÁFIÁS CSÚCSOK DEKONVOLUCIÓJA
Validált komponensek
kromatográfiás
módszerek
esetében,
amikor
kvantitatív
meghatározás,
illetve
szennyező
az
egyes anyagok
azonosítása a cél valamelyik szeparációs technikával, akkor természetesen nincs szükség a fejezet címében megnevezett eljárás alkalmazására. Módszerfejlesztésnél, új eljárások kidolgozása során, preparatív munkánál amikor nagy koncentrációjú oldatokból kell a komponenseket szétválasztaniazonban feltétlenül szükséges, hogy olyan eljárások birtokában legyünk, amelyek
segítségével
egy
kromatogramról
30
el
lehet
dönteni,
hogy
a
kromatográfiás csúcs homogén és az egy anyagtól származik, illetve fontos annak az eldöntése is, hogy a detektorjel két vagy több anyagtól származik-e. Szimmetrikus csúcsok esetében az átfedés mértéke aránylag könnyen megbecsülhető, ha a retenciós idők nem esnek egybe, mivel az elméleti haranggörbe legkisebb torzulása is egynél több anyag jelenlétét jelzi. Aszimmetrikus csúcsok (leading, tailing) esetében annak az eldöntése az elsődleges feladat, hogy a csúcs egy anyagtól származik, de a retenciót valamilyen nem várt hatás befolyásolja, vagy egynél több anyagtól származó jelek olvadnak eggyé. Ezt a problémát az előző fejezetben (4.2.1.2) tárgyalt hányados képzést alkalmazva oldottuk meg. Az átfedés mértékének meghatározásához szükséges, hogy valamilyen módszerrel meghatározzuk az egyes komponensekhez tartozó csúcsok valódi alakját. A felbontott görbék alapján meghatározható a csúcs alatti terület és így a minta koncentrációja is. A többkomponensű rendszerek esetében az átfedő csúcsok leírására és felbontására számos eljárás ismert, amelyekről több összefoglaló munka is megjelent az utóbbi időben. Felinger elsősorban a matematikai módszereket tekinti át [72], míg ennél általánosabb és szélesebb körű összefoglaló jellegű másik munkája kitér a jelen dolgozat szempontjából is fontos hányados képzési módszerekre [73]. Sharaf [74] a csúcsfelbontás vizsgálatának lehetőségeit alapvetően két nagy csoportban tárgyalja: Az első csoportba azokat a módszereket sorolja, amelyek segítségével egycsatornás detektorokból származó jelek alapján lehet a csúcs tisztaságát és az átfedés mértékét megbecsülni. Ide tartoznak a görbeillesztési módszerek, melyek közül a legtöbbnek az alapja az exponenciálisan módosított Gaussi függvény /EMG/.[75,76] Berthod e módszernek az irodalomban fellelhető hibáira mutat rá [77]. Előbbi szerző egy későbbi munkájában különböző, a normál eloszlást módosító függvényeket javasol a legáltalánosabban előforduló kromatogramok
modellezésére
[78].
A
Gaussi
függvény
exponenciális
módosítása mellett a polinom függvényekkel módosított Gaussi függvény (PMG) is alkalmas kromatogramok leírására, szimulálására és felbontására
31
[79]. A kromatogram alakjának leírásában a Fourier transzformációs eljárás [80] és a kiterjesztett Kalman filter használata is nagy segítséget nyújt [81]. A második csoportba azok az eljárások tartoznak, amelyek két detektor használatát feltételezik, vagy két-, esetleg több-csatornás detektorból származó jelek feldolgozásával szolgáltatnak a csúcsok felbontásához szükséges adatokat. Ezeknek a módszereknek alapjául az előző fejezetben (4.2.1) már említett csúcshomogenitási eljárások szolgálnak 4.2.2.2 CSÚCSFELBONTÁS
ELVÉNEK
LEÍRÁSA
A
SZIMULTÁN
KETTŐS
CD/UV
DETEKTÁLÁST KÖVETŐ HÁNYADOSKÉPZÉS ALAPJÁN
Abban az esetben, amikor szimultán kettős detektálást alkalmazunk, és a hányados kromatogramot is előállítjuk, elégséges adat áll rendelkezésre a csúcsok felbontására [59]*. A hányados képzés során igaz, hogy a hányados kromatogramból bizonyos információk elvesznek (pl.: az egyes komponensekre jellemző koncentráció), azonban olyan információk is rendelkezésünkre állnak, amelyek egyetlen kromatogramból a rendszer alulhatározottsága miatt nem extrahálhatók ki. Az irodalomban -annak ellenére-, hogy a hányados képzés egy széles körben elterjedt módszer, még ezt a felhasználási lehetőséget nem írták le, így ez újdonságnak tekinthető és a módszer matematikai levezetését az alábbiakban adom meg: Két anyag (A és B) elválasztása során kettős detektálást alkalmazva két detektorjel regisztrálható: S1=s1A + s1B
(7)
S2=s2A + s2B
(8)
ahol (S1) az egyes típusú detektor, (S2) a kettes típusú detektor által regisztrált jel, míg s1A ,s1B , s2A és s2B az A és B anyagtól származó jelkomponens. A két detektorjel hányadosát képezve, az anyagra jellemző, koncentrációtól független konstans értéket kapunk ott, ahol csak az egyik komponens található az elutumban (9,10). Részlegesen elváló anyagok esetében a kromatogramban általában találhatók ilyen szakaszok mind az A, mind pedig a B komponensre.
32
s1A/s2A=RA
(9)
s1B/s2B=RB
(10)
ahol RA a tiszta A anyagra jellemző hányados, RB pedig a tiszta B anyagra jellemző hányados. Amennyiben két anyag együtt eluálódik, és az arányuk állandó, úgy a csúcs homogén, de nem tiszta. Ilyenkor a hányados értéke eltér a tiszta anyagok esetében kapható hányadostól és ez adhat információt arra nézve, hogy nem egy anyag van az elutumban. Amennyiben a két komponens egymáshoz viszonyított aránya az idő függvényében változik -tehát a csúcs nem homogén- úgy a hányados értéke a két
komponenstől
származó
detektorjelek
összegének
arányában
fog
változni(5). S1/S2= (s1A + s1B )/ (s2A + s2B )=R
(11)
ahol R a nem homogén elutum esetében kapható hányados érték. Fenti egyenletekből (7-11) s1A, s1B, s2A és s2B kifejezhető. A matematikai levezetést és az egyes anyagoktól származó egyedi detektorjelek számolására alkalmas lehetséges megoldások egyikét a következőkben adom meg. A 2. típusú detektor által mért jelből származó értékek számítása: R(s2A+s2B)=s1A+s1B (12)
s1A=RAs2A (13);
s1B=RBs2B (14)
Rs2A+Rs2B=RAs2A+RBs2B
(15)
Rs2A-RAs2A=RBs2B-Rs2B
(16)
s2A(R-RA)=s2B(RB-R)
(17)
A (8) egyenlet átalakításával kapható (18) egyenletet s2A=S2-s2B
(18)
a (17)-be behelyettesítve jutunk a következő összefüggéshez: (S2-s2B)(R-RA)=s2B(RB-R)
33
(19)
Ebben az egyenletben (19) csak s2B értéke ismeretlen, a többi tag mért vagy számított és ismert érték. A következő két lépésben (20-21) jutunk el a (22) egyenlethez, amelyből s2B kifejezhető (23). S2R-S2RA-s2BR+s2BRA=s2BRB-s2BR
(20)
S2R-S2RA=s2BRB-s2BR+s2BR-s2BRA
(21)
S2(R-RA)=s2B(RB-R+R-RA)
(22)
s2B=S2(R-RA)/(RB-RA)
(23)
(23)-ból és (8)-ból pedig az s2A érték számolható ki: s2A=S2- S2(R-RA)/(RB-RA)
(24)
Az 1 típusú detektor által mért jelből származtatható értékek számítása: (9) és (10)-ből s2A és s2B kifejezve: s2A=s1A/RA és s2B= s1B/RB S2=(s1A/RA)+(s1B/RB) továbbá:
S2=S1/R S1/R=(s1A/RA)+(s1B/RB)
valamint
S1-s1B=s1A
(25, 26) (27) (28) (29) (30)
(29) és (30) kombinálásával kapjuk a következő egyenletet: S1/R=((S1-s1B)/RA)+(s1B/RB)
(31)
Az egyenlet jobb oldaláról s1B értékét kell kifejezni: ((RA RBS1)/R)=S1RB-(s1BRB)+(RAs1B)
(32)
((RARBS1)/R)-(S1RB)=s1B(RA-RB)
(33)
34
R R S1 A B − RB R s1B = R A − RB
(34)
s1A értéke megadható (34) és (7) ismeretében:
s 1A
R R S 1 A B − R B R = S1 R A − RB
A fenti egyenletek alapján komponenseket komponensek
jellemző egyedi
a
regisztrált
hányados
detektorjelekből és a
értékekből
hozzájárulása
a
(35)
kiszámolható
detektorjelhez,
tiszta
az
egyes
azaz
görbe
komponenseire bontható. Amennyiben az egyes komponensek fajlagos vagy moláris koefficiense az adott rendszerben ismert, úgy a koncentráció-profil a felbontott görbék alapján kiszámítható. Kis intenzitású csúcsok, zajos alapvonal és hasonló nagyságú hányados értékek esetében előfordulhat, hogy a számítással kapott kromatogram leírásához valamelyik csúcsleíró módszer -EMG, polinommal módosított Gaussi függvény- is szükséges. A két módszer kombinációja azonban sokkal egyszerűbb matematikai megoldást eredményez, mert mindig csak egyetlen egy csúcsot kell paraméter illesztéssel leírni és nem egyszerre többet, mint amire az említett két matematikai módszer alapvetően hivatott.
35
5.
EREDMÉNYEK
5.1 A MÉRÉSEKHEZ HASZNÁLT MŰSZEREK, VEGYSZEREK ÉS MÉRÉSI KÖRÜLMÉNYEK LEÍRÁSA
5.1.1 MŰSZEREK 5.1.1.1
KIROPTIKAI MÉRŐMŰSZER
A kiroptikai és a szimultán CD/UV méréseket, valamint a kiroptikai detektálást Jasco J-720 típusú spektropolariméterrel* /JASCO LTD, Japan/ végeztük. A műszer egyidejűleg képes valamelyik kiroptikai jel (CD vagy ORD) és az abszorbciós jel mérésére 170-800 nm hullámhossz tartományban. Fényforrásként egy nagyenergiájú, vízhűtéses, 450 watt teljesítményű xenon lámpa szolgál. A lámpaházban keletkező ózon kiűzésére illetve keletkezésének megakadályozására, valamint az alacsony hullámhosszú méréseknél a lámpaház és a küvetta tér oxigén-mentesítésére nagytisztaságú nitrogén gázt használtunk legalább 3 l/perc áramlási sebességet alkalmazva. A műszer validálását a műszer bekapcsolása után egy önellenőrző program lefuttatásával a készülék automatikusan elvégzi. A hullámhossz és intenzitás értékek validálását a műszerkönyv előírásainak megfelelően ammónium-d-10-kámforszulfonsav referencia anyag (JASCO LTD, Japan) felhasználásával hetente ellenőrizzük. A műszer alkalmas spektrumok normál illetve nagysebességű –akár 5000 nm/perc– rögzítésére valamint egy hullámhossznál /time mode/ történő mérésre. A mérési paramétereket gondosan kell kiválasztani, mert a szoftver a 2000 darabban limitálja a rögzíthető adatpontok számát. A 30, egymást követően felvehető, nagysebességgel rögzített spektrum lehetőséget ad arra, hogy kromatográfiás elválasztás során az elutum egy bizonyos részletének teljes spektrális analízisét elvégezzük.
*
Fenti készülékeket az OTKA műszerpályázat (OTKA CO/182/A) és FEFA II pályázatok
támogatásából szereztük be.
36
A kromatográfiás mérések kivitelezéséhez egy Jasco LCCD-311 típusú, egyszerűen beépíthető illetve kiemelhető, fókuszálható lencserendszerrel ellátott átfolyós küvettát használtunk. amely térfogata 16 µl, hossza 5mm. 5.1.1.2
KROMATOGRÁFIÁS MÉRŐRENDSZER
A mérésekhez felhasznált kromatográfiás mérőrendszer elemei a következők: Az eluens egyenletes áramlásának biztosítását egy Jasco PU-980 Intelligent HPLC Pump /JASCO LTD, Japan/ típusú pumpával biztosítottuk, amely, mint általában a korszerű műszerek, bekapcsolás után elvégez egy önellenőrzési tesztet, ami egyben műszervalidálásnak is tekinthető. A minta adagolására szolgáló injektor egy Rheodyne 7725i típusú injektor, mely 20 µl-es mintaadagoló hurokkal rendelkezik. A típusszám mellett található ’i’ jelzés azt jelenti, hogy az injektor alkalmas automatikusan indítani a kromatogram rögzítését végző szoftver futását az injektálás pillanatában. A kromatogramok rögzítésére és kiértékelésére a BORWIN for Windows /ver.1.5/ kromatográfiás célszoftvert, az adatok feldolgozására a STATISTICA 5.0 for Windows illetve az EXCELL (MS OFFICE 97) szoftvereket használtuk. 5.1.1.3
KIEGÉSZÍTŐ MÉRÉSTECHNIKÁK
Azon méréseknél, ahol a közeg kémhatása lényegesen befolyásolta a mérési eredményeket, meghatároztuk illetve beállítottuk a pH-t. Ehhez RADIOMETER PHM93 REFERENCE pH METER mérőműszert (RADIOMETER, Dánia) és ROUSSELL PCMAW/S7/K (ROUSSELL, Skócia) típusú kombinált üvegelektródot használtunk. Az egységnyi hidrogénion aktivitás változására adott elektródválaszt minden mérés megkezdése előtt legalább négy, nemzetközileg elfogadott (IUPAC) hitelesítő oldattal ellenőriztük. Az alkalmazott pufferoldatok összetételét a következő oldalon található 2.táblázat tartalmazza:
37
2. Táblázat.: A National Bureau of Standards által elfogadott pufferoldatok adatai pH (20 °C)
alapanyag
koncentráció (mol/dm3)
1,68
kálium tetraoxalát
0,05
4,00
kálium-hidrogén-ftalát
0,05
9,22
bórax
0,01
12,63
Kalcium-hidroxid
telített oldat
A reakcióelegyek illetve a küvettatér termosztálásához LAUDA M3 (LAUDA GMBH, Németország) típusú termosztátot használtunk.
5.1.2
VEGYSZEREK, REAGENSEK, OLDÓSZEREK Az enantiomertisztaság meghatározásához kidolgozott kettős CD/UV
spektroszkópián
alapuló
elmélet
gyakorlati
igazolásához
olyan
modellvegyületeket kívántunk felhasználni, amelyek viszonylag olcsón, mégis nagy tisztaságban szerezhetők be, valamint a kiroptikai tulajdonságaik is megfelelőek. Fenti követelményeknek a fenilglicin és a mandulasav (FLUKA) /4.ábra/ kiválóan megfelelt. Az enantiomerpárok a minőségi bizonylat alapján 99% fölötti enantiomer és 99.9% fölötti kémiai tisztasággal rendelkeztek, amelyeket további tisztítás nélkül használtuk fel.
38
H
NH2 COOH
H2N
S-α-aminofenilecetsav (L(+)-fenilglicin)
R-α-aminofenilecetsav (D(-)-fenilglicin)
H
H COOH
OH COOH
HO
H COOH
S-α-hidroxifenilecetsav L(+)-mandulasav
R-α-hidroxifenilecetsav D(-)-mandulasav
4. ábra.:Fenilglicin és mandulasav enantiomerek képletei A kettős spektroszkópiás kromatográfiás- illetve a nagysebességű spektrumfelvételen alapuló csúcshomogenitás vizsgálatok modellezéséhez morfinvázas alkaloidokat választottunk. Munkacsoportunk egyik fő kutatási területe a különböző típusú kábítószerek kiroptikai analitikája. Az alapanyagokat (5.ábra) /morfin, kodein, oxikodon, hidrokodon/ a tiszavasvári ICN ALKALOIDA Vegyészeti Gyár bocsátotta rendelkezésünkre. R1
O
3
4
O
R3
13
14
5
R2
9
NCH 3
R1
R2
C 7-C 8
R3
név
H
OH
C=C
H
morfin
CH 3
OH
C=C
H
kodein
CH 3
=O
C-C
H
hidrokodon
CH 3
=O
C-C
OH
oxikodon
8
6 7
5. ábra.:A felhasznált morfinvázas alkaloidok képlete
39
Az
átfedő
kromatográfiás
csúcsok
felbontására
kidolgozott
eljárás
hatékonyságának igazolására a morfinvázas alkaloidokon kívül még két eltérő szerkezetű modell-vegyületet is alkalmaztunk. A metiltesztoszteron oximot laboratóriumunkban állítottuk elő. (6.ábra).
NH 2 OH CH 3 CH 3
OH
CH 3
MeOH (50
CH 3
H H
CH 3
o C)
E
H
CH 3
H H
HO
OH
H
N
O
OH Z
6. ábra.: Z- és E-metiltesztoszteron képződése 17-α-metiltesztoszteronból
A kiindulási vegyületként használt metiltesztoszteront a Richter Gedeon Gyógyszergyár, Budapest bocsátotta rendelkezésünkre. A hidroxilamin HCl (Aldrich) alt. minőségű volt. A másik felhasznált modellanyag egy pyrazino[2,1-b]quinazoline-3,6-dione származék volt /MM285a/ (7.ábra) amelynek szintézisét és szerkezetvizsgálatát Kökösi és mtsai végezték el [82].
CH3 N
*
N
N O
O 7. ábra.: (R,S)-1-methyl-2-phenyl-1,2,3,4-tetrahydro-(6H)pyrazino[2,1-b] quinazoline-3,6-dione [MM285a]
40
5.2 ENANTIOMERTISZTASÁG MEGHATÁROZÁSA 5.2.1
ENANTIOMER TISZTASÁG MEGHATÁROZÁSA SZIMULTÁN KETTŐS SPEKTROSZKÓPIA ALKALMAZÁSÁVAL
5.2.1.1
ELŐVIZSGÁLATOK
Mind a CD, mind az UV spektroszkópia szempontjából fontos, hogy megtaláljuk azt a pH- és koncentráció-tartományt, ahol a vizsgált molekula csak egyféle protonáltsági állapotban van, vagyis a gerjeszthetőség szempontjából homogénnek tekinthető az elektronikus állapota. A koncentráció és a mért jel között gyakran nem lineáris az összefüggés, ha homoasszociátum képződés lép fel (túl nagy koncentráció), vagy abban az esetben, ha kétféle ionizáltságú állapotban lévő részecskefajta van egyidőben a mérendő oldatban és ezen részecskék kölcsönhatása fennáll. A fenilglicinnél különösen akkor nagy az ionos asszociátumok képződésének lehetősége, amikor a karboxilát-csoport deprotonálva, az amino-csoport viszont protonálva van. Ilyenkor az ikerionos forma dominál és jelentős az ikerionos részecskék közötti kölcsönhatás lehetősége.
Ezt
kiküszöbölendő
meghatároztuk
a
fenilglicin és a mandulasav egy protonálódási álladóit. Ez a vizsgálat egyben a CD spektroszkópia ritkán alkalmazott felhasználási területének, az egyensúlyi kémiának az alkalmazhatóságára is jó példaként szolgált. Felvettük a CD spektrumokat
(8.ábra)
és
kiválasztottuk
a
protonálódási
állandó(k)
meghatározásához a legmegfelelőbb hullámhosszakat. Az ábra bal oldalán a 200-250 nm közötti nagyintenzitású aromás LA-sávhoz valamint a karboxilát csoporthoz rendelhető Cotton-hatás görbe, míg az ábra jobb oldalán a sokkal kisebb intenzitású aromás LB-sávhoz rendelhető, jellemző hármas maximummal jelentkező spektrumrészlet látható. Az LA-sávban történő mérés esetén mind a fenilglicin, mind a mandulasav karboxilát csoportjának protonálódási állandója érzékenyen meghatározható.
41
----- D-fenilglicin, ----- L-fenilglicin, ----- D mandulasav, ----- L-mandulasav 1200 40000
600 20000
Mol. Ellipt. [Θ] 0
0
-20000 -600
-40000 -1200 200
210
220
230
240
250
260
270
8. ábra.:Fenilglicin és mandulasav enantiomerek moláris CD spektrumai [Θ] Jelmagyarázat: D-fenilglicin, L-fenilglicin,D-mandulasav, L-mandulasav
Megállapítottuk, hogy a vizsgálati körülmények között a két molekula sem savban, sem pedig lúgban nem bomlik, így a méréseket egyszerűen el lehetett végezni. Két azonos koncentrációjú (0.4 mMol/dm3) törzsoldatot készítettünk a modellanyagokból. Az egyiket 0.1mol/dm3 koncentrációjú sósavval, a másikat 0.1 mol/dm3 koncentrációjú nátrium-hidroxiddal készítettük. A két egyenként 0.4mMol/dm3 koncentrációjú oldat különböző arányú elegyítésével a pH-t egyszerűen, körülbelül azonos lépésközzel beállítottuk úgy, hogy közben a mérendő komponens összkoncentrációja állandó maradt. A mandulasav csak egy protonálható csoporttal rendelkezik, a 200-250nm közötti hullámhossz tartomány elégséges és alkalmas a karboxilát-csoport protonálódási állandójának /KP/ meghatározásához. A CD-pH titrálási görbe egy proton megkötődését reprezentáló lépcsőt mutat /9.ábra/, gyakorlatilag pH=6nál magasabb pH értékeknél az ellipticitás nem változik, azaz a CD spektrum a teljesen deprotonált mandulasavra lesz jellemző.
42
140
CD
120
100
80
0
2
4
6
8
10
12
pH
9. ábra.: L-mandulasav CD-pH titrálási görbéje 221 nm-es hullámhossznál A mandulasav esetében 31 mérési pontból számoltok ki a protonálódási állandót. A savas és a lúgos oldat összeöntése után a pH-t, pontosabban az annak megfeleltethető mV értékeket, majd az oldatok ellipticitását megmértük. A pH mérés előtt az elektródot a korábban leírtaknak megfelelően kalibráltuk. A pH-mV értékek lineáris regresszióval történő megfeleltetése után a következő paraméterekkel lehetett leírni a függvénykapcsolatot: mV=356.4+(-58.46×pH) /r=0.9999/ A regressziós egyenes adataiból meghatároztuk az oldatok pH-ját. A mérési adatok kiértékelésére és a pK érték számolására több módszer alkalmas.
A
legelterjedtebben
a
Handerson-Hasselbach
egyenlet
(36)
használatos. pK = pH + log
Sx − SpH SpH − Sy
(36)
Az egyenletben Sx és Sy a teljesen protonált illetve teljesen deprotonált részecske esetében mérhető jelet szimbolizálja, míg SpH egy adott pH-nál a különböző arányban jelen lévő kétféle protonáltsági állapotú részecskét tartalmazó oldatban mérhető jel. A pH-t annak mérése folytán ismerjük, így a
43
pK érték kiszámolható. Attól függően, hogy a meghatározni kívánt állandó esetében a protonált vagy a deprotonált forma optikai jele nagyobb-e, illetve savról vagy bázisról van szó, az egyenlet módosulhat [83] A módszer hibája, hogy a szélsőértékek, tehát a teljesen protonált illetve teljesen deprotonált részecskéket
tartalmazó
oldatokban
mérhető
intenzitásértékek
hibája
befolyásolja a számítást, valamint csak a 30-70%-os protonáltsági állapotok között mért adatokból számolható ki pontosan a pK érték. A másik lehetőség az, hogy a teljes görbét leíró függvény paramétereit nemlineáris paraméterillesztéssel határozzuk meg. A legáltalánosabb formában az f(pH)=S összefüggés írja le ezeket az összefüggéseket. Ennél konkrétabban az egy protont felvevő rendszerekre az alábbiakban adható meg a függvény: S=x+((y-x)/(1+((10^KP)*(10^(-pH)))))
(37)
ahol S a mért jel, x és y a teljesen protonál vagy a teljesen protonálatlan részecskét tartalmazó oldatok mérésekor kapott jel, pH az oldat mért hidrogénion koncentrációjának negatív logaritmusa, KP pedig a meghatározni kívánt protonálódási állandó logaritmusa. A paraméter illesztéskor x és y értéke akárcsak a protonálódási állandó közelítő értéke az ábrából jól megbecsülhető. Egyszerűbb esetben, -mint a mandulasav-, gyakorlatilag mindegy, hogy milyen iterációs algoritmust használunk, lehetőségeinket csak a rendelkezésre álló számítógépes program határolja be. Az általam használt STATISTICA matematikai-statisztikai programcsomag a legáltalánosabban használ Quasi Newton és Simplex Matrix eljárások mellett a Hook-Jeeves féle illetve a Rosenbrock féle algoritmusokat illetve ez utóbbi ketőnek a Newton féle módszerrel kombinált változatát tartalmazza. A Newton féle iteráció ugyan gyors, de amennyiben a függvénynek nincs jóldefiniált minimuma, úgy meglehetősen pontatlan eredményt szolgáltat és könnyen „elfut” a megoldás mellett. Tapasztalataim szerint, főleg a több protonálódási lépcsőt tartalmazó függvények megoldásakor a Rosenbrock féle iterációs eljárás konvergál a leggyorsabban és adja a legelfogadhatóbb eredményt. A függvények paraméterinek keresése során a programban megadható, hogy a minimalizálás
44
milyen függvény szerint történjen, de legjobb a standardnak tekinthető eltérésnégyzet minimalizálást választani a kemometriai számítások során. A 9.ábrán látható CD-pH titrálási görbe esetén az alábbi paramétereket illetve statisztikai jellemzőket kaptam: KP=1531.3±15.1 (log KP=3.185±0.0054); x=146.2±0.116; y=84.4±0.08; r=0.99993 ; Az eltérések négyzetösszege (final loss, maradék):1.681 Négy párhuzamos kísérletet végezve -amelyek közül háromszor a dmandulasavat (I-III) egyszer pedig az l-mandulasavat (IV) alkalmaztuk- az alábbi eredményeket kaptuk. 3. Táblázat.: Mandulasav CD-pH titrálásakor kapott protonálódási állandói és azok statisztikai paraméterei mérés száma⇒ stat. param.⇓ log KP szórás maradék r
I (n=26)
II (n=29)
III (n=26)
IV (n=33)
3.183 ±0.0038 1.398 0.9999
3.187 ±0.0034 1.327 0.9999
3.185 ±0.0041 1.681 0.9999
3.183 ±0.0038 2.692 0.9999
A négy paralell kísérletből megkapható az átlagérték, annak a szórása, valamint –amint az a kemometriában ma inkább elterjedt paraméter-, az adott valószínűséghez tartozó konfidencia intervallum. A számított eredmények a következők: Átlag=3.184 StdDev=0.00192 Konfidencia sáv (95%)=3.181-3.187 Fentiekből következik, hogy a mandulasav esetében a további méréseket 1-nél kisebb pH-ju oldatokban célszerű elvégezni, itt ugyanis a karboxilát csoport teljesen protonált állapotban van, és a molekula nem rendelkezik töltéssel. 6-nál nagyobb pH-ju oldatok esetében a teljesen deprotonált részecske van jelen, azonban a negatív töltésű karboxilát csoport és az alkoholos –OH csoport között az esetleges hidrogénhidas asszociátum képződés miatt az alcsonyabb pH-ju oldatban történő mérést preferáltuk.
45
A fenilglicin esetében bonyolultabb a helyzet, mivel az két protonálódásra alkalmas funkciós csoporttal rendelkezik, így a CD-pH titrálás során két, egymástól elkülönülő protonálódási lépcső várható. A 10.ábrán a fenilglicin CD-pH titrálási görbéje látható. A baloldali tengelyen a 218.6 nm-nél mért ellipticitás érték, míg a jobboldali tengelyen az aromás LB-sáv jellegzetes maximumainál mért elipticitás értékek láthatók.
0
180 CD 218.6 nm (bal) CD 255 nm (jobb) CD 261 nm (jobb)
135
CD 268 nm (jobb)
90
-45
45
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
-90 13
pH
10. ábra.: L-fenilglicin CD-pH titrálási görbéi
Alacsony
hullámhosszaknál
/218.6
nm/
a
karboxilát-csoport
deprotonálódása /pH 0 és 3 között/ jól követhető, azonban az amino-csoport deprotonálódása /pH 9 körül/ a titrálási görbén alig. Az aromás LB-sávban mérhető jelváltozás alkalmas arra, hogy az amino-csoport protonálódását követni lehessen. Ebben a hullámhossz tartományban viszont a karboxilátcsoport protonálódása okoz kisebb jelváltozást, tehát pontatlanabbul mérhető és nagyobb hibával terhelt. Az oldatkészítésnél ugyanúgy jártunk el, mint azt a mandulasav mérésénél leírtam, a törzsoldat koncentrációja azonban az előzőektől eltér /0.7 mMol/dm3/. A 4.táblázatban a különböző hullámhosszaknál kapott protonálódási állandók és azok statisztikai paraméterei láthatók:
46
4. Táblázat.: Az L-fenilglicin CD-pH titrálási görbéiből számított protonálódási állandói és azok statisztikai paraméterei (hullámhosszanként48 mérési pont adataiból) mérési hullámhossz⇒
218 nm
255 nm
261nm
268 (nm)
átlag
logKP1
-
9.086
9.080
9.088
9.085
szórás
-
±0.007
±0.009
±0.006
sd=±0.004
logKP2
1.797
1.771
1.764
1.778
1.777
szórás
0.002
0.031
0.027
0.020
sd=±0.014
Maradék
2.290
1.732
4.409
1.370
R
0.9999
0.9998
0.9998
0.9998
fenilglicin
protonálódási
stat. param.
A
állandóinak
értékeit
elemezve
arra
a
kövtkeztethetünk, hogy csak az erősen savas illetve lúgos oldatban kapunk olyan részecskéket, amelyeknek protonáltsági állapota egyértelmű, így nem kell tartanunk homoasszociátum képződéstől. Az erősen lúgos oldatokban a mérést azonban számos körülmény zavarhatja, mint pl. a CO2 abszorpció, aminek következtében az oldat abszorbanciája változhat. Fentiek miatt a savas oldatban történő mérés mellett döntöttünk. 5.2.1.2
ENANTIOMERTISZTASÁG KÖZVETLEN MEGHATÁROZÁSA A DISZIMMETRIA FAKTOR ALKALMAZÁSÁVAL
Igen fontos, hogy a vizsgált anyag protonáltsági állapota a mérés során változatlan legyen, -mint arra az előzőekben rávilágítottam-, mivel a mért ellipticitás és abszorpciós értékek különböző protonáltsági állapotban eltérőek. Az oldószer kiválasztásánál szintén elővigyázatosnak kell lenni, különben nem várt homo- és/vagy hetero-asszociációs folyamatok mehetnek végbe, amelynek a következménye szintén a linearitás torzulása [18]. A mérési adatok és a
47
koncentráció közötti lineáris függvénykapcsolat torzulásának oka lehet az is, hogy a mérés során valamilyen technikai hiba történik. Az anizotrópia faktor mérésével és analitikai célra történő felhasználásával azonban ezek a technikai hibák kiküszöbölhetők. A módszer előnyeiről a megbeszélés fejezetben lesz szó. Most csak a mérési körülményekkel, adatokkal valamint eredményekkel foglalkozom. A 8.ábrán (42.oldal) látható a fenilglicin és a mandulasav királisan perturbált fenil kromofór csoportjának LB sávja (250-270 nm), amely túlságosan alacsony intenzitású. A kedvezőtlen körülmények nem teszik lehetővé a diszimmetria, vagy más néven anizotrópia faktor (g) pontos, kis hibával terhelt meghatározását. Az anizotrópia faktor jól mérhető, ha a kiroptikai jel nagyintenzitású, az abszorpció pedig az optimális mérési tartományban van. 220 nm körül a g-érték sokkal előnyösebb, nagyobb intenzitású, mint az LB sávban, ezért a fenilglicint 218,6, míg a mandulasavat 221,6 nm-es maximum értéknél mértük a továbbiakban. Az anizotrópia faktor az anyagra jellemző, koncentráció független paraméter, amely bizonyítására a következő kísérlet szolgál. 1.2 mMol/dm3 koncentrációjú D-fenilglicin törzsoldat felhasználásával hígítás sort készítettünk 0.2-1.2 mMol/dm3 tartományban. A G-értéket, -amely az irodalmi g-érték 3300-szorosának felel meg (lsd. 3. és 4. egyenlet)/-, az ugyanabban
az
oldatban
mért
ellipticitás
és
abszorpciós
értékek
felhasználásával számoltuk ki. A mért CD és UV-jel 0.3-1.1 mMol/dm3 tartományban lineárisnak bizonyult, azonban 0.9 mMol/dm3 koncentráció fölött a túlságosan nagy abszorpciós értékek miatt a CD-jel jel/zaj aránya előnytelenül változott, ami az anizotrópia faktor zajszintjét is kedvezőtlen irányba befolyásolta. A 11. ábrán a 0.3-0.9 mMol/dm3 koncentráció tartományban mért ellipticitásokat, abszorpciókat és a G-értékeket valamint a koncentráció és a mért jel közti lineáris összefüggést feltételező regressziós egyenes paramétereit tüntettük fel. Jól látható, hogy az anizotrópia faktor értékek függetlenek a koncentrációtól. Hasonló eredményeket kaptunk az L-fenilglicin valamint a mandulasav enantiomerek esetében is.
48
Az anizotrópia faktor értéke az enantiomer párok esetében azonos nagyságú és ellentétes előjelű - mint az egyébként is várható -, amelyet a következő eljárással bizonyítottunk. 3.0
-100 -150
2.5 -200 2.0
-250 -300
1.5 -350 Ellipticitás (bal)
-400 -450 0.3
1.0
G (bal) Abszorpció (jobb)
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
D-fenilglicin koncentráció (mMol/l)
11. ábra.: A mért ellipticitás, abszorpció és a számított G-értékek a Dfenilglicin koncentrációjának függvényében A vizsgálatok során különböző koncentrációjú oldatokban megmértük az ellipticitásokat (Θ) és abszorpciókat (A), amelyeket elosztottunk az aktuális mólkoncentrációval. Az eredményként kapott standardizált ellipticitásokat (Θs ) és abszorpciókat (As), valamint az egyes mérésekből számolt G értékeket hasonlítottuk össze a megfelelő enantiomer pároknál. Az eredmények az 5. táblázatban láthatók. 5. Táblázat.: Standardizált ellipticitás (ΘS), standardizált abszorpció (AS) valamint G-értékek fenilglicin és mandulasav enantiomerek esetében D-fenilglicin
L-fenilglicin
D-mandulasav
L-mandulsav
(n=65)
(n=16)
(n=59)
(n=21)
ΘS
-401.8±0.5
402.5±0.6
-359.4±0.5
359.6±0.5
AS
2.506±0.004
2.503±0.004
2.563±0.005
2.568±0.004
G
-160.3±0.2
160.8±0.1
-140.1±0.2
140.1±0.2
49
A fenilglicin enantiomerek As értékei nem különböznek egymástól szignifikáns mértékben, amely a kémiai tisztaságuk hasonlóságát is jelenti, azaz
nincs
jelen
olyan
szennyező
komponens,
amelynek
moláris
abszorbanciája jelentősen különbözne a fenilglicinétől. Ez az egyezés az anyag minőségi bizonylatának ismeretében várható is volt. A standardizált ellipticitás (ΘS) értékek viszont szignifikáns különbséget mutatnak. Kétmintás t-próbát alkalmazva a két ΘS érték szignifikánsan különbözőnek bizonyult akárcsak a G értékek. P(ΘS) = 0,1% (t = 4,56), PG< 0,1% (t = 13,21) Az ellipticitási adatok alapján az L-enantiomer szennyezés a D-izomerben 0,09%-nak adódott, míg a G értékek alapján 0,15%-nak. Ez az adat jó egyezést mutat Szász és mtsai által, intézetünkben elvégzett a HPLC-s vizsgálat eredményével, amely szerint a fent D-fenilglicin minta 0,19% L-fenilglicin szennyezést
tartalmaz.[84]
A
vizsgálat
kiterjedt
a
mandulasav
enantiomertisztaságának vizsgálatára is, amely szerint az L-izomer 0.27% Dizomer szennyezést tartalmazott. A D-izomerben az L-mandulasav szennyezést közvetlenül nem lehetett mérni, amelynek a fő oka az volt, hogy az alkalmazott kromatográfiás rendszerben az L-izomer retenciós ideje nagyobb volt, mint a főkomponensé valamint a felbontás (RS) és a csúcsszimmetria sem volt megfelelő. A mandulasav esetében sem a Θs, sem az As sem pedig a G értékek nem mutatnak szignifikáns különbséget. Ebből következik, hogy a D-izomer szennyezésnek (0.27%) az L-formában történt meghatározása alapján, valamint a fenti adatok (Θ, A, G) mérése alapján deduktív módszerrel kiszámolható az L-izomer szennyezés mennyisége a D-formában is (0,27%), azaz a ΘS
és G értékek hasonlósága alapján következtetni lehet a minta
szennyezettségére. Így tehát a G érték alapján az enantiomer szennyezés meghatározható. A módszer teljesítőképességének a vizsgálatához tesztsorozatot készítettünk. A HPLC-s vizsgálatokból, valamint az alapanyagok CD, UV és G értékeiből ismert volt mind a négy anyag enantiomertisztasága, így Dés L-fenilglicin oldatokból különböző izomer arányú oldatokat állítottunk össze.
50
Vizsgálni kívántuk, hogy a G-érték lineárisan változik-e az izomerek arányának függvényében, miközben az összkoncentrációt állandó értéken tartjuk. D- és L-fenilglicin törzsoldatot (CD = 0,8097 mMol és CL = 0,7917 mMol) kevertünk össze különböző arányokban. A két ’tiszta’ oldat mellett 20-80% között variáltuk az L-fenilglicin mennyiségét a D-fenilglicinben. Az különböző arányoknál 3-5 párhuzamos mérést végeztünk. Összesen 31 oldat mérésére került sor. A számított G-értéket minden oldat esetében a D-izomer százalékos mennyiségének függvényében ábrázoltuk (12. ábra). 200
0,50
150 100
0,25
50 0
0,00
-50 -100
-0,25 G Rezidumok
-150 -200
0
20
40
60
80
100
-0,50
D-fenilglicin koncentráció [%]
12. ábra.:A diszimmetria faktor (G) /bal oldali tengely/ változása különböző arányú D- és L-fenilglicin tartalmú oldatokban a D-fenilglicin százalékos mennyiségének függvényében valamint a reziduális maradékok /jobb oldali tengely/ Az egyenes a független változót (D-fenilglicin koncentráció) reprezentáló "X"-tengelyt az 50 %-os összetételnél (racém elegy) metszi. A linearitás egyben bizonyítéka annak, hogy nincsenek homo- és heteroasszociációs folyamatok és a görbét analitikai kalibráló görbeként lehet használni. Az egyenestől való esetleges eltérés a nagy abszolút értékek miatt az ábrán nem érzékelhető, ezért a rezidumokat, azaz a számított és mért értékek eltéréseit is feltüntettük. A rezidumok véletlenszerű, tendencia mentes eloszlása a ’0’ érték körül alátámasztja a linearitás hipotézisét.
51
Az abszorbciós értékekből, -amelyek az adott esetben csak a fenilglicin összkoncentrációtól függnek-, kiszámoltuk az As értékeket a különböző arányú D- és L-fenilglicin enantiomer oldatok esetében. A kapott 2.505±0.002 érték nem különbözik szignifikánsan az 5. táblázatban megadott értéktől. Az
analitikai eljárások során általában a kis mennyiségben jelenlévő
szennyezések meghatározásának van nagy jelentősége. Számos esetben az abszolút tisztaságú enantiomerek nem állnak rendelkezésre, ehelyett csak validált mennyiségű szennyezést tartalmazó standardok szerezhetők be, ezért vizsgálatot végeztünk, hogy a diszimmetria faktor mérésének van-e létjogosultsága kismennyiségű enantiomerszennyezés meghatározásánál. Szennyezési standardot készítettünk a D-fenilglicinből, amely 1.097 %-os L-fenilglicin
szennyezést
tartalmazott.
A
"tiszta"
D-izomer
0.192%
L-
fenilglicinnel volt szennyezett. A szennyezési standard és a ’’tiszta’’ D-izomer összes fenilglicin tartalma gyakorlatilag megegyezett. Ezt a két törzsoldatot különböző arányokban elegyítettük. Az L-fenilglicin szennyezés mennyiségét korreláltattuk a mért ellipticitásokkal ás a számítható G-értékekkel. A kalibráló egyenes a következőnek adódott:
Θ= -325,305 + 42.994(CL) és G= -161,949 + 9,45(CL), ahol a CL az L-izomer százalékos koncentrációját jelenti. Ismert mennyiségű L-fenilglicin szennyezést tartalmazó D-fenilglicin oldatokat készítettünk az előzőekben ismertetett szennyezési standard és ’’tiszta’’ D-fenilglicin oldatokból, majd ezek ellipticitás és abszorbancia értékeinek mérése után a Θ és G értékeket a kalibrációs egyenes egyenletébe helyettesítettük, amelynek eredményeként számított CL értékeket nyertünk. A számolással kapott és a ténylegesen bemért szennyezés koncentrációk különbségei,
továbbá
egyéb,
számolással
táblázatban láthatók.
52
nyerhető
információk
a
6.
6. Táblázat.: A próbamérés adataiból számolt és a bemért L-fenilglicin koncentrációk, valamint ezek eltérései az ellipticitás és a diszimmetria faktor mérése alapján az oldat összetétele
TöOd 9d/1dl 9d/1dl 8d/2dl 8d/2dl 7d/3dl 7d/3dl 6d/4dl 6d/4dl 5d/5dl 5d/5dl 4d/6dl 4d/6dl 3d/7dl 3d/7dl 2d/8dl 1d/9dl 1d/9dl TöOdl
CL
Θ
G
CLΘ
CLG
CLG-CL
CLΘ-CL
0.192 0.282 0.282 0.373 0.373 0.464 0.464 0.554 0.554 0.644 0.644 0.735 0.735 0.825 0.825 0.916 1.006 1.006 1.097
-317.370 -313.120 -314.631 -308.745 -308.767 -304.934 -304.660 -301.694 -302.745 -296.227 -296.631 -294.559 -294.158 -289.626 -289.404 -286.874 -281.976 -282.388 -278.174
-160.134 -159.135 -159.346 -158.308 -158.407 -157.460 -157.626 -156.714 -156.516 -155.883 -155.753 -155.015 -155.040 -154.096 -154.038 -153.286 -152.426 -152.437 -151.577
0.192 0.290 0.255 0.391 0.391 0.479 0.485 0.554 0.530 0.680 0.671 0.719 0.728 0.833 0.838 0.896 1.009 1.000 1.097
0.192 0.298 0.275 0.385 0.375 0.475 0.457 0.554 0.575 0.641 0.655 0.733 0.731 0.831 0.837 0.916 1.007 1.006 1.097
0.000 0.015 -0.007 0.012 0.002 0.011 -0.007 0.000 0.021 -0.003 0.011 -0.002 -0.004 0.006 0.012 0.000 0.001 0.000 0.000
0.000 0.008 -0.027 0.018 0.018 0.015 0.021 0.000 -0.024 0.036 0.027 -0.016 -0.007 0.008 0.013 -0.020 0.003 -0.006 0.000
Jelmagyarázat: TöOd =’’tiszta’’ D-fenilglicin törzsoldat; TöOdl=L-fenilglicinnel szennyezett D-fenilglicin törzsoldat (szennyezési standard); CL= az L-izomer elméleti mennyisége (%);
Θ= mért ellipticitás milifokban; G=diszimmetria faktor; CLΘ az L-izomer mennyisége az ellipticitási értékek kalibrációs egyeneséből számolva; CLG=az L-izomer mennyisége a G értékek kalibrációs egyeneséből számolva;
Megvizsgáltuk, a számított és a mért értékek közötti eltérések középértékeit és szórását. Mindkét esetben az átlagos eltérés +0.0035-nek adódott, azonban az ellipticitási adatokból kapott eredmények
szórása
(±0.0175) jelentősen
meghaladja a diszimmetria értékekből számolt eltérések szórását. (±0.0078) Ez várható is volt, mivel az ellipticitási adatokból számolt szennyezés értékek
53
eltérései szemmel láthatóan nagyobbak, mint a diszimmetria faktorból számítottaké.
5.3 A CD ÉS A SZIMULTÁN KETTŐS CD/UV DETEKTÁLÁS FELHASZNÁLÁSI LEHETŐSÉGEI A NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁBAN
Az 5.2.1.2 fejezetben meghatároztuk enantiomerek arányát a kettős szimultán
CD/UV
spektroszkópia
segítségével,
amely
módszer
elvileg
alkalmazható kromatográfiás körülmények között is abban az esetben is, ha két vagy esetleg több csúcs nem, vagy csak részlegesen válik el egymástól. A kétféle detektorjel hányadosa egy, az időtengellyel párhuzamos egyenes lesz amikor csak az egyik komponens fordul elő az elutumban. Két komponens részleges elválása során a kromatogramon kapunk egy-egy olyan szakaszt, amelyik az egyik illetve a másik komponensre jellemző, tehát az egyedi hányados értékek meghatározhatók belőlük és a csúcs homogenitása és tisztasága meghatározható. A szimultán kettős detektálás így már nem csak enantiomer párok esetében alkalmas csúcstisztaság vizsgálatára, hanem általánosan
olyan
anyagok
esetében
is,
amelyek
mindkét
detektorral
észlelhetőek. Az általunk alkalmazott CD/UV detektálás természetesen csak az optikailag aktív abszorpciós sávval rendelkező anyagok mérésére alkalmas, de a kidolgozott elv alapján bármilyen párosítású szimultán kettős detektorral elképzelhetők a fenti vizsgálatok. Az SA/SB hányados képzésével kapcsolatban felmerülhet még néhány probléma a gyakorlati munka során, amelyeket ki kell küszöbölni. Zavarólag hat eluens saját jele (S>0 C=0 esetben), és az alapvonal emelkedését vagy csökkenését is ki kell küszöbölni. Ideális esetben, amikor a kromatográfiás csúcs a normál eloszlásnak megfelő szimmetriát követi a csúcsot a következő egyenlettel lehet leírni:
S =
A 2π × w
×e
54
1 − 2
{( t− rt) w }2
(37)
ahol S a detektorjel, ‘A’ a csúcs alatti területtel arányos mennyiség, t a retenciós idő, w a csúcs szélességének fele az rt időpontban kapott csúcsmaximum 60.65%-ánál. A normál eloszlási függvénynek megfelelő kromatogram alakját több tényező is befolyásolhatja. A hányadosképzés szempontjából az un. ’leadingesedés’
és
’tailingesedésnek’
nincs
jelentősége,
viszont
az
alapvonalnak a vízszintestől való eltérését korrekcióba kell venni. 5.3.1
KROMATOGRÁFIÁS CSÚCSHOMOGENITÁS MEGHATÁROZÁSA A SZIMULTÁN KETTŐS CD/UV DETEKTÁLÁS SEGÍTSÉGÉVEL
Munkacsoportunk a kábítószerek analitikájának számos aspektusával foglalkozik, így kézenfekvő volt a választás, hogy a morfinánvázas alkaloidok HPLC-s kromatogramjait használjuk fel az elmélet igazolására. A morfinvázas alkaloidok mellett szólt az a negatívumként említhető tulajdonság is, hogy fordított fázison történő elválasztásuk esetében a csúcsok szimmetriája az esetek döntő többségében nem kielégítő, még ionpárképző additívumok esetében is a tailingesedést csak csökkenteni lehet, de megszüntetni nem. Tailinges, elhúzódó kromatogramok esetében nagy az esély arra, hogy két csúcs egymástól nem válik el teljes mértékben. Ez a tény kromatográfiás szempontból előnytelen és a gyakorlati munka során lehetőség szerint kiküszöbölendő, de a módszer teljesítőképességét pont ezen kromatogramok vizsgálatával lehet jól bemutatni. Elsőként a két természetes eredetű alkaloid, a morfin és a kodein, valamint a két félszintetikus származék, a hidrokodon és az oxikodon kromatográfiás és CD spektroszkópiás viselkedését tanulmányoztuk. Az alapanyagok CD- és UV spektrumainak vizsgálata a detektálás megfelelő hullámhosszának kiválasztása miatt fontos. A 13. ábrán a morfin, a kodein a hidrokodon és az oxikodon moláris CDspektrumai láthatók 230-350 nm hullámhossz tartományban. Az említett vegyületek spektrumában bár még 230 nm alatt is van spektroszkópiásan jól értékelhető, nagyintenzitású, negatív Cotton-hatás görbe, azonban ezt a tartományt a kromatográfiás detektálás előnytelen jel/zaj viszonya miatt már nem célszerű alkalmazni, így csak a 240 nm fölötti tartományt tüntettük fel.
55
50000 40000
20000 Mol. Ellip. 0
-20000
-40000
250
Wavelength[nm]
300
350
13. ábra.: A morfin, a kodein, a hidrokodon és az oxikodon moláris CD spektrumai A kromatográfiás detektálásnál a detektálási hullámhossz megválasztását számos tényező befolyásolja. A kiroptikai detektálásnál általában a magasabb hullámhosszaknál előnyösebb a jel/zaj arány, alacsonyabb hullámhosszak felé haladva ez egyre csökken. A spektrumokból jól látszik, hogy a hidrokodon és az oxikodon igen intenzív, negatív előjelű sávval rendelkezik a 300 nm körüli hullámhossz tartományban, ami a 6-os helyzetű, királisan perturbált ketocsoport n→π* átmenetével magyarázható, azonban itt a kodein és a morfin nem detektálható. 286 nm körül a morfin és a kodein egy viszonylag gyenge negatív sávval /aromás LB-sáv / rendelkezik, azonban a másik két komponens spektrumának változása túl meredek ahhoz, hogy érdemes lenne ennél a hullámhossznál dolgozni. A legkézenfekvőbb kompromisszumnak a 240 nm körüli detektálás tűnt. A hidrokodon és az oxikodon moláris ellipticitása itt nagyintenzitású, ugyanakkor a morfin és a kodein CD jele közel maximumot mutat és nem a görbe meredek szakaszán dolgozhatunk. Ezen meggondolások alapján 242 nm-es hullámhossznál detektáltunk.
56
Eluensként 0.1 M/dm3 koncentrációjú H3PO4-KH2PO4 puffer (pH=3) 70 v/v% és metanol (HPLC grade) 30v/v% elegyét használtuk -előzetes szűrés és gáztalanítás
után-
1ml/perc
áramlási
sebességgel.
Állófázisként
Apex
octadecyl-silan fordított fázisú oszlopot (Jones Chromatography, 250x4 mm, 5µm) alkalmaztunk. A vizsgálatokhoz az anyagokból 25mM koncentrációjú törzsoldatokat és ezekből a törzsoldatokból hígítási sorozatokat készítettünk, oldószerként az eluenst használtuk. Megvizsgáltuk a kiválasztott kromatográfiás rendszerben az anyagok retenciós tulajdonságait és azt találtuk, hogy mind a négy anyagnál a retenciós idő erősen függ az injektált minta koncentrációjától (14.ábra). A morfin esetében 1.25 mM koncentrációjú oldat
140
injektálásakor a retenciós idő 25 mM
(csúcs maximum) 3.85 percnek , 25mM
koncentrációjú
minta
esetén ez az érték 3.51 percnek
100
adódott. Ugyanez a tendencia CD
volt tapasztalható a három másik
12.5 mM
vizsgált anyag esetében is azzal a különbséggel, hogy a retenciós
50
idők nagyobbak voltak. Kodein
2.5 mM
esetében
7.4
és
5.3
perc,
oxikodon esetén 7.7-5.7 perc, 0
200
400
600
800
Time
14. ábra.: A kodein retenciós maximumainak változása az injektált minta koncentrációinak függvényében
míg a hidrokodon esetében 9 és 6
perc.
koncentráció
A
retenciós függésén
idő túl-
menően a csúcs szimmetria is előnytelen mind a négy esetben,
mivel a csúcsok igen tailingesek. A retenciós adatokból az is nyilvánvalóvá, hogy a morfin a másik három anyagtól megfelelően elválik, így az adott rendszerben a csúcstisztasági vizsgálatoknak a kodein-hidrokodon és a kodeinoxikodon tartalmú keverékek esetében van elvi és gyakorlati jelentősége.
57
A retenciós tulajdonságok megismerése után a csúcs alatti terület és a koncentráció közötti összefüggés linearitását vizsgáltuk meg mind a CD mind pedig az UV detektálás esetén 8-8 mérési ponton. Az összefüggést mindkét detektálási mód és mind a négy anyag esetében lineárisnak találtuk 1.25 és 25 mM/dm3 koncentráció tartományban. A regressziós koefficiens [r] mindegyik anyag vizsgálatánál elérte vagy meghaladta a 0.999-es értéket. A linearitás vizsgálatra azért volt szükség, hogy a hányados érték számolásánál kontrollálni lehessen, vajon az esetleges eltérések homoasszociátum képződésnek vagy pedig mérési hibának köszönhetőek-e. Egy-egy alapanyag esetében kiszámoltuk az egyes koncentrációknál a hányados értékeket. Az egyes kromatogramok esetében a CD detektorból származó jelet elosztottuk az UV jellel és a kapott értékeket abban a tartományban vizsgáltuk meg, ahol az abszorbancia meghaladta 0.05 abszorpciós értéket. Ez azt jelenti, hogy mindegyik kromatogram esetében ez a tartomány legalább 60 másodperces időszaknak felel meg. Az adatpontokat 1 másodpercenként regisztráltuk, így tehát legalább 60 mérési adat átlagából származnak a hányados értékek, amelyek standard deviációja 0.4 és 1.7 közötti értéknek adódott. A különböző koncentrációknál kapott hányadosok átlagát és az átlag szórását a következőkben (7.táblázat) foglaltuk össze: 7. Táblázat.: Szimultán detektált CD és UV kromatogramokból számolthányados /diszimmetria/ értékek 242 nm-nél morfin /n=8/
kodein /n=12/
hidrokodon/n=8/ oxikodon/n=8/
Hányados
99.83
93.01
49.46
41.36
Szórás
±0.15
±0.07
±0.70
±0.22
A fenti adatokból látható, hogy az egyes anyagokat a hányadosaik jól jellemzik és helyesnek bizonyult az a hipotézis, miszerint a hányados koncentrációtól független érték. A kromatogramok olyan szakaszainál, ahol az elválasztás teljes, a tiszta anyagra jellemző hányados értéket kell kapni, míg azokon a szakaszokon, ahol a csúcsok részlegesen átfedik egymást, fentiektől eltérnek a hányados értékek. Elégtelen elválasztás esetén, amikor a két anyag egyáltalán nem válik el egymástól, a mért hányados értéke a szennyezettség indikátora lehet, ha a vizsgált anyag CD és UV jelének hányadosa
58
szignifikánsan eltér a tiszta anyag esetében várható értéktől. Természetesen ilyen esetben meg kell fontolni az eredeti rendszer elvetését és egy másik kromatográfiás rendszert kell alkalmazni, ahol megfelelő elválasztás érhető el. A részleges elválasztásra a kodein-hidrokodon rendszer, míg két csúcs teljes átfedésére a kodein-oxikodon rendszer vizsgálata szolgáltat példát. A kodein-hidrokodon összetételű keverékben a kromatogramon (15/a ábra) is látható, hogy 10 mol% kodein szennyezés estében a két anyag részlegesen elválik egymástól, míg 5 mol% kodein szennyezés (15/c.ábra) esetében már csak egy gyenge kis törés látható a kromatogram felszálló ágán. 15.ábra 24
0,48
200 SCD/SUV
15/a
20
15/b
0,40 150
16
0,32
12
0,24
8
0,16
4
0,08
0
0,00
100
0
240
480
720
50
0
-50 0
960
240
480
720
960
Idõ (sec)
Idõ (sec) 24
0,48
15/c
20
200 SCD/SUV
15/d
0,40 150
16
0,32
12
0,24
8
0,16
4
0,08
0
0,00
100
0
240
480
720
50
0
-50 0
960
240
480
720
15. ábra.: 10 (a, b) és 5 (c, d) mol% kodeinnel szennyezett hidrokodon minták kromatogramjai CD /piros/ és UV /kék/ detektálással /balra/ valamint a hányados kromatogramjaik /jobbra/
59
960
Ezek a kromatogram alakján látható devianciák egyértelműen jelzik az inhomogenitást, de arra nem adnak felvilágosítást, hogy a kromatogram mely részei származnak csak egyféle anyagtól. A 15/b és 15/d ábrán a CD és UV jelek hányadosai láthatók. A 360 másodperc környezetében látható magasabb vízszintes szakaszok értékei 92.93±0.54-nek (15/b ábra) és 93.09±0.56-nak (15/d ábra) adódtak. Ezek az értékek nem különböznek szignifikáns mértékben a tiszta kodein 93.01-es értékétől, tehát a kodein ezen a szakaszon tisztán van jelen. A második, alacsonyabb szakaszon a hányados
értékek
átlagai
50.84±0.34-nek (15/b ábra) és 50.55±0.60-nak (15/d ábra) adódtak. Ezek az értékek
a
tiszta
hidrokodonra
jellemző
49.46-os
értékhez
közeliek,
szignifikánsan nem magasabbak annál. A szakaszok a tiszta kodeinhez közeli részein az átlagnál kicsit magasabbak a hányados értékek és csak a kodeintől távolabbi szakaszokon érik el a hidrokodonra jellemző 49-50 közötti értékeket. Ez egyben azt is jelenti, hogy az alacsonyabb szakaszon döntően a hidrokodon van jelen, és a kodein mennyiségének jelentős hányada az elutum korábbi részében van, azonban kis mennyiségben kodein az alacsonyabb szakaszhoz tartozó elutumban is előfordul. A kodeinnel szennyezett oxikodon esetében a kromatogramokon (16 ábra) nincs szemmel látható jele annak, hogy a csúcs nem homogén és ilyen szempontból a hányados értékek ábrája sem informatív. A hányadosok numerikus értékeit megvizsgálva azonban az tapasztalható, hogy 5 mol% kodeint tartalmazó oxikodon esetében a hányados 44.38±0.39 ill. 44.18±0.81 értéknek adódik, míg 10 mol% kodein szennyezés esetén ezek az értékek rendre
46.60±0.80-nak
és
46.75±0.79-nek
adódtak.
Ezek
az
értékek
szignifikánsan magasabbak a tiszta oxikodon 41.36-os hányados értékénél. A tiszta
komponensek
hányados
értékeinek
és
pontos
koncentrációinak
ismeretében a teoretikus hányados érték kiszámítható, amely 5 mol% kodein szennyezés esetében 44.2, míg 10 mol% kodein esetében 46.7. A mérésekből származó és a teoretikus értékek igen jó egyezést mutatnak. Természetesen ezzel nem azt kívánom állítani, hogy a módszer ilyen esetekben is alkalmas lehet szennyezések pontos, kvantitatív meghatározására, azonban fenti eredmények is alátámasztják a módszer megbízhatóságát.
60
80
CD (bal)
0,8
G (bal) ABS (jobb)
40
0,4
0
0,0
120
240
360
480
600
720
840
960
idő /sec/
16. ábra.: 10 mol% kodeint tartalmazó oxikodon kromatogramjai CD- és UVdetektálással valamint a belőlük számolt hányados (G) kromatogram Elmondható, hogy bár látható jele nincs az inhomogenitásnak, a hányados értékek elemzése mégis egyértelműen mutatja, hogy az oxikodon minta valamilyen szennyezést tartalmaz. Ebben az esetben a csúcs homogén, mivel a két komponens aránya közel állandó, amit a hányados kromatogram is jelez, viszont nem tiszta. A kodein-szennyezés az adott kromatográfiás rendszerben nem válik el az oxikodontól, ezért egy másik, alkalmas kromatográfiás rendszert kell alkalmazni, ha a két komponens kvantitatív meghatározása a célunk.
61
5.3.2
KROMATOGRÁFIÁS CSÚCSHOMOGENITÁS VIZSGÁLATA NAGYSEBESSÉGŰ CD SPEKTRUMFELVÉTELEK ALAPJÁN.
A kromatográfiás csúcsok azonosítására jól alkalmazható eljárás az un. stop flow technika, amelynek során a kromatográfiás csúcs megfelelő részénél megállítják az eluens áramlását és az elutum adott szegmenséből spektrumot vesznek fel. Diódasoros UV-detektorok alkalmazásakor az eluens áramlást nem kell megszüntetni, mivel a műszer nagyon rövid idő alatt képes a teljes spektrum felvételére. Ezt az eljárást kívántuk a rendelkezésünkre álló Jasco J-720 spektropolariméter segítségével átültetni a kiroptikai detektálás gyakorlatába. Az elvi lehetőséget az biztosította, hogy a műszer képes akár 5000 nm/perc sebességgel egymás után 30 spektrumot rögzíteni. A gyakorlatban csak egy viszonylag szűk hullámhossz tartomány vizsgálatára van szükség, így egy átlagosnak tekinthető 1 ml/perc eluens áramlási sebesség mellett az elutum viszonylag kis szegmenséről vehetők fel spektrumok. Az eljárás kidolgozása során a következő kérdésekre kellett választ kapnunk: 1.)
Mennyire hasonlítanak a nagy sebességgel felvett spektrumok és a stop flow technikával kromatográfiás körülmények között felvett spektrumok ?
2.)
Melyik az a legkisebb hullámhossz áramló rendszerben, egy adott eluensben, ahol a jel/zaj viszony még elfogadható?
3.)
Milyen hullámhossz tartományban szolgáltatják a legtöbb információt a vizsgálni kívánt vegyület(ek) spektruma(i)?
4.)
Melyik az a legnagyobb felvételi sebesség, amely az adott körülmények között még alkalmazható?
5.)
Mennyi ideig tart egy-egy spektrum felvétele illetve egy újabb spektrum felvételének megkezdéséig mennyi idő telik el? (pl.: Mekkora
a
monochromátort
tehetetlensége?)
62
mozgató
mechanika
Fenti kérdése megválaszolása után lehet -bizonyos kompromisszumok árán- a mérés kivitelezéséhez leginkább alkalmas körülményeket kiválasztani. Vizsgálatainkat az előző alfejezetben leírt morfinvázas alkaloidok illetve azok
keverékeinek
felhasználásával
végeztük
el.
Fontos,
hogy
a
spektrumfelvétel sebességét a mérés szempontjából hasznos információt tartalmazó hullámhossz tartomány adta lehetőségekhez igazítsuk. A vizsgált molekulák jellegzetes CD spektrumot mutatnak a 230-330 nm közötti tartományban. A spektrumfelvétel sebeségének optimalizálása során azt tapasztaltuk, hogy ebben a mérési tartományban 1000 nm/perc felvételi sebesség a legnagyobb, ahol még nem túl zajosak a spektrumok. Ennél a sebességnél egy spektrum felvétele az előzőekben definiált hullámhossz tartományban 6 másodperc alatt megtörténik. A két egymást követő spektrum rögzítésének megkezdése között -a műszer mechanikai tehetetlenségét is figyelembe véve- 10 másodperc telik el. Ezeknek az adatoknak az alapján kiszámolható, hogy ezzel a módszerrel a kromatogram 5 perces részlete rögzíthető. A műszert vezérlő szoftver azonban lehetőséget biztosít arra is, hogy az egymást követő két spektrum felvétele ne azonnal, hanem csak a felhasználó által meghatározott várakozás után történjen meg. A spektrum felvételi sebessége a spektrum minőségét nagyban befolyásolja. Az oxikodon 25 mMol/l koncentrációjú oldatát injektálva a 17.ábrán látható spektrumokat lehetett rögzíteni, amelyen az oxikodon stop flow módszerrel és áramló rendszerből ’on line’ felvett spektrumai láthatók. A két spektrum kétségtelenül nagyon hasonlít egymásra, azonban az áramló rendszerben felvett spektrumon főleg 260 nm alatt jól látható, hogy zajosabb, mint a statikus rendszerben rögzített. A két spektrum hasonlóságát azonban egzakt módon is szükséges bizonyítani. Az abszolút intenzitási adatok erre nem alkalmasak, mivel a gyakorlatban szint kivitelezhetetlen az, hogy a két különböző spektrumfelvételi módszernél az anyag koncentrációja azonos legyen az átfolyó küvettában.
63
50 CD [m deg]
0
oxikodon (stop flow m ethod) 50 nm/min, 3x accum ulation
oxikodon ( on-line spectrum ) 1000 nm /min -50
240
260
280
300
320
W avelength[nm]
17. ábra.: Az oxikodon spektrumának összehasonlítása statikus és áramló rendszerben
A korrekt azonosításhoz a jellegzetes spektrális maximumok hányadosaiból képzett értékeket hasonlítottuk össze, az egyes maximumoknál mért abszolút intenzitások hányadosai alapján. Ez csak akkor oldható meg, ha a spektrumok ténylegesen csak a tiszta anyagtól származnak és az oldószernek vagy esetleg más additiveknek nincs saját, a tényleges jelet torzító hatása. Amennyiben az előbbi eljárás kivitelezhetetlen, akkor a relatív intenzitások összehasonlítása lehet célravezető. Az oxikodon esetében lehetőség van mind az abszolút, mind pedig a relatív intenzitások összehasonlítására. Az abszolút intenzitás értékek hányadosait három spektrális maximum, a 298, a 276 és a 240 nm-es hullámhosszaknál kapott adatokból számoltuk ki. A relatív intenzitás értékek
64
számolása úgy történt, hogy a 298 és a 276 nm-nél mérhető maximumok különbségét osztottuk el a 276 nm-es maximum és a 260 nm-es minimum értékek különbségével. A stop flow módszerrel rögzített spektrumok és az ’on line’ felvett spektrumok esetében kapott eredményeket a 8.táblázatban foglaltam össze.
8. Táblázat.: Statikus és áramló rendszerben rögzített CD-spektrumok abszolút (abs) és relatív (rel) intenzitás (ellipticitás /Θ/) hányadosai
Θ298/Θ276 (abs)
STOP FLOW módszer (n=1) -2.23
ÁRAMLÓ RENDSZER (n=3) -2.23±0.01
Θ298/Θ240 (abs)
-2.10
-2.10±0.05
Θ276/Θ240(abs)
0.94
0.94±0.02
(Θ280-Θ300)/(Θ280-Θ260)(rel)
3.89
3.92
Hullámhossz
A táblázat adataiból kitűnik, hogy bár az áramló rendszerben rögzített spektrumok zajosabbak, mint a statikus rendszerben mértek, a hányadosok nagyon jó egyezést mutatnak, amely egyezés a spektrumok azonosságát bizonyítja. Fentiekből eredményként levonható, hogy a nagy sebességgel felvett spektrumok ténylegesen az anyagra jellemzőek és nem szenvednek olyan torzulást, amely az anyag azonosítását meggátolná. A mérési körülmények optimalizálása után megvizsgáltuk, hogy a nagysebességű spektrum felvétellel milyen eredmény érhető el olyan esetekben, mint az előző alfejezetben ismertetett kodein-oxikodon rendszer, ahol a hányadosképzési módszer csak közvetett információt nyújtott, azaz sem a kromatogramon, sem pedig a hányados kromatogramon nem lehetett inhomogenitásra utaló jelet felfedezni és csak az utóbbi numerikus értékeinek vizsgálata szolgáltatott információt arra nézve, hogy az oxikodon valamilyen anyaggal szennyezett. A 18.ábrán a kromatográfiás csúcs környezetéből felvett 30 spektrumot tüntettem fel.
65
50 oxikodon kodein
0
CD [mdeg]
-50 keverék 240 Hullámhossz [nm] 30
300
20 10
18. ábra.: 5 mol% kodeint tartalmazó oxikodon mintából felvett CD spektrumok (részletes magyarázatot lásd a szövegben)
A spektrumok rögzítése az injektálást követő 260. másodpercben kezdődött meg. Az első négy spektrum (fekete) a tiszta oldószerre, az ötödik spektrum (piros) a kodeinre jellemző tulajdonságokat mutatja. A 240 nm körüli intenzív, pozitív előjelű sáv és a 285 nm körüli kisintenzitású negatív sáv mellett nem észlelhető az oxikodonra oly jellemző 300 nm körüli nagyintenzitású negatív sáv. A hatodik spektrumon azonban ez megjelenik, egyértelművé téve az oxikodon megjelenését az elutumban. A hatodiktól a kilencedik spektrumig (zöld) az oxikodon mellett a kodein is jelen van. Ezt bizonyítja, hogy a 243 nmes és a 276 nm-es maximumok intenzitás aránya nagyobb, mint az a tiszta oxikodon esetében várható lenne, amely. az ugyanebben a hullámhossz tartományban jelentkező kodein nagyintenzitású, pozitív előjelű sávjától eredő
66
ellipticitási érték szuperponálódásának az eredménye. A 10. spektrum után már nem változnak a hányadosok, a kodein itt már nem szennyezi az oxikodont. A 20. spektrum után a jel/zaj viszony nagymértékű romlása miatt már nem analizálhatók. A 19. ábrán a fentebb elmondottakat szemléltető, a spektrumok jellemző hullámhosszainál leolvasott intenzitás értékek hányadosai vannak feltüntetve. Meg kell jegyeznem, hogy az egyenes szakaszon a hányadosok azért különböznek a 8. táblázatban megadottaktól, mert a spektrumokból nem vontuk ki az eluens spektrumát, így a hányados értékek kismértékben torzulnak. További eltérést jelent, hogy a kodeinnel szennyezett oxikodon 243 nm-nél mutat maximumot szemben a tiszta oxikodon 240 nm-es maximumával és jelen esetben a 243 nm-es hullámhossz volt az, ahol az intenzitás értékek leolvasása megtörtént. 2 1 276nm/243nm
0
300nm/276nm 300nm/243nm
-1 -2 -3 -4
6
8
10
12
Spektrum száma
19. ábra.: 5 mol% kodeinnel szennyezett oxikodon jellemző spektrális maximumainak (300, 276 és 243 nm) hányados értékei
67
14
A
60
tényleges
CD [mdeg]
(kék)
spektrum száma
50 40
10
20
kromatogram a
kromatog-
szinkronizált
30
ábrája
látható. A kék tengelyeken a kromatográfiás, míg a
0 30
10 200
és
a
ramból felvett spektrumok
40
20
20.ábrán
belső
lila
spektrális -80
tengelyen
a
információkat
tüntettem fel. A 300
400
500
600
700
20. ábra.: 5 mol% kodeint tartalmazó oxikodon kromatogramja (kék) és a belőle felvett spektrumok dezése a 18. ábrán jól látható, a 20.ábrán
spektrumokat
ugyanazokkal a színekkel történő jelöltem, mint a 18.ábrán. A spektrumok háromdimenziós
elren-
viszont a hullámhossz tengely
merőleges a papír síkjára, a spektrumok számozása párhuzamos a papír síkjával, ezért csak a spektrumok pozitív és negatív maximumai láthatóak. A 240 nm-nél regisztrált kromatogram és a pozitív maximumok alakja paralel futnak, így a kromatogram és a felvett spektrumok fedésbe hozhatók egymással. A nagy sebességű CD felvételeken alapuló és az előző alfejezetben tárgyalt ’hányados kromatogram’ módszer jól kiegészíti egymást, segítségükkel homogénnek tűnő, de több anyagot tartalmazó kromatográfiás csúcsok homogenitás és tisztaságvizsgálata végezhető el.
68
5.3.3
KROMATOGRÁFIÁS CSÚCSFELBONTÁS A SZIMULTÁN KETTŐS CD/UV DETEKTÁLÁS SEGÍTSÉGÉVEL
A csúcsfelbontás kettő detektálás alapján történő elvét a módszerek fejezetben ismertettem és a módszer matematikai levezetését is leírtam. Ebben a fejezetben három különböző példán keresztül szeretném a módszer alkalmazhatóságát demonstrálni. Az első eset az, amikor rokon szerkezetű, de nem izomer viszonyban álló molekulák a modellvegyületek, tehát sem konstitúciós, sem konformációs, sem pedig
konfigurációs
izoméria
nem
áll
fenn.
A
második
esetben
a
metiltesztoszteron oxim Z és E geometriai izomerjeinek részlegesen elváló kromatogramját bontottuk fel, a harmadik esetben pedig egy enantiomerpár részleges elválasztása után végeztük el a dekonvoluciót. A kodein-hidrokodon és a kodein-oxikodon elválasztásának körülményei teljesen megegyeznek a korábbiakban leírtakkal. A metiltesztoszteron-oxim geometriai izomerjeinek elválasztását fordított fázisú oszlopon (ODS C18, 250x4mm, JONES Chromatography), 40 °C hőmérsékleten, 1 ml/perc áramlási sebességű metanol (60 tf%) és víz (40 tf%) eluens összetételű mozgófázissal, a detektálást 245 nm-en végeztük. Az oximképzési reakció ammónium acetáttal pufferolt etanolos közegben 65 °C-on két óra alatt kvantitatíve lezajlik [85]. Természetesen számos más ketoszteroid is szerepelt a vizsgálatban, azonban jelen dolgozat szempontjából csak a részleges elválást mutató metiltesztoszteront említem. Az MM285a jelű anyag 0.2% (m/v%) koncentrációjú racém elegyének elválasztását Chiralcel OD oszlopon (250x4 mm, DAICEL, Japán) végeztük el. A detektálás 243.2 nm-en, 1 ml/perc sebességű eluens áramlás mellett történt. Az eluens összetétele a következő volt: n-Hexan 75 tf%, i-propanol 23 tf%, metanol 2 tf% és 12,5 µl trietil-amin (100 ml eluensre nézve). A
metiltesztoszteron-oxim
szemipreparatív
elválasztást
izomerjeinek elúciós követően
69
H-NMR
sorrendjét előzetes
technika
segítségével
határoztuk meg, míg az MM285a jelű anyag enantiomerjeinek esetében az elúciós sorrend megállapítása még nem történt meg, azonban ennek a munka szempontjából nincs jelentősége. A kromatográfiás gyakorlatban sokszor előfordul, hogy a kapott csúcsok nem szimmetrikusak és az is, hogy két vagy több anyag csúcsa átfedi egymást. Ilyenkor nehéz megbecsülni az átfedés mértékét és a görbék lefutását. Az irodalomban számos eset található, amikor az elválasztás láthatóan nem tökéletes, azonban a szerzők a kromatogramokat kvantitatív célra használják fel. A csúcs alatti terület integrálásának módja nagyban befolyásolja a kapott eredményt, azonban csúcsfelbontással reálisabban lehet az egyes csúcsokat értékelni. Az elmondottakat jól szemlélteti a kodein és a hidrokodon elválasztásának példája. A 21.ábrán 6.75 mmol/dm3 kodeint és 18.25 mmol/dm3 hidrokodont tartalmazó minta kromatogramja (21.a), a kromatogramból származtatott hányados kromatogram (21.b) valamint a felbontott görbék (21.c, 21.d) láthatók. Nagy előnyt jelent a kromatogram felbontásában az a tény, hogy bár a két anyag UV abszorpciós spektruma meglehetősen hasonló, addig a CDspektrumok 242 nm-nél jelentős intenzitásbeli különbséget mutatnak. Tiszta kodein esetében a CD/UV hányados 93 körüli, míg a tiszta hidrokodon esetében 49.5-es érték, amely jelentős különbség, és így a mérési adatok alapján mind a CD, mind pedig az UV görbék könnyedén felbonthatók. A felbontáshoz a korábban már tiszta anyagoknál meghatározott hányados értékeket használtuk fel.
70
21.a
30
0,3 CD [mdeg] (bal) UV [AU] (jobb)
24 18 12
0,2 0,1
6 0
0,0 0
120
150
240
360
480
600
720
840
960
240
360
480
600
720
840
960
21.b
100 50 0 -50 -100 -150
0
120
UV detektor jel kodein jele a felbontás után hidrokodon jele a felbontás után
21.c
0,3 0,2 0,1 0,0 0
120
240
360
480
720
840
960
CD detektor jel [mdeg] kodein jele a felbontás után hidrokodon jele a felbontás után
21.d
30
600
20 10 0 0
120
240
360
480
600
720
840
Time [sec]
21. ábra.: 27 mol% kodeinnel szennyezett hidrokodon CD- és UV kromatogramja (21.a), hányados kromatogramja (21.b) valamint a felbontás utáni UV (21.c) és CD (21.d) jelek
71
960
A 22.ábrán 2.45 mmol kodeint és 25.8 mmol oxikodont tartalmazó minta kromatogramja látható. 40
0,8
22.a
CD [mdeg] (bal) UV [AU] (jobb)
30
0,6
20
0,4
10
0,2
0
0,0 0
120
240
360
480
600
720
200
840
960
22.b
100 0 -100 -200 0
120
240
360
480
600
720
840
960
0,8 22.c
0,6
UV detektor jel kodein jel a felbontás után oxikodon jel a felbontás után
0,4 0,2 0,0 0
120
240
360
480
600
720
840
960
40 22.d
30
CD detektor jel [mdeg] kodein jele a felbontás után oxikodon jel a felbontás után
20 10 0 0
120
240
360
480
600
720
840
Time [sec]
22. ábra.: 8.6 mol% kodeinnel szennyezett hidrokodon CD- és UV kromatogramja (22.a), hányados kromatogramja (22.b) valamint a felbontás utáni UV (22.c) és CD (22.d) jelek
72
960
A görbe lefutása alapján nehéz megítélni, hogy a csúcs egy vagy több komponenst tartalmaz, mivel semmilyen erre utaló deformáció nem látszik a görbén, a két anyag látszólag nem válik el egymástól. A kettős detektálást alkalmazva azonban a kísérleti adatok és a hányados-kromatogram alapján a görbe felbontható és a szennyezőként jelen lévő kodein is láthatóvá válik (22.c,22.d). A felbontás után kapott görbék kiértékelésével, és a csúcs alatti terület integrálásával a következő eredmények kaphatóak: A CD detektálás alapján 26.3 mMol/dm3 oxikodon és 2.48 mMol/dm3 kodein, míg az UV detektálás alapján 26.4 mMol/dm3 az oxikodon és 2.49 mMol/dm3 a kodein
mennyisége.
A
szennyezésként
jelenlévő
kodein
mennyiségét 2%-on belüli hibával meg lehetett becsülni úgy, hogy a szennyezettségre csak a hányados kromatogram számszerű értékének a tiszta oxikodonét meghaladó mértéke utalt. Természetesen ez az eljárás nem jelenti azt, hogy ismeretlen szennyezések esetén ez az eljárás alkalmazható, de a módszer hatékonyságának demonstrálására mindenképp megfelelő. A következő példában a metiltesztoszteron-oxim geometriai izomerjeinek részleges elválasztását és a görbék felbontását mutatjuk be. A 3-as helyzetű keto-csoport átalakításával két izomer, a Z és az E oxim képződik. A 23.ábrán a kétféle detektálási módszerrel rögzített kromatogramok (23.a) és a hányados kromatogram (23.b), valamint a felbontott görbék (23.c, 23.d) láthatók. Az eredeti kromatogramokon látszik, hogy a csúcsok átfedik egymást. A jel/zaj arány viszont kedvező, vagyis a hányados kromatogramokon csak ott nő meg a zaj, ahol már alacsony a CD és az UV jelek intenzitása, ezért a hányados értékek megbízhatóak. A két izomer CD/UV hányadosa azonban csak kismértékben különbözik, kevésbé jól definiált a különbség, mint az előző példában, ennek megfelelően a felbontás is bizonytalanabb. A kvantitatív kiértékelés a felbontott görbékből ilyen esetekben meggondolandó, de az eredeti kromatogramokon végzett integrálásnál a csúcs kezdetét valamint a végét jelző markereket objektívebben lehet elhelyezni, mint abban az esetben, ha nincs képünk az elutumban lévő anyagok eloszlásáról. A felbontás során kapott görbék –bár informatívak-, tovább ’finomíthatók’, amennyiben valamelyik kromatográfiás csúcsleíró és modellező eljárást alkalmazzuk (EMG,PMG).
73
40
30
1,5
CD [mdeg] (bal)
23.a
UV [AU] (jobb)
40
23.b
30 1,0
20 0,5
10
20 10 0
0
0,0 -10
960
1080
1200
1320
1440
1560
1680
960
1080
1200
1320
1440
1560
1680
2,0
23.c
1,6
40
UV detektor jel Z-izomer a felbontás után
CD detektor jel [mdeg] Z-izomer jele a felbontás után
30
E-izomer a felbontás után
1,2
23.d
0,8
E-izomer jele a felbontás után
20
0,4
10
0,0 0 -0,4 960
1080
1200
1320
1440
1560
1680
Time [sec]
960
1080
1200
1320
1440
1560
Time [sec]
23. ábra.: Metiltesztoszteron-oxim Z- és E-izomerjeinek CD- és UV-detektálása (23a), hányados kromatogramja (23b), valamint a felbontott UV(23.c) és CD-jelek (23.d) A CD vagy ORD/UV detektálás vitathatatlanul legspecifikusabb és leghatékonyabb felhasználási területe az enantiomer elválasztás. Következik ez abból is, hogy a hányados-képzés során a kiroptikai jelek ellentétes előjeléből adódóan a hányados kromatogram pozitiv és negatív egyenes tartományokra válik szét azokban az időintervallumokban, ahol az elutum csak az egyik enantiomert tartalmazza tisztán. Ezeknek az egyenes szakaszoknak az abszolút értéke megegyezik és független attól, hogy a kiindulási elegy azonos mennyiségben tartalmazta az enantiomereket (racém) vagy valamilyen enantiomer túlsúly állt-e fenn, amelyre a CD és UV detektálással kapott csúcs területéből lehet következtetni. A két egyenes szakasz közti átmenet az enantiomer összetétel függvényében fog változni. Az átmeneti szakaszon CD detektor esetében metszi az y=0 egyenest, itt az elutumban a két enantiomer azonos mennyiségben van jelen. A görbék felbontása után a számított kromatogramokból megadható a kiindulási elegy összetétele, következtetni lehet pl. egy enantiomer túlsúlyt produkáló reakció hatékonyságára is, mivel a
74
1680
görbe alatti területek aránya azonos az enantiomer aránnyal. Az átfedés mértékének ismerete nagyon fontos kérdés a preparatív kromatográfiás eljárások tervezésénél és kivitelezésénél. A fent elmondottakat szemlélteti a 24. ábra. Az MM285 jelű vegyület, amint az látható a 7. ábrán, királis szénatommal (C1) rendelkezik. Ismert, hogy a két enantiomer fizikai-kémiai tulajdonságai a kiroptikai tulajdonságok kivételével megegyeznek, ezért a kettős detektálási módszerek közül elvileg is csak azok jöhetnek szóba, ahol az egyik jelet kiroptikai módszerrel kapjuk. A diódasoros többcsatornás UV detektálás enentiomerek részleges elválasztás során nem használható a görbék felbontására, mivel az UV spektrum bármely két hullámhosszát választjuk is ki, azok hányadosa a két enantiomer esetében mindig megegyező.
15
75
1,5
23.a
10
CD [mdeg] (ba UV [AU] (jobb)
5
0,5
0
0,0 -0,5
-5
23.b
50
1,0
-1,0 -10
25 0 -25 -50
-1,5 -75
-15 300
360
420
480
540
600
300
360
420
480
540
600
2,0 23.c
10
1,5
23.d
CD detector jel [mdeg] +MM285 felbontás után -MM285 felbontás után
UV detector jel +MM285 a felbontás után -MM285 a felbontás után
1,0
0
0,5
-10 0,0 300
360
420
480
540
600
300
360
420
480
540
600
Time [sec]
Time [sec]
24. ábra.: Az MM285 vegyület kromatogramja CD- és UV detektálással (24a), hányados kromatogramja (24b), valamint a felbontott UV- (24.c) és CD-jelek (24.d)
75
6.
MEGBESZÉLÉS Az orvostudomány és a gyógyszerkutatás fejlődése a kiroptikai analízis
újabb módszereinek kidolgozását teszi szükségessé. Mind az in vivo mind pedig az in vitro vizsgálatok kiterjednek a molekulák egymással és az élő szervezet biokémiai folyamatait szabályozó kis és nagy molekulákkal való királis kölcsönhatásaira. Ezeknek a folyamatoknak a nyomon követése nagy teljesítőképességű, specifikus és szelektív analitikai módszerekkel oldható meg. Disszertációmban elsődlegesen a kiroptikai és a kombinált kiroptikaiultraibolya kettős spektroszkópia alkalmazásán alapuló, általunk kidolgozott, -az irodalomban mások által még nem publikált- módszereket kívántam bemutatni. Az enantiomertisztaság meghatározására kidolgozott közvetlen analitikai módszer olyan analitikai eljárás, amely elválasztástechnika alkalmazása nélkül képes egy minta enantiomer összetételéről információt szolgáltatni. Nincs szükség az enantiomerek elválasztására, ezen kívül a módszer még számos előnnyel rendelkezik. Az eljárás gyors, megfelelő körülmények között pontos, kis mennyiségű enantiomer szennyezés meghatározására is alkalmas. A további előnyei a módszer elvéből következnek. A hányadosképzés, mivel ugyan abból a mintából történt szimultán mérés eredménye, koncentrációtól független, tehát nem szükséges a mintában lévő enantiomerek koncentrációját ismerni ahhoz hogy arányukról információt kapjunk. A gyakorlati analitikai munka során ez azt is jelenti, hogy az analitikus által elkövethető hibák közül számosat kiküszöbölődik: az analitikai tömegmérés (bemérés) hibája, a térfogatmérő eszközök pontatlansága, a térfogatmérő eszközök (pipetta, büretta) használata során előforduló hibák. Az enantiomerpár mellett egyéb komponensek is előfordulhatnak, akár szennyezésként, akár mátrixként, akkor a fenti eljárás akirális körülmények között
elvégezhető
kromatográfiás
módszerként
is
használható.
A
kromatográfiás feladat a zavaró, az enantiomerek kiroptikai vagy abszorpciós jelét befolyásoló komponensek elválasztására szűkül, de az enantiomerek elválasztására nincs szükség. A szakmai szempontokon kívül ennek gazdasági jelentősége is van. Elég csak arra gondolni, hogy az analitikai célra használatos
76
királis oszlopok sokkal drágábbak, mint egy általános célokra alkalmas akirális oszlopok. Természetesen, mint minden módszernek, ennek az eljárásnak is vannak hátrányai. A diszimmetria faktor meghatározásához legalább az egyik enantiomernek tisztán a rendelkezésünkre kell állni ahhoz, hogy a hányados értéket pontosan meg lehessen határozni. Fontos, hogy csak az egyik enantiomerre van szükségünk, mivel a másik enantiomer hányados értéke csak előjelében különbözik, nagyságában nem, így ez az egyszerűsítés a vizsgálatokat megkönnyíti. A másik problémát az jelentheti, ha az enantiomerek mellett a kiroptikai vagy az abszorpciós jelet befolyásoló egyéb komponensek is vannak a mintában, ám ekkor a módszer előzőekben említett, kromatográfiával kombinált változata alkalmazható. A hányadosképzésen alapuló enantiomer tisztaság elvének kidolgozása és
a
kromatográfiás
felhasználás
lehetőségek
mellet
a
módszer
általánosításával ki lehetett terjeszteni az alkalmazások körét. Kiroptikai és UV detektálással megoldottuk királis molekulákat tartalmazó keverékek esetében a kromatográfiás
csúcshomogenitás
és
csúcstisztaság
vizsgálatát
is.
Hangsúlyozzuk azonban, hogy ez az elv nem csak erre a detektor párosításra igaz, hanem elvileg bármilyen két fiziko-kémiai tulajdonság detektálásával a feladat megoldható. Kiroptikai detektor alkalmazása esetén a módszer természetesen a királis anyagokra korlátozódik, azonban ez egyben szelektívvé és specifikussá is teszi az eljárást. Az elválasztandó anyagok részleges elválasztása esetén nincs szükség egyik anyagra sem tisztán, hogy a diszimmetria faktort meghatározzuk, mivel a hányados kromatogramból ez az érték kinyerhető. A módszer felhasználása szintén hordoz gazdasági és gazdaságossági előnyöket. Az ipari méretű gyógyszer- élelmiszer- és vegyszergyártás során alkalmazott preparatív elválasztások optimalizálását, az egyes frakciók leggazdaságosabb kinyerését lehet megtervezni a módszer segítségével azokban az esetekben, amikor az egyes frakciók között átfedés van. A másik előnyös alkalmazási terület a módszerfejlesztés. Egy új kromatográfiás eljárás kidolgozása számos empirikus tapasztalaton alapul. Az
77
elválasztás
optimalizálása
során
sokféle
állófázis
és
oldószer
elegy
kipróbálására van szükség. Hasznos, ha az analitikus az elválasztás hatásosságának,
a
csúcshomogenitást
és
csúcstisztaságot
megbízható
módszerrel ellenőrizheti. A hányadosképzésen alapuló kromatográfiás módszerek hibájának tekinthető az információ vesztés. A hányadosképzéssel a komponensek koncentrációjára vonatkozó információ elvszik, így a kvantitatív következtetések levonására a módszer csak közvetve alkalmas. Közvetlenül alkalmazható azonban a módszer, ha a két komponens enantiomer. A hányadosképzés másik kromatográfiás alkalmazási lehetősége az átfedő csúcsok felbontása. Egy kromatográfiás feladat során elsődleges cél az összes komponens teljes szétválasztása, azonban ez nagyszámú, hasonló kémiai szerkezettel rendelkező komponens esetében, egy kromatográfiás rendszerben nem mindig valósítható meg. Az átfedő csúcsok egyedi komponensekre való felbontása megoldhatja ezt a problémát, eldönthetjük, hogy hol kezdjük meg és hol fejezzük be az egyes csúcsoknál a kiértékelést. Ezáltal, -főképpen a szennyezés vizsgálatoknál-, az analízis eredménye pontosabbá és megbízhatóbbá tehető.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel
tartozom
Dr.
Gergely
András
egyetemi
docensnek,
témavezetőmnek és munkatársamnak, hogy tapasztalatával és tanácsaival segítette munkámat, megteremtette és biztosította a munkához szükséges feltételeket és Dr. Szász György egyetemi tanárnak, intézetünk korábbi igazgatójának támogatásáért és a kromatográfiás munkához nyújtott szakmai segítségéért. Külön köszönet illeti Dr. Noszál Béla egyetemi tanárt, intézetünk jelenlegi igazgatóját, aki oktatói és kutatói pályám minden szakaszában tanácsaival segítette munkámat és munkacsoportunk működéséhez biztosította az anyagi hátteret. Köszönet illeti továbbá Matalin Istvánné Foór Ilonát a lelkiismeretes, precíz és alapos technikai segítségért.
78
IRODALOMJEGYZÉK 1 Mason, S.,F.: Nature 311 (1984) 19-23 2 Bonner, W., A.; Rubenstein E.: Biosystems 20 (1987) 99-111 3 Prelog, V.: Science 193 (1976) 17-24 4 Fabros, S.; Smith, R. L.; Williams R. T.: Nature 215 (1967) 296 5 Hartlmaier, K., M.: Zahnartztl-Mitt. 61 (1971) 62-65 6 Gross ,M.; Cartwright, A.; Campbell, B.; Bolton, R.; Holmes, K.; Kirkland, K.: Drug Inform. J. 27 (1993) 453-457 7 Drayton, C.,J.: Drug Compendium (Vol.6). In:Comprehensive Medicinal Chemistry, ed.:Hansch C., Oxford (1990) 242-965 8 Chen, C.,Y.;Shieh, W.,R.; Chen, C.,S.: Clin.Research & Reg. Affairs 9 (1992) 247-259 9
Beck, M.:Komplex egyensúlyok kémiája. Akadémiai Kiadó 1965. p.56
10 Katzin, L. J.; Gulyás, E.: J. Phys. Chem. 64 (1960) 1739-1741 11 Beck, M.; Csiszár, B.; Szarvas, P.: Nature 188 (1960) 864-865 12 Hegedüs, H.; Gergely, A.; Horváth, P.; Noszál, B.: J. Chem. Res. 5 (1999) 306-307 13 Berhallam, R.; Collange, E.; Paris, M.R.: Bull. Soc. Chim. France 6 (1985) 1159 14 Szarvas, P.; Tibély, S.: Magy. Kém. Foly. 57 (1951) 212-219 15 Horváth, P.:Egyetemi doktori disszertáció. SOTE, Budapest, 1990 16 Petterson, L; Andersson, I.: Acta. Chem. Scand. 26 (1972) 2249-2254 17 Engle, A. R.; Purdie, N.: Anal. Chim. Acta 298 (1994) 175-182 18* Horváth, P.; Gergely, A.; Noszál, B.: J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, (1996) 1419-1422 19 Kirkwood, J.G.: J.Chem Phys. 5 (1937) 487-494 20* Noszál, B.; Erdélyi, M.; Horváth P.: Individual chiroptical characteristics of unseparable triplet rota-microspecies. 10th International Symposium on Chiral Discrimination. Vienna, Austria 1998. aug. 30- sept. 2 21 European Pharmacopoeia 2nd ed., Maisonneuve S. A., Paris, 1980 22 Pharmacopoea Hungarica VII., Medicina Könyvkiadó, Budapest, 1986
79
23 Gergely, A.: Application of circular dichroism spectopolarimetry to the determination of steroids in:Techniques and Instrumentation in Analytical Chemistry (14):Analytical Application of Circular Dichroism ed.: Purdie, N. and Brittain, H. G., Elsevier, Amsterdam. 1994. pp.293-305 24 Bowen, J.M.; Crone, T.A.; Head, V.L.; McMorrow H.A.; Kennedy, R.K.; Purdie, N: J. Forensic Sci. 26 (1981) 664-670 25 Han, S.M.; Purdie, N.: Anal. Chem. 57 (1985) 2068-2071 26 Bowen, J.M.; McMorrow, H.A.: Purdie, N.: J. Forensic Sci. 27 (1982) 822-826 27 Crone, T.A.; Purdie, N.: Anal Chem. 53 (1981) 17-21 28 Bowen, J.M.; Crone, T.A.; Kennedy, R.K.; Purdie, N.: Anal. Chem. 54 (1982) 66-68 29 Han, S.M.; Purdie, N.: Anal. Chem. 58 (1985) 113-116 30 Palma, R. J.; Young, J.M.; Espenscheid, M. W.: Analyt. Lett. 18 (1985) 641-652 31 Mitschker, L.A.: The chemistry of the tetracyclin antibiotics Vol.13, Marcel&Dekker, 1978 32 Purdie, N.; Swallows, K.A.: Anal Chem. 59 (1987) 1349-1352 33 Gortázar, P.; Ravina, M.; Vázquez ,J.T.: J.Pharm. Sci. 84 (1995) 1316-1321 34 Hegedűs H., Gergely A., Veress T., Horváth P.: Analusis 27 (1999) 458-463 35 Ryan, J.A.: J. Pharm. Sci. 73 (1984) 1301-1302 36 Pesez, M.; Bartos, J.:Colorimetric and fluorometric analysis of organic compounds and drugs in:Clinical and biochemical analysis Vol1. ed.:Schwartz, M.K., Marcel Dekker Inc., New York 1974 37 Hegedűs, H.: Doktori értekezés SOTE Doktori Iskola 84, Budapest 1999 38 Yoshisa, N.; Yamaguch, H.; Iwao, T.; Higashi, M.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2 (1999) 379-386 39 Negi S.; Terai, K.; Kano, K.; Nakamura, K.: J. Chem. Res.S. (1998) 750-751 40 Bowen, J.M.; Purdie, N.: Anal. Chem. 53 (1981) 2239-2243 41 Han, S.M.; Purdie, N.: Anal. Chem. 56 (1984) 2822-2824 42 Perczel, A.; Laczkó, I.; Hollósi, M.: Peptidek térszerkezet-vizsgálata,
80
A kémia legújabb eredményei 44., szerk.: Csákvári, B., Akadémiai Kiadó, Budapest ,1994. 43 Carter, D.C.; He, X. M.: Science 249 (1990) 302-303 44 Kragh-Hansen, U.: Danish Med. Bull. 37 (1990) 57-84 45 Maruyama, K.; Nishigori, H.; Iwatsuru, M.: Chem. Pharm. Bull. 33 (1985) 5002-5012 46 Otagiri, M.; Nakamura, H.; Maruyama, T.; Imamura, Y.; Takadate, A.: Chem. Pharm. Bull. 37 (1989) 498-501 47 Izumi, T.; Nagayama, T.; Kitagawa, T.: Chem. Pharm. Bull. 37 (1989) 746-752 48 Ascoli, G.; Bertucci, C.; Salvadori, P.: J. Pharm. Sci. 84 (1995) 737-741 49 Szókán, Gy.; Szarvas, S.; Májer Zs.; Szabó D.; Kapovits, I; Hollósi, M: J. Liq. Chromatogr R.T. 22 (1999) 993-1007 50 Bertucci C.; Andrisano, V,; Cavrini, V.;Castiglioni, E.: Chirality 12 (2000) 84-92 51 Kanazawa H.; Kunito, Y.; Matsushima, Y.; Okubo, S.; Mashige, F.: J. Chromatogr. A 871 (2000) 181-188 52 Brandl, F.; Pustet, N.; Mannschreck, A.: Int. Lab. 29 (1999)10C-15C 53 Gergely A.:The use of circular dichroism as a liquid chromatographic detector in:Techniques and Instrumentation in Analytical Chemistry (14): Analytical Application of Circular Dichroism ed.: Purdie, N. and Brittain, H. G., Elsevier, Amsterdam. 1994. pp.:279-292 54 Zukowski, J.; Tang, Y.; Berthod, A.; Armstrong, D.W.: Anal. Chim. Acta 258 (1982) 83-92 55 a.) Mannschreck, A.; Andert, D.; Eiglsperger, A.; Gmahl, E; Buchner, H.: Chromatographia 25 (1988) 182-188 b.) Mannschreck, A.; Kieβsl, L.: Chromatographia 28 (1989) 263-266 c.) Brandl, G.; Kastner, F.; Mannschreck, A.; Nölting, B.; Andert, K.; Wetzel, R.: J. Chromatogr. 586 (1991) 249-254 d.) Mannschreck, A.: Trends Anal. Chem. 12 (1993) 220-225
81
56 a.) Bertucci, C.; Domenici, E.; Salvadori, P.: J. Pharm. Biomed. Anal. 8 (1990) 843-846 b.) Bertucci, C; Salvadori, P.; Lopes-Guimares, L. F.: J. Chromatogr. 666 (1994) 535-539 c.) Bertucci, C.; Andrisano, V.; Cavrini, V.; Castiglioni, E.: Chirality 12 (2000) 84-92 57* Horváth, P.; Gergely, A.; Noszál, B.: Chromatographia 48 (1998) 584-588 58* Gergely, A.; Horváth, P.; Noszál, B.: Anal. Chem. 71 (1999) 1500-1503 59* Gergely, A.; Horváth, P.; Noszál, B.: J. Chrom. Sci (2000) /közl. elf./ 60 Zsila, F.; Gergely, A.; Horváth, P.; Szász, Gy.: J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 22 (1999) 713-719 61 Souter, R. W.: The determination of isomeric purity in:Modern methods of Pharmaceutical Analysis, 2nd ed., CRC Press, Boston, 1991. pp. 422-423 62 Hanna, G. M.; Lau-Cam, J.; J. Pharm. Biomed. Anal. 11 (1993) 66563 Jaroszewski, J. W.; Olsson, A. J.: J. Pharm. Biomed. Anal. 12 (1994) 29564 Ladányi, L.; Szilágyi, I.; Hermetz, I.: Acta Pharm. Hung. 62 (1992) 23165* Horváth, P.; Gergely, A.; Noszál, B.: Talanta 44 (1997) 1479-1485 66 Nógrádi, M.:Bevezetés a szterokémiába Műszaki Kiadó, Budapest, 1975 67
a.) Yost, R.; Stoveken, J.; MacLean, W.: J.Chromatogr., 134, (1977) 73-82. b.) White, P.C.: J.Chromatogr., 200, (1980) 271-276. c.) Sottolano, S. M.; Lurie, I. S.: J. Forensic. Sci., 28, (1983) 929-935. d.) Szepesi, G.; Gazdag, M.; Mihályfi, K.:J. Chromatogr. 464, (1989) 265-278. e.) Mcintyre, I. M.; King, C. V.; Skafidis, S.; Drummer, O.H.: J. Chromatogr. Biomed. Appl., 621, (1993) 215-223.
68
a.) Billiet, H. A.; Wolters, R.; De-Galan, L.; Huizer, H.: J. Chromatogr. 24 (1986) 351-361. b.) Keller, H. R.; Massart, D. L.: Anal. Chim. Acta 1991, 246, 379-390. c.) Debertrand, N.; Barcelo, D.: Anal. Chim. Acta 1991, 254, 235-244.
82
d.) Castledine, J. B.; Fell, A. F.; Modin, R.; Sellberg, B.: J. Pharm. Biomed.Anal. 9 (1991) 619-624. e.) Fasanmade, A. A.; Fell, A. F.: Anal. Lett. 25 (1992) 363-378. f.) Keller, H. R.; Massart, D. L.: Anal. Chim. Acta 263, (1992), 21-28. g.) Koves, E. M.; Wells, J.: J. Forensic Sci. 37 (1992) 42-60. h.) Keller, H. R.; Massart, D. L.; Debeer, J. O.: Anal. Chem. 65 (1993) 471-475. i.) Castledine, J. B.; Fell, A. F.: J. Pharm. Biomed. Anal. 11 (1993) 1-13. j.) White, P. C.; Catterick, T.: Analyst 118 (1993) 791-799. k.) Logan, B.K.: Anal.Chim. Acta 288 (1994) 111-122. l.) Sanchez, F. C.; Khots, M. S.; Massart, D. L.: Anal. Chim. Acta 290 (1994) 249-258. 69
a.) Carter, G. T.; Schiesswohl, R. E.; Burke, H.; Yang, R.: J. Pharm. Sci. 71 (1982) 317-321. b.) Fell, A. F.; Scott, H. P.; Gill, R.; Moffat, A.C.: J. Chromatogr. 282 (1983) 123-140. c.) Fabre, H.; Fell, A. F.: J. Liq. Chromatogr. 15 (1992) 3031-3043.
70 Bertuci C., Andrisano V., Cavrini V., Castiglioni E. Chirality 12 (2000) 84-92 71 Bossu E., Cotichini V., Farina A. Chirality, /bírálatra beérkezett kézirat/ 72 Felinger, A. Adv. Chromatogr. 39, (1998) 201-238 73 Felinger, A.: Data Analysis and Signal Processing in Chromatography pp.274-275 in Data Handling in Science and Technology Vol 21. ed.:Vandenginste B.G.M., Rutan S.C.,Elsevier Science 1998 74 Sharaf, M. A. Adv. Chromatogr. 37 (1998) 2-28 75 Foley, J.P.;Dorsey, J. G. J. Chromatogr. Sci. 22 (1984) 40-46 76 Foley, J.P. J. Chromatogr. 384 (1987) 301-313 77 Berthod, A. Anal. Chem. 57 (1985) 2394-2395 78 Berthod, A. Anal. Chem. 63 (1991) 1879-1884 79 Torres-Lapasio, J. R.; Baeza-Baeza, J.J.; Garcia-Alvarez-Coque, M.C. Anal.Chem. 69 (1997) 3822-3831 80 Felinger, A. Anal. Chem. 6 (1994) 3066-3072
83
81 Felinger, A.; Pap, T.; Inczédy, J. Talanta, 41 (1994) 1119-1126 82 Kökösi, J.; Almási, J.; Podányi, B.; Fehér, M.; Böcskei Zs.; Simon K.; Hermecz, I. Heterocycles 48 (1998) 1851-1866 83 Albert A., Serjeant E. P. The Determination of Ionization Constant, Chapman and Hall Ltd, London pp.:44-45 84 Szász Gy., Budváriné Bárány Zs.: Nem közölt eredmények (1996) 85 Szentesi A, Gergely A., Horváth P., Szász Gy. Fresen. J. Anal. Chem. 368 (2000) 384-388
84
