Spektrofotometri UV-Vis adalah salah satu teknik analisis spektroskopik yang memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik) UV (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna. Hukum Dasar dalam Spektrofotometri UV-Vis Spektrofotometri uv-vis mengacu pada hukum Lambert-Beer. Bunyi Hukum Lambert–Beer, yaitu : “Bila cahaya monokromatis melalui media transparan maka bertambah turunnya intensitas cahaya yang dipancarkan sebanding dengan bertambahnya kepekatan media.” Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan linieritas antara absorban dengan konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan. Hukum Lambert-Beer dinyatakan dalam rumus sbb : A = e.b.c dimana : A = absorban e = absorptivitas molar b = tebal kuvet (cm) c = konsentrasi Instrumen Spektrofotometri Uv – Vis 1. Sumber Cahaya Sumber cahaya pada spektrofotometer UV-Vis ada dua macam : Lampu Tungsten (Wolfram), lampu ini digunakan untuk mengukur sampel pada daerah tampak. Bentuk lampu ini mirip dengna bola lampu pijar biasa. Memiliki panjang gelombang antara 350-2200 nm. Spektrum radiasianya berupa garis lengkung. Umumnya memiliki waktu 1000jam pemakaian. Lampu Deuterium, lampu ini dipakai pada panjang gelombang 190380 nm. Spektrum energi radiasinya lurus, dan digunakan untuk mengukur sampel yang terletak pada daerah uv. Umumnya memiliki waktu 500 jam pemakaian. 2. Monokromator Monokromator adalah alat yang akan memecah cahaya polikromatis menjadi cahaya tunggal (monokromatis) dengan komponen panjang gelombang tertentu.
Komponen – komponen monokromator : Celah untuk masuknya radiasi polikromatis dari sumber radiasi. Lensa/cermin untuk menyerap cahaya Pendispersi cahaya yang berupa prisma atau grating yang dapat memecah radiasi menjadi komponen-komponen panjang gelombang. Lensa/cermin pemfokus cahaya. Celah keluar 3. Kuvet kuvet merupakan wadah yang digunakan untuk menaruh sampel yang akan dianalisis. Cuvet terbuat dari kuarsa atau silika untuk radiasi UV dan gelas biasa atau kuarsa untuk radiasi sinar tampak. Tebal cuvet bervariasi dari 1-10 cm. Cuvet ditempatkan setelah monokromator supaya kemungkinan terjadinya dekomposisi/ fluorescence oleh panjang gelombang berenergi tinggi yang masih ada didalam radiasi polikromatis dapat diminimalkan. Posisi permukaan cuvet tegak lurus datangnya radiasi sehingga kehilangan radiasi akibat pantulan/ refraksi dapat dikurangi. Beberapa jenis wadah sampel (cuvet) :
4. Detektor Detektor akan menangkap sinar yang diteruskan oleh larutan. Sinar kemudian diubah menjadi sinyal listrik oleh amplifier dan dalam rekorder dan ditampilkan dalam bentuk angka-angka pada reader (komputer). Detector dapat memberikan respons terhadap radiasi pada berbagai panjang gelombang. Syarat detektor : Sensitivitas tinggi sehingga daya radiasi yang kecil dapat terdeteksi. Waktu response yang singkat. Stabil.
Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.
Jenis-jenis detektor UV-Vis :
5. Recorder/Visual Display Merupakan system baca yang memperagakan besarnya isyarat listrik, menyatakan dalam bentuk % Transmitan maupun Absorbansi. Operasi Single-beam dan Double-beam spektrofotometer UV-Vis. Berdasarkan banyaknya sumber cahaya, spektrofotometer terbagi menjadi single beam dan double beam spektrofotometer UV-Vis. 1. Single Beam
Skematik single-beam UV-Vis spektrofotometer Prinsip kerja dari single-beam spektrofotometer UV-Vis diawali dengan adanya pemisahan berkas cahaya sumber oleh diffraction grating. Kemudian berkas cahaya tersebut diseleksi oleh kisi agar didapatkan intensitas tertentu. Kemudian berkas cahaya ini akan diserap oleh sample
cuvette kemudian dideteksi oleh detektor. Sebelum dilakukan pengukuran terhadap larutan uji, terlebih dahulu diujikan sample cuvette yang berisi pelarut dari larutan uji. Pada pengujian ini akan didapatkan I 0 yang merupakan intensitas cahaya yang melewati cuvette pelarut. Kemudian dengan proses yang sama dilakukan pengujian terhadap larutan uji dan akan didapatkan I yang merupakan intensitas cahaya yang melewati larutan uji. Kedua proses ini kemudian dibandingkan. 2. double-beam
Skematik double beam UV-Vis spektrofotometer Sementara pada double-beam spektrofotometer UV-Vis, prinsip kerja dari instrument ini diawali dengan adanya pemisahan komponen panjang gelombang cahaya yang berasal dari sumber radiasi UV-Visible oleh prisma ataupun diffraction grating. Kemudian berkas sinar monokromatis akan terbagi menjadi dua bagian dengan intensitas yang sebanding dengan mirror dan dipantulkan. Berkas cahaya yang dipantulkan masingmasing melewati cuvette berisi larutan referensi (berisi pelarut dari larutan uji) dan cuvette berisi larutan uji,kemudian berkas cahaya yang melewati kedua cuvette ini dideteksi oleh detektor. Kedua proses yang bersamaan ini kemudian dibandingkan. Hubungan Antara Warna Pada Sinar Tampak dengan Panjang Gelombang
Hal-hal yang harus diperhatikan 1. Larutan yang dianalisis merupakan larutan berwarna Apabila larutan yang akan dianalisis merupakan larutan yang tidak berwarna, maka larutan tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi larutan yang berwarna. Kecuali apabila diukur dengan menggunakan lampu UV. 2. Panjang gelombang maksimum Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Hal ini dikarenakan pada panajgn gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang gelombang tersebut, perubahan absorbansi untuk tiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar. Selain itu disekitar panjang gelombang maksimal, akan terbentuk kurva absorbansi yang datar sehingga hukum Lambert-Beer dapat terpenuhi. Dan apabila dilakukan pengukuran ulang, tingkat kesalahannya akan kecil sekali. 3.
Kalibrasi Panjang gelombang dan Absorban Spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang dipancarkan dan cahaya yang diabsorbsi. Hal ini bergantung pada spektrum elektromagnetik yang diabsorb oleh benda. Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawa yang terbentuk. Oleh karena itu perlu dilakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban pada spektrofotometer agar pengukuran yang di dapatkan lebih teliti.
Kelebihan Spektrofotometer 1. Penggunaannya luas. Dapat digunakan untuk senyawa organic, anorganik dan biokimia yang diabsorbsi pada daerah ultraviolet maupun daerah tampak 2. Sensitivitasnya tinggi. Batas deteksi untuk mengabsorbsi dapat diperpanjang menjadi 10-6 sampai 10-7 M 3. Selektivitasnya tinggi
4. 5.
Ketelitiannya baik Pengukurannya mudah, dengan kinerja yang cepat
