Určení rodičů (analýza paternity)
Možné problémy •
Oba rodiči neznámi
•
Jeden rodič (matka) znám, druhý neznám
•
Jeden nebo dva rodiči? Samooplození u hermafroditů → potomci mají jen alely matky → deficit heterozygotů oproti HW
•
Samooplození nebo mitotická partenogeneze (klonalita)? klony → fixovaná heterozygotnost u potomků heterozygotů (není segregace) POZOR! Existuje i meiotická partenogeneze.
Chen caerulescens hnízdní parasitismus mimopárové paternity
Limacidae outcrossing
Epiactis prolifera samooplození
Rodič Aa, gamety A a samooplození → potomci AA, Aa, aa klonalita → potomci jen Aa
Deroceras laeve klonalita (očekávalo se samooplození)
Techniky • Dříve minisatelitový alozymy, mtDNA • Dnes převážně
DNA fingerprinting
mikrosatelity
• Další možnosti: AFLP, SNPs, proteinový fingerprinting
RFLP a AFLP • Základem je naštípání DNA restrikčními enzymy • → milióny fragmentů různé délky • Rozdíly díky: – přítomnosti/absenci restrikčních míst – tandemovým opakováním (mikrosatelity, minisatelity) – delece a inzerce
• Zviditelnění jen určité části fragmentů – AFLP selekce primery – RFLP selekce hybridizací
Sir Alec Jeffreys
DNA fingerprinting x
• Jeffreys et al. 1985 – „naštípání“ DNA pomocí restrikčního enzymu – Rozdělení fragmentů pomocí elektroforézy – Hybridizace (jako sonda minisatelit)
• Dostatek kvalitní DNA • Vše na jednom gelu • Laboratorní náročnost
Otec 3
Otec 2
→ Procento sdílených „otcovských“ proužků
Otec 1
DNA fingerprinting
děti
matka
Určení otce
Bucephala clangula
Proteinový fingerprinting •
Hohol severní
•
Proteiny z bílku vajec
•
isoelectric focusing in immobilized pH gradients
•
Problém: nevím jistě, která vejce jsou od „hostitelské“ matky
•
Vnitrodruhový hnízdní parazitismus (více něž polovina hnízd)
•
Zanáší si zřejmě příbuzné samice
Andersson & Åhlund 2000
SNPs (dnes již stovky najednou)
Illumina's GoldenGate Assay
Mikrosatelity Vyhledání primerů pro nové lokusy: dříve: náročné na čas i finance
genomové knihovny, hybridizace se sondou, sekvenování pozitivních klonů
Alternativa – NGS možno i komerčně
Stejné primery často fungují pro více příbuzných druhů (ale ne vždy, mutace v místě nasedání primerů)
70
66
54
12
Alely se liší délkou
CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT
CTTTCTTTCTTTCTTTC
+
CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT
CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT
Určení paternity Matka
Otec
Mládě 1 Mládě 2
Fragmentační analýza
Je možné analyzovat několik lokusů najednou.
LOX8 (CTTT)n(CCTT)n Samec 55 krmící samec
Samice 56 matka
Mládě 57 mládě
• Specializované programy • Automatické dohledání rodičů
Vyvození důsledků
Kolik je třeba lokusů? •
Nutný počet není absolutní
•
Dáno: počtem alel heterozygotností četností alel
Nielsen et al. 2001 různý počet alel, různý počet možných rodičů
velikostí vzorku vazbou lokusů
•
Ideální - hypervariabilní lokusy
•
Obvykle však 6 a více, optimálně kolem 20ti nebo více
•
Tedy nejdříve je nutná pilotní studie dospělců v populaci
•
→ výpočet Exclusion probability, kontrola možné vazby lokusů
Exclusion probability •
Pravděpodobnost, že genotyp náhodně vybraného jedince nebude pasovat na potomka
Tedy pravděpodobnost, že náhodně vybraného jedince vyloučíme jako rodiče •
Často se ale udává i non-exclusion probability (tedy 1 – Exclusion probability)
•
Závisí na počtu lokusů a alel
•
Dobré jsou hodnoty okolo 0,01 a nižší (pro non-exclusion)
•
Vypočítá například Cervus
•
Jiné hodnoty pro prvního a druhého rodiče
Možní rodičové
Ab
Aa
AA
AB AB
Ba matka
Aa potomek
• Exclusion probability – hrubý odhad • Vhodnější → simulace zahrneme i počty a procenta ovzorkovaných jedinců, chyby a jiné problémy (mutace, nulové alely)
Lokusy ve vazbě • → snížení variability • → porušen předpoklad nezávislosti • → vyřazení jednoho z lokusů • Kontrola v běžně dostupných programech • Např. GenePop
Technické a biologické obtíže •
Nulové alely (nikdy se neamplifikují)
•
Allelic dropout (někdy se neamplifikují)
•
False alleles
•
Chyby při zjišťování alel (scoring errors)
•
Lokus na pohlavním chromosomu
•
Mutace
•
Příbuznost potenciálních rodičů (extended family structure) Nejhorší je zařadit mezi potenciální rodiče sourozence potomků!
Nulové alely •
Alely, které nejsme schopni detekovat –
Mutace v místě nasedání primeru
•
→ Falešní homozygoti
•
Odhalení
•
–
Neshoda matek s mláďaty
–
Rozdíl mezi očekávanou a pozorovanou heterozygotností
Podobný efekt má „allelic dropout“ –
Interakce fragmentů při amplifikaci
–
Velký rozdíl v délce alel → kratší alely se lépe amplifikují
–
nízká koncentrace nekvalitní DNA templátu
Heterozygotnost (= Podíl heterozygotních lokusů)
Pozorovaná heterozygotnost - odečtu ze zjištěných genotypů Příklad:
jedinec 1 jedinec 2 HO
Aa AA 0,5
BB BB 0
Cc CC 0,5
Očekávaná heterozygotnost - vypočtu z HW rovnováhy Očekávané frekvence genotypů z HW rovnováhy
p2, 2pq a q2
p = frekvence A = 0,75, q = frekvence a = 0,25
→ očekávaná heterozygotnost na prvním lokusu 2pq = (2 x 0,75 x 0,25) = 0,375
Dd Dd 1 → 0,50
Rozdíl mezi očekávanou a pozorovanou heterozygotností
•
Nadbytek homozygotů → možný výskyt nulových alel
•
Cervus, hodnoty frekvence nulových alel nad 0,05 stojí za úvahu: → homozygoty beru jako potenciální heterozygoty
•
Nadbytek může být ale i díky jiným příčinám: populační struktura, inbreeding, náhoda
Mutace Ibarguchi et al. 2004
• Obvykle se zanedbávají • Mohou však být i poměrně časté (4.5 x 10-2 - 5.1 x 10-6 na lokus)
• Navíc častější u samců (2 až 6x)
• → Vyloučení na základě jednoho lokusu může být špatně
Řešení •
Použít více lokusů
•
Mutace → nejčastěji posun o jednu jednotku opakování
•
Probability of resemblance (PR)
například rodič (CTTT)7 potomek (CTTT)8, délka fragmentu tedy například 120 u rodiče a 124 u potomka
Podívám se na ostatní lokusy a vypočítám s jakou pravděpodobností mohou alely sdílet dva nepříbuzní jedinci.
Možní otci
Pro jeden lokus
Možní otci
Ab AB
AA AC AB BC
Ab AB
Od matky
Součin pravděpodobností přes lokusy
Aa potomek
AC
AA
AB
BB Od matky
Ca potomek
Uria lomvia
• 22% mimopárová paternita bez korekce na mutace • 7% mimopárová paternita s korekcí soulad s jinou použitou technikou
Počítačové programy Cervus Colony SOLOMON (R, Bayes) Newpat Probmax Kinship Famoz Pasos Papa Parente Patri a další viz např. Jones et al. 2010 (Některé programy počítají i s možnými chybami při určování genotypů Cervus3, SOLOMON, Newpat)
Co je nejdůležitější? • Kvalitní data z terénu! • Nejlépe všichni dospělci z populace, behaviorální data, mláďata přiřazena do rodin • Pokud máme jen omezený vzorek → více lokusů (např. 20 dobrých) • Špatná data = špatné výsledky • Možnost srovnání mláďat se všemi potenciálními otci – téměř nemožné u minisatelitového DNA fingerprintingu – snadné u mikrosatelitů
Příklady použití analýzy paternity
Orangutan na Sumatře (paternita)
• Nápadný dimorfismus
(vystouplé tváře a hrdelní vaky u samců)
• Předpoklad: Samci bez nápadných znaků hormonálně suprimováni a nemnoží se
• Mikrosatelity 50 % mláďat je samců bez nápadných znaků → alternativní strategie
Skladování spermií
• Dny u savců týdny u ptáků nebo hmyzu měsíce u mloků roky u hadů a želv • Chrysemys picta
Chrysemys picta
mikrosatelity → po 3 roky mláďata od stejného otce, opakované páření se stejným otcem je nepravděpodobné
Pinus sylvestris Robledo-Arnuncio & Gil 2005 •
Izolovaná populace ve Španělsku 36 stromů (další nejbližší 30 km)
•
DNA z jehličí a 813 embryí
•
Chloroplastové a jaderné mikrosatelity EP=0,996
•
35 embryí → otci mimo lokalitu (min 30 stromů)
•
Vysoká míra samooplození - 25% (3% ve velkých monokulturách)
•
Míra samooplození roste se vzdáleností k nejbližšímu sousedovi
•
Pravděpodobnost oplození klesá strmě se vzdáleností
•
Disperze pylu je výrazně asymetrická
Ptáci •
Řada druhů byla považována za monogamní (pěvci)
•
Ale u 75 % druhů ptáků mimopárová mláďata
•
Skutečně monogamní pěvci – jen 14% (Phylloscopus?)
•
Velké rozdíly i u příbuzných druhů (vlaštovky)
Emberiza schoeniclus až 55% mimopárových mláďat
Malurus cyaneus až 72% mimopárových mláďat
Hirundo pyrrhonota, H. rustica, Delichon urbica, Tachycineta bicolor, T. albilinea, Riparia riparia, Progne subis
Odhad % mimopárových mláďat
• Griffith et al. 2002 • Dostatečný vzorek pro odhad • Více než 200
Dohledání mimopárových otců •
Vzorky z většiny možných rodičů ve sledované populaci
•
Více lokusů
•
Technicky obtížné
Tachycineta bicolor vlaštovka stromová
Určení mimopárových otců Notiomystis cincta (hihi) medozobka novozélandská
Metody Jones & Ardren 2003, Jones et al. 2010
Málo potenciálních rodičů, všichni ovzorkováni, dostatek dobrých markerů → Exclusion (prosté vyloučení) nekompatibilita mezi rodičem a potomkem → zamítnutí rodičovství postupným vyřazováním nakonec zbude jeden možný rodič (→ biologický otec nebo matka)
Zbyde více možných otců než 1, neovzorkováni všichni, víme o genotypizačních chybách → Metody založené na maximální věrohodnosti Categorical and fractional allocation (založeno na pravděpodobnosti chyb a homozygotnosti → homozygot má větší pravděpodobnost předat alelu) → Full probability parentage analysis (Bayesian statistics) (zahrnutí i dalších dat jako vzdálenost hnízd, behaviorální data…) Rodiče neznámi a neovzorkováni → Parental reconstruction Z genotypů potomků z jedné rodiny → rekonstrukce genotypu rodičů Například k určení „multiple paternity“
Full probability model Bayesiánská statistika
•
Složitější modely, zohledňují vzdálenost hnízd, frekveci krmení, párování…
Categorical x fractional allocation •
Vezmu potomka, pro každou kombinaci možných rodičů spočtu pravděpodobnost, s jakou lze kombinací jejich genotypu vygenerovat genotyp potomka → věrohodnostní profil
• Categorical likelihood Potomek přiřazen jednomu nejpravděpodobnějšímu otci, biologicky validní
• Fractional likelihood Potomek přiřazen všem kompatibilním otcům. Statisticky přesnější a proto někdy výhodnější Používá se však zcela vyjímečně
Rodiči neznámí nebo neovzorkováni
→ Parental reconstruction Z genotypů potomků z jedné rodiny → rekonstrukce genotypu rodičů Například k určení „multiple paternity“, „rate of selfing“ Zásadní je velký počet mláďat ve snůšce/vrhu! Optimální je > 10
Příklad genotypy matky a embryí lokus 1
lokus 2
Matka
100
150
300
350
1. embryo 2. embryo 3. embryo
100 150 120
115 120 100
300 350 350
320 310 365
Alely od matky lokus 1
lokus 2
Matka
100
150
300
350
1. embryo 2. embryo 3. embryo
100 150 120
115 120 100
300 350 350
320 310 365
Na druhém lokusu více než dvě alely, které nejsou od matky → více otců (nebo chyba → více lokusů)
Apodemus agrarius a sylvaticus mláďata až od tří samců (Bryja et al. 2008)
Kachny (Kreisinger et al. 2010)
•
Neinvazivně
•
Genotyp matky z peří v hnízdě
•
Genotypy mláďat z blan z vylíhlých vajec
•
Zjištění vnitrodruhového hnízdního parazitismu
•
Dohledání hnízd parazitických samic
•
Opakované hnízdění
•
Rekonstrukce genotypů otců
•
Zjištění extrapárových paternit
•
Dohledání dalších mláďat extrapárových otců
Ambystoma maculatum axolotl skvrnitý Myers & Zamudio 2004
• Jde to i bez matek
• Vnitřní oplození • Spermatofory – Samec klade 20 – 40 – Samice sebere 15 - 20
• 30 – 200 vajec ve snůšce • 2 – 8 samců na snůšku
Alternativní přístup k paternitám •
Vytvoření nejpravděpodobnějších skupin potomků podle jejich příbuznosti
•
Ke skupinám dohledání rodičů (nebo určení počtu rodičů)
•
Silnější než jednoduché paternity
•
Pracujeme s větším množstvím informace (genotypy z celého vrhu nebo snůšky versus genotypy jen jednoho mláděte)
•
Vhodné pro druhy s větším množstvím mláďat ve vrhu (snůšce)
•
Program Colony
Caridina ensifera, sladkovodní krevetka Yue & Chang 2010
• • • • •
4 msat lokusy 20 matek s potomstvem 5 až 30 potomků Minimální počet otců - až 5 Colony – nejpravděpodobnější počet - až 11
Qian et al. 2012 Myrmecia pilosula
• 319 dělníků (17 – 36 na hnízdo) • 9 msat lokusů • 1 - 4 královny na kolonii • Královna se množí s 1 – 9 samci
Polydomní kolonie
Metodická poznámka •
Colony vytvoří nejpravděpodobnější skupiny
•
Nás však často zajímá průkaznost výsledku
•
Srovnáváme tedy věrohodnost dvou hypotéz
•
Např. –
jedinci z hnízda jsou si příbuznější než náhodná dvojice z populace
–
„Full siblings“ versus „half siblings“ versus „unrelated“
•
Program Kingroup
•
Pozor na problém s Bonferroniho korekcí!
•
→ průkaznost zjišťuji jen u vybraných dvojic
Příbuzenský koeficient r • r - kvantitativní míra příbuznosti, lze si představit jako:
Pravděpodobnost sdílení alely jedinci (vynásobeno 2) Podíl stejných alel v genomu jedinců Celková IBD (identity by descent) • Diploidní organismy – – – – – –
Rodič – potomek Sourozenci Jednovaječná dvojčata Nevlastní sourozenci Bratranci a sestřenice Nepříbuzní
0,5 0,5 1 0,25 0,125 0
• Problém: většinou neznám rodokmeny → odhad z několika lokusů (msat) pomocí ML (BAYES) programy RELATEDNESS, KINSHIP (Mac), KINGROUP, makra pro Excel, COLONY
♀
♂
☺
♀
♂
☺ R=0
♀
♂
♀
♂
☺
☺ R = 0.5
♀
♂
♀
♂
☺
☺ R = 0.25
Cynopterus sphinx kaloň krátkonosý Storz et al. 2001 • • • • •
Kolonie složené z harémů, v harému samec a 1 až 37 samic Příbuzenská struktura kolonie a harémů (kin structure)? 10 mikrosatelitových lokusů, r, KINSHIP r blízké nule → jedinci v kolonii jsou nepříbuzní Zásadní role disperze (mláďata z kolonie se v dospělosti nedrží pospolu)
Megaptera novaeangliae Valsecchi et al. 2002 •
Cestují v malých skupinách
•
Tvoří skupiny příbuzní? Kin selection?
•
Mikrosatelity (8 lokusů), KINSHIP, NEWPAT
•
Jediní příbuzní ve skupinách byly matky a jejich potomci.
•
Kromě nich hodnoty r stejné jako při sloučení skupin dohromady
•
Kin selection skupiny nevysvětluje
Cryptomys damarensis Burland et al. 2004 •
Kolonie, i více než 40 jedinců
•
Množí se jen 1 samice (královna) a 1 až 2 samci
•
Mark-recapture → minimální disperze a výměna mezi koloniemi
•
Laboratorní experimenty → inbreeding avoidance
•
Vysvětluje to, proč se množí jen královna?
•
11 kolonií, mikrosatelity, RELATEDNESS
•
Královna má mláďata i se samci, kteří nejsou v kolonii
•
V kolonii často nepříbuzní jedinci opačného pohlaví
•
Inbreeding avoidance nestačí k vysvětlení sociality
•
Dominance královny
Haplodiploidie • ♂♂ haploidní, ♀♀ diploidní • Jeden otec – Sestry: – Matka – dcera
0,75 0,5
• Více otců – Sestry: – Matka – dcera
0,25 - 0,75 0,5
• Více matek i otců
r různé
Polistes dominulus (dříve P. gallicus)
vosík francouzský Queller et al. 2000 •
Hnízdo bez ochranného obalu
•
Zakládá často více přezimovavších samic
•
Dominantní samice klade vajíčka (>90%), subordinátní se starají o potravu
•
Kin selection? (Jsou si samice příbuzné?)
•
Ve třetině případů jsou samice nepříbuzné (ML 35% nepříbuzné 7% sestřenice 56% sestry)
•
Jediná výhoda – nahrazení dominantní samice, pokud zahyne
•
Výjimka u sociálního hmyzu!
Bombus pascuorum
Čmeláci Darrvill et al. 2004 Bombus terrestris
• 10 km transekt, 9 mikrosatelitových lokusů, GENEPOP, KINSHIP • Haplodiploidie, monoandrie → sestry r~0,75
• B. terrestris 30/97 sestry → 80 kolonií B. pascuorom 84/237 sestry → 190 kolonií V hnízdech B. terrestris 4,5x více jedinců → hnízda B.p. 11x četnější • B. terrestris létá až 600 m za květy (sestry často na sousedních bodech)
B. pascuorom vzácně více než 300 m (sestry většinou na stejných bodech)
