Univerzita Palackého Přírodovědecká fakulta
studijní obor: Bioanorganická chemie
Role Mn2+ v organismu a využití jeho komplexů v bioaplikacích
bakalářská práce
Vedoucí práce:
Autor:
RNDr. Bohuslav Drahoš, Ph.D.
Michal Kriegelstein
J m éno a pří j m ení aut ora:
Michal Kriegelstein
Náz ev bakal á řs ké pr áce:
Role Mn2+ v organismu a využití jeho komplexů v bioaplikacích
Náz ev prác e v an gl i čt i ně:
The role of Mn2+ in the organism and the utilization of its complexes in bioaplications
Druh práce:
Bakalářská
Kat edra:
AFC (Katedra anorganické chemie)
Vedoucí bak al ářs ké práce:
RNDr. Bohuslav Drahoš, Ph.D.
R ok obhaj ob y:
2014
Abstrakt: Superoxid dismutasa je mangan-obsahující enzym, který chrání organismus před kyslíkovými radikály (ROS – reactive oxygen species), které jsou původci různých nemocí (např. revmatoidní artritidy). Z tohoto důvodu byly připraveny syntetické látky, které napodobují (mimikují) aktivitu superoxid dismutasy (SOD). Na základě dřívějších studií SOD aktivity Mn(II) komplexů s patnáctičlennými makrocykly obsahující pyridinové jádro, byl vybrán ligand L1(L1 = 3,12,18-triaza-6,9-dioxabicyklo[12.3.1]oktadeka-1(18),14,16-trien), který byl v rámci práce syntetizován, a byla optimalizována příprava prekurzorů pro jeho syntézu. Dále byl připraven komplex [MnL1Cl2], jehož SOD aktivita byla studována pomocí nepřímé metody využívající barvivo XTT a v porovnání s již známými SOD-mimiky byla její hodnota nižší. Ve snaze o vysvětlení nižší SOD aktivity, byla tato aktivita korelována s rychlostí výměny vody manganatého komplexu, protože disociace molekuly vody je prvním krokem v mechanismu dismutace superoxidu. Vliv rychlosti výměny vody na SOD aktivitu byl ovšem nejednoznačný a jeho vysvětlení by vyžadovalo detailnější studium většího množství podobných systémů. Prvním krokem takového studia vlivu sterických a strukturních faktorů na SOD aktivitu, byla příprava ligandu s jedním acetátovým pendantním ramenem L1-Ac (Nkarboxymethyl-3,12,18-triaza-6,9-dioxabicyklo[12.3.1]oktadeka-1(18),14,16-trien)
a
jeho
komplexu [Mn(L1-Ac)Cl2], jehož bližší charakterizace a měření SOD aktivity bude předmětem dalšího studia Klíčová slova: mangan, komplex, makrocyklus, superoxid dismutasa, pyridin
Aut hor ´s fi rs t nam e and s urenam e: Michal Kriegelstein Ti t l e:
The role of Mn2+ in the organism and the utilization of its complexes in bioaplications
T ype o f t hes i s :
Bachelor
Depart m ent :
AFC (Department of Inorganic Chemistry)
S upervi s or:
RNDr. Bohuslav Drahoš, Ph.D.
The ye a r of pr es ent a t i on:
2014
Abstract: Superoxide dismutase is manganese containing enzyme which protects the organisms against oxygen radicals (ROS – reactive oxygen species). Increased concentrations of ROS were identified in patients with diseases like Rheumatoid arthritis or cancer. Due to these reasons, synthetic compounds which mimic the activity of the enzyme were prepared. On the basis of previous studies on SOD-mimic activity of Mn(II) complexes with 15-membered macrocycles containing pyridine in their scaffolds, the ligand L1 was chosen (L1= 3,12,18-triaza-6,9dioxabicyklo[12.3.1]octadeca-1(18),14,16-triene). In this work, the ligand L1 was synthesized and the synthesis of its precursors was optimized. Complex [MnL1Cl2] was prepared and its SOD activity was investigated by XTT assay. In comparison with known SOD mimics, SOD activity of [MnL1Cl2] is lower. In an attempt to explain its lower SOD activity, the SOD activity was correlated with water exchange rate of Mn(II) complex, because the dissociation of water molecule is the first step of the catalytic mechanism of superoxide dismutation. However, the influence of the water exchange rate on the rate of dismutation was not straightforward and its interpretation would require a precise investigation of a large number of similar systems. First step in such investigation, what is the influence of the the structural and sterical factors on the SOD activity, was done by a synthesis of the ligand modified with one acetate pendant arm ‒ L1 -Ac (L1-Ac = N-carboxymethyl-3,12,18-triaza-6,9dioxabicyklo[12.3.1]oktadeca-1(18),14,16-triene) and its komplex [Mn(L1-Ac)Cl2] whose komplete characterization and measurement of its SOD activity will bet he topic of further studies.
Keywords: manganese, complex, macrocycle, superoxid dismutase, pyridine
Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci Role Mn2+ v organismu a využití jeho komplexů v bioaplikacích vypracoval samostatně pod vedením RNDr. Bohuslava Drahoše, Ph.D. a uvedl v ní všechny použité literární a jiné odborné zdroje v souladu s právními předpisy, vnitřními předpisy Univerzity Palackého a vnitřními akty řízení Univerzity Palackého a Přírodovědecké fakulty UP.
V Olomouci dne
vl a s t n or u č ní p o dp i s au t o r a
Poděkování Rád bych poděkoval RNDr. Bohuslavu Drahošovi, Ph.D. za vedení práce a všem pracovníkům Katedry anorganické chemie za vytvoření příjemného pracovního prostředí. Rád bych poděkoval všem vyučujícím, jejichž kurzy jsem absolvoval za to, že mě kvalitně připravili na vypracování této bakalářské práce. V neposlední řadě bych rád poděkoval rodině, mé přítelkyni a spolužákům za podporu při psaní bakalářské práce.
Michal Kriegelstein
Obsah 1. Úvod .................................................................................................................. 1 2. Cíle práce........................................................................................................... 1 3. Teoretická část................................................................................................... 2 3.1 Mangan ............................................................................................................................. 2 3.1.1 Výskyt, výroba a chemické vlastnosti........................................................................ 2 3.1.2 Biologická role manganu ........................................................................................... 3 3.2 Enzymy obsahující mangan.............................................................................................. 4 3.2.1 Arginasa ..................................................................................................................... 4 3.2.2 Katalasa...................................................................................................................... 5 3.2.3 Superoxid dismutasa .................................................................................................. 6 3.3. Reaktivní kyslíkové a dusíkové částice ......................................................................... 10 3.3.1 Úvod......................................................................................................................... 10 3.3.2 Vznik........................................................................................................................ 10 3.3.3 Biologická role......................................................................................................... 11 3.3.4 Oxidativní poškození biomolekul ............................................................................ 12 3.4 Mimiky SOD .................................................................................................................. 14 3.4.1 Komplexy s makrocyklickými ligandy .................................................................... 15 3.4.2 Komplexy s ligandy na bázi porfyrinu..................................................................... 16 3.4.3 Komplexy s ligandy na bázi salenu a jiných Schiffových bází................................ 17 3.5. Syntéza a derivatizace polyaza-makrocyklyckých ligandů ........................................... 19 3.5.1. Richman-Atkinsova reakce ..................................................................................... 19 3.5.2. Kondenzace dikarbonylové sloučeniny s diaminem/templátová syntéza ............... 21 3.5.3. Metoda cyklického peptidu..................................................................................... 24 3.5.4. Derivatizace makrocyklů ........................................................................................ 25
4. Praktická část................................................................................................... 27 4.1.Úvod ............................................................................................................................... 27 4.2. Syntéza prekurzorů ........................................................................................................ 28 Dimethylester pyridin-2,6-dikarboxylové kyseliny (2) .................................................... 28 Pyridin-2,6-dimethanol (3)................................................................................................ 29 Pyridin-2,6-dikarbaldehyd (4)........................................................................................... 30 4.3 Syntéza ligandů............................................................................................................... 30 4,12,18-triaza-6,9-dioxabicyklo[12.3.1]oktadeka-1(18),14,16-trien (L1) ........................ 30 N-karboxymethyl-3,12,18-triaza-6,9-dioxabicyklo[12.3.1]oktadeka-1(18),14,16-trien (L1-Ac) ............................................................................................................................. 31 4.4 Syntéza komplexů........................................................................................................... 32 Komplex MnL1................................................................................................................. 32 Komplex MnL1-Ac........................................................................................................... 33 4.5.Měření SOD aktivity komplexu MnL1 .......................................................................... 33
5. Diskuse ............................................................................................................ 34 5.1 Syntéza............................................................................................................................ 34 5.2 Měření SOD aktivity ...................................................................................................... 39
6. Závěr................................................................................................................ 43 7. Seznam Literatury ........................................................................................... 45
1. Úvod Mangan patří mezi důležité kofaktory některých enzymů v aerobních organismech. Jedním z těchto enzymů je i superoxid dismutasa (SOD), která funguje jako první linie obrany proti –
kyslíkovým radikálům (ROS, reactive oxygen species) jako je třeba superoxid O2 nebo hydroxylový radikál OH∙. Tyto kyslíkové radikály se běžně vyskytují v aerobních organismech a díky své vysoké reaktivitě jsou schopny poškozovat své okolí např. peroxidací lipidů nebo oxidací bází DNA. Jelikož byly zvýšené koncentrace těchto radikálů zjištěny např. při revmatoidní artritidě nebo zánětlivých nemocech, byla vyvinuta značná snaha syntetizovat tzv. mimiky SOD, tedy látky které budou schopny tyto kyslíkové radikály odbourávat podobně jako superoxid dismutasa. Nejčastějšími příklady takových látek jsou Mn(II) komplexy s cyklickými nebo chelatujícími ligandy. Tato práce je proto zaměřena na přípravu a charakterizaci komplexů Mn(II) s deriváty 1,4,7,10,13-pentaazacyklopentadekanu ([15]aneN5), které ve své struktuře obsahují pyridinové jádro a dva atomy dusíku jsou nahrazeny dvěma atomy kyslíku.
2. Cíle práce Cílem
této
práce
bylo
připravit
ligand
L1
(L1
=
3,12,18-triaza-6,9-
dioxabicyklo[12.3.1]oktadeka-1(18),14,16-trien, (Obr. 1a) a optimalizovat reakční podmínky jednotlivých syntetických kroků, především zvýšení výtěžku a vylepšení izolace pyridin-2,6dimethanolu a pyridin-2,6-dikarbaldehydu. Dalším cílem byla příprava manganatého komplexu [MnL1Cl 2], změření jeho SOD aktivity a porovnání s podobnými systémy, tj. Mn(II) komplexy s 15-člennými makrocykly, obsahujícími 5 dusíkových donorových atomů a pokusit se o korelaci rychlosti výměny vody a SOD aktivity. Posledním cílem byla příprava derivátů ligandu L1 modifikovaných jedním popř. dvěma acetátovými pendantními rameny (Obr. 1b, 1c) a zjistit, zdali a jak tato substituce ovlivňuje SOD aktivitu tohoto komplexu, případně jestli by bylo možné ladit tuto aktivitu pomocí různých funkčních skupin v pendantním ramenu.
[1]
O
N
O
OH
N
NH
NH
O
OH
O
N
N
NH O
a)
O
N
O
N O
b)
O
HO
c)
Obr. 1: Strukturní vzorce připravovaných ligandů: a) L1, b) L1-Ac, c) L1-Ac2
3. Teoretická část 3.1 Mangan 3.1.1 Výskyt, výroba a chemické vlastnosti
Mangan patří mezi nejvíce zastoupené d-prvky v zemské kůře. S koncentrací 0,106 % (1060 ppm) to je třetí nejrozšířenější kov (po železe a titanu). V porovnání se všemi prvky z periodické tabulky se řadí na celkové 12. místo. Mangan se vyskytuje v přibližně třech stech různých minerálech, ale pouze asi dvacet z nich má průmyslové využití. Nejdůležitější z nich je MnO2, nazývaný burel, ze kterého se vyrábí. Nejčastější využití kovového manganu je v ocelářském průmyslu, kde se využívá pro snížení obsahu kyslíku a síry v oceli. Mangan reaguje přednostně se sírou a kyslíkem za vzniku MnS a MnO, které přechází do strusky, čímž zabraňuje vzniku FeS a bublinek kyslíku, které by snižovaly pevnost materiálu. Vzhledem k tomuto využití se vyrábí jeho slitina se železem (ferromangan), která obsahuje asi 80% Mn. Tato výroba je založena na redukci směsi MnO2 a Fe2O3 pomocí koksu.1
Elektronová konfigurace základního stavu manganu [Ar] 3d5 4s2 umožňuje oxidační stav od -III až do +VII. Nejstálejším oxidačním stavem je +II, což je způsobeno tím, že vzniklý Mn2+ je ve vysokospinovém stavu se symetrickou konfigurací d5. Naproti tomu, oxidační stav +VII, je ve srovnání s ostatními prvky 7. vedlejší podskupiny méně stálý a Mn(VII) je v kyselém i v zásaditém prostředí silné oxidační činidlo.2
[2]
Mangan vytváří celou řadu komplexních sloučenin v nichž má nejčastěji oxidační číslo +II a +III. Obvykle se jedná o vysokospinové oktaedrické komplexy, u kterých v oxidačním stavu +III můžeme pozorovat Jahn-Tellerův efekt a přechod z oktaedrické koordinační sféry na tetragonální bipyramidu. Nízkospinové komplexy nejsou obvyklé a vyskytují se pouze v případě, že je ligandem kyanidový anion CN‒, který tvoří jedno z nejsilnějších ligandových polí.1
3.1.2 Biologická role manganu
Vzhledem k vysokému výskytu manganu na Zemi není překvapivé, že se vyskytuje v mnoha biologických procesech. Typický denní příjem manganu je 0,7 ‒ 11 mg (v USA). Potraviny s obsahem větším než 1 mg v porci jsou například ořechy, čaj nebo ananas. 3 Lidské tělo obsahuje přibližně 12 mg manganu, který je ukládán zejména v kostech. V tkáních jsou nejvyšší koncentrace manganu v játrech a ledvinách.4 V biologických systémech se mangan nejčastěji vyskytuje v oxidačních stavech Mn(II), Mn(III) a Mn(IV). Velký rozdíl ve srovnání s jinými redoxně aktivními kovy, jako je např. železo, je v tom, že mangan má za fyziologických podmínek nižší redukční schopnosti (hůře se oxiduje). To je způsobeno symetrickou elektronovou konfigurací d5 pro Mn2+ oproti např. elektronové konfiguraci d6 u Fe2+. Z tohoto důvodu se mangan nejenže může účastnit redoxních reakcí, podobně jako železo nebo další kovy, ale zároveň je volný Mn2+ díky svému vyššímu redoxnímu potenciálu méně škodlivý než Fe2+, který za stejných podmínek tvoří velice reaktivní hydroxylové radikály tzv. Fentonovou reakcí (viz. kapitola 3).5
Mangan je v organismech přítomen jako kofaktor některých důležitých enzymů. Jedná se například o arginasu (EC 3.5.3.1), která katalyzuje přeměnu argininu a vody na ornitin a močovinu nebo katalasu (EC 1.11.1.6) hemový protein obsahující dva atomy manganu v aktivním místě, která katalyzuje dismutaci dvou molekul H2O2 na O2 a H2O. Ačkoliv jsou katalasy přítomny ve velkém množství životních forem, Mn obsahující katalasa je bakteriálního původu. 6 Dalším velice důležitým enzymem, který se vyskytuje ve všech aerobních organismech, je superoxid dismutasa (EC 1.15.1.1). Tento enzym katalyzuje –
dvoukrokovou přeměnu dvou molekul reaktivního superoxidu O2 na jednu molekulu [3]
peroxidu vodíku a jednu molekulu kyslíku. U člověka se superoxid dismutasa vyskytuje v několika formách: mitochondriální Mn-SOD, dimerní cytoplasmatická CuZn-SOD a tetramerní extracelulární CuZn-SOD. Zejména mitochondriální Mn-SOD je jedním z klíčových antioxidačních mechanismů aerobních organismů, jelikož mitochondrie zpracovávají přes 95 % kyslíku v buňce.7
Kromě přítomnosti v živočišných buňkách se mangan vyskytuje v kyslík vyvíjejícím komplexu (oxygen-evolving complex, OEC), který je součástí multienzymového fotosystému II a katalyzuje fotochemický rozklad vody: 2H2O + 4hⱱ → O2 + 4e‒ + 4H+.8 Tato reakce umožnila vznik neomezeného množství redukčního ekvivalentu a tím pádem přeměnu CO2 na uhlovodíky a posléze na další, pro život nezbytné molekuly: 4e‒ + 4H+ + CO2 → (CH2O) + H2O. Kromě toho, vzniká fotolýzou vody molekulární kyslík, který umožnil přeměnu anaerobního života na aerobní a vznik ozonové vrstvy, která poskytuje ochranu proti UV záření z vesmíru.
3.2 Enzymy obsahující mangan 3.2.1 Arginasa
Arginasa (EC 3.5.3.1) je homotrimer o molekulové hmotnosti 105 kDa, který obsahuje dva atomy manganu v aktivním místě každé podjednotky, které jsou nezbytné ke katalýze hydrolýzy argininu na ornitin na močovinu: NH2 HN
O
NH
O OH
+
H2O
H2N
NH2
OH NH2
O
+ H2N
NH2
U savců se vyskytuje ve dvou isoformách. Tyto isoformy jsou si velmi podobné z hlediska katalytických vlastností a obě také vyžadují mangan pro svoji aktivitu, ale liší se v lokalizaci v těle. Typ 1 je cytosolický enzym vyskytující se ve velkém množství v jaterních
[4]
buňkách, zatímco typ 2 je mitochondriální enzym, který se v menších množstvích nachází v ledvinách, makrofázích nebo mozku, ale v játrech se prakticky nevyskytuje.9
Arginasa je klíčový enzym v metabolismu savců, vzhledem k tomu, že zajišťuje hlavní metabolickou dráhu pro zpracování dusíkatých produktů vzniklých při odbourávání aminokyselin a proteinů. Největší koncentrace arginasy je v játrech, kde také probíhá největší část močovinového cyklu,10 nicméně se vyskytuje i v ostatních buňkách, protože arginin je důležitým prekurzorem prolinu a polyaminů, jako je například putrescin a z něj vznikající spermidin a spermin.9 Další role arginasy souvisí s aktivitou NO syntasy v některých buňkách imunitního systému. Aktivita arginasy snižuje množství substrátu pro NO syntasu, čímž ji efektivně inhibuje a na druhou stranu, jeden z meziproduktů biosyntézy NO, Nhydroxyarginin, je jedním z nejefektivnějších inhibitorů arginasy. Toto naznačuje, že jedna z možných rolí arginasy je ovlivňování biosyntézy NO, čímž dochází k regulaci jeho cytotoxicity.10 Jelikož NO patří mezi reaktivní kyslíkové částice, bude jeho vzniku a biologické funkci věnována samostatná kapitola později. 3.2.2 Katalasa
Katalasy (EC 1.11.1.6 ) jsou přítomny ve většině životních forem, nicméně Mnobsahující katalasy jsou známé pouze jako bakteriální enzymy a oproti hemovým Feobsahujícím katalasám, je jejich výskyt poměrně omezený (přibližně 300 známých katalas, ale jen 29 obsahuje mangan).11 Katalasy katalyzují přeměnu peroxidu vodíku na vodu a kyslík podle následujících reakcí: H2O2 + 2H+ + [Mn2+–Mn2+] → 2H2O + [Mn3+–Mn3+] H2O2 + [Mn3+–Mn3+]→ 2H+ + O2 + [Mn2+–Mn2+ ] Jedná se o homohexamer složený z šesti podjednotek s molekulovou hmotností přibližně 30 kDa obsahující dva atomy manganu v každém z aktivních míst.12 Peroxid vodíku vniká nejčastěji jako produkt dismutace superoxidu O2 pomocí superoxid dismutasy a je znám zejména pro svoje cytotoxické účinky, nicméně jedná se také o důležitou signální molekulu a regulátor. Z tohoto důvodu je pro organismy důležité mít [5]
schopnost regulovat jeho koncentraci, protože biologický účinek H2O2 závisí zejména na jeho množství.13 3.2.3 Superoxid dismutasa 3.2.3.1 Úvod
Superoxid dismutasy (SOD) (EC 1.15.1.1) je skupina enzymů katalyzující dismutaci superoxidu na vodu a peroxid vodíku podle následujících rovnic, kde M= Cu, Mn, Fe nebo Ni; pro Cu je n= 1, pro ostatní výše zmíněné kovy je n= 2. [M(n+1)-SOD] + O2 → [M(n+)-SOD] + O2 [M(n+)-SOD] + O2 → [M(n+1)-SOD] + H2O2 U člověka se SOD vyskytují ve třech formách: cytosolická SOD obsahující měď a zinek jako kofaktory (CuZn-SOD), mitochondriální SOD obsahující jako kofaktor mangan (Mn-SOD) a nakonec extracelulární SOD, která jako kofaktory obsahuje opět měď a zinek. 14 Kromě těchto tří existují ještě další dva druhy superoxid dismutasy: první má jako kofaktor železo (Fe-SOD) a druhý typ, pro svoji funkci vyžaduje přítomnost niklu (Ni-SOD). Tyto dva posledně zmíněné typy SOD se vyskytují zejména u bakterií.15 Jelikož je tato práce zaměřená na mangan, budeme se dále zabývat pouze Mn-SOD. 3.2.3.2 Struktura
Mn-SOD je homotetramer (dimer dimeru) s molekulovou hmotností 96 kDa, který obsahuje jeden atom manganu v aktivním místě každé podjednotky.14 Každá podjednotka se skládá ze dvou domén (obr. 2). První („malá“) doména je definována aminokyselinami 1–40 a druhá („velká“) jako aminokyseliny 60–190 (Obr.3).16 Velká doména poskytuje centrálnímu atomu tři koordinující se aminokyseliny: dva histidiny (H81, H171) a jednu kyselinu asparagovou (D167), které se všechny nachází v jedné rovině a jsou navzájem stabilizovány velkým množstvím vodíkových vazeb. Malá doména poskytuje pouze jedinou koordinující se aminokyselinu histidin (H26), který je kolmý na rovinu zbylých tří aminokyselin a není tak silně vázán vodíkovými vazbami. Poslední koordinační místo umožňuje vazbu jedné molekuly rozpouštědla, obvykle vody nebo OH‒. Tvar koordinačního polyedru je tedy deformovaná trigonální bipyramida [6]
s molekulou rozpouštědla a histidinovým zbytkem H26 v axiálních polohách (Obr. 4). Struktura aktivního místa Mn-SOD je prakticky stejná jako aktivní místo Fe-SOD.15 Pravděpodobně největší rozdíl, co se týče struktury, je v aminokyselinovém zbytku, který tvoří vodíkovou vazbu s molekulou rozpouštědla (H2O nebo OH‒), jak je vidět na obr.5 (Gln 146 a Gln69).15 Okolí aktivního místa je tvořeno velkým množstvím aromatických aminokyselin, pravděpodobně jako způsob ochrany proti vysoce toxickému substrátu a produktu jeho dismutace15, zejména v případě Fe-SOD, kdy volné železo je schopné aktivovat jak substrát, tak produkt za vzniku vysoce reaktivních radikálů pomocí tzv. Fentonovy reakce: H2O2 + Fe2+ → OH∙ + OH ‒ + Fe3+ (viz kapitola 3.2).17
Obr. 2: Znázornění prostorového uspořádání Obr. 3: Znázornění prostorového uspořádání Mn-SOD (atomy Mn(II) jsou značeny šedě)7
podjednotky Mn/Fe-SOD16
[7]
Obr. 4: Struktura aktivního místa Mn-SOD18
Obr. 5: Srovnání aktivních míst Fe-SOD (bíle) a Mn-SOD (šedě)
Tato strukturální podobnost umožňuje zachování, i když nižší, dismutační aktivity enzymu v případě, že je atom manganu v Mn-SOD nahrazen atomem železa a opačně. Takto velká podobnost obou enzymů, je pravděpodobně důsledkem změn podmínek na Zemi v průběhu jejího vývoje. Zatímco při nízkých koncentracích O2 v atmosféře mohlo být výhodné pro organismy využít železo z důvodu jeho velkého výskytu, tak při vyšších koncentracích O2 a potřeby větší ochrany před vznikajícími vysoce reaktivními kyslíkovými radikály (ROS, reactive oxygen species), se nižší toxicita volného manganu mohla ukázat jako výrazná výhoda i přesto, že je méně zastoupen.15
–
3.2.3.3 Mechanismus odbourávání O2
Během dismutace dochází ke strukturním změnám, které jsou znázorněny ve schématu 1. –
V prvním kroku dochází ke koordinaci O2 na centrální atom za změny tvaru koordinačního polyedru z trigonální na tetragonální bipyramidu. Superoxid je následně redukován na kyslík, který je uvolněn za současné protonizace koordinovaného OH ‒ a oxidace centrálního atomu [8]
na Mn2+ a přechodu koordinačního polyedru zpět na trigonální bipyramidu. Koordinací –
druhého O2 dochází opět ke změně na tetragonální bipyramidu a přenosu protonu z protonovaného OH ‒ na superoxid. V dalším kroku dojde k přenosu elektronu z centrálního atomu. Tento přenos je usnadněn interakcí Gln146 s koordinovanou molekulou rozpouštědla, protože Gln preferuje interakci s koordinovaným OH‒ než s H2O a tedy i oxidační stav Mn(III). Oxidací Mn(II) na Mn(III) se sníží pK koordinovaného rozpouštědla, čímž pravděpodobně dojde k přenosu protonu na odstupující substrát a následnou protonizací odstoupivšího HO vzniká H2O2.15
Schéma 1: Mechanismus dismutace superoxidu na aktivním místu Mn-SOD 15
[9]
3.3. Reaktivní kyslíkové a dusíkové částice 3.3.1 Úvod
Reaktivní kyslíkové (ROS) a dusíkové částice (RNS) jsou běžným produktem buněčného metabolismu. Jedná se o radikály odvozené od superoxidu O2 (ROS), případně od oxidu dusnatého (RNS). Jde o vysoce reaktivní částice, které jsou ve vysokých koncentracích organismu nebezpečné, protože mohou poškozovat buněčné membrány a další struktury, jako jsou proteiny a enzymy nebo DNA.17 Na druhou stranu jejich nízká koncentrace je pro organismus prospěšná. ROS a RNS jsou využívány imunitním systémem a jsou součástí mnoha signálních drah.17 3.3.2 Vznik
Jednoelektronovou redukcí molekulárního kyslíku vzniká superoxidový radikál O2 .
Tento radikál je považován za primární ROS a je schopen interagovat s dalšími molekulami za vzniku sekundárních ROS jako je H2O2 nebo OH∙. 17 Hlavní místo vzniku O2 je mitochondrie buňky, kde probíhá zpracování kyslíku.
Během přenosu elektronů v elektronovém transportním řetězci se může stát, že přenášený elektron „unikne“ a bude předčasně reagovat s kyslíkem za vzniku superoxidového radikálu.19 Bylo zjištěno, že až 3% ze všech elektronů v elektronovém transportním řetězci takto „uniknou“ a vytvoří superoxidový radikál místo vody.19 O2 je také produkován buňkami imunitního systému, které ho využívají jako součást obrany proti mikrobům. O2 je zde generován NADPH oxidasou. NADPH oxidasa je membránový enzym, který v případě stimulu katalyzuje redukci O2 pomocí NADPH přítomného v cytosolu a vypouští O2 mimo buňku nebo do vezikulu vzniklého pohlcením mikroorganismu.15 Dalším zástupcem ROS je hydroxylový radikál OH∙. Jedná se o vysoce reaktivní radikál s poločasem rozpadu in vivo asi 10-9 s.20 OH∙ vzniká zejména tzv. Fentonovou reakcí: H2O2 + Fe2+ → OH∙ + OH‒ + Fe3+. Hladina volného železa je v organismu velmi přísně regulována, nicméně v případě porušení rovnováhy mezi ROS a antioxidanty (oxidativní stres), je O2 schopen uvolňovat železo [10]
z molekul, jako jsou například enzymy obsahující [4Fe‒4S] klastr.
21
Tudíž během
oxidativního stresu usnadňuje O2 tvorbu OH∙ uvolňováním Fe 2+ z enzymů. Superoxid se dále zúčastňuje tzv. Haber-Weissovy reakce, O2 + H2O2 → O2 + OH‒ + OH∙ která je katalyzována Fe3+. Superoxid nejprve redukuje Fe3+ na Fe2+ a následuje Fentonova reakce která dokončí cyklus: Fe3+ + O2 → Fe2+ + O2 a poté Fe2+ + H2O2 → OH∙ + OH‒ + Fe3+.22 Kromě výše zmíněných částic O2 a OH∙ vznikají v organismech různé peroxydové radikály ROO∙, z nichž nejjednodušší je HOO∙, který je vlastně protonovaná forma O2 případně H2O2, který sice není radikál, ale řadí se k ROS. Peroxisomy (buněčné organely účastnící se metabolismu) obsahují velké množství H2O2, který je zde využíván jako oxidační činidlo pro oxidaci rozličného množství molekul. V případě, že dojde k poškození nebo omezení regulace H2O2 v peroxisomu, H2O2 se uvolní do cytosolu a výraznou měrou se podílí na vzniku oxidativního stresu.17
Oxid dusnatý, NO, je generován v mitochondriích pomocí NO syntasy, která katalyzuje přeměnu argininu na NO a citrulin. Vzniklý NO dále může reagovat s O2 za vzniku vysoce reaktivního ONOO‒ 23 případně na další RNS, jako jsou NO‒ nebo NO+.24 3.3.3 Biologická role
Ačkoliv jsou obvykle volné radikály spojeny s poškozováním buněk, hrají také významnou roli v buněčné komunikaci a regulaci různých buněčných pochodů.24 Jako příklady lze uvést: a) regulace biosyntézy NO b) produkce ROS fagocyty c) regulace vazodilatace a vazokonstrikce d) sledování změn koncentrace kyslíku e) regulace imunitního sytému f) vyvolání apoptosy.
[11]
ROS hrají klíčovou roli jako ochrana proti patogenům. Aktivované neutrofily a makrofágy produkují velká množství ROS pomocí NADPH oxidasy. V tomto případě se koncentrace peroxidu vodíku pohybuje okolo 10-100 μM. Produkce ROS pomocí NADPH oxidasy probíhá i v jiných buňkách, jako jsou například fibroblasty nebo buňky hladké cévní svaloviny. ROS v tomto případě fungují jako regulátory signálních kaskád uvnitř buňky a hrají významnou roli v ovlivňování funkce srdečních a cévních buněk. Regulace vaskulárního tonu probíhá pomocí cyklického guanosin monofosfátu (cGMP). NO se váže do hemové části kanyl cyklasy a tím ruší planární uspořádání a aktivuje enzym, jehož produkt, cGMP, ovlivňuje funkci iontových kanálů a enzymů, jako jsou proteinové kinasy a fosfodiesterasy a srůst krevních destiček. 23
3.3.4 Oxidativní poškození biomolekul
ROS jsou schopny interagovat s velkým množstvím biomakromolekul ve svém okolí a pomocí chemických reakcí měnit jejich strukturu a tím i biologickou funkci. Nejčastěji se jedná o oxidativní poškozování molekul DNA a peroxidaci lipidů. Zvýšené koncentrace ROS byly pozorovány např. při Parkinsonově nemoci, kardiovaskulárních nemocech, revmatoidní artritidě a zejména rakovině.23
3.3.4.1 Oxidativní poškození DNA
Hydroxylový radikál OH∙ je schopen reagovat se všemi komponentami DNA , ať již se jedná o purinové a pyrimidinové báze nebo cukernou složku. Trvalé poškození DNA, které je následkem reakcí ROS nebo RNS s DNA, má za následek např. omezení nebo úplné zastavení transkripce či chyby v replikaci, což se významně podílí např. na vzniku rakoviny. Bylo identifikováno přes 100 různých produktů oxidace DNA (v roce 2006).25 Asi nejvýznamnější z těchto produktů je 8-hydroxyguanin (8-OH-G) (Obr. 8). Význam 8-OH-G spočívá především v tom, že vzniká velice snadno a dá se detekovat v moči, tudíž ho lze využít jako indikátor oxidativního stresu v organismu.25
[12]
O N
HN H2N
O
NH
N
HN
+ HO N
O
H2N
H
oxidace
NH
N
N
HN
OH H2N
OH N O
HN H2N
NH H N O
N
NH
Obr. 6: Vznik 8-hydroxyguaninu a jeho ketoformy, 8-oxoguaninu
3.3.4.2 Peroxidace lipidů
Kyslíkové radikály jsou schopné atakovat nejen buněčnou DNA, ale i další makromolekuly, kdy zejména polynenasycené řetězce mastných kyselin jsou náchylné k tomuto ataku, jak je vidět na následujícím schématu. Nejprve dochází k reakci polynenasyceného řetězce s radikálem (1), který odštěpí methylenový vodík za vzniku nového radikálu 1∙ . Tento radikál reaguje s kyslíkem (2, 3) za vzniku radikálů 2∙ a 3∙. V případě, že se tento radikál nachází na konci řetězce (3∙ ), je redukován na hydroperoxid (4). Pokud se peroxylový radikál nachází uprostřed řetězce(2∙), může docházet k cyklizaci (5). Tento cyklický radikál může být redukován na hydroperoxid (6) nebo dojde k další cyklizaci (7). Molekula 7 je meziproduktem při tvorbě malondialdehydu 8, který je schopen tvořit adukty s bázemi DNA (9,10,11). V případě, že nedojde k cyklizační reakci 5, může dojít k odtržení protonu z jiné polynenasycené mastné kyseliny za vzniku hydroperoxidu 12, který je schopen reagovat s redox-aktivními kovy, jako je např. železo (13) za vzniku alkoxylových radikálů, které se mohou štěpit na uhlovodíky, jako je pentan (14).25
[13]
Schéma 2: Znázornění procesu peroxidace lipidů
3.4 Mimiky SOD
Ačkoliv jsou SOD velice účinné při odbourávání ROS, v některých případech je jejich aktivita nedostatečná, což vede k oxidativnímu stresu, který vede k rozličným nemocem, jako jsou např. záněty, nemoci kardiovaskulárního systému nebo rakovina. Terapeutické využití superoxid dismutás u lidí je omezené. SOD má malý poločas eliminace, vyvolává reakci imunitního systému, pokud není lidského původu, obtížně prochází skrz membrány do buňky, kde se vyskytuje nejvíce ROS a v neposlední řadě, je to jeho vysoká cena.26 Z těchto důvodů byla připravena celá řada syntetických mimiků SOD. Nejčastěji se jedná o makrocyklické komplexy Mn(II). Jako ligandy jsou používány polyaza-makrocykly, ligandy na bází porfyrinu, popřípadě i další, nemakrocyklické.
[14]
Tyto komplexy by měly splňovat několik vlastností, aby se daly použít jako SOD mimiky. Jejich redoxní potenciál musí být mezi potenciálem pro oxidaci (-0,16 V vs. NHE) a redukci (0,89 V vs NHE) superoxidu. Komplex musí přecházet dostatečně rychle mezi oxidovanou a redukovanou formou a musí mít minimálně jedno volné místo pro koordinaci substrátu. A v neposlední řadě musí mít ligand vysokou afinitu k centrálnímu atomu jak v oxidované, tak v redukované formě, aby nedošlo k jeho uvolnění.
3.4.1 Komplexy s makrocyklickými ligandy
Jedny z prvních mimiků byly komplexy Mn(II) s ligandy na bázi 1,4,7,10,13pentaazacyklopentadekanu ([15]aneN5) či jeho derivátů. Některé z těchto derivátů jsou ukázány na obrázku 7.
Mn
HN
HN
N
N
NH NH
Cl
Cl
Cl NH
HN
NH
HN Mn
Mn NH
Cl [Mn([15]aneN 5)Cl 2]
HN
Cl NH
HN
[Mn([15]PyaneN 5)Cl 2]
Cl NH
M40403
Obr. 7: Příklady Mn(II) komplexů s makrocyklickými ligandy, které se využívají jako SOD mimiky
Základní komplex, [Mn([15]aneN5) Cl2], je účinný mimik SOD (viz tabulka 1.), který je termodynamicky poměrně stabilní (logK= 10,7) a vysoce kineticky inertní – nedochází k disociaci kovu ani při několikadenní přítomnosti EDTA. 27 Výsledkem práce na těchto látkách byl komplex M40403, který prokázal terapeutické účinky na zvířatech a pokročil do druhé fáze klinických testů v roce 2001. 26 Kromě těchto komplexů, byly připraveny komplexy Mn(II) se substituovaným triazacyklononanem (Obr. 8). Tyto komplexy jsou schopny fungovat jako mimiky SOD, ale bylo zjištěno, že v přítomnosti NaOH velice účinně odbourávají H2O2. Jejich SOD aktivita je ovšem nízká, pravděpodobně proto, že je určité množství komplexu hydroxylované nebo se vyskytuje v dimerní formě s kyslíkovým můstkem mezi atomy Mn.28 [15]
HN
NH
N
Cl Mn
HN
N
NH
NH N
Mn
NH
HN
N
N
Cl
Cl 2 + [Mn(tacnL Cl)]
1
[Mn(tacnL Cl 2)]
Obr. 8: Komplexy Mn(II) s deriváty triazacyklononanu studované pro jejich SOD aktivitu
3.4.2 Komplexy s ligandy na bázi porfyrinu
Další skupinou komplexů jsou komplexy manganu s ligandy na bázi porfyrinu (obr. 9) Jedním z výsledků práce na těchto komplexech je MnBr8TM-3-Py4+ (obr. 10), který se svojí aktivitou blíží samotným SOD (logkkat(
)= 8,85 (komplex) vs. logkkat(
)= 8,84‒9,3
(enzym)).29 R
R
Br
Br
Br
HN R
HN
N Mn
N
Br
R
N Mn
R N
NH
R
Obr. 9: Obecné schéma porfyrinových komplexů s manganem
R=
NH
Br
R
+
N
Br Br
R
R
Br
Obr. 10: Strukturní vzorec MnBr8TM-3-Py4+
Kromě tohoto komplexu byla připravena celá řada porfyrinových komplexů manganu s různými N-alkylpyridinovým substituenty. Bylo zjištěno že délka alkylu ovlivňuje jak SOD aktivitu, tak průchodnost membránami v buňce. Lipofilita komplexu se zvýší desetkrát s každým prodloužením alkylového řetězce o jeden uhlík (CH2), případně změnou polohy [16]
alkylového řetězce z ortho do meta polohy, jak je znázorněno na obr. 11. Lipofilita byla stanovena jako logaritmus poměru koncentrace komplexu v n-oktanolu a vodě (logPow) v závislosti na počtu uhlíků v alkylovém řetězci na pyridinovém dusíku. Zvýšení lipofility se ovšem projeví na desetinásobném snížení SOD aktivity komplexu, což je důsledek snížení elektronového deficitu na manganu díky posunutí kladného náboje na substituentech dále od centrálního atomu. Nicméně tento pokles aktivity je kompenzován zvýšenou biologickou dostupností komplexu.30 +
N +
N
R
R
+
N
R Obr. 11: Změna lipofility v závislosti na poloze a délce alkylového řetězce (R v pyridinovém substituentu na porfyrinovém skeletu) 30
3.4.3 Komplexy s ligandy na bázi salenu a jiných Schiffových bází
Poslední skupinou SOD mimiků, jsou komplexy Mn(II) s deriváty salenu (N,N'ethylenbis(salicylimin)). Tyto komplexy vykazují nejen SOD, ale i katalasovou aktivitu. Dva z těchto komplexů, EUK-8 a EUK-134 (Obr. 12 a 13), prokázaly schopnost chránit organismus (myši) před neurologickými poruchami, které jsou spojovány s oxidativním stresem.27
N
N
N
N -
Mn
O
Cl
-
O
-
-
Mn Cl
O
O
Obr. 12: Struktura EUK-8
-
O
-
O
Obr. 13: Struktura EUK-134 [17]
Poměrně nízká rozpustnost Mn(II) komplexů se salenem a jeho deriváty podnítila vznik nových derivátů salenu. Jedním z příkladů je zavedení cyklodextrinového kruhu (MnL7, Obr.14) nebo sulfonátových skupin na aromatická jádra salicylaldehydu (MnL8, Obr.15).26 Zavedením sulfonánových skupin do molekuly ligandu se také zvýšila SOD aktivita komplexu, jak je vidět v tabulce 1.
N
N
O -
N O
O S
N -
Mn Cl
-
O
O
-
O
Mn O
-
Sol
O
S O
-
O
-
Obr. 14: Schematický strukturní vzorec Obr. 15: Strukturní vzorec komplexu [MnL8]‒, Sol= MnL7, cyklodextrinová část je znázorněna H2O, MeOH jako horní konus.
Tabulka 1: Srovnaní aktivity SOD mimiků komplex IC50 (μmol x dm‒3) 31 [Mn[15]aneN5]Cl2 [Mn([15]PyaneN5]Cl2 32 M4040333 8,33 [MnTacnL1Cl2] 28 5,36 [MnTacnL2Cl]+ 28 4+ 29 0,012 MnBr8TM-3-Py 26 1,40 EUK-8 1,42 EUK-13426 26 1,93 / 1,70 MnL7 0,77 [MnL8]‒ 26 CuZn SOD33
kkat (M‒1s‒1) 4,13 x 107 (pH 7,4) 4,10 x 107 (pH 7,4) 4,91 x 107 (pH 7,4)
metoda SF SF SF NBT NBT cyt C cyt C cyt C cytC / NBT NBT SF
2,2 x 108 6,0 x 105 * 6,0 x 105 * 6,76 / 9,10 x 106 * 3,6 x 106 * 2,0 x 109
* Hodnota vypočtena z hodnoty IC50 podle kkat=
∗[
]
. Hodnota IC50 závisí na
množství indikátoru a proto se nehodí k porovnávání účinnosti jednotlivých SOD mimik. Superoxid o koncentraci IC50 reaguje s indikátorem stejnou měrou jako s mimikem a pokud známe rychlostní konstantu této reakce(kindikator), lze vypočítat rychlostní konstantu dismutace, která je nezávislá na koncentraci indikátoru.26 SF: stopped flow metoda, NBT: nitroblue tetrazolium assay, cytC: cytochrom C assay [18]
Pro stanovení rychlostní konstanty dismutace superoxidu jsou využívány různé metody. První skupinou jsou přímé metody, jako je např. stopped flow metoda, které sledují rozklad superoxidu přímým měřením UV-VIS spektra reakční směsi v čase. Protože jsou tyto reakce velmi rychlé, vyžadují speciální aparaturu umožňující velmi rychlé smíchání reaktantů (řádově ms) stejně jako dostatečně rychlé měření UV-VIS spektra. Do druhé skupiny patří nepřímé metody, které sledují rozklad superoxidu pomocí konkurenční reakce s indikátorem. Superoxid reaguje s tímto indikátorem za vzniku intenzivně zbarvených produktů a intenzita tohoto zbarvení je následně měřena pomocí UV-VIS spektroskopie a ze změny absorbance je vypočtena hodnota IC50 odpovídající koncentraci SOD mimiku, při které dojde k padesátiprocentní inhibici vzniku barevného formazánu. Mezi tyto metody patří například XTT, NBT nebo cytochrom C assay.33
3.5. Syntéza a derivatizace polyaza-makrocyklyckých ligandů 3.5.1. Richman-Atkinsova reakce
V literatuře je velmi často uváděným postupem syntéza podle Richmana a Atkinse, která se dá použít pro velké množství rozličných dusíkatých makrocyklů a je založena na využití p-toluensulfonové chránící skupiny (tosyl). Obecně se jedná se o reakci soli
tris(p-toluensulfonamidu) s halogenderivátem nebo se sloučeninou obsahující jiné dobře odstupující skupiny (Obr. 16). Reakce je často prováděna v prostředí bezvodého DMF. Toluensulfonamidovou
sůl
lze
připravit
přidáním
NaOMe
do
horkého
roztoku
toluensulfonamidu 34 v metanolu nebo může být snadno generována in situ smícháním reaktantů za přítomnosti K2CO3 nebo Cs2CO3.35 Reakce obvykle nemusí být prováděna za velkého zředění (high dilution conditions), protože objemný tosyl, mesyl (methylensulfonyl) nebo jiná chránící skupina svojí přítomností podporují cyklizační reakci na rozdíl od oligomerace či polymerace.
[19]
Ts
Ts
-
N Na Ts
+
X
+
N -
N Na
+
N N
Ts
Ts
N
N
Ts
N
X
Ts
Ts
Obr. 16: Obecné schéma makrocyklizace podle Richmana a Atkinse. X= OTs, OMs. Cl, Br nebo I (Ts = p-toluensulfonyl, Ms = methansulfonyl)
Ačkoli je samotný průběh cyklizace obvykle velmi efektivní, odstranění chránících skupin vyžaduje drastické podmínky: horká H2SO4, HBr+fenol, LiAlH4 a jiné, což může být poměrně závažná komplikace, pokud se v molekule vyskytují další funkční skupiny labilní vůči výše zmíněným podmínkám.36 Z těchto důvodů byly hledány jiné chránící skupiny, které by se daly odstranit za mírnějších podmínek. Některé z těchto chránících skupin jsou zobrazeny na obrázku 17. Jednou z nich je například nosyl (2-nebo 4-nitrobenzensulfonyl), který se odštěpí pomocí thiofenolu a K2CO3 v DMF za laboratorní teploty, 37 případně βtrimethylsilylethansulfonyl (SES), který je odštěpen pomocí CsF v DMF36.
NO2
Si
O S O
O S O
O S O
O S O
a
b
c
d
Obr. 17: Strukturní vzorce zmiňovaných chránících skupin a) tosyl, b) mesyl, c) nosyl, d) SES
Touto reakcí lze připravit rozličné druhy makrocyklů od 9- do 21-členných se třemi až sedmi heteroatomy, ať již kyslíkem, dusíkem nebo kombinací obou, výtěžky se obvykle pohybují mezi 45‒85%.34
[20]
3.5.2. Kondenzace dikarbonylové sloučeniny s diaminem/templátová syntéza
Kondenzací karbonylových sloučenin s primárními aminy vznikají tzv. Schiffovy báze a jejich následná redukce umožňuje přípravu sekundárních aminů. Tato reakce je univerzální a umožňuje přípravu velkého množství sloučenin. R2
O H2N R
+
R2
redukce
NH
N R2
R1
R
R1
R
R1
Obr. 18: Obecné schéma přípravy Schiffových bází a jejich redukce na sekundární aminy R= H, R2, R3= alkyl, aryl
V případě syntézy makrocyklické Schiffovy báze, tedy reakce sloučeniny se dvěma primárními aminoskupinami (diaminosloučeniny) se sloučeninou obsahující dvě karbonylové skupiny (dikarbonylová sloučenina), vyvstává problém vzniku velkého množství produktů, ať již různých oligomerů, polymerů či makrocyklických produktů různé stechiometrie/velikosti ([1+1], [1+2], [2+1], [2+2] atp.) jak je znázorněno ve schématu 3.38 Z tohoto schématu je patrné, že izolace jednoho konkrétního produktu může být velice náročná. K potlačení intermolekulárních reakcí reaktantů bývá využito nízkého zředění (high dilution conditions, 10-2 M a méně), stejně jako ekvimolárního množství reaktantů. Rigidní funkční skupiny omezují rotaci alifatického prekurzoru a usnadňují cyklizaci.
[21]
R
Z
R
+ O
Z
R O
H2N
NH2
O
R
R
Z O
N
N
X O
X
[1+1]
N
R
R
Z
X
X
NH2
NH
N
R N
X HN n
oligomery
R
Z
R
[2+1]
R R
Z N
X
N Z
N
N
NH2
Z
Z
R
R
R N
N
Z
X NH2
[1+2]
R
[2+2]-makrocyklus
Schéma 3: Reakce dikarbonylové sloučeniny s diaminosloučeninou a možné produkty
Velice efektivní metoda přípravy makrocyklů je tzv. templátová syntéza (template synthesis), která využívá přítomnosti vhodného kovového iontu v reakční směsi.39 Přítomný kovový iont svojí koordinací na donorové atomy funguje jako chránící skupina, čímž usnadňuje cyklizační reakci a zároveň zabraňuje tvorbě nežádoucích produktů. V závislosti na druhu kovu, zejména na jeho atomovém poloměru a povaze reaktantů (délka řetězce atp.) vznikají [1+1] a [2+2] makrocyklické Schiffovy báze. Jako templáty lze využít velkého množství iontů různých kovů: Sc, 40 Ni, 41 Mn, 42 Fe 43 a další. Použití kovu jako templátu nejenže usnadňuje samotnou cyklizaci, ale také (v případě použití dostatečně velkého iontu) umožňuje vznik [2+2] produktu, který lze izolovat jako vedlejší produkt reakce v překvapivě velkých množstvích. 44 Nicméně volbou vhodných reakčních podmínek (zejména volba rozpouštědla) lze získat žádaný [2+2] makrocyklus ve vyšších výtěžcích.45 Velice zajímavé je, že použití různých templátujících iontů při reakci jedné dikarbonylové sloučeniny s různými
[22]
diamino sloučeninami ve stejné reakční směsi umožňuje selektivní vznik určitých markocyků jak je ukázáno ve schématu 4.44
Schéma 4: Selektivní vznik specifických makrocyklů v závislosti na použití vhodného templátujícího kovu
Makrocyklus lze ze směsi izolovat jako komplex použitého templátujícího kovu, což je velice výhodné v případě, že chceme získat makrocyklickou Schiffovu bázi v komplexu s daným templátujícím kovem. Získání samotného ligandu může být náročné, vzhledem k tomu, že reduktivní demetalace pomocí NaBH4 také redukuje dvojnou vazbu C=N. Nicméně bylo zjištěno, že tyto komplexy jsou kineticky labilní a je možné substituovat koordinovaný iont použitý jako templát jiným iontem přítomným v roztoku a připravit tak komplexy s takovými kovovými ionty, které by přímou metodou nebylo možné připravit.39 Pokud je cílem příprava polyaza-makrocyklického ligandu, není reduktivní demetalace problematická, naopak je dokonce velice výhodná, protože umožňuje v jednom kroku jak redukovat dvojnou C=N vazbu, tak odstranit použitý templátující kovový iont.
[23]
3.5.3. Metoda cyklického peptidu
Tato metoda je velmi vhodná pro přípravu C-substituovaných polyaza-makrocyklů, protože není nutné vytvářet nové C-C vazby po izolaci daného makrocyklu, jelikož tyto substituenty jsou součástí lineárního oligopeptidického prekurzoru. Tento lineární prekurzor lze relativně snadno připravit pomocí syntézy na pevné fázi, která je v dnešní době již standardem pro syntézu poly- nebo oligopeptidů (schéma 5). Princip této metody spočívá v tom, že jeden konec aminokyseliny je ukotven pomocí karboxylové skupiny na vhodně derivatizovaný polymerní nosič, který zároveň funguje jako chránící skupina karboxylové skupiny, zatímco amino skupina je chráněna vhodnou protektivní skupinou. Po ukotvení první aminokyseliny a jejím odchránění se přidávají další (N-chráněné) aminokyseliny jedna po druhé (schema 5). Jelikož je vznikající polymer ukotven na nerozpustném nosiči, vždy po přídání aminokyseliny je možné odstranit nezreagované zbytky a nežádoucí vedlejší produkty promytím vhodným rozpouštědlem a filtrací. Po ukončení syntézy je vzniklý poly- nebo oligopeptid uvolněn z nosiče pomocí vhodného činidla. Tento způsob syntézy nejenže usnadňuje manipulaci, snižuje časové nároky a omezuje tvorbu vedlejších produktů,46 ale hlavně umožňuje automatizaci celého procesu. O POL
O
HO R NH2
O
R2
+
POL O
NH
PROT
R2 NH
O R
O
NH PROT
Schéma 5: Zjednodušené schéma syntézy na pevné fázi POL= vhodně derivatizovaný polymerní nosič, PROT = vhodná chránící skupina
Poté, co je připraven vhodný oligopeptid následuje cyklizace. Tato cyklizace je provedena za nízkých teplot (-20°C až 0°C) za přítomnosti DPPA (difenylfosforyl azid) jako cyklizačního činidla a triethylaminu jako báze (schéma 6).47 Redukce oligopeptidu na C-substituovaný pentaazacyklopentadekan probíhá pomocí nadbytku LiAlH4 v THF. V případě rozpouštění pentapeptidu s hydrofilními vedlejšími řetězci se může vyskytnout problém s rozpustností v THF, nicméně tento problém se dá vyřešit kontrolováním stechiometrie přidaného LiAlH4.48
[24]
O
R5
R O
R2 NH
HO R
O
R4 NH
NH O
R3
O NH2
NH
O
DPPA, TEA
R5
O
NH
R2
NH
O
N H HN H N
R4 O
R5
R NH R2
O
NH
R3
N H HN H N
R4
LiAlH4, THF
R3
Schéma 6: Syntéza cyklického pentapeptidu a následná redukce na pentaazacyklopentadekan
3.5.4. Derivatizace makrocyklů
Pro studium vztahu mezi strukturou a SOD aktivitou je nutná příprava dalších derivátů daného makrocyklického ligandu. Synteticky velmi snadná metoda je alkylace na dusíku pomocí halogenderivátů v přítomnosti báze. V případě SOD mimiků na bázi [15]aneN5 nebo [15]pyaneN5 nebyly N-substituované deriváty zkoumány, protože v původní studii, kterou provedli D.P.Riley a R.H.Weis nebyla u N-substituovaných ligandů zjištěna žádná SOD aktivita.31 Nicméně, je třeba podotknout, že v případě této studie se jednalo o ligandy substituované na všech atomech dusíku. Syntéza derivátů substitovaných pouze na některých atomech dusíku je možná, nicméně použítí přímé alkylace halogenderiváty není vhodné, protože vede ke špatně dělitelné směsi. V některých případech se může žádaný produkt vysrážet z roztoku.49 N-substituce na makrocyklech jako [15]pyaneN5 je možné provést tak, že při syntéze makrocyklu použijeme již nasubstituované reaktanty, jak je znázorněno ve schématu 7.50
[25]
H2N
NH2
HN
NH 1) pyridinal, MeOH 2) NaBH4, MeOH
Ts
Ts
N
tosylaziridin, MeCN, reflux
N
N
NH TsO
N
NH
OTs
N
CaCO3, DMF
N N
N Ts
N
N
N N
Schéma 7: Syntéza substituovaného makrocyklu odvozeného od [15]pyaneN5
[26]
N
Ts
N
4. Praktická část 4.1.Úvod Pro syntézu byly použity komerčně dostupné chemikálie a rozpouštědla (jejich seznam je uveden v tabulce 2) a byly použity bez dalších úprav. Produkty byly charakterizované pomocí MS, 1H-NMR, 13C-NMR a elementární analýzy. Tabulka 2: seznam použitých chemikálií název chemikálie 1,8-diamino-3,6-dioxaoktan acetonitril (AcCN) aktivní uhlí amoniak, vodný roztok (NH3)
výrobce Sigma-Aldrich Penta Penta Penta
deuterovaný dimethylsulfoxid (DMSO-D6) deuterovaný chloroform (CDCl3) diethylether (Et2O) dihydrogenfosforečnan draselný (KH2PO4) dimethylsulfoxid (DMSO) ethylester kyseliny octové (ethylacetát) hydrogenfosforečan sodný (Na2HPO4) hydroxid sodný (NaOH) chlorid amonný (NH4Cl) chlorid manganatý, tetrahydrát (MnCl2.4H2O) chloroform (CHCl3) kyselina bromoctová (BrCH2COOH) kyselina chlorovodíková, vodný roztok (HCl) kyselina octová (CH3COOH) kyselina sírová (H2SO4) metanol (MeOH) oxid manganičitý (MnO2) pyridin-2,6-dikarboxylová kyselina
Gen-chem Gen-chem Penta Lachema Sigma-Aldrich Penta Lachema Penta Penta Penta Penta Sigma-Aldrich Penta Penta Penta Penta Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich
síran sodný, bezvodý (Na2SO4) superoxid draselný (KO2) terc-butylester kyseliny bromoctové (BrCH2COOC(CH3)3) tetrahydridoboritan sodný (NaBH4) tetrahydrofuran (THF)
Penta Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Penta
toluen XTT, sodná sůl
Penta Sigma-Aldrich
[27]
1
H a
13
C NMR spektra byla změřena na 400 MHz NMR spektrometru od firmy
Varian. Některá 1H a 13C spektra a 2D spektra (COSY, HMQC, HMBC) byla změřena na 600 MHz NMR spektrometru JNM-ECA600II firmy JEOL. Změřená spektra byla referencována na signály reziduálního nedeuterovaného rozpouštědla (CDCl3: δ 1H 7,27; 13C 77,00; DMSOD6: δ 1H 2,50;
13
C 39,51). Spektra byla měřena při laboratorní teplotě, pokud není uvedeno
jinak. Hmotnostní spektra byla změřena na přístroji LCQ Fleet Ion Mass Trap MS od firmy Thermo Scientific s 3D iontovou pastí a ionizací elektrosprejem. Vzhledem k povaze studovaných látek, byla spektra měřena v kladném módu. UV-VIS spektra byla měřena na přístroji Perkin-Elmer Lambda40. Měření byla prováděna v roztoku při laboratorní teplotě. Elementární analýza byla provedena na elementárním analyzátoru Thermo Scientific Flash 2000.
4.2. Syntéza prekurzorů Dimethylester pyridin-2,6-dikarboxylové kyseliny (2)
HO
OH
N O
+
MeOH
H2SO4
O
O
O
N O
O
Dimethylester pyridin-2,6-dikarboxylové kyseliny byl připraven z 20 g (119 mmol) pyridin2,6-dikarboxylové kyseliny podle postupu z literatury.42 Bylo získáno 22,18 g (94 %) produktu ve formě bílých krystalků. Produkt byl bez přečištění použit v následující reakci. 1
H-NMR (400MHz, CDCl3): δ 3,96 (s, 6H, -O-CH3); 7,98 (t, 1H, -CH- arom., 3JHH= 7,8 Hz);
8,25 (d, 2H, -CH- arom., 3JHH= 7,8 Hz) 13
C-NMR (400MHz, CDCl3): δ 52,97 (-O-CH3); 127,84 (2C, -CH- arom.); 138,23 (1C, -CH-
arom.); 148,01 (2C, N-C- arom.); 164,83 (2C, -COO-) MS(+): 218,47 [M+Na]+, 234,27 [M+K]+
[28]
Elementární analýza pro C9H9NO4, Mr= 197,15; nalezeno (vypočteno): C 54,90 (55,39); H 4,65 (4,73); N 7,18 (6,97) Pyridin-2,6-dimethanol (3)
O
O
N O
NaBH4 MeOH THF
HO
N
OH
O
2,6‒bis(hydroxymethyl)pyridin byl připraven modifikovaným postupem popsaným v v literatuře.42 22,18 g dimethylesteru pyridin-2,6-dikarboxylové kyseliny (113 mmol) bylo rozpuštěno v 250 ml THF a bylo přidáno 10 g NaBH4 a směs byla následně refluxována asi 2 hodiny. Poté co reakční směs přestala pěnit, bylo přidáno dalších 9 g NaBH4 (2,91 mol celkem) a byl pomalu přikapáván MeOH (1 kapka/2s) po dobu 5 hodin. Po 5 hodinách byl roztok odpařen na RVO skoro do sucha, bylo k němu přidáno 150 ml nasyceného vodného roztoku NH4Cl a roztok byl přes noc kontinuálně extrahován 80 ml ethylacetátu. Po extrakci bylo získáno 16,83 g produktu, který byl dále dvakrát rekrystalizován z toluenu. Vzniklo 3,44 g (22 %) bíložlutého prášku. 1
H-NMR (400MHz, DMSO): δ 4,54(d,4H, -CH2-OH, 3JHH= 5,6 Hz); 5,38 (s, 2H, -OH, 3JHH=
5,6 Hz); 7,32 (d, 2H, -CH- arom.,3JHH= 7,6 Hz);7,75 (t, 1H, -CH- arom., 3JHH= 7,6 Hz) 13
C-NMR (400MHz, DMSO): δ 64,22 (2C, -CH2-OH); 118,20 (2C, -CH- arom.); 137,04 (1C,
-CH- arom.); 160,85 (2C, N-C- arom.); MS(+): 140,08 [M+H]+, 162,07 [M+Na]+ Elementární analýza pro C7H9NO2, Mr= 139,15; nalezeno (vypočteno): C 61,52 (60,42); H 7,10
(6,52); N 10,01 (10,07)
[29]
Pyridin-2,6-dikarbaldehyd (4)
MnO2
HO
OH
N
O
toluen
O
N
3,44 g (25 mmol) pyridin-2,6-dimethanolu (produktu z předcházející reakce) bylo rozpuštěno ve 100 ml toluenu a roztok byl refluxován spolu s 17,0 g MnO2 (195 mmol; 7,8 mol. ekv.) po dobu 20 hodin. Po odfiltrování MnO2 na fritě a odpaření rozpouštědla na RVO bylo izolováno 1,44 g (43 %) bíložlutého prášku. 1
H-NMR (400MHz,CDCl3 ): δ 8,09 (t, 1H, -CH-, 3JHH= 8 Hz); 8,19 (d, 2H, -CH-, 3JHH= 8
Hz); 10,17 (s, 2H, -CHO) 13
C-NMR (400MHz, CDCl3): δ 125 (2C, -CH- arom.); 138,36 (1C, -CH- arom.); 152,99 (2C,
N-C- arom.); 192,33 (2C, -CHO) Elementární analýza pro C7H5NO2, Mr= 135,12; nalezeno (vypočteno): C 65,97 (62,22); H 3,94 (3,73); N 10,71 (10,37)
4.3 Syntéza ligandů 4,12,18-triaza-6,9-dioxabicyklo[12.3.1]octadeka-1(18),14,16-trien (L1)
O
O
N (4)
H2N
O
MnCl2
+ O
NH2
N
1) NaBH4 2) H2O, O2
Cl
N Mn
N
O Cl O
(5)
N NH O
NH O
Ligand L1 byl připraven podle postupu v literatuře42 z 1,30 g pyridin-2,6dikarbaldehydu (10 mmol). Bylo izolováno 2,3 g (96%) produktu ve formě hnědooranžového oleje. Výtěžek vztažený na pyridin-2,6-dikarboxylovou kyselinu je 8,6 %.
[30]
1
H-NMR (400MHz, CDCl3): δ2,81 (t, 4H, OCH2-CH2-N, 3JHH= 4,5 Hz); 3,63 (s, 4H, O-CH2-
CH2-O); 3,67 (t, 4H, O-CH2-CH2-N, 3JHH= 4,5 Hz); 3,88 (s, 4H, N-CH2-py), 6,97 (d, 2H, CHarom.); 7,5 (t, -CH-arom.,3JHH= 7,6 Hz) 13
C-NMR (400MHz, CDCl3): δ 49,08 (2C, CH2-N); 53,70 (2C, CH2-N); 70,12 (2C, CH2-O);
70,12 (2C, CH2-O); 119,86 (-CH-arom.); 136,27 (1C, -CH-arom); 157,93 (2C, C-CH2) MS(+): 251,60 [M+H]+, 274,15 [M+Na]+ Elementární analýza pro C13H21N3O2 .1,2 H2O, Mr=272,60; zjištěno (vypočteno): C: 57,15 (57,21); H: 8,50 (8,64); N 15,11 (15,40)
N-karboxymethyl-3,12,18-triaza-6,9-dioxabicyklo[12.3.1]octadeka-1(18),14,16-trien (L1-Ac)
12 11
13
10
N NH O
NH
Br
O
+
O
OH
postup b) MeOH, reflux
N
9
postup a) NaOH, H2O, reflux
O 15 OH
14 1
NH
2
N 3
8 7
O
O
6
5
4
Postup a) 1,00 g ligandu L1 (4 mmol) bylo rozpuštěno v 70 ml MeOH a k roztoku bylo přikapáváno 0,11 g BrCH2COOH (0,8 mmol; 0,2 mol. ekv.) v 5 ml MeOH a reakce byla refluxována přes noc. Po ukončení refluxu byla reakční směs odpařena do sucha na RVO a po rozpuštění v malém množství vody byly produkty odděleny na silném anexu (Dowex 1X8, 50-100 mesh). Nejprve byl vodou a NH3 vyeluován nezreagovaný ligand L1 (0,6 g) a následně byl produkt eluován HCl (1/2 v/v). Bylo izolováno 150 mg ligandu L1Ac ve formě hydrochloridu (61 %). Postup b) 1,00 g ligandu L1 (4 mmol) bylo rozpuštěno v 70 ml destilované vody a k roztoku bylo přikapáváno 0,12 g BrCH2COOH (0,86 mmol; 0,3 mol ekv.) v 5 ml destilované vody. [31]
Během tohoto přikapávání bylo udržováno pH roztoku okolo 9 pomocí 1M NaOH. Směs byla refluxována přes noc. Po ukončení refluxu byla voda odpařena na RVO na objem roztoku přibližně 10 ml a směs byla oddělena na silném anexu. Nejprve byl vodou vyeluován nezreagovaný ligand L1 (0,8g) a poté produkt pomocí HCl (1/2 v/v). Bylo izolováno 120 mg produktu ve formě hydrochloridu (50 %). Charakterizace: MS(+): 310 [M+H]+; 331 [M+Na]+ 1
H-NMR (400 MHz, DMSO, 85°C): δ 3,21 (H8; t, 2H, 3JHH=4,5 Hz); 3,60 (H5, H6; m, 4H);
3,65 (H3; t, 2H, 3JHH=5,1 Hz); 3,81 (H7; m, 2H); 3,81 (H7, m, 2H); 3,86 (H4; t, 2H, 3JHH=5,1 Hz); 4,19 (H2; s, 2H); 4,38 (H9; s, 2H); 4,79 (H1; s, 2H); 7,49 (H11, H13; d, 2H, 3JHH=7,6 Hz); 7,94 (H12; t, 1H, 3JHH=7,6 Hz) 13
C-NMR (400 MHz, DMSO, 85°C): δ 46,40 (C8); 49,15 (C9); 53,80 (C2); 54,38
(C3); 57,44 (C1); 63,74 (C4); 64,62 (C7); 69,13 (C5, C6); 122,69 (C11, C13);138,64 (C12); 149,20 (C14); 151,02 (C10); 166,44 (C15);
4.4 Syntéza komplexů Komplex MnL1
N NH O
N
MnCl2
NH
MeOH
HN
Cl
Mn
NH
O Cl O
O
0,50 g ligandu L1 (2 mmol, olej) bylo rozpuštěno v 15 ml MeOH a refluxováno s aktivním uhlím 25 minut. Po zfiltrování aktivního uhlí na fritě byl získán žlutý roztok (žádná barevná změna) a přidáno 0,37 g MnCl2.4H2O (1,8 mmol; 0,9 mol. ekv.). Roztok byl zahřát pro rozpuštění všeho MnCl2 a následně zfiltrován na fritě. Pomalou difúzí diethyletheru do roztoku za chladu vzniklo 0,1 g komplexu MnL1 (13%) jako bíložluté krystalky. MS(+): 341,06 [MnL1Cl]+ [32]
Elementární analýza pro [L1MnCl2].MeOH, Mr= 408,0 změřeno (vypočteno): C 41,40 (41,09); H 6,59 (6,16); N 11,45 (10,27) Komplex MnL1-Ac
0,33 g ligandu L1-Ac (1,6 mmol) bylo rozpuštěno v 5 ml metanolu. K tomuto roztoku bylo přidáno 0,27g Et3N (2,7 mmol; 1,7 mol. ekv.). Po přidání aminu se vyloučilo malé množství světlé látky. K tomuto roztoku bylo přidáno 0,21 g MnCl2.4H2O (1 mmol; 0,62 mol ekv.). Vysrážená látka se z většího množství zpět rozpustila a zbytek byl odfiltrován na stříkačkovém mikrofilmu. Filtrát byl odpařen do sucha na RVO za vzniku hnědé pevné látky. MS(+): 363 [MnL1-Ac]+; 102 [Et3N+H] + (viz. diskuse)
4.5.Měření SOD aktivity komplexu MnL1 Do 1,2 ml 1mM fosfátového pufru o pH 7,4, bylo přidáno takové množství 1mM nebo 14mM (pro koncentraci 5×10-4M) roztoku komplexu MnL1 v DMSO, aby jeho výsledná koncentrace při objemu 1,5 ml byla 5×10-4M, 5×10-5M, 2,5×10-5M, 1×10-5M. K roztoku pufru a komplexu bylo přidáno 0,1 ml 5mM roztoku barviva XTT v DMSO a reakce byla zahájena přídavkem 0,1 ml nasyceného roztoku KO2 v DMSO, který byl před přídavkem zfiltrován pomocí stříkačkového mikrofilmu (0,45μm). Po přídavku KO2 byly vzorky protřepány a inkubovány 30 minut při laboratorní teplotě a následně proměřeny. Jako slepý vzorek (blank) byl použit roztok obsahující 1,3 ml pufru, 0,1 ml barviva a takové množství komplexu, které bylo stejné jako v měřeném vzorku. Jako kontrolní vzorek (vzorek s nulovou inhibicí tvorby barevného formazánu) byl použit roztok 1,3 ml pufru, 0,1 ml barviva XTT a 0,1 ml nasyceného roztoku KO2 v DMSO. Absorbance vzorků byla měřena při vlnové délce 477 nm (absorpční maximum kontrolního vzorku).
[33]
5. Diskuse 5.1 Syntéza Jako vhodný ligand pro Mn(II) komplexy s potencíální SOD aktivitou byl zvolen derivát [15]pyaneN5 –ligand L1, obsahující dva kyslíkové a tři dusíkové donorové atomy ve svém makrocyklickém skeletu (viz. cíle práce, kapitola 2). Tento ligand byl zvolen z několika důvodů. Prvním z nich, byla strukturní podobnost s již známými mimiky SOD, jako je např. Mn(II) complex [15]pyaneN5. Druhým důvodem je strukturní podobnost tohoto ligandu s aktivním místem MnSOD (koordinace pomocí tří atomů dusíku a dvou atomů kyslíku) a zároveň dvě volná koordinační místa pro přístup molekul superoxidu. Jako výchozí látka pro syntézu L1 byl zvolen pyridin-2,6-dikarbaldehyd (4), který po cyklizační reakci s 1,8-diamino-3,6-dioxaoktanem v přítomnosti MnCl2 a následné redukci NaBH4 vytvoří požadovaný makrocyklický ligand L1. Jelikož je cena (4) vysoká (7241 Kč/g, Sigma-Aldrich), byl připraven v laboratoři. Některé možné metody přípravy (4) jsou uvedeny ve Schématu 8.
N
HO
OH
N O
oxidace SeO2
HO
N
OH
O redukce DIBAH oxidace MnO2
O
O
N (4)
Schéma 8: Možnosti přípravy pyridin-2,6-dikarbaldehydu
Oxidace 2,6-dimethylpyridinu pomocí SeO2 je možná, ale probíhá za vzniku dalších produktů navíc SeO2 je toxický. Redukce pomocí diisobutylaluminium hydridu (DIBAH) je také možná, ale překážkou byla poměrně vysoká cena redukčního činidla (5018 kč/100g, Sigma-Aldrich). Pyridin-2,6-dimethanol také může sloužit jako výchozí látka pro přípravu 2,6-bis(brommethyl)pyridinu, který slouží jako výchozí látka pro přípravu pentaaza-ligandů jako
[34]
je např. [15]pyaneN5. Z těchto důvodu byla zvolena poslední možnost, oxidace pyridin-2,6dimethanolu pomocí MnO2. Celý postup přípravy pyridin-2,6-dikarbaldehydu 4 krokovou syntézou z pyridin-2,6dikarboxylové kyseliny (1) je uveden na následujícím schématu.
H2SO4
HO
OH
N O
(1)
MeOH
O
O
O
N O
O
(2)
NaBH4, MeOH THF MnO2
O
N
O
toluen
HO
(4)
N (3)
OH
Schéma 9: Reakční schéma přípravy pyridin-2,6-dikarbaldehydu
Prvním krokem byla esterifikace (1) metanolem za vzniku methylesteru (2). Reakce probíhala s výtěžky kolem 95% i v případě použití většího množství výchozí látky (20 g nebo 30 g kyseliny). Druhým krokem byla redukce vzniklého esteru (2) pomocí NaBH4, která v přítomnosti MeOH probíhala s velkým výtěžkem. Z důvodu extrémní hydrofility vzniklého produktu, pyridin-2,6-dimethanolu, bylo nutné použít kontinuální extrakci, protože klasická několikanásobná extrakce vedla k separaci pouze cca 10% produktu. Kontinuální extrakce reakční směsi byla prováděna ethylacetátem a vyžádala si speciální aparaturu (obr.19) pro kontinuální extrakci těžší kapaliny lehčí kapalinou. Páry refluxujícího ethylacetátu proudily trubičkou pro vyrovnávání tlaku do horní části aparatury, kde ve zpětném chladiči kondenzovaly a kapilárou stékaly na dno dělící nálevky. Ze dna poté ethylacetát procházel skrze vodný roztok produktu a docházelo k extrakci produktu. Jakmile se na hladině vodného roztoku v dělící nálevce vytvořila dostatečná vrstva ethylacetátu s extrahovaným produktem, ethylacetát začal protékat boční trubičkou pro vyrovnávání tlaku do baňky, kde opět
[35]
refluxoval. Protože kapilára velice rychle ucpala vysráženým NH4Cl nebo produktem, byla při sestavování aparatury naplněna vodou, čímž se tomuto ucpání zabránilo.
Obr. 19: Aparatura pro extrakci ethylacetátem
Po odpaření ethylacetátu bylo získáno 16.83g bílé pevné látky, která obsahovala kromě (3) i zbytky chloridu amonného a velké množstvím vody (výtěžnost více než 100%). Proto byl tento hrubý produkt rekrystalizován z toluenu a čistý produkt vážil pouze 3.44 g (výtěžnost 22%). Malé množství získaného produktu není způsobeno nedostatečnou redukcí NaBH4, ale pravděpodobně vysokým obsahem vody v (3), která snižuje rozpustnost v toluenu a tím pádem i výsledný výtěžek rekrystalizace. Kromě tohoto postupu byla zkoušena redukce za RT, která probíhala s vysokým výtěžkem (80%), nicméně, po zvýšení množství výchozí látky z 5 g na 23 g se výtěžek výrazně snížil (26%).
[36]
Dialkohol (3) byl dále oxidován pomocí MnO2 na dialdehyd (4). Reakce se musí provádět s aktivovaným MnO2 (velký povrch) a v aprotických rozpouštědlech, aby nedocházelo ke konkurenčnímu vázání rozpouštědla na povrch MnO2, na kterém dochází k oxidaci. Bohužel rozpustnost dialkoholu (3) je v aprotických rozpouštědlech, jako je např. chloroform, velmi malá a většinou se používá k jejímu rozpuštění velký objem rozpouštědla, což vede k nízkým výtěžkům reakce. Polární aprotické rozpouštědla jako dimethlyformamid nebo dimethyl sulfoxid nejsou vhodná z důvodu jejich velmi obtížného odpařování po provedení reakce. Reakce byla proto provedena v toluenu, ale probíhala s nižším výtěžkem (43%), který byl pravděpodobně způsoben naadsorbováním produktu na MnO2. Kvůli zvýšení výtěžku byla zkoušena reakce bez rozpouštědla. Nejprve byl použit hmotnostní poměr MnO2:dialkohol 7:1 a reakce byla zahřívána na 150°C po dobu 10 minut. Během těchto 10 minut došlo k bouřlivé reakci za uvolnění vodní páry, která unášela MnO2 a produkt, proto bylo nutné použít baňku o větším objemu. Této exotermní reakci, se v rámci optimalizace metody zabránilo intenzivním mícháním reakční směsi. Výtěžky byly opět nižší (26% z 3,15 g (3)) a při použití většího množství výchozí látky se ještě dále snížily (12% z 6,42 g (3)). Proto byla prodloužena reakční doba na 20 hodin a zvýšen poměr na 10:1. Po této úpravě se zvýšily výtěžky až na 60 % (na 1 g výchozí látky (3) ) . Samotná cyklizace dialdehydu (4) s 1,8-diamino-3,6-dioxaoktanem (5) za vniku makrocyklické Schiffovy báze probíhala s výtěžky přes 95%. Přídavkem MnCl2.4H2O se zabránilo polymeračním reakcím, jelikož Mn(II) fungoval jako templátující ion (viz. kapitola 5.2) a čistý ligand L1 byl získán redukcí Schiffovy báze pomocí NaBH4. Následné přidání vody do reakční směsi vedlo ke zvýšení pH a její expozice vzdušnému kyslíku zapříčinila oxidaci Mn(II) a následnou demetalaci komplexu za uvolnění manganu ve formě hydratovaného MnO2 (schéma 10).
O
O
N (4)
H2N
O
MnCl2
+ O
NH2
N
1) NaBH4 2) H2O, O2
Cl
N Mn O Cl O
(5)
Schéma 10: Reakční schema cyklizace a redukce za vzniku L1
[37]
N
N NH O
NH O
První pokus o přípravu ligandu L1-Ac byl proveden alkylací L1 pomocí kyseliny bromooctové ve vodném roztoku NaOH (reakce a) nebo v metanolu (reakce b). Nejprve byl vyzkoušen poměr reaktantů 1:1 což vedlo ke vzniku směsi mono- (L1-Ac), di- (L1-Ac2) a nesubstituovaného ligandu (L1), která byla dělena pomocí iontové-výměnné chromatografie (IEC – ion exchange chromatography). Nečistoty byly eluovány na silném katexu pomocí H2O a eluce 5% NH3 vedla k vymytí směsi produktů L1-Ac a L1-Ac2. Eluát byl odpařen do sucha a rozpuštěn v malém množství destilované vody a směs mono- a disubstituovného ligandu byla dělena na silném anexu elucí 5% AcOH, poté 10% AcOH a nakonec HCl:voda 1:2), nicméně se nepodařilo tuto směs rozdělit na jednotlivé složky. Z tohoto důvodu byl pro alkylaci použit t-butylbromoacetát, jelikož ligandy, kde je karboxylová skupina ve formě esteru, by mělo být možné rozdělit pomocí chromatografie na SiO2. Stejně jako v předchozím případě byl molární poměr mezi reaktanty 1:1 a opět vznikala směs mono-, bis- a nesubstituovaného ligandu. Tato směs byla dělena chromatograficky na silikagelu. Jako mobilní fáze byla použita směs CHCl3+MeOH v poměrech: 20:1, 100:7, 10:1, 1:1, 2:3 a nakonec čistý MeOH. Tyto mobilní fáze byly postupně používány v uvedeném pořadí a podařilo se izolovat bis-substituovaný ligand L1-(t-ButAc)2 ve vysoké čistotě, nicméně monosubstituovaný ligand L1-(t-ButAc) se izolovat nepodařilo.
O reakce a) BrCH2COOH, NaOH, H2O
OH N
NH
N
N
reakce b) BrCH2COOH, MeOH
N
OH
O NH O
N
+
O
O
O
N HO
O
NH L1-Ac2
L1-Ac O
O L1
reakce a) BrCH2COOC(CH3)3 , NaOH, H2O
reakce b) BrCH2COOC(CH3)3, MeOH
O
O
N
N NH
O
N
O
O
L1-(t-butAc)
O
+
N
O
N O
O
O
L1-(t-butAc) 2
Schéma 11: Příprava substituovaných ligandů L1 jedním nebo dvěma acetátovými pendantními rameny: L1-Ac, L1-Ac2, L1-(t-ButAc), L1-(t-ButAc)2 [38]
Jako další možnost se jevila alkylace kyselinou bromoctovou ve velkém nadbytku ligandu L1. Tento postup se nakonec ukázal jako úspěšný. Ligand L1 a kyselina bromoctová reagovaly v molárních poměrech 5:1. Reakce proběhla za vzniku pouze monosubstituovaného ligandu L1-Ac, který byl oddělen z reakční směsi pomocí IEC na silném anexu. Nezreagovaný ligand L1 byl eluován pomocí destilované vody a produkt byl eluován HCl zředěné vodou v poměru 1:2.
Komplex [MnL1Cl2] byl připraven podle postupu z literatury.42 Ligand byl povařen s aktivním uhlím kvůli odstranění možných nečistot, nicméně po odfiltrování aktivního uhlí nebyla pozorována žádná barevná změna roztoku. Jelikož byla struktura komplexu známá z literatury,42 nebylo nutné pokoušet se získat krystal pro rentgenovou strukturní analýzu. Komplex [Mn(L1-Ac)Cl2] byl připraven reakcí ligandu L1-Ac s MnCl2.4H2O v přítomnosti Et3N jako báze. Po odpaření rozpouštědla, bylo zjištěno, že vzniklá pevná látka je směs komplexu a chloridu triethylamonia. Z tohoto důvodu byly ke směsi přidány 3 ml acetonitrilu. Bylo předpokládáno, že komplex nebude v acetonitrilu rozpustný z důvodu přítomnosti karboxylové skupiny, zatímco sůl ano. Analýza roztoku i nerozpuštěného zbytku ukázala, že se rozpustil i komplex. Acetonitril byl odpařen a ke směsi byly přidány 3 ml chloroformu, ale opět došlo k rozpuštění soli i komplexu. Po odpaření chloroformu byla směs rozpuštěna v MeOH a pomalou plynnou difúzí diethyletheru byla získána šedá sraženina. Analýzou sraženiny i roztoku bylo zjištěno, že sraženina obsahuje větší množství komplexu ve směsi se solí. Sraženina byla stejným způsobem znovu rekrystalizována za vzniku bílých monokrystalů vhodných pro RTG strukturní analýzu. RTG strukturní analýza byla provedena, nicméně z časových důvodů se nepodařilo získaná data interpretovat před odevzdáním této práce.
5.2 Měření SOD aktivity SOD aktivita komplexu [MnL1Cl2] byla změřena pomocí nepřímé metody využívající reakce superoxidu s barvivem XTT. Při pipetování roztoku KO2 se vyskytl problém se zvířenými částečkami nerozpuštěného superoxidu, které se dostávaly do pipetovaného roztoku. Proto bylo nutné [39]
roztok KO2 před pipetováním zfiltrovat. Tuto filtraci bylo nutné opakovat, protože po odfiltrování nerozpuštěného KO2 se rozpuštěný KO2 ve filtrátu na vzduchu velice rychle rozkládal a po přibližně 5–10 minutách stání již tento roztok neposkytoval barevnou reakci s barvivem ve vzorku. Z hodnoty naměřené absorbance při každé koncentraci bylo vypočteno procento inhibice (%INH) podle vzorce %INH = 100 − 100 ×
. Z rovnice přímky
závislosti %INH na záporném dekadickém logaritmu koncentrace testované látky se vypočetla hodnota IC50 (koncentrace testované látky, při které se vyskytne 50% úbytek vzniku barevného formazánu – produktu reakce KO2 s barvivem XTT). Pro každou koncentraci byla provedena tři paralelní měřeníabsorbance při vlnové délce 477 nm a pro výpočet %INH byl použit průměr z každých tří měření. Tabulka 3: Absorbance jednotlivých vzorků ckomplex (mol×dm‒3)
Absorbance
%INH
5×10
‒4
0,209
82,245
5×10‒5
0,583
50,554
2,5×10
0,672
43,072
1×10‒5
0,743
27,038
kontrola
1,187
0
‒5
%INH
Z grafu závislosti %INH na –logc (graf 1) byla vypočtena hodnota IC50, která je 38,1 μM.
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
y = -27,47x + 171,4 R² = 0,981
3
3,5
4
4,5
5
-logckomplex Graf 1: Závislost %INH na záporném dekadickém logaritmu koncentrace komplexu [40]
5,5
Jelikož hodnoty IC50 se nedají přímo porovnávat, byla hodnota IC50 přepočítána na kkat (rychlostní konstantu reakce superoxidu s Mn(II) komplexem), která nezávisí na koncentraci indikátoru. kkat=
∗[
]
=
, ×
× ,
,
×
×
= 7,52×105 M‒1s‒1
kde kindikator (rychlostní konstanta reakce XTT se superoxidem)51 = 8,6×104 M‒1s‒1, [indikátor] (molární koncentrace barviva ve vzorku) = 3,33×10‒4 M a IC50= 3,81×10‒5M Porovnáním hodnot kkat připraveného komplexu s hodnotami kkat některých známých SOD mimiků (tabulka 4) můžeme říci, že komplex [MnL1Cl2] má srovnatelnou SOD aktivitu jako komplexy Mn(II) se salenovými ligandy (EUK-8 a EUK-134). Ve srovnání s Mn(II) komplexy
s pentaaza-makrocycklickými
ligandy
([Mn([15]aneN5)Cl2]
a
[Mn([15]pyaneN5)Cl2]), je aktivita [MnL1Cl2] o přibližně 2 řády nižší. kkat ostatních zmiňovaných mimiků je vyšší o jeden až tři řády.
Tabulka 4: Srovnání SOD aktivity [MnL1Cl2] a některých SOD mimiků SOD mimik
kkat M‒1s‒1
[MnL1Cl2]
7,52×105
EUK-8
6,0×105
EUK-134
6,0×105
[Mn([15]pyaneN5)Cl2]
4,10×107
[Mn([15]aneN5)Cl2]
4,13×107
Cu/Zn SOD
2,0×109
SOD aktivita Mn(II) komplexů s deriváty [15]aneN5 nebo [15]pyaneN5 byla v literatuře často porovnávána s rychlostí výměny vody na příslušném komplexu (koordinovaná molekula vody se vyměňuje s okolními molekulami vody v rozpouštědle a ustanovuje se termodynamická rovnováha této výměny charakterizovaná rychlostí její výměny – kex), protože chloridové ligandy jsou ve vodném roztoku substituovány molekulami vody, což bylo potvrzeno měřením vodivosti těchto roztoků.42 Disociace molekuly vody je prvním krokem v mechanismu odbourávání superoxidového radikálu pomocí Mn(II) komplexů, kde má Mn(II) koordinační číslo 7,52 a proto je důležité zjistit, jakým způsobem [41]
rychlost výměny vody ovlivňuje rychlost odbourávání superoxidu SOD mimiky. Aby bylo možné číselně porovnat konstanty kex a kkat, které mají rozdílné jednotky, byla hodnota kex podělena molární koncentrací vody v daném roztoku (55,5M), čimž byla získána hodnota kex/[H2O], která má stejnou jednotku jako kkat (tabulka 5).
Tabulka 5: Srovnání rychlosti výměny vody a SOD aktivity některých SOD mimiků SOD mimik
kex s‒1
kex/[H2O] M‒1s‒1
kkat M‒1s‒1
[MnL1Cl2] 42
0,38×107
6,85×104
7,52×105
[Mn([15]aneN5)Cl2] 52
>108
1,80×106
4,13×107
[Mn([15]pyaneN5)Cl2 ]52
4,7×107
8,47×105
4,10×107
[Mn([15]pydieneN5)Cl2] 52
2,0×107
3,60×105
neaktivní
Je nutné podotknout, že korelace rychlosti výměny vody a SOD aktivity je vhodné provádět pouze u podobných látek. Jak je vidět v tabulce 4, nedá se určit obecný trend, např. kkat pro [Mn([15]aneN5)Cl2] a [Mn([15]pyaneN5)Cl2] jsou prakticky stejné, nicméně rychlost výměny vody na těchto komplexech se liší více než dvakrát. Pokud srovnáme komplex [MnL1Cl2] a [Mn([15]pyaneN5)Cl2] zjistíme, že se jejich rychlostní konstanty kkat liší více než padesátkrát, ale rychlost výměny vody se u těchto komplexů liší pouze přibližně desetkrát. Pro zajímavost je uveden i komplex [Mn([15]pydieneN5)Cl2], který není SOD mimikem (obr.19), nicméně rychlost výměny vody je u tohoto komplexu srovnatelná s [Mn([15]pyaneN5)Cl2].
Cl N N
N Mn O
O Cl
Obr. 20: Struktura neaktivního [Mn([15]pydieneN5)Cl2]
[42]
SOD aktivita je ovlivněna mnoha parametry. My jsme se pokoušeli porovnat změnu SOD aktivity v případě, že se zamění dva donorové atomy dusíku za atomy kyslíku. Ze srovnání hodnot rychlosti výměny vody kex/[H2O] pro [MnL1Cl2] a [Mn([15]pyaneN5])Cl2] vyplývá, že nižší rychlost výměny vody je spojena s nižší hodnotou rychlostní konstanty dismutace superoxidu kkat. Pro objektivní potvrzení tohoto trendu, by bylo vhodné studovat Mn(II) komplex ligandu, který by v makrocyklickém skeletu obsahoval pouze jeden donorový atom kyslíku a čtyři atomy dusíku („mezistupeň“ mezi [MnL1Cl 2] a [Mn([15]pyaneN5)Cl2]. Na druhou stranu vysoká hodnota kex/[H2O] pro [Mn([15]aneN5)Cl2] je patrně důsledek chybějícího pyridinového jádra, které zapříčiní oslabení vazby mezi koordinovanou vodou a centrálním atomem, která ovšem nezpůsobuje adekvátní zvýšení SOD aktivity. 52 Tato nepravidelnost v nalezeném trendu ukazuje na celkovou složitost procesu odbourávání superoxidu a pro přesné porovnání vlivu všech, jak strukturních, tak sterických parametrů, by bylo potřeba studovat mnohem rozsáhlejší skupinu látek.
6. Závěr Podařilo se připravit ligand L1 včetně jeho charakterizace a charakterizace meziproduktů a částečně se podařilo optimalizovat některé kroky přípravy prekurzorů k jeho syntéze. Výtěžek redukce dimethylesteru pyridin-2,6-dikarboxylové kyseliny na pyridin-2,6dimethanol se výrazně zvýšil, pokud redukce probíhala za laboratorní teploty, nicméně tato redukce probíhala úspěšně pouze s menším množstvím výchozí látky. Výtěžek oxidace pyridin-2,6-dimethanolu na pyridin-2,6-dikarbaldehyd se zvýšil přibližně o 20%, když oxidace probíhala bez rozpouštědla za vysoké teploty a ve velkém nadbytku oxidačního činidla (MnO2). Velké množství produktu zůstávalo naadsorbováno na MnO2 a výtěžek reakce by mohl být zvýšen vícenásobným promýváním MnO2 po reakci (i při zvýšené teplotě). Dále byl připraven komplex [MnL1Cl2] a byla změřena jeho SOD aktivita. Z tohoto měření vyplývá, že tento komplex je mimikem SOD s aktivitou srovnatelnou s některými již známými mimiky např. Mn(II) komplexy salenu. Jeho SOD aktivita je v porovnání se strukturně podobným komplexem [Mn([15]pyaneN5)Cl2], ve kterém jsou dva kyslíkové atomy v L1 zaměněny za dva dusíkové atomy v [15]pyaneN5, asi o dva řády nižší. Snížení SOD aktivity koreluje se snížením rychlosti výměny vody v MnL1 komplexu. Rychlost výměny vody kex však nemůže být rychlost-určujícím krokem dismutace superoxidu [43]
(disociace molekuly vody je prvním krokem v reakčním mechanismu dismutace superoxidu pomocí Mn(II) komplexů), protože je její hodnota nižší než výsledná rychlostní konstanta dismutace superoxidu kkat. Proto není jasné, jak moc rychlost výměny vody ovlivňuje SOD aktivitu. Navíc, některé jiné komplexy mají prakticky shodnou kkat, nicméně rychlost výměny vody u těchto komplexů se poměrně výrazně liší. Celý proces se tedy jeví jako velmi komplexní a z těchto důvodů by bylo potřeba vytvořit soubor přesnějších měření na větším počtu strukturně podobných Mn(II) komplexů (např. jeden atom kyslíku v makrocyklickém skeletu aj.) a měřit SOD aktivitu jednou metodou, nejlépe stopped-flow metodou, ze které lze získat rovnou hodnotu kkat. První krok v tomto zkoumání byl učiněn v tom, že byl připraven a charakterizován ligand L1-Ac, který se liší od původního ligandu L1 substitucí acetátovým pendantním ramenem na jednom dusíkovém atomu. Byl také připravem Mn(II) komplex tohoto ligandu, kde je acetát pendantního ramene koordinován na centrální atom a pro koordinaci vody zbývá jen jedno volné koordinační místo. Tato koordinace pendantního ramene bude ovlivňovat jak strukturu a rigiditu celé koordinační sféry, tak i rychlost výměny vody (ta může být laděna změnou funkční skupiny v pendantním ramenu např. fosfonát, pyridin aj.). Zkoumání SOD aktivity tohoto komplexu bude předmětem dalšího studia, stejně jako snaha o lepší pochopení faktorů ovlivňující SOD aktivitu Mn(II) komplexů 15-členných pyridinových makrocyklů.
[44]
7. Seznam Literatury 1
Lukeš I., Mička Z.; Anorganická chemie II ‒ systematická část (1999), Karolinum
2
Greenwood N.N., Earnshaw A.; Chemie prvků (1993), Informatorium
3
Gielen M., Tiekink E.R.T.; Metallotherapeutics Drugs and Metal-Based Diagnostic Agents:
The Use of Metals in Medicine (2005), John Wiley & Sons, Inc. 4
Emsley J.; Nature´s Building Blocks: An A-Z guide to the Elements (2001), Oxford
University Press 5
Crichton R.R.; Biological Inorganic Chemistry (2012), Elsevier
6
Fronko R.M., et al; (1988), J. Am. Chem. Soc. 110, 7554-7555.
7
Borgstahl G.E.O., et al.; (1996), Biochemistry 35: 4287-4297.
8
Voet D., Voet G.J.; Biochemie; (2005), Victoria Publishing
9
Guoyao Wu, Morris S. M.; (1998), Biochem. J. 336(1): 1-17.
10
Christianson W.D.; (1997), Prog Biophys Mol Biol 67: 217-252.
11
Chelikani P., Fita I., Loewen P.C.; (2004), Cell. Mol. Life Sci 61(2): 192-208.
12
Barynin V.V. et al.; (2001), Structure 9: 725-738.
13
Veal E. A., Day A.M, Morgan B.A.; (2007), Mol. Cell 26(1): 1-14.
14
Matés J.M., Pérez-Gómez Ch., Núňez de Castro I.; (1999), Clin. Biochem. 32(8): 595-603.
15
McCleverty J.A., Meyer J.T.; Comprehensive Coordination Chemistry II, vol. 8, (2003),
Elsevier Pergamon 16
Stoddard B.L., Howell P.L, Ringe D., Petsko G.A.; (1990), Biochemistry 29: 8885-8893.
17
Valko M., et al.; (2007), Int. J. Biochem. Cell 39: 44-84.
18
Frances-Miller A.; (2004), Curr. Opin. Chem. Biol.8: 162-168.
19
Valko M., et al.; (2004), Mol. Cell. Biochem. 266: 37-56.
20
Pastor N., Weinstein H., Jamison E., Benowitz M.; (2000), J. Mol. Biol.304: 55-68.
21
Fridovich I., Liochev S. I.; (1994), Free Radical Biol. Med. 16(1): 19-33.
22
Fridovich I., Liochev S. I.; (2002), Redox Rep. 7: 55-57.
23
Ghafourifar P., Cadenas E.; (2005), Trends Pharmacol. Sci. 26(4): 190-195.
24
Dröge W.; (2002), Physiol Rev 82: 47-95.
25
Valko M., et al.; (2006), Chem.-Biol. Interact. 160: 1-40.
26
Iranzo O.; (2011), Bioorg. Chem. 39: 73-87.
27
Riley D.P.; (1999), Chem. Rev. 99: 2573-2587.
28
Qing-Xiang Li, et al.; (2004), Eur. J. Inorg. Chem. 22: 4447-4456. [45]
29
Batinic-Haberle I, et al.; (1997), Arch. Biochem. Biophys. 343(2): 225-233.
30
Batinic-Haberle I., et al.; (2012), Amino Acids 42(1): 95-113.
31
Riley D.P., Weiss R. H.; (1994), J. Am. Chem. Soc.116(1): 387-388.
32
Riley D.P., Schall O. F.; (2007), Adv. Inorg. Chem. 59: 233-263.
33
Friedel F. C., Lieb D., Ivanović-Burmazović,I.; (2012). J. Inorg. Biochem.109: 26-32.
34
Richman J. E., Atkins T. J.; (1974), J. Am. Chem. Soc. 96(7): 2268-2271.
35
Vriesema B. K., Buter J., Kellog R.M.; (1983), J. Org. Chem. 49: 110-113.
36
Hoye R. C., et al. (2001), J. Org. Chem. 66: 2722-2725.
37
Fukuyama T., Chung-Kuang J., Cheung M.; (1995), Tetrahedron Lett. 36(36): 6373-6375.
38
Borisova N. E., Reshetova M.D., Ustynyuk Y.A.; (2007), Chem. Rev. 107: 46-79.
39
Guerriero P., Tamburini S., Vigato P.A.; (1993), Coord. Chem. Rev. 139: 17-243.
40
Radecka-Paryzek W., Pastroniak V., Lisowski J.; (2005), Coord. Chem. Rev. 249(21-22):
2156-2175. 41
Barefield E. K., et al. (2007), Inorg. Synth., John Wiley & Sons, Inc.
42
Drahos B., et al. (2010), Inorg. Chem. 49(7): 3224-3238.
43
Reid C. M., et al. (2008), Bioorg. Med. Chem. Lett. 18: 2455-2458.
44
Storm O., Lüning U.; (2002), Chem. Eur. J. 8(4): 793-798.
45
Martell A. E., Motekaitis R.J., Nation A.D.; (1999), Polyhedron 18: 3203-3218.
46
Merrifield R. B. (1963), J. Am. Chem. Soc. 85(14): 2149-2154.
47
Brady S. F., et al. (1979), J. Org. Chem. 44(18): 3101-3105.
48
Neumann W. L., et al. (1994), Tetrahedron Lett. 35(22): 3687-3700.
49
Jagadish B., et al. (2011), Tetrahedron Lett. 52(17): 2058-2061.
50
Park W., et al. (2006), Tetrahedron Lett. 47(50): 8841-8845.
51
Sutherland M. W., Learmonth B. A.; (1997), Free Radical Res. 27(3): 283-289.
52
Dees A., et al. (2007), Inorg.Chem. 46(7): 2459-2470.
[46]
