UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakognozie
Diplomová práce
Kultury léčivých rostlin in vitro - IX Hana Kačírková
Vedoucí katedry: Vedoucí diplomové práce: Oponent diplomové práce: Datum zadání: Termín odevzdání: Počet stran:
Doc. RNDr. Jaroslav Dušek, CSc. Doc. PharmDr. Lenka Tůmová, CSc. Doc. RNDr. Jiřina Dušková, CSc. 25. 11. 2008 15. 5. 2010 81
Tento výstup vznikl v rámci projektu specifického vysokoškolského výzkumu 2010-261-002. Prohlašuji, ţe tato diplomová práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichţ jsem pro zpracování čerpala, řádně cituji.
Děkuji mojí vedoucí diplomové práce Doc. PharmDr. Lence Tůmové, CSc. za odborné vedení, rady a cennou pomoc při vypracování této práce a kolektivu katedry farmakognozie Farmaceutické fakulty UK za vytvoření příjemného pracovního prostředí.
Obsah SOUHRN POUŽITÝCH ZKRATEK ...........................................................................6 SOUHRN .........................................................................................................................7 1. ÚVOD ...........................................................................................................................8 2. CÍL PRÁCE.................................................................................................................9 3. TEORETICKÁ ČÁST ..............................................................................................10 3.1. SILYBUM MARIANUM ............................................................................................... 10 3.1.1. Význam a původ ............................................................................................ 10 3.1.2. Matečná rostlina ........................................................................................... 10 3.1.3. Droga – Plod ostropestřece mariánského .................................................... 10 3.1.4. Obsahové látky .............................................................................................. 11 3.1.5. Biosyntéza flavonolignanů ............................................................................ 13 3.1.6. Farmakologické účinky ................................................................................. 14 3.2. EXPLANTÁTOVÉ KULTURY .................................................................................... 19 3.2.1. Základní principy .......................................................................................... 19 3.2.2. Kategorie kultur rostlinných explantátů ....................................................... 19 3.2.3 Charakteristika explantátových kultur........................................................... 20 3.2.4. Typy buněčných kultur .................................................................................. 20 3.2.5 Kultivace explantátů vyšších rostlin .............................................................. 21 3.2.6. Podmínky kultivace ....................................................................................... 22 3.2.7. Produkce sekundárních metabolitů .............................................................. 30 3.2.8 Využití explantátových kultur......................................................................... 31 3.3. ELICITACE ............................................................................................................. 32 3.3.1. Charakteristika elicitace, stresu a stresových faktorů .................................. 32 3.3.2. Elicitory ........................................................................................................ 33 3.3.3. Mechanismus stresové reakce ....................................................................... 35 3.3.4 Podmínky úspěšné elicitace ........................................................................... 36 3.4. PŮSOBENÍ CERITÝCH IONTŮ IN VITRO ..................................................................... 38 3.4.1. Lanthanoidy .................................................................................................. 38 3.4.2. Cer ................................................................................................................ 38 3.4.3. Elicitace ceritými ionty a ionty jiných kovů .................................................. 39 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ....................................................................................45 4.1. ROSTLINNÝ MATERIÁL .......................................................................................... 45 4.2. CHEMIKÁLIE A POMOCNÉ LÁTKY........................................................................... 45 4.3. PŘÍSTROJE A VYBAVENÍ......................................................................................... 46 4.4. KULTIVACE TKÁŇOVÝCH KULTUR ........................................................................ 47 4.4.1. Příprava kultivačních nádob a nástrojů ....................................................... 47 4.4.2. Složení a příprava živného média ................................................................. 47 4.4.3. Odvození kultury ........................................................................................... 48 4.4.4. Pasážování a kultivace.................................................................................. 48 4.5. ELICITACE ............................................................................................................. 49 4.5.1. Příprava elicitoru ......................................................................................... 49 4.5.2. Elicitace kalusových kultur ........................................................................... 49 4.5.3. Elicitace suspenzních kultur ......................................................................... 50 4.6. STANOVENÍ OBSAHU FLAVONOLIGNANŮ ............................................................... 50 4.7. STATISTICKÉ ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ .................................................................. 56
5. VÝSLEDKY ..............................................................................................................58 6. DISKUSE ...................................................................................................................67 7. ZÁVĚR ......................................................................................................................72 8. LITERATURA ..........................................................................................................74
Souhrn použitých zkratek 2,4,5-T 2,4-D 2ip či IPA 4-Cl-IAA ABA AP BA BAP CAT COX-2 DPI ERK HPLC IAA IBA IL-1α ISO A ISO B JA LDL LysoPC MAPK MCPA MeJa MS NF-κB OA PA PAA PCD PLA2 PLD POD PSA SENCAR SIL A SIL B SILCR SILYD SOD TAX TNF-α TPA α-NAA
2,4,5-trichlorfenoxyoctová kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina 6-dimethylaminopurin 4-chlorindolyl-3-octová kyslina abscisová kyselina askorbátperoxidáza 6-benzyladenin 6-benzylaminopurin kataláza cyklooxygenáza 2 difenyljodium extracellular signal-regulated kinase vysokoúčinná kapalinová chromatografie indolyl-3-octová kyselina indolyl-3-máselná kyselina interleukin 1α isosilybin A isosilybin B jasmonová kyselina low-density lipoprotein lysofosfatidylcholin mitogen-activated protein kinase 2-methyl-4-chlorfenoxyoctová methyljasmonát médium Murashigeho a Skooga nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells okadaická kyselina fosfatidová kyselina fenyloctová kyselina programovaná buněčná smrt fosfolipáza A2 fosfolipáza D peroxidáza prostatický specifický antigen SENsitive to CARcinogenesis silybin A silybin B silychristin silydianin superoxiddismutáza taxifolin tumor nekrotizující faktor α 12-O-tetradekanoylphorbol α-naftyloctová kyselina
6
Souhrn Kultury léčivých rostlin in vitro - IX Elicitace je metoda vyuţívající obranných mechanismů rostlin ke zvýšení produkce sekundárních metabolitů v rostlinách i kulturách in vitro. Byl sledován vliv tří koncentrací abiotického elicitoru - ceritých iontů na produkci flavonolignanů kalusovou a suspenzní kulturou Silybum marianum. Kultura byla kultivována na médiu Murashigeho a Skooga s přídavkem 10 mg/l kyseliny α-naftyloctové. Doba aplikace elicitoru byla 6, 12, 24, 48, 72 a 168 hodin. Pro stanovení obsahu flavonolignanů v kalusové i suspenzní kultuře byla zvolena metoda HPLC. Maximální obsah flavonolignanů v kalusové kultuře byl prokázán po 72 hod elicitaci Ce3+ o koncentraci c2 = 4,0572 · 10-4 mol/l (0,1%). Na rozdíl od kalusové kultury byla produkce flavonolignanů v suspenzní kultuře ovlivněná minimálně. U suspenzních i kalusových kultur Silybum marianum po působení různých koncentrací Ce3+ bylo zjištěno i zvýšení obsahu flavonoidu taxifolinu. In vitro cultures of medicinal plants – IX
Elicitation is a method using protective mechanisms of plants to increase the production of secondary metabolites in plants and cultures in vitro. The effect of three concentrations of the abiotic elicitor – cerium (Ce3+) on the flavonolignan production by Silybum marianum callus and suspension culture was examined. The culture was cultivated on a Murashige-Skoog medium with the addition of 10 mg/l of α-naphthylacetic acid. The periods of application of the elicitor were 6; 12; 24; 48; 72; and 168 hours. The content of flavonolignans in callus and suspension culture was detected by HPLC. The maximal enhancement of the flavonolignan content (0,1%) was proved after 72-hour action of Ce3+ in the concentration of c2 = 4,0572 · 10-4 mol/l in callus cultures. Contrary to callus cultures, the production of flavonolignans in suspension cultures was influenced by Ce3+ only in minimal extent. Furthermore, an increase of the flavonoid taxifolin content was detected after the elicitation of various concentrations of Ce3+ in Silybum marianum callus and suspension cultures.
7
1. Úvod Rostliny jsou pro ţivot na Zemi natolik významné a samozřejmé, ţe si jejich důleţitost jen málokdy plně uvědomujeme. Poskytují člověku daleko více neţ jen energii pro ţivotní procesy. V rostlinné potravě člověk přijímá řadu důleţitých látek, které jsou pro jeho ţivot nezbytné. Rostliny jsou pro člověka zdrojem mnoha důleţitých surovin, jako je například dřevo a vlákno. Sekundární metabolity rostlin mají nejrůznější moţnosti vyuţití. Především je významné jejich vyuţití k léčení nebo jako výchozích látek k výrobě léčiv, k barvení tkanin a kůţí, poskytují vonné látky k výrobě parfémů a kosmetických prostředků a téţ se vyuţívají v potravinářství (1). Většinu přírodních látek ovšem nelze získat izolací či ekonomicky únosnou chemickou syntézou ani pomocí genového inţenýrství. Poţadované rostlinné látky můţeme získat vyuţitím rostlinných explantátových kultur (2). Explantátové kultury rostlin znamenají kultivaci izolovaných částí rostlin (buněk, pletiv a orgánů) ve sterilních podmínkách řízeného prostředí. Pro dosaţení co nejvyššího zisku poţadovaných látek, je třeba, co nejvíce optimalizovat kultivační podmínky (kultivační média, teplota, vlhkost, kvalita a kvantita světla) (3). Vzhledem k tomu, ţe aţ na výjimky je charakteristickým problémem kultivace rostlinných explantátů v kulturách in vitro nízká produkce sekundárních metabolitů těmito kulturami, jsou hledány různé techniky ke zvýšení produkce sekundárních látek. Je to například biotransformace, imobilizace, metody genového inţenýrství a také jednou z metod, kterou je moţné dosáhnout zvýšení produkce sekundárních látek je metoda elicitace (4). Elicitace je metoda vyuţívající působení elicitoru na rostliny. Elicitor je substance, která v rostlině působí stres. Tímto signálem je aktivován obranný mechanismus, kterým je zvýšena hladina sekundárních metabolitů. Především jde o jejich syntézu, nikoli o elicitorem indukované uvolnění (5). Aby byla elicitace úspěšná, je nutné pouţít takový elicitor, který má vhodnou koncetraci a musíme stanovit optimální dobu jeho působení.
8
2. Cíl práce Cílem práce bylo: seznámit se s metodikou kultivace rostlinných kultur in vitro zjistit vliv abiotické elicitace (ionty Ce) na produkci flavonolignanů kalusovou a suspenzní kulturou Silybum marianum na základě stanovení obsahu flavonolignanů HPLC metodou zjistit, zda ionty ceru v různých koncetracích jsou schopny ovlivnit produkci obsahových látek
9
3. Teoretická část 3.1. Silybum marianum 3.1.1. Význam a původ Ostropestřec mariánský zaujímá významné místo mezi léčivými rostlinami, uţ Dioskorides doporučuje pouţívat tuto rostlinu při poruchách jater a ţlučníku. V roce 1959 se z naţek získala krystalická látka silymarin. S jeho pěstováním se u nás začalo v 80. letech minulého století. Dnes se řadí mezi velkoplošně pěstované léčivé rostliny (6). 3.1.2. Matečná rostlina Silybum marianum /L./ GAERTN., ostropestřec mariánský /Asteraceae/. Jednoletá nebo dvouletá velmi pichlavá bodlákovitá 30 aţ 200 cm vysoká rostlina. Z kůlovitého kořene vyrůstá přímá, dole hustě, nahoře řidčeji olistěná lodyha s dření. Přízemní listová růţice má širokoeliptické listy zakončené bělavým ostnem, listy jsou panašované. Stonkové listy jsou objímavé, pevné, střídavé, přisedlé, ostře zoubkované, chobotnatě laločnaté, téţ s bílými skvrnami. Květní poupata jsou vejcovitého tvaru dlouhé 50 mm. Zákrovní listy květních úborů jsou zakončené silným ostnem. Květy jsou trubkovité, světle aţ tmavě červenofialové. Plodem je naţka mírně zploštělá, lesklá, hnědé barvy, dlouhá 6 mm a široká 3 mm. Naţky nesou bílý pappus, který jim umoţňuje létat, snadno odpadající. V jednom úboru se nachází kolem sta plodů. Kvete podle oblasti od června aţ do září. Jedná se o suchomilnou rostlinu. Je původní od Kanárských ostrovů na západě, přes Středomoří do Malé a Přední Asie. Pěstuje se však ve všech světadílech a mnohde i zplaňuje. U nás rovněţ často pěstován a občas i zplaňuje, převáţně v blízkosti zahrad, kompostů, podél cest (7, 8, 9). 3.1.3. Droga – Plod ostropestřece mariánského Silybi mariani fructus (Cardui mariae fructus) je chmýru zbavený zralý plod druhu Silybum marianum (L.) GAERTN. Musí obsahovat nejméně 1,5% silymarinu, 10
vyjádřeno jako silibinin (C25H22O10; Mr 482,4), počítáno na vysušenou drogu. Krátce před dozráním (zralost avizuje chmýr, který se dá lehce vytáhnout prsty) se odříznou celé úbory a nechají se dozrát na suchém a vzdušném místě. Doba sběru je od srpna do září. Následně se plody z úborů vymlátí a zbaví chmýru. Podlouhlé vejčité silně zmáčklé naţky asi 6 mm aţ 8 mm dlouhé, 3 mm široké a 1,5 mm silné; svrchní strana je hladká, lesklá, základní barva je šedá nebo světle hnědá s podélným tmavohnědým ţíháním, celková barva je světle našedlá nebo hnědá; naţka je naspodu zúţená, nahoře má světle ţlutý asi 1 mm vysoký vyčnívající okraj, který uzavírá zbytek čnělky. Na příčném řezu je patrné úzké hnědé oplodí a dvě velké bílé silné olejnaté dělohy. Droga je bez pachu a má mírně nahořklou chuť (10). Droga Cardui mariae fructus je uţívána jako choleretikum, cholagogum, při ţloutence, posthepatickém syndromu a cholecytopatiích, při ţlučníkových kaméncích s kolikami, akutních a chronických zánětech jater a cirhózách. Zvyšuje tvorbu ţluče (hořčina, silice). Silymarin slouţí jako podpůrná terapie při poškození jater alkoholem či léky (13). 3.1.4. Obsahové látky Účinnou látkou jsou flavonolignany tzv. silymarinový komplex, neboli zkráceně silymarin (1,5-3%). Jde o adiční sloučeniny flavanonolů s koniferylalkoholem. Silymarin je izomerická směs obsahující silybin (silybinin), isosilybin (1:1 směs diastereoizomerů), silychristin a silydianin. Směs má obsahovat nejméně 80% silymarinu, vyjádřeného jako silybinin. Další flavonolignany objevené v Silybum marianum jsou 2,3-dehydrosilybin, 2,3-dihydrosilychristin, deoxysilydianin, silandrin, silybinome, silyhermin, neosilyhermin A a B, silymonin. Výtaţky z drogy obsahují často různé polymerní produkty silybinu (silybinomery). Dále rostlina obsahuje flavonoidy quercetin, taxifolin a dehydrokaempferol. Další obsahové látky této drogy jsou mastné oleje s vysokým podílem nenasycených kyselin 20 – 30% linolová, olejová, palmitová a steroly jako je cholesterol, kampesterol, stigmasterol a betasitosterol. V droze téţ najdeme škroby, cukry (arabinosa, rhamnosa, xylosa, glukosa), aminokyseliny, biogenní aminy (tyramin, histamin), silice a hořčiny (7, 13, 14). ČL 2009 (10) uvádí Silybi mariani extractum siccum raffinatum et normatum – Ostropestřecový extrakt suchý čištěný a standardizovaný vyrobený z drogy Silybi 11
mariani fructus. Obsahuje 90% aţ 110% jmenovitého obsahu silymarinu, vyjádřeno jako silibinin (C25H22O10; Mr 482,4), uvedeného v označení na obalu. Počítáno na vysušený extrakt, je jmenovitý obsah silymarinu 30% aţ 65%. Obsah silymarinu zahrnuje: -
součet obsahů silikristinu a silidianinu (oba C25H22O10; Mr 482,4): 20% aţ 45%, vztaţeno k celkovému obsahu silymarinu;
-
součet obsahů silibininu A a silibininu B (oba C25H22O10; Mr 482,4): 40% aţ 65%, vztaţeno k celkovému obsahu silymarinu;
-
součet obsahů isosilibininu A a isosilibininu B (oba C25H22O10; Mr 482,4): 10% aţ 20%, vztaţeno k celkovému obsahu silymarinu.
Obr. 1. Chemická struktura hlavních sloţek silymarinového komplexu (2)
12
3.1.5. Biosyntéza flavonolignanů Tyto flavonolignany představují zvláštní typ stereochemických moţností oxidativní adice olefinu (koniferylalkoholu) na fenol, resp. flavonoid (taxifolin). Tvorba 1,4-benzodioxanů, při níţ reagují obě sousední fenolické skupiny (3´, 4´) poskytne čtyři stereoisomery nalezené v přírodní směsi: dva silybiny, v nichţ je α-uhlík koniferylalkoholu vázán na 3´-O a dva isosilybiny, v nichţ je tento α-uhlík vázán na 4´-O náleţející C-kruhu taxifolinu. Protoţe jsou v molekule další chirální centra, jsou jednotlivé stereoisomery rozlišitelné HPLC v achirálním systému: podle pořadí eluce jsou označovány jednotlivé silybiny a isosilybiny A a B. Ačkoliv byly tyto látky připraveny v čistém stavu, jejich absolutní konfiguraci se nepodařilo dosud vyřešit. Koniferylalkohol se můţe také adovat na pozici jedné ze dvou OH skupin C-kruhu taxofilinu (3´nebo 4´) a současně na jeden ze sousedních uhlíků (2´nebo 5´) jako je tomu v případě silychristinu (4´-O-α, 5´-C-β), iso-silychristinu (3´-O-α, 2´-C-β), silyherminu (4´- O-α, 5´-C-β = 3-deoxy-silychristin) (11, 12).
13
Obr. 2. Syntéza silybinu z taxifolinu a koniferylalkoholu (83)
3.1.6. Farmakologické účinky U plodu ostropestřece mariánského bylo zaznamenáno dokonce několik farmakologických účinků. Byly zjištěny hepatoprotektivní, antioxidační, protizánětlivé, protifibrózní a protinádorové vlastnosti, stejně tak byla objevena schopnost inhibice peroxidace lipidů, stimulace proteinové biosyntézy a zrychlení jaterní regenerace. Farmakologie a klinická účinnost ostropestřece mariánského je stále přezkoumávána (14-18). 14
In vitro studie a studie na zvířatech Antioxidační aktivita Silymarin a silybin jsou antioxidanty, které reagují s volnými radikály (např. vysoce reaktivní kyslíkový radikál) a přemění je na více stabilní a méně reaktivní sloučeniny (14, 19-21). Bylo oznámeno, ţe silymarin a silybin inhibují lipidovou peroxidaci vyvolanou systémy spojenými s ţelezem v jaterních mikrosomech potkanů (22, 23) a chrání proti phenylhydrazinem vyvolanou peroxidací lipidů v erytrocytech potkanů (14). Intraperitoneální silymarin dokázal zvýšit celkový glutathion v játrech, střevech a ţaludku u potkanů (24). Silymarin inhibuje mědí vyvolanou oxidaci lidského LDL (low-density lipoprotein) in vitro (25). Silybin se zdá být sloţkou silymarinu zodpovědného za LDL antioxidační efekt. Naproti tomu silychristin a silydianin se chovají jako pro-oxidanty, ale bez významného sníţení celkové antioxidační schopnosti silymarinu. Bylo zjištěno, ţe volné radikály mají důleţitou roli v několika patologických procesech, hlavně zánětu, nekróze, fibróze, ateroskleróze, karcinogenezi a stárnutí a v hepatotoxických účincích různorodých látek. Domníváme se, ţe antioxidační aktivita silymarinu přispívá k hepatoprotektivním účinkům (26, 18). Hepatoprotektivní účinky In vitro studie pouţívající izolované jaterní buňky, zaznamenaly ochrannou aktivitu silymarinu proti poškozování buněk vyvolané různými cytotoxickými látkami (14). In vivo studie na potkanech a myších ukázaly hepatoprotektivní aktivitu silymarinu a silybinu při akutní jaterní intoxikaci. Tuto intoxikaci vyvolaly různé toxické chemické látky, které působily různými mechanismy účinku. Jednalo se například o tetrachlormethan, galaktosamin, thioacetamid, ethanol, paracetamol (acetaminophen), thallium, phalloidin a α-amantin (hlavní toxická látka houby A. phalloides) (14).
Experimentální studie chronické toxicity jater vyvolané
opakovaným podáváním tetrachlormethanu, těţkých kovů, thioacetamidu a několika léčiv včetně azathioprinu a indometacinu také ukázaly, ţe podání silymarinu a silybinu poškozování jater zabraňuje (14). Další studie informovaly o ochranném účinku silymarinu proti poškození jater vyvolané ischémií (28) a gama-zářením (29). 15
Studie na králících krmených 12 týdnů potravou velmi bohatou na tuky ukázala, ţe histopatologické změny byly méně rozvinuté u zvířat, která současně dostávala silymarin-fosfolipidový komplex (27). U potkanů silymarin inhiboval rozvoj hypercholsterolémie, která byla vyvolána potravou (30). Hypocholesterolemické účinky silymarinu mohou být dány účinkem silymarinu na lipoproteinový metabolismus (31). Účinek silymarinu na sekreci ţlučových solí byl zjištěn ve studiích na potkanech (32). Pětidenní aplikace intraperitoneálního silymarinu (25, 50, 100 a 150 mg/kg/den) vyvolala na dávce závislý vzrůst sekrece ţluči a ţlučových solí. Stimulace sekrece ţlučových solí byla objasněna vzrůstem ţlučové sekrece hepatoprotektivních ţlučových solí β-muricholátu a ursodeoxycholátu. Nefroprotektivní vlastnosti Silybin vpíchnutý potkanům po předchozím podání cisplatiny poskytnul ochranu glomerulární a proximální tubulární funkce (33, 34). Silybin neovlivňuje cytotoxickou aktivitu cisplatiny (34). Intraperitoneálně podaný silybin (5mg/kg) podaný potkanům 30 minut před podáním ciclosporinu sníţil ciclosporinem vyvolanou lipidovou peroxidaci, ale nezpůsobil ochranný účinek na rychlost glomerulární filtrace (35). Antikancerogenní účinnost Silybin o koncentraci 0,1-20 μmol/l inhiboval růst k léčivu rezistentních rakovinných buněk vaječníků a doxorubicin rezistentních buněk rakoviny prsu in vitro (36). Dále silybin v rozmezí 0,1-1,0 μmol/l zesílil účinek cisplatiny a doxorubicinu na linii experimentálních nádorových buněk. Při aplikaci na kůţi SENCAR myší poskytoval
silymarin
ochranu
proti
účinkům
spouštěčů
nádorového
bujení
12-O-tetradekanoylphorbolu (TPA) a okadaické kyseliny (OA) (37). Předcházející topická aplikace silymarinu před podáním TPA a OA úplně zabránila indukci tumor nekrotizujícího faktoru α (TNF-α) při expresi mRNA v epidermis. Významná ochrana proti rakovině způsobené slunečním zářením byla prokázána u myší, kterým byl podáván forbolový ester nebo 7, 12-dimethylbenz(a)antracen (38). Protinádorový účinek je především v první fázi zaměřen na nádorové bujení a silymarin účinkuje potlačením cyklooxygenázy 2 (COX-2) a interleukinu 1α (IL-1α) (39). Takové účinky mohou vyvolat zpomalení edému, hyperplázie, indexu proliferace a oxidačního stavu, které bylo vyvoláno aktivátorem (40). Další studie na lidských nádorových buňkách prostaty ukázala, ţe silymarin můţe uplatnit silný antikancerogenní účinek proti 16
rakovině prostaty (41). Také bylo zjištěno, ţe silymarin měl silný antikancerogenní účinek proti lidským nádorovým buňkám rakoviny prsu (42). Rakovinná
chemoprevence
a
antikancerogenní
účinky
silymarinu
pravděpodobně způsobuje hlavní obsahová látka silibinin (43). PSA (prostatický specifický antigen) je enzym produkovaný normálními i rakovinovými buňkami prostaty a je zvláště citlivým ukazatelem pro diagnózu a léčbu této nemoci. Silibinin sniţuje PSA u hormon-dependentních buněk LNCaP karcinomu prostaty a zpomaluje buněčný růst zástavou v G1 fázi (44). SENCAR myši byly krmeny silibininem a následně byla sledována jeho distribuce do tkání (45). Volný silibinin se shromaţďoval hlavně v játrech, ale distribuoval
se
i
do
dalších
orgánů.
Byl
zpozorován
vzrůst
aktivity
glutathion-S-transferasy a chinon reduktázy v játrech, plících, ţaludku, kůţi a tenkém střevě. Výsledky ukázaly, do jaké míry se silibinin absorbuje do různých tkání. Taktéţ byla v různých tkáních prokázána enzymová indukce. Silymarin je tak moţné vnímat jako silné chemopreventivní činidlo. Protizánětlivé účinky Při orálním podávání silymarinu došlo k redukci abscesu na tlapce potkana. Jednalo se o karagenový dávkově závislý test edému na potkanní tlapce (ED50 = 62,4 mg/kg) (46). Při testu, kdy byl xylenem vyvolán zánět, měl topicky podávaný silymarin srovnatelné účinky s indometacinem (46). Silymarin podáváný myším intraperitoneálně způsobil inhibici akumulace leukocytů v zánětlivém exudátu a sníţení počtu neutrofilů (46). NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) je proteinový komplex, který kontroluje transkripci DNA. NF-κB hraje klíčovou roli v regulaci imunitní odpovědi při infekci. Naopak nesprávná regulace NF-κB by vedla k rakovině, zánětu, autoimunitním onemocněním, septickému šoku, virové infekci a nesprávnému vývoji imunity (47). Aktivace NF-κB vyvolaná působením TNF (tumor necrosis factor), forbolových esterů, okadaické kyseliny a ceramidu byla zablokovaná silymarinem. Účinnost byla závislá na jeho dávkování. Inhibice aktivace NF-κB pravděpodobně
poskytuje
část
molekulárního
principu
pro
protizánětlivý
a
protikancerogenní účinek silymarinu (48). Silymarin navíc inhibuje COX-2 a IL-1α (39).
17
Protektivní účinky na žaludeční vředy Orální podání silymarinu potkanům chránilo před ţaludečními vředy vyvolanými pobytem v chladu. Mnoţství ţaludeční sekrece a její kyselost nebyly ovlivněny, ale koncentrace histaminu značně poklesla. Odhaduje se, ţe účinek silymarinu proti vředům, můţe být spojen s inhibicí enzymové peroxidace lipoxygenasovou cestou (49). Ochranný účinek silymarinu na ischémií poškozený ţaludek potkanů spočíval v reperfúzi a jejím účinku na slizniční myeloperoxidázu. Tento účinek byl srovatelný s účinkem allopurinolu (50). Další účinky Silymarin prokázal ochranu před diabetes mellitus vyvolaným alloxanem u potkanů. Tento jeho účinek je pravděpodobně způsoben díky jeho antioxidační aktivitě a vzrůstu jeho koncentrace v plazmě (51). U silymarinu byla popsána i jeho schopnost chránit kůţi proti následkům UVB záření. Také bylo prokázáno, ţe silymarin, silybin a dehydrosilybin sniţují toxický efekt UVA, čehoţ můţe být vyuţito v účinné ochraně kůţe proti oběma sloţkám UV záření. Tento nález je nutné ověřit in vivo (52). Nežádoucí a vedlejší účinky Přípravky se silymarinem jsou většinou dobře snášeny; u citlivých osob se mohou objevit běţné symptomy GIT (změkčení stolice, flatulence, pocit naplnění ţaludku). Silymarin je obsaţen v řadě léčivých přípravků, které lze zakoupit i bez lékařského předpisu jako je např. FLAVOBION tbl., IBEROGAST tct., LAGOSA drg., LEGALON cps., SILYGAL tbl., SILYMARIN AL drg., SIMEPAR cps.; silymarin je také součástí homeopatik a velkého mnoţství potravinových doplňků. Léčivý přípravek LEGALON SIL inj., který obsahuje Silibinini dinatrii disuccinas, je vázaný na lékařský předpis a pouţívá se při akutní intoxikaci houbou Amanita phalloides (53).
18
3.2. Explantátové kultury 3.2.1. Základní principy Explantátové kultury rostlin (kultury rostlinných explantátů) jsou vyuţívány k biochemickým, fyziologickým, morfologickým a genetickým studiím. Jejich vyuţití není omezeno pouze na oblast základního a aplikovaného výzkumu, ale v řadě vyspělých zemí se staly nedílnou součástí zemědělské produkce rostlin. Explantátové kultury rostlin znamenají aseptickou kultivaci izolovaných částí rostlin za umělých podmínek. V praxi se jedná o oddělení určité části ze sterilně napěstované nebo povrchově sterilizované rostliny, její umístění do sterilního prostředí a kultivování za více či méně definovaných podmínek (3). Kultivace in vitro znamená pěstování rostlinného materiálu v podmínkách co nejpřesněji definovatelných po stránce chemické i fyzikální a zabraňující neţádoucí kontaminaci cizorodými ţivými organismy a buňkami. Rostlinné buňky kultivované in vitro se vyznačují totipotencí, tj. schopností obnovit v průběhu diferenciačních procesů specializované funkce a postupně regenerovat ve fertilní rostlinu (54). Ve svém principu zahrnují rostlinné explantátové kultury izolaci buněk, pletiv a orgánů a jejich kultivaci ve sterilních podmínkách řízeného prostředí (definovaná kultivační média, teplota, vlhkost, kvalita a kvantita světla). 3.2.2. Kategorie kultur rostlinných explantátů Explantátové
kultury
lze
podle
morfologické,
respektive
anatomické
charakteristiky zařadit do některé z pěti kategorií: 1) kultura orgánová: orgánové systémy, orgány či jejich základy nebo části, pěstované v podmínkách in vitro způsobem, který umoţňuje jejich diferenciaci a celkově zachovává jejich stavbu a funkci 2) kultura tkáňová resp. pletivová: morfologicky desorganizované mnohobuněčné komplexy tkáně, různě soudrţné, které jsou pomnoţované buď na polotuhých, nebo pevných nosičích, většinou nasycených ţivným médiem, vyjímečně přímo v tekuté ţivné půdě 3) kultura suspenzní: volné buňky a buněčné shluky společně pomnoţované jsou suspendovány
v tekutém
ţivném
provzdušňována 19
médiu,
kultura
je
promíchávána
a
4) kultura buněčná resp. kultura volných buněk: volné jednotlivé buňky, identifikovalné, jsou pomnoţovány v tekutém či polotekutém médiu nebo na nosiči nasyceném půdou 5) kultura protoplastů: je kultura buněk zbavených buněčných stěn, kde je buněčný obsah obalen jen pruţnou, elastickou plasmolemou a nikoliv pevnou buněčnou stěnou (54) 3.2.3 Charakteristika explantátových kultur Rostlinný explantát můţe být kaţdý fragment ţivého pletiva, celý orgán nebo komplex orgánů odebraný buď z intaktní rostliny (rostlina pěstovaná v přirozených podmínkách) nebo z jiţ existující kultury s cílem pěstování v podmínkách in vitro. Tkáňovou, suspenzní či buněčnou kulturu můţeme odvodit z buňky či komplexu buněk pletiva kteréhokoliv orgánu rostlinného těla s výjimkou velmi specializovaných buněk (např. sítkovice, tracheidy apod.) Za vhodných kultivačních podmínek lze kultury pěstovat in vitro neomezeně dlouhou dobu. Tkáňová resp. suspenzní kultura se v průběhu růstu in vitro dediferencuje, coţ znamená, ţe ztrácí svůj původní morfologický a fyziologický charakter, ale nestává se homogenní. U suspenzní kultury můţeme nalézt jak volné buňky, tak i buněčné shluky různých velikostí a jejich poměr se můţe různě měnit. Mnoho orgánových, tkáňových i buněčných kultur je schopno trvalého růstu na zcela syntetických půdách a to i na velmi jednoduchých. Zato nejsou schopny bez poškození podstoupit konzervaci mrazem. Explantované orgány, resp. orgánové základy mohou v kultuře in vitro dorůstat (54). 3.2.4. Typy buněčných kultur Metodologie pro vytváření a pěstování buněčných kultur odvozených z tkání vyšších
rostlin
je
základem
pro
vypracování
velkokapacitní
kultivace
pro
biotechnologické vyuţití, pro klonování rostlinného materiálu a pro techniky genových manipulací s rostlinami. Pouţíváme dva typy buněčných kultur – kalusové a suspenzní.
20
Počátečním stádiem pro oba typy kultur rostlinných buněk je tvorba kalusové kultury. Rozřezané kousky poraněných sterilních částí rostlin se inkubují na pevném ţivném médiu agaru. Tím vznikne nepravidelný výrůstek buněk, který nazýváme kalus. Přes řadu subkultur lze pak zaloţit nezávisle rostoucí kalusovou kulturu. Kdyţ změníme kombinaci fytohormonů v kultivačním médiu, dojde ke sníţení vzájemné přilnavosti buněk; pak lze třepáním kalusu v kapalném médiu uvolnit jednotlivé buňky, které dále rostou a vytvářejí suspenzní kulturu (55). 3.2.5 Kultivace explantátů vyšších rostlin Odvození explantátových kultur lze rozdělit na čtyři fáze: V první fázi musíme vybrat vhodnou matečnou rostlinu, pokud moţno s vysokou produkcí metabolitů a získat primární explantát. Obtíţněji se odvozují kultury z jednoděloţných rostlin. Z povrchově sterilizované nebo asepticky pěstované rostliny se fragment některého orgánu umístí in vitro na vhodné sterilní agarové médium. Sloţení ţivného média musí být v této fázi komplexnější neţ v dalších pasáţích. Primární kalus se objevuje po několika týdnech a je schopný rozmnoţování na novém médiu. V druhé fázi ze získaného kalusu odstraníme zbytky výchozího orgánu a při zajištění pasáţování na vhodném médiu můţe kalus neomezeně proliferovat. Během prvních pasáţí se často projevují morfologické (pigmentace) nebo morfogenetické (regenerace) změny a teprve aţ po větším počtu pasáţí získáme stabilní a homogenní rostlinný materiál. Abychom toho docílili, je nutné přísné dodrţování konstantních podmínek kultivace. Obvykle jsou vlastnosti vyselektované homogenní kultury dány původním genotypem a kultivačními podmínkami. V třetí fázi chceme získat suspenzní kulturu rostoucí v tekutém médiu. Lze ji získat z tkáně pěstované na pevné půdě buď enzymovým rozvolněním (např. působením pektináz) nebo mechanickou cestou. Získané kultury jsou dále udrţovány pomocí pravidelných pasáţí a po několika pasáţích můţeme získat suspenze s konstantním stupněm agregace. Buňky proliferují jako drobné shluky buněk. Jediným regulátorem rozpadavosti na volné buňky je charakter ţivné půdy a vhodný subkultivační reţim. Čtvrtá fáze zajišťuje udrţování suspenzních kultur, které se uskutečňuje vsádkovou kultivací v malých baňkách, rollerech nebo třepačkách. Přechod na větší objemy je velmi náročný hlavně z hlediska nutnosti udrţení dokonalé sterility, dostatku 21
kyslíku a dalších faktorů. Rostlinné buňky jsou křehké a špatně snášejí mechanické míchání, ale nemíchané rychle sedimentují. Volba vhodného způsobu kultivace závisí na vlastnostech kultury (54). 3.2.6. Podmínky kultivace Volba vhodných kultivačních podmínek je nutná pro optimální růst kultury a stejně tak je důleţitá i pro produkci sekundárních metabolitů. Zejména je důleţité zajistit příslušné chemické a fyzikální podmínky. Do chemických podmínek řadíme sloţení ţivné půdy a z fyzikálních podmínek je nutné zajistit dostatek světla, vhodnou teplotu a optimální pH ţivného média. Složení živných médií Sloţení kultivačních médií se dá povaţovat za jeden z nejdůleţitějších faktorů, který ovlivňuje růst a morfogenezi v tkáňových kulturách rostlin. Ţivné médium se zpravidla označuje jménem badatele, který ho sestavil, pouţil a vyzkoušel jako první. Existuje celá řada médií pouţívaných pro různé druhy rostlin a pro různé účely kultivace. Mezi nejčastěji pouţívaná média patří média, která popsali White (1963), Murashige and Skoog (MS, 1962), Gamborg et al (B5, 1968), Gautheret (1942), Shenk and Hildebrant (SH, 1968), Nitsch and Nitsch (1969) a Lloyd and McCown (1981). Média pouţívaná pro kultivaci buněk, rostlinných pletiv a orgánů obsahují obvykle následující sloţky: makroelementy, mikroelementy, vitamíny, aminokyseliny nebo další zdroje organického dusíku, sacharidy, další nedefinované organické sloţky, zpevňující látku a růstové regulátory (3, 54).
MAKROELEMENTY Směs anorganických makroprvků, které jsou nutné pro kultivaci intaktních rostlin. Jejich kvantitativní zastoupení v médiu je větší neţ 30 mg/l. Makroelementy dodávané do kultivačních médií zahrnují šest nejdůleţitějších prvků: dusík, fosfor, draslík, vápník, hořčík a síru. Ionty jsou přidávány do ţivného média ve formě jejich solí (3, 54).
22
MIKROELEMENTY Mezi mikroelementy nezbytné pro růst tkáňových kultur rostlin patří ţelezo, mangan, zinek, bór, měď a molybden. Do médií se také někdy dodává kobalt, jód, sodík a chlór, ale nemusí to být pro růst kultivovaných rostlinných tkání nezbytné. Význam niklu a hliníku je pro růst explantátové kultury zatím sporný (3, 54). ZDROJ UHLÍKU A ENERGIE Rostlinné tkáně kultivované in vitro jsou schopné vyuţívat uhlík z cukrů, alkoholů a organických kyselin. Uhlík je pro ně základní stavební jednotkou pro nově vznikající tkáň. Nejčastější zdroj uhlíku je sacharóza, obvykle pouţívaná v koncentraci 2-3%. V některých případech je moţné sacharózu nahradit glukózou či fruktózou. V kultivačních médiích byly testovány i jiné sacharidy jako laktóza, galaktóza, rafinóza, maltóza a škrob, ale většinou byly méně efektivní neţ sacharóza a glukóza. Alkoholy nemají pro tkáňové kultury takový význam jako cukry. Uspokojujícím zdrojem uhlíku můţe být glycerin. Jiné alkoholy (methanol, ethanol, dulcit) jsou jiţ méně účinné, některé (mannit) jsou neúčinné nebo jsou dokonce toxické (propanol, butanol). Organické kyseliny nejsou ideálním zdrojem uhlíku. Příznivý vliv na růst kultur byl zjištěn u kyseliny jablečné (3, 54). VITAMÍNY Přestoţe většina rostlinných tkáňových kultur sama syntetizuje všechny vitamíny nezbytné k jejímu růstu a vývoji, tvořené mnoţství není dostačující, a proto exogenní zdroje vitamínů hrají v růstu kultury významnou úlohu. Mezi nejčastěji pouţívané vitamíny v ţivných médiích jsou vitamíny skupiny B, tzv. bios faktory, thiamin, pyridoxin, dále kyselina nikotinová a myo-inositol. Myo-inositol je sacharid, který nemusí být pro růst explantátů nezbytný, ale můţe tento růst stimulovat. V kultivačních médiích se někdy pouţívají další vitamíny, i kdyţ jejich přítomnost v médiích není nezbytná, jako biotin, kyselina listová, kyselina askorbová, kyselina pantotenová, riboflavin atd (3, 54). AMINOKYSELINY A DALŠÍ ZDROJE ORGANICKÉHO DUSÍKU Kultivované rostlinné buňky jsou sice schopné syntetizovat všechny nezbytné aminokyseliny, ale přítomnost některých aminokyselin přidaných do ţivného média 23
můţe stimulovat růst explantátů. Aminokyseliny slouţí buňkám jako bezprostřední zdroj dusíku, který je v organické formě vyuţíván rychleji neţ ve formě anorganické a většinou jsou dodávány v případě kultivace buněčných suspenzí a protoplastů. Nejčastěji dodáváme dusík ve formě aminokyselin (např. kasein hydrolyzát), často se také pouţívá L-glutamin, L-asparagin, glycin a adenin. Při dodávání samotných aminokyselin je nutné pamatovat na to, ţe mohou při vyšších koncentracích také inhibovat růst (3). NEDEFINOVANÉ ORGANICKÉ SLOŢKY MÉDIÍ Pouţití těchto nedefinovaných směsí můţe často stimulovat růst explantátové kultury. Nejčastěji se pouţívá protein (kasein) hydrolyzát a kokosové mléko, ale také kvasniční extrakt, sladový extrakt, extrakt z banánů, pomerančové či rajčatové šťávy. Do médií se také někdy dodává aktivní uhlí, které můţe mít jak stimulační, tak inhibiční efekt na růst explantátů. V současné době se však dává přednost definovaným kombinacím látek (3, 54). LÁTKY POUŢÍVANÉ PRO ZPEVNĚNÍ MÉDIA Pro přípravu tuhých médií se nejčastěji pouţívá agar a vyznačuje se řadou výhod. Agarové gely jsou stabilní při teplotách pouţívaných ke kultivaci. Agar nereaguje s ostatními sloţkami média a není rozkládán rostlinnými enzymy. V případě pouţití tekutého média, je moţné explantáty "fixovat" na můstcích z filtračního papíru, polyuretanové pěně, čedičové vatě, perforovaném celofánu aj. (54). RŮSTOVÉ REGULÁTORY Růstové regulátory jsou látky, které se podílejí na regulaci růstových a vývojových procesů u rostlin. Působí v místě svého vzniku nebo i v jiných částech rostliny, do které jsou transportovány (56, 57). Přirozené regulátory růstu lze rozdělit do dvou skupin: rostlinné hormony (fytohormony) a další látky s regulační aktivitou. Pět základních typů endogenních růstových regulátorů je povaţováno za rostlinné hormony. Jsou to auxiny, cytokininy, gibereliny, kyselina abscisová a etylen. Mimo ně existuje v rostlinách mnoţství látek s růstově regulační aktivitou, jsou účinné aţ ve vyšších koncentracích nebo neznáme dostatečně obecnost jejich působení. Řadíme sem zejména brassinosteroidy, polyaminy, kyselina jasmonová, oligosachariny a velkou skupinu fenolických látek (56). 24
O charakteru růstu explantátové kultury nerozhoduje pouze jenom koncentrace jednotlivých hormonů, ale často i jejich vzájemný poměr (3). Mechanizmus účinku hormonů: Fytohormony působí jako regulační signály. Účinku hormonu musí vţdy předcházet vazba na receptor. Hormon se můţe vázat na receptor umístěný na membráně a signál je pak dále do buňky přenášen systémy druhých poslů nebo hormon proniká do buňky, váţe se na rozpustný receptor v cytoplazmě a takto vzniklý komplex proniká do jádra, kde vyvolá změnu v expresi některých genů (56). Fyziologická účinnost fytohormonů: Účinnost fytohormonů závisí na koncentraci jejich aktivních forem a na citlivosti buněk. Koncentrace aktivních forem fytohormonů v buňce je regulována různými způsoby, zejména prostřednictvím jejich syntézy a rozkladu a různými chemickými modifikacemi. Citlivost buněk vůči fytohormonu závisí na počtu molekul receptoru, afinitě receptoru k fytohormonu a na účinnosti přenosu signálu z komplexu hormon-receptor k cílovému místu (57).
1. Auxiny Hlavním auxinem a prvním známým, dlouhou dobu jediným známým fytohormonem je kyselina indolyl-3-octová (IAA). Další přirozené auxiny jsou strukturně podobné látky. Patří sem kyselina indolyl-3-máselná (IBA), kyselina 4-chlorindolyl-3-octová (4-Cl-IAA) a kyselina fenyloctová (PAA) (1). Při hledání látek s růstově regulační aktivitou byla nalezena řada syntetických látek s účinky podobnými IAA. Tyto látky nazýváme syntetické auxiny. Jejich společným znakem je aromatický kruhový systém (s výjimkou alkylthiokarbamátů), v jehoţ postranním řetězci je umístěna karboxylová skupina (nebo skupina na karboxylovou snadno převeditelná). Pro přehlednost lze syntetické auxiny rozdělit do čtyř skupin: a) naftalenové kyseliny: nejdůleţitější je α-naftyloctová kyselina (NAA), b) chlorfenoxykyseliny: kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová (2,4-D), 2,4,5-trichlorfenoxyoctová (2,4,5-T) a 2-methyl-4-chlorfenoxyoctová (MCPA), c) benzoové kyseliny (2,3,6- a 2,4,5-trichlorbenzoová, dicamba) a 25
d) deriváty kyseliny pikolinové: picloram (56). K auxinům pouţívaným při kultivaci rostlin patří především kyselina indolyloctová (IAA), kyselina indolylmáselná (IBA), kyselina dichlorfenoxyoctová (2,4-D) a kyselina naftylooctová (NAA). Různé druhy auxinů mají různou fyziologickou aktivitu, pohybují se různou rychlostí pletivy, jsou vázány na jiné receptorové buňky a jsou metabolizovány rozlišnými způsoby. Auxiny jsou v kultivačním médiu pouţívány především za účelem stimulace růstu kalusu a buněk, v některých případech k indukci tvorby prýtů a zejména kořenů, k indukci somatické embryogeneze a stimulaci růstu apikálních meristémů (3).
2. Cytokininy K objevu cytokininů vedl rozvoj pěstování kultur rostlinných explantátů. Jak napovídá jejich název, podněcují buněčné dělení (58). Nejbohatším zdrojem cytokininů je autoklávovaná DNA, ze které byl jako účinná látka izolován a identifikován 6-furfurylaminopurin (6-furfuryladenin, kinetin). První přirozený (endogenní) cytokinin byl nalezen v nezralém endospermu kukuřice a byl nazván zeatin. V současné době známe více neţ 30 přirozených cytokininů. Strukturně všechny vycházejí z adeninu substituovaného na aminoskupině v poloze 6. Substituenty mohou být: a) isopentenyl nebo hydroxyisopentenyl (u zeatinu) b) benzyl, nesoucí v poloze 2 nebo 3 hydroxylovou skupinu; podle výskytu v topolu byly nazvány topoliny. Jsou to aromatické cytokininy (57). Nejvyšší aktivitu mají látky, které jako substituent v poloze N-6 mají izoprenoidní řetězec s dvojnou vazbou (56). V kulturách in vitro jsou nejčastěji pouţívány 6-benzyladenin (BA) neboli 6-benzylaminopurin (BAP), 6-dimethylaminopurin (2ip či IPA), furfurylaminopurin (kinetin) a zeatin. Zeatin a 2ip jsou povaţovány za nativní cytokininy, zatímco kinetin a BAP představují syntetické cytokininy. Cytokininy se pouţívají v kultivačních médiích za účelem stimulace buněčného dělení, k indukci tvorby prýtů a inhibici tvorby kořenů. Morfogenetická reakce v explantátové kultuře je značně závislá na vzájemném poměru auxinu v kultivačním médiu. Iniciace tvorby kořenů, embryogeneze a iniciace tvorby kalusu je stimulována, je-li poměr auxinu k cytokininu vysoký. Je-li tento poměr nízký, je indukována tvorba 26
adventivních či axilárních prýtů. Koncentrace auxinu a cytokininu je stejně významná jako jejich vzájemný poměr (3).
3. Gibereliny Gibereliny jsou cyklické diterpeny, jejichţ molekula má tzv. gibanovou strukturu. Byly objeveny ve 30. letech v Japonsku jako produkt houby Gibberella fujikuroi, která napadá rýţi, působí její abnormální prodluţování a sniţuje produkci semen a jejich výnos (choroba zvaná bakanae). Dnes známe více neţ 100 giberelinů a označují se zkratkou GA a indexem 1 aţ n (1, 57). Většina explantátů přítomnost giberelinů pro svůj růst v médiu nevyţaduje, ale u některých druhů mohou růst stimulovat. Především se pouţívá kyselina giberelová, značená jako giberelin A3 – GA3 a giberelin GA7. GA3 se přidává většinou do média za účelem stimulace růstu buněčných kultur při nízké hustotě suspenze, ke stimulaci růstu kalusu a ke stimulaci růstu zakrslých rostlin (3). 4. Abscisová kyselina Kyselina abscisová (ABA) je seskviterpen s 15 uhlíkovými atomy a cyklickou částí v molekule. Díky schopnosti navodit dormanci, tak byla původně nazvána dormin. Podobná frakce byla izolována z opadlých mladých plodů bavlníku a nazvána abscisin. Ukázalo se, ţe účinná látka je totoţná a byla nazvána kyselina abscisová (1, 56). Abscisová kyselina se dodává do kultivačních médií za účelem stimulace i inhibice růstu kalusu v závislosti na rostlinném druhu, ke stimulaci proliferace prýtů a k inhibici pozdějších fází embryogeneze (3).
5. Etylen Etylen je nejjednodušší uhlovodík s dvojnou vazbou. Jedná se o plynnou látku s hydrofóbní povahou, která můţe být tvořena prakticky ve všech částech rostliny. Jeho koncentrace v buňce je velmi nízká, daná rozpustností v cytoplazmě. Etylen inhibuje prodluţovací růst a stimuluje růst radiální. Urychluje zrání plodů, stimuluje stárnutí a opad listů, květů, nahrazuje účinek IAA na udrţení apikální dormance. Nejvyšší
27
produkce je v částech meristematických, hladina etylenu se zvyšuje během senescence, opadu listů, zrání plodů, při stresu a po poranění (1, 56). 6. Ostatní růstové regulátory Brassinosteroidy jsou skupinou asi třiceti látek, které se vyskytují především v nadzemní části rostliny. Významně ovlivňují dlouţivý růst a zvyšují odolnost rostliny k působení nízkých teplot a suchu. Jsou aktivní pouze na světle. Jasmonáty představuje kyselina jasmonová a její metylester. Biosyntéza vychází z kyseliny linolenové, hladina jasmonátů stoupá především při stresových reakcích, např. po poranění nebo napadení patogenem. Kyselina jasmonová stimuluje expresi genů, které kódují inhibitory proteáz. Proteázy můţe do buňky vylučovat patogen nebo škůdce. Polyaminy jsou jednoduché organické látky s několika aminoskupinami – putrescin, spermin a spermidin. Jejich biosyntéza vychází z argininu a ornitinu. Polyaminy stimulují dělení buněk, jejich funkce v regulaci buněčného cyklu je však zatím nejasná. Jejich hladina stoupá ve stresových situacích. Oligosachariny jsou oligosacharidy, které vznikají rozkladem buněčné stěny rostliny při napadení patogenem nebo stěny patogenní houby při obranné reakci rostliny. Stimulují obranné reakce a zároveň inhibují dlouţivý růst buňky, coţ lze povaţovat za součást obranné strategie. Systemin je peptid tvořený 18 aminokyselinami, který se uvolňuje do apoplastu při poranění. Je transportován floémem. V buňkách vybavených příslušným receptorem na plazmalemě indukuje biosyntézu kyseliny jasmonové (1, 56). Fyzikální podmínky kultivace Pro optimální růst rostlinných tkáňových kultur a pro optimální produkci sekundárních metabolitů je třeba zajistit vhodné fyzikální faktory jako je teplota, světlo, pH ţivného média, aerace atd. SVĚTLO V závislosti na světle dochází často v intaktních rostlinách i tkáňových kulturách ke změně intenzity biosyntézy a akumulace sekundárních metabolitů, coţ je v mnoha 28
případech spojeno s anatomickou diferenciací. Světlo můţe být také indukčním faktorem některých biosyntetických pochodů např. syntézy flavonoidů v buňkách petrţele, anthokyanů v buňkách mrkve apod. Pozitivní vliv světla byl dále prokázán u kultur produkujících digitoxin, diosgenin. Jsou známé i práce popisující vliv světla o různých vlnových délkách na produkci sekundárních metabolitů. Světlo rovněţ můţe ovlivňovat orgánovou diferenciaci (54).
TEPLOTA Kaţdá metabolická reakce je charakterizována teplotním koeficientem, který uvádí, o kolik se změní rychlost reakce, změníme-li teplotu. Kultivační teplota je jedním z faktorů, který ovlivňuje průběh kultivace tkáňových kultur. Teplota kultivace je většinou zvolena empiricky v těsném rozmezí kolem 25˚C. Její hodnota má vliv na dobu zdvojení počtu buněk a její zvýšení můţe indukovat organogenezi kultur (54). ACIDITA ŢIVNÉHO MÉDIA Na rozdíl od kultivace mikroorganismů nebo ţivočišných tkání není u rostlinných tkáňových kultur bezpodmínečně nutná přesná hodnota pH ţivného média. Přesná hodnota pH bývá ţádoucí pouze ve speciálních případech. Pouţívané roztoky bývají obvykle slabě kyselé. Optimální hodnota pH ţivného média je závislá na typu kultury. Většinou je počáteční hodnota média 5,5 – 6,0. Na tyto hodnoty se v případě potřeby upravují půdy přísadou hydroxidu sodného nebo kyseliny chlorovodíkové (54). Chemické sloţení a fyzikální vlastnosti média musí odpovídat poţadavkům rostliny v různých fázích rozmnoţovacího cyklu. V první etapě (zaloţení kultury) se do média přidávají někdy antioxidanty, které zabraňují aktivaci hydrolytických enzymů a hynutí explantátů. Ve druhé etapě se médium často obohacuje o látky, které stimulují tkáňovou proliferaci. Jedná se především o vyšší koncentraci cytokininů. Ve třetí etapě mnoţení se do média přidávají především auxiny podporující tkáňovou diferenciaci a elongační fázi růstu (3).
Sterilizace Jednou ze základních podmínek úspěšné kultivace explantátových kultur je zajištění sterility po celý průběh kultivace. Proto je nezbytné zabývat se sterilitou 29
rostlinného materiálu pouţívaného jako explantát, sterilitou kultivačních médií a sterilitou prostředí, ve kterém jsou tkáňové kultury realizovány. Při nedodrţení sterility v některém stupni kultivace dojde ke kontaminaci kultur plísněmi či bakteriemi. Ţivná média pouţívaná pro tkáňové kultury rostlin mají totiţ vhodné sloţení pro růst těchto všudypřítomných organismů (3). 3.2.7. Produkce sekundárních metabolitů Rostliny mají schopnost syntetizovat ze ţivin kromě nepostradatelných sloţek svého těla (aminokyselin, vitamínů, nukleových bází atd.) i další rozmanité látky, jeţ jsou pravděpodobně pro vlastní růst rostliny postradatelné. Označují se jako sekundární metabolity a jsou specifické pro určitý biologický druh. Jejich molekuly jsou z chemického hlediska velice rozmanité a dle chemické příbuznosti je lze uspořádat asi do padesáti skupin. Velmi dobře známá a komerčně vyuţívaná je produkce sekundárních metabolitů u mikroorganismů (např. produkce antibiotik). Intaktní rostliny produkují ve srovnání s mikroorganismy mnohem širší škálu sekundárních metabolitů, z nichţ mnohé mají význam ve farmacii, potravinářství, kosmetickém průmyslu atd. Sekundární metabolity se většinou získávaly z intaktních rostlin, ale s přibývajícími obtíţnostmi při pěstování, sušení a skladování roste jejich cena. Chemické syntézy těchto látek jsou téţ obtíţné, finančně náročné a mnohdy neuskutečnitelné. Tkáňové kultury rostlin se mohou v průmyslové produkci sekundárních metabolitů uplatnit na několika úrovních. Především je moţné vyuţít tkáňových kultur k vlastnímu mnoţení rostlin významných z hlediska produkce sekundárních metabolitů. Tkáňové kultury mají oproti tradičním způsobům získávání sekundárních metabolitů podstatné výhody: a) syntéza probíhá řízeně v umělém prostředí nezávisle na klimatu a půdních podmínkách b) produkčním
systémem
jsou
vyloučeny
negativní
biologické
vlivy
(mikroorganismy, hmyz) v přírodě c) v tkáňové kultuře je moţné selektovat kultivary s vyšší produkcí sekundárních metabolitů d) automatizací řízení buněčného růstu a regulací metabolických procesů můţe klesat výrobní cena a stoupat produkce (3). 30
3.2.8 Vyuţití explantátových kultur Kultury rostlinných buněk sice hrají zásadní roli v základním výzkumu, ale k významnému vyuţití dochází i v zemědělství a průmyslu. V zemědělství
slouţí
k mnoţení,
šlechtění
a
ozdravování
rostlin.
K nejdůleţitějším aplikacím patří: a) Vegetativní mnoţení umoţňující rychlé získání tisíců shodných rostlinných jedinců. b) Meristémové kultury, které umoţňují získání ozdravených bezvirových rostlin. c) Pylové kultury umoţňující získávání haploidních rostlin a od nich odvozených čistých linií pro šlechtitelské účely (rýţe, tabák, obilí…). d) Fúze protoplastů téhoţ nebo různého druhu umoţňující tvorbu somatických hybridů (buněk nebo celých rostlin) s vlastnostmi epigenetické povahy z jiného druhu (přenos samčí cytoplasmatické sterility, rezistence apod.). e) Tvorba různých regenerovaných rostlin, coţ umoţňuje vyuţití polymorfismu ve šlechtitelském programu a selekce produkčních klonů na úrovni izolované buňky. f) Genové inţenýrství u izolovaných buněk nebo protoplastů pro zavedení nových vlastností do rostliny (pouţítí plazmidu z Agrobacterium tumefaciens jako vektoru k přenosu cizorodé DNA). V průmyslu se biotechnologického pěstování rostlinných buněk vyuţívá jako producentů biomasy pro získání sloučenin primárního a zejména sekundárního metabolismu. Vzhledem k zabírání půdy pro nezemědělské účely, narušování ţivotního prostředí, dochází k drastickému omezování rostlinných zdrojů. Pěstování některých rostlin je pouze sezónní záleţitostí a mnohdy klimatické podmínky vůbec nevyhovují. Ceny surovin stoupají a současně vzrůstají i nároky farmaceutických firem. Moţnost pěstovat rostlinné buňky podobně jako mikroorganismy nabízí základ pro vývoj nových technologií (3, 54).
31
3.3. Elicitace Asi třetina vyráběných léčivých přípravků obsahuje biogenní látky rostlinného původu nebo z nich získané deriváty. Tyto látky můţeme zajistit pěstováním rostlinných kultur in vitro, které ovšem nedosahují tak intenzivní biosyntézy jako intaktní rostliny. Proto jsou hledány nové techniky, kterými by bylo moţné zvýšit produkci sekundárních metabolitů buněčnými kulturami. Experimentálními studiemi bylo zjištěno, ţe produkci těchto sekundárních metabolitů lze ovlivnit například procesem elicitace (55, 59). 3.3.1. Charakteristika elicitace, stresu a stresových faktorů Elicitace je proces, který vyuţívá schopnosti rostlin i rostlinných buněk kultivovaných in vitro reagovat na různé stresové podněty celou řadou obranných reakcí, na jejichţ konci nastává zvýšená akumulace sekundárních látek (59). Nepříznivé vlivy vnějšího prostředí závaţně ohroţující rostlinu označujeme jako stresové faktory (stresory). Termín stres je obvykle pouţíván pro souhrnné označení stavu, ve kterém se rostlina nachází pod vlivem stresorů. Můţe, ale nemusí znamenat ohroţení ţivota rostliny. Problematika stresu je u rostlin komplikovanější neţ u ţivočichů – důvodem je přisedlost ţivota (neumoţňuje únik) a velká mezidruhová variabilita a heterogenita vnitřního prostředí (buněk, pletiv) (56, 57). Stresové faktory, ať uţ fyzikálně-chemické (abiotické) či biotické, mohou pronikat do vnitřního prostředí rostlin nestejně snadno, a to především v důsledku různě vyvinutých ochranných struktur. Tento způsob ochrany (stress avoidance) má hlavně pasivní a dlouhodobý charakter (např. tlustá kutikula na listech, výrazná impregnace buněčných stěn, rezervoáry vody a snadno rozloţitelných organických látek tlumící jejich nedostatek). Mechanismy aktivní odolnosti (stress tolerance) omezují negativní dopad stresorů aţ po jejich proniknutí k plazmatické membráně buněk a do symplastu. Poté dochází ke spuštění řetězce změn, který bývá označován jako stresová reakce. Průběh stresové reakce: poplachová fáze – bezprostředně po začátku působení stresového faktoru, dochází k narušení buněčných struktur a funkcí,
32
restituční fáze – kdyţ intenzita působení stresoru nepřekračuje letální úroveň, dochází záhy k mobilizaci kompenzačních mechanizmů, fáze rezistence – kompenzační mechanizmy směřují ke zvýšení odolnosti rostliny vůči působícím faktorům, ale ne vţdy má toto zvýšení trvalý charakter, fáze vyčerpání – při dlouhodobém a intenzivním působení stresového faktoru můţe být zvýšení odolnosti vystřídáno poklesem. Obr. 3. Idealizovaný průběh stresové reakce (56)
Průběh stresové reakce a její konečný výsledek závisí jak na intenzitě a délce působení stresového faktoru na danou rostlinu, tak i na geneticky vázaných předpokladech odpovědi, souhrnně označovaných jako adaptační schopnosti. Přechodné zvýšení odolnosti získané pod vlivem stresoru se nazývá aklimatizace (56).
3.3.2. Elicitory Elicitor je specifický metabolit, který je podnětem ke spuštění obranných reakcí v postiţené buňce. Většina obranných reakcí rostliny je závislá na aktivaci vhodných genů, avšak elicitory obvykle neovlivňují genovou aktivitu přímo, ale zprostředkovaně pomocí přenašečů signálu (druhých poslů tzv. second messengers) (56). Předpokladem úspěšné elicitace je pouţití vhodného elicitoru, jeho koncentrace a stanovení optimální doby jeho působení. Aplikované elicitory jsou charakteru 33
biotického (ţivé organismy včetně člověka) či abiotického (fyzikálního a chemického). Většinou vyuţití abiotických elicitorů je výhodnější pro jejich snadnější dostupnost a často i niţší cenu (60, 61). Buněčné struktury jsou v mnohých případech citlivé na elicitor během růstové fáze, částečně ve fázi sníţeného růstu. V některých případech působení elicitorů vedlo k dočasnému nebo trvalému růstu kultury a tento tlak podnítil zvýšení akumulace produktů. Poznatky o procesu elicitace, který podmiňuje tvorbu a akumulaci sekundárních přírodních látek v rostlinných buněčných kulturách, lze shrnout následovně: -
tvorba sekundárních přírodních látek po působení elicitoru se vyskytuje především v buňkách, které se nacházejí na konci růstové fáze;
-
nastává v průběhu několika hodin po působení elicitoru (12-48 hodin);
-
probíhá v buňkách suspendovaných v růstovém médiu i v kalusu;
-
sekundární přírodní látky se nacházejí v buňkách i v médiu;
-
elicitaci můţeme opakovat, aniţ nastává poškození buňky (62). Přehled nejdůleţitějších stresových faktorů, se kterými se rostliny setkávají
v přírodě: ABIOTICKÉ FAKTORY – fyzikální: -
mechanické účinky větru
-
nadměrné záření (UV, viditelné)
-
extrémní teploty (horko, chlad, mráz)
ABIOTICKÉ FAKTORY – chemické: -
nedostatek vody (sucho)
-
nedostatek kyslíku (hypoxie, anoxie)
-
nedostatek ţivin v půdě
-
nadbytek iontů solí a vodíku v půdě
-
toxické kovy a organické látky v půdě
-
toxické plyny ve vzduchu
BIOTICKÉ FAKTORY -
herbivorní ţivočichové (spásání, poranění)
-
patogenní mikroorganismy (viry, mikrobi, houby)
34
jako elicitory mohou slouţit jednak některé metabolity vylučované patogeny (exogenní elicitory, např. některé polysacharidy, specifické enzymy a peptidy), jednak sloučeniny, které se uvolňují z narušovaných buněčných stěn obou organismů (endogenní elicitory, např. oligomery chitinu, oligoglukany a glykoproteiny uvolňované hydrolýzou buněčné stěny patogenních hub či oligogalakturonany uvolňované z buněčné stěny napadené buňky). -
vzájemné ovlivňování (alelopatie, parazitizmus) (56)
3.3.3. Mechanismus stresové reakce I přes velkou různorodost aklimatizačních biochemických změn v buňkách existují i metabolické změny v buňkách při působení i velmi odlišných stresorů mající řadu společných znaků. K nejčastějším společným změnám, které vedou ke zvýšení odolnosti vůči několika stresovým faktorům současně, patří: -
tvorba stresových proteinů,
-
tvorba a odstraňování aktivních forem kyslíku,
-
tvorba „stresových“ fytohormonů (kyseliny abscisové, etylenu, kyseliny jasmonové, methyljasmonátu a polyaminů),
-
tvorba osmoregulačních sloučenin (cukrů, polyalkoholů a jednoduchých dusíkatých látek).
Stresové proteiny Vlivem stresových faktorů dochází ke změnám zastoupení proteinů v buňkách. Tvorba některých prudce stoupá, u jiných se naopak zastavuje. Syntetizují se také proteiny, které se za normálních podmínek v buňkách nedají zjistit a některé jsou specifické pouze pro určitý stresový faktor. Nově tvořené stresové proteiny mají velmi rozmanitou velikost i funkci. Většina proteinů indukovaných různými typy stresorů, patří do některé z těchto skupin: molekulární chaperony, proteázy, ubikvitin. Chaperony slouţí k úpravě konformace proteinů při transportech přes membrány i při jejich mírném poškození. Při nenapravitelné změně je protein „označen“ malou molekulou ubikvitinu a rozloţen pomocí proteáz na aminokyseliny (56). K nejdůleţitějším skupinám stresových proteinů patří: proteiny indukované zvýšenou teplotou, chladem, dehydratací, sníţenou koncentrací kyslíku, patogeny. 35
Aktivní formy kyslíku Jako aktivní formy kyslíku označujeme molekulární kyslík, singletový kyslík, superoxidový anion O2- či silně oxidační sloučeniny hydroxylový radikál ˙OH, peroxid vodíku H2O2. Vznikají jako nebezpečné produkty při působení řady stresových faktorů a rostliny musí mít účinné systémy na jejich deaktivaci nebo mohou mít kladnou úlohu jako signály či ochranné látky při některých typech stresů. Protistresová
úloha
aktivních
forem
kyslíku
má
zcela
zásadní
roli
v hypersenzitivní reakci při napadení patogenem. Tvorba superoxidu a dalších aktivních forem kyslíku vyvolaná elicitory je velmi častým a rychlým způsobem přenosu signálu a aktivace genové exprese. Kromě přímého účinku peroxidu vodíku na expresi genů existuje ještě nepřímá cesta, při které nejprve peroxidací lipidů v membránách vzniká kyselina jasmonová a methyljasmonát a ty pak teprve ovlivňují transkripci. Peroxid vodíku je zapojen i do dalších obranných reakcí rostliny při napadení patogeny. V součinnosti s kyselinou salicylovou (která je schopná inaktivovat katalázu, a tím dočasně zvýšit koncentraci peroxidu vodíku) indukuje tvorbu některých stresových proteinů. Peroxid vodíku téţ slouţí jako přenašeč signálu pro expresi některých genů. Regulovaná tvorba aktivních forem kyslíku můţe mít i antimikrobiální účinek a můţe také významně přispívat ke zpevnění buněčné stěny, a tím i k větší odolnosti vůči různým stresovým faktorům. Nejuniverzálnější ochranu před poškozením aktivními formami kyslíku ve všech částech buňky poskytují některé specializované enzymy a enzymatické systémy. K těm patří především superoxiddismutáza (SOD), která katalyzuje přeměnu superoxidu na peroxid vodíku. Peroxid vodíku je dále rozkládán buď katalázou (především v peroxizomech a glyoxyzomech) nebo askorbátperoxidázou (AP) (v chloroplastech, někdy i v cytozolu). K reakci katalyzované AP je nutný askorbát a k regeneraci vznikajícího
dehydroaskobátu
také
glutation
společně
s enzymy
dehydroaskorbátreduktázou a glutationreduktázou (56). 3.3.4 Podmínky úspěšné elicitace Úspěšná elicitace je podmíněna celou řadou faktorů, které jsou specifické pro kaţdý elicitor a pro kaţdou tkáňovou kulturu. Předpokladem úspěšné elicitace je pouţití vhodného elicitoru, jeho koncentrace a stanovení optimální doby působení. Elicitor 36
přidaný k buněčné kultuře má za následek tvorbu sekundárních látek. Citlivost kultury k působení elicitoru ovlivňuje druh explantátu, stáří kultury, fyziologický stav kultury a médium. Interakci elicitoru s buněčnou kulturou lze popsat pěti fázemi: 1. aplikace elicitoru, 2. rozpoznání elicitoru buňkami, 3. genová aktivace a syntéza enzymů, 4. kultura vytváří větší mnoţství fytoalexinů (specifické nízkomolekulárni obranné látky, jsou to produkty sekundárního metabolismu) a jiných stresových metabolitů, 5. dochází buď k akumulaci stresových metabolitů v buňkách kultury, nebo k sekreci metabolitů z kultury do média (63, 64).
37
3.4. Působení ceritých iontů in vitro 3.4.1. Lanthanoidy Takto se nazývá skupina 14 prvků následujících v periodické tabulce chemických prvků za lanthanem, které doplňují jeho elektronovou konfiguraci a postupně zaplňují elektrony sféru (n-2)f, tj. 4f. Jsou to
58Ce
aţ
71Lu.
Veškeré
lanthanoidy vykazují velmi podobné chemické chování a patří mezi kovy. Spolu s lanthanem, skandiem a yttriem tvoří skupinu prvků vzácných zemin. Prvky 62Sm
58Ce
aţ
se nazývají cerité zeminy, ostatní, které svými vlastnostmi navazují na yttrium,
pak yttrité zeminy. Chemické chování i základní fyzikální vlastnosti všech prvků skupiny lanthanoidů jsou velmi podobné. Všechny patří mezi kovy, mají stříbrolesklou barvu a jsou velmi měkké. Jejich reaktivita postupně klesá se stoupajícím atomovým číslem. Například lanthan a cer poměrně rychle reagují se vzdušným kyslíkem. Prvky za europiem jsou na vzduchu relativně stálé. S vodou reagují za vzniku plynného vodíku, snadno se rozpouští v běţných minerálních kyselinách. Za zvýšené teploty také přímo reagují s běţnými nekovovými prvky jako dusíkem, borem, křemíkem, fosforem, sírou a halogeny. Ve sloučeninách se vyskytují především v mocenství Me3+. Výjimkou jsou cer, který tvoří velmi stabilní sloučeniny i v mocenství Ce4+ a europium, jehoţ sloučeniny v mocenství Eu2+ jsou zcela stálé. Chemické vlastnosti solí lanthanoidů jsou značně podobné sloučeninám hliníku. Všechny tvoří například vysoce stabilní oxidy, které nereagují s vodou a jen velmi obtíţně se redukují. V přírodě se lanthanoidy vyskytují pouze ve formě sloučenin. Mezi nejznámější minerály na bázi fosforečnanů patří monazity (Ce, La, Th, Nd, Y)PO4, jinou hojně zastoupenou skupinu tvoří bastnäzity (Ce, La, Y)CO3F - směsné flourouhličitany prvků vzácných zemin a dále například minerály euxenit (Y,Ca,Ce,U,Th)(Nb,Ta,Ti)2O6 nebo samarskit ((Y,Ce,U,Fe)3(Nb,Ta,Ti)5O16) (65). 3.4.2. Cer Cer, chemická značka Ce, (lat. Cerium) je vnitřně přechodný kovový prvek, druhý člen skupiny lanthanoidů. Vzhledově připomíná ţelezo, je šedavě bílý, značně měkký a snadno tvárný. Chemicky je cer značně reaktivním prvkem. Za mírně zvýšené teploty (kolem 80 °C) reaguje se vzdušným kyslíkem (hoří) za vzniku velmi stabilního 38
oxidu ceričitého CeO2. S vodou reaguje cer za vzniku plynného vodíku, snadno se rozpouští v běţných minerálních kyselinách. Ve sloučeninách se vyskytuje v mocenství Ce3+ a jako jediný z lanthanoidů tvoří i stabilní sloučeniny s valencí Ce4+. Soli Ce3+ jsou obvykle bílé, sloučeniny čtyřmocného ceru mají barvu ţlutou aţ oranţovou. 3.4.3. Elicitace ceritými ionty a ionty jiných kovů Cerité ionty patří do skupiny abiotických stresových faktorů. Mechanismus účinku abiotických elicitorů lze vysvětlit buď stresově podmíněným uvolněním endogenních elicitorů z narušené buněčné stěny, nebo vyvoláním obranných stresových reakcí explantátových buněk, které probíhají shodnými mechanismy jako u intaktních rostlin. Konktétně těţké kovy spouštějí peroxidaci lipidů membrány, coţ jednak vede k prudkému nárůstu koncentrace stresových fytohormonů, jednak dochází ke zvýšení propustnosti plazmatické membrány pro vápenaté ionty, které mají rovněţ důleţitou signální funkci (84). Velmi častým a rychlým způsobem přenosu signálu, který probíhá na membránách, a aktivace genové exprese je také tvorba superoxidu a dalších forem kyslíku. Prudké zvýšení hladiny peroxidu vodíku bylo zjištěno například po aplikaci kademnatých iontů u suspenzní kultury Nicotiana tabacum L. (85). Další významnou reakcí rostlin na stres způsobený těţkými kovy je tvorba malých polypeptidů strukturně podobných glutathionu, které se nazývají fytochelatiny. Jejich mechanismus účinku spočívá v inaktivaci toxických iontů uzavřením do chelátu (86). Vytvořené komplexy hrají při detoxikaci jen přechodnou roli, po 7 aţ 14 dnech od expozice je jejich mnoţství jiţ nedetegovatelné (87). Mají zřejmě jen transportní funkci – slouţí k přenosu a následnému uvolnění navázaných iontů do vakuoly, kde dochází k omezení toxických účinků iontů díky chelatační schopnosti přítomných vícemocných organických kyselin (56). Kvantitativní analýza fytochelatinů a jejich komplexů s kadmiem byla provedena například v explantátové kultuře Datura innoxia (88). Kašparová M. a Siatka T. ve své studii (66) sledovali vliv chloridu kademnatého a chloridu hlinitého v koncentracích 1; 10 a 100 μM na produkci anthracenových derivátů kulturou Rheum palmatum L. (Polygonaceae), která byla kultivována na médiu podle Murashigeho a Skooga s přídavkem 10 mg.l-1 kyseliny α-naftyloctové. Doba aplikace elicitoru byla 6, 24, 48 a 168 hodin. Z výsledků vyplývá, ţe pouţitá abiotická elicitace pozitivně ovlivnila produkci zejména v suspenzní kultuře. Maximální zvýšení 39
obsahu anthracenových derivátů oproti kontrole o 66 % nastalo po 48hodinovém působení 10 μM koncentrace chloridu kademnatého. Chlorid hlinitý způsobil největší zvýšení produkce po 6hodinové aplikaci 100 μM koncentrace, kdy došlo v porovnání s kontrolní kulturou ke stimulaci produkce o 60%. V práci Kašparové M. a kol. (67) byl sledován vliv čtyř koncentrací vápenatých iontů na produkci anthracenových derivátů kalusovou a suspenzní kulturou Rheum palmatum L. (Polygonaceae), která byla elicitována abiotickým elicitorem – 20 μM vodným roztokem chloridu olovnatého. Kultura byla kultivována na médiu podle Murashigeho a Skooga s přídavkem 10 mg.l-1 kyseliny α-naftyloctové. Maximální obsah anthracenových derivátů byl prokázán v suspenzní kultuře po 24hodinové aplikaci elicitoru a 10 mM roztoku chloridu vápenatého. V porovnání s kontrolní kulturou došlo ke stimulaci produkce o 44% a oproti elicitované kultuře o 17%. Po přidání vápenatých iontů k elicitované kalusové kultuře k pozitivnímu ovlivnění produkce nedošlo. Ashtiani a kol. (89) studovali vliv Ag+ na produkci silymarinu v suspenzní kultuře Silybum marianum L. Gaertn. Nejprve byla zahájena tvorba kalusu z části děloh semenáčků. Následně byl kalus inkubován na MS médiu obohaceném pikloramem (3 mg.l-1) a kinetinem (0,4 mg.l-1). Suspenze byla vytvořena z měsíc staré nediferencované kalusové kultury. Suspenzní kultura byla uchovávána v tekutém médiu MS, v temnu a byla inkubována na rotační třepačče (150 rpm) při 25˚C. Suspenzní kultury Silybum marianum byly vystaveny působení Ag+ v různých koncetracích (0,2, 0,4, 0,8, 1 a 2 mM). Vzorky byly odebírány v intervalu 12, 24, 48, 72, 144 a 216 hodin po působení elicitoru. Nejvyšší produkce silymarinu 60 μg.g-1 sušiny byla zaznamenána po 24 hodinách působení Ag+ (0,8 mM), která byla třicetinásobně vyšší při porovnání s kontrolou. Ve studii Wang a kol. (68) sledovali vliv lanthanu a ceru na rostliny druhu Hydrilla verticillata. Desetidenní působení lanthanu a ceru na rostliny druhu Hydrilla verticillata vyvolalo oxidační stres. Koncentrace niţší 10 μM nezpůsobily škodlivé následky. Rostliny, na něţ bylo působeno vyššími koncentracemi, ukázaly vyšší obsah H2O2 a niţší obsah chlorofylu a rozpustných proteinů ve srovnání s kontrolními rostlinami. Se vzrůstajícími koncentracemi La a Ce vzrůstal i obsah malondialdehydu. Kdyţ se koncentrace La a Ce zvyšovaly, ochranné účinky před poškozením aktivními formami kyslíku, superoxiddismutázy a katalázy se postupně sniţovaly, zatímco aktivita peroxidázy rostla. Obsah prolinu se lehce sníţil při 10 μM La nebo Ce a poté s vyššími
40
koncentracemi rostl. Výsledek naznačuje, ţe La a Ce způsobují oxidační poškození zaznamenané vzrůstem lipidové peroxidace a poklesem chlorofylu a hladiny proteinů. Chanjuan Liang a kol. se ve studii (69) zabývali účinky ceru (Ce3+) na charakteristické vlastnosti fotosyntézy. Účinky byly zkoumány hydroponií (pěstování rostlin v ţivných roztocích) za laboratorních podmínek, kdy semenáčky sojových bobů byly exponovány dvěma intenzitami UV-B záření. UV-B záření inhibovalo fotosyntézu v semenáčcích sojových bobů, vedlo ke sníţení rychlosti čisté fotosyntézy (Pn), účinku Hillovy reakce, saturace fotosyntézy světlem, kvantového výtěţku (AQY) a efektivity karboxylace (CE). Naopak Ce zřejmě podporuje fotosyntézu rostlin zvýšením účinku Hillovy reakce, zrychlením transportu elektronů a fotofosforylace a zvýšením efektivity karboxylace. Při pouţití Ce i UV-B, hodnoty parametrů fotosyntézy byly stále niţší neţ u kontrolních vzorků, ale zřetelně vyšší neţ při aplikaci UV-B. Výsledky ukazují, ţe Ce zmírňuje inhibiční působení UV-B záření na fotosyntézu v semenáčcích sojových bobů do jisté výše. V další studii Liang Chanjuan a kol. (70) zkoumali účinek ceru (Ce3+) na růst, fotosyntézu a antioxidační enzymový systém v semenáčcích brukve (Brassica juncea L.) vystavených dvěma intenzitám UV-B záření (T1: 0.15 W/m2 a T2: 0.35 W/m2). Studie probíhala za laboratorních podmínek hydroponicky. Po 5-denním účinku UV-B, indexy nadzemního růstu evidentně poklesly o 13,2% - 44,1% (T1) a 21,4% - 49,3% (T2) při srovnání s kontrolou a kromě oblasti aktivní absorpce kořenů, indexy podzemního růstu poklesly o 14,1% - 35,6% (T1) a 20,3% - 42,6% (T2). Po aplikaci Ce + UV-B indexy nadzemního a podzemního růstu poklesly v tomto pořadí o 4,1% - 23,6%, 5,2% - 23,3% (Ce + T1) a 10,8 – 28,4%, 7,0 – 27,8% (Ce + T2), jsou niţší neţ při UV-B. Pokles indexů růstu je důsledkem změn fyziologických procesů. Dvě intenzity záření UV-B vyvolaly pokles v obsahu chlorofylu, rychlosti čisté fotosyntézy, míry transpirace, vodivosti průduchů a schopnosti vyuţít vodu, zatímco se zvýšila permeabilita membrány a aktivita antioxidačních enzymů superoxiddismutázy (SOD), katalázy (CAT) a peroxidázy (POD). Redukce parametrů fotosyntézy při pouţití Ce + UV-B byla sníţena a vzrůst permeability membrány a účinku antioxidačních enzymů kromě POD se sníţil. Tyto výsledky ukazují, ţe regulační vliv Ce na fotosyntézu a antioxidační funkci enzymů je ekofyziologickým základem zmírnění UV-B záření na růst semenáčků. Protektivní účinek Ce na semenáčky vystavené intenzitě záření UV-B T1 je vyšší neţ u T2.
41
Liang Chanjuan a kol. ve své práci (71) studovali účinek ceru (Ce3+) na ochranné
membránové
enzymy
v semenáčcích
brukve
exponovaných
dvěma
intenzitami UV-B záření (UV-B 280 ~ 320 nm). Výsledky ukázaly, ţe obsah chlorofylu poklesl a permeabilita membrány v listech vlivem UV-B záření s intenzitou 0,15 a 0,35 W.m-2 vzrostla. Aktivity SOD, CAT, POD nejprve vzrostly a poté v listech vystavených nízké intenzitě UV-B poklesly. Aktivita POD v listech vystavených vysoké intenzitě UV-B byla zvýšena po celou dobu. Citlivost těchto enzymů klesala v pořadí SOD>CAT>POD. Zhoršení funkce ochranných enzymů zářením UV-B nebylo tak výrazné, jejich schopnost odstranit radikály se zlepšila a permeabilita membrány byla zachována přidáním ceru. Navíc protektivní účinek ceru byl nápadnější u rostlin vystavených nízké intenzitě UV-B záření neţ u těch, které byly vystavené intenzitě vysoké. Všechny výsledky prokázaly, ţe ochranný účinek Ce na rostliny vystavených UV-B záření byl realizován pomocí ochranného systému rostlin. Li J.-J. a kol. ve studii (90) sledovali vliv Ce3+ na fotochemickou reakci v semenáčcích sojových bobů exponovaných UV-B záření (UV-B, 280-320 nm). Výsledky ukázaly, ţe CeCl3 (20 mg.L-1) zlepšil fotosyntézu a rychlost čisté fotosyntézy, aktivitu Mg2+-ATPázy, fotosyntetickou fosforylaci a stimuloval aktivitu Hillovy reakce. Song Yang a kol. ve své práci (72) pozorovali elicitorem vyvolanou apoptózu v buněčné kultuře rostliny Taxus cuspidata. Degradace fosfolipidové membrány je spojená s apoptickou reakcí, ale signalizace rozvoje degradace není dobře známa. Cer (Ce4+), důleţitý prvek vzácných zemin, navozoval buněčnou apoptózu a biosyntézu taxolu v suspenzní kultuře Taxus cuspidata. Hmotnostní spektrometrie a biochemické metody ukázaly, ţe Ce4+ rychle aktivovaly fosfolipázu D (PLD) a hydrolyzovaly strukturní fosfolipidy, aby vytvořily lipidovou signální molekulu, fosfatidovou kyselinu (PA). 1-Butanol, antagonista na PLD závislé produkci PA, zamezil dvoufázovému průniku superoxidových aniontů (O2·-), a tak zmírnil buněčnou apoptózu. Analýza časového průběhu akumulace PA a ERK-like (=extracellular signal-regulated kinase) mitogen-activated protein kinase (MAPK) regulace ukazují, ţe PA regenerace předcházela MAPK aktivaci a naznačuje, ţe rychlá akumulace PA můţe být zapotřebí pro počáteční MAPK aktivitu. Nicméně po dvouhodinové elicitaci Ce4+ kyselina fosfatidová negativně regulovala aktivitu MAPK, která následně vedla k rozvoji apoptické signalizace. Yang S. a kol. ve studii (91) pozorovali vliv Ce4+ na apoptózu v kultuře Taxus cuspidata. Ce4+ o koncentraci 1 mmol.l-1 vyvolaly apoptózu buněk suspenzní kultury 42
Taxus cuspidata; zásadní mechanismus regulace signálu superoxidovými anionty (O2·-) a extracellularly-responsive kinase (ERK)-like MAP (mitogen-activated protein) kinázy je však neznámý. Ya-Wen He, Chiang-Shiong Loh ve své práci (73) studovali účinky ceru a lanthanu na vegetativní růst, zahájení kvetení a reprodukční růst Arabidopsis thaliana. Přidání dusičnanu ceritého (0,5–10 mM) nebo dusičnanu lantanitého (0,5–50 mM) k médiu kultury značně zvýšilo délku primárních kořenů, ale nemělo ţádné významné účinky na počet listů v listové růţici, výšku rostliny a hmotnost sušiny během stádia vegetačního růstu (17 dní po klíčení semen). Procento vysemeněných rostlin významně vzrostlo přidáním 0,5–10 mM dusičnanu ceritého nebo dusičnanu lanthanitého. Kombinace 0,5 mM dusičnanu ceritého a 0,5 mM dusičnanu lanthanitého byla shledána jako nejefektivnější při zahájení kvetení. Výška, hmotnost sušiny a průměrný počet květů byly při 35-denním pěstování v médiu obsahujícím dusičnan ceritý nebo dusičnan lanthanitý (0,5–10,0 mM) jednoznačně vyšší v porovnání s kontrolním médiem. Endogenní hladiny cytokinů (zeatin ribosid, dihydrozeatin ribosid a isopentenyl adenosin) a uhlovodíků (sacharóza, glukóza a fruktóza) v pletivu listů a kořenů rostlin pěstovaných v médiu obohaceném 0,5 mM dusičnanu ceritého a 0,5 mM dusičnanu lanthanitého nebyly jednoznačně odlišné od rostlin v kontrolním médiu. Aplikace 0,5 mM dusičnanu ceritého a 0,5 mM dusičnanu lanthanitého zvýšila účinek 10-6M isopentenyl adenosinu na růst kořenů, výšku rostliny a kvetení. Role ceru a lanthanu v podpoře zahájení kvetení a reprodukčního růstu a moţnost vývoje činidel nehormonálního rozkvětu jsou diskutovány. Song Yang a kol. ve své práci (75) popisují vliv methyljasmonátu a ceria na produkci taxolu. Elicitace methyljasmonátem (MeJa) a ceriem (Ce4+) se podílí na běţných znacích vzrůstu akumulace taxolu v buňkách Taxus cuspidata. Je zajímavé, ţe Ce4+ vyvolává programovanou buněčnou smrt (PCD), ale tento jev není pozorován při elicitaci MeJa. Pouţitím lipidomického přístupu ke kvantitativnímu stanovení více neţ 100 membránových glycerofosfolipidů u buněk Taxus cuspidata, bylo zjištěno, ţe lysofosfatidylcholin (LysoPC), fosfatidová kyselina (PA) a fosfatidylcholin byly tři potencionální lipidové markery, které byly zodpovědné za rozdíly mezi buňkami ovlivněnými Ce4+ a MeJA. Značný vzrůst aktivity fosfolipázy D (PLD) byl pozorován po elicitaci Ce4+ při srovnání s elicitací MeJA. To svědčí o tom, ţe aktivace PLD a vyšší koncentrace produkované PA mohou zprostředkovat programovanou buněčnou smrt. Po elicitaci Ce4+ byl zaznamenán prudký vzrůst aktivity fosfolipázy A2 (PLA2), který 43
způsobil uvolnění mastných kyselin a LysoPC, které zvýšilo nahromadění jasmonové kyseliny (JA). V porovnání s tím při elicitaci MeJA byla aktivita PLA2 indukována slabě. Inhibice PLA2 nepotlačila pouze nahromadění JA, ale také produkci taxolu, coţ ukazuje, ţe aktivace PLA2 zprostředkovala po indukci Ce4+ produkci taxolu částečně signální cestou závislou na JA. Tyto výsledky ukazují, ţe rozdílné střídání glycerolfosfolipidů způsobené fosfolipázami tvoří důleţitý krok v buněčné smrti po reakci na Ce4+ a ve vzrůstající produkci taxolu.
44
4. Experimentální část 4.1. Rostlinný materiál V této práci byla pouţita tkáňová kultura odvozená z kořenové části klíční rostliny Silybum marianum (L.) Gaertn. v 51.-56. pasáţi.
4.2. Chemikálie a pomocné látky Ajatin, Profarma-Produkt, ČR Cerium chlorid p.a., Sigma-Aldrich, USA Destilovaná voda, Katedra analytické chemie, Faf UK HK, ČR Dihydrogenfosforečnan draselný p.a., Lachema, ČR Dusičnan amonný p.a., Penta, ČR Dusičnan draselný p.a., Lach-Ner, ČR Ethanol 96%, Lachema, ČR Ethylester kyseliny octové p.a., Lachema, ČR Glycin, Sigma-Aldrich, USA Hydrolyzát kaseinu, Imuna, Slovensko Chlorid kobaltnatý p.a., (CoCl2.6 H2O), Lachema, ČR Chlorid vápenatý p.a., Penta, ČR Chlorové vápno, Spolana, ČR Jodid draselný p.a., Lachema, ČR Kyselina boritá p.a., Lachema, ČR Kyselina nikotinová, Lachema, ČR Kyselina o-fosforečná, Lachema, ČR Kyselina α-naftyloctová, Sigma-Aldrich, USA Methanol HPLC grade, Merk, Německo Methanol p.a., Penta, ČR Molybdenan sodný, Lachema, ČR Myo-inositol, Fluka, Švýcarsko Propylether p.a., Lachema, ČR Pyridoxin puriss., Koch-Light Laboratories, Velká Británie Sacharosa čistá, Lachema, ČR 45
Síran hořečnatý p.a., Lachema, ČR Síran manganatý p.a., Lachema, ČR Síran měďnatý p.a., Lachema, ČR Síran zinečnatý (ZnSO4.7 H2O), Lachema, ČR Síran ţeleznatý čistý (FeSO4.7 H2O), Lachema, ČR Superčistá voda, Katedra analytické chemie, Faf UK HK, ČR Thiamin, Koch-Light Laboratories, Velká Británie
4.3. Přístroje a vybavení Analytické váhy A 200S, Sartorius, Německo Autokláv PS 20 A, Chirana, ČR Autosampler Jasco AS-2055 Plus, Japonsko Box s laminárním prouděním Fatran LF, Výrobné druţstvo Pokrok, Slovensko Diodový detektor Jasco MD-2015, Japonsko Horkovzdušný sterilizátor Chirana SVS9/1, ČR Kolona LiChrospher RP-18 250-4, sorbent Li Chrospher 5 μm Mikrofiltry (0,45 μm), Tessek, ČR Pipetovací balónek, Filip, Německo Předkolona Li ChroCART 4-4, sorbent Li Chrospher 5 μm Pumpa Jasco PU-2089 Plus, Japonsko Sušárna HS 61A Chirana, ČR Termostat kolony Jetstream 2 Plus, Japonsko Těsnění na vialky, LABICOM s.r.o. Olomouc, ČR Třepačka UNIMAX 2010, Heidolph Instruments, Německo Vialky, LABICOM s.r.o. Olomouc, ČR Vodní lázeň, typ 1042, GFL, Německo
46
4.4. Kultivace tkáňových kultur 4.4.1. Příprava kultivačních nádob a nástrojů Všechny pouţívané skleněné nádoby byly z varného skla zn. SIAL, které je odolné vůči výkyvům teplot a vůči působení chemikálií. Pro kultivaci byly pouţity 100 ml Erlenmayerovy baňky, do kterých byly vpraveny můstky z filtračního papíru a nalito 30 ml ţivného média. Hrdla baněk byla překryta hliníkovou fólií a baňky byly sterilizovány v autoklávu 15 minut při teplotě 121˚C a přetlaku 100 kPa. Hliníkové fólie a baňky byly před manipulací sterilizovány ajatinem. Pasáţování a odvozování kultur byla prováděna v laminárním boxu vymytém roztokem lihu 96% a vyzářeném germicidní zářivkou. Pouţívané pinzety byly před pouţitím očištěny a opláchnuty 96% ethanolem. Poté byly zabaleny do hliníkové fólie a sterilizovány v horkovzdušném sterilizátoru 2 hodiny při teplotě 200˚C. 4.4.2. Sloţení a příprava ţivného média Kultury byly kultivovány in vitro na médiu Murashigeho a Skooga (MS) (54) s obsahem 10 mg/l kyseliny α-naftyloctové (α-NAA) jako růstového regulátoru. Jednotlivé sloţky půdy byly přesně naváţeny na analytických váhách. Velmi malá mnoţství kapalných sloţek půdy byla odměřena ze zásobních roztoků odpipetováním. Všechny součásti byly rozpuštěny v destilované vodě v odměrné baňce na 1000 ml a doplněny vodou aţ po rysku. Ţivné médium s růstovým regulátorem bylo rozplněno do vysterilizovaných baněk, do kaţdé baňky po 30 ml média. Po uzavření hliníkovou fólií byly baňky s médiem sterilizovány v autoklávu 15 minut při 121˚C a přetlaku 100 kPa. Živné médium Murashigeho a Skooga (mg/l)
CaCl2.2 H2O
440,0
KNO3
1900,0
NH4NO3
1650,0
MgSO4.7 H2O
370,0
KH2PO4.H2O
170,0
FeSO4.7 H2O
27,84
Na2EDTA
37,34 47
MnSO4.4 H2O
22,30
ZnSO4.7 H2O
11,50
H3BO3
6,20
KI
0,83
CuSO4.5 H2O
0,025
Na2MoO4.2 H2O
0,25
CoCl2.6 H2O
0,025
Myo-inositol
100,0
Hydrolyzát kaseinu
1000,0
Glycin
2,0
Kyselina nikotinová
0,5
Pyridoxin hydrochlorid
0,5
Thiamin hydrochlorid
0,1
Sacharosa
30,0 g
4.4.3. Odvození kultury K pokusům byla pouţita tkáňová kultura odvozená z kořenové části klíční rostliny Silybum marianum (L.) Gaertn. v 51.-56. pasáţi.
4.4.4. Pasáţování a kultivace V prostředí laminárního boxu bylo do vysterilizovaných Erlenmayerových baněk s ţivným médiem přeneseno inokulum (část kalusu z předchozí kultivace). Baňky s naočkovanými kulturami byly opět uzavřeny hliníkovou fólií a řádně označeny. Kultivace probíhala za normálního světelného reţimu (16 hodin světlo, 8 hod. tma). Kalusová kultura rostla po dobu 3-4 týdnů při 25˚C. Suspenzní kultura byla kultivována po dobu 2-3 týdnů na třepačce (120 otáček/min.) za stejných světelných a teplotních podmínek.
48
4.5. Elicitace 4.5.1. Příprava elicitoru Jako elicitor byl pouţit chlorid ceritý CeCl3, ve třech koncetracích a to: 1,0 mg/100 ml; 10,0 mg/100 ml a 100,0 mg/100 ml. Koncentrace c1 byla připravena naváţením přesné hmotnosti 100,0 mg na analytických vahách, poté bylo vše kvantitativně převedeno do odměrné baňky o objemu 100 ml a doplněno vysterilizovanou destilovanou vodou po rysku. Odpipetováním 10 ml tohoto roztoku do odměrné baňky o objemu 100 ml a doplněním rozpouštědlem po rysku byla získána koncentrace c2. Odpipetováním 1 ml roztoku o c1 do odměrné baňky o objemu 100 ml a doplněním rozpouštědlem po rysku byla připravena koncentrace c3. Koncentrace připravených roztoků ceritých iontů: c1 = 100,0 mg/100 ml (4,0572 · 10-3 mol/l) c2 = 10,0 mg/100 ml (4,0572 · 10-4 mol/l) c3 = 1,0 mg/100 ml (4,0572 · 10-5 mol/l) Příprava elicitoru byla prováděna za aseptických podmínek v boxu s laminárním prouděním, předem vysvíceném germicidní UV lampou. K přípravě byly pouţívány pouze sterilní nástroje a sklo. 4.5.2. Elicitace kalusových kultur Na základě vyhodnocení růstové a produkční křivky kalusové kultury Silybum marianum v předchozích studiích byl zvolen jako optimální termín k aplikaci elicitoru 3.-4. týden po subkultivaci. V návaznosti na tyto studie byl i v této práci jako optimální termín aplikace zvolen 3.-4. týden po subkultivaci. Po 3-4 týdnech od subkultivace byl do kaţdé z baněk napipetován vţdy 1 ml elicitoru. Přidávání elicitoru bylo prováděno za aseptických podmínek pomocí sterilních nástrojů. Kalusy byly z baněk odebírány v šesti časových intervalech od aplikace elicitoru a to po 6, 12, 24, 48, 72 a 168 hodinách. Kalusy byly po uvedené době z baněk vyjmuty 49
a usušeny na filtračním papíru za laboratorní teploty. Získané usušené kalusy byly pomocí třenky s těrkou upráškovány a pouţity k následnému stanovení obsahu flavonolignanů a flavonoidu taxifolinu. Jako kontrola byla zvolena kalusová kultura pěstovaná bez přídavku elicitoru. 4.5.3. Elicitace suspenzních kultur Suspenzní kultury byly získány mechanickým rozmělněním kalusu ve 30 ml ţivného média. Tyto kultury byly kultivovány 2-3 týdny na třepačce při 120 ot/min a tím bylo zabezpečeno promíchávání a provzdušnování ţivné půdy. Po 2-3 týdnech od subkultivace bylo do 30 baněk napipetováno po 1 ml elicitoru a baňky byly následně umístěny zpět na třepačku. Elicitor byl přidáván pomocí sterilních nástrojů za aseptických podmínek. Suspenzní kultura Silybum marianum byla odebírána z baněk v pravidelném intervalu po 6, 12, 24, 48, 72 a 168 hodinách. Vzorky byly přefiltrovány přes filtrační papír a papír se zachycenými buněčnými shluky byl sušen při laboratorní teplotě. Suché buněčné shluky byly pomocí třenky a těrky rozetřeny na prach a byly pouţity k následnému stanovení obsahu flavonolignanů. Jako kontrola byla zvolena kultura po subkultivaci bez přídavku elicitoru. U suspenzní kultury bylo sledováno i vylučování metabolitů do ţivného média. Vzorky média byly odebrány náhodným výběrem u koncentrací c2 a c3. Odebrané médium (10 ml) bylo odpařeno do sucha a získaný podíl byl rozpuštěn v 10 ml methanolu a analyzován. Elicitace kalusových i suspenzních kultur byla provedena všemi třemi koncentracemi elicitoru.
4.6. Stanovení obsahu flavonolignanů Princip stanovení: Ke
stanovení
byla
pouţita
vysokoúčinná
kapalinová
chromatografie
High – Performance Liquid Chromatography (HPLC). Kapalinová chromatografie je separační metoda, při které dochází k oddělení analyzovaných sloţek ze směsi a umoţňuje nám analýzu jak kvalitativní, tak kvantitativní. 50
Tato metoda je zaloţena na rozdílu v distribuci látek mezi dvě nemísitelné fáze, z nichţ mobilní fází je kapalina, která prostupuje stacionární fází naplněnou do kolony. Principem je zejména mechanická adsorpce, rozdělování, výměny iontů, vylučování nebo stereochemická interakce. Citlivost a selektivita chromatografické analýzy závisí na pouţitém detektoru (76, 77). Parametry HPLC analýzy: HPLC analýzy byly prováděny na chromatografické sestavě Jasco (čerpadlo PU2089, detektor MD-2015, autosampler AS-2055), vybavené předkolonovým filtrem a kolonou LiChrospher RP-18 250x4 (5 μm) s ochrannou předkolonkou. Detekce byla prováděna pomocí DAD detektoru v rozmezí vlnových délek 190 – 450 nm. Obsah sledovaných látek byl vypočten z píků při vlnové délce 288 nm. Objem nástřiku byl 20 μl. Eluce mobilní fáze probíhala nejdříve gradientově, z 0% methanolu v čase t = 0 do 50% methanolu v čase t = 5 min. Následovala isokratická eluce 50% methanolem do času t = 25 min. Mobilní fáze obsahovala jako pufr vţdy 0,15% kyseliny fosforečné. Průtok byl 1,4 ml/min. Standardy: Silymarin Validace HPLC analýzy: Validací rozumíme ověření platnosti zvoleného analytického postupu (metody). Cílem validace je určit podmínky, za kterých je zkušební postup pouţitelný, a zajistit stejnou spolehlivost při opakovaném pouţití v jedné nebo i v různých laboratořích. Instrumentální validace je zajištěna výrobcem HPLC sestavy (Jasco), a to normou ISO 9001 (International Organization for Standardization). Test opakovaného nástřiku – tzv. test na přesnost ověřuje způsobilost chromatografických systémů (provedeno vţdy 6 nástřiků týmţ vzorkem, vypočtená relativní směrodatná odchylka byla vţdy menší neţ 1,5%) a test linearity (na základě pěti různých koncentrací standardu se lineární regresní analýzou zjistí hodnota korelačního koeficientu r, která musí být větší neţ 0,9900). Pro hodnocení analytického měření byly dále převzaty metody z Evropského lékopisu: asymetrie píku a počet teoretických pater. Pro hodnocení celé metody byly pouţity tyto validační parametry:
51
Správnost metody – vyjadřuje shodu mezi získaným výsledkem a správnou hodnotou (tedy porovnáním ověřovaných hodnot se standardem, porovnáním s jinou jiţ osvědčenou metodou, nebo srovnáním s referenčním materiálem). Kvantitativní limit – je nejniţší koncentrace látky, stanovená s přijatelnou přesností a správností (limitující relativní směrodatná odchylka menší neţ 15%) (79, 80, 81). Postup stanovení: Sušené vzorky kalusů a suspenzních kultur byly rozetřeny v třecí misce na jemný prášek. Tento prášek byl přesně zváţen na analytických váhách a kvantitativně převeden do varných baněk. Byla provedena dvakrát extrakce 10 ml methanolu po dobu 10 minut na vodní lázni pod zpětným chladičem. Oba extrakty byly přefiltrovány přes vatu, spojeny a doplněny na 20 ml. Pak byla provedena filtrace přes mikrofiltr (0,45 μm) a asi 1,7 ml bylo převedeno do vialek a analyzováno metodou HPLC. Vzorky média byly odpařeny do sucha. Ty byly poté rozpušteny v 10 ml methanolu a po přefiltrování byly převedeny do vialek a analyzovány metodou HPLC.
Kalibrační křivky flavonolignanů: 1. Kalibrační křivka: taxifolin x: koncentrace (mg/g) y: plocha y = bx + a regresní koeficient: 0,9999 a=0 b = 3,26361
52
2. Kalibrační křivka: silychristin x: koncentrace (mg/g) y: plocha y = bx + a regresní koeficient: 0,9999 a=0 b = 3,26964
3. Kalibrační křivka: silydianin x: koncentrace (mg/g) y: plocha y = bx + a regresní koeficient: 0,9999 a=0 b = 3,28186
53
4. Kalibrační křivka: silybin A x: koncentrace (mg/g) y: plocha y = bx + a regresní koeficient: 0,9999 a=0 b = 3,26609
5. Kalibrační křivka: silybin B x: koncentrace (mg/g) y: plocha y = bx + a regresní koeficient: 0,9999 a=0 b = 3,26957
54
6. Kalibrační křivka: isosilybin A x: koncentrace (mg/g) y: plocha y = bx + a regresní koeficient: 0,9999 a=0 b = 3,27665
7. Kalibrační křivka: isosilybin B x: koncentrace (mg/g) y: plocha y = bx + a regresní koeficient: 0,9999 a=0 b = 3,28158
55
4.7. Statistické zpracování výsledků Směrodatná odchylka je veličina, která vyjadřuje, jak se naměřené hodnoty liší od průměrné (střední) hodnoty. Jedná se o kvadratický průměr odchylek hodnot znaku od jejich aritmetického průměru. Funkce směrodatné odchylky je definována vztahem (81):
x n
i 1
i
x
n 1
2
, kde
xi = hodnota i-tého pozorování n = počet pozorování
x = průměrná hodnota všech pozorování σ = směrodatná odchylka, někdy bývá také označována písmenem s
Ke zjištění statistické významnosti vlivu elicitoru na obsah flavonolignanů byl pouţit t-test rozdílů dvou průměrů. Pro testovací kritérium t-testu platí následující vztah:
t – testovací kritérium x1 – aritmetický průměr kontrolního souboru x2 – aritmetický průměr pokusného souboru s1 – směrodatná odchylka kontrolního souboru s2 – směrodatná odchylka pokusného souboru n1 – počet členů kontrolního souboru n2 – počet členů pokusného souboru
56
Testovacímu kritériu přísluší t-rozdělení se stupněm volnosti vypočteném podle vzorce:
v = n1 + n2 – 2
Vypočtená hodnota testovacího kritéria se porovnává s příslušnou kritickou hodnotou t(v)p pro vypočtený stupeň volnosti v a zvolenou hladinu významnosti p. Je-li hodnota t větší neţ hodnota t(v)p, je rozdíl statisticky významný na hladině významnosti p (82). Byla provedena vţdy 3 paralelní stanovení, proto počet členů souboru je n1 = n2 = 3, počet stupňů volnosti v = 4. Pro zvolenou hladinu významnosti p = 0,05 a pro 4 stupně volnosti je tato kritická hodnota testovacího kritéria (t(v)p) rovna 2,78. Výsledky jsou statisticky významné, je-li hodnota testovacího kritéria vyšší neţ kritická hodnota (81, 82). Pro výpočet hodnot testovacího kritéria pro odběry po 6, 12, 24, 48, 72 a 168 hodinách byla pouţita kontrolní hodnota odběru po 0 hodinách působení elicitoru.
57
5. Výsledky Tabulka č. 1 Obsah flavonolignanů (%) v kalusové kultuře Silybum marianum (L.) Gaertn. Elicitor: cerité ionty (Ce3+)
koncentrace Ce3+ (mol/l)
doba odběru (hod)
obsah směrodatná flavonolignanů odchylka (%)
hodnota testovacího kritéria
c1 = 4,0572 · 10-3
0K 6 12 24 48 72 168
0 0,05 0,05 0,05 0,05 0,04 0,04
0 0,00047 0,00047 0,00082 0,00047 0,00047 0,00047
151 149 86,6 151 119 121
c2 = 4,0572 · 10-4
0K 6 12 24 48 72 168
0 0,06 0,05 0,07 0,09 0,10 0,04
0 0,00047 0,00094 0,00094 0,00082 0,00236 0,00082
181 76 106 157,62 61 69,28
c3 = 4,0572 · 10-5
0K 6 12 24 48 72 168
0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
Pozn.: K = kontrola
58
Tabulka č. 2 Obsah flavonolignanů (%) v suspenzní kultuře Silybum marianum (L.) Gaertn. Elicitor: cerité ionty (Ce3+)
koncentrace Ce3+ (mol/l)
doba odběru obsah směrodatná (hod) flavonolignanů odchylka (%)
hodnota testovacího kritéria
c1 = 4,0572 · 10-3
0K 6 12 24 48 72 168
0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
c2 = 4,0572 · 10-4
0K 6 12 24 48 72 168
0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
c3 = 4,0572 · 10-5
0K 6 12 24 48 72 168
0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
Pozn.: K = kontrola
59
Graf č. 1
Porovnání obsahu flavonolignanů v kalusové kultuře Silybum marianum po elicitaci různými koncentracemi CeCl3
obsah flavonolignanů (%)
Obsah flavonolignanů v kalusové kultuře Silybum marianum 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0
c1 c2 c3
6
12
24
48
72
doba odběru (hod)
60
168
Tabulka č. 3 Obsah jednotlivých složek silymarinového komplexu a taxifolinu v kalusové kultuře Silybum marianum po elicitaci různými koncentracemi elicitoru Ce3+
doba koncentrace odběru Ce3+ (mol/l) (hod)
c1 = 4,0572 · 10-3
c2 = 4,0572 · 10-4
c3 = 4,0572 · 10-5
TAX [%]
SILCR SILYD [%]
[%]
SIL
SIL
ISO
A
B
A
[%]
[%]
[%]
ISO
sil.
B [%] komplex
0K
0
0
0
0
0
0
0
0
6
0,02
0,05
0
0
0
0
0
0,05
12
0,03
0,05
0
0
0
0
0
0,05
24
0,02
0,05
0
0
0
0
0
0,05
48
0,02
0,05
0
0
0
0
0
0,05
72
0,02
0,04
0
0
0
0
0
0,04
168
0,02
0,04
0
0
0
0
0
0,04
0K
0
0
0
0
0
0
0
0
6
0,05
0,06
0
0
0
0
0
0,06
12
0,04
0,05
0
0
0
0
0
0,05
24
0,01
0,07
0
0
0
0
0
0,07
48
0
0,09
0
0
0
0
0
0,09
72
0,01
0,10
0
0
0
0
0
0,10
168
0,03
0,04
0
0
0
0
0
0,04
0K
0
0
0
0
0
0
0
0
6
0
0
0
0
0
0
0
0
12
0
0
0
0
0
0
0
0
24
0
0
0
0
0
0
0
0
48
0
0
0
0
0
0
0
0
72
0
0
0
0
0
0
0
0
168
0
0
0
0
0
0
0
0
61
Tabulka č. 4 Obsah jednotlivých složek silymarinového komplexu a taxifolinu v suspenzní kultuře Silybum marianum po elicitaci různými koncentracemi elicitoru Ce3+
doba TAX SILCR SILYD koncentrace odběru Ce3+ (mol/l) [%] [%] [%] (hod)
c1 = 4,0572 · 10-3
c2 = 4,0572 · 10-4
c3 = 4,0572 · 10-5
SIL
SIL
ISO
ISO
A
B
A
B
[%]
[%]
[%]
[%]
sil. komplex
0K
0
0
0
0
0
0
0
0
6
0
0
0
0
0
0
0
0
12
0
0
0
0
0
0
0
0
24
0
0
0
0
0
0
0
0
48
0
0
0
0
0
0
0
0
72
0
0
0
0
0
0
0
0
168
0
0
0
0
0
0
0
0
0K
0
0
0
0
0
0
0
0
6
0
0
0
0
0
0
0
0
12
0
0
0
0
0
0
0
0
24
0
0
0
0
0
0
0
0
48
0
0
0
0
0
0
0
0
72
0
0
0
0
0
0
0
0
168
0
0
0
0
0
0
0
0
0K
0
0
0
0
0
0
0
0
6
0
0
0
0
0
0
0
0
12
0
0
0
0
0
0
0
0
24
0
0
0
0
0
0
0
0
48
0,01
0
0
0
0
0
0
0
72
0
0
0
0
0
0
0
0
168
0
0
0
0
0
0
0
0
62
Graf č. 2 Obsah taxifolinu v kalusové kultuře Silybum marianum po elicitaci různými koncentracemi elicitoru Ce3+
obsah taxifolinu (%)
Obsah taxifolinu v kalusové kultuře Silybum marianum 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0
c1 c2 c3
6
12
24
48
72
168
doba odběru (hod)
Graf č. 3 Obsah taxifolinu v suspenzní kultuře Silybum marianum po elicitaci různými koncentracemi elicitoru Ce3+
obsah taxifolinu (%)
Obsah taxifolinu v suspenzní kultuře Silybum marianum 0,012 0,01 0,008 0,006 0,004 0,002 0
0,01 c1 c2 c3 0 0 0
0 0 0
0 0 0
6
12
24
0 0 48
doba odběru (hod)
63
0 0 0
0 0 0
72
168
Graf č. 4 Porovnání obsahu taxifolinu v kalusové a suspenzní kultuře Silybum marianum po elicitaci různými koncentracemi elicitoru Ce3+
obsah taxifolinu (%)
Obsah taxifolinu v kultuře Silybum marianum in vitro 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0
kalusová kultura c1 kalusová kultura c2 kalusová kultura c3 suspenzní kultura c1
6
12
24
48
72
168
suspenzní kultura c2 suspenzní kultura c3
doba odběru (hod)
Tabulka č. 5 Obsah flavonolignanů a taxifolinu v médiu suspenzní kultury Silybum marianum po přidání elicitoru Ce3+ o koncentraci c2 = 4,0572 · 10-4 mol/l
koncentrace doba TAX SILCR SILYD Ce3+ odběru [%] [%] [%] (mol/l) (hod) 0K 0 0 0
c2 = 4,0572 · 10-4
SIL A [%] 0
SIL ISO ISO sil. B A B komplex [%] [%] [%] 0 0 0 0
6
0
0,05
0,01
0
0
0
0
0,06
12
0
0
0,01
0
0
0
0
0,01
24
0
0
0
0
0
0
0
0
48
0
0
0
0
0
0
0
0
72
0
0
0
0
0
0
0
0
168
0
0
0
0
0
0
0
0
64
Tabulka č. 6 Obsah flavonolignanů a taxifolinu v médiu suspenzní kultury Silybum marianum po přidání elicitoru Ce3+ o koncentraci c3 = 4,0572 · 10-5 mol/l
koncentrace doba TAX SILCR SILYD Ce3+ odběru [%] [%] [%] (mol/l) (hod) 0K 0 0 0
c3 = 4,0572 · 10-4
SIL A [%] 0
SIL ISO ISO sil. B A B komplex [%] [%] [%] 0 0 0 0
6
0
0,07
0,03
0,06
0,08
0
0
0,24
12
0
0
0,01
0,01
0,02
0
0
0,04
24
0
0
0
0
0
0
0
0
48
0
0,01
0,03
0
0,05
0
0
0,09
72
0
0
0
0
0
0
0
0
168
0
0,01
0,01
0
0
0
0
0,02
Graf č. 5 Porovnání obsahu flavonolignanů v médiu suspenzní kultury Silybum marianum po elicitaci různými koncentracemi elicitoru Ce3+
obsah flavonolignanů (%)
Obsah flavonolignanů v médiu suspenzní kultury Silybum marianum 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00
c2 c3
6
12
24
48
doba odběru (hod)
65
72
168
Obr.č. 4
HPLC chromatogram standardu silymarinu
Standard
Retenční čas
1 – taxifolin
9,05
2 – silycristin
10,93
3 – silydianin
11,76
4 – silybin A
16,98
5 – silybin B
18,20
6 – isosilybin A
21,39
7 – isosilybin B
22,48
66
6. Diskuse Vzhledem k tomu, ţe se stále více projevují obtíţe při zajišťování přírodních surovin (vzrůstající ceny, nároky farmaceutického průmyslu, sběr planě rostoucích rostlin i jejich polní pěstování je sezonní záleţitostí), jsou dalším moţným zdrojem surovin
pro
farmaceutický
průmysl
kultury
rostlinných
explantátů.
Buňky
explantátových kultur mohou díky své totipotenci syntetizovat sekundární metabolity, které jsou typické pro mateřskou rostlinu. Jejich produkce oproti intaktním rostlinám však zpravidla bývá niţší, a proto se hledají způsoby, jimiţ by bylo moţné dosáhnout zvýšené akumulace sekundárních metabolitů. Vedle genetické manipulace a přidávání prekurzorů do média je také moţné pouţít metodu elicitace (13, 66). Cílem této diplomové práce bylo sledovat vliv abiotického elicitoru iontů Ce na produkci flavonolignanů kalusovou a suspenzní kulturou Silybum marianum (L.) Gaertn. Úspěšná elicitace je podmíněna celou řadou faktorů, které jsou specifické pro kaţdý elicitor a pro kaţdou tkáňovou kulturu. Jedná se např. o koncentraci a dobu působení elicitoru (63). Z tohoto důvodu byly zkoušeny tři koncentrace vodného roztoku chloridu ceritého: c1 = 100,0 mg/100 ml (4,0572 · 10-3 mol/l) c2 = 10,0 mg/100 ml (4,0572 · 10-4 mol/l) c3 = 1,0 mg/100 ml (4,0572 · 10-5 mol/l) Cerité ionty byly zvoleny jako elicitor díky své prokázané oxidační aktivitě. Ce3+ způsobují oxidační poškození zaznamenané vzrůstem lipidové peroxidace a poklesem chlorofylu a hladiny proteinů a tím se podílí na stresových reakcích rostlin (68). V této práci byla pouţita tkáňová kultura odvozená z kořenové části klíční rostliny Silybum marianum (L.) Gaertn. v 51.-56. pasáţi. Tato kultura byla kultivována na médiu dle Murashigeho a Skooga s přídavkem 10 mg/l kyseliny α-naftyloctové. Vliv elicitoru byl sledován v šesti časových intervalech: 6, 12, 24, 48, 72 a 168 hodin. Pro stanovení obsahu flavonolignanů v kalusové i suspenzní kultuře byla zvolena metoda HPLC.
67
Kalusová kultura V kalusové kultuře Silybum marianum (L.) Gaertn. došlo ke statisticky významnému nárůstu obsahu flavonolignanů po aplikaci roztoku elicitoru v koncentraci c1 = 4,0572 · 10-3 mol/l u všech zvolených časů elicitace. Po 6, 12, 24, a 48 hodinách byl obsah flavonolignanů vyšší neţ při 72 a 168 hodinách elicitace. Při pouţití elicitoru v koncentraci c2 = 4,0572 · 10-4 mol/l byl statisticky významný nárůst obsahu flavonolignanů sledován u všech zvolených časů elicitace. Nejvyšší byl po 72 hodinách a nejniţší po 168 hodinách působení. Po aplikaci roztoku o koncentraci c3 = 4,0572 · 10-5 mol/l k ţádnému statisticky významnému zvýšení obsahu flavonolignanů nedošlo (viz tab. č. 1, graf č. 1). Kontrolní vzorek, tedy kalusová kultura bez přídavku elicitoru, flavonolignany neprodukoval. Působením elicitoru tedy došlo k ovlivnění produkce obsahových látek. Dá se tedy předpokládat, ţe syntéza flavonolignanů je součástí obranných reakcí rostliny na působení vnějších vlivů. Nejvyšší nárůst obsahu flavonolignanů (0,1%) v kalusové kultuře nastal po aplikaci roztoku elicitoru o koncentraci c2 po 72 hodinách. Zde produkce flavonolignanů vzrostla 2,5x oproti hodnotám získaným po aplikaci elicitoru o koncentraci c1 po 72 a 168 hodinách a po aplikaci elicitoru o koncentraci c2 po 168 hodinách, kde obsah látek činil 0,04%. Obsah flavonolignanů 0,05% byl zjištěn u působení elicitoru v koncentraci c1 po 6, 12, 24 a 48 hodinách a u c2 po 12 hodinách působení elicitoru. Působením roztoku elicitoru o koncentraci c2 po dobu 6 hodin dosáhl obsah flavonolignanů 0,06%, po 24 hodinách se zvýšil na 0,07% a po 48 hodinách na 0,09%. Ze sloţek silymarinového komplexu se po aplikaci roztoku elicitoru výrazněji zvýšil pouze obsah silychristinu. Obsah ostatních sloţek silymarinového komplexu nebyl elicitací ovlivněn vůbec. Pouze u kontrolního vzorku byla zaznamenána nepatrná mnoţství silydianinu a silybinu A. Největší nárůst silychristinu (0,1%) nastal po 72 hodinách působení elicitoru o koncentraci c2 (viz tab. č. 3). V kalusové kultuře byl kromě sloţek silymarinového komplexu také detekován flavonoid taxifolin, a to po aplikaci elicitoru v koncentraci c1 po 6, 12, 24, 72 a po 168 hodinách působení roztoku elicitoru o koncentraci c2. Při aplikaci elicitoru v koncentraci c3 byla ve všech sledovaných intervalech zjištěna přítomnost taxifolinu v kalusové kultuře pouze ve stopovém mnoţství. V kontrolním vzorku kalusové kultury 68
nebyl taxifolin detekován vůbec. Nejvyšší nárůst obsahu taxifolinu (0,05%) nastal po 6 hodinách působení elicitoru o koncentraci c2 (viz tab. č. 3, graf č. 2). Suspenzní kultura V suspenzní kultuře Silybum marianum (L.) Gaertn. nedošlo k ţádnému statisticky významnému nárůstu obsahu flavonolignanů po aplikaci roztoků elicitoru (viz tab. č. 2). U všech testovaných koncentrací elicitoru a ve všech sledovaných intervalech byl zaznamenán pouze stopový obsah silychristinu. Další dvě sloţky silymarinového komplexu silydianin a silybin A byly detekovány ve stopovém mnoţství u koncentrace c3 = 4,0572 · 10-5 mol/l a to ve všech sledovaných časových intervalech. Kontrolní vzorek suspenzní kultury bez přídavku elicitoru flavonolignany produkoval pouze ve stopovém, statisticky nevýznamném mnoţství. Byla detekována stopová mnoţství silychristinu, silydianinu a silybinu A. Mimo sloţky silymarinového komplexu bylo zjištěno i stopové mnoţství taxifolinu (viz tab. č.4). Produkce taxifolinu ve stopovém mnoţství byla pozorována ve všech sledovaných časových intervalech působení elicitoru v koncentraci c1 a c2 a po 72 a 168 hodinách elicitace koncentrací c3. Nejvyšší nárůst obsahu taxifolinu (0,01%) nastal po 48 hodinách působení elicitoru o koncentraci c3 = 4,0572 · 10-5 mol/l (viz tab. č. 4, graf č. 3). Bylo sledováno vylučování flavonolignanů a flavonoidu taxifolinu do ţivného média a to u suspenzní kultury po aplikaci elicitoru o koncentraci c2 = 4,0572 · 10-4 mol/l a c3 = 4,0572 · 10-5 mol/l. Po aplikaci elicitoru v koncentraci c2 byl zjištěn nejvyšší obsah silychristinu (0,05%) po jeho 6 hodinovém působení a dále obsah silydianinu (0,01%) po 6 a 12 hodinách (viz tab. č. 5). Při působení elicitoru o koncentraci c3 byly nejvyšší hodnoty obsahu jednotlivých sloţek silymarinového komplexu zaznamenány po 6 hodinách. V ţivném médiu bylo detekováno 0,07% silychristinu, 0,03% silydianinu, 0,06% silybinu A a 0,08% silybinu B (viz tab. č. 6). Přítomnost taxifolinu nebyla v médiu zjištěna. Ze získaných výsledků lze konstatovat, ţe ke statisticky významné produkci jak silymarinu, tak i taxifolinu docházelo pouze u kalusové kultury.
69
Důvodů nízké produkce flavonolignanů v kultuře Silybum marianum můţe být několik. Jedním z nich mohlo být stáří kultury. V této studii byly pouţity kalusové a suspenzní kultury v 51.-56. pasáţi. Gallová (92) ve své studii pouţila kalusovou a suspenzní kulturu v 10.-25. pasáţi. Obsah flavonolignanů však prokazatelně klesal a jiţ ve 34. pasáţi byla jejich produkce nulová. Kašparová (63) na základě provedených pokusů zaznamenala určitý vztah mezi stářím elicitovaných kultur a produkcí anthracenových derivátů těmito kulturami, kdy tříletá kultura produkovala více anthracenových derivátů neţ kultura devítiletá. Tím se potvrzuje domněnka, ţe se zvyšujícím se stářím kultury se sniţuje její schopnost tvořit sekundární metabolity jako odpověď na působení elicitorů (93). Dalším důvodem mohl být nevhodně zvolený elicitor. Aby elicitace mohla být úspěšná, je k tomu potřeba pouţít vhodný elicitor, který musí mít správnou koncentraci a musí být stanovena optimální doba jeho působení (5). Wang, X. a kol. (68) sledoval vliv lanthanu a ceru na rostliny druhu Hydrilla verticillata. Desetidenní působení lanthanu a ceru na rostliny druhu Hydrilla verticillata vyvolalo oxidační stres. Koncentrace niţší 10 μM nezpůsobily škodlivé následky. Vyšší koncentrace ukázaly vyšší obsah H2O2 a niţší obsah chlorofylu a rozpustných proteinů ve srovnání s kontrolními rostlinami. Se vzrůstajícími koncentracemi La a Ce vzrůstal i obsah malondialdehydu, coţ je marker lipoperoxidace. Kdyţ se koncentrace La a Ce zvyšovaly, ochranné účinky, před poškozením aktivními formami kyslíku se postupně sniţovaly, zatímco aktivita peroxidázy rostla. Výsledek naznačuje, ţe La a Ce způsobují oxidační poškození zaznamenané vzrůstem lipidové peroxidace a poklesem chlorofylu a hladiny proteinů. Ya-Wen He a kol. ve své práci (73) studovali účinky ceru a lanthanu na vegetativní růst, zahájení kvetení a reprodukční růst Arabidopsis thaliana. Přidání dusičnanu ceritého (0,5–10 mM) nebo dusičnanu lantanitého (0,5–50 mM) k médiu kultury značně zvýšilo délku primárních kořenů. Procento vysemeněných rostlin významně vzrostlo přidáním 0,5–10 mM dusičnanu ceritého nebo dusičnanu lanthanitého. Kombinace 0,5 mM dusičnanu ceritého a 0,5 mM dusičnanu lanthanitého byla shledána jako nejefektivnější při zahájení kvetení. Výška, hmotnost sušiny a průměrný počet květů byly při 35-denním pěstování v médiu obsahujícím dusičnan 70
ceritý nebo dusičnan lanthanitý (0,5–10,0 mM) jednoznačně vyšší v porovnání s kontrolním médiem. Aplikace 0,5 mM dusičnanu ceritého a 0,5 mM dusičnanu lanthanitého zvýšila účinek 10-6M isopentenyl adenosinu na růst kořenů, výšku rostliny a kvetení. Role ceru a lanthanu v podpoře zahájení kvetení a reprodukčního růstu a moţnost vývoje činidel nehormonálního rozkvětu jsou stále diskutovány.
71
7. Závěr Výsledky práce lze shrnout následovně: 1. V kalusové kultuře Silybum marianum po elicitaci ceritými ionty byly detekovány tyto flavonolignany a flavonoidy: silychristin a taxifolin. V suspenzní kultuře Silybum marianum po elicitaci ceritými ionty byl detekován pouze flavonoid taxifolin. 2. Maximální produkce taxifolinu v kalusové kultuře nastala po 6 hodinovém působení elicitoru Ce3+ o koncentraci c2 = 4,0572 · 10-4 mol/l (obsah taxifolinu 0,05%). Maximální produkce silychristinu v kalusové kultuře byla pozorována po 72 hodinovém působení elicitoru Ce3+ opět o koncentraci c2 = 4,0572 · 10-4 mol/l (obsah silychristinu 0,1%). V kontrolách kalusové kultury (tzn. bez elicitace) nebyly detekovány ţádné ze sledovaných látek (silychristin, silydianin, silybin A, silybin B, isosilybin A, isosilybin B, taxifolin). 3. Maximální produkce taxifolinu v suspenzní kultuře nastala po 48 hodinovém působení elicitoru Ce3+ o koncentraci c3 = 4,0572 · 10-5 mol/l (obsah taxifolinu 0,01%) Z flavonolignanů nebyly detekovány ţádné ze sledovaných látek (silychristin, silydianin, silybin A, silybin B, isosilybin A, isosilybin). V kontrolách suspenzní kultury nenastala produkce ţádné ze sledovaných látek (silychristin, silydianin, silybin A, silybin B, isosilybin A, isosilybin B, taxifolin). 4. Maximální produkce silymarinového komplexu v kalusové kultuře byla zjištěna po 72 hodinovém působení elicitoru o koncentraci c2 = 4,0572 · 10-4 mol/l (obsah silymarinového komplexu 0,1%). Jedná se o hodnotu statisticky významnou v porovnání s kontrolou. 5. V suspenzní kultuře jednotlivé sloţky silymarinového komplexu nebyly detekovány vůbec.
72
6. V ţivném médiu byla maximální produkce sloţek silymarinového komplexu detekována po 6 hodinovém působení elicitoru Ce3+
o koncentraci
c3 = 4,0572 · 10-5 mol/l (obsah silymarinového komplexu 0,24%) Maximální produkce silychristinu v ţivném médiu byla zjištěna po 6 hodinovém působení elicitoru Ce3+
o koncentraci c3 = 4,0572 · 10-5 mol/l (obsah
silychristinu 0,07%). Maximální produkce silydianinu v ţivném médiu byla detekována po 6 hodinovém působení elicitoru Ce3+ o koncentraci c3 = 4,0572 · 10-5 mol/l (obsah silydianinu 0,03%). Maximální produkce silybinu A v ţivném médiu byla po 6 hodinovém působení elicitoru Ce3+ o koncentraci c3 = 4,0572 · 10-5 mol/l (obsah silybinu A 0,06%). Maximální produkce silybinu B v ţivném médiu nastala po 6 hodinovém působení elicitoru Ce3+ o koncentraci c3 = 4,0572 · 10-5 mol/l (obsah silybinu B 0,08%).
73
8. Literatura 1. PAVLOVÁ, L.: Fyziologie rostlin. 1. vydání. Praha: Karolinum, 2005. s. 11, 234-248. 2. TŮMOVÁ, L., TŮMA, J.: Ovlivnění produkce sekundárních metabolitů v buněčné kultuře Silybum marianum přídavkem elicitoru paraquat. Chem. listy, 2009, 103, 503-510. 3. KOVÁČ, J.: Explantátové kultury rostlin. 1. vydání. Ústí nad Labem: Pedagogická fakulta UJEP, 1992. s. 1, 7-8, 12-20, 82-82. 4. KAŠPAROVÁ, M., SIATKA, T., DUŠEK, J.: Biotic elicitation of the Trifolium pratense L. suspension culture. Čes. slov. Farm., 2008, 57, 107-110. 5. DUŠEK, J., DUŠKOVÁ, J., TŮMOVÁ, L., SPILKOVÁ, J.: Biotechnologické vyuţití kultur vyšších rostlin in vitro. Čes. slov. Farm., 1996, 45, 204-212. 6. VILDOVÁ, A.: Léčivé, aromatické a kořeninové rostliny [online]. Dostupné z: http://etext.czu.cz/php/skripta/skriptum.php?titul_key=57. [cit. 2010-02-17]. 7. HUBÍK, J., DUŠEK, J., SPILKOVÁ, J., ŠÍCHA, J.: Obecná farmakognosie II. Sekundární látky. 1. vydání. Praha: SPN, 1978. s. 265-266. 8. KARLÍČKOVÁ,
J.:
Zdravcentra.cz
[online].
Dostupné
z:
https://www.zdravcentra.cz/cps/rde/xchg/zc/xsl/77_17445.html. [cit. 2010-02-17]. 9. JAHODÁŘ, L.: Farmakobotanika. 1. vydání. Praha: Karolinum, 2006. s. 170. 10. MINISTERSTVO ZDRAVOTNICTVÍ ČR.: Český lékopis 2009. 1. vydání. Praha: Grada, 2009. s. 3144-3147. 11. OPLETAL, L., ŠIMERDA, B.: Výzkumný ústav živočišné výroby, v.v.i. [online]. Flavanoidy
ve
výţivě
zvířat.
Dostupné
z:
http://www.vuzv.cz/sites/Flavanoidy(2).pdf. [cit. 2010-02-06]. 12. TŮMOVÁ, L., ŘIMÁKOVÁ, J., TŮMA, J., DUŠEK, J.: Silybum marianum in vitro – flavonolignan production. Plant Soil Environ., 2006 (10), 52, 454–458. 13. TŮMOVÁ, L., GALLOVÁ, K., ŘIMÁKOVÁ, J.: Silybum marianum in vitro. Čes. slov. Farm., 2004, 53, 135-140. 14. MORAZZONI, P., BOMBARDELLI, E.: Silybum marianum (Carduus marianus). Fitoterapia, 1995, 66, 3-42. 15. AWANG, D.: Milk thistle. Can. Pharm. J., 1993, 403-404, 422. 74
16. PEPPING, J.: Milk thistle: Silybum marianum. Am. J. Health-Syst. Pharm., 1999, 56, 1195-1197. 17. MILLS, S., BONE, K.: Principles and Practice of Phytotherapy. Edinburgh: Churchill Livingstone, 2000, p. 643. 18. SCHULZ, V., HÄNSEL, R., TYLER, V.: Rational Phytotherapy. A Physicians´ Guide to Herbal Medicine. Berlin: Springer-Verlag, 1998. p. 258-263. 19. LENG-PESCHLOW, E.: Properties and medical use of flavolignans (silymarin) from Silybum marianum. Phytother Res., 1996, 10, 25-26. 20. PASCUAL, C., GONZ, R., ARMESTO, J., MURIEL, P.: Effect of silymarin and silybinin on oxygen radicals. Drug Dev. Res., 1993, 29, s. 73-77. 21. MIRA, L., SILVA, M., MANSO, C. F.: Scavenging of reactive oxygen species by silibinin dihemisuccinate. Biochem. Pharmacol., 1994, 48, 753-759. 22. BINDOLI, A., CAVALLINI, L., SILIPRANDI, N.: Inhibitory action of silymarin of lipid peroxide formation in rat liver mitochondria and microsomes. Biochem. Pharmacol., 1977, 26, 2405-2409. 23. VALENZUELA, A., GUERRA, R., VIDELA, L. A.: Antioxidant properties of the flavonoids silybin and (+)-cyanidanol-3: comparison with butylated hydroxyanisole and butylated hydroxytoluene. Planta Med., 1986, 16, 438-440. 24. VALENZUELA, A., ASPILLAGA, M., VIAL, S., GUERRA, R.: Selectivity of silymarin on the increase of the glutathione content in different tissues of the rat. Planta Med., 1989, 55, 420-422. 25. SKOTTOVÁ, N., KRECMAN, V., SIMÁNEK, V.: Activities of silymarin and its flavonolignans upon low density lipoprotein oxidizability in vitro. Phytother. Res., 1999, 13, 535-537. 26. VALENZUELA, A., GARRIDO, A.: Biochemical basis of the pharmacological action of the flavonoid silymarin and its structural isomer silibinin. Biol. Res., 1994, 27, 105-112. 27. DROZDZIK, M., JUZWIAK, S., MACHOY MOKRZYNSKA, A., WOJCICKI, J., KALDONSKA, M., MYSLIWIEC, Z., JUZYSZYN, Z., SKOWRON, J., ROZEWICKA, L., MSCISZ, A.: Effect of silymarinphospholipid complex on the liver in rabbits maintained on a high-fat diet. Phytother. Res., 1996, 10, 406-409.
75
28. WU, C. G., CHAMULEAU, R. A. F. M., BOSCH, K. S., FREDERIKS, W. M.: Protective effect of silymarin on rat liver injury induced by ischaemia. Virchows Arch. B Cell Pathol. Mol. Pathol., 1993, 64, 259-263. 29. KROPACOVA, K., MISUROVA, E., HAKOVA, H.: Protective and therapeutic effect of silymarin on the developement of latent liver damage. Radiat. Biol. Radioecol., 1998, 38, 411-415. 30. KRECMAN, V., SKOTTOVÁ, N., WALTEROVÁ, D., ULRICHOVÁ, J., SIMÁNEK, V.: Silymarin inhibits the developement of diet-induced hypercholesterolemia in rats. Planta Med., 1998, 64, 138-142. 31. SKOTTOVA, N., KRECMAN, V.: Silymarin a potential hypocholesterolaemic drug. Physiol. Res., 1998, 47, 1-7. 32. CROCENZI, F. A., PELLEGRINO, J. M., SÁNCHEZ POZZI, E. J., MOTTINO, A. D., GARAY, E. A., ROMA, M. G.: Effect of silymarin on biliary bile salt secretion in the rat. Biochem. Pharmacol., 2000, 59, 1015-1022. 33. GAEDEKE, J., FELS, L. M., BOKEMEYER, C., MENGS, U., STOLTE, H., LENTZEN, H.: Cisplatin nephrotoxicity and protection by silibinin. Nephrol. Dial. Transplant., 1996, 11, 55-62. 34. BOKEMEYER, C., FELS, L.M., DUNN, T., VOIGT, W., GAEDEKE, J., SCHMOLL, H. J. , STOLTE, H., LENTZEN, H.: Silibinin protects against cisplatin-induced nephrotoxicity without compromising cisplatin or ifosfamide anti-tumour activity. Br. J. Cancer, 1996, 74, 2036-2041. 35. ZIMA, T., KAMENÍKOVÁ, L., JANEBOVÁ, M., BUCHAR, E., CRKOVSKÁ, J., TESAR, V.: The effect of silibinin on experimental cyclosporine nephrotoxicity. Renal fail., 1998, 20, 471-479. 36. SCAMBIA, G., DE VINCENZO, R., RANELLETTI, P. O., BENEDETTI PANICI, T., FERRANDINA, G., D´AGOSTINO, G., FATTOROSSI, A., BOMBARDELLI, E., MANCUSO, S.: Antiproliferative effects of silybin on gynaecological malignancies: synergism with cisplatin and doxorubicin. Eur. J. Cancer, 1996, 32A, 877-882. 37. ZI, X., MUKHTAR, H., AGARWAL, R.: Novel cancer chemopreventative effects of a flavonoid constituent silymarin: inhibitor of mRNA expression of an endogenous tumour promoter TNFalpha. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, 239, 334-339.
76
38. KATIYAR, S. K., KORMAN, N. J., MUKHTAR, H., AGARWAL, R.: Protective effects of silymarin against photocarcinogenesis in a mouse skin model. J. Natl. Cancer Inst., 1997, 89, 556-566. 39. ZHAO, J., SHARMA, Y., AGARWAL, R.: Significant inhibition by the flavonoid antioxidant silymarin against 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate caused
modulation
of
antioxidant
and
inflammatory
enzymes
and
cyclooxygenase 2 and interleukin-1 alpha expression in SENCAR mouse epidermis: implications in the prevention of stage I tumour promotion. Mol. Carcinogen., 1999, 26, 321-333. 40. LAHIRI-CHATTERJEE, M., KATIYAR, S. K., MOHAN, R. R., AGARWAL, R.: A flavonoid antioxidant, silymarin, affords exceptionally high protection against tumour promotion in the SENCAR mouse skin tumorigenic model. Cancer Res., 1999, 59, 622-632. 41. ZI, X., GRASSO, A. W., KUNG, H. J., AGARWAL, R.: A flavonoid antioxidant, silymarin, inhibits activation of erbB1 signaling and induces cyclindependent kinase inhibitors, G1 arrest and anticarcinogenic effects in human prostate carcinoma DU145 cells. Cancer Res., 1998, 58, 1920-1929. 42. ZI, X., FEYES, D. K., AGARWAL, R.: Anticarcinogenic effect of a flavonoid antioxidant, silymarin, in human breast cancer cells MDA-MB468: induction of G1 arrest through an increase in Cip1/p21 concomitant with a decrease in kinase activity of cyclin-dependent kinases and associated cyclins. Clin. Cancer Res., 1998, 4, 1055-1064. 43. BHATIA, N., ZHAO, J., WOLF, D. M., AGARWAL, R.: Inhibition of human carcinoma cell growth and DNA synthesis by silibinin, an active constituent of milk thistle: comparison with silymarin. Cancer Lett., 1999, 147, 77-84. 44. ZI, X., AGARWAL, R.: Silibinin decreases prostate-specific antigen with cell growth inhibition via G1 arrest, leading to differentiation of prostate carcinoma cells: implications for prostate cancer intervention. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 7490-7495. 45. ZHAO, J., AGARWAL, R.: Tissue distribution of silibinin, the major active constituent of silymarin, in mice and its association with enhancement of phase II enzymes: implications in cancer chemoprevention. Carcinogenesis, 1999, 20, 2101-2108.
77
46. DE LA PUERTA, R., MARTINEZ, E., BRAVO, L., AHUMADA, M. C.: Effect of silymarin on different acute inflammation models and in leukocyte migration. J. Pharm. Pharmacol., 1996, 48, 968-970. 47. ALBENSI, B. C., MATTSON, M. P.: Evidence for the involvement of TNF and NF-κB in hippocampal synaptic plasticity. Synapse, 2000, 35 (2), 151-159. 48. MANNA, S. K., MUKHOPADHYAY, A., VAN, N. T., AGGARWAL, B. B.: Silymarin suppresses TNF-induced activation of NF-kappaB, c-Jun N-terminal kinase and apoptosis. J. Immunol., 1999, 163, 6800-6809. 49. ALARCON DE LA LASTRA, A. C., MARTIN, M. J., MARHUENDA, E.: Gastric antiulcer activity of silymarin, a lipoxygenase inhibitor, on rats. J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 929-931. 50. ALARCON DE LA LASTRA, A. C., MARTIN, M. J., MOTILVA, V., JIMENEZ, M., LA CASA, C., LOPEZ, A.: Gastroprotection induced by silymarin, the hepatoprotective principle of Silybum marianum in ischaemiareperfusion mucosal injury: role of neutrophils. Planta Med., 1995, 61, 116-119. 51. SOTO, C. P., PEREZ, B. L., FAVARI, L. P., REYES, J. L.: Prevention of alloxan-induced diabetes mellitus in the rat by silymarin. Comp. Biochem. Physiol., 1998, 119C, 125-129. 52. VOSTÁLOVÁ, J.: Nové biologické aktivity silymarinu a jeho obsahových sloţek. Chem. listy, 2008, 102, 631-635. 53. AISLP – automatizovaný informační systém léčivých přípravků. Mikro-verze AISLP-ČR 2007.1 pro MS Windows. Dostupné z: http://www.aislp.cz/cs/ [cit. 2010-02-17]. 54. SIKYTA, B.: Biotechnologie pro farmaceuty. 1. vydání. Praha: Univerzita Karlova, 1992. s. 84-97. 55. VODRÁŢKA, Z.: Biotechnologie. 1. vydání. Praha: Academia, 1992. s. 63-74. 56. PROCHÁZKA, S., MACHÁČKOVÁ, I., KREKULE, J., ŠEBÁNEK, J.: Fyziologie rostlin. 1. vydání. Praha: Academia, 1998. s. 240-280, 412-431. 57. LUŠTINEC, J., ŢÁRSKÝ, V.: Úvod do fyziologie vyšších rostlin. 1. vydání. Praha: Karolinum, 2003. s. 191-201. 58. HEJNÁK, V., ZÁMEČNÍKOVÁ, B., ZÁMEČNÍK, J., HNILIČKA, F.: Fyziologie rostlin. 1. vydání. Praha: Česká zemědělská univerzita v Praze, 2005. s. 120-135.
78
59. KAŠPAROVÁ, M., SIATKA, T.: Vliv biotického elicitoru Candida utilis na produkci anthracenových derivátů tkáňovou kulturou Rheum palmatum L. Čes. slov. Farm., 2001, 50 , 41-45. 60. TŮMOVÁ, L., OSTROŢLÍK, P.: Ononis arvensis in vitro – abiotická elicitace. Čes. slov. Farm., 2002, 51, 173-176. 61. BLÁHA, L., HNILIČKA, F., ZIEGLEROVÁ, J.: Rostlina a stres. 1. vydání. Praha: Výzkumný ústav rostlinné výroby, 2003. s. 5-9. 62. DUŠEK, J., DUŠKOVÁ, J., TŮMOVÁ, L., SPILKOVÁ, J.: Biotechnologické vyuţití kultur vyšších rostlin in vitro. Čes. slov. Farm., 1996, 45, 204-212. 63. KAŠPAROVÁ, M., SIATKA, T.: Vliv kyseliny salicylové na produkci anthracenových derivátů v kultuře Rheum palmatum L. in vitro. Čes. slov. Farm., 2002, 51, 177-181. 64. BEIDERBECK, R., REICHLING, J.: Pflanzellkulturen in Forschung und Praxis. Teil V/2, Biologie 5, 1989, s. 453-464. 65. KRÄTSMÁR-ŠMOGROVIČ, J. a kol.: Všeobecná a anorganická chémia: učebnica pre farmaceutické fakulty. 1. vydání. Martin: Osveta, 1994. s. 360-362. 66. KAŠPAROVÁ, M., SIATKA, T.: Abiotická elicitace explantátové kultury Rheum palmatum L. těţkými kovy. Čes. slov. Farm., 2004, 53, 252-255. 67. KAŠPAROVÁ, M., SIATKA, T., DUŠEK, J.: Vliv abiotické elicitace a vápenatých iontů na produkci explantátové kultury Rheum palmatum L. Čes. slov. Farm., 2003, 52, 248-251. 68. WANG, X., SHI, G. X., XU, Q. S., XU, B. J., ZHAO, J.: Lanthanum- and cerium-induced oxidative stress in submerged Hydrilla verticillata plants. Russ. J. Plant Physiol., 2007, 54 (5), 693-697. 69. LIANG, C. J., HUANG, X. H., ZHOU, Q.: Effect of cerium on photosynthetic characteristics of soybean seedling exposed to supplementary ultraviolet-B radiation. J. Environ. Sci., 2006, 18 (6), 1147-1151. 70. LIANG, C. J., HUANG, X. H., TAO, W. Y., ZHOU, Q.: Effects of cerium on growth and physiological mechanism in plants under enhanced ultraviolet-B radiation. J. Environ. Sci., 2006, 18 (1), 125-129. 71. LIANG, C. J., HUANG, X. H., TAO, W. Y., ZHOU, Q.: Effect of rare earths on plants under supplementary ultraviolet-B radiation: II. Effect of cerium on antioxidant defense system in rape seedlings under supplementary ultraviolet-B radiation. J. Rare Earths, 2006, 24 (3), 364-668. 79
72. YANG, S., LU, S. H., YUAN, Y. J.: Cerium elicitor-induced phosphatidic acid triggers apoptotic signaling development in Taxus cuspidata cell suspension cultures. Chem. Phys. Lipids, 2009, 159, 13-20. 73. HE, Y. W., LOH, C. S.: Cerium and lanthanum promote floral initiation and reproductive growth of Arabidopsis thaliana. Plant Sci., 2000, 159, 117-124. 74. WAETZIG, G. H., SOBCZAK, M., GRUNDLER, F. M. W.: Localization of hydrogen peroxide during the defence response of Arabidopsis thaliana against the plant-parasitic nematode Heterodera glycines. Nematology, 1999, 1 (7-8), 681-686. 75. YANG, S., LU, S. H., YUAN, Y. J.: Lipidomic analysis reveals differential defense responses of Taxus cuspidata cell to two elicitors, methyl jasmonate and cerium (Ce4+). Biochim. Biophys. Acta 1781, 2008, 123-134. 76. KLIMEŠ, J. a kol.: Kontrola léčiv I. 1. vydání. Praha: Karolinum, 2006. s. 3340. 77. MINISTERSTVO ZDRAVOTNICTVÍ ČR: Český lékopis 2005. 1. vydání. Praha: Grada, 2005, s. 187-190. 78. KLIMEŠ, J. a kol.. Kontrola léčiv II. 2. vydání. Praha: Karolinum, 2007. s. 7982. 79. KOLEKTIV AUTORŮ: Věstník SÚKL, 1994, 1, 6. 80. KOLEKTIV AUTORŮ: ČSN ISO 3534-1, Statistika – slovník, značky, část 1.: Pravděpodobnost a statistické termíny, ČNI, Praha, 1994. 81. KLEMERA, P., KLEMEROVÁ, V.: Základy aplikované statistiky pro studující farmacie. 3. vydání. Praha: Karolinum, 1999. s. 15-16. 82. REISENAUER, R.: Metody matematické statistiky a jejich aplikace. 2. vydání. Praha: SNTL, 1970. s. 78-81. 83. DEWICK, P. M.: Medicinal natural products: A Biosynthetic Approach. 3. vydání. Chichester: Wiley, 2009, p. 173. 84. BEIDERBECK, R., REICHLING, J.: Biologie, 1999, 3, 188. 85. OLMOS, E., MARTÍNEZ-SOLANO, J. R., PIQUERAS, A., HELLÍN, E.: Early steps in the oxidative burst induced by cadmium in cultured tobacco cells (BY-2 line). Exp. Bot. 2003, 54, 291-301. 86. KNEER, R., ZENK, M.: The formation of Cd-phytochelatin complexes in plant cell cultures. Phytochem., 1997, 44, 69.
80
87. LEOPOLD, I., GŰNTHER, D., SCHMIDT, J., NEUMANN, D.: Phytochelatins and heavy metal tolerance. Phytochem., 1999, 50, 1323-1328. 88. YEN, T. Y., VILLA, J. A., DE WITT, J. G.: Analysis of phytochelatin-cadmium complexes from plant tissue culture using nano-electrospray ionization tandem mass spectrometry and capillary liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom., 1999, 34, 930-941. 89. ASHTIANI, S. R., HASANLOO, T., BIHAMTA, M. R.: Ag+-induced silymarin production in cell suspension culture of Silybum marianum L. Gaertn. Planta Med., 2008, 74, 1168. 90. LI, J. J., LI, J. M., ZHOU, Q.: Effect of Ce (III) on photochemical reaction activity in soybean seedlings under supplementary UV-B radiation stress. Huan Jing Ke Xue, 2007, 28 (6), 1388-91. 91. YANG, S., GE, Z., YUAN, Y.: ERK-like MAP kinase regulated by O2-· during Ce4+-induced apoptosis of cultured Taxus cuspidata cells. J. Chem. Ind. Eng. 2006, 57 (4), 902-907. 92. GALLOVÁ, K.: Rigorózní práce. Univerzita Karlova, Praha 2003. 93. FETT, W. F., ZACHARIUS, R. M.: Bacterially-induced glyceollin production in soybean cell suspension cultures. Plant Sci. Lett. 1982, 24, 303-309.
81
