UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ
ROZDÍLY MEZI CITLIVÝMI A REZISTENTNÍMI KMENY VLASOVKY SLÉZOVÉ (HAEMONCHUS CONTORTUS) Diplomová práce
Vedoucí diplomové práce: Mgr. Hana Bártíková, Ph.D. Hradec Králové 2013
Lenka Bartásková
Na tomto místě bych ráda poděkovala Mgr. Haně Bártíkové, Ph.D. za odborné vedení diplomové práce a cenné připomínky. Dále mé poděkování patří celé katedře biochemických věd Farmaceutické fakulty za vstřícnost a pomoc.
Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu.
2
ABSTRAKT
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Lenka Bartásková Školitel: Mgr. Hana Bártíková, Ph.D. Název diplomové práce: Rozdíly mezi citlivými a rezistentními kmeny vlasovky slézové (Haemonchus contortus) Vlasovka slézová (H. contortus) patří mezi parazity, kteří jsou rozšířeni po celém světě. Cizopasí na drobných přežvýkavcích a jsou hrozbou pro chovy ovcí a koz. Infekci, kterou tito červi způsobují, označujeme termínem hemonchóza. Projevuje se anemií, úbytkem váhy a může končit až smrtí některých kusů. V dnešní době je možné se této nemoci bránit. Využívá se převážně anthelmintik, z této skupiny léčiv se nejvíce podávají benzimidazoly. Častým užíváním však dochází k rozvoji rezistence. Odolnost na benzimidazoly je dána mutací na 200. kodonu pro β-tubulin. Červy H. contortus je možné dělit do kmenů podle jejich citlivosti na anthelmintika. Tato práce porovnává zastoupení alel zodpovědných za rezistenci u citlivých a rezistentních kmenů vlasovky slézové. Nízké procento rezistentní alely je u citlivého kmene ISE, u rezistentních kmenů WR a BR je tato alela zjištěna ve vyšší četnosti. Diplomová práce se dále zabývá účinností anthelmintik na vajíčka. Z testovaných léčiv (thiabendazol, flubendazol a monepantel) vývoji larev z vajíček zabraňuje při koncentraci 0,1 μg.ml-1 pouze thiabendazol, a to jen u citlivého kmene ISE. Rezistentní kmeny jsou vůči léčbě mnohem méně citlivé.
3
ABSTRACT
Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Departement of Biochemical Sciences Candidate: Lenka Bartásková Supervisor: Mgr. Hana Bártíková, Ph.D. Title of the thesis: Differences between susceptible and resistant strains of Barber´s pole worm (Haemonchus contortus) Haemonchus contortus is very common parasite. It can infect a large number of ruminant species and is a very dangerous parasite of sheep and goats worldwide. The infection caused by these worms is called haemonchosis. The symptoms are anaemia, loss of weight and death of the infected sheep and goats. Nowadays we can prevent this disease. The prevention of haemonchosis is available in the form of anthelmintic drugs. The most commonly administered drugs from this category are represented by benzimidazoles. However, the frequent use of anthelmintic leads to development of drug resistance in parasites. The resistance to anthelminthic drugs is caused by mutation at codon 200 of β-tubulin. The worms Haemonchus contortus can be divided into sub-groups according to their anthelmintic resistance. This thesis compares the number of alleles responsible for resistance in sensitive and resistant strains of Haemonchus contortus. A low percentage of the resistant allele is found in the sensitive strain ISE. In the resistant strains WR and BR the percentage is higher. The thesis also focuses on the
effect of anthelminthics on eggs. From all tested drugs (thiabendazole,
flubendazole and monepantel), the development of larvaes from eggs at drug concentration 0.1 μg.ml-1 was affected only by thiabendazole in susceptible strain ISE. The resistant strains are less sensitive to the treatment.
4
OBSAH ABSTRAKT................................................................................................................. 3 ABSTRACT ................................................................................................................. 4 OBSAH ........................................................................................................................ 5 1. ÚVOD ...................................................................................................................... 7 2. TEORETICKÁ ČÁST ............................................................................................. 8 2.1. HAEMONCHUS CONTORTUS ...................................................................... 8 2.1.1.Haemonchus contortus ................................................................................. 8 2.1.2. Životní cyklus H. contortus ......................................................................... 9 2.1.3. Hemonchóza ................................................................................................ 9 2.1.4. Diagnostika ................................................................................................ 11 2.2. LÉČBA A PREVENCE .................................................................................. 11 2.2.1. Farmakologická profylaxe ......................................................................... 11 2.2.2. Nefarmakologická profylaxe ..................................................................... 12 2.2.3. Anthelmintika ............................................................................................ 13 2.3. Rezistence........................................................................................................ 17 2.3.1. Mechanismus vzniku rezistence ................................................................ 17 2.3.2. Citlivé a rezistentní kmeny H. contortus ................................................... 19 2.4. Metody detekce rezistence .............................................................................. 20 2.4.1. Test redukce počtu vajíček v trusu (Faecal egg count reduction test FECRT) ............................................................................................................... 20 2.4.2. Test líhnutí vajíček (Egg hatch assay- EHA) ............................................ 21 2.4.3. Mikroagarový test vývoje larev (Microagar larval development test MALDT) ............................................................................................................. 21 2.4.4. Polymerázová řetězová reakce (Polymerasechainreaction- PCR) ............ 22 3. CÍL PRÁCE ........................................................................................................... 24 4. PRAKTICKÁ ČÁST .............................................................................................. 25 4.1. Primery a kit pro PCR, přístrojové vybavení, biologický materiál ................. 25 4.1.1. Primery a kit pro PCR ............................................................................... 25 4.1.2. Přístrojové vybavení .................................................................................. 25 4.1.3. Biologický materiál ................................................................................... 26 4.2. Pracovní postupy ............................................................................................. 26
5
4.2.1. Izolace DNA .............................................................................................. 26 4.2.2. PCR ........................................................................................................... 28 4.2.3. Gelová elektroforéza ................................................................................. 30 4.2.4. Test líhnutí vajíček .................................................................................... 31 5. VÝSLEDKY .......................................................................................................... 33 5.1. Výsledky molekulárních metod: qPCR a elektroforéza .................................. 33 5.2. Test líhnutí vajíček (Egg hatch test) ................................................................ 37 6. DISKUZE ............................................................................................................... 44 7. ZÁVĚR .................................................................................................................. 49 8. SEZNAM ZKRATEK ............................................................................................ 50 ZDROJE ..................................................................................................................... 51
6
1. ÚVOD Haemonchus contortus patří mezi parazitární červy rozšířené po celém světě. Jejich nejčastějšími hostiteli jsou ovce a kozy, ale i další drobní přežvýkavci. Způsobují onemocnění zvané hemonchóza. Napadají žaludeční sliznici, kde sají krev. Jejich působením dochází k rozvoji anemie, ztrátě váhy, až smrti. Při napadení stáda způsobují velké ztráty. Léčba i preventivní opatření proti hemonchóze nejvíce spoléhá na farmakoterapii v podobě anthelminik, převážně benzimidazolů. Jejich časté a kolikrát ne zcela správné užívání vede ke vzniku rezistence na anthelminika a následně neúspěšné léčbě. Mechanismy rezistence jsou dvojího typu, buď farmakodynamické, nebo farmakokinetické, mohou se však i mezi sebou prolínat. Rezistence na léčiva proti gastrointestinálním hlístům se dnes stává velmi aktuálním problémem a můžeme se již setkávat s kmeny, které jsou odolné nejen k jednomu, ale k více druhům anthelmintik. Tyto kmeny pak nazýváme multirezistentními. K určení rezistence se může využít PCR (polymerázová řetězová reakce) metody, EHT (test líhnutí vajíček), FECRT (test redukce počtu vajíček v trusu) a dalších. Tato práce se zabývá srovnáním citlivých a rezistentních kmenů H. contortus. Byl využit kmen ISE, který reaguje na všechna anthelmintika, dále kmen BR, u kterého je rozvinuta rezistence na benzimidazoly. Posledním zástupcem je WR (White River) kmen, který je znám svojí odolností ke všem třídám anthelmintik. Použita byla metoda PCR na zjištění mutací pro β-tubulin. Poté byl proveden test líhnutí vajíček pro určení rezistence na léčiva v tomto vývojovém stádiu.
7
2. TEORETICKÁ ČÁST
2.1. HAEMONCHUS CONTORTUS
2.1.1.Haemonchus contortus Haemonchus contortus, česky vlasovka slézová, je parazitární červ kmene Nematoda, čeledi: Trichostrongyloidea, řádu Strongylida, třídy Secernentea, rodu Haemonchus. V dnešní době můžeme zástupce tohoto rodu nalézt na všech kontinentech, ale původně se vyskytoval v Africe. Prvotními hostiteli byly antilopy, dále se rozšířili na další malé přežvýkavce včetně domestikovaných. Následně, díky migraci lidí, se tito cizopasníci dostávají na další kontinenty, kde se dále specifikují až na dnešních jedenáct druhů (Angulo-Cubilán a kol. 2007). Haemonchus contortus má oblý tvar těla, a proto patří mezi nematoda (hlístice). Dospělí jedinci jsou nitkovitého tvaru, samci dorůstají 10-20 milimetrů, samice jsou větší, měří 18 až 30 milimetrů. Krev, kterou sají z hostitele, jim dodává růžové až červené zbarvení. Samice mají okolo střeva obtočeny výrazně bílé až šedobílé vaječníky, proto se mohou zdát červenobílé, jakoby obtočené stužkou. Dutina ústní je vybavena zubem nebo lancetou, pomocí které červ narušuje žaludeční mukózu a saje krev. Tělo je kryto příčně a podélně rýhovanou kutikulou, která chrání vlasovku pro život v nevhodných podmínkách hostitele. Kutikula je tvořena třemi vrstvami, kolagenem a nebuněčnými výměšky epidermis. Na hlavové části jsou umístěny cervikální papily. Samec má dobře vyvinutou bursu s velkými asymetrickými laloky. Samice mají v kaudální části těla vulvu, která je překryta kutikulární řasou. Samice jsou velmi plodné, mohou vyprodukovat až 5000 vajíček za den. Vajíčka o velikosti 70 x 45 μm jsou ve fázi moruly vylučovány ve výkalech hostitele do vnějšího prostředí, kde se mohou přeměnit na infekční stadium larvy L3 (Angulo-Cubilán a kol. 2005, Jíra a kol. 1998, Sendow 2003).
8
Obr. 1. Haemonchus contortus
2.1.2. Životní cyklus H. contortus
H. contortus, stejně jako většina zástupců nematod, prodělává vývojová stádia bez přítomnosti mezihostitelů, proto jej řadíme mezi geohelminty. Jak již bylo řečeno, vajíčka jsou vypuzena s hostitelovými výkaly do vnějšího prostředí v podobě moruly. Za příznivých podmínek, tedy za správné teploty a vlhkosti, se za 6 – 7 dní z vajíčka vylíhne larva (L3). H. contortus se v prvním i druhém vývojovém stadiu živí bakteriemi. Třetí vývojové stadium (L3) je již infekční. Hostitel tuto formu pozře společně s potravou. Pozřená larva obnaží žaludeční mukózu a zde dochází k přeměně do stadia L4. Po tomto stadiu může dojít k hypobióze, neboli zastavení vývoje hlístice. Hypobióza je dána různými okolnostmi, vnějšími podmínkami, ale i kondicí daného hostitele. Hypobióza nastává zpravidla v zimě. Když nastane zlepšení životních podmínek, vývin se obnoví, larva opustí žaludeční mukózu, svlékne kutikulu a přemění se na dospělého jedince, který je schopný se množit (Angulo-Cubilán a kol. 2005, Sendow 2003).
2.1.3. Hemonchóza
H. contortus se řadí mezi gastrointestinální parazity, kteří způsobují velké 9
škody na chovech drobných přežvýkavců. U napadených zvířat dochází ke ztrátám hmotnosti, úbytku tukových zásob. Je snížena také produkce mléka a vlny. Může dojít až k úhynu některých kusů. U zvířat můžeme pozorovat vyhublost, která je dána zhoršeným příjmem potravy. S tímto souvisí i ztráta tukových zásob. Bledé sliznice jsou ukazatelem na chudokrevnost zvířete. Povšimnout si lze i otoků tělních dutin zvířat a hypertrofie lymfatických uzlů. Napadené kusy bývají ve většině případů netečné ke svému okolí. V krvi lze dokázat zvýšené množství kolujících eosinofilů. Do jaké míry se infekce rozšíří, udávají dva faktory, virulence a odpověď hostitele. Za základní a nejpodstatnější mechanismus patogeneze lze označit poranění žaludeční mukózy parazitem a sání krve hostitele. Důsledkem jsou morfologické i funkční změny v hostitelském organismu, které jsou nejčastější ve slezině. Dochází ke vzniku anemie a zhoršení trávicích a absorpčních podmínek. V průměru dokáže dospělec H. contortus za den vysát až 0,05 ml krve. To způsobuje snižování hodnoty hematokritu hostitele. Tento jev je pozorovatelný již po 4 dnech od počátku infekce, což je doba, kdy larva ve stadiu L4 opouští žaludeční mukózu. Dále je možné sledovat snižování hodnot hemoglobinu, což je dáno hemoragií, ale dále také rozkladem erytrocytů. Rozpad červených krvinek zapříčiňují hemolytické faktory, které H. contortus využívá pro zlepšení podmínek sání krve. K dalšímu výraznému úbytku krve u přežvýkavce dochází okolo 7. týdne po infekci, v době, kdy parazit dospěje a vytvoří se mu v dutině ústní lanceta. Dále dochází k poklesu hladiny plasmatických bílkovin. Ten je opět dán ztrátami krve, ale také sníženým příjmem potravy. Následkem tohoto stavu je porušená buněčná integrita, permeabilita a ztráta epitelu. Hostitelský organismus se snaží zachovat rovnováhu a dochází ke zvyšování požadavků syntézy bílkovin od imunitního systému. Dalším projevem hemochózy je zhoršení absorpce a trávení potravy dobytkem. Napadená zvířata přijímají potravu pomalu. K tomu dochází ke zhoršení absorpce aminokyselin a malých peptidů. To je dáno zvýšením hodnoty pH sleziny. Tato hodnota zabraňuje syntéze pepsinu. Nárůst pH ve slezině je způsoben sníženou tvorbou kyseliny chlorovodíkové v žaludku. Kyselina chlorovodíková je tvořena parietálními buňkami. V průběhu hemonchózy dochází ke snížení počtu těchto buněk nebo úplné ztrátě (Angulo-Cubilán a kol. 2007, Abbott a kol. 2012).
10
2.1.4. Diagnostika
Pro odhalení zvířat napadených zástupcem H. contortus se využívají poznatky o jeho životním cyklu. Vajíčka jsou vylučována dospělými jedinci z organismu hostitele společně s výkaly. Proto je možné dokázat napadení stáda z fekálií nacházejících se na pastvině. Tato metoda je sice levná, její nevýhodou ovšem je, že již nedospělé vývojové stadium H.contortus pro svůj další vývoj saje krev z napadených zvířat. Proto odhalení infekce touto metodou je poněkud opožděné. Dokázání dospělého vývojového stadia parazita je možné pouze pitvou (Kauffmann 1996). Další možností, jak určit napadené ovce, je využitím systému FAMACHA. Jeho výhodou je možnost odhalení jednotlivých napadených kusů. FAMACHA (Faffa Malan chart) je systém, o který se zasloužil doktor Faffa Malan. Určení jedinců, které je nutné léčit anthelmintiky, je založeno na barevné změně spojivek. Zdravá zvířata mají sytě červenou tkáň, která se v průběhu nemoci mění na růžovou a bělavou. Tento jev je dán postupující anemií. Anemie je též možné hodnotit dle hodnot hematokritu. FAMACHA je jednoduše aplikovatelná, jsou zde vytvořeny karty, na kterých jsou zobrazeny barvy spojivek a přiřazeny hodnoty hematokritu. Po zjištění závažnosti infekce se přistoupí k odpovídající léčbě (van Wyk a Bath 2002).
2.2. LÉČBA A PREVENCE Jelikož nákaza způsobená hlístem rodu H. contortus způsobuje velké ekonomické škody na chovech ovcí a dalších drobných přežvýkavců, snaží se chovatelé těmto napadením vyhnout. To je možné podáváním preventivních dávek anthemintik a zavedením zoohygienických opatření. Léčba helmintóz doposud závisí především na použití anthelmintik.
2.2.1. Farmakologická profylaxe Anthelmintika se nepoužívají jen pro léčbu již infikovaných kusů, ale také jako
11
profylaxe před možným napadením přežvýkavce. V mírném podnebném pásu se tato metoda užívá méně, anthelmintika se zde podávají jedenkrát za rok. V pásech subtropických a tropických je tato metoda obvyklejší, v období dešťů je totiž vytvořeno optimální klima pro vývin vlasovek, kterým prospívá teplota mezi 22 °C a 26 °C a vlhkost blížící se 100%. Proto se zde anthelmintika podávají dvakrát ročně. Nejdříve se podává první dávka měsíc před začátkem dešťů a druhá na konci tohoto období. Nicméně dodatečná léčba není věcí neobvyklou. K preventivnímu ošetření se používají převážně benzimidazolové přípravky. Hlavními problémy profylaktického užívání anthelmintik se jeví objevování se reziduí anthelmintik v mase a dále také možný vznik rezistence. To je dáno dlouhodobým užíváním, nestandardním použitím a poddávkováním. Z tohoto důvodu je od preventivního podávání anthelmintik snaha odstoupit a hledají se nové způsoby ochrany před nákazou. Pro severní Afriku byl vyvinut systém FAMACHA, který by měl snížit používání anthelmintik jako preventivního prostředku před hemonchózami. Léčivé látky se zde nepodávají celému stádu, ale je sledován zdravotní stav jednotlivců. Jestliže je u některého ze zvířat zaznamenána anemie, ukazatel na infekci daného kusu, je tento jedinec léčen. Díky tomu se tedy snižuje množství využívaných anthelmintik a snižuje se riziko vzniku rezistence (Getachew a kol. 2007).
2.2.2. Nefarmakologická profylaxe Aby bylo sníženo riziko nákazy, měla by být dodržována zoohygienická pravidla. Jak je známo, vajíčka jsou vylučována dohromady s výkaly. Následně se z nich vyvíjejí larvy, které jsou spaseny. Z toho vyplývá, že jedním z řešení je odstraňování výkalů z pastvin. Další možností je obměna pastvin. Ze studií vyplývá, že nejvíce kontaminována je pastvina po prvním týdnu. Naopak po devíti týdnech se na pastvině vyskytuje těžko detekovatelné množství zástupců H. contortus. Rotace pastvin je výhodná zvláště se stády, která nejsou náchylná na stejné parazity. Ne všude však kvůli geografickým nebo sociálním podmínkám lze tato metoda využít. Nesmíme také opominout výživu zvířat. Jedinci, kteří nejsou správně krmeni a jsou podvyživení, nemají dostatečnou schopnost bránit se nákaze.
12
Další možný způsob ochrany drobných přežvýkavců je využití houbových spor. Mohou ochránit pastviny, ale také se dají použít přímo u jednotlivých kusů zvířat. Jsou to zástupci Drechumeria contiopsora a Harposportium angutillulae. Mají schopnost tvořit tři lepivé sítě, které pevně obalí žijící larvy, což je nakonec usmrtí (Getachew a kol. 2007).
2.2.3. Anthelmintika Anthelmintika jsou léčiva, která jsou určena pro léčbu helmintóz. Jsou to látky většinou syntetického nebo biosyntetického původu. Dále mohou být dělena na antinematoda, antitrematoda a anticestoda. Antinematoda jsou látky, které působí proti oblým červům. Některá z nich však mimo této aktivity mohou mít i účinek proti tasemnicím (cestoda) a motolicím (trematoda). Podávají se individuálně, mohou se však podávat i preventivně celému stádu (Lamka a Ducháček 2008). Stejně jako všechna léčiva i anthelmintika se dají dělit podle několika kritérií. Nejčastěji to bývá podle chemické struktury nebo podle mechanismu účinku. Jestliže se zaměříme na chemické struktury, získáváme pět skupin, které působí na nematoda. Jsou jimi benzimidazoly (BZD), makrocyklické laktony, imidazothiazoly, tetrahydropyrimidiny a aceto-aminonitrilové deriváty (Abbot a kol. 2012).
Benzimidazoly Benzimidazoly (BZD) jsou látky nejen s antinematodním účinkem, ale také některé mohou působit proti trematodům a cestodům. Benzimidazoly jsou nejširší skupinou, která se používá v terapii nematod. Látky této chemické skupiny působí nejen proti dospělým formám, ale i proti všem vývojovým stadiím. Některé z nich působí i ovocidně. Používají se jak k profylaxi, tak i k léčbě jedinců již napadených. Mechanismus jejich působení je dán schopností navázat se na β-tubulin, čímž brání polymerizaci a prodlužování mikrotubulů. To vede za prvé k narušení tvorby mitotického vřeténka, bez kterého nelze dokončit buněčné dělení. Díky této
13
vlastnosti je můžeme nazývat též mitotickými či vřeténkovými jedy. Za druhé je též narušena funkce cytoplasmatických mikrotubulů. Ty jsou zodpovědné za příjem potravy parazita. Nedostane-li se do organismu glukóza, pomalu dochází k odčerpání energetické zásoby parazita (v podobě glykogenu) a jeho úhynu. Benzimidazoly mají vyšší schopnost vázat se na mikrotubuly parazitů než hostitelů. Proto nedochází k výrazným nežádoucím účinkům způsobeným těmito léčivy. Látky ze skupiny benzimidazolů jsou hostiteli málo metabolizovány, většina je v nezměněné formě vylučována stolicí. Některé látky jsou zakázané podávat laktujícím přežvýkavcům a jatečním zvířatům určeným pro lidskou konzumaci. Prvním z řady těchto léčiv, i když v dnešní době již nevyužívaný, je thiabendazol, který se využíval již v 60. letech 20. století. Substitucí na benzimidazolu byly připraveny další látky této chemické a terapeutické skupiny. Mezi látky v dnešní době využívané řadíme albendazol, flubendazol, mebendazol, fenbendazol a febantel. Febantel je vlastně proléčivo odvozené od fenbendazolu (Lamka a Ducháček 2008, Abbott a kol. 2012).
Obr. 2. Chemická struktura flubendazolu Makrocyklické laktony Makrocyklické laktony nemají účinek proti jiným helmintům, pouze proti nematodům. Působí ovšem proti některým ektoparazitům, obzvláště proti členovcům. Patří mezi biosyntetické látky, které vznikají kvašením aktinomycety rodu Streptomyces avermitilis. Mechanismus účinku je spojen se zvýšeným průnikem chloridových iontů do 14
neuronu. To má za následek hyperpolarizaci membrány a snížení transmise nervových impulsů. Inhibicí neurotransmise dochází k paralýze parazita, úhynu a následně
jeho
odstranění
z hostitelského
organismu.
Prvním
vysvětlením
hyperpolarizace a zvýšeného průniku chloridových iontů bylo navázání se na receptory neuronální membrány, vypuzení velkého množství kyseliny γaminomáselné. GABA následně měla tvořit komplex na chloridových kanálech. Po sérii studií je však hlavní účinek připisován schopnosti makrocyklických laktonů navázat se na glutamátové receptory, které se u savců nevyskytují. Makrocyklické laktony mají schopnost přejít do mléka. Metabolizují se v játrech, vylučovány jsou stolicí. Zástupci makrocyklických laktonů jsou dále děleni na dvě řady, a to avermektiny
a
milbemyciny.
Mezi
zástupce
avermektinů
patří
i
první
makrocyklický lakton. Jedná se o ivermektin, který je stále využíván v terapii. Dále se do této skupiny řadí i abamektin, doramektin, eprinomektin a selamektin. Mezi milbemyciny můžeme zařadit moxidetin, který je oproti avermektinům lipofilnější, proto přetrvává delší dobu v organismu, a milbemycin (Lamka a Ducháček 2008, Dobšíková a kol. 2012).
Obr. 3. Chemická struktura ivermektinu
15
Imidazothiazoly Imidazothiazoly jsou látky, které účinkují pouze na vývojová a dospělá stadia hlístů. Nemají aktivitu anticestodickou a antitrematodickou. Mechanismus jejich působení je dán navázáním na nikotinové receptory parazitů. Jsou agonisty nikotinových receptorů, zvyšují vodivost membrány, což způsobuje otevření neselektivních kationtových kanálů. V konečném důsledku dojde k celkové svalové paralýze helminta a jeho následnému vypuzení z hostitelského organismu. Imidazothiazoly jsou velmi dobře vstřebávány, jejich metabolismus probíhá v játrech. Konečná exkrece probíhá převážně močí, pouze asi 10% přes trus. Prvním zástupcem byl tetramisol. Levamisol, což je další zástupce, je pouze levotočivá forma tetramisolu (Dobšíková a kol. 2012, Lamka a Ducháček 2008).
Tetrahydropyrimidiny Daly by se též označit za deriváty imidazothiazolu. Proto je i mechanismus účinku veden přes nikotinové receptory, depolarizaci nervosvalové ploténky a následné paralýze nematoda a jeho vypuzení. U této skupiny je vhodné upozornit na zkříženou rezistenci s imidazothiazoly. Zástupci tetrahydropyrimidinů jsou pyrantel a oxantel (Lamka a Ducháček 2008). Aceto-aminonitrilové deriváty Tato skupina léčiv je poměrně mladá, nová anthelmintická skupina vznikla po 30 letech. Na trh se ve Velké Británii dostávají v roce 2010. Jedná se o širokospektrá anthelmintika působící na všechny zástupce nematod. Mechanismu působení je srovnatelný s levamisolem, také zde dochází k paralýze červa. Pouze probíhá na nikotinovém receptoru, který je specifický pro hlísty. Zástupcem je monepantel (Abbott a kol. 2012). 16
Obr. 4. Monepantel
2.3. Rezistence
2.3.1. Mechanismus vzniku rezistence
Prvotní zprávy o vzniku rezistence jsou z konce 50. let, kdy byla zaznamenána odolnost H. contortus na fenothiazin u ovcí, který byl někdy využíván k léčbě helmintóz. V 70. letech další výzkum prokazuje mnohonásobně větší rozšíření rezistence na benzimidazoly po celém světě. Tento stejný vzor se opakuje se zavedením
nových
imidazothiazol-tetrahydropyrimidinových
a
avermektin-
milbemycinových tříd anthelmintik a v 80. letech se poprvé vynořila zpráva o multirezistentních červech (Kaplan 2004). Od 90. let již není rezistence vnímána jako problém budoucnosti, ale v některých částech světa je velmi aktuální. Jde především o jižní Afriku, Jižní Ameriku, Malajsii.
Rezistence je definována jako stav, kdy větší množství jedinců parazitující populace, obvykle zasažené dávkou nebo koncentrací směsi, není dále ovlivněno (nebo pro dosažení stejného účinku je nutná vyšší koncentrace léčiva) (Wolstenholme a kol. 2004). Rezistence není nutným výsledkem podávání léčiv, vždy záleží na poměru rezistentní a citlivé alely v populaci, ale jestliže se vyvine, je jevem nevratným. Stále více se objevuje mnohočetná rezistence, postupně a nezávisle se rozvíjí na několik tříd anthelmintik.
17
Vznik rezistence na anthelmintika, ale i jiná léčiva, je možný na základě farmakokinetického
a
farmakodynamického
působení.
Farmakokinetický
mechanismus snižuje koncentraci aktivní formy léčiva v buňce, čímž nemůže dojít k zamýšlenému účinku. Toto může být způsobeno snížením absorpce látky, jejím zrychleným vylučováním nebo aktivací enzymů metabolizujících léčiva (či inaktivací
enzymů
metabolizujících
proléčiva
na
jejich
aktivní
formu).
Farmakodynamika se týká strukturálních změn cílových makromolekul pro léčiva. Jestliže je látka neschopna se navázat, nemá možnost přenést svůj účinek dále. Nezřídka se rezistence vyvíjí jak na základě farmakodynamického, tak i farmakokinetického mechanismu. Tím se řešení rezistence stává ještě více složitým.
Rezistence je záležitostí dědičnou. Přenáší se v populaci přes rezistentní alelu. Rozšíření této alely můžeme sledovat ve třech fázích. I.
Z velké části je vznik rezistence jevem náhodným. Je ovlivněn velikostí a
rozdílností populace. Prvotní šíření rezistentní alely je pomalé. II.
Další vývoj záleží na schopnosti léčiva zabít citlivé parazity, ale rezistentní již
ne. Ti se dále množí a přenášejí schopnost přežít i na další generace. III. Posledním stupněm je již významné rozšíření rezistentní alely do podstatné části populace.
Vedlejší rezistence je jev, kdy parazité rezistentní na jedno léčivo chemické třídy jsou také rezistentní vůči ostatním léčivům stejné třídy. To se zdá být univerzálním
závěrem.
Příkladem
jsou
benzimidazoly,
imidazothiazoly a
avermektin-milbemycin (Sangster 1998).
Naproti tomu o zkřížené rezistenci se mluví u parazitů, kteří jsou odolní vůči léčivům, která se nenalézají ve stejné chemické skupině. Zkřížená rezistence se vyskytuje například mezi organofosfáty a imidazothiazoly. Organofosfát, naftalofos, je anticholinesterasa, která dovoluje akumulaci dostatečně vysoké hladiny acetylcholinu na neuromuskulárních ploténkách, aby došlo k paralýze. Rezistence imidazothiazolů (levamisolu) se týká snížení citlivosti acetylcholinových receptorů
18
na acetylcholin červa. Acetylcholin nakumulovaný jako výsledek působení naftalofosu je tedy méně účinný u levamisol-rezistentních červů (Sangster 1998).
BZD fungují přes inhibici polymerace tubulinu a vzniku mikrotubulů a je jisté, že rezistence souvisí s mutací na genu pro β-tubulin, která zabrání navázání léčiva. Prvně byl popsán Phe-Tyr polymorfismus na 200. kodonu pro β-tubulin isotypu 1. (Wolstenholme a kol. 2004). Druhý polymorfismu Phe-Tyr byl objeven na 167. kodonu pro β-tubulin isotypu 2. Navazující studie ukazují, že tato mutace u H. contortus snižuje afinitu BZD na receptory. Proto rezistenci může prohloubit, ale není schopna ji sama navodit. Jiná situace nastává u Teladorsagia circumcincta, kde je rezistence na BZD založena právě na mutaci 167. kodonu (Wolstenholme a kol. 2004).
S rezistencí souvisí také selekční tlak léčiv. Na faktorech, které selekční tlak ovlivňují, závisí, zda se rezistence projeví v celé populaci. Výhodami pro vznik rezistence je velká plodnost parazitů. Jestliže se za krátký čas vytvoří několik generací parazitů, dochází k pevnějšímu zakotvení nových rezistentních alel v populaci s velkou frekvencí. Další výhodou H. contortus je přímý životní cyklus. A snad nejpodstatnějším faktorem selekčního tlaku je samotná léčba. Podáváním nedostatečných dávek léčiva si sami vytváříme rezistentní populace parazitů. Jestliže podáme nižší dávku, která je schopna zabít jen citlivé jedince, přežívají jen odolní. Ti mají dále schopnost se množit mezi sebou, a tím si předávají geny pro rezistenci. Jestliže se léčba bude dále opakovat, opět přežijí jen nejodolnější a tím se tvoří populace rezistentních parazitů (Wolstenholme a kol. 2004).
2.3.2. Citlivé a rezistentní kmeny H. contortus
Zástupce H. contortus je možné dělit podle jejich vztahu k anthelmintikům na kmeny citlivé a rezistentní. Mezi kmeny odolné řadíme BR a WR, do kategorie, která jsou k léčbě vnímavá, řadíme kmen ISE (Vokřál a kol. 2012).
19
ISE kmen je citlivý vůči všem anthelmintikům, která jsou dnes známá. Tento kmen byl získán křížením z původního SE kmenu, který pochází z doby před uvedením benzimidazolů na trh, a proto jim nebyl vystaven (Cvilink a kol. 2008). Rezistentní kmen BR vznikl zkřížením SE a RE4 populace. Je rezistentní vůči benzimidazolovým anthelmintikům, na ostatní léčiva je však dosud citlivý. Kmen, který pochází z jižní Afriky, se nazývá WR (White River). Tato populace je rezistentní vůči benzimidazolům, ivermektinu, rafoxanidu a klosantelu. Proto se o tomto kmenu hovoří jako o multirezistentním. V laboratoři v Edinburgu byl izolován zástupce ISE-S, který představuje kmen odolný pouze pro ivermektin (Vokřál a kol. 2012).
2.4. Metody detekce rezistence
Aby bylo možno rezistenci kvantitativně hodnotit a srovnávat, musely vzniknout metody, které ji jsou schopny odhalit a číselně ohodnotit. Dále je velmi důležitá možnost srovnávat výsledky ze všech světových laboratoří. Proto Světová asociace pro rozvoj ve veterinární parazitologii (The World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology) sjednotila a vytvořila jejich postupy. Metody detekce se dají dělit na dvě skupiny, na testy probíhající in vivo a in vitro. Testy in vitro jsou užívány pro detekci rezistence u benzimidazolů a imidazothiazolů (Coles a kol. 2005, Álvarez-Sanchéz a kol. 2005).
2.4.1. Test redukce počtu vajíček v trusu (Faecal egg count reduction test - FECRT)
FECRT je metoda, kterou je možné prokázat rezistenci na všechna anthelmintika bez výjimky. Patří mezi často užívané metody. Její podstatou je rozdíl v počtu vajíček před a po aplikaci anthelmintika. Po výběru zvířat, která budou do testu zahrnuta, dochází k odebrání vzorku z rekta, poté se spočítá zastoupení vajíček. Aplikace anthelmintika je prováděna převážně stříkačkou a to dávkou, která je 20
podávaná při klasické léčbě. K novému odběru vzorku dochází po době, která je určena podaným léčivem. Pro imidazothiazoly (levamisol) je tato doba 3 – 7 dní, benzimidazoly se testují po 8 – 10 dnech a nejdéle se čeká s odběrem u makrocyklických laktonů a to 14 – 17 dní. Účinnost léku se dopočítává metodou McMaster. Anthelmintikum se považuje za vyhovující a nepodléhající dosud rezistenci v případě, že došlo k redukci vajíček o více jak 95%. U léčiv, která vyžadují delší časový úsek před druhým odběrem, může dojít k re-infekci zvířete, jestliže setrvává na infikovaných pastvinách (Coles a kol. 2005).
2.4.2. Test líhnutí vajíček (Egg hatch assay- EHA)
EHA nebo také EHT (egg hatch test) patří do skupiny in vitro metod. Používá se především pro BZD. První jej popsal LeJambre v roce 1976 s použitím thiabendazolu. Jde o test, který zjišťuje účinnost anthelmintik na vajíčka. Vajíčka by měla být zpracována do 3 hodin po odběru nebo anaerobně konzervována, jelikož s narůstajícím časem se jejich citlivost k léčivu snižuje. Vajíčka se inkubují v roztoku anthelmintika rozpuštěného v DMSO. Po uplynutí 48 h se přidává Lugolův roztok, který zastaví další líhnutí, a test se hodnotí pod mikroskopem. Sleduje se, jaké množství vajíček se vyvinulo v larvu a kolik vajíček zůstalo nevylíhnutých. Většinou se poté dopočítává hodnota LD50 nebo LD99 (koncentrace, která zamezí líhnutí 50% či 99% vajíček). Abychom mohli mluvit o citlivosti parazita vůči anthelmintiku, požadujeme 99% nevylíhnutých vajíček při dané koncentraci léčiva (Coles a kol. 2005, Kotze a kol. 2004).
2.4.3. Mikroagarový test vývoje larev (Microagar larval development test - MALDT)
Další metoda, která probíhá in vitro, je MALDT. Její princip je postavený na stejných základech jako EHT. Od EHT se liší mediem, na kterém probíhá inkubace. Zde je to agar s roztokem anthelmintik, u EHT se jedná pouze o roztok anthelmintik. Hodnotí se zastoupení larev L3 vůči nevylíhnutým vajíčkům, L1 a L2 larvám. Výsledek lze opět udávat v hodnotách LD50 nebo LD99. Dále zde na rozdíl od EHT
21
není podstatné stáří vajíček. (Coles a kol. 2005, Várady a kol. 2007).
2.4.4. Polymerázová řetězová reakce (Polymerase chain reaction- PCR)
Polymerázová řetězová reakce je metoda, kterou lze dokazovat rezistenci pouze benzimidazolů. Pro makrocyklické laktony a levamisol se nepoužívá, jelikož je nutné znát sekvenci aminokyselin, kde vznikem rezistence dochází ke změnám (Coles a kol. 2005). Ke vzniku rezistence na BZD u H. contortus dochází mutací 200. kodonu genu pro β-tubulin, kde dojde k záměně fenylalaninu za tyrosin (Álvaréz-Sanchéz a kol. 2005). Na rozdíl od ostatních metod je PCR schopna odhalit vznik rezistence již ve velmi brzké fázi. Metody typu EHT, FECRT nebo test vývoje larev jsou spolehlivé teprve v době, kdy se v populaci nachází alespoň 25% rezistentních jedinců (Elard a kol 1998). Nezbytné komponenty pro provedení PCR jsou primery a DNA-polymeráza. Primery jsou oligopeptidy, které musí být komplementární s templátovou DNA. Po rozdělení dvoušroubovice nasedají na konce vláken a v přítomnosti DNApolymerázy vzniká vlákno nové. Při každém cyklu se počet kopírovaných úseků vždy zdvojnásobí (Alberts a kol. 2004). Ke vzniku rezistence, ale i různých chorob může dojít záměnou pouhého 1 nukleotidu. Dokázání tohoto bodového polymorfismu pomocí PCR je poměrně obtížné, protože dochází nejen k amplifikaci vlákna bez mutace, ale dobře se množí i vlákno s mutací, na něž se primery rovněž navážou. Ke zvýšení specifity reakce se používají primery se záměrnou chybou v nukleotidové sekvenci (mismatch primery). Nejúčinnější je vytvoření záměn na 3' konci. Mismatch primery zvyšují specifitu reakce tím, že DNA polymeráza prodlužuje méně efektivně nesprávně spárovaný komplex primer-templát v porovnání s více se shodujícím komplexem, a tak dochází k jednoznačnější detekci polymorfismu. Tato vlastnost DNA polymerázy je dána buď vyšší afinitou enzymu k templátu s více se shodujícím primerem či problematickým prodlužováním mismatch primeru. Možná je i kombinace obou faktorů. Studie provedená s reverzní transkriptasou z viru ptačí myeloblastózy však ukázala, že neefektivní syntéza DNA s bodovou mutací tímto enzymem je způsobená spíše kinetickým blokem prodlužovací fáze než rozdílem v afinitě
22
enzymu se shodujícím se či neshodujícím se komplexem primer – templát (Huang a kol. 1992). Q-PCR (real time PCR) je schopna detekce a kvantifikace testované DNA kontinuálně během každého cyklu. Je charakterizována časem cyklu, kdy je zaznamenáno dostatečné množství amplifikovaných úseků. Další možností zobrazení výsledků PCR je využití elektroforézy. Komplexy s DNA se ve stejnoměrném proudu pohybují rychlostí, která odpovídá jejich hmotnosti (Fawley a Wilcox 2005).
23
3. CÍL PRÁCE
Tato práce je zaměřena na zjišťování rozdílů u jednotlivých kmenů H. contortus s rozdílnou citlivostí vůči anthelmintikům. Cílem práce bylo porovnání:
1. Zastoupení rezistentní alely u kmene WR, B, ISE a ISE léčeného flubendazolem. 2. Porovnat citlivost vajíček H. contortus pro vybraná anthelmintika
24
4. PRAKTICKÁ ČÁST 4.1. Primery a kit pro PCR, přístrojové vybavení, biologický materiál
4.1.1. Primery a kit pro PCR
FastStart SYBR Green Master, Roche Primer pro PCR PN1 (forward), Generi Biotech (5´-GGCAAG TATGTTCCACGTGC-3´) Primer pro PCR PH4M, Generi Biotech (5´-TACAGAGCTTCGTTGTCAATACAGAT-3´) Primer pro PCR PH5M, Generi Biotech (5´-TACAGAGCTTCGTTGTCAATACAGTT-3´)
4.1.2. Přístrojové vybavení Analytické váhy Scaltec SBC 22 Centrifuga Eppendorf 5415D Centrifuga Eppendorf Mini Spin plus CO2 inkubátor – HeraCell Mikroskop - NikonEclipse TS 100 Mrazicí box (-80°C) - Jouan Digitální pH-metr Thermo Orion model 410 Thermoblok s nástavcem Thermomixer Eppendorf Real-Time PCR detekční systém (iQ5, Bio Rad) Třepačka IKA Vortex Genius 3
25
Elektroforetické vany Fisher Scientific Zdroj na elektroforézu Bio Rad Power Pac 200 UV transiluminátor BioRad GelDoc System
4.1.3. Biologický materiál
Pro získání biologického materiálu bylo nutné infikovat ovce domácí. Použité a následně získané kmeny byly ISE, WR a BR. Využita byla zvířata zdravá, 3 – 4 měsíce stará. Suspenze, která byla ovcím podána perorálně, obsahovala 5000 larev (L3) H. contortus. Sedm týdnů po infekci byla nakažená zvířata poražena a vykrvena. Dospělé formy vlasovky slézové se ze slézu získaly agarovou metodou, která je popsána van Wykem a kol. (1980). Někteří ze zástupců kmene ISE byli léčeni 3x2 mg flubendazolu. Každý den byla podána jedna dávka.
4.2. Pracovní postupy
4.2.1. Izolace DNA Izolace DNA metodou fenol-chloroformové extrakce H. contortus byl vložen po jednom jedinci do mikrozkumavky, k němu bylo přidáno 100 μL Liftonova pufru a 10 μl proteinasy K a inkubovalo se při teplotě 56 °C s občasným protřepáváním do celkového rozložení. Po vyjmutí z thermomixeru se ke každému vzorku přidalo 11,1 μl 5M octanu draselného a promíchalo se. Dále se směs ponechala reagovat na ledu. Po 30 minutách byly vzorky stočeny 10 min při 10 000 rpm. Vzniklý supernatant byl přenesen do nové mikrozkumavky a k němu přidán stejný objem směsi fenolu, chloroformu a isoamylalkoholu (25:24:1), tedy 120 μl. Celý obsah byl promíchán otáčením mikrozkumavek a následně byla provedena centrifugace při 5000 rpm po
26
dobu 5 minut. Po vynětí z centrifugy by měly být patrné dvě vrstvy. Horní vrstva byla přenesena do nové mikrozkumavky. K dolní organické fázi byl přidán opět stejný objem TE pufru a vzorky byly znovu stočeny. Nově vzniklá vodná fáze byla spojena
s vrstvou
z první
extrakce.
Následovalo
zdvojnásobení
objemu
chloroformem, promíchání vzorku otáčením v ruce a stočení v centrifuze po dobu pěti minut při 5000 rpm. Horní vodná vrstva byla přepipetována do nové zkumavky, spojena s 480 μl ledového ethanolu (95 – 100%), promísena a nechána při -20 °C po dobu nejméně 10 minut pro zajištění precipitace vzorku. Po vyjmutí vzorků následovala centrifugace 5 minut na maximální možnou rychlost. Veškerá kapalina byla odpipetována a peleta byla resuspendována v 0,5 ml TE pufru. Po přidání TE pufru byl zvýšen objem dále o 0,3 ml 5 M octanu amonného a 1 ml 100% ethanolu a vzorky byly opět umístěny do teploty - 20 °C na 30 minut. Po uplynutí dané doby byly vzorky centrifugovány opět při nejvyšší možné rychlosti 5 minut. Po odstranění ethanolového supernatantu byla peleta dosušena, což je možné provést na vzduchu nebo v thermomixeru při teplotě 65 °C. Posledním krokem byla resuspendace v TE pufru. Takto vzniklé vzorky DNA byly uchovávány krátkodobě při -4°C nebo dlouhodoběji při -20°C.
Izolace DNA pomocí High Pure PCR template Preparation Kit Roche
Do každé zkumavky bylo vloženo po jednom zástupci Haemonchus contortus a připipetováno 200 μl Tissue Lysis Buffer, 40 μl proteinasy K. Po důkladném promíchání byly vzorky inkubovány při 55 °C do rozložení, což by mělo nastat za 60 minut. Po vyjmutí z thermomixeru bylo do zkumavky přidáno 200 μl Binding Buffer, opět se důkladně protřepalo a inkubovalo (10 min, 70 °C). Následně byl objem vzorku zvýšen o 100 μl isopropanolu, znovu se precizně promíchalo. Celý obsah byl přenesen do již připravených kolonek s mikrozkumavkou, vložen do centrifugy, na které bylo nastaveno 8000 rpm po dobu 1 min. Kolonky byly přendány na nové zkumavky, na kolonku jsme připipetovali 500 μl Inhibitor Removal Buffer a opět se zopakoval proces centrifugace při stejných podmínkách. Do kolonky, která byla umístněna na nové mikrozkumavce, bylo přidáno 500 μl Wash Buffer a
27
zcentrifugováno. Tento krok se opakoval dvakrát. Kolonka byla opět usazena na novou zkumavku a proběhla centrifugace při nejvyšší možné rychlosti po dobu 10 vteřin. Naposledy byla přendána kolonka do čisté, sterilní mikrozkumavky, kolonka byla naplněna 200 μl Elution Buffer, který byl zahřátý na teplotu 70 °C, a stočena (8000 rpm, 1 min). Takto vzniklý vzorek se uchovává při stejných podmínkách, které byly popsány u izolace DNA metodou fenol-chloroformové extrakce.
Izolace DNA pomocí Qiagen kitu
Vlasovky byly rozděleny po jedné do připravených mikrozkumavek. Ke každému parazitovi se přidalo 180 μl ATL pufru a 20 μl proteinasy K a okamžitě se vše důkladně promísilo. Vzorky byly vloženy do thermomixeru, kde došlo při 56 °C a občasném protřepání k rozložení přibližně za 3 hodiny. Po ukončení inkubace bylo do každé zkumavky přidáno 200 μl AL pufru a stejné množství 96% ethanolu. Takto vzniklá směs byla po promíchání přenesena pipetou na kolonku, pod níž se nacházela mikrozkumavka. Následně došlo k centrifugaci (8000 rpm, 2 min). Kolonka byla přenesena na novou, čistou mikrozkumavku a naplněna 500 μl AW1 pufrem a provedla se centrifugace za stejných podmínek jako v předchozím kroku. Znovu byla kolonka přendána, nyní do ní bylo napipetováno 500 μl AW2 pufru a po dobu 3 minut se nechala stočit při 13 000 rpm. Centrifugace byla zopakována za stejných podmínek s novou zkumavkou. Posledním krokem bylo přenesení kolonky na novou, sterilní mikrozkumavku, kolonka se naplnila 200 μl AE pufru a byla vložena do centrifugy po dobu 2 minut při 8000 rpm. Je také možnost přidávat AE pufr nadvakrát, po 100 μl.
4.2.2. PCR PCR Pro tuto metodu musel být předem vytvořen mastermix, který je rozdílný pro
28
citlivou a rezistentní alelu. Množství bylo připraveno podle požadovaného počtu vzorků, které jsme podrobili měření, a dále byl připočten jeden navíc. Na jeden vzorek se smísilo 8,5 μl redestilované vody, primery a 12,5 μl kitu (Taq DNA Polymerasa, pufr, nukleotidy (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), a SYBR Green I), který byl nejdříve promíchán otočením v ruce. Primery byly pipetovány po 0,5 μl a to pro citlivou alelu PN1 (forward primer) a PH4M (reverse primer), pro rezistentní byl místo PH4M přidán PH5M (reverse primer). Celá směs byla promíchána a krátce provedena centrifugace. Poté následovalo nanášení do stripů. Vždy bylo pipetováno 22 μl mastermixu a 3 μl DNA, která se předem promíchala v ruce. Po dokončení pipetování a následné centrifugaci byly stripy vloženy do PCR cykleru a provedena samotná PCR.
Tab. 1 Průběh PCR Fáze
čas
teplota
I.
10 min
95°C
15 s
95°C
60 s
65°C
55s
72°C
10 min
72°C
II.
neomezenou III.
4°C
dobu
V první fázi dochází k aktivaci enzymů. Při druhé fázi se opakuje 50 cyklů. Nejprve dochází k denaturaci dvoušroubovice, následuje nasedání primerů a tvorba nového vlákna.
29
4.2.3. Gelová elektroforéza
Příprava 1,5 % agarózového gelu Před vlastní přípravou agarózového gelu bylo nutné mít v zásobě TRIS-borátový pufr. Pro jeho uchystání byla potřeba 54,0 g trishydroxymethylaminomethanu, 27,5 g kyseliny borité a 20 ml 0,5M EDTA. Pro zlepšení rozpouštění EDTA lze přidat několik kapek hydroxidu sodného. Směs byla nakonec doplněna na 1 l, jeho pH by mělo být okolo hodnoty 8,3. K dalšímu použití bylo nutné tento pufr naředit 10x.
Pro vytvoření gelu bylo nutné nejdříve navážit agarózu. K přípravě 30 ml gelu to je 0,225 g. Dále byl přidán elektroforetický pufr, který jsme nejprve naředili. Roztok byl vložen do mikrovlnné trouby, kde se uvedl do varu. Po vychladnutí na přibližnou teplotu 55 °C bylo přidáno 0,1 μl barvy GelRed, směs byla zamíchána a nalita do připravené formy s umístěnými hřebínky tak, aby nikde nevznikla bublina. Gel se nechal zchladnout, k čemuž dochází přibližně za 45 min, následně se opatrně odstranily hřebínky. V tomto bodě je možné pokračovat v elektroforéze nebo několik dní gel uskladnit v chladu.
Nanesení vzorků DNA a separace fragmentů
Gel, který byl předem připraven, byl vložen do elektroforetické vany, byl zalit dostatečným množstvím TRIS-borátového pufru. Vzorky DNA byly před vlastním nanesením zředěny v poměru 1:5 s nanášecím pufrem. Do každé z jamek v gelu se nanáší 20 μl takto upravené DNA. Po skončení nanášení vzorků byl vytvořen elektrický okruh elektroforetické vany a stabilizovaného zdroje napětí (105 V). Po dokončení elektroforézy byl gel pozorován pod UV-transiluminátorem.
30
4.2.4. Test líhnutí vajíček
Izolace vajíček
Vajíčka byla získána z čerstvého nebo anaerobně uskladněného trusu. Anaerobně uskladněný trus lze uchovávat 7 dní při teplotě 20 °C v lahvičce, která je doplněna po okraj vodou. Prvním krokem při izolaci vajíček je homogenizace trusu s vodou. Tato směs je následně přenesena na systém sít seskládaných od největšího průměru ok po nejmenší (250 μm, 100 μm a 25 μm) a proplachována vodou, dokud nezačala odtékat čistá kapalina. V této době byl zachycený obsah spodního síta spláchnut do připravené kádinky a ponechal se 5 až 10 minut stát. Sediment byl po slití supernatantu přenesen do zkumavek s víčkem a doplněn vodou. Zkumavky byly poté přeneseny do centrifugy na 2 minuty (300 g), supernatant byl slit a sediment doplněn flotačním roztokem (nasycený roztok NaCl připravený za tepla). Usazenina byla rozbita tyčinkou a vše se promísilo. Opět došlo k doplnění flotačního roztoku, odstranily se bubliny a směs byla vložena do centrifugy na 2 minuty (250 g). Po ukončení byla z víčka do kádinky spláchnuta vajíčka. Na jedno víčko se použije cca 5 ml redestilované vody. Vajíčka byla propláchnuta vodou na sítu s oky o velikosti 20 μm, aby došlo k odstranění NaCl, a poté byla opět vrácena do kádinky pomocí vody ze střičky. Následně byl v kapce při desetinásobném zvětšení zjišťován počet vajíček v 10 μl.
Příprava roztoků anthelmitik
Test byl proveden se třemi anthelmintiky, a to s flubendazolem, thiabendazolem a monepantelem. Nejdříve byly připraveny zásobní roztoky anthelmintik v DMSO, jejichž koncentrace byla 1 mg/1ml. Tento roztok se následně ještě 100x naředil. Vajíčka byla pozorována v pěti různých koncentracích léčiv.
31
Tab. 2 Ředění anthelmintik pro získání adekvátní koncentrace Koncentrace
Zásobní roztok
DMSO
v jamce (μg/ml)
anthelmintika (μl)
(ml)
0,05
10
0,99
0,1
20
0,98
0,3
60
0,94
0,5
100
0,9
1.0
200
0,8
Inkubace
Inkubace probíhala na destičce se 24 jamkami. Do každé jamky bylo naneseno 1,99 ml roztoku vajíček a 10 μl anthelmintika o příslušné koncentraci. Měření bylo prováděno ve dvou paralelních řadách o koncentracích 0; 0,05; 0,1; 0,3; 0,5 a 1,0 μg/ml. Roztok vajíček byl naředěn tak, aby se v každé jamce vyskytovalo 200 vajíček. Před nanesením byl roztok s vajíčky míchán. Destička byla následně obalena parafilmem a inkubovalo se 48 hodin při teplotě 25 – 27 °C.
Vyhodnocení
Výsledky byly odečteny po 48 hodinách, kdy do každé jamky byla přidána kapka Lugolova roztoku. Ten zabrání dalšímu líhnutí a navíc se zlepší viditelnost vajíček a larev. Pomocí mikroskopu se poté zjišťoval počet vylíhnutých larev a nevylíhnutých vajíček do celkového počtu 100. Pomocí šablony v programu Excel jsme na základě zjištěných hodnot vypočítali koncentrace LD50 a LD99 (koncentrace, která zamezí líhnutí 50% či 99% vajíček).
32
5. VÝSLEDKY 5.1. Výsledky molekulárních metod: qPCR a elektroforéza Před vlastním provedením qPCR a elektroforézy bylo nutné získat DNA z testovaných kmenů H.contortus 1 . DNA byla získána izolací fenol-chloroformovou metodou a pomocí kitů (High Pure PCR template Preparation Kit Roche a Qiagen kit). Izolace pomocí kitu se zdá být jednodušší a zaručenější. U fenol-chloroformové metody je vyšší riziko ztráty DNA, která se izoluje, při odstraňování kapaliny, která je okolo pelety. Pelety s DNA často nepřilnou ke zkumavce, nebo se v průběhu odběru potrhají, tím se zvyšuje riziko, že peleta bude částečně nebo úplně odstraněna společně s kapalinou. Další hrozbu pro ztrátu genetického materiálu představuje to, že DNA je izolována z jednotlivých jedinců. Jelikož červi jsou jedinci o velikosti pouhých několik mm, ne vždy se vytvořila okem pozorovatelná peleta. Po izolaci DNA z jednotlivých kmenů H. contortus se provedla qPCR. Byly použity mismatch primery PH4M a PH5M, v nichž je záměrně vytvořena záměna 1 nukleotidu, která zvyšuje citlivost detekce. Za rezistenci zástupců H. contortus na daná anthelmintika je zodpovědná mutace 200. kodonu genu pro β-tubulin. Tab. 3 Výsledky qPCR vzorků H. contortus kmene ISE vz 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1
Ct s Ct s citlivými rezistentními genotyp primery primery 37,58 0 SS 36,38 0 SS 39,55 0 SS 37,82 0 SS 39,76 0 SS 37,11 0 SS 36,27 0 SS 36,98 0 SS 37,71 0 SS 39,85 0 SS 39,51 0 SS
kmeny WR, BR a ISE
33
vz 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Ct s Ct s citlivými rezistentními genotyp primery primery 39,83 0 SS 37,6 0 SS 35,34 0 SS 37,20 36,36 Sr 35,46 37,41 Sr 35,26 36,18 Sr 35,58 37,70 Sr 35,78 36,77 Sr 34,93 36,86 Sr 36,05 36,66 Sr 0 38,67 rr 38,6 37,70 Sr
Tab. 4 Výsledky qPCR vzorků H. contortus kmene ISE léčeného flubendazolem vz 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Ct s Ct s citlivými rezistentními genotyp primery primery SS 39,29 0 SS 35,81 0 SS 38,21 0 SS 33,99 0 SS 38,79 0 SS 37,90 0 SS 38,16 0 SS 36,05 0 SS 37,01 0 SS 34,05 0 Sr 37,07 36,64 SS 37,53 0 rr 0 38,60 SS 34,79 0 Sr 36,15 36,36 Sr 39,11 37,41 Sr 29,92 26,86 Sr 30,60 37,70 Sr 38,81 37,26 Sr 36,46 37,59 Sr 36,26 38,48 rr 0 37,84 Sr 35,63 37,46
34
Tab. 5 Výsledky qPCR vzorků H. contortus kmene BR vz 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Ct s Ct s citlivými rezistentními genotyp primery primery rr 0 38,15 Sr 37,56 35,88 rr 0 34,96 rr 0 36,99 rr 0 36,73 Sr 37,34 35,15 rr 0 36,21 rr 0 35,07 Sr 37,82 35,64 Sr 36,80 37,05 Sr 37,39 35,41 Sr 35,68 35,84 Sr 36,55 35,93 Sr 36,59 34,09 Sr 35,07 34,46 Sr 35,50 35,28 rr 0 36,63 Sr 36,24 38,82 Sr 36,72 35,17 Sr 36,52 35,25 Sr 35,77 34,39 Sr 36,56 35,56 SS 35,19 0 Sr 38,15 36,79 Sr 38,71 38,40
Tab. 6 Výsledky qPCR vzorků H. contortus kmene WR vz 1 2 3 4 5 6
Ct s Ct s citlivými rezistentními genotyp primery primery Sr 35,71 36,33 Sr 35,06 37,03 Sr 35,72 36,74 Sr 38,34 37,29 Sr 35,81 36,62 Sr 33,81 35,72
35
vz 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Ct s Ct s citlivými rezistentními genotyp primery primery Sr 36,95 36,11 Sr 35,77 34,29 Sr 35,08 36,01 Sr 37,41 36,99 Sr 34,94 36,83 Sr 34,86 36,95 Sr 33,94 33,49 SS 31,75 0 SS 35,39 0 Sr 37,78 38,69 Sr 39,35 37,89 Sr 38,18 37,51 Sr 35,83 36,49
Pro určení přítomnosti alely, ať citlivé či rezistentní, se bere naměřená hodnota cyklu, která je menší než 40. Vyizolovaná DNA byla dále použita na elektroforézu, kde byla ověřena specifita PCR (velikost a počet produktů reakce). Výsledky gelové elektroforézy však nebyly vždy úplně jednoznačné.
Obr. 5. Agarozový gel pod UV-transiluminátorem; dráha 1: ISE vz. 2 citlivý primer; dráha 2: ISE vz. 2 rezistentní primer; dráha 3: ISE 4 vz. citlivý primer; dráha 4: ISE vz.4: rezistentní primer; dráha 5: žebříček Syntetizovaný a dokazovaný produkt je 644 bází dlouhý. Jak je vidět z obr. 1, velikosti zkoumaných vzorků se neliší.
36
Oba zobrazené vzorky H. contortus kmene ISE se jeví jako citliví homozygoti, což potvrzuje výsledky z qPCR, kde byly oba vzorky rovněž identifikovány jako citliví homozygoti. Kmen ISE má proti kmenům BR a WR výrazně nižší výskyt rezistentní alely, čímž si můžeme vysvětlit jeho vyšší citlivost k jednotlivým anthelmintikům. Stejně tak si můžeme povšimnout výrazného počtu citlivých homozygotů u ISE kmenu, kmen WR se ve stanovených vzorcích nejčastěji vyskytuje v podobě heterozygotů na rozdíl od BR, který je tvořen především homozygoty rezistentními. Jestliže budeme porovnávat ISE kmen před a po léčbě flubendazolem 2 , není zde žádná viditelná změna v zastoupení alel. Tab. 7 Procentuální zastoupení citlivé a rezistentní alely Citlivé alely (%) ISE ISE + FLU WR BR
Rezistentní alely (%) 29,03 27,59 47,22 57,14
70,97 72,41 52,78 42,86
Tab. 8 Genotyp H. contortus vyjádřen procentuálně
ISE ISE + FLU WR BR
Homozygoti Citliví (%) Rezistentní (%) 60,87 4,35 65,21 8,70 10,53 4
Heterozygoti (%) 34,78 26,09
68
89,47 28
5.2. Test líhnutí vajíček (Egg hatch test) Egg hatch test byl prováděn u dvou kmenů H. contortus, a to u ISE a WR. Bylo použito tří antihelmintik: flubendazolu, thiabendazolu a monepantelu v pěti různých
2
Léčba byla prováděna podáváním 3x2 mg flubendazolu. Každý den byla podána jedna dávka.
37
koncentracích (0,01; 0,1; 0,3; 0,5; 1,0 µg/ml). Tab.9 Výsledky EHT; měření bylo provedeno ve dvou měřeních, výsledky představují průměr těchto měření.
THIA
ISE
FLU
MON
THIA
WR
FLU
MON
Koncentrace (µg.ml-¹) Kontrola 0,01 0,1 0,3 0,5 1,0 Kontrola 0,01 0,1 0,3 0,5 1,0 Kontrola 0,01 0,1 0,3 0,5 1,0 Kontrola 0,01 0,1 0,3 0,5 1,0 Kontrola 0,01 0,1 0,3 0,5 1,0 Kontrola 0,01 0,1 0,3 0,5 1,0
Vajíčka (počet) 17 85 91,5 91 94,5 94 17,5 19,5 24,5 31 58 89 14 15 19 17,5 20 25,5 15,5 51,5 73 86,5 93,5 96,5 13,5 21 22,5 47 76,5 91,5 17,5 16 19,5 19 21 33,5
Larvy (počet) 83 15 8,5 9 5,5 6 82,5 80,5 75,5 69 32 11 86 85 81 82,5 80 75 84,5 48,5 27 13,5 6,5 3,5 86,5 79 77,5 53 23,5 8,5 82,5 84 80,5 81 79 66,5
Abychom mohli mluvit o citlivosti parazita k danému anthelmintiku, musí splňovat 38
podmínku alespoň 90% nevylíhnutých vajíček pro koncentraci 0,1 µg.ml-¹ daného antihelmintika. Tab. 10 Vliv anthelmintik na líhnutí vajíček. Procentuální zastoupení nevylíhnutých vajíček je normalizováno ke kontrole. Anthelmintikum ISE
WR
THIA FLU MON THIA FLU MON
Nevylíhnutá vajíčka (%) 90,5 8,4 5,82 68,98 10,41 6,49
Jak je vidět z tabulky, vajíčka kmene WR jsou rezistentní vůči všem třem použitým anthelmintikům. H. contortus v tomto stádiu je citlivý pouze v případě kmene ISE, a to jen k thiabendazolu. FLU a MON nevykazuje téměř žádné účinky na ISE kmen při této koncentraci. Za povšimnutí jistě také stojí fakt, že flubendazol působil o něco více na rezistentní kmen WR než na ISE. Závislost líhnutí vajíček lze zobrazit také graficky
39
Obr. 6. Závislost líhnutí vajíček na koncentraci flubendazolu u kmenu ISE
Obr. 7. Závislost líhnutí vajíček na koncentraci thiabendazolu u kmene ISE
40
Obr. 8. Závislost líhnutí vajíček na koncentraci monepantelu u kmene ISE
Obr. 9. Závislost líhnutí vajíček na koncentraci flubendazolu u kmene WR
41
Obr. 10. Závislost líhnutí vajíček na koncentraci thiabendazolu u kmene WR
Obr. 11. Závislost líhnutí vajíček na koncentraci monepantelu u kmene WR Díky testu líhnutí vajíček můžeme dále určit hodnoty LD50 a LD99. LD neboli „lethal dose“ je dávka, která zabrání líhnutí 50 či 99% vajíček. Čím menší je smrtelná dávka, tím toxičtěji daná látka působí.
42
Tab. 11 Hodnoty LD50 a LD99
ISE
WR
Anthelmintika THIA FLU MON THIA FLU MON
LD50 (µg/ml) 0,0109 0,5028 2,4833 0,057 0,3640 1,7742
LD99 (µg/ml) 1,0332 2,2837 25,6418 3,1527 2,4098 11,6709
Ze zjištěných údajů je nejvíce účinný thiabendazol. Jak již bylo řečeno, k tomuto anthelmintiku jsou citlivá vajíčka kmenu ISE. Dále má také nejnižší hodnotu LD50 a LD99, a to u obou testovaných kmenů H. contortus.
43
6. DISKUZE Hemonchóza je onemocnění, které způsobuje gastrointestinální parazit, vlasovka slézová (Haemonchus contortus). Patří mezi nejrozšířenější a nejzávažnější choroby, které mohou postihovat malé přežvýkavce (Angulo-Cubilán 2007). Jestliže parazit napadne chov, dochází ke značným ekonomickým ztrátám. Může způsobovat závažné anemie, obtíže při trávení a vstřebávání potravy. To se dále odráží na snížené produkci mléka, úbytku váhy dobytka i úmrtí napadených zvířat, často mladých kusů. Infekce je rozšířena nejvíce v tropických a subtropických oblastech, které poskytují příhodné podmínky pro šíření choroby v období dešťů (Ghisi a kol. 2007, Getachew a kol. 2007).
V dnešní době se proti hemonchóze využívají širokospektrá anthelmintika. Mezi nejběžnější spadají benzimidazoly, makrocyklické laktony a imidazothiazoly, je však možnost využít i jiných skupin. Tato léčiva se nepodávají pouze napadenému dobytku, ale podávají se též jako preventivní prostředek, hlavně v teplých oblastech v období s očekávaným nárůstem parazitů.
Časté a ne vždy správné využívání anthelmintik vede ke vzniku rezistence. Podáváním nižších dávek léčiva je umožněno přežívat pouze odolnějším parazitům. Ti se dále mohou množit a tímto způsobem je rezistence šířena mezi další generace. Díky velkému počtu vajíček a rychlému dospívání H. contortus dochází k rozvoji rezistence poměrně rychle. Rozšířením rezistence i na jiné skupiny anthelmintik se již setkáváme s vícečetnou lékovou rezistencí (Prichard 2001, Silvestre, Humbert 2002).
Jsou známé dva základní mechanismy rezistence, farmakokinetické a farmakodynamické. Tyto dva mechanismy se mohou slučovat. Rezistence na BZD je dána záměnou fenylalaninu za tyrosin na 200. kodonu pro β-tubulin isotypu 1. Díky této změně je zabráněno navázání se benzimidazolů na β-tubulin, což způsobí neúčinnost léčiva.
44
Tato práce se zabývá zastoupením rezistentních a citlivých alel u kmene ISE (citlivý) a WR a BR (rezistentní kmeny). U ISE kmenu je dále porovnáván stav před a po léčbě flubendazolem. Po izolaci byly vzorky podrobeny analýze na PCR a také byla provedena elektroforéza. Použití elektroforézy nebylo v řadě případů ideální, jelikož výsledky získané z elektroforézy nebyly vždy příliš jednoznačné. U některých ze vzorků se vyskytlo větší množství produktů, což je nejspíše způsobeno fragmentací DNA v důsledku nesprávného skladování vzorků. Před izolací nejspíše došlo k opakovanému rozmražení a opětovnému zmražení testovaných červů.
Problémem molekulárních testů je určení jediné mutace, proto vzniká-li rezistence spojením více faktorů, nejsme ji schopni odhalit jedním testem (Coles 2005). V této práci byla dokazována mutace na 200. kodonu, která je zodpovědná za neúčinnost benzimidazolů.
Metodou PCR byl zjišťován poměr citlivé a rezistentní alely u H. contortus. Citlivá populace je charakteristická vysokým procentem citlivých homozygotů (SS) případně heterozygotů (Sr). V případě značného výskytu rezistentních homozygotů (rr) mluvíme o rezistentních kmenech (Elard a kol. 1999). Výsledky této práce potvrzují, že ISE kmen patří do kategorie citlivých na benzimidazoly. Zastoupení citlivých homozygotů se pohybuje přes 60%, naproti tomu homozygoti rezistentní se vyskytli v pouhých 4%. Námi získané výsledky se shodují s literaturou, kdy Álvarez-Sánchéz a kol. (2005) uvádí u citlivých kmenů H. contortus 60,5% citlivých homozygotů. Procentuální výskyt citlivé alely uvádí 76% a rezistentní 24%. Výsledky této práce ukazují 71% citlivé alely a 29% rezistentní. V této práci bylo provedeno také měření pro citlivý kmen, který byl předem podroben léčbě flubendazolem. V porovnání s červy neovlivněnými léčbou nejsou zaznamenány výrazné změny v zastoupení alel. Došlo ke zvýšení rezistentních homozygotů, ale stejně tak i citlivých. Pro výraznější změnu by byla potřeba časově delší léčba.
45
Za rozvojem rezistence stojí ve větší míře selekční tlak léčiv. Z počátku vývoje odolnosti na léčiva se v populaci vyskytuje rezistentní alela pouze výjimečně. Avšak opětovným podáváním anthelmintik stejného druhu se rezistence prohlubuje a tento stav není zastavitelný. Největším problémem je poddávkování léčených jedinců, kdy dochází k přežití pouze odolných parazitů, množení mezi sebou a rozšiřování rezistentní alely do dalších generací (Beech a kol. 1994, Humbert a kol. 2001). Beech a kol. (1994) ve své práci uvádí, že alela, která má za následek neúčinnost benzimidazolových léčiv u H. contortus, se v této populaci vyskytovala již v době před uvedením těchto anthelminitik na trh. Alela, která je v dnešní době značně rozšířená, byla původně raritní. Za nynější rozsah rezistence na BZD je zodpovědné neuvážené používání těchto léčiv, nestřídání s jinými a jejich nesprávné dávkování. Výraznější rozdíly ve srovnání s literaturou lze pozorovat u rezistentních kmenů. Tato práce hodnotila kmen WR a BR. Kmen BR se vyznačuje vyšším zastoupením rezistentních homozygotů (68%). Ve srovnání s ním je velmi výrazný nulový výskyt tohoto genotypu u kmene WR, který se v našem případě vyskytoval převážně ve formě heterozygotů. Álvarez-Sánchéz a kol. (2005) uvádí u rezistentních kmenů H. contortus výskyt citlivé alely 28,7%, rezistentní 71,3%. Pro kmen BR zde byla zjištěna hodnota 42,86% pro citlivou a 57,14% pro rezistentní alelu. U kmene rezistentního na všechna anthelmintika je výskyt citlivé alely poněkud vyšší a to 52,78%. Tyto hodnoty jsou oproti výsledkům, které naměřil Álvarez-Sánchez a kol. (2005) poněkud odlišné. Tento rozdíl může být dán relativně malým množstvím vzorků, které byly podrobeny analýze. Álvarez-Sánchéz a kol. (2005) podrobil stejnému měření jako H. contortus také druh Teladorsagia circumcincta, který též patří mezi gastrointestinální nematoda. U citlivého kmenu na benzimidazoly byl naměřen 70,7% výskyt citlivé alely. Avšak u rezistentního je tato alela zastoupena v pouhých 13,7% na rozdíl od H. contortus, kde je tato hodnota zhruba dvojnásobná. Rezistentní kmen T. circumcincta má i vyšší procentuální výskyt rezistentních homozygotů (71%).
Dále se tato práce zaměřila na účinnost anthelmintik vůči vajíčkům H. contortus. Nevýhodou EHT oproti PCR je neschopnost detekce rezistence do doby, kdy zkoumaná populace dosáhne alespoň 25% rezistentních jedinců (Humbert a kol. 2001). Na rozdíl od PCR není zaměřena na jedinou mutaci, která vede ke vzniku 46
rezistence, je proto možné hodnotit rozvoj rezistence v populaci nezávisle na množství mechanismů tvořících odolnost na anthelmintika. Metoda EHT je zaměřená pouze na zhodnocení účinnosti anthelmintik na vajíčka. Proto není možné z výsledků tohoto testu vytvářet závěry o rezistenci pro všechna vývojová stadia H. contortus. U citlivého kmenu (ISE) byl proveden test líhnutí vajíček, ze kterého byly získány výsledky ukazující na citlivost kmene pouze v případě thiabendazolu. Dle tohoto testu H. contortus není citlivý na flubendazol a monepantel. Rezistentní formy H. contortus jsou určeny podmínkou, že při koncentraci anthelmintika 0,1 μg.ml-1 dojde k vylíhnutí více jak 10% vajíček. Dospělé formy tohoto kmene však jsou citlivé na benzimidazoly, mezi které flubendazol také patří, což bylo prokázáno PCR metodou. Rezistentní kmen (WR), u kterého se nevylíhlo 68,98% vajec, nevykazuje citlivost vůči žádnému zkoušenému anthelmintiku. To potvrzuje i jiná studie (Álvarez-Sánchéz a kol. 2005), která uvádí pro odolný kmen působením thiabendazolu 77,43% nevylíhnutých vajíček. U citlivého kmene nebylo vylíhnuto 97,82% vajíček, oproti tomu v této práci se nevylíhlo 90,5%. Obě tyto hodnoty dokazují citlivost vůči thiabendazolu. Dále byly vypočítávány smrtelné dávky pro 50% populace. Hodnota LD50 nám udává množství látky, které je nutné pro zamezení líhnutí 50% vajíček. Čím je tato hodnota nižší, tím je látka účinnější. Množství anthelmintika pro flubendazol a monepantel jsou u rezistentního kmene nižší než u citlivého. Dalo by se spíše předpokládat, že tomu bude naopak. Z těchto výsledků vyplývá, že rezistentní kmen WR je vůči flubendazolu a monepantelu vnímavější než citlivý. K thiabendazolu je citlivější kmen ISE. Vyšší citlivost rezistentního kmene k monepantelu oproti citlivému kmeni je patrná i z hodnot LD99. V případě LD99 pro flubendazol však není mezi rezistentním a citlivým kmenem téměř žádný rozdíl, což znamená, že vývoji 99% vajíček rezistentního kmene je zabráněno téměř stejnou koncentrací léčiva jako u citlivých jedinců Poměrně časté jsou práce, ve kterých je prováděn test vývoje larev (LDT). Po inkubaci v anthelminticích různých koncentrací je pozorováno zastoupení nevylíhnutých vajíček a larev ve stádiu L1-L3. Výsledky této metody jsou uváděny hodnotami koncentrací, při které nedojde k vývinu 50% (LC50) nebo 99% (LC99) L3 larev (Várady a kol. 2007). Tuto metodu využila ve své práci Bártíková a kol. 47
(2010). Byl zde proveden test u citlivého a rezistentního kmene, přičemž jako anthelmintikum zde byl použit thiabendazol, flubendazol a dále redukovaný a hydrolyzovaný flubendazol. Hodnoty LC pro flubendazol byly v této práci zjištěny nižší než pro THIA a to jak u citlivého, tak rezistentního kmene. Hodnoty, které byly naměřeny pro citlivý kmen a thiabendazol se shodují s výsledky práce, kterou provedl Várady a kol. (2006). Tento test byl použit i v práci Várady a Čorba (1999), ale zde se výsledky různí nejen u rezistentní formy, ale také u citlivého kmenu. Várady a kol. (2007) a Álvarez-Sánchéz a kol. (2005) ve svých pracích neuvádí hodnoty LD50, ale ED50. Tato hodnota nám značí potřebné množství anthelmintika, aby bylo dosaženo účinku u 50% populace. Hodnoty vyjadřují účinnost thiabendazolu a byly využity citlivé i rezistentní kmeny H. contortus. Várady u rezistentního kmene měří citlivost H. contortus ze čtyř rozdílných chovů, stejně jako i u citlivého kmene. Hodnoty ED50 u odolných zástupců nepřekročily mez 0,5 µg/ml, u citlivých 0,05 µg/ml, což odpovídá i výsledkům získaným v našich experimentech. Álvarézova práce s hodnotami pro rezistentní kmen 0,17 µg/ml a citlivý 0,039 µg/ml vyhovuje údajům získaným Váradym.
48
7. ZÁVĚR Haemonchus contortus představuje v dnešní době velké problémy pro chovy ovcí a koz. Vyskytuje se u něj značná rezistence na anthelmintika, která jsou používána pro léčbu, ale i prevenci. Z tohoto důvodu je nutné vznik a rozvoj rezistence studovat. Tato práce využila tří kmenů H. contortus, rezistentní kmeny WR a BR a citlivý ISE. Z anthelmintik bylo využito flubendazolu, thiabendazolu a monepantelu. Dalšími testovanými jedinci byli zástupci citlivého kmene ISE, kteří byli přeléčeni třemi dávkami flubendazolu. Provedením PCR bylo zjišťováno zastoupení alel u jednotlivých kmenů H. contortus. Dále bylo zkoumáno, zda se složení alel změní v důsledku léčby, tzv. selekčním tlakem. Citlivá alela je nejvíce zastoupena u citlivého kmene ISE. Rozdíl mezi červy, u kterých proběhla a neproběhla léčba, nebyl pozorován. Nejvyšší podíl rezistentní alely byl zaznamenán u kmene, který je odolný vůči benzimidazolům (BR). Citlivých homozygotů se opět nejvíce vyskytuje u ISE kmene, rezistentních homozygotů se zde vyskytuje zanedbatelně. WR kmen, který je odolný vůči všem anthelmintikům, se v námi zkoumané populaci vyskytoval nejčastěji ve formě heterozygotů, rezistentní homozygot u WR kmene nebyl zaznamenán. Test líhnutí vajíček byl prováděn se třemi anthelmintiky a to FLU, THIA a MON. Byl testován multirezistentní kmen WR a citlivý kmen ISE. Podmínkám citlivosti, které jsou dány minimálně 90% nevylíhlých vajíček při koncentraci anthelmintika 0,1 μg.ml-1, vyhověl pouze kmen ISE při léčbě thiabendazolem.
49
8. SEZNAM ZKRATEK BR
kmen rezistentní na benzimidazoly
BZD
Benzimidazoly
EHT
test líhnutí vajíček
FECRT
test redukce počtu vajíček v trusu
FLU
Flubendazol
GABA
Gama-aminomáselná kyselina
ISE
kmen citlivý na běžná anthelmintika
LD50
smrtelná dávka pro 50% populace
LD99
smrtelná dávka pro 99% populace
LDT
test vývoje larev
MON
Monepantel
PCR
polymerázová řetězcová reakce
Phe
Fenylalanin
THIA
Thiabendazol
Tyr
Tyrosin
WR
kmen rezistentní na běžná anthelmintika
50
ZDROJE Abbott K. A., Taylor M., Stubbings L. A.. Sustainable worm control strategies for sheep. Context Publication 2012, ISBN 0-9547447-4-8 Alberts B., Bray D., Johnson A., Lewis J ., Raff M., Roberts K., Walter P. Základy buněčné biologie – Úvod do molekulární biologie buňky. Ústí nad Labem: Espro Publishing, 2006, ISBN 80-902906-2-0 Álvaréz-Sanchéz M. A., Pérez-García J., Cruz-Rojo M. A., Rojo-Vázquez F. A. (2005): Real time PCR for the diagnosis of benzimidazole resistance in trichostrongylids of sheep. Veterinary Parasitology 129, 291 - 298 Angulo-Cubillán F. J., García-Coiradas L., Coquerella M., de la Fuente C., Alunda J. M. (2007): Haemochus contortus – Sheep Relationship: a review. Revista Cientifica, FCVLU 17 (6), 577 – 587 Bártíková H., Skálová L., Lamka J., Szotáková B., Várady M. (2010): The effects of flubendazole and its metabolites on the larval development of Haemochus contortus ((Nematoda: Trichostrongylidae): an in vitro study. Helminthologia 47, 269 – 272 Beech R. N., Prichard R. K., Scott M. E. (1994): Genetic variability of the β-tubulin genes in benzimidazole-susceptible and –resistant strains of Haemonchus contortus. Genetics 138, 103 – 110
Coles G. C., Jackson F., Pomroy W. E., Prichard R. K., von Samson-Himmelstjerna G., Silvestre A., Taylor M. A., Vercruysse J. (2006): The detection of anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance. Veterinary Parasitology 136, 167 – 185 Cvilink V., Kubíček V., Nobilis M., Křížová V., Szotáková B., Lamka J., Várady M., Kuběnová M., Novotná R., Tabelová M., Skálová L. (2008): Biotransformation of
51
flubendazole and selected model xenobiotics in Haemochus contortus. Veterinary Parasitology 151, 242 – 248 Dobšíková R., Široká Z., Blahová J. Farmakologie v produkci potravin. Brno: Veterinární a farmaceutická fakulta Brno, 2012, ISBN 978-80-7305-616-2
Elard L., Cabaret J., Humbert J. F. (1999): PCR diagnosis of benzimidazolesusceptibity or –resistance in natural populations of the small ruminant parasite, Teladorsagia circumcinata. Veterinary Parasitology 80, 231 – 237
Fawley N. W., Wilcox M. H. (2005): Molecular diagnostic techniques. The Medicine Publishing Company
Getachew T., Dorchies P., Jacquiet P. (2007): Trends and challenges in the effective and sustainable control of Haemonchus contortus infection in sheep. Review. Parasite 14, 3 – 14 Ghisi M., Kaminsky R., Mäser P. (2007): Phenotyping and genotyping of Haemonchus contortus isolates reveals a new putative candidate mutation for benzimidazole resistance in nematodes. Veterinary Parasitology 144, 313 – 320
Huang M., Arnheim N., Goodman M. F. (1992): Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Research 20 (17), 4567 – 4573
Humbert J. F., Cabaret J., Elard L., Leignel V., Silvestre A. (2001): Molecular approaches to studying benzimidazole resistance in trichostrongylid nematode parasites of small ruminates. Veterinary Parasitology 101, 405 – 414 Jíra J. Lékařská helminotologie, Helmintoparazitární nemoci. Praha: Galén, 1998. ISBN 80-85824-82-5
Kaplan M. R. (2004): Drug resistance in nematodes of veterinary importance: a status report. Trends in Parasitology 20 (10), 477 -481 52
Kaufmann J.: Parasitic Infections of Domestic Animals: a diagnostic manual. Basel: Birkhäuser Verlag, 1996. ISBN 3-7643-5115-2
Kotze A. C., Coleman G. T., Mai A., McCarthy J. S. (2005): Field evaluation of anthelmintic drug sensitivity using in vitro egg hatch and larval motility assays with Necator americanus recovered from human clinical isolates. International Journal for Parasitology 35, 445 – 453 Lamka J., Ducháček L. Veterinární léčiva pro posluchače farmacie. Praha: Karolinum, 2008. ISBN 978-80-246-1243-0
Prichard R. K. (2001): Genetic variability following selection of Haemonchus contortus with anthelimintic. Trends in Parasitology 17, 445 - 453
Sangster N. C. (1999): Anthelmintic resistance: past, present and future. International Journal for Parasitology 29, 115 – 124
Silvestre A., Humbert J. F. (2002): Diversity of benzimidazole-resistance alleles in populations of small ruminant parasites. International Journal for Parasitology 32, 921 928
van Wyk J. A., Bath G. F. (2002): The FAMACHA system managing haemonchosis in sheep and goats by clinically identifying individual animals for treatment. Veterinary Research 33, 509 – 529 Várady M., Čorba J. (1999): Comparison of six in vitro tests in determining benzimidazole and levamisole restistance in Haemonchus contortus and Ostertagia circumcincta of sheep. Veterinary Parasitology 80, 239 – 249 Várady M, Čerňanská D., Čorba J. (2006): Use two in vitro methods for the detection of anthelmintic resistant nematode parasites on Slovak sheep farms. Veterinary Parasitology 135, 325 – 331
53
Várady M., Čudeková P., Čorba J. (2007): In vitro detection of benzimidazole resistance in Haemonchus contortus: Egg hatch test versus larval development test. Veterinary Parasitology 149, 104 – 110 Vokřál I., Bártíková H., Prchal L., Stuchlíková L., Skálová L., Szotáková B., Lamka J., Várady M., Kubíček V. (2012): The metabolism of flubendazole and the activites of selected biotransformation enzymes in Haemonchus contortus strains susceptible and resistant to anthelmintics. Parasitology 139, 1309 – 1316
Wolstenholme A. J., Fairweather I., Prichard R., von Samson-Himmelstjerna G., Sangster N. C. (2004): Drug resistance in veterinary helminths. Trends in Parasitology 20 (10), 469 - 476
Internetové zdroje
Sendow J. (2003): ADW: Haemonchus contortus: INFORMATION [online]. Animal Diversity Web. [cit 2013-02 -21] Dostupné z: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/site/accounts/information/Haemonchus_contort us.html
54
