UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ
Katedra biochemických věd
VLIV FLAVONOIDŮ IN VITRO NA AKTIVITU VYBRANÝCH BIOTRANSFORMAČNÍCH ENZYMŮ VE STŘEVNÍCH BUNĚČNÝCH LINIÍCH
Diplomová práce
Vedoucí diplomové práce: Doc. Ing. Barbora Szotáková, Ph.D. Hradec Králové 2014
Petra Pokorná
Prohlášení: ,,Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu.“ ……………………………
Poděkování: Na tomto místě bych chtěla poděkovat především své školitelce Doc. Ing. Barboře Szotákové, Ph.D., za ochotu, odborné vedení, podnětné rady a připomínky při psaní této diplomové práce. Dále děkuji všem pracovníkům na Katedře biochemických věd Farmaceutické fakulty v Hradci Králové Univerzity Karlovy v Praze za ochotu pomoci a realizaci experimentální části této práce.
ABSTRAKT
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Petra Pokorná Školitel: Doc. Ing. Barbora Szotáková, Ph.D. Název
diplomové
práce:
Vliv
flavonoidů
in
vitro
na
aktivitu
vybraných
biotransformačních enzymů ve střevních buněčných liniích
Anthokyany se řadí mezi flavonoidní látky, které patří mezi hlavní přírodní barviva v rostlinách. Jsou považovány za velmi prospěšné pro lidský organismus. Anthokyany jsou hojně konzumovány prostřednictvím ovoce, zeleniny a červeného vína, a představují významné složky doplňků stravy. Obliba potravních doplňků s vysokými koncentracemi flavonoidů se stále zvyšuje, ale kromě pozitivního vlivu na lidské zdraví mohou také mít nežádoucí účinky – ovlivňovat enzymy metabolizující léčiva a tím ovlivňovat jak žádoucí, tak i nežádoucí účinky řady léčiv. V této diplomové práci se zkoumal in vitro vliv některých anthokyanidinů (cyanidin, delfinidin, malvidin, pelargonidin) na proliferaci střevní buněčné linie Caco2 za použití testu metabolické aktivity (MTT) a stanovení integrity plazmatické membrány buněk (neutrální červeň), a dále se sledoval jejich vliv na aktivitu vybraných biotransformačních enzymů: glutathion-S-transferasy (GST), karbonylreduktasy (CBR), UDP-glukuronosyltransferasy (UGT) a cytochromů P450 (CYP). Výsledky ukázaly, že uvedené anthokyanidiny kromě malvidinu nemají vliv na proliferaci střevní linie Caco-2. Malvidin snižoval proliferaci buněk v závislosti na koncentraci. Dále anthokyanidiny působily inhibičním vlivem na GST. Nejsilnější inhibitor GST byl pelargonidin. Aktivitu CBR inhibovaly delfinidin a pelargonidin. Naopak malvidin a cyanidin spíše aktivitu CBR indukovaly. Aktivita UGT a CYP v mikrosomech kontrolních ani ovlivněných buněk Caco-2 nebyla prokázána.
ABSTRACT
Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Petra Pokorná Supervisor: Doc. Ing. Barbora Szotáková, Ph.D. Title of diploma thesis: In vitro effect of flavonoids on activity of selected biotransformation enzymes in intestinal cell lines
Anthocyanins belong to a class of flavonoids which are part of major natural pigments in plants. They are considered to be very beneficial for the human organism. Anthocyanins are widely consumed as fruits, vegetables and red wine and they represent significant constituents of dietary supplements. The popularity of dietary supplements with high concentrations of flavonoids is still increasing, but in addition to positive effects on human health it can also have side effects influence drug metabolizing enzymes and thus affect either desirable or undesirable effects of many drugs. In this thesis in vitro effect of some anthocyanidins (cyanidin, delphinidin, malvidin, pelargonidin) on the proliferation of the intestinal cell line Caco-2 was investigated using the assay of metabolic activity (MTT) and determination of the integrity of the cytoplasmic membrane of cells (neutral red). Then was studied their effect on the activity of selected biotransformation enzymes: glutathione S-transferase (GST),
carbonyl
reductase
(CBR),
UDP-glucuronosyltransferase
(UGT)
and
cytochrome P450 (CYP). Results showed that tested anthocyanidins except malvidin have no effect on the proliferation of intestinal cell line Caco-2. Malvidin decreased cell proliferation in concentration-dependent manner. Furthermore, anthocyanidins inhibited the activity of GST. Pelargonidin was the most potent inhibitor of GST. Delphinidin and pelargonidin inhibited the activity of CBR. Conversely, malvidin and cyanidin increased the activity of CBR. The activity of CYP and UGT in control and treated microsomes of Caco-2 cells has not been detected.
OBSAH 1 ÚVOD ......................................................................................................................... 9 2 TEORETICKÁ ČÁST .............................................................................................. 10 2.1 FLAVONOIDY ................................................................................................. 10 2.2 ANTHOKYANY ............................................................................................... 12 2.2.1 Chemická struktura..................................................................................... 12 2.2.2 Biosyntéza anthokyanů ............................................................................... 14 2.2.3 Stabilita a zbarvení anthokyanů.................................................................. 16 2.2.4 Výskyt ........................................................................................................ 17 2.2.5 Biologická dostupnost ................................................................................ 18 2.2.6 Biologické účinky na lidský organismus .................................................... 19 2.3 BIOTRANSFORMAČNÍ ENZYMY ................................................................ 23 2.3.1 Cytochromy P450 ....................................................................................... 23 2.3.2 Karbonylreduktasa ...................................................................................... 25 2.3.3 UDP-glukuronosyltransferasa .................................................................... 25 2.3.4 Glutathion-S-transferasa ............................................................................. 25 2.3.5 Anthokyany a biotransformační enzymy.................................................... 26 2.4 BUNĚČNÉ LINIE ............................................................................................. 27 3 CÍLE PRÁCE ............................................................................................................ 29 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST .................................................................................... 30 4.1 MATERIÁL, PŘÍSTROJE, POMŮCKY, CHEMIKÁLIE ............................... 30 4.1.1 Biologický materiál .................................................................................... 30 4.1.2 Přístroje ...................................................................................................... 30 4.1.3 Pomůcky ..................................................................................................... 31 4.1.4 Chemikálie.................................................................................................. 31 4.2 METODIKA ...................................................................................................... 32 4.2.1 Kultivace buněčných linií Caco-2 .............................................................. 32 4.2.1.1 Příprava kultivačního média pro Caco-2 ........................................... 32 4.2.1.2 Příprava fosfátového pufru s NaCl (PBS) .......................................... 32 4.2.1.3 Kultivace buněčné linie ...................................................................... 32 4.2.1.4 Pasážování buněk linie Caco-2 .......................................................... 33
7
4.2.2 Test cytotoxicity – barvení neutrální červení (Neutral Red uptake (NRU) test) ............................................................................................................. 33 4.2.3 Test cytotoxicity – MTT test ...................................................................... 36 4.2.4 Ovlivňování buněčných linií testovanými látkami ..................................... 37 4.2.5 Příprava subcelulárních frakcí .................................................................... 38 4.2.6 BCA stanovení bílkoviny ........................................................................... 39 4.2.7 Stanovení aktivity glutathion-S-transferasy ............................................... 41 4.2.8 Stanovení aktivity karbonylreduktasy pomocí menadionu ........................ 42 4.2.9 Stanovení aktivity UDP-glukuronosyltransferasy ...................................... 44 4.2.10 Stanovení aktivity jednotlivých isoforem cytochromu P450 ..................... 46 5 VÝSLEDKY ............................................................................................................. 49 5.1 Testování vlivu anthokyanidinů na buňky Caco-2 ............................................ 49 5.2 Stanovení koncentrace bílkovin......................................................................... 55 5.3 Testovaní vlivu anthokyanidinů na specifickou aktivitu GST .......................... 57 5.4 Testovaní vlivu anthokyanidinů na specifickou aktivitu CBR .......................... 59 5.5 Testovaní vlivu anthokyanidinů na specifickou aktivitu UGT .......................... 61 5.6 Testovaní vlivu anthokyanidinů na specifickou aktivitu CYP .......................... 62 6 DISKUZE ................................................................................................................. 64 7 ZÁVĚRY .................................................................................................................. 68 8 SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ A ZKRATEK .............................................. 69 9 SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ .......................................................................... 71
8
1
ÚVOD
Mezi významné flavonoidní látky patří také anthokyany. Jedná se o přírodní rostlinná barviva, která se dostávají do lidského organismu s konzumovanou potravou. Nacházejí se hojně v ovoci, zelenině a červeném víně. V potravinářském průmyslu se využívají ke zvýšení stability či intenzity zabarvení různých výrobků. Dnes jsou také spojovány s výraznými pozitivními účinky na lidské zdraví. Zkoumají se především jejich antioxidační účinky, které by jim dávaly potenciální roli v prevenci různých onemocnění souvisejících s oxidačním stresem. Na základě prospěšných účinků anthokyanů roste zájem je přijímat ve zvýšené míře také jako potravní doplňky. Zvýšená koncentrace anthokyanů v organismu může ovlivnit aktivitu biotransformačních enzymů, které se podílejí jak na jejich metabolismu, tak na biotransformaci současně podávaných léčiv. Případné účinky na tyto enzymy by mohly způsobit nežádoucí účinky v podobě lékových interakcí a selhání farmakoterapie daného pacienta. V této diplomové práci jsme se zaměřili na sledování vlivu anthokyanidinů, neboli aglykonů anthokyanů, na proliferaci střevní buněčné linie Caco-2 a na jejich vliv na aktivitu biotransformačních enzymů této linie. Pro experimenty jsme použili nejčastěji se vyskytující anthokyanidiny: cyanidin, delfinidin, malvidin a pelargonidin.
9
2
TEORETICKÁ ČÁST
2.1
Flavonoidy Flavonoidy patří k polyfenolickým látkám, které jsou tvořeny jako sekundární
metabolity v rostlinách. V lidské stravě se nejčastěji vyskytují v ovoci, zelenině, vínu, čaji a kakau (Heim et al. 2002). K naleznutí jsou v různých orgánech rostlin, jako jsou stonky, květy, kořeny a kůra rostlin (Middleton 1998). Zájem o poznávání těchto přírodních látek roste pro svůj zřejmý prospěšný účinek na lidské zdraví. Studie ukazují, že by jejich příjem v potravě mohl být spojen se sníženým rizikem vzniku kardiovaskulárních a některých nádorových onemocnění (Slanina a Táborská 2004). Různé in vitro a in vivo experimenty ukázaly, že vybrané flavonoidy
mají
antialergické,
protizánětlivé,
antivirové,
antioxidační
a antikarcinogenní účinky (Middleton 1998). Flavonoidní látky obsahují ve své struktuře cyklický skelet tzv. flavan, který je zobrazen na obrázku 1. Ten se skládá ze dvou substituovaných benzenových kruhů (A a B) a pyranového kruhu (C) (Velíšek 1999).
Obr. 1: Struktura flavanu (Velíšek 1999) Jednotlivé flavonoidy se od sebe liší substitucí na všech třech kruzích. Substituenty mohou být methoxylové či hydroxylové skupiny. Podle stupně oxidace tříuhlíkatého řetězce spojující kruh A a B se mohou flavonoidy rozlišit do několika strukturních tříd (Obr. 2) (Velíšek 1999):
10
katechiny
flavanony
flavanonoly
flavony
flavonoly
anthokyanidiny
Obr. 2: Obecná struktura flavonoidních látek (Velíšek 1999) V potravinách se vyskytují především jako glykosidy a polymery, které jsou rozložitelné ve větší míře v trávicím traktu (Heim et al. 2002).
11
2.2
Anthokyany Nejprominentnější mezi flavonoidy jsou anthokyany – univerzální rostlinná, ve
vodě rozpustná, barviva odpovědná za červené, fialové a modré odstíny obsažená v mnoha druzích ovoce, zeleniny, obilných zrn a květin. Využívají se jako potravinářská barviva v průmyslu díky schopnosti zvyšovat intenzitu zabarvení výrobku. Anthokyany (název vycházející z řeckého spojení slov anthos = květina a kianos = modrá) využívali lidé už před mnoha staletími. Objevovaly se v tradičních rostlinných přípravcích používaných severoamerickými indiány, Evropany a Číňany. Používali sušené listy, plody (bobule), kořeny či semena a léčili jimi různorodé patologické stavy jako vysoký krevní tlak, horečku nebo nachlazení, poruchy funkce jater, úplavici a průjem či onemocnění močových cest. Údajně měly dokonce přinášet zlepšení zraku a krevního oběhu (Konczak a Zhang 2004, Pazmiño-Durán et al. 2001).
2.2.1
Chemická struktura Základní
strukturou
anthokyanů
jsou
jejich
aglykony
nazývané
anthokyanidiny. Jedná se tedy o glykosidy polyhyhydroxy a polymethoxy derivátů 2fenylbenzopyriliového neboli flavyliového kationtu. Flavyliový kation tvoří aromatický kruh A, který je přes tři uhlíky heterocyklického kruhu C obsahujícího kyslík spojen s dalším aromatickým kruhem B. Dále se skládají z cukerné složky a v mnoha případech obsahují acylovou skupinu. V dnešní době je identifikováno přes 700 anthokyanových molekul (Wallace a Giusti 2014). Ale v přírodě je běžně k naleznutí 6 těchto anthokyanidinů: cyanidin (50 %, z lat. Cyanus), delfinidin (12 %, z lat. Delphinium), malvidin (12 %, z lat. Malva), pelargonidin (12 %, z lat. Pelargonium), peonidin (7 %, z lat. Peonia) a petunidin (7 %, z lat. Petunia), tvořících 90 % této skupiny látek. Tyto struktury jsou zobrazeny na obrázku 3 a substituenty uvedeny v tabulce 1. Hlavní rozdíly mezi jednotlivými anthokyany jsou v počtu hydroxylových skupin či methoxyskupin, v povaze a počtu vázaných cukrů, alifatických či aromatických karboxylových kyselinách připojených na cukernou část molekuly, a v polohách těchto vazeb (Kong et al. 2003, Velíšek 1999). 12
Obr. 3: Obecná struktura anthokyanidinů (Castañeda-Ovando et al. 2009)
Tab. 1: Struktura 6 nejčastějších anthokyanidinů vyskytujících se v přírodě (CastañedaOvando et al. 2009). Název
Substituce
anthokyanidinu
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
Cyanidin
OH
OH
H
OH
OH
OH
H
Delfinidin
OH
OH
H
OH
OH
OH
OH
Malvidin
OH
OH
H
OH
OMe
OH
OMe
Pelargonidin
OH
OH
H
OH
H
OH
H
Peonidin
OH
OH
H
OH
OMe
OH
H
Petunidin
OH
OH
H
OH
OMe
OH
OH
Anthokyanidiny jsou nejčastěji glykosylovány jedním či více cukernými zbytky. Tato cukerná složka zvyšuje jejich stabilitu a rozpustnost ve vodě. Samostatný anthokyanidin je velmi reaktivní a v této volné formě se v rostlinách vyskytuje jen zřídka. Nejběžnějším cukerným zbytkem je D-glukosa, méně často se objevuje Dgalaktosa a nejméně L-rhamnosa, D-xylosa a L-arabinosa. Ty se pak nachází nejen jako monoglykosidy, ale také jako di- nebo triglykosidy. Hlavní polohou glykosylace je primárně C3 poloha a následně poloha C5. Ačkoliv to není běžné, může se cukerný zbytek dále připojit k ostatním hydroxylovým skupinám v polohách C7, C3´, C5´ či C4´. Dále mohou být cukerné části anthokyanů acylovány aromatickými kyselinami (např. kyselina kumarová, kávová, ferulová, jantarová) nebo alifatickými kyselinami jako malonová, jablečná nebo šťavelová kyselina (Wallace a Giusti 2014).
13
2.2.2
Biosyntéza anthokyanů Anthokyany jsou sekundární metabolity rostlin. V syntéze flavonoidů mají roli
dvě hlavní syntetické dráhy, šikimátová a acetátová. Obě vycházejí z glukosy a dávají možnost vzniku dvěma důležitým produktům. Tyto prekurzory v syntéze flavonoidů, včetně anthokyanů, jsou malonyl-CoA a 4-kumaroyl-CoA (Říhová 2008). Jejich reakcí pomocí
chalkonsynthasy
se
tvoří
tetrahydroxychalkon
žlutého
zbarvení.
Tetrahydroxychalkon je rychle a stereospecificky isomerizován na bezbarvý naringenin chalkonisomerasou. Dále dochází k hydroxylaci tohoto flavanonu na dihydrokaempferol pomocí flavanon-3-hydroxylasy. Tento meziprodukt může být dále hydroxylován v pozici 3´ nebo v pozicích 3´ a 5´ na B kruhu. První možnost vede ke vzniku dihydrokvercetinu a k tvorbě pigmentů na základě cyanidinu. Druhou reakcí vzniká dihydromyricetin. Touto cestou dochází k tvorbě delfinidinových anthokyanů. Při syntéze pelargonidinu nedochází k hydroxylaci. Dále mohou být dihydroflavonoly redukovány pomocí dihydroflavonol-4reduktasy za vzniku leukoanthokyanidinů. Ty jsou bezprostředními prekurzory v syntéze anthokyanů. Touto cestou dochází také k tvorbě jiných flavonoidních látek jako katechinů nebo proanthokyanidinů. Enzym, který umožňuje tvorbu anthokyanidinů z leukoanthokyanidinů, se nazývá anthokyanidinsynthasa. Dalším důležitým enzymem v biosyntéze anthokyanů je flavonoid-3-Oglykosyltransferasa, který umožňuje glykosylaci hydroxylové skupiny v poloze 3 na kruhu C. Tato modifikace chemické struktury zvyšuje stabilitu a rozpustnost anthokyanidinů. Obecně anthokyanidiny jsou za fyziologických podmínek nestabilní a samostatně se v přírodě nevyskytují (Shijlen et al. 2004) (Obr. 4). Malvidin se syntetizuje cestou delfinidinu, kdy díky methylaci pomocí Omethyltransferasy v poloze 3´ nejprve vzniká petunidin a poté další methylací v poloze 5´ malvidin (Lücker et al. 2010).
14
Obr. 4: Hlavní cesta syntézy anthokyanů. PAL - fenylalaninamoniaklyasa; C4H - 4kumaryl-CoA-ligasa; 4CL - 4-kumaryl-CoA-ligasa; CHS - chalkonsynthasa; CHI chalkonisomerasa; F3H - flavanon-3-hydroxylasa; F3´H - flavonoid-3´-hydroxylasa; F3´5´H - flavonoid-3´,5´-hydroxylasa; DFR - dihydroflavonol-4-reduktasa; ANS anthokyanidinsynthasa; 3GT flavonoid-3-glykosyltransferasa; RT rhamnosyltransferasa; FNS – flavonsynthasa (Syntéza anthokyanů 2014) 15
2.2.3
Stabilita a zbarvení anthokyanů Fyzikálně-chemické vlastnosti anthokyanů jim propůjčují svou jedinečnou
barvu a stabilitu. Protože se nacházejí ve formě flavyliového kationtu, jejich stabilita je závislá na hodnotě pH, což ovlivňuje jejich zabarvení od červené až po modrou. Při vyšších hodnotách pH dochází k přeměně na žlutou formu chalkon. Podle hodnoty pH prostředí mohou anthokyany ko-existovat v pěti základních formách – flavyliový kation, karbinolová báze, chalkon, chinoidní báze, anion chinoidní báze (Obr. 5).
Obr. 5: Transformace anthokyanů v závislosti na pH prostředí (R1 a R2 = H, OH, CH3 nebo O-glykosyl) (Vliv pH na anthokyany 2012)
Mezi další faktory ovlivňující stabilitu anthokyanů patří kyslík, teplota, světelné záření, rozpouštědla a přítomnost enzymů. K degradaci může docházet i při procesech zpracování a skladování potravin (Fernandes et al. 2014). 16
Zabarvení anthokyanů dále ovlivňuje struktura. Se zvyšujícím se počtem hydroxylových skupin na kruhu B anthokyanidinů se zvyšuje vlnová délka absorpčního maxima ve viditelné oblasti. Pigmenty odvozené od pelargonidinu bývají oranžové, růžové nebo červené barvy. Delfinidinové pigmenty propůjčují fialovou nebo modrou barvu a cyanidinové pigmenty červenou (Shijlen 2004). Glykosidy jsou stabilnější než jejich aglykony (Velíšek 1999). V potravinářských výrobcích k zachování barvy se využívá interkopigmentace (interakce s jinými flavonoidními látkami) nebo intrakopigmentace (acylované formy). Kopigmentace je jev, při kterém se pigmenty spojují s jinými bezbarvými organickými sloučeninami nebo kovovými ionty. Mezi významné reakce patří zejména interakce s jinými flavonoidy, bílkovinami a polysacharidy. Toto spojení zvyšuje stabilitu flavyliového kationtu a může změnit či zintenzivnit barvu produktu. To je právě hojně využíváno v potravinářství, protože barva je jedním z hlavních faktorů vyjadřujících kvalitu výrobku (Castañeda-Ovando 2009). V potravinách se používají jako aditivní látky označené kódem E163 (Burešová a Pavelková 2011).
2.2.4
Výskyt Anthokyany se nachází v mnoha druzích ovoce a zeleniny, dále v mnoha
krytosemenných rostlinách a v dalších rostlinných tkáních. Jejich přítomnost byla nalezena i v nahosemenných rostlinách, kapradinách a některých mechorostech. Právě v mechorostech a kapradinách se vyskytují jako deoxyanthokyany v buněčných stěnách. Většinou jsou anthokyany v buňkách rovnoměrně rozpuštěny ve vakuolách. V jednotlivých rostlinných orgánech převládá jejich místo ve vnějších vrstvách jako je epidermis či palisádový a houbový mezofyl. Anthokyany se hojně vyskytují v Rubus species (bobule jako maliny a ostružiny), Vaccinium species (bobule jako brusinky, borůvka), jahodách, rybízu, červeném pomeranči, třešních a hroznovém víně. Dalšími zdroji v naší potravě mohou být červené víno, zelenina jako je červené zelí, sladké brambory, červená cibule, lilek či ředkev. Vysoký obsah anthokyanů je také k naleznutí v plodech palmy Acai (Euterpe oleracea, Arecaceae), sóji nebo kukuřice (Wallace a Giusti 2014, Horbowicz et al. 2008).
17
2.2.5
Biologická dostupnost anthokyanů Za biologickou dostupnost látek se považuje podíl požité dávky perorální
cestou, který se absorboval a dostal do krevního oběhu (Heaney 2001). V naší stravě jsou anthokyany zastoupeny ve velkém množství (Manach et al. 2005). Biologická dostupnost anthokyanů je ale obecně považována za nízkou. Anthokyany v mnoha studiích byly změřeny v plazmě a moči ve velmi nízkých koncentracích i po požití potravin či extraktů bohatých na anthokyany. Obvykle jsou nalezeny hladiny nižší než 1% přijaté dávky. I přes nízkou absorpci byly anthokyany objeveny v mnoha tkáních těla
(Wallace
a
Giusti
2014).
Anthokyany
mohou
také
přecházet
přes
hematoencefalickou bariéru (HEB) (Hribar a Ulrich 2014). Všeobecně platí, že absorpce a metabolismus anthokyanů jsou závislé na struktuře aglykonu a cukerné části (Bobinaitė a Viškelis 2013). Anthokyany se vyznačují rychlou absorpcí (Wallace a Giusti 2014). Maximální plazmatické koncentrace je dosaženo mezi 45 min až 4 hod po požití stravy bohaté na antokyany v závislosti na podmínkách experimentu. Tato pozorování vedla k poznatku, že antokyany jsou absorbovány nejen v horní části tenkého střeva, ale i v žaludku (Bobinaitė a Viškelis 2013). Možným mechanismem absorpce anthokyanů v žaludku je interakce s bilitranslokasou. Je to přenašeč nacházející se v plazmatické membráně jaterních buněk nebo právě v epiteliálních buňkách žaludku (Passamonti et al. 2002). Podle studií není nutná hydrolýza cukerné složky pro vstřebání anthokyanů z trávicího traktu. V lidské plazmě a moči byly opakovaně nalezeny některé glykosidy anthokyanidinů, např. cyanidin-3-glukosid a cyanidin-3,5-diglukosid. Glykosidy flavonoidů se pravděpodobně transportují do enterocytů pomocí glukosového přenašeče závislého na Na+ (sodium-dependent glucose cotransporter - SGLT1). V těchto střevních buňkách může pak dojít k hydrolýze glykosidů a k transportu do portální krve ve formě aglykonů či glykosidů (Slanina a Táborská 2004). V jejunu může docházet k hydrolýze anthokyanů různými hydrolasami a k absorpci fenolických aglykonů. Po prvním průchodu játry vstupují anthokyany do systémové cirkulace. V játrech jsou nejčastěji metabolizovány methylací, glukuronidací a sulfatací, a některé metabolity se mohou vrátit zpět do střev pomocí žluče. Metabolizované i metabolicky nezměněné anthokyany se mohou distribuovat do orgánů a tkání a být vyloučeny močí (Wallace a Giusti 2014). 18
Vzhledem k tomu, že je absorpce antokyanů nízká, většina z nich doputuje do tlustého střeva neporušená. Zde mohou být degradovány na fenolické kyseliny a aldehydy střevní mikroflórou (Bobinaitė a Viškelis 2013). Tyto produkty mohou představovat největší množství absorbovaných derivátů anthokyanů a přispět k prospěšným účinkům na zdraví, a to buď přímo v gastrointestinálním traktu, nebo až po vstřebání z tlustého střeva (Wallace a Giusti 2014). Hlavním metabolitem přeměny anthokyanů střevními bakteriemi je protokatechová kyselina (Bobinaitė a Viškelis 2013).
2.2.6
Biologické účinky na lidský organismus Z historického hlediska se potraviny bohaté na anthokyany využívaly
v tradičních léčivých přípravcích v mnoha kulturách. Anthokyany jsou dnes předmětem zájmu pro řadu zdraví podporujících účinků. Tyto přírodní látky jsou spojovány s ochranou proti mnohým nemocem, jako jsou kardiovaskulární onemocnění, metabolický syndrom, diabetes mellitus (DM) typu II, různé druhy rakoviny včetně gastrointestinálního traktu, problémy se zrakem, neurodegenerativní onemocnění, zánět, stárnutí pokožky a další zdravotní potíže (Wallace a Giusti 2014).
Antioxidační aktivita anthokyanů Anthokyany mají důležitou roli v rostlinné fyziologii, v opylení a rozptýlení semen. Kvůli jejich intenzivní barvě jsou potenciálními kandidáty jako přírodní barviva v potravinářském průmyslu. Nicméně, pozornost je také zaměřena na jejich antioxidační účinky, na možné prospěšné účinky na zdraví a vlastnosti v prevenci nemocí. Anthokyany byly dlouho považovány za silné antioxidanty. Efektivně zhášejí volné radikály. Tyto vlastnosti přinášejí příznivé účinky v prevenci kardiovaskulárních onemocnění, antikarcinogenní účinek, zlepšení kognitivních funkcí (Wallace a Giusti 2014). Dokonce anthokyanidiny ukázaly vyšší antioxidační aktivitu než vitaminy C a E (Castañedo-Ovando 2009). Za antioxidant podle Halliwella (2011) se považuje jakákoliv molekula, která chrání biologické cíle proti oxidačnímu poškození. Oxidační stres je závažná 19
nerovnováha mezi tvorbou reaktivních forem kyslíku a antioxidační ochranou ve prospěch reaktivních forem způsobujících oxidační poškození. V živých organismech se nachází nejčastěji reaktivní formy kyslíku (ROS) a reaktivní formy dusíku (RNS). Tyto skupiny tvoří volné radikály a některé neradikálové sloučeniny. Za volný radikál se považuje částice mající nepárový elektron, která je velmi reaktivní a málo stabilní. Jejich role je dvojí. Slouží k udržení homeostázy. Ale za určitých podmínek mohou být škodlivé a způsobovat výše zmiňovaný oxidační stres. Nadměrné množství ROS a RNS může poškozovat buněčné lipidy, proteiny nebo DNA a narušit jejich normální funkci. Oxidační stres je součástí patologie mnoha chronických a degenerativních nemocí, a věří se, že má roli v procesu stárnutí (Wallace a Giusti 2014). Erlejman et al. (2004) navrhuje tři důležité struktury přítomné ve flavonoidních látkách, které jsou zodpovědné za jejich antioxidační schopnost: 1) katecholová skupina na B kruhu, 2) dvojná vazba s 4-oxoskupinou na C kruhu, 3) přítomnost hydroxylových skupin na pozici 3 a 5. Ačkoliv anthokyany vykazují v různých in vitro testech vysoký antioxidační potenciál, je nepravděpodobné, že působí jako antioxidanty in vivo přímo reakcí s ROS a RON kvůli jejich extremně nízké absorpci a rychlému vylučování. Výjimkou z tohoto pravidla můžou být antioxidační účinky v gastrointestinálním traktu. Existují důkazy, které poukazují na to, že anthokyany jsou schopny regulovat expresi vícero genů a některé klíčové signální dráhy v odpovědi na oxidační stres in vivo. Tyto nepřímé antioxidační účinky jsou pravděpodobně hlavními mechanismy podporujícími preventivní účinky anthokyanů (Wallace a Giusti 2014).
Anthokyany v kardiovaskulárních onemocněních
Protizánětlivé a antioxidační účinky anthokyanů hrají rozhodující roli v ochraně proti kardiovaskulárním nemocem. Je třeba poznamenat že, ačkoliv výsledky z buněčných studií a studií na zvířatech prokazují prospěšné účinky, je náročné je aplikovat na lidi. Zánět je také spojován s několika nemocemi včetně obezity a DM typu II. Zánět, důležitá a přirozená součást lidské vrozené imunity, je ve skutečnosti ochranná odpověď, která pomáhá vytvářet bariéru proti škodlivým podnětům a zahájit procesy
20
obnovení k léčení tkání. Nicméně, nadměrná a nekontrolovatelná prozánětlivá činnost může poškozovat normální biologické systémy. Tuková tkáň je vysoce aktivní orgán, který vylučuje řadu peptidů jako prozánětlivé adipokiny, tumor nekrotizující faktor alfa (TNF-α) či C-reaktivní protein do těla. Vytváří se tak chronicky zánětlivé prostředí, které podporuje porušenou glukózovou toleranci, inzulinovou rezistenci a aterogenní činnosti. Ve studiích na zvířatech ovoce bohaté na anthokyany jako jahody a jeřabiny snižovaly C-reaktivní protein, interleukin-6, TNF-α, kromě markerů lipidové oxidace (Wallace a Giusti 2014). Role anthokyanů v protekci kardiovaskulárních onemocnění je spojena s ochranou proti oxidačnímu stresu. Anthokyany mohou poskytnout ochranu proti štěpení DNA, estrogenní aktivitu, inhibici enzymů, zvýšení produkce cytokinů (tedy regulaci imunitní odpovědi), protizánětlivou aktivitu, peroxidaci lipidů, snižování kapilární permeability a fragility, a posílení membrány. Zdá se, že inhibují enzymy podílející se na tvorbě ROS jako xanthinoxidasu, lipoxygenasu a NADPH-oxidasu. NADPH-oxidasa je považována za nejdůležitější zdroj superoxidu v cévních stěnách. Pro inhibici je významný benzenový kruh anthokyanů sousedící s methoxy, hydroxyskupinami jako má malvidin, peonidin, petunidin. Ochrana proti infarktu myokardu podáváním hroznové šťávy a vína byla silně vázaná na snížení zánětu, inhibici tvorby krevních destiček a zvýšení uvolňovaní oxidu dusnatého (Schewe et al. 2008). Ve studiích byl nalezen vasodilatační účinek anthokyanů u pacientů s ischemickou chorobou srdeční (Wallace a Giusti 2014).
Protirakovinový účinek
U anthokyanů bylo prokázáno, že vykazují antikarcinogenní aktivitu proti mnoha typům nádorových buněk. Potenciální chemopreventivní účinky anthokyanů souvisejí s radikální antioxidační aktivitou, se stimulací detoxikačních enzymů druhé fáze biotransformace, se snížením proliferace buněk, zánětu, angiogeneze a invaze, a s indukcí apoptózy a diferenciace. In vivo studie ukazují, že inhibují rakovinu gastrointestinálního traktu a lokálně aplikované mají schopnost inhibovat rakovinu kůže.
21
Ačkoliv
laboratorní
studie
poskytly
možnosti
mechanismů,
kterými
anthokyany inhibují karcinogenezi, je stále, co se učit. Ve výzkumu rakoviny plic anthokyany prokázaly, že inhibují vývoj nádorů u myší po subkutánní injekční aplikaci plicních nádorových buněk. Na rozdíl od studií in vivo na modelových zvířatech, epidemiologické studie u lidí neposkytly přesvědčivé důkazy o protinádorových účincích anthokyanů. Ale naznačují, že mohou snížit určité parametry oxidačního poškození (Wang a Stoner 2008).
Další možné účinky anthokyanů Některá data ukazují, že anthokyany procházejí HEB po dlouhodobém podávání anthokyanů. To jim dává příležitost mít aktivní roli při udržování normální funkce vidění a v prevenci oční patologie. Mechanismus, kterým by anthokyany procházely HEB není dosud znám. Pasivní difuze je nepravděpodobná, protože anthokyany jsou vysoce polární molekuly s relativně vysokou molekulou hmotností. Dále anthokyany mohou pomáhat chránit proti neurodegenerativním onemocněním, které sdílejí společné prvky jako oxidační stres, excitotoxicita, zánět a buněčná apoptóza. Proto jsou anthokyany diskutovány ve spojení s Alzheimerovou a Parkinsonovou chorobou (Wallace a Giusti 2014).
22
2.3
Biotransformační enzymy Významnou roli v eliminaci exogenních i endogenních sloučenin v lidském
organismu mají biotransformační enzymy. Jejich cílem je změna chemické struktury sloučenin pro snadnější vyloučení z těla. Těmito chemickými reakcemi vznikají nové sloučeniny tzv. metabolity s novými fyzikálně-chemickými a biologickými vlastnostmi, které bývají hydrofilnější a snadněji přístupné pro transportní a exkreční systémy (Skálová a Boušová 2011). Obecně se rozdělují biotransformační reakce do dvou fází. Cílem první fáze, je připravit sloučeninu pro druhou fázi reakcemi, které zvyšují polaritu dané molekuly i její rozpustnost ve vodě (Horňáková 2010). Tuto fázi tvoří především reakce jako oxidace, redukce a hydrolýza. Hlavními enzymy jsou cytochromy P450 a flavinové monooxygenasy jako významné oxidasy. Dále sem patří reduktasy např. aldoketoreduktasy a dehydrogenasy/reduktasy s krátkým řetězcem (SDR) nebo hydrolasy jako epoxidhydrolasy a karboxyesterasy. Ve druhé fázi biotransformace podstupují sloučeniny konjugační reakce s endogenní sloučeninou. Mezi hlavní konjugační činidla patří glutathion, UDP-glukuronová kyselina, aminokyseliny a sulfáty. Tyto reakce vedou k detoxikaci a deaktivaci parentní látky nebo jejich metabolitů, které se stávají polárnějšími sloučeninami, a usnadňují jejich renální exkreci (Bártíková et al. 2013). Dále blíže jsou popsány enzymy, které jsem v této práci studovala, protože se podílejí na biotransformaci anthokyanů.
2.3.1
Cytochromy P450 Cytochromy P450 (CYP) patří k rozsáhlé skupině hemoproteinů katalyzující
především hydroxylační reakce. Jsou to mikrosomální monooxygenasy se smíšenou funkcí (Stiborová et al. 1999). CYP využívají jeden kyslíkový atom ze vzdušného kyslíku a použijí ho k tvorbě oxidovaného substrátu. Ze zbylého druhého atomu kyslíku vzniká molekula vody. V lidském těle jsou CYP hojně k naleznutí v játrech, gastrointestinálním traktu, plicích a ledvinách (Bártíková et al. 2013). CYP se rozdělují podle míry podobnosti jejich primární struktury do rodin, podrodin a jednotlivých isoforem. Při shodě 40 % aminokyselinové sekvence patří 23
jednotlivé CYP do jedné rodiny a označují se prvním číslem. Do podrodiny patří ty proteiny, které se shodují ve více než 60 % v pořadí aminokyselin. Společná podrodina se označuje velkým písmenem. Jednotlivé isoformy vyjadřuje další číslice za písmenem podrodiny (Stiborová et al. 1999). Z hlediska biotransformace cizorodých látek mezi nejvýznamnější CYP v játrech patří isoformy 1A2, 2A6, 2D6, 2C (2C8, 2C9, 2C18 a 2C19), 2E1 a 3A4, a v ostatních tkáních (gastrointestinální trakt, ledviny, plíce) isoformy 1A1, 2B6, 2E1 a 3A4 (Stiborová et al. 2009).
CYP1A1/1A2 Hlavními substráty této podrodiny jsou aromatické planární molekuly. Patří sem kontaminanty životního prostředí, jako jsou polycyklické aromatické uhlovodíky, polychlorované bifenyly a heterocyklické aromatické aminy. Jednotlivé isoformy se liší především v jejich lokalizaci. Isoforma 1A1 se nachází v extrahepatálních tkáních jako jsou plíce, kde se aromatické sloučeniny vyskytují častěji ze znečištěného vzduchu a kouření. Isoforma 1A2 je typickým jaterním enzymem. 1A2 oxiduje především planární aromatické aminy. V důsledku toho dokáže metabolizovat léčiva podobná aromatickým aminům jako kofein, theofylin a 2-naftylamin. Dokáže také oxidovat estrogeny (Stiborová et al. 2009, Coleman 2005, Skálová a Boušová 2011).
CYP3A4 CYP3A4 je nejvýznamnější isoformou z této nadrodiny enzymů. K naleznutí je zejména v játrech a střevech. Dále se objevuje v ledvinách, plicích a děloze. Tento enzym katalyzuje biotransformací velkého množství léčiv a karcinogenů i endogenních látek (steroidů). Díky této široké substrátové specifitě jsou velmi významné indukce či inhibice tohoto enzymu, které mohou pak způsobit některé nežádoucí účinky či selhání terapie vlivem lékových interakcí (Stiborová et al. 2009, Skálová a Boušová 2011). Mezi významné inhibitory CYP3A4 patří makrolidová antibiotika, ketokonazol, verapamil, diltiazem, ritonavir a grapefruitový džus. Mezi významné induktory
24
CYP3A4
patří
barbituráty,
karbamazepin,
fenytoin,
rifampicin,
pioglitazon
a glukokortikoidy (CYP3A4 – Wikipedia 2014).
2.3.2
Karbonylreduktasa Karbonylredukasa (CBR) patří do rozsáhlé nadrodiny SDR. SDR katalyzují
NADP(H)-depedentní oxido/redukční reakce (Kallberg et al. 2002). Přítomnost CBR v lidském těle byla naleznuta v různých tkáních a v různých koncentracích. U člověka se prokázaly tři izoformy CBR1, CBR3 a CBR4. Např. CBR1 je nejvíce lokalizovaná v játrech, gastrointestinálním traktu a epidermis, tedy v místech, kde dochází nejvíce ke styku s toxickými karbonyly. Ale svoje místo mají také v endogenním metabolismu (Hlaváčová 2013). Hlavními exogenními substráty CBR jsou o-chinony, menadion, doxorubicin, oracin, haloperidol, warfarin, atd. (Skálová a Boušová 2011).
2.3.3
UDP-glukuronosyltransferasa UDP-glukuronosyltransferasa
(UGT)
katalyzuje
konjugaci
sloučenin
s kofaktorem UDP-glukuronovou kyselinou. Jedná se o nejběžnější biotransformační cestu konjugace v lidském těle. Mezi nejběžnější substráty UGT se řadí alkoholy, fenoly a karboxylové kyseliny (Bártíková et al. 2013). Tyto enzymy jsou k naleznutí v mnoha tkáních, nejvíce v játrech. Menší aktivity UGT byly zjištěny v plicích, kůži a tenkém střevě. Jedná se především o enzymy lokalizované v membránách endoplazmatického retikula (Knejzlík et al. 2000).
2.3.4
Glutathion-S-transferasa Mezi další významné biotransformační enzymy patří glutathion-S-transferasa
(GST), která urychluje konjugaci především elektrofilních sloučenin (Bártíková et al. 2013). Kofaktorem těchto chemických reakcí je tripeptid glutathion (GSH) složený
25
z aminokyselin glutamátu, cysteinu a glycinu. Thiolová skupina v redukované formě GSH umožňuje právě tuto konjugaci (Knejzlík et al. 2000). Jedná se především o cytosolický enzym, ale dnes se rozeznávají tři nadrodiny: cytosolické, mitochondriální a mikrosomální (Oakley 2011). Lidské cytosolické GST se rozdělují do 8 tříd, přiřazené na základě sekvenční podobnosti: alfa, mí, pí, théta, kappa, zeta, omega, a sigma (Josephy 2010). Jednotlivé isoformy GST se liší orgánovou lokalizací. Nacházejí se v játrech, mozku, ledvinách, placentě, kosterním svalstvu (Skálová a Boušová 2011). Mezi hlavní substráty patří exogenní i endogenní sloučeniny chemické struktury jako jsou chinony, epoxidy a hydroperoxidy. GST pomáhá v detoxikaci elektrofilních sloučenin pomocí konjugace s GSH, čímž se sníží pravděpodobnost škodlivých interakcí mezi těmito škodlivými molekulami a základními buněčnými složkami jako jsou proteiny a nukleové kyseliny. Mezi elektrofilní sloučeniny patří i léky používané v léčbě rakoviny jako cyklofosfamid a melfalan (Josephy 2010).
2.3.5
Anthokyany a biotransformační enzymy Anthokyany jsou hojně konzumovány jako součást ovoce, zeleniny
a červeného vína. Díky jejich prospěšným účinkům na lidské zdraví roste i zájem o jejich zvýšený příjem v podobě potravních doplňků. Proto je dobré mít na paměti, že anthokyany mohou ovlivňovat enzymy metabolizující léčiva a být příčinou jejich nežádoucích účinků nebo selhání léčby pacienta. Ale na druhé straně modulace určitých enzymů a antioxidačních enzymů anthokyany může napomáhat chemoprotekci a antioxidační obraně organismu. Anthokyany jsou metabolizovány biotransformačními enzymy v organismu. Ale také mohou soutěžit o tyto enzymy nebo transportéry s jinými substráty jako např. s jinými léčivy. Z toho mohou vyplývat možné lékové interakce s potravou. Na tyto souvislosti vzniklo mnoho studií, ale spíše se věnovaly jiným flavonoidním látkám než anthokyanům (Bártíková et al. 2013).
26
2.4
Buněčné linie Práce s buněčnými kulturami patří dnes k základním laboratorním technikám
pro základní a aplikovaný výzkum či výrobu. Ve výzkumu představují buněčné kultury vhodný biologický model pro experimenty ve studiu xenobiotik. Pro tento účel se využívají nádorové buněčné linie. Tyto buňky se snadno množí a kultivují. Nedochází u nich ke zkracování telomer, což umožňuje jejich neomezený počet dělení s neomezeným počtem pasáží. Využití buněčných kultur jako biologického modelu má oproti jiným modelům značné výhody. V krátké době lze získat poměrně velké množství homogenního materiálu. Nedochází k ovlivnění jinými orgány, tkáněmi či buněčnými populacemi. Na druhou stranu přinášejí omezení, se kterými by se mělo počítat. Jedná se o in vitro experimenty. Buňky rostou za nefyziologických podmínek, v uměle vytvořených, které neodpovídají podmínkám v organismu. Práce s buněčnými kulturami vyžaduje speciální podmínky. Je náročná na technické vybavení, jednorázový spotřební materiál, vyškolený personál a čas. Hlavním bodem je zajištění sterility. K tomu se používá laminární box a sterilní nádoby. Buněčné linie se kultivují v inkubátoru při 37°C obvykle s 5 % CO2 v kultivačních lahvích nebo Petriho miskách. Aby buňky v těchto nádobách přežily, musí se jim zajistit správné prostředí tzv. kultivační médium. Tento živný roztok by se měl svým chemickým složením a fyzikálními vlastnostmi co nejvíce podobat tělním tekutinám. Obsahuje živiny a látky, které umožňují, aby se buněčné linie mohly dělit. Mezi nejvýznamnější látky patří anorganické soli, pufry, glukosa, vitamíny, bílkoviny, růstové faktory, některé peptidy, mastné kyseliny, lipidy a stopové prvky. Růst buněčné linie prochází těmito fázemi. Buňky se nejprve přisednou na stěnách nádoby, adaptují se na prostředí (počet buněk mírně klesne) a začnou se pomalu dělit. Tato první fáze se nazývá lag-fáze. V další fázi tzv. log-fázi dochází k exponenciálnímu růstu buněk. Pak se dostanou do stacionární fáze, kdy se růst buněk pozastavuje. A z důvodu vyčerpání živin, snížení pH a nahromadění metabolitů a toxinů dojde ke konečné fázi úbytku buněk. V této fázi se nejpozději musí provést tzv. pasáž buněk, kdy se odebere část buněk do nové kultivační nádobky s kultivačním médiem. Pro udržení živé buněčné kultury se musí tento postup pravidelně opakovat (Vejražka 2008, Kočárek et al. 2010). 27
V experimentech této diplomové práce byla využita lidská střevní buněčná linie Caco-2. Ta se značně využívá jako model střevní bariéry. Tato buněčná kultura, původně získaná z adenokarcinomu tlustého střeva, se při určitých kultivačních podmínkách diferencuje tak, že představuje formaci jednovrstevných buněk podobající se v několika morfologických a funkčních charakteristikách zralým enterocytům lemujícím tenké střevo. Vypadají jako polarizované elementy cylindrického tvaru s mikroklky na apikální straně a s těsnými spoji mezi sousedními buňkami. Také exprimují řadu enzymů a transportérů charakteristických pro enterocyty. Pro tuto buněčnou linii je charakteristické, že jejich subkultury jsou heterogenní a mají různé morfologické a funkční vlastnosti. Ovlivňují je podmínky související s buňkami jako je počet pasáží, doba kultivace, složení média. Toto je pak problémem pro porovnávání výsledků z různých laboratoří (Sambuy et al. 2005). Monovrstva buněčné linie Caco-2 je široce využívaná ve farmaceutickém průmyslu jako model in vitro lidské sliznice tenkého střeva pro předvídání absorpce perorálně podávaných léčiv (Artusson a Karlsson 1991). Protože se anthokyanidiny obecně špatně vstřebávají, jejich koncentrace v těle jsou nízké, ale ve střevech po příjmu potravy mohou být vyšší. V této situaci může pak docházet k ovlivnění biotransformačních enzymů ve střevních buňkách (Wallace a Giusti 2014). Proto byly v této práci použity buňky Caco-2.
28
CÍLE PRÁCE
3
Tato diplomová práce je součástí projektu „Centre of drug - dietary supplement interactions and nutrigenetics“ podporovaného Grantovou agenturou České republiky (grant P303/12/G163). Cílem předložené diplomové práce bylo:
zjistit vliv anthokyanidinů pelargonidinu, cyanidinu, delfinidinu a malvidinu na proliferaci buněk kolorektálního karcinomu linie Caco-2 za použití testu metabolické aktivity MTT a testu neutrální červeně
zjistit vliv uvedených anthokyanidinů na aktivitu vybraných biotransformačních enzymů
29
4
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
4.1
MATERIÁL, PŘÍSTROJE, POMŮCKY, CHEMIKÁLIE
4.1.1
Biologický materiál Buněčná linie Caco-2 (odvozeno z lidského kolorektálního adenokarcinomu)
4.1.2
Přístroje Laminární box BioAir Aura 2000 M.A.C. CO2 inkubátor HeraCell Vodní lázeň Memmert Stolní centrifuga Eppendorf Třepačka mikrotitračních destiček Thermomixer Comfort Mikroskop Nikon Eclipse TS 100 Multifunkční snímač Tecan Mrazicí box Heraeus Analytické váhy Scaltec SBC 22 Digitální pH metr Sartorius CP225D Ultrazvuková čistička Bandelin Sonorex Centrifuga Heraeus Centrifuga Sorvall Ultrazvukový sonikátor Bandelin SonoPuls Stolní centrifuga Eppendorf Centrifuge 5415D Spektrofluorimetr Perkin Elmer LS 50 B Termostat Haake DC10
30
4.1.3
Pomůcky Sterilní kultivační lahve 75 cm2, sterilní pipety, sterilní pipetovací špičky,
sterilní nádobky, multikanálové pipety, stojánky na zkumavky, sterilní zkumavky, zkumavky, pipetovací špičky, mikrozkumavky 0,5 ml, 1 ml, 2 ml, stojánky na mikrozkumavky, sterilní vaničky, lihové fixy, nůžky, parafilm, kádinky, sterilní kádinky, Bürkerova komůrka, sterilní mikrotitrační destičky s plochým dnem pro buněčné kultury, falkonky, navažovací lodička, latexové rukavice, pinzeta, odměrné baňky, odměrné válce, lžička, váženky, špachtličky, magnetické míchadlo, skleněná tyčinka, buničina, lahve pro uchování roztoků, Petriho misky (průměr 15cm), nádoby na led, odsávací baňka na odpad, špachtličky, centrifugační zkumavky 15 ml, centrifugační kyvety, stojany na kyvety, titrační destičky GAMA a Greiner, kyveta Hellma
4.1.4
Chemikálie delfinidin (Extra Synthese, Francie), pelargonidin (Extra Synthese, Francie),
malvinidin (Extra Synthese, Francie), cyanidin (Extra Synthese, Francie), MTT (SigmaAldrich Praha, ČR), sterilní roztok neutrální červeně 3,3 mg/ml v DPBS + MgCl2 + CaCl2 (Sigma-Aldrich Praha, ČR), dimetyhlsulfoxid (Sigma-Aldrich Praha, ČR), EMEM (Sigma-Aldrich Praha, ČR), FBS (Lonza, Švýcarsko), NEAA (Sigma-Aldrich Praha, ČR), glutamin (Sigma-Aldrich Praha, ČR), penicilin/streptomycin (Lonza, Švýcarsko), Trypsin-EDTA (Lonza, Švýcarsko), tablety na fosfátový pufr NaCl (PBS) (Sigma-Aldrich Praha, ČR), BCA (Sigma,-Aldrich, Praha), CuSO4.6H2O, práškový hovězí
albumin
(Sigma-Aldrich,
Praha),
glutathion
(Sigma-Aldrich,
Praha),
chlorodinitrobenzen (Fluka, Švýcarsko), menadion (Sigma-Aldrich, Praha), NADPH (Serva, Německo), p-nitrofenol (Fluka, Švýcarsko), UDP-glukuronvá kyselina (SigmaAldrich, Praha), MgCl2 (Sigma-Aldrich, Praha), ethoxyresorufin (Sigma-Aldrich, Praha), benzoxyresorufin (Sigma-Aldrich, Praha), resorufin (Sigma-Aldrich, Praha), a další běžné chemikálie od firem Sigma-Aldrich (Praha) a Penta (Česká republika)
31
4.2
METODIKA
4.2.1
Kultivace buněčných linií Caco-2
4.2.1.1 Příprava kultivačního média pro Caco-2 V laminárním boxu se odebralo 60 ml Eagle’s minumum essential medium (EMEM). Do původní lahve EMEM se postupně přidávalo: 50 ml inaktivovaného fetálního bovinního séra, 5 ml MEM non essential amino acid solution, 5 ml glutaminu a 2,5 ml penicilinu/streptomycinu. Dobře se promíchalo.
4.2.1.2 Příprava fosfátového pufru s NaCl (PBS) Rozpuštěním jedné tablety pro přípravu PBS v 200 ml redestilované vody se získal 0,01 M fosfátový pufr o pH 7,4 obsahující 0,0027 M KCl a 0,137 M NaCl.
4.2.1.3 Kultivace buněčné linie Získaná rozmražená buněčná linie Caco-2 byla zpasážována a jejich kultivace se prováděla v inkubátoru při 37°C a 5 % CO2. V inkubátoru se buněčné linie kultivují v kultivační lahvi s otevřeným uzávěrem. Před vyjmutím z inkubátoru se uzávěr uzavře. Používaly se kultivační lahve T-75 (13 ml). Při dosažení 80-90 % konfluence se vykonávala pasáž buněk, obvykle jednou až dvakrát týdně.
32
4.2.1.4 Pasážování buněk linie Caco-2 Pasážování se provádí, aby mohly buňky neustále proliferovat a mohly se používat k experimentům. Část buněk se převede do nové kultivační lahve s příslušným množstvím média pro další buněčné dělení. Kultivační lahev s uzavřeným uzávěrem se přenesla z inkubátoru do laminárního boxu. Zde se odlilo kultivační médium. Buňky se opláchly dvakrát 7 ml PBS pro zbavení vápníku. Přidaly se 2 ml Trypsin-EDTA (TE) a buňky se nechaly asi 30 s v inkubátoru. Poté se odstranily 2/3 (asi 1,2 ml) TE a lahev se přenesla na 5 min do inkubátoru. Když buňky dosáhly kulovitého tvaru (vytvořily suspenzi), sklepaly se v laminárním boxu k jednomu kraji lahve. Zbývající buňky se spláchly 4 ml kultivačního média a vše se homogenizovalo pomocí pipety. K pasáži se použilo 0,5 ml tohoto homogenátu, který se přenesl do připravené kultivační lahve (75 cm2, 13 ml), a dopipetovalo se 12,5 ml kultivačního média. Tato nová lahev se nechala s otevřeným uzávěrem v inkubátoru. Zbylá část homogenátu se dala použít pro experimenty.
4.2.2
Test cytotoxicity – barvení neutrální červení (Neutral Red uptake
(NRU) test) Principem této metody je hromadění neutrální červeně v lysozomech zdravých buněk. Toto barvivo při fyziologickém pH prostupuje buněčnou membránou, a díky nižšímu pH v lysozomech vstupuje do těchto organel a nevrací se zpět. Při poškození buněk či jejich smrti dochází ke ztrátě protonového gradientu, což způsobí uvolnění neutrální červeně z buněk.
Použité roztoky Neutrální červeň: Roztok neutrální červeně (3,3mg/ml) se naředil médiem na koncentraci 80 µg/ml (0,24 ml roztoku neutrální červeně + 9,76 ml čistého média). Použitím do pokusu byla jeho výsledná koncentrace 40 µg/ml.
33
Fixační roztok: 1 g/100 ml CaCl2 v 0,5 % formaldehydu. Lyzační roztok: 1 % CH3COOH v 50 % ethanolu.
Nasazení buněčné suspenze na mikrotitrační destičku a expozice buněk Při pasážování buněk se odebraly 4 ml buněčné suspenze do sterilní kádinky. Před nasazením této buněčné suspenze na mikrotitrační destičku se provedl odběr 9 µl suspenze do každé poloviny předem připravené Bürkerovy komůrky. Pod mikroskopem se spočítaly buňky ležící uvnitř deseti čtverců komůrky. Do výpočtu byly zahrnuty i ty buňky, které se dotýkaly horního a levého okraje jednotlivých čtverců (v obrázku 6 červené tečky). Buňky dotýkající se dolních a pravých okrajů se nepočítaly (v obrázku 6 modré tečky).
Obr. 6: Počítání buněk v Bürkerově komůrce (Referenční hodnoty vyšetření hemokoagulace 2014) Pomocí této metody se zjistila koncentrace v neředěné buněčné suspenzi, podle vzorce: C=x*4*104*10 C – počet buněk ve 4 ml neředěné suspenze x – průměrný počet buněk v 1 čtverci 4*104 – přepočet na 4 ml 10 – ředění 34
Podle potřeby se buněčná suspenze naředila kultivačním médiem na hustotu 2500 buněk/100 µl. Poté byla nasazena buněčná suspenze o přibližné hustotě 2,5 tisíc/100 µl kultivačního média na mikrotitrační destičku (96 jamek) pomocí multikanálové pipety v množství 100 µl do každé vnitřní jamky. V okolních jamkách se napipetovala destilovaná voda pro udržení dostatečné vlhkosti. Destička se nechala inkubovat 72 h v inkubátoru (37°C, 5 % CO2). Po inkubaci byly buněčné suspenze ovlivněny testovanými látkami. Od každé látky bylo použito 6 koncentrací připravených ze zásobních roztoků ředěním v médiu. Testovaná látka se napipetovala ve dvojnásobné příslušné koncentraci v množství 100 µl k 100 µl buněčné suspenze. Od každé koncentrace bylo 6 paralelních vzorků v jednom sloupci. Ve dvou dalších sloupcích se nanesla kontrola. Použil se 0,1 % dimethylsulfoxid (DMSO), ve kterém byly testované látky rozpuštěny. Ve zbývajících sloupcích se napipetoval 10 % DMSO jako negativní kontrola pro usmrcení buněk. Poté se znovu dala mikrotitrační destička do CO2 inkubátoru na 72 hodin.
Vlastní test Po inkubaci se odsálo 100 µl média z jamek. Přidalo se 100 µl roztoku neutrální červeně v médiu (80 µg/ml) do výsledné koncentrace 40 µg/ml. Následně proběhla 3 hodinová inkubace v inkubátoru. Po vyjmutí z inkubátoru se z destičky vyklepalo veškeré médium a přidalo se do jamek 100 µl fixačního roztoku. Tento roztok se nechal působit 15 min při pokojové teplotě. Poté se slil z destičky a přidalo se 200 µl lyzačního roztoku. Destička se nechala v klidu 15 min při laboratorní teplotě a následně se umístila na deskovou třepačku na 15 min. Během toho došlo k cytolýze buněk a vylití neutrální červeně.
Vyhodnocení Nakonec se provedlo měření absorbance při 540 nm na multifunkčním snímači Tecan programem Magellan. Výsledné hodnoty byly vyjádřeny jako procenta hodnoty absorbance kontroly mínus absorbance negativní kontroly. 35
4.2.3
Test cytotoxicity - MTT test Principem tohoto pokusu je přeměna žlutého, ve vodě rozpustného substrátu 3-
[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyl
tetrazolium
bromidu
(MTT)
pomocí
mitochondriálních dehydrogenas u živých buněk na fialový, ve vodě nerozpustný produkt formazan.
Použité roztoky: Roztok MTT: 3 mg MTT se rozpustily v 1 ml fosfátového pufru 0,1 M o pH=7,4. Pro lepší rozpouštění se použil ultrazvuk a roztok se předehřál v lázni při 37°C. Lyzační roztok (0,08 M HCl v isopropanolu): Smíchaly se 2 ml 4 M HCl s 98 ml isopropanolu.
Nasazení buněčné suspenze na mikrotitrační destičku a expozice buněk V laminárním boxu byla buněčná suspenze v množství 100 µl nanesena na 96 jamkovou destičku s plochým dnem o hustotě přibližně 2,5x103/100 µl. V okolních jamkách se napipetovala destilovaná voda pro udržení vlhkosti. Inkubace probíhala při 37°C a 5 % CO2 po dobu 72h. Po třech dnech se k buňkám napipetovaly testované látky v různých koncentracích. Připravené koncentrace se přidaly v množství 100 µl ve dvojnásobné koncentraci. Použilo se šest koncentrací v šesti sloupcích po 6 paralelních vzorcích. Ve dvou sloupcích byla použita kontrola. Tu tvořilo médium s 0,1 % DMSO, který se použil při rozpouštění testovaných látek. A v dalších dvou sloupcích byla nanesena negativní kontrola obsahující médium s 10 % DMSO, který způsobil usmrcení všech buněk v dané jamce. Takto připravená mikrotitrační destička se nechala inkubovat dalších 72 h.
36
Vlastní test Po vyjmutí z inkubátoru se do jamek s buňkami (včetně kontrol) naneslo 25 µl roztoku MTT předehřátého na 37°C. Destička se nechala inkubovat 1-2 hodiny v inkubátoru při 37°C a 5 % CO2. Médium se opatrně slilo. Ke všem vzorkům se přidalo 50 µl lyzačního roztoku. Poté se nechala destička cca na 30 min (700 RPM, 37°C) na třepačce pro úplné rozpuštění buněk.
Vyhodnocení Vyhodnocení se provedlo na multifunkčním snímači Tecan pomocí programu Magellan. Měřila se absorbance při 570 nm. Výsledky se interpretovaly jako procenta hodnoty absorbance kontroly mínus absorbance negativní kontroly.
4.2.4
Ovlivňování buněčných linií testovanými látkami Před vlastními pokusy in vitro měření aktivit vybraných biotransformačních
enzymů byly buněčné linie Caco-2 vystaveny expozici testovaných látek. Byly použity 2 koncentrace (1 a 10 µM) těchto 4 anthokyanidinů: delfinidin, pelargonidin, cyanidin, malvidin. Nejprve byly buňky nasazeny do Petriho misek (průměr 15 cm). Ke každé koncentraci od jedné testované látky bylo nasazeno 5 misek. Použilo se 180 µl buněčné suspenze na jednu misku, ke kterým se doplnilo 14,82 ml kultivačního média. Misky se nechaly inkubovat 3 až 5 dní. Při dosažení 80 % konfluence se misky přenesly do laminárního boxu. Kultivační médium se slilo a buňky se nechaly ovlivnit testovanými látkami. Použily se připravené zásobní roztoky 10 mM a 1 mM, které se zředily do výsledných koncentrací 1 µM a 10 µM (tzn. do misek se napipetovalo 15 µl zásobního roztoku a 14,985 ml kultivačního média). 5 misek se použilo jako kontrola za použití DMSO, který se zředil do výsledné koncentrace 0,1 % (též 1 000 x zředit). Řádně popsané misky se přenesly
37
do inkubátoru, kde se ponechaly další 2 – 3 dny. Poté mohly být buňky použity k izolaci subcelulárních frakcí.
4.2.5
Příprava subcelulárních frakcí Pro in vitro měření aktivit vybraných biotransformačních enzymů z buněčné
linie Caco-2 musely být izolovány mikrosomy a cytosol. Cytosol se použil pro stanovení aktivit cytosolových enzymů, glutathion-S-transferasy a karbonylreduktasy, a mikrosomy pro stanovení aktivit mikrosomálních enzymů, cytochromů P-450 a UDPglukuronosyltransferay. Tyto subcelulární frakce byly získány rozrušením buněk sonikací a následnou centrifugací. Před plánovanou izolací cytosolu a mikrosomů byly buněčné linie zpasážovány a nasazeny na Petriho misky o průměru 15 cm. Následně se ovlivnily příslušnými anthokyanidiny (viz kap. 4.2.4). Po této expozici byly misky z inkubátoru vyndány. Následně se odsálo kultivační médium z misek. Ty se pak pokládaly na ledítko. Misky s buňkami se opláchly dvakrát 2 ml PBS a vždy odsály do sucha. Na každou misku, stále na ledu, se napipetovaly 2 ml chlazeného 0,1 M fosfátového pufru o pH=7,4. Poté se buňky seškrabovaly z misek pomocí špachtličky ke krajům a vzniklá suspenze se přenesla pipetou do připravených centrifugačních 15 ml zkumavek chlazených v ledové lázni. Tyto zkumavky se nechaly stočit na chlazené centrifuze Heraeus (100 G, 5 min, 5°C). Vzniklý supernatant se slil. K peletě buněk se přidaly 3 ml fosfátového pufru. Stojánek se zkumavkami, stále v ledu, se přenesl do chladicího boxu, kde se obsah každé zkumavky nechal sonikovat dvakrát po 20 s. Takto vzniklý homogenát se opatrně přenesl do vychlazených kyvet, které se pak vložily symetricky proti sobě do centrifugy Heraeus. Centrifuga byla nastavena na 20 000 G, 20 min, 4°C. Po odstředění se kyvety přenesly zpět do chladící místnosti. Supernatant z kyvet se přelil do 4 ml zkumavek pro centrifugu Sorvall (rotor TST 60.4). Zkumavky se vložily do předem vychlazeného rotoru a nechaly centrifugovat při 105 000 G, 4°C, po dobu 1 hodiny. Poté se rotor vyndal z centrifugy a kyvety se odnesly do chladicího boxu. 38
Supernatant (cytosol) se rozpipetoval do 0,5 ml popsaných eppendorfek. Sediment (mikrosomy) se nechal sonikovat (resuspendovat) v 1 ml 0,1 M fosfátového pufru pH 7,4 s 20 % glycerolu. Do každé řádně popsané eppendorfky se rozpipetovala po 200 µl tato směs. Část eppendorfek s mikrosomy či cytosolem byla použita na stanovení bílkoviny. Tímto způsobem připravené mikrosomy a cytosol se zmrazily v popsané krabičce na -80°C.
4.2.6
BCA stanovení bílkoviny Tato metoda slouží ke stanovení koncentrace proteinů, v našem případě
v cytosolu
a
mikrosomech.
Principem
tohoto
postupu
je
vznik
stabilního
modrofialového komplexu sodné soli kyseliny bicinchoninové (BCA) s ionty Cu1+ tvořenými reakcí proteinů s Cu2+ v alkalickém prostředí (Smith et al. 1985). Koncentrace proteinů se stanovovala spektrofotometricky, kdy platí, že intenzivnější zabarvení odpovídá většímu množství bílkoviny. Absorbance komplexu byla měřena při 562 nm.
Použité roztoky
Roztok A: NaHCO3, Na2CO3, BCA v 0,1 M NaOH Roztok B: 4% CuSO4.6H2O Pracovní roztok C: Ten se připravil smícháním roztoku A s roztokem B v poměru 50:1.
Kalibrační křivka Nejprve se stanovila tzv. kalibrační křivka ze standardních roztoků. Jako výchozí roztok se použil připravený roztok hovězího sérového albuminu (BSA) 1 %.
39
Tento roztok se naředil s destilovanou vodou ve stoupajících koncentracích do připravených eppendorfek podle tabulky 1. Od každé koncentrace se připravily dvě ředění.
Tab. 2: Kalibrační křivka 1 % BSA k BCA stanovení bílkoviny Sloupec destičky č.
Koncentrace [µl/ml] Roztok 1 % BSA [µl]
Destilovaná voda [µl]
1
0
0
500
2
200
10
490
3
400
20
480
4
600
30
470
5
800
40
460
6
1000
50
450
Poté se tyto koncentrace ve dvou ředěních napipetovaly v množství 10 µl na mikrotitrační destičku. Každé ředění od jedné koncentrace bylo ve 4 paralelních jamkách v sloupci. Poté se pomocí multikanálové pipety napipetoval pracovní roztok C (200µl). Destička se na stole dobře promíchala a dala se inkubovat na 30 min při 37 °C.
Stanovení bílkoviny v mikrosomech a cytosolu Eppendorfky s ovlivněným
cytosolem
a mikrosomy se naředily 5x
destilovanou vodou. Provedly se od každého vzorku dvě ředění. Takto připravené vzorky se napipetovaly na mikrotitrační destičku v množství 10 µl (z každého ředění 4 paralelní vzorky). Jeden sloupec vzorků byl použit jako slepý vzorek, kdy se místo bílkoviny použilo 10 µl destilované vody. Pomocí multikanálové pipety se přidalo 200 µl pracovního roztoku C. Destička se dobře promíchala na stole a dala se inkubovat na 30 min při 37 °C.
40
Vyhodnocení Po inkubaci se destička vložila do multifunkčního snímače Tecan pro změření absorbance při 562 nm. Vynesením absorbance standardních roztoků proti odpovídajícím koncentracím bílkoviny a použitím lineární regrese se vytvořila kalibrační křivka. Při tom se od průměru hodnot absorbance jednotlivých koncentrací odečetla zprůměrovaná hodnota absorbance vzorků s nulovou koncentrací bílkoviny. Od hodnot absorbance měřených vzorků se odečetl průměr hodnot slepých vzorků. Poté se pomocí takto získaných hodnot absorbance odečetly koncentrace bílkoviny ve vzorcích.
4.2.7
Stanovení aktivity glutathion-S-transferasy Tato metoda spektrofotometrického stanovení aktivity glutathion-S-transferasy
je založena na tvorbě S-2,4-dinitrofenylglutathionu
za použití 1-chloro-2,4-
dinitrobenzenu (CDNB) jako substrátu při absorpčním maximu 340 nm.
Použité roztoky 0,1 M Na-fosfátový pufr (pH 6,5): Navážený 1,79 g Na2HPO4 doplněný redestilovanou vodou do 50 ml odměrné baňky se smíchal s 1,56 g NaHPO4 doplněným redestilovanou vodou do 100 ml přibližně v poměru 1:3. Hodnota pH se upravila na 6,5.
Roztok glutathionu: Navážení 7,92 mg GSH a rozpuštění v 5 ml 0,1 M Na-fosfátového pufru (pH 6,5) postačilo na pokus s jednou titrační destičkou.
Roztok CDNB: 5,22 mg CDNB se nechalo rozpustit v 0,5 ml ethanolu pro použití na 1 titrační destičku. 41
Master mix: Připravoval se těsně před vlastním stanovením. Na 1 destičku bylo zapotřebí napipetovat 4 ml GSH, 0,4 ml CDNB a 15,6 ml 0,1 M Na-fosfátového pufru.
Vlastní stanovení Pokus se prováděl na titračních destičkách Greiner s plochým dnem. V šesti jamkách každého sloupce bylo napipetováno 6 µl cytosolu a ve zbývajících dvou jamkách 6 µl pufru jako blank. Poté se naneslo po řádcích pomocí multikanálové pipety do každé jamky 194 µl Master mixu. Lehce se destička protřepala a vložila do spektrofotometru. Měření se provádělo na multifunkčním snímači Tecan pomocí programu Magellan. Přístroj zaznamenával absorbanci 6x v minutových intervalech při 340 nm.
Vyhodnocení Hodnota změny absorbance za 1 minutu s použitím extinkčního koeficientu 9,6 mM-1cm-1 se použila k výpočtu specifické aktivity jako množství molů na mg proteinu za 1 min. To bylo pak vyjádřeno graficky, kdy hodnota specifické aktivity kontrolních cytosolů představovala 100 %.
4.2.8
Stanovení aktivity karbonylreduktasy pomocí menadionu Principem metody je redukce menadionu karbonylreduktasou. Při této
biotransformaci dochází k oxidaci NADPH, což se při spektrofotometrickém měření projeví jako pokles absorbance.
42
Použité roztoky Pufr (0,1 M K-fosfátový pufr, pH 7,4): Tento pufr se připravil sléváním K2HPO4 (připravený odvážením 8,71 g do 500 ml redestilované vody) a KH2PO4 (připravený odvážením 2,72g do 200 ml redestilované vody) do dosažení pH=7,4.
Menadion: 8,61 mg se rozpustilo v 1 ml etanolu. NADPH: 6,25 mg se rozpustilo v 1,5 ml redestilované vody.
Vlastní stanovení Stanovení se provádělo na multifunkčním snímači Tecan. Použily se GAMA destičky s 96 jamkami. Do nich se po 6 vzorcích ve sloupci napipetovalo 10 µl cytosolu. Jako slepý vzorek ve dvou zbývajících jamkách se použil 10 µl 0,1 M Nafosfátového pufru o pH=7,4. Destička se nechala preinkubovat 5 min při 37°C. Mezitím se připravil Master mix. Složení Master mixu na 1 destičku: 21,36 ml pufru 240 µl menadionu 1200 µl NADPH Po inkubaci se tato směs přidala pomocí multikanálové pipety na destičku. Destička se ihned vložila do Tecanu a spustila se příslušná metoda. Program sledoval pokles absorbance po dobu 5 min při 340 nm.
43
Vyhodnocení Od poklesu absorbance vzorku za min se odečetl pokles absorbance slepého vzorku za min. Aktivita CBR se spočítala podle vzorce:
aktivita=
A vz.
A sl. Vi 1000 NADPH l Vs
A
pokles absorbance
NADPH
6,22 mM-1cm-1
l
výška jamky (0,75 cm)
Vi
objem reakční směsi (0,2 ml)
Vs
objem biol. frakce (0,01 ml) Jednotky aktivity se přepočítaly na mg proteinu. Hodnoty kontrolních cytosolů v grafickém vyjádření představovaly 100 %.
4.2.9
Stanovení aktivity UDP-glukuronosyltransferasy V této metodě dochází k tvorbě bezbarvého konjugovaného substrátu za použití
žlutého p-nitrofenolu jako substrátu. Spektrofotometrické vyhodnocení aktivity UGT se provádí při absorpčním maximu 415 nm.
Použité roztoky Substrát – p-nitrofenol: 1,39 mg substrátu se rozpustilo v 10 ml redestilované vody. Konjugační činidlo – UDP-glukuronová kyselina (UDP-GA): 1,26 mg se nechalo rozpustit v 1 ml redestilované vody.
Detergent: Slovasol 44
Trishydroxymethylaminomethan (Tris)/HCl pufr pH=7,4: 0,5 g Tris se rozpustilo v 10 ml redestilované vody. Poté se upravilo pH pomocí 1 M HCl. Nakonec se roztok doplnil do 15 ml. Deproteinizační činidlo: Použil se 3 % roztok trichloroctové kyseliny (TCA). Neutralizační roztok: Použil se 1 M NaOH.
Vlastní stanovení Nejprve se vložily mikrozkumavky se vzorky do stojanu s ledem. Od každého vzorku bylo připraveno 6 paralelních vzorků a 2 slepé vzorky. Poté se vypočítal objem potřebného roztoku s detergentem pro rozrušení mikrosomů a zpřístupnění UGT. K 100 µl rozmraženého množství mikrosomů o známé koncentraci proteinů (získanou metodou BCA stanovení bílkoviny, viz kap. 4.2.6) se napipetovalo takové množství detergentu, aby odpovídající poměr detergent:protein byl 1:2. Takto připravené eppendorfky se nechaly inkubovat po 20 min v lednici při 4°C. Po inkubaci se do připravených mikrozkumavek postupně napipetovalo 50 µl pufru, 20 µl UDP-GA v případě vzorku nebo 20 µl vody v případě slepého vzorku, 20 µl p-nitrofenolu a nakonec 10 µl mikrosomů s detergentem. Tato inkubační směs se promíchala a nechala se inkubovat 25 min v Thermomixeru (37°C, mírné třepání). Po ukončení inkubace se eppendorfky přesunuly zpět do ledu. Do každé z nich se napipetovalo 50 µl TCA pro odstranění proteinů. Ty by mohly zkreslovat výsledky. Směs se promíchala a nechala stočit na stolní centrifuze (5000 otáček/min, 5 min). Dále se připravila mikrotitrační destička, kdy v každé jamce bylo napipetováno 50 µl roztoku NaOH. V první jamce (A1) se napipetovala destilovaná voda. Následně do každé jamky s NaOH se přeneslo 50 µl inkubační směsi. Nakonec se provedlo změření absorbance při 415 nm na multifunkčním snímači Tecan.
45
Vyhodnocení Z hodnot absorbance slepých vzorků byly odečteny zprůměrované hodnoty absorbance paralelních vzorků. Poté se pro každý vzorek vypočítala koncentrace konjugovaného p-nitrofenolu z molárního absorpčního koeficientu ( =18,3 mM-1.cm-1) a spočítatala se specifická aktivita v jednotkách nmol/mg/min.
4.2.10 Stanovení aktivity jednotlivých isoforem cytochromu P450 Metoda je založena na přírůstku fluorescence při vzniku fluoreskujícího resorufinu za použití substrátů relativně specifických k určitým isoformám cytochromu P450 v mikrosomech. Měření se provedlo na spektrofluorimetru Perkin Elmer LS 50 B.
Použité substráty 0,5 mM Ethoxyresorufin-O-deethylasa (EROD) – katalytická aktivita 1A1, částečně 1A2 0,5 mM Benzyloxyresorufin-O-deethylasa (BROD) – katalytická aktivita 3A
Použité roztoky
Pufr 0,1 M Tris/HCl, pH=7,4 Kofaktor MgCl2 0,1 M Mikrosomy Substrát (ethoxyresorufin, benzyloxyresorufin) 0,5 mM rozpuštěný v DMSO NADPH 50 mM v Tris pufru Standardní přídavek resorufinu (0,5 µM)
46
Vlastní stanovení Nejprve se zapnul spektrofluorimetr spolu s počítačem. Poté se ověřila funkčnost příslušné metody a to tím, že se nechala změřit intenzita 10 µl přídavku 0,5 µM resorufinu v 990 µl pufru. Intenzita 5 pmol resorufinu v kyvetě by se měla pohybovat kolem 30. Byl spuštěn program Time Drive. Na počítači byly nastaveny tyto parametry: vlnové délky měření
λexcitační = 530 nm λemisní = 585 nm
excitační štěrbina = 10 nm emisní štěrbina = 20 nm 37°C délka inkubace 2 min excitační filter cut off on emisní filter open míchání low Do příslušné kyvety Hellma s míchadlem se postupně napipetovalo: 885 µl pufru nahřívaného v termostatu 50 µl kofaktoru MgCl2 50 µl mikrosomů 5 µl substrátu Base line se nastavila na nulu a spustil se záznam na fluorimetru. Po 20 s temperování se napipetovalo 10 µl NADPH, které spustilo reakci. Po lineárním růstu fluorescence se přibližně kolem 125 s přidal standardní přídavek resorufinu (10 µl). Ve 150 s se měření ukončilo. Poté se obsah kyvety odsál a kyveta se třikrát vypláchla destilovanou vodou. Mohlo se provést měření dalšího vzorku. Od každého vzorku se provedly dvě měření pro jeden substrát.
47
Vyhodnocení Z naměřených dat se odečetla směrnice k, číslo A a číslo B, a vypočítala se aktivita jednotlivých isoforem CYP podle vzorce:
(pmol/ml mikrosomů/min)
k
směrnice
A
intenzita začátku přídavku resorufinu
B
intenzita konce přídavku resorufinu
n
látkové množství standardního přídavku resorufinu v 1 ml (5 pmol)
D
zředění (20)
60
přepočet na minuty Výsledky se zprůměrovaly a vynesly do grafu. Určila se směrodatná odchylka.
48
5
VÝSLEDKY
5.1
Testovaní vlivu anthokyanidinů na buňky Caco-2 K testování byly použity 4 anthokyanidiny: delfinidin (D), pelargonidin (P),
cyanidin (C), malvidin (M). Zkoumal se jejich vliv na proliferaci Caco-2 buněk. Ke sledování cytotoxicity uvedených anthokyanidinů se použil test metabolické aktivity (MTT test) a měření celistvosti buněčné membrány (NRU test). Při sledování vlivu delfinidinu se ukázalo, že MTT je metodou vhodnější a citlivější pro tento experiment, proto se při testování vlivu dalších látek použil pouze MTT test. Metody jsou popsány v kapitolách 4.2.2 a 4.2.3. Testované látky byly naneseny ke Caco-2 buňkám v 6 koncentracích (0,5, 1, 2, 5, 10 a 20 µM) na 96-jamkovou kultivační destičku. Od každé koncentrace bylo 6 paralelních vzorků v jednom sloupci. Ve dvou sloupcích byla napipetována kontrola, kterou tvořil 0,1 % DMSO, ve kterém testované látky byly rozpuštěny. Ve dvou dalších sloupcích byla nanesena negativní kontrola tvořena 10 % DMSO. Výsledné hodnoty absorbance byly vyjádřeny jako procenta hodnoty absorbance kontroly mínus absorbance negativní kontroly. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 3-7 a na obrázcích 7-11.
49
Tab. 3: Stanovení antiproliferativního vlivu D na buněčnou linii Caco-2 metodou NRU test. Výsledky jsou vyjádřeny jako % kontroly ± směrodatná odchylka v %. Doba expozice 72 hodin. Delfinidin (µM)
Viabilita Caco-2 ± SD (%)
0,5
98 ± 6
1
100 ± 5
2
102 ± 6
5
97 ± 5
10
100 ± 4
20
86 ± 6
Delfinidin - NRU test Viabilita (% kontroly)
120 100 80 60 40 20 0 Kontrola
0,5
1 2 5 Koncentrace D (µM)
10
20
Obr. 7: Ovlivnění buněčné proliferace linie Caco-2 delfinidinem (D), metoda NRU test.
50
Tab. 4: Stanovení antiproliferativního vlivu D na buněčnou linii Caco-2 metodou MTT test. Výsledky jsou vyjádřeny jako % kontroly ± směrodatná odchylka v %. Doba expozice 72 hodin. Delfinidin (µM)
Viabilita Caco-2 ± SD (%)
0,5
97 ± 15
1
100 ± 11
2
97 ± 10
5
97 ± 6
10
87 ± 5
20
83 ± 13
Delfinidin - MTT test Viabilita (% kontroly)
120 100 80 60 40 20 0 Kontrola
0,5
1 2 5 Koncentrace D (µM)
10
20
Obr. 8: Ovlivnění buněčné proliferace linie Caco-2 delfinidinem (D), metoda MTT test.
Při použití testů cytotoxicity bylo zjištěno, že se u delfinidinu v těchto koncentracích antiproliferativní účinek na buněčnou linii Caco-2 neprojevil.
51
Tab. 5: Stanovení antiproliferativního vlivu P na buněčnou linii Caco-2 metodou MTT test. Výsledky jsou vyjádřeny jako % kontroly ± směrodatná odchylka v %. Doba expozice 72 hodin. Pelargonidin (µM)
Viabilita Caco-2 ± SD (%)
0,5
90 ± 8
1
83 ± 16
2
96 ± 19
5
96 ± 10
10
90 ± 10
20
87 ± 10
Pelargonidin - MTT test Viabilita (% kontroly)
140 120 100 80 60 40 20 0 Kontrola
0,5
1 2 5 Koncentrace P (µM)
10
20
Obr. 9: Ovlivnění buněčné proliferace linie Caco-2 pelargonidinem (P), metoda MTT test.
Při použití testu cytotoxicity bylo zjištěno, že se u pelargonidinu v těchto koncentracích antiproliferativní účinek na buněčnou linii Caco-2 neprojevil.
52
Tab. 6: Stanovení antiproliferativního vlivu C na buněčnou linii Caco-2 metodou MTT test. Výsledky jsou vyjádřeny jako % kontroly ± směrodatná odchylka v %. Doba expozice 72 hodin. Cyanidin (µM)
Viabilita Caco-2 ± SD (%)
0,5
102 ± 14
1
108 ± 24
2
112 ± 10
5
110 ± 12
10
104 ± 10
20
112 ± 18
Cyanidin - MTT test Viabilita (% kontroly)
140 120 100 80 60 40 20 0 Kontrola
0,5
1 2 5 Koncentrace C (µM)
10
20
Obr. 10: Ovlivnění buněčné proliferace linie Caco-2 cyanidinem (C), metoda MTT test.
Při použití testu cytotoxicity bylo zjištěno, že se u cyanidinu v těchto koncentracích antiproliferativní účinek na buněčnou linii Caco-2 neprojevil.
53
Tab. 7: Stanovení antiproliferativního vlivu M na buněčnou linii Caco-2 metodou MTT test. Výsledky jsou vyjádřeny jako % kontroly ± směrodatná odchylka v %. Doba expozice 72 hodin. Malvidin (µM)
Viabilita Caco-2 ± SD (%)
0,5
83 ± 17
1
96 ± 15
2
91 ± 26
5
87 ± 16
10
62 ± 23
20
47 ± 11
Malvidin - MTT test Viabilita (%kontroly)
140 120 100 80 60 40 20 0 Kontrola
0,5
1
2 5 Koncentrace (µM)
10
20
Obr. 11: Ovlivnění buněčné proliferace linie Caco-2 malvidinem (M), metoda MTT test.
Při použití testu cytotoxicity bylo zjištěno, že se u malvidinu v těchto koncentracích antiproliferativní účinek na buněčnou linii Caco-2 projevil. Se zvyšující se koncentrací malvidinu proliferace buněk klesala. U nejvyšší koncentrace (20 µM) byl počet buněk snížen až na 47 % počtu kontrolních buněk.
54
Stanovení koncentrace bílkovin
5.2
Koncentrace
proteinů
v jednotlivých
ovlivněných
a
kontrolních
(neovlivněných) subcelulárních frakcích připravených z buněčné linie Caco-2 byla stanovena pomocí metody BCA (kapitola 4.2.6). Nejprve byla sestavena kalibrační křivka o šesti bodech. Pro každý bod křivky bylo provedeno osm paralelních měření. Vždy od každého vzorku byly použity dvě ředění. Následně byly změřeny absorbance vzorků mikrosomů nebo cytosolu a hodnoty koncentrace bílkovin byly odečteny z kalibrační křivky. Cytosol a mikrosomy byly pro měření naředěny 5 krát. Pro nižší detekci absorbance mikrosomů bylo měření provedeno ještě jednou, kdy mikrosomy nebyly zředěny. Pomocí hodnot absorbance se odečetly jednotlivé koncentrace vzorků z kalibrační křivky podle rovnice lineární regrese. Kalibrační křivka je uvedena na obrázku 12 a průměrné hodnoty a příslušné směrodatné odchylky zjištěných koncentrací bílkovin v jednotlivých vzorcích mikrosomálních a cytosolických frakcí jsou uvedeny v tabulce 8.
BCA kalibrační křivka 0,8 0,7 Absorbance
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0
y = 0,0007x R² = 0,9952
200
400 600 800 Koncentrace (µg/ml)
Obr. 12: Kalibrační křivka pro BCA stanovení bílkoviny.
55
1000
1200
Tab. 8: Koncentrace proteinů v kontrolních a ovlivněných cytosolech a mikrosomech buněčné linie Caco-2, změřena metodou BCA.
Cytosol
Mikrosomy
Koncentrace proteinů (µg/ml)
Koncentrace proteinů (µg/ml)
± SD
± SD
Kontrola
260 ± 24
140 ± 15
D 1 µM
1 179 ± 100
388 ± 41
D 10 µM
1 281 ± 65
443 ± 17
P 1 µM
1 311 ± 83
724 ± 86
P 10 µM
1 299 ± 54
709 ± 65
C 1 µM
294 ± 36
282 ± 19
C 10 µM
262 ± 40
263 ± 29
M 1 µM
317 ± 44
283 ± 42
M 10 µM
259 ± 55
225 ± 19
V cytosolu byla nalezena koncentrace proteinů vyšší než v mikrosomech. Tyto výsledky byly použity pro výpočet specifické aktivity zkoumaných enzymů (viz kapitola 5.3-5.6).
56
Testování vlivu anthokyanidinů na specifickou aktivitu GST
5.3
V ovlivněných cytosolech a kontrolním cytosolu se měřila aktivita GST. Stanovení bylo provedeno spektrofotometrickým měřením přírůstku produktu reakce mezi 1-chloro-2,4-dinitrobenzenem a glutathionem katalyzované GST ( kapitola 5.2.7). Hodnota změny absorbance za 1 minutu s použitím extinkčního koeficientu 9,6 -1
-1
mM cm se použila k výpočtu specifické aktivity jako množství molů na mg proteinu za 1 min. To bylo pak vyjádřeno graficky, kdy hodnota specifické aktivity kontrolních cytosolů představovala 100 %. Byla provedena 3 nezávislá měření pro každý vzorek. Výsledky jsou vyjádřeny v tabulce 9 a na obrázku 13.
Tab. 9: Specifická aktivita GST v kontrolních a ovlivněných cytosolech buněčné linie Caco-2. Aktivita GST* (nmol/min/mg) ± SD Kontrola
17,67 ± 7,60
Delfinidin 1 µM
9,81 ± 1,34
Delfinidin 10 µM
9,05 ± 0,88
Pelargonidin 1 µM
8,49 ± 1,06
Pelargonidin 10 µM
8,10 ± 0,54
Cyanidin 1 µM
12,77 ± 4,18
Cyanidin 10 µM
14,14 ± 5,43
Malvidin 1 µM
12,68 ± 5,20
Malvidin 10 µM
12,13 ± 6,10
* - průměr z 3 nezávislých měření
57
Specifická aktivita GST 140
% kontroly
120 100 80 60 40 20 0 Kontrola
D1
D 10
P1
P 10
C1
C 10
M1
M 10
Obr. 13: Grafické porovnání specifické aktivity GST v kontrolních a ovlivněných cytosolech buněčné linie Caco-2.
Z výsledků je patrné, že se projevil inhibiční vliv vybraných anthokyanidinů na aktivitu GST buněčné linie Caco-2. Nejvíc inhibičně působil pelargonidin a poté delfinidin. Pelargonidin o koncentraci 10 µM snížil specifickou aktivitu GST až o 54 % oproti neovlivněným buňkám. Vyšší koncentrace těchto anthokyanidinů působila povětšinou více inhibičně.
58
Testování vlivu anthokyanidinů na specifickou aktivitu CBR
5.4
V ovlivněných cytosolech a kontrolním cytosolu se měřila aktivita CBR. Stanovení bylo provedeno spektrofotometrickým měřením úbytku NADPH v reakci s menadionem katalyzované CBR (kapitola 5.2.8). Hodnota poklesu absorbance vzorku za min se použila k výpočtu specifické aktivity za použití Lambert-Beerova zákona (extinkční koeficient 6,22 mM-1cm-1). Jednotky aktivity se přepočítaly na mg proteinu. Hodnoty kontrolních cytosolů v grafickém vyjádření představovaly 100%. Byla provedena 3 nezávislá měření pro každý vzorek. Výsledky jsou vyjádřeny v tabulce 10 a na obrázku 14.
Tab. 10: Specifická aktivita CBR v kontrolních a ovlivněných cytosolech buněčné linie Caco-2. Aktivita CBR* (pmol/min/mg) ± SD Kontrola
50,52 ± 17,81
Delfinidin 1 µM
15,54 ± 7,12
Delfinidin 10 µM
15,44 ± 5,13
Pelargonidin 1 µM
12,55 ± 2,41
Pelargonidin 10 µM
13,81 ± 6,50
Cyanidin 1 µM
64,32 ± 26,96
Cyanidin 10 µM
63,08 ± 17,26
Malvidin 1 µM
63,46 ± 30,84
Malvidin 10 µM
74,39 ± 27,82
* - průměr z 3 nezávislých měření
59
Specifická aktivita CBR 200,00
% kontroly
150,00
100,00
50,00
0,00 Kontrola
D1
D 10
P1
P 10
C1
C 10
M1
M 10
Obr. 14: Grafické porovnání specifické aktivity CBR v kontrolních a ovlivněných cytosolech buněčné linie Caco-2.
Z výsledků je patrné, že se projevil inhibiční vliv delfinidinu a pelargonidinu na aktivitu CBR buněčné linie Caco-2. Nejvíc inhibičně působil pelargonidin o koncentraci 1 µM, kdy byla specifická aktivita snížena až na 25 % specifické aktivity neovlivněných buněk. U cyanidinu a malvidinu se projevil spíše indukční vliv. U malvidinu o koncetraci 10 µM se zvýšila specifická aktivita o 47 %.
60
5.5
Testování vlivu anthokyanidinů na specifickou aktivitu UGT V ovlivněných a kontrolních mikrosomech se měřila aktivita UGT. Aktivita
UGT
byla
stanovena
spektrofotometrickou
metodou
kvantifikování
přeměny
p-nirofenolu na p-nitrofenolglukuronid. Měření se provedlo na mikrotitračních destičkách podle metody popsané v kapitole 4.2.9. V každém sloupci bylo 6 paralelních vzorků testovaných mikrosomů a 2 slepé vzorky. Měření bylo provedeno dvakrát. Z hodnot absorbance slepých vzorků byly odečteny zprůměrované hodnoty absorbance paralelních vzorků. Poté se vypočítala koncentrace konjugovaného pnitrofenolu z molárního absorpčního koeficientu ( =18,3 mM-1.cm-1) a specifická aktivita UGT v jednotkách nmol/min/mg. Zřejmě kvůli nízké detekční citlivosti metody nešly výsledky dále statisticky zpracovat. Získané hodnoty aktivit byly na hranici detekce, proto zde nejsou uvedeny. Aktivita UGT v mikrosomech připravených z kontrolních a ovlivněných Caco-2 buněk nebyla prokázána.
61
5.6
Testování vlivu anthokyanidinů na specifickou aktivitu CYP V ovlivněných a kontrolních mikrosomech se měřila aktivita CYP. Aktivita
cytochromů byla změřena pomocí metody měření přírůstku produktu, který vykazuje fluorescenci. Pro jednotlivé isoformy byly použity relativně specifické substráty (ethoxyresorufin pro CYP1A1 a benzyloxyresorufin pro CYP3A4). Měření se provedlo na spektrofluorimetru Perkin Elmer LS 50 B podle metody popsané v kapitole 4.2.10. Zkoumaly se především isoformy CYP1A1 a CYP3A4. Každý vzorek testované látky se použil 2 krát k měření jednoho substrátu. Během celého experimentu nedošlo ke změně směrnice a k nárůstu intenzity fluorescence. Záznamy z 2 měření jsou na obrázcích 15-16. Pro nulové výsledky se nabízí možnost, že toto konkrétní měření bylo pod detekčním limitem přístroje. Aktivita CYP v mikrosomech připravených z kontrolních a ovlivněných Caco-2 buněk nebyla prokázána.
Obr. 15: Záznam ze stanovení aktivity isoformy 1A1 cytochromu P450 z mikrosomů buněčné linie Caco-2 ovlivněných D 1 µM. Měřeno na spektrofluorimetru Perkin Elmer LS 50 B. 62
Obr. 16: Záznam ze stanovení aktivity isoformy 3A cytochromu P450 z mikrosomů buněčné linie Caco-2 ovlivněných P 1 µM. Měřeno na spektrofluorimetru Perkin Elmer LS 50 B.
63
6
DISKUZE
Anthokyany patří mezi hojně se vyskytující flavonoidy v ovoci a významné složky v mnoha populárních doplňcích stravy. V 70. letech minulého století vznikla studie, kdy denní příjem anthokyanů byl odhadnut na 180-215 mg za den, a to odpovídalo 9 krát vyššímu příjmu než u ostatních flavonoidů, jako jsou genistein a kvercetin (Kühnau 1976). Na druhou stranu se musí počítat s tím, že spotřeba anthokyanů je do značné míry ovlivněna individuálními stravovacími návyky a dostupností sezónního ovoce a zeleniny (Bártíková et al. 2013). Jejich popularita v podobě potravních doplňků roste díky příznivým účinkům na lidské zdraví. Jedná se hlavně o antioxidační účinky, které mají významnou roli v prevenci různých onemocnění založených na oxidačním stresu (Andersen a Jordheim 2006). Jako nutraceutika obsahují koncentrované bioaktivní složky. Zkonzumované dávky jsou pak vyšší než ty získané přirozenou stravou. A protože anthokyany mají schopnost modulovat aktivitu či expresi enzymů metabolizující léčiva, je dobré počítat s možnými neočekávanými účinky. Mohly by způsobit selhání určité farmakoterapie či vznik nežádoucích účinků (Szotáková et al. 2013). Do dneška vzniklo mnoho studií věnujících se modulaci enzymů metabolizujících léčiva či možným interakcím způsobených flavonoidy, ale pozornost byla zaměřena spíše na jiné látky z této skupiny či jejich směsi než na anthokyany či anthokyanidiny samostatné. V této diplomové práci jsme se zaměřili na anthokyanidiny, které se nejčastěji vyskytují v přírodě, a to delfinidin, cyanidin, malvidin a pelargonidin. Byl sledován vliv uvedených anthokyanidinů na buněčnou linii Caco-2 odvozenou od kolorektálního karcinomu. Buňky Caco-2 jsou často využívány jako model tenkého střeva a koncentrace anthokyanidinů bývá ve střevě nejvyšší, protože mají nízkou biologickou dostupnost. Proto je ve střevních buňkách vysoká pravděpodobnost ovlivnění biotransformačních enzymů. Nejprve jsme zjišťovali, zda samotné anthokyanidiny nemají vliv na proliferaci buněčné linie Caco-2. Pro tento experiment se použil test metabolické aktivity MTT. V naší studii nevykazovaly anthokyanidiny kromě malvidinu antiproliferativní účinek. Ve studii Cvorovic et al. (2010) se ukázal necytotoxický účinek na buněčnou linii Caco2 u všech čtyř anthokyanidinů. Ve srovnání s jinou lidskou kolorektální buněčnou linií 64
Lo/Vo, která je příkladem metastázujících nádorových buněk, se u delfinidinu a cyanidinu cytotoxický účinek projevil. Zde pak autor navrhuje možnost využití anthokyanidinů v možném vývoji léčby metastatických onemocnění a nabádá k dalšímu prozkoumání. Studie Lazzè et al. (2004) uvádí, že cyanidin a delfinidin nevykazovaly cytotoxický účinek na buněčnou linii Caco-2 ani v nejvyšší koncentraci 200 µM. Při zkoumání vlivu anthokyanidinů na proliferaci buněk žaludečního karcinomu linie AGS byl zjištěn největší antiproliferativní vliv u malvidinu (63 % kontroly) a delfinidinu (67 % kontroly) při použití koncentrace 200 µM (Shih et al. 2005). Všechny studie využily test metabolické aktivity MTT. Z toho vyplývá, že antiproliferativní působení záleží na typu buněčné linie a na koncentraci použitých anthokyanidinů. To ukazuje i studie Zhang et al. (2005), ve které byl prozkoumán vliv anthokyanidinů na různých typech nádorových buněčných linií. Největší inhibiční vliv na proliferaci vykazoval malvidin, obdobný inhibiční vliv malvidinu se projevil v našich experimentech na linii Caco-2. Hlavní částí této práce bylo zkoumání vlivu anthokyanidinů na aktivitu čtyř významných biotransformačních enzymů. Z enzymů první fáze biotransformace se sledovaly aktivity některých isoforem CYP a CBR, z druhé fáze biotransformace pak aktivity UGT a GST. Ohledně vlivu anthokyanů či jejich aglykonů na enzymy první fáze biotransformace, byl obecně výzkum zaměřen hlavně na CYP. Ve studii Dreiseitel et al. (2008) byly zkoumány anthokyany, anthokyanidiny a jejich hlavní metabolity (např. fenolické kyseliny) za použití membránových vzorků obsahujících rekombinantní lidský CYP3A4. Testované látky inhibovaly aktivitu CYP3A4 v závislosti na koncentraci. Projevily se spíše slabým inhibičním účinkem a fenolické kyseliny dokonce zanedbatelným účinkem. Slabý inhibiční účinek anthokyanidinů se také prokázal u Kimura et al. (2010). V naší práci se neprokázala žádná aktivita zkoumaných CYP v buněčné linii Caco-2. To může souviset s problematickou expresí CYP v tlustém střevě. Lze říci, že exprese CYP v tlustém střevě je u lidí značně snížena oproti vzorkům jater a tenkého střeva (McKinnon 1993). Druhým zkoumaným enzymem první fáze biotransformace byla CBR. Ale v této oblasti výzkumu byly spíše studovány jiné flavonoidní látky než anthokyanidiny. V těchto studiích se flavonoidy projevily jako inhibitory CBR1 (např. Carlquist et al. 2008, Gonzales-Covarrubias et al. 2008). V práci Szotáková et al. (2013) působily anthokyanidiny středním inhibičním účinkem na aktivitu CBR v potkaních i lidských jaterních mikrosomech. V potkaních buňkách největší inhibiční vliv na CBR projevil 65
pelargonidin. U lidských jaterních buněk delfinidin v koncentraci 100 µM zcela potlačil aktivitu CBR. Podobný účinek ve srovnání s játry potkanů se ukázal také v našich měřeních aktivity CBR buněčné linie Caco-2. Zde pelargonidin (1 µM) snížil aktivitu CBR až o 75 %. Ale u malvidinu a cyanidinu se projevil spíše indukční vliv. Tyto práce dokazují rozdílné účinky v ovlivnění biotransformačních enzymů na základě rozdílných typů buněk. Podstatnou roli v druhé fázi detoxikace léčiv má GST. Mnohé studie ukázaly inhibiční vliv flavonoidů na aktivitu GST (Boušová et al. 2012, Merlos et al. 1991, Zhang a Das 1994). V práci Szotáková et al. (2013) se sledovala aktivita jaterní GST ovlivněné anthokyanidiny u potkana a člověka. U potkaního cytosolu působily anthokyanidiny (v koncentraci 100 µM) středním inhibičním účinkem (30-60 %) a u lidských vzorků slabším. V našich pokusech na buňkách
Caco-2
působily
anthokyanidiny také slabým až středním inhibičním vlivem. Vyšší koncentrace testované látky inhibovala aktivitu GST ve všech případech kromě cyanidinu více. Nejvíce snížil aktivitu GST pelargonidin 10 µM (o 54 %), poté delfinidin 10 µM (o 49 %). Malvidin a cyanidin snížily aktivitu do 30 %. Posledním zkoumaným enzymem se stala UGT. Ačkoliv glukuronidace patří k nejčastějším
konjugacím
v lidském
organismu,
důkazů
o
ovlivnění
UGT
anthokyanidiny není mnoho. Anthokyanidiny samy o sobě podléhají rozsáhlé glukuronidaci a jsou substráty UGT, proto lze očekávat možné ovlivnění metabolismu jiných substrátů UGT. Tyto skutečnosti by si zasloužily více pozornosti (Bártíková et al. 2013, Szotáková et al. 2013). Nicméně, v práci Szotáková et al. (2013) byl změřen účinek čtyř anthokyanidinů na aktivitu UGT v potkaních a lidských jaterních buňkách. V této práci se ukázal inhibiční vliv na aktivitu UGT s mezidruhovými rozdíly. V našich experimentech výsledky z měření aktivity UGT v anthokyanidiny ovlivněných buňkách Caco-2 nešly statisticky zpracovat. Hodnoty aktivit UGT získané spektrofotometrickou metodou byly na hranici detekce. Studie Nakamura et al. (2008) však ukazuje expresi několika isoforem UGT v buněčných liniích Caco-2. Ačkoliv naše výsledky ukázaly možné ovlivnění aktivit GST a CBR buněk Caco-2 anthokyanidy, musí se počítat s tím, že se jedná pouze o in vitro experimenty. Několik in vivo výzkumů na lidských dobrovolnících nepotvrdilo výsledky z in vitro testů (Bártíková et al. 2013). Rozumný příjem anthokyanů z ovoce a zeleniny pravděpodobně neovlivňuje farmakokinetiku a účinnost současně podávaných léčiv. Opatrnost je však třeba při konzumaci potravních doplňků s vysokým obsahem 66
anthokyanů. Proto by bylo přínosné dále tuto oblast problémů zkoumat a provádět klinické studie, které by upozornily na případné lékové interakce.
67
ZÁVĚRY
7
Výsledky diplomové práce lze shrnout do následujících bodů:
Delfinidin, pelargonidin a cyanidin v žádných testovaných koncentracích neprojevily antiproliferativní účinek na buněčnou linii Caco-2.
U zvyšující se koncentrace malvidinu klesala proliferace buněk Caco-2. U nejvyšší koncentrace 20 µM byl počet buněk snížen o 53 %.
Anthokyanidiny inhibovaly aktivitu GST buněk Caco-2. Jako nejsilnější inhibitor působil pelargonidin v koncentraci 10 µM.
Delfinidin a pelargonidin měly na aktivitu CBR v buňkách Caco-2 inhibiční vliv (pelargonidin 1 µM snížil aktivitu až o 75%). Naopak u cyanidinu a malvidinu se projevil indukční vliv, kdy nejvíce zvýšil aktivitu malvidin 10 µM (o 47 %).
Aktivita UGT v buňkách Caco-2 byla na hranici detekce a výsledky se proto nedaly statisticky zpracovat.
Aktivita CYP v kontrolních ani v ovlivněných Caco-2 buňkách nebyla prokázána.
68
8
SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ A ZKRATEK
AGS
buněčná linie odvozená z lidského žaludečního karcinomu
BCA
kyselina bicinchoninová
BROD
benzyloxyresorufin-O-deethylasa
BSA
hovězí sérový albumin
C
cyanidin
Caco-2
buněčná linie odvozená z lidského kolorektálního karcinomu
CBR
karbonylreduktasa
CDNB
1-chloro-2,4-dinitrobenzen
CYP
cytochrom P450
D
delfinidin
DMSO
dimethylsulfoxid
EMEM
Eagle’s minumum essential medium
EROD
ethoxyresorufin-O-deethylasa
GSH
glutathion
GST
glutathion-S-transferasa
HEB
hematoencefalická bariéra
DM
diabetes mellitus
DNA
deoxyribonukleová kyselina
Lo/Vo
buněčná linie odvozená z lidského kolorektálního metastázujícího karcinomu
M
malvidin
MTT
[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyl tetrazolium bromid
NADPH
redukovaná forma nikotinamidadenindinukleotidfosfátu
NRU
neutral red uptake
P
pelargonidin
PBS
fosfátový pufr
ROS
reaktivní formy kyslíku
RNS
reaktivní formy dusíku
SD
směrodatná odchylka
SDR
dehydrogenasy/reduktasy s krátkým řetězcem 69
SGLT-1
sodium-depedent glucose cotransporter
TCA
trichloroctová kyselina
TE
trypsin-EDTA
TNF-α
tumor nekrotizující faktor alfa
TRIS
trishydroxymethylaminomethan
UDP
uridindifosfát
UDP-GA
UDP-glukuronová kyselina
UGT
UDP-glukuronosyltransferasa
70
9
SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ
Andersen O.M. a Jordheim M. (2006). The anthocyanins. V: Andersen O.M. a Markham K.R. Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and Applications. Boca Raton: CRC Press. Str. 471-552. Artusson P. a Karlsson J. (1991). Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells. Biochemical and biophysical research communications. 175: 880-885. Bártíková H., Skálová L., Dršata J. a Boušová I. (2013). Interaction of anthocyanins with drug-metabolizing and antioxidant enzymes. Current medicinal chemistry. 20: 4665-4679. Bobinaitė R. a Viškelis J. (2013). Anthocyanins: occurrence, bioactivity and bioavailability, with special reference to the anthocyanins of raspberries (a review). Sodininkystė ir Daržininkystė. 32: 39-47. Boušová I., Hájek J., Dršata J. a Skálová L. (2012). Naturally occuring flavonoids as inhibitors of purified cytosolic glutathione S-transferase. Xenobiotica. 42: 872-879. Burešová P. a Pavelková K. [online]. c2011. Přídatné látky (aditiva). Státní zemědělská a potravinářská inspekce. [cit. 2014-02-16]. Dostupné z:
. Carlquist M., Frejd T. a Gorva-Grauslund M.F. (2008). Flavonoids as inhibitors of human carbonyl reductase 1. Chemico-biological interactions. 174: 98-108. Castañeda-Ovando A., Pacheco-Hernández M., Páez-Hernández M.E., Rodríguez J.A. a Galán-Vidal C.A. (2009). Chemical studies of anthocyanins: A review. Food Chemistry. 113: 859–871. Coleman M.D. (2005). Human Drug Metabolism. An introduction. First edition. Chichester: John Wiley & Sons. ISBN: 0-470-86352-8. Cvorovic J., Tramer F., Granzotto M., Candussio L., Decorti G. a Passamonti S. (2010). Oxidative stress-based cytotoxicity of delphinidin and cyanidin in colon cancer cells. Archives of biochemsitry and biophysics. 501: 151-157. CYP3A4 – Wikipedia [online]. Poslední revize 3.4.2014. [cit. 2014-04-4]. Dostupné z: . Dreiseitel A., Schreier P., Oehme A., Locher S., Hajak G. a Sand P.G. (2008). Anthocyanins and their metabolites are weak inhibitors of cytochrome P450 3A4. Molecular nutrition & food research. 52: 1428-1433.
71
Erlejman A.G., Verstraeten S.V., Fraga C.G. a Oteiza P.I. (2004). The interaction of flavonoids with membranes: potential determinant of flavonoid antioxidant effects. Free radical research. 38: 1311-1320. Fernandes I., Faria A., Calhau C., de Freitas V. a Mateus N. (2014). Bioavailability of anthocyanins and derivatives. Journal of functional foods. Gonzales-Covarrubias V., Kalabus J.L. a Blanco J.G. (2008). Inhibition of polymorphic human carbonyl reducase 1 (CBR1) by the cardioprotectant flavonoid 7monohydroxyethyl rutoside (monoHER). Pharmaceutical research. 25: 1730-1734. Halliwell B. (2011). Free radicals and antioxidants – quo vadis?. Trends in pharmacological sciences. 32: 125-130. Heaney R.P. (2001). Factors influencing the measurement of bioavailability, taking calcium as a model. Journal of Nutrition. 131: 1344-1348. Heim K.E., Tagliaferro A.R. a Bobilya D.J. (2002). Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships. The Journal of Nutritional Biochemistry. 10: 572-584. Hlaváčová J. (2013). Inhibiční účinek anthokyanidinů na jaterní karbonylreduktasu. Diplomová práce. Katedra biochemických věd, Farmaceutická fakulta Univerzity Karlovy, Hradec Králové. Horbowicz M., Kosson R., Grzesiuk A. a Dębski H. (2008). Anthocyanins of Fruits and Vegetables - Their Occurrence, Analysis and Role in Human Nutrition. Vegetable Crops Research Bulletin. 68: 5-22. Horňáková V. (2010). Reakce katalyzované cytochromem P450. Bakalářská práce. Ústav biochemie, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, Brno. Str. 18. Hribar U. a Ulrih N.P. (2014). The metabolism of anthocyanins. Current Drug Metabolism. 15: 3-13. Josephy P.D. (2010). Genetic variations in human glutathione transferase enzymes: significance for pharmacology and toxicology. Human Genomics and Proteomics. 2: 876940. Kallberg Y., Oppermann U., Jörnvall H. a Persson B. (2002). Short-chain dehydrogenases/reductases (SDRs). European of journal biochemistry. 269: 4409-4417. KimuraY., Ito H., Ohnishi R. a Hatano T. (2010). Inhibitory effects of polyphenols on human cytochrome P450 3A4 and 2C9 activity. Food and chemical toxicology. 48: 429435. Kočárek E., Pánek M. a Novotná D. (2010). Klinická cytogenetika I. Úvod do klinické cytogenetiky Vyšetřovací metody v klinické cytogenetice. 2. vydání. Praha: Karolinum. Str. 55-57. ISBN 978-80-246-1880-7.
72
Konczak I. a Zhang W. (2004). Anthocyanins – More than nature’s colours. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 5: 239-240. Kong J.M., Chia L.S., Goh N.K., Chia T.F. a Brouillard R. (2003). Analysis and biological activities of anthocyanins. Phytochemistry. 64: 923-933. Knejzlík Z., Káš J. a Ruml T. (2000). Mechanismus vstupu xenobiotik do organismu a jejich detoxikace. Chemické listy. 94: 913-918. Kühnau J. (1976). The flavonoids: a class of semi-essential food components: their role in human nutrition. World review of nutrition and dietetics. 24: 117-191. Lazzè M.C., Savio M., Pizzala R., Cazzalini O., Perucca P., Scovassi A.I., Stivala L.A. a Bianchi L. (2004). Anthocyanins induce cell cycle perturbations and apoptosis in different human cell lines. Carcinogenesis. 25: 1427-1433. Lücker J., Martens S. a Lund S.T. (2010). Characterization of a Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon 3´,5´-O-methyltransferase showing strong preference for anthocyanins and glycosylated flavonols. Phytochemistry. 71: 1474-1484. Manach C., Williamson G., Morand C., Scalbert A. a Rémésy C. (2005). Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans. 1. review of 97 bioavailability studies. The American journal of clinical nutrition. 81: 230-242. McKinnon R.A., Burgess W.M., Gonzalez F.J. a McManus M.E. (1993). Metabolic differences in colon mucosal cells. Mutation research. 290: 27-33. Merlos M., Sanchez R.M., Camarasa J. a Adzet T. (1991). Flavonoids as inhibitors of rat liver cytosolic glutathione S-transferase. Experientia. 47: 616-619. Middleton E.J. (1998). Effect of plant flavonoids on immune and inflammatory cell function. Advances in Experimental Medicine and Biology. 439: 175–82. Nakamura A., Nakajima M., Yamanaka H., Fujiwara R. a Yokoi T. (2008). Expression of UGT1A and UGT2B mRNA in human normal tissues and various cell lines. Drug metabolism and disposition. 36: 1461-1464. Oakley A. (2011). Glutathione transferases: a structural perspective. Drug metabolism reviews. 43: 138-151. Passamonti S., Vrhovsek U. a Mattivi F. (2002). The interaction of anthocyanins with bilitranslocase. Biochemical and biophysical research communications. 296: 631-636. Pazmiño-Durán A.E., Giusti M.M., Wrolstad R.E. a Glória M.B.A. (2001). Anthocyanins from oxalis triangularis as potential food colorants. Food Chemistry. 75: 211-216. Referenční hodnoty vyšetření hemokoagulace [online]. Ústav patologické fyziologie Lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Plzni. [cit. 2014-3-15]. Dostupné z: . 73
Říhová H. (2008). Flavonoidy. Stručný přehled a význam. Bakalářská práce. Katedra biochemických věd, Farmaceutická fakulta Univerzity Karlovy, Hradec Králové. Str. 17. Sambuy Y., de Angelis I., Ranaldi G., Scarino M.L., Stammati A. a Zucco F. (2005). The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culturerelated factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell biology and toxicology. 21: 1-26. Shewe T., Steffen Y. a Sies H. (2008). How do dietary flavanols improve vascular function? A position paper. 476: 102-106. Shih P.H., Yeh C.T. a Yen G.C. (2005). Effects of anthocyanidin on the inhibition of proliferation and induction of apoptosis in human gastric adenocarcinoma cells. Food and chemical toxicology. 43: 1557-1566. Shijlen E.G., Ric de Vos C.H., van Tunen A.J. a Bovy A.G. (2004). Modification of flavonoid biosynthesis in crop plants. Phytochemistry. 65: 2631-2648. Skálová L. a Boušová I. (2011). Metabolismus léčiv a jiných xenobiotik. 1. vydání. Praha: Nakladatelství Karolinum. 162 s. ISBN 978-80-246-1917-0. Slanina J. a Táborská E. (2004). Příjem, biologická dostupnost a metabolismus rostlinných polyfenolů u člověka. Chemické listy. 98: 239-245. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J. a Klenk D.C. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150: 76-85. Stiborová M., Hudeček J., Hodek P. a Frei E. (1999). Význam cytochromů P450 pro lidské zdraví. Chemické listy. 93: 229-237. Syntéza anthokyanů [online]. Department of agricultural sciences, University of Helsinki. [cit. 2014-2-20]. Dostupné z: . Velíšek J. (1999). Chemie potravin 3. 1. vydání. Tábor: Ossis. Str. 19-26. ISBN 80902391-5-3. Vejražka M. (2008). Buněčné kultury. Molekulární medicína a biotechnologie: soubor přednášek. 1. vydání. Praha: Galén pro 1. LF UK v Praze. Str. 81-100. ISBN 978-807262-535-2. Vliv pH na anthokyany [online]. Wikiskripta. Poslední revize 13.3.2012. [cit. 2014-126]. Dostupné z: .
74
Wallace T.C. a Giusti M.M. (2014). Anthocyanins in Health and Disease. 1st. edition. New York: CRC Press. 355 s. ISBN 978-1-4398-9471-2. Wang L.S. a Stoner G.D. (2008). Anthocyanins and their role in cancer prevention. Cancer letters. 269: 281-290. Zhang K. a Das N.P. (1994). Inhibitory effects of plant polyphenols on rat liver glutathione S-transferases. Biochemical pharmacology. 47: 2063-2068. Zhang Y., Vareed S.K. a Nair M.G. (2005). Human tumor cell growth inhibition by nontoxic anthocyanidins, the pigments in fruits and vegetables. Life sciences. 76: 14651472.
75
